CN104854129B

CN104854129B - 色素上皮衍生因子衍生之多肽于促进肌肉或肌腱再生或动脉血管生成的用途

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Publication number: CN104854129B
Application number: CN201280075699.7A
Authority: CN
Inventors: 曹友平; 何宗权
Original assignee: MAXIE MEMORIAL HOSPITAL
Current assignee: MAXIE MEMORIAL HOSPITAL
Priority date: 2012-08-09
Filing date: 2012-08-09
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2032-08-09
Also published as: AU2012387503A1; IL237137A0; EP3342781B1; CA2882479A1; EP3342781A1; JP2015525786A; US20160000862A1; EA033145B1; BR112015002828B1; WO2014023007A1; IL237137B; EP2882772A4; EP3339317A1; AU2012387503B2; BR112015002828A2; KR20150058177A; JP6228977B2; EP2882772B1; CN104854129A; MX2015001721A

Abstract

提出一种来自PEDF的合成肽，其具有20–39个氨基酸残基。还提出含有此合成肽的药学组合物及其用途。此合成肽可用以促进肌肉或肌腱再生或促进动脉血管生成。

Description

色素上皮衍生因子衍生之多肽于促进肌肉或肌腱再生或动脉血管生成的用途

技术领域

本发明是关于组织损伤的治疗，且特别是关于利用来自色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，简称PEDF)的合成肽来促进肌肉或肌腱组织再生或促进动脉血管生成，以治疗组织损伤。

现有技术

肌肉组织可分为骨骼肌、心肌或平滑肌。肌肉能够修复其所受到的损伤。以骨骼肌为例，在受伤后，骨骼肌会藉由自发的过程来移除受损的肌纤维，并合成新的肌纤维。然而，在某些组织损伤的情形下，可能不会发生这种自发性的组织修复机制，或其修复程度不足以完全修复组织所受的损伤。举例来说，某些病理因素或遗传缺陷可能导致组织无法完全愈合；常见的病理因素如重伤、年迈、肌肉废用(muscle disuse)、癌症与组织缺血(tissueischemia)；上述遗传缺陷如肌肉萎缩症(muscular dystrophy)。组织无法修复可能会导致肌肉质量(muscle mass)的永久损失、疾病进展与组织功能缺失。

肌腱是有韧性且成束状的纤维性结缔组织，通常用于将肌肉连接至骨骼。肌腱损伤通常会导致发炎以及肌腱退化或弱化，最终可能导致肌腱断裂。肌腱修复是漫长且复杂的过程，通常要花上数个月甚至超过一年，在这段时间中，肌腱组织会由纤维状慢慢变成疤状。这种疤状组织可能会使得肌腱的弹性与可动性降低，且使得再次受伤的可能性偏高。肌腱干细胞(tendon-derived stem cell，简称TSC)与骨髓间叶干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cell，简称BM-MSC)对于肌腱炎病变所提供的自体疗愈效果有限。

缺血现象也是造成明显组织损伤的常见原因。缺血现象引起的组织损伤会造成心肌梗塞、中风与其它疾病。细胞通常能够修复因短暂缺血现象所造成的轻微损伤；然而长时间缺血通常会造成不可回复的细胞损伤，进而导致细胞死亡。在长时间缺血的情形下，就算之后重新建立血液循环，仍无法完全回复受损细胞的功能。此外，功能丧失通常会早于细胞死亡而发生。

到目前为止，仍未发展出能有效治疗受损且失去功能的组织或协助此类组织再生的方法。因此，相关领域亟需提出一种促进组织再生的方法。具体来说，需提供能够促进动脉血管生成的药学组合物与方法，以便促进损伤组织区域附近或其中的血流量，进而使得组织功能回复到近乎正常的程度。

发明内容

发明内容旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容旨在提供本公开内容的简化摘要，以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

本发明至少部分是基于发现PEDF衍生合成肽能够促进一个体体内的肌肉再生、肌腱再生或动脉血管生成。因此，此处所述的PEDF衍生合成肽可作为治疗组织损伤(特别是由缺血现象引发的组织损伤)的制剂或药剂。

有鉴于上述，本发明的一方面是关于一种用以促进一个体体内肌肉或肌腱再生的合成肽。

根据本说明书多个实施例，所述的合成肽长度为20–39个氨基酸残基，且其序列至少80％与SEQ ID NO:1相同。此外，上述氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基，其序列至少90％与SEQ ID NO:1的氨基酸残基11–30相同，而使得此合成肽可用于促进一个体体内肌肉或肌腱再生。

在可任选的实施例中，上述合成肽中有至少四个连续的氨基酸，其序列与SEQ IDNO:1的氨基酸残基11–14相同。此种合成肽的非限制性例示包括氨基酸序列如SEQ ID NO:1(39聚体)、SEQ ID NO:2(34聚体)、SEQ ID NO:3(29聚体)、SEQ ID NO:5(24聚体)、SEQ IDNO:6(20聚体)、SEQ ID NO:8(MO 29聚体)与SEQ ID NO:9(MO 20聚体)所示者。根据本发明某些实施例，上述合成肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3(29聚体)、SEQ ID NO:5(24聚体)或SEQ ID NO:6(20聚体)任一者所示。

在本发明另一方面中，提出一种用以促进一个体体内肌肉或肌腱再生的药学组合物。所述的个体/患者可以是任何哺乳类动物，包括人类。

根据本发明一实施方式，上述药学组合物包含任一根据本发明上述方面/实施例的合成肽，且此合成肽的含量足以促进该个体体内的肌肉或肌腱再生。此药学组合物亦包含可用以携带该合成肽的一药学上可接受载体。

在本发明的可任选实施例中，上述药学上可接受载体可为一高分子材料，譬如海藻酸盐(alginate)、明胶(gelatin)、胶原蛋白(collagen)或聚乳酸/甘醇酸共聚物(poly(lactide-co-glycolide)，简称PLGA)。

根据本发明的可任选实施例，此药学组合物中所述合成肽的含量为约1–100μM；较佳为约10μM。

在本发明的又另一个方面中，提出了一种方法，其可用以促进个体体内于邻近一损伤区域或该损伤区域中的肌肉或肌腱再生。所述的个体/患者可以是任何哺乳类动物，包括人类。

于一实施例中，上述方法包含对该个体体内的一治疗区域给予一治疗有效量的根据本发明上述方面/实施例之合成肽，其中上述治疗区域系邻近该损伤区域，藉以促进该个体体内于邻近该损伤区域或其中的肌肉或肌腱再生。

于可任选的实施例中，可将上述合成肽调制成根据本发明上述方面/实施例所述的药学组合物。在实际操作时，可透过肌肉内注射(intradermal injection)的方式来给予该组合物。

根据某些实施例，该个体可能因为肌肉损伤、肌肉废用、肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、肌腱损伤、组织缺血、脑缺血(cerebralischemia)、周边动脉疾病(peripheral arterial diseases)或心肌梗塞等原因，而使损伤区域中的肌肉或肌腱受损。

此外，本发明于另一方面中提出了一种用以促进一个体体内动脉血管生成的合成肽。

根据本说明书多个实施例，所述的合成肽长度为20–39个氨基酸残基，且其序列至少80％与SEQ ID NO:1相同。此外，上述氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基，其序列至少90％与SEQ ID NO:1的氨基酸残基11–30相同，而使得此合成肽可用于促进一个体体内动脉血管生成。

在本发明另一方面中，提出一种用以促进一个体体内动脉血管生成的药学组合物。所述的个体/患者可以是任何哺乳类动物，包括人类。

根据本发明一实施方式，上述药学组合物包含任一根据本发明上述方面/实施例的合成肽，且此合成肽的含量足以促进该个体体内的动脉血管生成。此药学组合物亦包含可用以携带该合成肽的一药学上可接受载体。

在本发明的又另一个方面中，提出了一种方法，其可用以促进个体体内于邻近一缺血区域或该缺血区域中的动脉血管生成。所述的个体/患者可以是任何哺乳类动物，包括人类。

于一实施例中，上述方法包含对该个体体内的一治疗区域给予一治疗有效量的根据本发明上述方面/实施例之合成肽，其中上述治疗区域系邻近该缺血区域，藉以促进该个体体内于邻近该缺血区域或其中的动脉血管生成。

根据某些实施例，该个体可能因为肌肉损伤、肌肉废用、肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis)、肌腱损伤、组织缺血、脑缺血(cerebralischemia)、周边动脉疾病(peripheral arterial diseases)或心肌梗塞等原因，而使缺血区域中的血流受阻。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域普通技术人员当可轻易了解本发明之基本精神及其它发明目的，以及本发明所采用之技术手段与实施方面。

附图说明

为让本发明的上述与其它目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，附图说明如下。

图1以折线图绘示在37℃下，海藻胶将PEDF合成肽于活体外释放至PBS中的累积释放量。结果以三次独立试验结果的平均值±标准差来表示。

图2为雷射都卜勒灌流影像(LDPI)，绘示缺血后肢在手术后4周内的血流灌注情形。

图3以折线图绘示小鼠经单独海藻胶(空白对照)、含29聚体、24聚体、20聚体或18聚体之缓释配方以及含29聚体的丸剂配方处理后，其后肢血流灌注分析的结果。果以三次独立试验结果的平均值±标准差来表示；n≥6。*P<0.05；相较于空白对照组。

图4A为经曼森氏三色染剂染色后之胫骨肌样本的代表性照片(原始倍率：×40)；而图4B为相同样本在较高倍率下的照片，以更清楚地呈现以手术诱发后肢缺血后2周与7周的肌肉坏死程度(原始倍率：×200)。

图5为缺血后两周于内收长肌中之小动脉的代表性免疫显微照片。小动脉以抗-α-SMA(褐色)标记，而细胞核以苏木色素标记。

图6为经过不同培养基培养四天后之主动脉环培植体的代表性照片，所用的培养基分别为：基础MCDB131培养基(未处理对照组，UT)以及添加了已知血管新生因子(FGF2或VEGF)、对照组PEDF合成肽(25聚体或18聚体)或根据本发明实施例之PEDF合成肽(29聚体、24聚体、20聚体、Mo 29聚体或Mo 20聚体)的培养基。

图7为经过不同培养基培养四天后之主动脉环培植体的代表性双重免疫染色照片，以观察在添加了不同PEDF合成肽(29聚体、20聚体或18聚体)的培养基中，由主动脉环向外长出脉管平滑肌细胞(vSMCs)的情形。照片中内皮细胞系以Alexa Fluor 594–标记之凝集素B4(IB4；红色，左方)标记，而vSMCs则以抗-α-SMA(绿色；中间)标记。右方为合并图式(黄色)。以Hoechst 33258来染色细胞核。原始倍率：×400。所示照片为四次独立实验的代表性照片。

图8为注射丁胍卡因后第14天之比目鱼肌的代表性H&E染色照片。

图9为折线图，绘示了在不同实验状况下的肌肉之肌纤维直径分布。

图10为受伤后3周之肌腱内部之再生组织(↑)的代表性照片。原始倍率：×100。

图11为受伤后3周阿基利斯(Achillis)肌腱的代表性H&E染色照片。原始倍率：×400；比例尺：50μM。所示照片为三次独立实验的代表性照片。

图12为受伤后3周经曼森氏三色染剂染色以呈现胶原蛋白纤维之组织切片的代表性照片。星号(*)代表肌腱中未受伤的区域。原始倍率：×400；比例尺：50μM。所示照片为三次独立实验的代表性照片。

图13为受伤后3周的第一型胶原蛋白(褐色)的代表性免疫染色照片。细胞核以苏木色素标记。下方以较高倍率显示方块区域。比例尺：50μM。所示照片为三次独立实验的代表性照片。

图14为根据本发明一实施例的代表性电泳照片，其显示此处提出的PEDF合成肽(29聚体与20聚体)可促进腱调蛋白(TNMD)基因的表现。腱调蛋白(TNMD)基因的表现显示BM-MSC分化为肌腱细胞。所示照片为三次独立实验的代表性照片。

实施方式

为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方面与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其它具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇之含义与本发明所属技术领域普通技术人员所理解与惯用的意义相同。此外，在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值，已尽可能精确地呈现具体实施例的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，「约」通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，「约」一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实施例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其它相似者)均经过「约」的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

在此处「肽」(peptide)一词系指氨基酸残基所组成的高分子。「合成肽」(synthetic peptide)一词则代表此肽并未包含存在于自然界的完整蛋白质分子。此种肽之所以是「合成的」，表示其乃是由人类利用技术手段所得，譬如化学合成、重组遗传技术或将整个抗原切段。于本说明书中，任何氨基酸残基于一肽中的位置系由该肽的N端起算。

「干细胞」(stem cell)一词在此系指此细胞在某些条件下保有能够增殖而不实质分化的能力，且亦能够在某些条件下分化成更专一或分化程度较高的细胞。

在此处「增殖」的各种词性(如proliferate或proliferation)系指族群中的细胞数目透过细胞分裂而增加之情形。

「肌肉细胞」(muscle cells)一词在此系指任何对肌肉组织有贡献的细胞，且包含肌母细胞(myoblasts)、卫星细胞(satellite cells)、肌小管细胞(myotubes)及肌原纤维组织(myofibril tissues)。「肌肉再生」(muscle regeneration)一词在此是指由肌肉先驱细胞(muscle progenitor cells)形成新的肌纤维之任何过程。可透过多种指针来评估肌肉在损伤区域中或邻近区域的再生情形，这些指针如在损伤区域中或附近的肌纤维数目、直径(大小)、湿重和/或蛋白质含量等。此外，亦可透过损伤区域中或附近之肌肉细胞和/或卫星细胞的增殖活性，来观察肌肉再生之情形。

在本说明书中，「肌腱」(tendon)一词系指由平行排列且紧密相接的胶原蛋白纤维所形成的纤维状组织，其可将肌肉连接至骨骼。肌腱损伤的复原过程非常缓慢的过程，且通常会形成疤痕，因而使得肌腱产生缺陷，而无法回复正常或原本的肌腱功能。在此处「肌腱再生」(tendon regeneration)一词系指在肌腱复原的过程中，产生第一型胶原蛋白(typeI ollagen)，且新形成的胶原蛋白纤维平行于张力方向，因而将复原过程中的疤痕形成降至最低。在损伤区域之中或附近呈有组织排列的胶原蛋白原纤维(fibrils)之数目，可用以评估肌腱再生之程度。此外，亦可透过损伤区域中或附近之肌腱干细胞的增殖活性，来观察肌腱再生之情形。

于本说明书中，「动脉血管生成」(arteriogenesis)一词与「血管新生」(angiogenesis)并不相同。血管新生是指由既有血管分枝形成微血管的过程；这些新生成的微血管并没有脉管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，简称vSMCs)，因此较为脆弱且容易破裂。此种微血管无法进行血管重塑(vasculature remodeling)过程，且因而不能对损伤区域或邻近区域供应和/或回复适当的血流循环。与血管新生相较之下，动脉血管生成系指由既有动脉管路的内皮细胞与平滑肌细胞增殖，而在原地补充与扩展动脉或侧枝动脉(collateral arteries)。这些新形成的动脉或侧枝动脉可发展成动脉(或侧枝动脉)网络，而能够形成天然的绕道已供应足够的血液至受损或缺血组织或发炎部位。

「缺血」(ischemia)一词系指在任何组织和/或器官中，因为缺乏氧气供应和/或因为代谢物不正常累积，而导致的状况。此种情形通常是由于不正常的灌流(perfusion)，而使得氧气供需不平衡所引起。已知有多种情况可能会引发上述不正常的灌流，如动脉粥状硬化(atherosclerosis)、血管狭窄(restenotic lesions)、贫血(anemia)、中风(stroke)或动脉阻塞(clogged arteries)等，这些情况会导致组织(如，肌肉心脏或脑部)的氧气量不足。然而，缺血状况不限于上述器官或组织，而可能发生在任何器官/组织。

「促进」及其各种时态(如promote或promoting)在此系指一种正面的改变；特别是指在统计上具有显著意义的正面改变。在一实施例中，正面的改变系指相较于一参考标准，增加了至少10％。

此处针对合成肽序列所述的「氨基酸序列相似度百分比」(Percent％amino acidsequence identity)系指该候选合成肽之氨基酸残基与一参考多肽之氨基酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可将该候选合成肽与该参考多肽并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在计算相似度时，并未将保守性置换之氨基酸残基纳入考虑。相关领域已有多种方法可供进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Center for BiotechnologyInformation，简称NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析软件Blastp来进行。一候选氨基酸序列A相较于一参考氨基酸序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为序列A与序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下:

其中X是利用Blastp软件对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。

在此处「药学上可接受载体」(pharmaceutically acceptable carrier)系指一种药学上可接受的材料、组合物或媒剂(vehicle)，诸如液体或固体填充物(liquid or solidfiller)、稀释剂(diluent)、赋型剂(excipient)、溶剂(solvent)或包覆材料(encapsulating material)，其可用以携带或运送标的成分由身体的一器官或部分到达身体的另一器官或部份。「可接受」的载体系指其可含组合物中的其它成分兼容。载体可为固态、半固态、液态、乳霜或胶囊等形式。

于本说明书中，「治疗」一词的各种词性与时态(如treat、treating或treatment)系指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置。「治疗」一词可用以指称将此处提出的组合物给予或施用于一个体，此个体可能有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常或易于罹患一疾患，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻一特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对并未表出现疾病、异常和/或病症之征兆的个体和/或呈现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关之病理变化的风险。在本说明书中，当一或更多种症状或临床指标减少时，通常认为该治疗是「有效」的。或者是，有效的治疗意味着一疾病的进展减少或暂停。亦即，「治疗」不仅包含改善症状或降低疾病指标，还涵盖了使得原本在不进行治疗的情形下，极有可能发生的疾病进展或症状恶化等情形停止或减缓。有益的或的临床结果包括，但不限于：一或多种症状的缓解、疾病程度的缩减、疾病状态的稳定(如，并未恶化)、疾病进程的延迟或延缓、疾病状态的部分或完全改善或缓和，以上所述包含可侦测或不可侦测的症状、程度、状态或进程。

在此处，「有效量」一词系指一成分的用量足以招致所欲的反应或效果。「治疗有效量」一词则是指药学组合物中的治疗药剂之含量足以产生上文定义的所欲「有效治疗」。具体的治疗有效量取决于多种因素，诸如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、目前疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。治疗有效量亦指于此用量下，该化合物或组合物的毒性或负面效果不及于其所带来的正面疗效。

「患者」或「个体」等词在此系指可接受本发明之合成肽、药学组合物和/或方法来进行治疗的哺乳类动物(包括人类)。除非另有指明，「个体」一般包含雄性与雌性。

色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor，简称PEDF)是一种多功能的分泌性蛋白质，其具有抗血管新生(anti-angiogenic)、抗肿瘤生成(anti-tumorigenic)与神经滋养(neurotrophic)等功能。人类PEDF蛋白质(SEQ ID NO:14)是一种大小约50kDa的分泌性蛋白质，具有418个氨基酸。已知PEDF的34聚体片段(相当于PEDF之第44–77号残基)与44聚体片段(相当于PEDF之第78–121号残基)分别具有抗血管新生与神经滋养性质。

本说明书至少部分是基于发现来自PEDF的合成肽能够促进一个体体内的肌肉或肌腱再生与动脉血管生成。特别是，本发明率先发现局部施用此PEDF衍生合成肽与受损或缺血的肌肉或肌腱组织的复原以及在缺血区域中或附近的动脉(或侧枝动脉)生成之间的关联。本发明的另一创新特征在于此处所提出的合成肽最长只有39个氨基酸残基，比起现有技术所述的全长PEDF短了许多；因此，本发明克服了传统蛋白质在临床使用上经常面临的困境，诸如制造成本高昂、生体可用率(bioavailability)低落与药物动力学(pharmacokinetics)表现不佳等。因此，这些合成肽可用以治疗肌肉或肌腱损伤以及缺血的组织或器官。

因此，本发明的一方面是关于用以促进一个体体内肌肉或肌腱再生的合成肽。本发明的另一方面则是关于用以促进一个体体内动脉血管生成的合成肽。下文叙述了适用于上述两种方面或其中之一的实施例。

根据本说明书多个实施例，此合成肽有20–39个氨基酸残基，且其氨基酸序列与SEQ ID NO:1(LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少80％的氨基酸序列相似度。举例来说，此合成肽与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相似度可为约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。另外，此合成肽包含至少20个连续的氨基酸残基，其与SEQ ID NO:1第11–30个残基有至少90％的氨基酸序列相似度。具体来说，这20个连续氨基酸残基与SEQ ID NO:1第11–30个残基的氨基酸序列相似度可为约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。

在本发明一实施例中，所述的合成肽有39个氨基酸残基，其序列即如SEQ ID NO:1所示。在下文实施例中，亦将此合成肽称为39聚体。此种39聚体肽是来自人类PEDF的已知44聚体片段(PEDF第78–121号残基)的一种较短的变形。

本案发明人先前所做的实验(如，审查中的美国专利申请号13/428996，在此将该先申请案的内容一并纳入为本说明书的一部分)与本说明书所提供的实施例显示还有其它数种来自此39聚体的短PEDF合成肽能够有效促进一个体体内的肌肉或肌腱再生和/或动脉血管生成。

举例来说，由下文与先申请案的实施例可知，如SEQ ID NO:2(ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的34聚体合成肽能够有效促进个体体内的肌肉或肌腱再生和/或动脉血管生成。34聚体合成肽相当于人类PEDF的第88–121号氨基酸残基；根据上文所述的氨基酸序列相似度的计算方法，此34聚体与39聚体的氨基酸序列相似度为100％，且34聚体的第6–25号氨基酸残基与39聚体的第11–30号氨基酸残基的氨基酸序列相似度也是100％。

此外，下文多个实施例证明如SEQ ID NO:3(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的29聚体合成肽能够有效促进个体体内的肌肉或肌腱再生，还能促进动脉血管生成。此29聚体合成肽相当于人类PEDF的第93–121号氨基酸残基；其与39聚体的氨基酸序列相似度为100％，且29聚体的第1–20号氨基酸残基与39聚体的第11–30号氨基酸残基的氨基酸序列相似度亦为100％。

某些实施例证实，一24聚体合成肽亦可有效促进个体体内的肌肉或肌腱再生以及动脉血管生成；此24聚体的序列如SEQ ID NO:5(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP)所示，且相当于人类PEDF第93–116号氨基酸残基。此外，24聚体序列与39聚体的第11–30号氨基酸残基完全相同(氨基酸序列相似度：100％)且其相较于39聚体的氨基酸序列相似度同样也是100％。

某些实施例证实，如SEQ ID NO:6(SLGAEQRTESIIHRALYYDL)所示的20聚体亦可有效促进个体体内的肌肉或肌腱再生以及动脉血管生成。此20聚体的序列相当于人类PEDF第93–112号氨基酸残基，其与39聚体的第11–30号氨基酸残基完全相同(氨基酸序列相似度：100％)且其相较于39聚体的氨基酸序列相似度同样也是100％。

本案与先申请案所揭载的实施例亦显示，另外有两种衍生自小鼠PEDF的短、合成肽同样也能够有效地促进个体体内的肌肉或肌腱再生和/或动脉血管生成。第一种衍生自小鼠的合成肽在本说明书中称为Mo 29聚体，其序列如SEQ ID NO:8(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST)所示，此序列与39聚体的氨基酸序列相似度为83％，且其前20个氨基酸残基与39聚体第11–30个残基的氨基酸序列相似度为90％。另一种衍生自小鼠PEDF的合成肽称为Mo 20聚体，其序列如SEQ ID NO:9(SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示。Mo 20聚体与39聚体或39聚体的第11–30号氨基酸残基的氨基酸序列相似度皆为90％。

在可任选的实施例中，上述合成肽中有至少四个连续的氨基酸，其序列与SEQ IDNO:1的氨基酸残基11–14相同。本案发明人所进行的实验结果显示，SEQ ID NO:1所示序列的第11–14号氨基酸残基(即，SLGA)对于维持短PEDF合成肽之生理功能扮演的重要的角色。举例来说，下文提出的多个实施例显示，不具有此SLGA片段的18聚体合成肽(EQRTESIIHRALYYDLIS；SEQ ID NO:7)无法促进个体体内的动脉血管生成。此外，由本案与先申请案所载的实施例可以发现，25聚体合成肽(EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT；SEQ IDNO:4)无法有效促进个体体内的肌肉或肌腱再生和/或动脉血管生成。

可利用任何习用的技术来合成此处所述的合成肽，譬如t-BOC或FMOC来保护α-氨基(alpha-amino groups)。这两种方法都采用了逐步合成法，其系由该肽的C端开始，每次加上一个氨基酸。亦可利用其它已知的固态肽合成(solid phase peptide synthesis，简称SPPS)法来合成此处所述的合成肽。

本发明之范围亦涵盖了其它相较于39聚体具有保守性置换的合成肽。在此处，「保守性置换」一词系指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性置换的例示包括亲水性残基(如异白胺酸、缬胺酸、白胺酸与甲硫胺酸)彼此间的置换，或相近极性残基(如精胺酸与离胺酸；或麸胺酸与天冬胺酸)彼此间的置换，以及其它类似的置换模式。「保守性置换」在此亦指利用一具有取代基的氨基酸来取代一不具有取代基的原始氨基酸，只要可和此具有取代基之氨基酸反应的抗体亦可和原始氨基酸进行免疫反应即可。

亦可将上述实施方式所述的各种合成肽调制成用以促进个体体内的肌肉或肌腱再生和/或动脉血管生成之药学组合物，此药学组合物即属于本发明另一方面之范围。

根据本发明一实施例，上述药学组合物包含根据本发明上述方面/实施方式所述的任一种合成肽，且此合成肽的含量足以促进个体体内的肌肉或肌腱再生和/或动脉血管生成。此药学组合物亦包适用于该合成肽的药学上可接受载体。

在选择适用于递送合成肽之药学上可接受载体时，主要需考虑该药学组合物的给药途径。根据本发明的可任选实施例，此药学组合物可透过肌肉内注射的方式来给药。在此种情形中，可利用无菌水溶液作为药学上可接受载体，此水溶液较佳为与接受者血液等张的溶液。举例来说，可将活性成分溶解或悬浮于含有生理可兼容物质的水中，所述的生理可兼容物质如氯化钠、甘胺酸及与其相似者，且其pH值经缓冲可与生理条件兼容，以得到一水溶液，而后再进行灭菌。

于可任选的实施例中，亦可将所述合成肽调制于一缓释剂型中，以确保该药学组合物可提供较长效的治疗效果。已知有多种高分子材料可延长药物的释放，其实施例包括但不限于：海藻酸盐、明胶、胶原蛋白及聚乳酸/甘醇酸共聚物。

根据本发明某些实施例，所述的合成肽系包埋于由经交联的海藻胶所组成的基质中，此时该合成肽的最终浓度约为1–100μM；且较佳为约10μM。举例来说，上述合成肽的浓度可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μM。

本发明之组合物亦可包含各种本领域习知的添加物。举例来说，可使用溶剂(包括少量乙醇)来稳定某些药物。其它可任选的药学上可接受添加物包括：乳白剂、抗氧化剂、香料、色素、胶化剂、增稠剂、安定剂、界面活性剂及与其相似者。亦可添加其它物质以防止组合物因储存而变质，譬如可添加抗菌剂来抑制微生物(如酵母菌与霉菌)的生长。本发明的组合物中亦可包括渗透促进剂和/或降低刺激性的添加物。

在又一方面中，本发明提出了一种用以于一个体的损伤区域中或邻近处促进肌肉或肌腱再生的方法；且本发明的另一方面是关于用以于一个体的缺血区域中或邻近处促进动脉血管生成的方法。在以上任一种实施方面中，所述个体/患者可以是任何哺乳类动物，包括人类。下文叙述了适用于上述两种方面或其中之一的实施例。

于一实施例中，上述用以促进肌肉或肌腱再生的方法包含对该个体体内的一治疗区域给予一治疗有效量的根据本发明上述方面/实施例之合成肽，其中上述治疗区域系邻近该损伤区域，藉以促进该个体体内于邻近该损伤区域或其中的肌肉或肌腱再生。

于另一实施例中，上述促进动脉血管生成的方法包含对该个体体内的一治疗区域给予一治疗有效量的根据本发明上述方面/实施例之合成肽，其中上述治疗区域系邻近该缺血区域，藉以促进该个体体内于邻近该缺血区域或其中的动脉血管生成。

于可任选的实施例中，可将所述合成肽调制为上述本发明方面/实施例所述的药学组合物。在实际操作时，可透过肌肉内注射(intradermal injection)的方式来给予该组合物。

根据某些实施例，该个体可能因为肌肉损伤、肌肉废用、肌肉萎缩症、肌萎缩性侧索硬化、肌腱损伤、组织缺血、脑缺血、周边动脉疾病或心肌梗塞等原因，而使缺血区域中的血流受阻。

下文提出多个实施例来说明本发明的某些方面，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信习知技艺者在阅读了此处提出的说明后，可在不需过度解读的情形下，完整利用并实践本发明。此处所引用的所有公开文献，其全文皆视为本说明书的一部分。

实施例

材料与方法

<材料>

经HEPES缓冲的DMEM培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.25％胰蛋白酶，抗-BrdU抗体、MCDB131培养基、TRIzol与Dynabeads皆购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。超纯海藻酸盐(6000Da)、二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、5-溴-2'-脱氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU)、Hoechst 33258染料与曼森氏三色染剂(Masson'sTrichrome)皆购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。第一型胶原蛋白酶(collagenase typeI)与第二型中性蛋白酶(dispase II)系购自Roche(Indianapolis,IN)。各种荧光染料-结合二级抗体皆购自BioLegend(San Diego,CA)。苏木色素与伊红(Hematoxylin and eosin，简称H&E)染料购自Merck(Rayway,NJ,USA)。抗-胶原蛋白1A1抗体系购自Santa CruzBiotechnology(Santa Cruz,CA)。基质胶(Matrigel)系购自BD Biosciences(Bedford,MA)。抗-α-平滑肌肌动蛋白(anti-α-smooth muscle actin，简称anti-α-SMA)抗体(ab5694)与抗-核干细胞因子(anti-nucleostemin)抗体系购自Abcam(Cambridge,MA)。抗-Pax7抗体(GTX62311)购自GeneTex(Taipei,Taiwan)。凝集素B4(Isolectin B4，简称IB4)-Alexa Fluor 568荧光耦合物系购自Molecular Probes(Eugene,OR)。

短合成肽(包括29聚体(SEQ ID NO:3)、25聚体(SEQ ID NO:4)、24聚体(SEQ IDNO:5)、20聚体(SEQ ID NO:6)、18聚体(SEQ ID NO:7)、Mo 29聚体(SEQ ID NO:8)与Mo 20聚体(SEQ ID NO:9))系购自GenScript(Piscataway,NJ)，于合成后，将其N端酰化(acetylated)并将C端酰胺化(amidated)以提升安定性，并以质谱仪定性(纯度>95％)。

本说明书所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度与湿度控制的饲养笼中，饲养温度约24℃至25℃，光暗循环为12小时。试验过程中提供饮水与标准啮齿类饲料供任食。实验计划皆通过马偕纪念医院(新北市，台湾)伦理委员会核准，并遵循国家动物保护相关规范。

<PEDF合成肽/海藻胶配方及丸剂配方>

以DMSO分别将每一合成肽(29聚体、25聚体、24聚体、20聚体、18聚体、MO 29聚体或MO 20聚体)复水备用(5mM)。之后，将备用液与超纯海藻酸盐混合，以得到浓度2％(重量/体积)的海藻酸盐溶液，其中PEDF合成肽的最终浓度约10μM。接着以薄膜过滤器(孔洞大小：0.22μm)过滤海藻酸盐溶液，并和经过滤的硫酸钙浆液(每毫升蒸馏水含0.21克硫酸钙)以25：1的比例混合(每毫升经过滤的海藻酸盐溶液和40μL的硫酸钙浆液混合)。将混合物静置于室温下1小时，以使海藻酸盐进行交联反应。所得到的缓释配方之后可用以治疗肌肉或肌腱损伤与缺血。

欲进行一次大量给药(bolus delivery)时，将5mM备用液连续稀释，以得到PEDF肽最终浓度为10μM的丸剂配方(bolus formulation)。

<组织学、免疫荧光与定量分析>

股薄肌(gracilis)、内收长肌(adductor magnus)、比目鱼肌(soleus)与胫骨肌(tibialis)分别以4％三聚甲醛(paraformaldehyde)固定，之后以梯度乙醇脱水，接着以石蜡包埋。经固定的样本以二甲苯(xylene)脱腊，并以梯度乙醇复水。将组织切成约5-μm的切片。利用H&E染料进行一般组织学分析。

脱腊的组织切片以10％山羊血清处理约1小时以进行阻断。在4℃下利用BrdU初级抗体(GTX42641；稀释比例1：50)或抗第一型胶原蛋白1A1初级抗体稀释比例1：50)染色一夜，之后在室温下先和适当的过氧化物酶-标记驴免疫球蛋白(peroxidase-labeleddonkey immunoglobulin)反应约30分钟，而后和显色原基质(chromogen substrate)3,3-二氨基联苯胺(3，3’-diaminobenzidine，简称DAB)反应2分钟，接着利用苏木色素进行对比染色。利用Nikon Eclipse 80i光学显微镜撷取高质量影像(分辨率1208X 960画素)，以供进行定量分析。

利用经H&E染色之肌肉切片来决定肌纤维直径，并以与颗粒边缘(particleborders)相切的一对并行线之间的最小距离进行定量，此即「最小费里特直径」(minimalFeret’s diameter)。利用Nikon Eclipse 80i光学显微镜撷取影像后，以Image-Pro Plus4.5.1软件(Media Cybernetics)来计算最小费里特直径。以每一张照片中肌纤维总数为基准，将各纤维费里特群组(以每5μm为单位)中的纤维数目标准化。

为了确认细胞核中心移位(centrally nucleated)肌纤维的数目，切片样本以H&E染色后，以上述装置撷取影像。于每一照片中随机选择至少100条经染色之纤维；若该纤维中有一或多细胞核并未处于靠近纤维周围的位置，则将该肌纤维判定为细胞核中心移位纤维。将数据表示为所计算之总纤维数的百分比。每一实验组别10只老鼠，每一肌肉部位中选择6个切片进行计算。

根据制造商的指示，以曼森氏三色染剂将脱腊的肌腱组织染色。对胶原蛋白面积进行半定量(semi-quantitative)分析时，在光学显微镜下，由每一玻片样本中随机选择10个视野(field)，并以Image-Pro Plus 4.5.1软件来计算样本中修复区域面积占未受损肌腱面积的比例(mm²/mm²)。

<肌腱干细胞的分离与培养>

本实验采用纽西兰白兔(6-8个月大，3.0-4.0kg)。顺着兔子的肌腱韧带骨附着处(bony attachment)切下，以取得阿基利斯肌腱。剥除腱翘后，将肌腱芯部切成小片。于DMEM-高葡萄糖溶液中加入3mg/ml的第一型胶原蛋白酶与4mg/ml的中性蛋白酶，将每100mg的肌腱芯部片段加入1ml上述溶液中，于37℃下进行2小时的水解反应。之后将所得细胞悬浮液在1,000rpm的转速下离心15分钟，取出细胞沈淀物后重新悬浮于DMEM生长培养基中，此培养基添加了10％经热不活化胎牛血清(FBS)、100μM的2-巯乙醇(2聚体captoethanol)与100U/ml的青霉素(Penicillin)及100μg/ml的链霉素(streptomycin)。欲进行继代时，利用0.25％胰蛋白来收集几近长满的细胞，且之后将密度1X 10⁵的继代培养细胞培养于培养基中。

<肌腱干细胞增殖分析>

将继代4的肌腱干细胞以每孔2X 10⁵个细胞的密度植入经明胶涂覆玻片上置于六孔盘中，并加入生长培养基(DMEM+10％FBS)培养24小时，而后将培养基置换成仅含5％FBS的基础生长培养基(对照组)或含有5％FBS加上50nM的PEDF合成肽(即，29聚体、24聚体、20聚体、18聚体、Mo 29聚体或Mo 20聚体)并培养24小时。欲进行BrdU标记分析时，将BrdU(最终浓度10μM)加入培养系统中约4小时。在以4％三聚甲醛固定后，将细胞置于冷的甲醇中约2分钟，而后在室温下以1N氯化氢处理约1小时，而后再进行免疫荧光分析。透过核干细胞因子(nucleostemin)与第一型胶原蛋白的免疫化学分析，来决定继代4的肌腱干细胞的表现型。几乎所有经增殖的肌腱干细胞都是核干细胞因子与第一型胶原蛋白-双阳性细胞。

<DNA合成的活体侦测>

欲侦测细胞增殖时，将BrdU重新溶于DMSO中备用(80mM)。将10μl的BrdU备用液和90μl的PBS混合后经腹膜内注射至小鼠体内，并于16小时后将小鼠进行安乐死。大白鼠则是经腹膜内注射150μl的BrdU备用液与350μl的PBS，并同样于16小时后安乐死。利用抗-BrdU抗体来标记BrdU，评估以DNA合成。

<免疫荧光分析>

脱腊组织切片或经4％三聚甲醛固定的兔子肌腱干细胞(TSC)以10％山羊血清与5％BSA处理约1小时以进行阻断。利用抗α-SMA(稀释比例1：100)、IB4(5μg/ml)、Pax7(稀释比例1：100)、核干细胞因子(稀释比例1：100)或第一型胶原蛋白1A1(稀释比例1：50)的一抗于37℃下染色2小时，之后在室温下和适当的玫红-或FITC-结合驴免疫球蛋白反应约1小时。利用Hoechst 33258对细胞核进行对比染色(约7分钟)。利用带有CCD相机的蔡司(Zeiss)荧光显微镜来撷取影像，并利用Axiovert软件照相。

每一内收长肌样本中，随机选取10个区域来撷取影像(放大倍率：200×)，并据以计算小动脉(围绕于血管整个周边的α-SMA阳性细胞)之密度。以事先不知处理组别的实验人员来计算各样本中的阳性细胞，并重复三次；之后将来自五个样本的数值平均，并表示成每平方毫米的小动脉(arteriole)密度。

<骨髓间叶干细胞的分离、培养与处理>

由雄性Sprague-Dawley大鼠(300–450g)的股骨(femur)分离出初级大鼠骨髓间叶干细胞(BM-MSC)。在无菌环境下移出股骨，并切除附着(adhering)组织，之后将DMEM培养基注入骨髓腔内冲洗。将收集到的骨髓细胞培养于100×15-mm的Petri碟中，使用DMEM培养基(添加10％FBS、100U/ml青霉素与100μg/ml链霉素)在5％二氧化碳与37℃的环境下培养2周，并每2-3天更换新鲜培养基。欲进行继代时，利用0.25％胰蛋白来收集几近长满的细胞，且之后将2X 10⁵的继代培养细胞培植于6孔盘的每一孔中，并培养于10％FBS-DMEM培养基中。在进行处理前，改用添加1％FBS的DMEM培养基使细胞饥饿12小时，而后在新鲜的1％FBS-DMEM中加入50nM的PEDF合成肽(29聚体或20聚体)，并培养24或48小时。

<RNA萃取与反转录聚合酶连锁反应>

利用TRIzol自细胞内萃取出全RNA，并以不含核糖核酸水解酶(Rnase-free)的第一型脱氧核糖核酸水解酶(DNase I)(Qiagen,Santa Clarita,CA)处理以移除基因组DNA，之后以RNA纯化套组Dynabeads进行纯化。在20μl的反应缓冲液(含0.25μg的随机引子与0.8mM脱氧核糖核苷三磷酸盐(dNTPs))中加入1μg取自BM-MSC的全RNA与200单位的反转录酶(Roche,Mannheim,Germany)，于42℃下反应1小时，以将RNA反转录为cDNA。在后续的PCR反应中，取2μl的cDNA作为反应模板。

PCR反应的反应体积为30μl，其中含有15μl的PLUS GREEN 2×Master Mix(Corp.)、1μM的各种引物以2μl的模板DNA。合成cDNA的增殖反应约18–22个循环(变性：20秒、94℃；黏合：30秒、57℃；以及聚合：40秒、72℃)。每种引物组所用的循环数落在扩充的线性范围内。用以增殖大鼠腱调蛋白(Tenomodulin，简称TNMD)基因(注册号：NM_022290)的引物组包含正向引物(AGAATGAGCAATGGGTGGTC；SEQ ID NO:10)与反向引物(CTCGACCTCCTTGGTAGCAG；SEQ ID NO:11)，其PCR产物大小约240bp。另外以大鼠甘油醛3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，简称GAPDH)基因(注册号：X02231.1)作为管家基因(housekeeping gene)，以将基因表现量标准化。用以增殖GAPDH基因的引物组包括正向引物(AGACAGCCGCATCTTCTTGT；SEQ ID NO:12)与反向引物(CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT；SEQ ID NO:13)，而PCR产物的大小约207bp。

利用含有溴化乙锭(ethidium bromide)的2％洋菜胶对PCR产物进行电泳分析，并以UV光照使其显影。利用FUJI LAS-3000系统与Multi Gauge Ver.1.01软件(Fujifilm,Tokyo,Japan)对PCR产物进行光密度法定量分析。

<统计分析>

将结果表示为平均值±平均值的标准差(standard error of the mean，SEM)。利用单向(one-way)ANOVA分析来进行统计比较。除非另有说明，P<0.05时具有统计上的显著差异。

实施例1

PEDF合成肽可自海藻胶基质中持续释放

为了决定29聚体与20mer的释放动力学，将100μg的FITC-结合PEDF合成肽与100μL的海藻酸盐溶液混合，之后根据「材料与方法」中所述的步骤制备水凝胶。其后，在微量离心管中加入100mg的水凝胶与1.5ml的PBS(pH 7.4)，并于回转式振荡培养箱(orbitalshaking incubator)中在37℃下培养6天。分别在预定的时间点将微量离心管离心后取出200μL的上清液并储存于-80℃下以供后续分析，同时将200μL的新鲜PBS加入离心管中，以补足所抽取的上清液。利用96孔的荧光计(fluorimeter)来测定所收取之上清液中FITC-结合PEDF合成肽的含量。利用已知浓度且未经包埋之FITC-肽来产生一标准曲线。本分析采用三次重复实验所得数据，并整理于图1。

如第1图所示，在6天的试验过程中，经包埋的PEDF合成肽会自海藻胶基质持续地释出。更明确地说，在试验开始后24小时，海藻胶基质中仍有约48％的29聚体与35％的20聚体合成肽。大多数(约90％)的29聚体合成肽会在试验前四天释出，其后释放速率会明显减缓，因而在累积释放曲线中可以观察到一个平线区(plateau)。20聚体合成肽的释放速率比起29聚体稍微快了一些，在试验前三天就释出了约90％的20聚体。

实施例2

缓释PEDF合成肽可降低缺血损伤

缺血性肌肉损伤通常会导致局部坏死(necrosis)以及组织与功能的丧失。因此，以下实施例中采用缺血性动物模型，以探究局部给予PEDF合成肽/海藻胶配方(下称「缓释配方」)是否能促进遭受缺血性损伤之组织或器官的组织或器官功能的回复。在下文的实施例中，分别分析了与缺血性损伤相关的多种情形，例如，肢体灌流(limb perfusion)、组织坏死、动脉血管生成与新血管分枝(neovessel sprouting)等。

本实验采用六周大的雌性C57BL/6野生型小鼠，动物经腹腔内注射舒泰(zoletil，用量为每公斤体重6毫克)与若朋(xylazine，用量为每公斤体重3毫克)混合液，以进行麻醉。以脱毛霜移除后腿与臀部的毛发。将单边外肠股动脉(external iliac artery)和股动脉(femoral artery)及周边血管扎起并切除，以得到后肢缺血小鼠。手术后，将小鼠随机分成数个实验群组(每一群组样本数为6)并分别给予如下处置。在空白对照组中，小鼠给予50μl的空白海藻胶；而在丸剂对照组中，小鼠接受含有29聚体的丸剂配方。在PEDF合成肽/海藻胶处理组中，小鼠接受50μl的缓释配方，其分别含有29聚体、24聚体或20聚体。此外，于PEDF 18聚体对照组中，小鼠接受含PEDF 18聚体合成肽的缓释配方。在手术后，立刻以单一剂肌肉内注射的方式将药物递送至股薄肌。伤口以无菌生理食盐水冲洗后缝合。

实施例2.1

缓释PEDF合成肽可增加肢体灌流

利用雷射都卜勒灌流影像(Laser Doppler Perfusion imaging，简称LDPI)分析仪(Moor Instruments,USA)来定量手术前(术前；pre OP)、手术后实时(术后；post OP)以及手术后一段时间的血液灌流情形。为了最小化因麻醉热损失(anesthetic heat loss)所造成的血管收缩，在测量前将动物置于37℃的加热板上5分钟。图2为代表性的LDPI照片，这些照片显示了在手术后四周间缺血性后肢的血液灌流情形，其中深蓝色代表血流量较低。另外，以LDPI指数来表示血液灌流情形，此一数值为同一动物之经手术(缺血性)后肢相对于未经手术(非缺血性)后肢的血流量比例，其结果摘要整理于图3与表1(n≥6)。以雷射频率(不同颜色的像素)的改变来表示血流量。

表1

*P<0.05；相较于空白对照组。

如图3所示，一如预期地，在所有处理组别中，局部血流在手术后(术后)都立刻下降为同一动物非缺血性后肢的约8％。在空白对照组(仅以海藻胶处理)中，可以观察到重新灌流随着时间缓慢成长的现象。另外，可注意到丸剂给药的效果与空白对照组相似，意味着PEDF合成肽的持续释出可能是这些PEDF合成肽产生保护效果所必须的。再者，相较于空白对照组或丸剂对照组而言，以含有18聚体合成肽之缓释配方处理的小鼠并未观察到血液灌流提升之现象；代表18聚体合成肽无法有效治疗缺血损伤。相较之下，以本发明实施例提出的PEDF合成肽处理的小鼠，其血液灌流皆有显著的提升(相较于空白对照组、丸剂对照组与PEDF 18聚体对照组。具体来说，经含有29聚体、24聚体或20聚体的缓释配方处理的动物，在手术后约第二周开始，皆可观察到血流量有明显的提升(至少为正常肢体的约60％)。在术后第4周，经含有29聚体、24聚体或20聚体的缓释配方处理的动物，其灌流状况的复原情形良好，分别达到正常肢体的约105％、92％与93％；相较之下，空白对照组的灌流比例只有约50％，而丸剂对照组的灌流比例也只有约55％。

实施例2.2

缓释PEDF合成肽可预防缺血诱发的组织坏死

在大多数的后肢缺血模型中，位于膝盖下方的肌肉通常会发生组织坏死的情形。举例来说，在股动脉切除后，位于给予治疗之股薄肌远程的胫骨前肌(tibialis anteriormuscle)通常会出现大量肌肉坏死与再生的情形。样本经曼森氏三色染剂后，蓝色染料的强度取决于样本组织中胶原蛋白纤维的含量，而坏死则会导致这种纤维化的情形。因此，在手术与治疗后第二周与第七周分别自胫骨前肌取得组织样本，并以曼森氏三色染剂染色，以评估纤维化(与坏死)程度。图4A与4B提供了代表性样本的照片。

如图4A所示，在术后两周，空白对照组动物的肌肉组织出现大量纤维化的情形(蓝色染色区域)，而经本发明提出之缓释配方处理的动物，其肌肉组织中纤维化区域相对较小。此外，在图4A中还可发现，于术后七周，此处提出之缓释配方可有效降低坏死与纤维化区域，且因而可使肌肉组织完全复原。

在缺血性损伤之后，可透过卫星细胞增殖来进行肌纤维再生。新生成的肌纤维的特点之一为中心位移的细胞核。此外，坏死区域中出现坏死肌原纤维，其呈现浅色嗜伊红细胞质且具有水肿与欠缺周边细胞核等现象。如图4B所示，于手术后两周，经本缓释配方处理的小鼠中，具有中心位移之细胞核的肌原纤维之再生情形比起空白对照组小鼠更为明显。参照图4B上方照片，空白对照组之样本中的较大浅红色区域(相较于经20聚体治疗之样本)代表此处提出的缓释配方能够有效地预防组织坏死。在手术后7周，空白对照组之动物的胫骨前肌中，还有15％的肌肉区域可见到小型的肌纤维束，且有脂肪滴交错分布于其间(图4B；左下方)。

针对术后两周的损伤区域(坏死区域与纤维化区域)以及细胞核中心移位之纤维数目进行统计分析，结果摘要整理于表2。将损伤区域面积表示成总染色区域面积的百分比(％)，而将细胞核中心移位之纤维表示成所计算之肌纤维总数的百分比(％)。

由表2所载的数据可以看出，注射此处提出的缓释配方可实质降低组织损伤(相较于空白或丸剂对照组)。具体来说，经PEDF处理之群组损伤区域可降低至空白或丸剂对照组的约45–48％。此外，这些数据显示以29聚体、24聚体或20聚体配方治疗会使得胫骨前肌中细胞核中心移位之纤维数目增加约3–3.7倍(相较于空白或丸剂对照组)。

表2

*P<0.001；相较于空白对照组。

P<0.02；相较于空白对照组。

综上所述，实施例2.2所述的结果显示以含29聚体、24聚体或20聚体之缓释配方进行处置，可预防缺血所引发的组织坏死与纤维化，且因而可促进肌肉组织的复原。此外，以此处提出之缓释配方治疗的小鼠，其胫骨肌复原情形较佳，可进一步左证此缓释配方于促进缺血性肢体中血液灌流的效果(参见上文实施例2.1)。

实施例2.3

缓释PEDF合成肽可刺激动脉血管生成而藉由侧枝循环供应血流至缺血性组织

在主要动脉(如冠状动脉或股动脉)急性阻塞的情形中，可以运用既有的动脉连接来绕过阻塞部位。此一过程称为「动脉血管生成」，且和「血管新生」过程有诸多不同之处。从解剖学的角度来看，这些既有的侧枝动脉是由一内皮细胞层(endothelial lining)、一内弹性层(internal elastic lamina)以及一或两层平滑肌细胞所组成的具有薄管壁的微型血管管路；此一结构与血管新生过程中生成的微血管不同。在一般的情形下，不会使用这些原生的既有小动脉来提供血液灌流。然而，在主要动脉阻塞后，这些血管会经由生长作用而大幅提升其管腔容量，并绕过阻塞区域，而能提供较高的血液灌流至受损的缺血区域。在动物体内许多器官或组织(如后肢、心脏、脑、肾等)中，当主要动脉发生慢性或急性阻塞时，这些侧枝动脉可缓减随后可能发生的各种不利状况。当注意到，动脉血管生成血管新生并非使既有侧枝动脉被动扩张的简单过程；反之，动脉血管生成涉及将既有动脉连结经主动增殖与重塑而形成真正的侧枝动脉。已知血管半径对血流量具有关键性的影响；因此，侧枝动脉在经过适应性的生长后，能够在单位时间内输送相对大量的血液。因而，刺激动脉血管生成比起管新生能够更有效率地保护缺血的后肢或其它器官(如心脏、脑等)。相较之下，血管新生指由既有血管形成内皮细胞结构的微血管过程，其对于提供较高的血液灌流至受损的缺血区域没有帮助。因此，新形成的微血管，不论数量有多少，其供应血流至可能缺血组织的能力，都比不上二或三条侧枝动脉所增加的血流量。

为了探究此处提出的缓释配方对动脉血管生成的效果，于术后两周取得每一处理组别之动物的内收长肌(其深度与股动脉切除位置相同，且预期该处会出现用以建立侧枝循环之动脉血管生成)。对脉管平滑肌细胞(α-SMA；褐色)染色，以标记肌肉剖面中的小动脉，并以苏木色素来标记细胞核；代表性照片见第5图。此外，亦进行定量分析，其结果表示为损伤区域周边(peri-injury region)内每平方毫米(mm²)的α-SMA-阳性小动脉之数目，如表3所示。

表3

*P<0.001；相较于空白对照组。

这些数据显示，相较于空白与丸剂对照组，给予此处提供的缓释配方能够增加邻近股动脉移除处之内收长肌内的小动脉密度。因而，在急性阻断血液供应后，PEDF合成肽的持续释出能够提供动脉血管生成活性，以建立侧枝循环。透过生长作用而大幅提升这些血管的管腔容量，能够促进受损之缺血区域的灌流；而此种发展良好的侧枝循环使得组织或器官能够自缺血情况中复原。

实施例2.4

PEDF合成肽可刺激完整组织培养(ex vivo)之新血管分枝

为了进一步确认由PEDF合成肽促进之新血管发展，进行大鼠主动脉环分枝(aortic ring sprouting)分析。自安乐死的大鼠取出胸主动脉(thoracic aortas)，并轻轻地剥除大动脉周边的纤维脂肪(fibroadipose)组织。将大动脉切片成长度约2mm的环，之后将其嵌入于低生长因子基质胶(growth factor-reduced Matrigel)中。将含有主动脉环的胶体置于12孔的孔盘内，在37℃下培育30分钟使胶体聚合。将1ml的MCDB131培养基加入含有基质胶的培植体中，上述培养基内添加了100U/ml的青霉素、100ng/ml的链霉素、1％FBS以及不同的添加剂(50ng/ml的VEGF-A、20ng/ml的FGF-2；或50ng/ml的29聚体、24聚体、20聚体、Mo 29聚体、Mo 20聚体、25聚体或18聚体)。将培植体置于有湿度调节的保温箱中在37℃下培养4天，并每2天更换新鲜培养基。在培养后第4天，利用具有明视野镜头(bright-field optics)的倒立显微镜(inverted microscope)平台(Leica)来观察新血管分枝的情形；代表性照片见第6图。此外，利用Image-Pro Plus 6.0软件(Dendrites program)对新血管分枝进行定量分析，结果表示成相对于未经处理之主动脉环的倍数，如表4所示。本实验重复三次。

在未经处理的对照组(UT)中，培养基并未添加任何生长因子，在第4天仅可观察到少量的新血管分枝情形。可注意到，相较于未经处理的对照组，添加对照组PEDF合成肽(即，25聚体及18聚体)并未实质促进新血管分枝。

表4

*P<0.02；相较于未经处理的对照组。

一如预期地，已知的血管新生因子包括VEGF与FGF2皆可实质提升新血管分枝。经VEGF或FGF-2处理之样本的新血管分枝分别是未经处理之对照组的约3.4倍与约3.5倍。

表4的数据亦显示，此处提出的PEDF合成肽(包括29聚体、24聚体、20聚体、Mo 29聚体与Mo 20聚体)于刺激新血管分枝的效果更胜于VEGF或FGF2。此外，对这些新血管进行双重染色免疫分析，分别标记α-平滑肌肌动蛋白(小动脉壁平滑肌肉细胞(SMC)的标记)与凝集素B4(IB4，内皮细胞的标记)，代表性照片见图7。由第7图可以看出，以此处提出之PEDF合成肽(29聚体或20聚体)处理的样本显现出小动脉的表现型而具有SMC披覆。相反地，在以对照组PEDF 18聚体处理的样本中，几乎很难观察到初级管状构造(endothelial tube)的形成与及SMC增殖的情形。此一结果显示根据本发明实施例的PEDF合成肽能够刺激新血管生成，而不仅止于只含内皮细胞之微血管的血管新生。此外，此实验结果亦可支持此处提出的PEDF合成肽可于活体内刺激动脉血管生成之论述。

总结来说，实施例2(包含实施例2.1至2.4)所记载的结果显示此处提出的PEDF合成肽可有效促进肢体灌流、减少组织坏死与纤维化以及促进动脉血管生成与新血管分枝；且因而给予上述PEDF合成肽(特别是含有任一种所述PEDF合成肽的缓释配方)能够降低缺血性损伤并有助于组织或器官之结构与功能的复原。当注意到，先前研究显示人类PEDF有一34聚体片段(PEDF第44–77号残基)具有抗血管新生(anti-angiogenic)性质，且人类PEDF另有一44聚体片段(PEDF第78–121号残基)具有神经滋养(neurotrophic)性质。然而，本发明首度证实，短的PEDF片段(至少包含上述29聚体、24聚体、20聚体、Mo 29聚体与Mo 20聚体)具有促进动脉血管生成(arteriogenic)的活性。

实施例3

缓释PEDF合成肽可促进肌肉再生

将单一剂丁胍卡因(bupivacaine)注射至大鼠之比目鱼肌，致使大鼠肌肉坏死(myonecrosis)，并用此模型探究此处提出的PEDF合成肽对于肌肉再生的影响。本实验采用十周大的雄性Sprague-Dawley大鼠(试验开始的平均体重为312±11g)，动物经腹腔内注射舒泰(zoletil，用量为每公斤体重10毫克)以进行麻醉。以脱毛霜移除后腿与臀部的毛发。之后，以抛弃式注射器与26号(26-gauge)针头将0.5ml的丁胍卡因(AstraZeneca)单边注射到动物的比目鱼肌中。简言之，将针头插入至比目鱼肌的远程，且之后纵向收回针头至进端，同时均匀地注射丁胍卡因溶液。在缓慢收回针头的过程中，使溶液注射于肌肉的全长范围中。

在注射丁胍卡因之后，将大鼠平均分成四个实验群组(每群样本数为10只)，并分别给予以下处理。在空白对照组中，给予小鼠50μl的空白海藻胶。在治疗组中，给予小鼠50μl的缓释配方(含29聚体或20聚体)。丸剂对照组之小鼠则接受丸剂配方(含29聚体)。在丁胍卡因灌流后，立刻以单一剂肌肉内注射的方式，将不同的处理施用至动物的比目鱼肌。

在注射丁胍卡因后第4天，取比目鱼肌的切片进行组织学分析，结果显示不同组别皆出现一般肌肉坏死的情形，比目鱼肌样本中可见到肌纤维崩解与大量浸润发炎细胞(照片未示出)。只有在周边区域还有少数肌纤维保有相对正常的结构；在空白对照组与经PEDF肽处理的组别中，肌纤维坏死的程度都很相近。以上结果显示丁胍卡因对不同组别的原有肌纤维引起相同程度的肌纤维崩解。

实施例3.1

缓释PEDF合成肽可促进细胞增殖

肌肉再生过程涉及了肌纤维或肌肉细胞的增殖；于本实施例中，将BrdU引入增殖的细胞核中，以观察肌纤维增殖之情形。卫星细胞的增殖是肌肉再生的关键；因此，亦对比目鱼肌进行染色，藉由侦测卫星细胞标记Pax7来探究肌肉再生活性。详细的检测方法如「材料与方法」一节所述。以标记指数(labeling index)来表示BrdU-阳性细胞的数量，此一数值是将经标记的细胞数目除以细胞总数，并以百分比(％)表示。Pax7-阳性细胞的标记指数(％)则是将经标记的细胞数目除以具有细胞核的细胞总数。自每一实验群组的10只小鼠分别取得肌肉切片，且每一切片取六个部分进行定量分析，结果摘要整理于表5。

表5

由表5可以看出，经含有29聚体或20聚体之缓释配方治疗的小鼠伤口中，有明显较多的BrdU-阳性细胞(相较于经空白或丸剂对照组处理的小鼠)。关于卫星细胞的增殖活性，表5的数据显示，相较于空白与丸剂对照组，此处提出的缓释配方可导致较高的Pax7-阳性细胞比例。总结来看，这些数据显示给予此处提出的缓释配方能够提升肌纤维和/或卫星细胞的增殖活性，而此一特性又能够促进肌肉再生。

实施例3.2

缓释PEDF合成肽可促进肌纤维再生

在肌肉再生的过程中，新生成的肌纤维的细胞核通常位于中心。因此，这种细胞核中心移位之肌纤维的百分比亦可作为肌肉之再生活性的指标。在注射丁胍卡因后第7天，对细胞核中心移位之纤维数目进行统计分析，结果摘要整理于表6。

表6

由表6可以看出，相较于空白或丸剂对照组，经含有29聚体或20聚体之缓释配方处理的动物中，含有中心位移之细胞核的肌纤维比例较高。这些结果显示给予此处提出的缓释配方能够有效促进肌肉再生。

此外，在注射丁胍卡因后第14天，在所有实验群组中，比目鱼肌内都形成了新的肌肉细胞来取代已坏死的肌纤维。然而，在以空白或丸剂对照组处理的动物中，其再生肌肉仍可见到许多细胞核中心移位之纤维(第8图)，这意味着这些群组中的肌肉再生尚未完成。相反地，在经过含有29聚体或20聚体之缓释配方处理的动物中，其肌肉切片内的细胞核中心移位之纤维明显少了许多。总结来看，这些数据显示PEDF合成肽的持续释放有利于肌纤维的再生。

实施例3.3

缓释PEDF合成肽可促进再生之肌纤维的成熟

在肌肉再生过程的后期，新生成的肌纤维会开始变大。于受伤后第14天取得肌肉样本，并根据「材料与方法」一节所述的步骤，分别测量纤维直径，结果摘要整理于图9。

平均来看，以含有29聚体或20聚体之缓释配方处理的动物之肌肉纤维直径大于空白或丸剂对照组中之动物。此外，经20聚体治疗的动物肌肉之尺寸分布非常接近未受伤的完整肌肉之尺寸分布。具体来说，经20聚体治疗的动物约有56.6％的肌纤维其最小费里特直径为15–25μm，而未受伤的动物则有约53.2％的肌纤维落于此一范围中；相较之下，空白及丸剂对照组则分别有约59.6％与约56.2％的再生纤维的丸剂对照组最小费里特直径介于约10–20μm之间。这些数据显示与此处提出的缓释配方能够有效增加再生之肌肉的质量。

总结而论，实施例3(包括实施例3.1至3.3)所提出的资料证实此处提出的PEDF合成肽能够有效促进肌纤维与卫星细胞的增殖、肌纤维的再生以及再生之肌纤维的成熟；且因而给予所述PEDF合成肽(特别是含有任一种所述PEDF合成肽之缓释配方)能够有效促进肌肉再生过程并有助于肌肉组织结构与功能的复原。本发明率先发现短的PEDF片段(至少包含29聚体与20聚体)能够促进肌肉再生。

实施例4

缓释PEDF合成肽可促进肌腱再生

本实施例采用大鼠肌腱损伤模型来探究此处提出的PEDF合成肽对肌腱再生的效果。采用十周大的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(总样本数50只，试验开始的平均体重为312±11g)，动物经腹腔内注射若朋(用量为每公斤体重10毫克)以进行麻醉。接着，将18号(18-gauge)针头插入穿过大鼠左腿阿基利斯腱的完整厚度，并在跟骨(calcaneum)上方约1公分处将阿基利斯腱横切切断，以得到左阿基利斯腱缺损的动物模型。此一方式所得到的水平伤口两侧有完整的肌腱组织，可防止两断裂端的收缩。

将大鼠随机分派于五个实验群组(每群样本数为10只)，并分别接受以下处置。空白对照组的小鼠接受150μl的空白海藻胶。丸剂对照组的小鼠给予150μl的丸剂配方(29聚体)。在PEDF处理组中，小鼠分别接受150μl的缓释配方(含29聚体、24聚体或20聚体)。伤后立刻将各处理以皮下注射的方式注射至邻近肌腱损伤处，伤口以无菌生理食盐水冲洗后缝合。

实施例4.1

缓释PEDF合成肽可促进肌腱愈合

在肌腱损伤后第3周，进行组织学分析以观察肌腱复原的情形，代表性照片如图10所示。图10上方为空白对照组之动物的复原情形，由图中可看到在两断裂端之间，形成了由不规则的纤维所组成的疤痕组织，且在此疤痕组织中经染色的胶原蛋白束(粉红色)非常少。相较之下，经含有29聚体之缓释配方处理后，肌腱二断裂端之间形成的愈合组织中的疤痕组织较少(相较于空白对照组样本)，且有成熟胶原蛋白束(粉红色)延伸至肌腱损伤处；此外，在某些区域中，来自二断裂端的肌腱纤维似乎有接合的情形(第10图下方照片)。再者，经29聚体处理处理的群组中，疤痕中的纤维组织似乎较为规则，且平行排列。

图11为较高倍率的组织学分析照片。由照片中可以看出，正常肌腱在胶原蛋白纤维之间所含的细胞数相对较少，且细胞核几乎都呈狭长形。在空白与丸剂对照组中，在经过三周的复原后，可在肌腱中观察到较多的纤维母细胞(fibroblast，其特征在于有圆形或纺锤形的似纤维母细胞细胞核)，且新形成的胶原蛋白纤维结构较不规则(照片中未损伤组织以星号(*)标记)。这些型态学上的改变显示空白及丸剂对照组中的肌腱伤口愈合较差。

相较之下，图11显示在以此处提出之缓释配方处理的肌腱中，愈合区域可见到较薄、细长形的细胞核，其型态近似成熟肌腱细胞(tenocyte)的细胞核，而其中的胶原蛋白纤维排列规则且和原生肌腱(深粉红色deep pink)相平行；以上型态代表着肌腱伤口的愈合情形较佳。这些结果显示此处提出的缓释配方有利于肌腱伤口之愈合。

此外，样本经曼森氏三色染剂染色，以评估胶原蛋白纤维的结构与排置，代表性样本照片如图12所示。在未受伤的肌腱中，胶原蛋白纤维实质上彼此平行(图12左方)。相反地，在空白对照组中，受伤肌腱之复原区域内的胶原蛋白纤维成不规则排列(图12中；伤口边缘以星号(*)标记)。然而，以此处提出的缓释配方处理的受伤肌腱中，可观察到排列规则的胶原蛋白纤维，且其方向与受伤边缘之外的未受伤肌腱组织大致相同(图12右方；伤口边缘以星号(*)标记)。这些高度规则排列的胶原蛋白纤维意味着经此处提出的缓释配方处理的动物，其肌腱伤口复原情形较佳。

此外，以定量分析来评估于再生区域中的胶原蛋白百分比(％)，结果摘要整于表7。

表7

由表7可以看出，PEDF(29聚体、24聚体或20聚体)处理组中的动物其再生区域内的胶原蛋白含量较高(相较于空白或丸剂对照组)。这些数据显示，施用此处提出的缓释配方能够促进创伤区域内的胶原蛋白生合成。

此外，对样本中的第一型胶原蛋白进行免疫染色，并以苏木色素来染色细胞核，代表性的样本照片如图13所示，其中下方图式为上方图式虚线部分的放大图。当可想见，未受伤肌腱中的胶原蛋白纤维彼此有良好的交链，且因而抗-胶原蛋白1A1抗体可能不易辨识这些胶原蛋白纤维。因此，在图13左方照片中，仅可观察到非常少量的第一型胶原蛋白(褐色)。藉由比较空白对照组的照片(图13中)与PEDF处理组的照片(图13右方)，可以发现经PEDF处理的动物中，第一型胶原蛋白(褐色)的含量高于空白对照组之动物。

总结来看，这些结果显示给予含有所述PEDF合成肽之缓释配方能够刺激受伤肌腱组织内的细胞之第一型胶原蛋白的生合成，有助于愈合损伤组织胶原蛋白的沈积，且可促使胶原蛋白纤维排列更为规则，因而有利于肌腱再生。

实施例4.2

PEDF合成肽可诱导活体外(in vitro)肌腱干细胞增殖

已知在肌腱愈合的过程中，肌腱干细胞(tendon stem cell，简称TSC)会扩增并分化为肌腱细胞。为了探讨此处提出的PEDF合成肽是否可诱使肌腱干细胞于活体外增殖，利用「材料与方法」一节所述的步骤来分离并培养肌腱干细胞。并利用肌腱干细胞标记(核干细胞因子)以及肌腱干细胞可表现第一型胶原蛋白的特性来确认肌腱干细胞的纯度(近百分之百；资料未示出)。再利用BrdU脉冲标记2小时，来确认细胞增殖。采用上文所述的方法对BrdU-阳性细胞进行定量分析，结果摘要整理于表8。

表8

*P<0.002；相对于未处理之对照组细胞。

这些结果显示，相较于培养于对照组培养基中的肌腱干细胞，培养于含此处提出之PEDF合成肽(29聚体、24聚体、20聚体、Mo 29聚体或Mo 20聚体)之培养基中的肌腱干细胞的增殖活性较佳。此外，亦可注意到，此处所用的Mo 29聚体与Mo 20聚体是来自老鼠PEDF肽，且这两个序列和39聚体的11–30个氨基酸残基的序列相似度并非100％；然而，这两个序列促进有丝分裂的效果与来自人类PEDF的短PEDF合成肽(如，29聚体、24聚体与20聚体)不相上下。

实施例4.3

缓释PEDF合成肽于肌腱损伤后可促进活体内(in vivo)肌腱干细胞增殖

由实施例4.1中的各组动物身上取得样本，并对核干细胞因子进行染色(绿色)，以探究此处提出的缓释配方在肌腱伤口复原的过程中，是否能够促进活体内的肌腱干细胞增殖。进行定量分析时，由每一实验群组的样本中随机选取10个显微视野并撷取影像，接着计算在所有细胞中(以Hoechst33258进行对比染色；蓝色)，核干细胞因子-阳性细胞的百分，结果摘要整理于表9。

表9

*P<0.001；相较于空白对照组。

这些数据显示，在经过29聚体、24聚体或20聚体处理的动物中，呈核干细胞因子-阳性之肌腱干细胞较多(相较于空白与丸剂对照组中之动物)。将实施例4.1与4.3的实验结果综合分析，可以发现藉由给予此处提出的缓释配方而促进活体内肌腱干细胞扩增的现象，和肌腱复原情形较佳(相较于自然的复原过程)的现象可互相呼应。

实施例4.4

PEDF合成肽可诱导由骨髓间叶干细胞产生似肌腱细胞

近来研究显示，可利用成体间叶干(mesenchymal stem cell，简称MSC)来再生具有功能的肌腱。于本实施例中，将骨髓间叶干细胞培养于对照组培养基或含有PEDF 29聚体或20聚体的培养基中，以探究此处提出的PEDF合成肽于促进骨髓间叶干细胞分化为肌腱细胞的能力。腱调蛋白(TNMD)基因大量表现于肌腱中，且被认为是肌腱细胞系(lineage)最可靠的表现型标记之一。因此，本实验藉由TNMD的表现量，来评估肌腱细胞的分化。RT-PCR分析的代表性照片见图14。

分析结果显示，在体外培养的骨髓间叶干细胞内，此处提出的PEDF合成肽(如29聚体或20聚体)可有效地诱导似肌腱细胞的细胞分化。由于骨髓间叶干细胞的移动(mobilization)与分化是活体内肌腱修复的可能机制之一，上述结果意味着此处提出的PEDF合成肽似乎能够藉由促进骨髓间叶干细胞分化为肌腱细胞，而修复肌腱损伤。这些结果亦显示出，此处提出的PEDF合成肽有潜力用于由骨髓间叶干细胞组成的骨架基质培养系统(scaffold matrix culture)中，以促进人工肌腱的合成。

总结而论，实施例4(包括实施例4.1至4.4)所示的数据显示此处提出的PEDF合成肽能够有效促进规则排列之胶原蛋白(特别是第一型胶原蛋白)纤维的生合成以及肌腱干细胞的增殖；且因而给予此处提出的PEDF合成肽(特别是，含有任一种所述PEDF合成肽之缓释配方)能够促进肌腱再生过程，且有利肌腱组织在结构与功能方面的复原。本发明率先证实短的PEDF肽片段(至少29聚体与20聚体)能够促进肌腱再生，亦能促使骨髓间叶干细胞分化为肌腱细胞。

综上所述，上开实施例所载的结果证实此处提出的PEDF合成肽(例如29聚体、24聚体、20聚体、Mo 29聚体、与Mo 20聚体)能够促进缺血区域中或其邻近区域内的动脉血管生成，亦能促进损伤区域中或其邻近区域内的肌肉与肌腱再生。因而，此处提出的PEDF合成肽可作为一种用以促进肌肉与肌腱伤口复原以及降低缺血性损伤的治疗药剂。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中普通技术人员，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明之保护范围当以附随权利要求所界定者为准。

Claims

1.以下所述合成肽用于制造药物的用途，所述药物用以促进对象肌肉再生、肌腱再生或动脉生成，所述合成肽由长度为20-29个氨基酸残基的氨基酸序列组成，所述氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的用途，所述合成肽的4个连续残基与SEQ ID NO:1的残基11-14相同。

3.如权利要求1所述的用途，所述合成肽的所述氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，所述药物包含药学上可接受的载体。

5.如权利要求4所述的用途，所述药学上可接受的载体是选自藻酸盐、明胶、胶原和丙交酯-乙交酯共聚物的聚合物材料。

6.如权利要求5所述的用途，所述聚合物材料是藻酸盐。

7.如权利要求6所述的用途，所述药物配制成缓释型。

8.如权利要求7所述的用途，所述药物配制成适用于肌肉注射的药物。