KR101801198B1 - 근육 또는 힘줄 재생 또는 동맥형성을 촉진하기 위해 사용되는 pedf-유도 폴리펩티드의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에는 20 내지 39개의 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열을 가지는 합성 펩티드가 개시된다. 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 대해 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함한다. 또한 본원에는 합성 펩티드를 함유하는 약학적 조성물 및 그것의 적용이 개시된다. 본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 대상의 근육 또는 힘줄 재생 및/또는 동맥형성을 촉진하는 데 유용하다.

Description

근육 또는 힘줄 재생 또는 동맥형성을 촉진하기 위해 사용되는 PEDF-유도 폴리펩티드의 용도{USE OF PEDF-DERIVED POLYPEPTIDES FOR PROMOTING MUSCLE OR TENDON REGENERATION OR ARTERIOGENESIS}

본 발명은 조직 손상의 치료에 관한 것이다. 구체적으로, 개시된 본 발명은 조직 손상의 치료에서 근육 또는 힘줄 재생 또는 동맥형성(arteriogenesis)을 촉진하기 위해 사용되는 PEDF-유도 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

근육 조직은 골격근, 심장 근육 또는 평활근으로 분류된다. 근육은 자체의 손상을 복구할 수 있다. 부상 후에 골격근은 손상된 근섬유를 제거하고 새로운 근섬유를 합성하기 위한 자발적 과정에 의해 복구된다. 그러나, 그런 자발적 조직 복구 메커니즘은 어떤 조직 손상시에는 없거나 조직의 전체 회복을 이루기에는 부적절하다. 예를 들어 어떤 병적 상태(예컨대 심각한 부상, 고령, 근육 폐기, 암 및 조직 허혈) 또는 유전적 결함(예컨대 근육 이영양증)은 치유 장애를 유발할 수 있다. 복구의 실패는 근육량의 영구적인 손실, 질병 진전 및 기능 결핍을 유발할 수 있다.

힘줄은 통상적으로 근육을 뼈에 연결시키는 섬유상 연결 조직의 질긴 띠이다. 힘줄 부상은 일반적으로 힘줄의 염증과 퇴행 또는 약화를 초래하며, 그것들은 궁극적으로 힘줄 파열을 유발한다. 힘줄 치유는 전형적으로 수 개월이 걸리는 길고 복잡한 과정이고, 약 1년 정도의 시간이 지나야 조직은 점차적으로 섬유상으로부터 흉터와 같이 변할 것이다. 그런 흉터 조직은 힘줄의 감소된 탄성 및 운동성과 증가된 부상 재발의 성향을 초래할 수 있다. 힘줄-유도 줄기세포(TSC) 및 골수-유도 간엽 줄기세포(BM-MSC)는 건염 병변의 제한된 자가 치유를 제공한다.

허혈 에피소드는 상당한 조직 손상의 또 다른 원인이다. 조직 손상을 유발하는 허혈성 에피소드는 심근 경색, 뇌졸중 및 다른 장애를 초래한다. 짧은 허혈 에피소드는 세포가 회복할 수 있는 경미한 손상을 유발하는 한편, 더 긴 허혈 에피소드는 비가역적인 세포 손상을 유발하여 세포 사망에 이르게 한다. 후자의 경우, 혈액 순환이 재수립된다 하더라고 손상된 세포의 총 기능 회복은 불가능하다. 나아가, 기능의 손실은 언제나 세포 사망에 선행한다.

현재로는 이들 상태에 대해 손상되고 비기능적인 조직을 치료하거나 재생을 용이하게 하는 치료가 없다. 그러므로 해당 기술분야에는 조직의 재생을 촉진하는 수단에 대한 요구가 있다. 구체적으로 손상된 조직 영역에서 또는 인접한 곳에서 혈류를 촉진하고 조직이 거의 정상적인 기능을 하게 하기 위하여 동맥형성을 촉진하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이 바람직할 것이다.

발명의 개요

다음의 내용은 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위하여 본 발명의 간단한 개요를 제공한다. 이 개요는 본 개시내용의 광범위한 개관이 아니며 본 발명의 핵심/결정적 요소를 확인하거나 본 발명의 범주를 묘사하지 않는다. 개요의 하나의 목적은 본원에 개시된 일부 개념을 나중에 제공되는 보다 상세한 설명의 서곡으로서 단순화된 형태로 제공하는 것이다.

본 발명은 적어도 색소 상피-유도 인자(PEDF)로부터 유도된 합성 펩티드가 대상의 근육 재생 또는 힘줄 재생뿐 아니라 동맥형성까지도 촉진할 수 있다는 발견을 토대로 한다. 그러므로 본 발명의 PEDF-유도 합성 펩티드는 조직 손상(특히 허혈과 관련된 조직 손상)을 치료하기 위한 제제 또는 의약으로서 유용하다.

따라서, 한 측면으로 본 발명은 대상의 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 합성 펩티드에 관련된다.

본 발명의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 20 내지 39개의 아미노산 잔기의 길이를 가지고, SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 또한 아미노산 서열은 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함하는데, 그것은 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 적어도 90% 동일함으로써, 합성 펩티드는 대상의 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하는 데 유용하다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 전가는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 동일하다. 그런 합성 펩티드의 비-제한적인 실례로는 각각 SEQ ID NO:1(39-량체), SEQ ID NO:2(34-량체), SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체), SEQ ID NO:6(20-량체), SEQ ID NO:8(MO 29-량체) 및 SEQ ID NO:9(MO 20-량체)의 아미노산 서열을 가지는 것들을 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 합성 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체) 또는 SEQ ID NO:6(20-량체) 중 어느 것이다.

다른 측면으로, 본 발명은 대상의 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 약학적 조성물에 관련된다. 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드를 포함하고, 그 합성 펩티드는 대상의 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하기에 충분히 효과적인 양으로 존재한다. 약학적 조성물은 또한 합성 펩티드에 대해 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 약학적으로 허용되는 담체는 중합체 물질로, 알긴산염, 젤라틴, 콜라겐 또는 폴리(락타이드-코-글리코라이드) 중 어느 것일 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 약 1 내지 100μM, 바람직하게는 약 10μM의 양으로 약학적 조성물에 존재한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 또는 대상의 손상된 영역에 인접한 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 방법에 관련된다. 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 방법은 대상의 치료 영역에 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예에 따르는 합성 펩티드의 치료적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하고, 이때 치료 영역은 손상된 영역에 인접하여 대상의 또는 대상의 손상된 영역에 인접한 근육 또는 힘줄 재생이 촉진된다.

임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예에 따르는 약학적 조성물 안에 제형된다. 실제로 약학적 조성물은 근육 내 주사를 통해 투여될 수 있다.

어떤 구체예에 따르면, 대상은 근육 부상, 근육 폐기, 근육 이영양증, 근위축성 측색 경화증, 힘줄 부상, 조직 허혈, 뇌 허혈, 하지 동맥 질환 또는 심근 경색으로 고생할 수 있고, 이것들은 손상된 영역의 근육 또는 힘줄 손상을 유발한다.

또한 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 동맥형성을 촉진하기 위한 합성 펩티드에 관련된다. 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류되는 어떠한 동물일 수 있다.

본 발명의 구체예들에 따르면, 합성 펩티드는 길이가 20 내지 39 아미노산 잔기이고, SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 또한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 대해 적어도 90% 동일한 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함하고, 그로써 합성 펩티드는 대상의 동맥형성을 촉진하는 데 유용하다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14와 동일하다. 그런 합성 펩티드의 비-제한적인 실례로는 각각 SEQ ID NO:1(39-량체), SEQ ID NO:2(34-량체), SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체), SEQ ID NO:6(20-량체), SEQ ID NO:8(MO 29-량체) 및 SEQ ID NO:9(MO 20-량체)의 아미노산 서열을 가지는 것들을 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 합성 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체) 또는 SEQ ID NO:6(20-량체) 중 어느 것이다.

다른 측면으로, 본 발명은 대상의 동맥형성을 촉진하기 위한 약학적 조성물에 관련된다. 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드를 포함하고, 그 합성 펩티드는 대상의 동맥형성을 촉진하기에 충분히 효과적인 양으로 존재한다. 약학적 조성물은 또한 합성 펩티드에 대해 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 약학적으로 허용되는 담체는 중합체 물질로, 알긴산염, 젤라틴, 콜라겐 또는 폴리(락타이드-코-글리코라이드) 중 어느 것일 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 약 1 내지 100μM, 바람직하게는 약 10μM의 양으로 약학적 조성물에 존재한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 또는 대상의 허혈 영역에 인접한 동맥형성을 촉진하기 위한 방법에 관련된다. 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류된 어떠한 동물일 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 방법은 대상의 치료 영역에 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예에 따르는 합성 펩티드의 치료적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하고, 이때 치료 영역은 허혈 영역에 인접하여 대상의 또는 대상의 허혈 영역에 인접한 동맥형성이 촉진된다.

임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예에 따르는 약학적 조성물 안에 제형된다. 실제로 약학적 조성물은 근육 내 주사를 통해 투여될 수 있다.

어떤 구체예에 따르면, 대상은 근육 부상, 근육 폐기, 근육 이영양증, 근위축성 측색 경화증, 힘줄 부상, 조직 허혈, 뇌 허혈, 하지 동맥 질환 또는 심근 경색으로 고생할 수 있고, 이것들은 허혈 영역에서 혈류가 방해되거나 차단되는 것을 유발한다.

본 발명의 많은 부수적인 특징 및 장점들은 첨부되는 도면과 관련하여 고려되는 다음의 상세한 설명을 참조로 더 잘 이해될 것이다.

본 특허 또는 출원 파일은 칼라로 그려진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 칼라 도면이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 비용이 요구되고 지불될 때 관청에 제공될 것이다.
본 설명은 첨부되는 도면에 비추어 다음의 상세한 설명을 판독하면 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 37℃의 PBS 중에서 알긴산염 겔로부터 PEDF 펩티드가 시험관 내 누적 방출되는 것을 도시한다. 결과는 세 개의 별도 실험에 대하여 평균±표준 편차로서 표시된다.
도 2는 4주의 시간 주기에 걸쳐 허혈성 뒷다리의 혈액 관류를 예시하는 대표적인 LDPI 영상을 나타낸다.
도 3은 블랭크 알긴산염 겔, 29-량체, 24-량체, 20-량체 또는 18-량체를 함유하는 지속성 방출 제형 및 29-량체를 함유하는 볼루스 제형으로 치료된 마우스 뒷다리의 혈액 관류 분석 결과를 도시한다. 그 결과는 세 개의 별도의 실험에 대하여 평균±표준 편차로서 표시된다; n≥6, * 블랭크 대조표준에 비하여 p<0.05.
도 4a는 Masson 3색(원래 배율, ×40)에 의해 염색된 경골 근육 표본으로부터의 대표적인 사진을 나타내고, 도 4b는 2 및 7주 동안의 뒷다리 허혈의 수술 유도 후 괴사 정도를 강조하기 위하여 보다 높은 배율에서 동일한 표본으로부터 얻은 대표적인 사진을 나타낸다(원래 배율, ×200).
도 5는 허혈 2주 후의 대 내전근 근육의 소동맥의 대표적인 면역염색 영상을 나타낸다. 소동맥은 항-α-SMA로 표지되었고(갈색) 핵은 헤마톡실린으로 표지되었다.
도 6은 기본 MCDB131 배지(미처리 대조표준) 또는 공지의 동맥형성 인자(FGF2 또는 VEGF), 대조표준 PEDF 펨티드(25-량체 또는 18-량체) 또는 본 발명의 구체예에 따르는 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체, 20-량체, Mo 29-량체 또는 Mo 20-량체)가 첨가된 배지에서 4일 동안 배양된 대동맥 고리 외식편의 대표적인 사진을 나타낸다.
도 7은 PEDF 펩티드(29-량체, 20-량체 및 18-량체)가 첨가된 배지에서 배양된 대동맥 고리로부터 생장한 혈관 평활근 세포(vSMC)를 보여주는 대표적인 이중-면역염색된 영상을 나타내는데, 여기서 내피 세포는 Alexa Fluor 594-표지된 아이소렉틴 B4에 의해 검출되었고(IB4; 적색; 좌측 패널), vSMC는 항-α-SMA로 표지되었다(녹색: 중단 패널). 병합된 영상들은 우측에 위치한다(노란색). 핵은 Hoechst 33258 염색으로 가시화되었다. 원래의 배율, ×400. 영상은 4개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 8은 부피바카인 주사 후 14일에 H&E에 의해 염색된 가자미근 표본으로부터의 대표적인 사진을 나타낸다.
도 9는 다양한 실험 조건의 동물로부터의 근육의 근섬유 크기 분포를 나타내는 다이어그램이다.
도 10은 부상 후 3주 후에 힘줄의 내부에서 재생하는 조직(↑)을 보여주는 대표적인 사진을 나타낸다. 원래의 배율, ×100.
도 11은 부상 후 3주 후에 아킬레스 건의 H&E-염색 구획의 대표적인 사진을 나타낸다. 원래의 배율, ×400; 축척 막대 = 50μM. 영상은 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 12는 부상 후 3주 후에 콜라겐 섬유를 강조하기 위해 Masson 3색에 의해 염색된 조직 구획의 대표적인 사진을 나타낸다. 별표(*)는 힘줄의 부상당하지 않은 영역을 나타낸다. 원래의 배율, ×400; 축척 막대 = 50μM. 영상은 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 13은 수술 후 3주 후에 재생하는 힘줄의 새롭게 형성된 유형 1 콜라겐(갈색)의 대표적인 면역염색된 사진을 나타낸다. 핵은 헤마톡실린으로 표지되었다. 박스 안의 영역은 아래의 보다 높은 배율에서 도시된다. 축척 막대 = 50μM. 영상은 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.
도 14는 본 발명의 작업 실시예에 따라 본 발명의 PEDF 펩티드((29-량체 및 20-량체)에 의한 테노모듈린(TNMD) 유전자의 증강된 발현 수준을 보여주는 대표적인 겔 전기영동 연상이다. 테노모듈린(TNMD) 유전자의 발현은 BM-MSC의 힘줄세포로의 분화를 가리킨다. 영상은 3개의 독립적인 실험을 나타낸다.

첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공되는 상세한 설명은 본 발명의 실례의 설명으로서 의도된 것이고 본 실례가 구성되거나 활용될 수 있는 유일한 형태를 나타내려는 의도는 아니다. 설명은 실례의 기능과 실례의 제조 및 작동 단계 순서를 나타낸다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서는 상이한 실례에 의해서도 이루어질 수 있다.

편리를 위해, 전체 출원(명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위를 포함하여)에 사용된 특정 용어들은 본원에서 포괄적이다. 본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 과학적이고 기술적인 전문용어들은 관련된 기술분야에서 숙련된 기술을 가진 사람에 의해 통상적으로 이해되고 사용되는 것과 같은 의미를 가질 것이다. 맥락에 의해 다르게 요구되지 않는 한, 단일 형태의 용어는 동일한 다수의 형태를 포함하고 다수의 용어는 단일한 것을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 구체적으로, 본원과 청구범위에서 사용되는 것과 같이 하나를 나타내는 용어들은 맥락이 명백하게 다른 것을 가리키지 않는 한 다수의 항목을 포함한다.

본 발명의 광범위한 범주를 나타내는 수치 범위와 매개변수들이 근사치임에도 불구하고, 특수한 실례에서 나타나는 수치는 가능한 정확한 것으로 기록된다. 그러나 어떠한 수치든지 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 오차로부터 필연적으로 유발되는 오류를 함유한다. 또한 본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 번위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 내에 있는 것을 의미한다. 또는 다르게는, 용어 "약"은 해당 기술분야의 숙련된 기술을 가진 사람이 인지할 때 평균의 허용되는 표준 오류 내에 있는 것을 의미한다. 작동/작업 실시예 이외에, 또는 다르게 표시되지 않는 한, 본원에서 개시된 본원의 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율, 예컨대 재료의 양, 시간의 기간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등은 모든 경우에 용어 "약"으로 변형되어 이해되어야 한다. 따라서 반대를 나타내지 않는 한, 본 발명 및 첨부된 청구범위에 나타낸 수로 표시된 매개변수들은 의도된 대로 변할 수 있는 근사치이다. 적어도 각각의 수로 표시된 매개변수는 적어도 기록된 많은 유의할만한 숫자를 고려하여, 그리고 통상적인 라운딩 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.

본원에서 사용되는 것과 같이, 용어 "펩티드"는 아미노산 잔기의 중합체를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "합성 펩티드"는 전체적으로 자연적으로 발생하는 단백질 분자를 포함하지 않는 펩티드를 의미한다. 펩티드는 그것이 화학적 합성, 재조합 유전자 기법 또는 전체 단백질의 단편화 등과 같은 기법을들 사용하여 인간이 개입함으로써 제조될 수 있을 때 "합성"이다. 본 명세서를 통털어 펩티드 내에 있는 어떠한 명시된 아미노산의 위치는 펩티드의 N-말단으로부터 시작하여 넘버링된다.

본원에서 사용되는 용어 "줄기 세포"는 특정 상황 하에서 실질적으로 분화하지 않고 증식하는 능력뿐 아니라 특별한 상황 하에서 보다 특수화되거나 분화된 표현형으로 분화하는 능력 또는 잠재력을 보유하는 세포를 말한다.

본원에서 사용되는 "증식하는" 및 "증식"은 세포 분할에 의해 집단의 세포의 수를 증가시키는 것을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "근육 세포"는 근육 조직에 기여하는 모든 세포를 말하고, 근아세포, 위성 세포, 근관 세포 및 근원섬유 조직을 포함한다. 본원에서 사용된 "근육 재생"은 근육 선구 세포로부터 새로운 근섬유가 형성되는 과정을 말한다. 손상된 영역에 있거나 인접한 근육의 재생은 손상된 영역에 있거나 인접한 근섬유의 수, 직경(크기), 습윤 중량 및/또는 단백질 함량의 증가에 의해 증명될 수 있다. 또한 근육 재생은 손상된 영역에 있거나 인접한 근육 세포 및/또는 위성 세포의 증식성 활성에 의해 모니터될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "힘줄"은 근육을 뼈에 연결시키는 밀접하게 쌓여진 콜라겐 섬유의 평행 배열로 구성된 섬유상 조직을 말한다. 손상된 힘줄의 치유는 느린 과정이고 보통 흔적 형성과 관련되고, 그것은 정상적이거나 원래의 힘줄 기능을 재개할 수 없는 결함이 있는 힘줄을 초래할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "힘줄 재생"은 유형 I 콜라겐이 형성되고, 새롭게 형성된 콜라겐 섬유가 부하가 걸리는 방향과 나란히 배열됨으로써 최소한의 흉터 형성을 초래하는 힘줄 치유 과정을 말한다. 손상된 영역에 있거나 인접한 힘줄의 재생은 손상된 영역에 있거나 인접한 조직화된 방향을 가지는 콜라겐 소섬유의 수의 증가에 의해 증명될 수 있다. 또한 힘줄 재생은 손상된 영역에 있거나 인접한 힘줄 줄기 세포의 증식 활성에 의해 모니터될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "동맥형성"은 "혈관형성"과 구별되어야 한다. 혈관형성은 그것에 의해 새로운 모세 혈관이 기존의 혈관으로부터 자라기 시작하는 과정이다. 이들 새롭게 형성된 모세관은 혈관 평활근 세포가 결핍되는 것을 인지하는 것이 중요하다. 따라서, 그것들은 손상되기 쉽고 파괴되기 쉽다. 이들 모세관은 맥관구조 리모델링 과정을 통과하지 않을 것이고, 그러므로 손상된 영역에 있거나 및/또는 인접하여 지속될 수 없거나 및/또는 적절한 순환을 복원할 수 없다. 모세관 생장(sprouting)과는 대조적으로, 동맥형성은 기존의 소동맥 연결로부터 내피 및 평활근 세포의 증식에 의해 동맥 또는 부행 동맥의 제자리 보충 및 확대를 말한다. 이들 새롭게 형성된 동맥 또는 부행 동맥은 염증의 손상된 또는 허혈성 조직 또는 부위에 충분한 혈액을 공급할 수 있는 천연 우회로를 구성할 기능성 동맥 네트워크(또는 부행 동맥)으로 발달할 것이다.

본원에서 사용된 용어 "허혈"은 산소 공급의 부족 및/또는 대사물의 비정상적인 축적으로 시달리는 어떠한 조직 및/또는 기관에서 일어날 수 있는 질환과 관련되고, 그것은 예를 들어 몇 가지 예를 들자면 조직, 예컨대 근육, 심장 또는 뇌에 불충분한 산소를 유도하는 아테롬성 동맥경화증, 재협착 병변, 빈혈, 뇌졸중 또는 폐색된 동맥에 의해 유발된 부적당한 관류로 인하여 산소 공급과 수요 사이의 불균형이 있을 때 일어난다. 그러나, 허혈은 상기 언급된 기관 또는 조직에 한정되지 않는데, 왜냐하면 그것은 모든 기관/조직에서 일어날 수 있기 때문이다.

용어 "촉진하다" 또는 "촉진하는"은 긍정적인 변경, 특히 실질적으로 유의미한 긍정적 변경을 나타내는 것을 의미한다. 긍정적 변경이란 참고 수준에 비교하여 적어도 10%의 증가를 의미한다.

본원에서 확인된 합성 폴리펩티드 서열과 관련하여 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 일렬 배열하고, 필요하다면 최대 % 서열 동일성을 이루기 위하여 갭을 도입한 후에 특이한 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되고, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존성 치환을 고려하지 않는다. 백분율 서열 동일성을 측정하는 목적을 위한 배열은 해당 기술분야의 숙련도 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 활용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 해당 기술분야의 숙련자들은 배열을 측정하기 위한 적절한 매개변수, 이를테면 비교하고자 하는 서열의 전체 길이에 대해 최대 배열을 이루기 위해 필요한 어떠한 알고리즘을 측정할 수 있다. 본원의 목적에 대해 두 개의 아미노산 서열 사이의 서열 비교를 Nation Center for Biotechnology Information(NCBI)에 의해 온라인으로 제공되는 컴퓨터 프로그램 Blastp(단백질-단백질 BLAST)에 의하여 수행될 수 있다. 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에 대한 백분율 아미노산 서열 동일성(다르게 표현하면 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 가지는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현할 수 있다)은 다음과 같은 식에 의해 계산된다:

상기 식에서, X는 서열 배열 프로그램 BLAST에 의해 A와 B의 그 프로그램의 배열에서 동일한 매치로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 어느 것이 더 짧든지간에 A 또는 B의 총 아미노산 잔기의 수이다.

본원에서 사용된 구절 "약학적으로 허용되는 담체"는 약학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 대상 제제를 한 기관으로부터 또는 신체의 일부로부터 또 다른 기관 또는 신체의 다른 부분에 운반 또는 수송하는 데 포함된 캡슐화 물질을 의미한다. 각 담체는 제형 중의 다른 성분들과 부합한다는 의미에서 "허용될 수 있는" 것이어야 한다. 담체는 고체, 반-고체 또는 액체 희석제, 크림 또는 캡슐의 형태일 수 있다.

본원에서 용어 "치료" 및 "치료하는"은 일반적으로 원하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미하기 위해 사용된다. 바람직하게는 그 효과는 근육 손상, 힘줄 손상 또는 허혈을 부분적으로 또는 완전하게 치료하는 측면에서 치료적이다. 본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은 의학적 질환, 질환의 증상, 그 질환에 이차적인 질병 또는 장애, 또는 그 질환에 대한 성향을 가지고 있는 대상에게, 의료적 질환, 질환의 증상, 그 질환에 이차적인 질병 또는 장애, 또는 특별한 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 또는 그것보다 많은 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전하게 경감, 개선, 완화, 개시의 지연, 진전의 억제, 심각성의 감소 및/또는 발생의 감소를 목적으로, 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 말한다. 치료는 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리학의 발달 위험을 감소시킬 목적에 대해 질병, 장애 및/또는 질환의 신호를 나타내지 않는 대상 또는 단지 질병, 장애 및/또는 질환의 초기 신호만을 나타내는 대상에게 투여될 수 있다. 치료는 일반적으로 만약 하나 또는 그것보다 많은 증상 또는 임상적 마커가 그 용어가 본원에서 정의된 것과 같이 감소된다면 "효과적"이다. 또는 다르게는, 치료는 만약 질병의 진전이 감소되거나 정지된다면 "효과적"이다. 즉, "치료"는 단순히 증상의 개선 또는 질병의 마커의 감소뿐 아니라, 치료가 없을 때에도 기대될 수 있을 증상의 진전 또는 악화의 중단 또는 해결을 포함한다. 유익한 또는 원하는 임상적 결과는 검출가능하거나 그렇지 않거나 간에 하나 또는 그것보다 많은 증상(들)의 경감, 질병의 정도의 축소, 질병의 안정화된(즉 악화되지 않은) 상태, 질병 진전의 지연 또는 해결, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 차도(부분적이거나 총체적이거나)를 포함하며, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

본원에서 사용된 용어 "효과적인 양"은 원하는 반응을 생성하기에 충분한 성분의 양을 말한다. 본원에서 사용된 용어 "치료적으로 효과적인 양"은 상기에서 정의된 것과 같은 원하는 "효과적인 치료"를 유발하기 위한 약학적 조성물의 치료적 제제의 양을 말한다. 구체적인 치료적으로 효과적인 양은 치료되는 특별한 질환, 환자의 신체적 상태(예컨대 환자의 체중, 연령 또는 성별), 치료되는 포유류 또는 동물의 유형, 치료 기간, 공존하는 치료법(만약 있다면)의 본질 및 사용되는 특이한 제형과 같은 인자들에 따라 달라질 것이다. 치료적으로 효과적인 양은 또한 화합물 또는 조성물의 어떠한 독성 또는 유해한 효과보다 치료적으로 효과적인 효과가 훨씬 더 크다.

용어 "대상"은 본 발명의 합성 펩티드, 조성물 및/또는 방법으로 치료가능한 인간 종을 포함한 포유류를 말한다. 용어 "대상"은 한 가지 성이 구체적으로 표시되지 않는 한 남성과 여성 둘 다를 말한다.

색소 상피-유도 인자(PEDF)는 항-혈관형성, 항-종양형성 및 신경영양성 기능을 가지는 다중기능성의 분비된 단백질이다. 인간 PEDF 단백질(SEQ ID NO:14)은 대략 50kDa 크기와 418 아미노산 길이의 분비된 단백질이다. PEDF의 34-량체 단편(잔기 44 내지 77) 및 44-량체(78 내지 121)는 각각 항-혈관형성 및 신경영양성 특성을 가지는 것으로 확인되었다.

본 발명은 적어도 PEDF로부터 유도된 합성 펩티드가 대상의 근육 또는 힘줄 조직의 재생 및 동맥형성을 촉진할 수 있다는 발견을 토대로 한다. 특히, 본 발명은 먼저 PEDF-유도 펩티드의 국소 전달과 손상 및/또는 허혈로 고통받는 근육 또는 힘줄 조직의 치유 또는 허혈성 영역에 있거나 인접한 (측부) 동맥의 형성 사이의 관련을 확인하는 것이다. 본 발명의 또 다른 진보적 특징은 합성 펩티드가 전체-길이 PEDF보다 훨씬 짧고(최대 39 아미노산 잔기), 그로써 높은 제조 비용, 낮은 생체 내 활용성 및 불량한 약물동역학을 포함하여, 종래의 단백질 약물의 임상적 사용과 관련된 한계점들을 극복한다는 데에 있다. 따라서, 본 발명의 합성 펩티드는 허혈로 고생하는 조직 또는 기관뿐 아니라 근육 또는 힘줄 손상을 치료하기에 유용하다.

그러므로, 한 측면으로 본 발명은 대상의 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 합성 펩티드에 관련된다. 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 동맥형성을 촉진하기 위한 합성 펩티드에 관련된다. 이들 두 가지 측면 중 하나 또는 둘 다에 적용가능한 구체예들은 아래에서 논의된다.

본 발명의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 길이가 20 내지 39 아미노산 잔기이고, LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 예를 들어 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1과 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 적어도 90% 동일한 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함한다. 구체적으로, 20개의 연속적인 아미노산 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30과 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.

한 구체예에서, 합성 펩티드는 길이가 39 아미노산인 SEQ ID NO:1의 서열을 가진다. 이 합성 펩티드는 아래에서 설명되는 39-량체로서 언급된다. 이 39-량체 펩티드는 인간 PEDF의 잔기 83 내지 121에 해당하고, 그러므로 공지된 PEDF 44-량체(PEDF의 잔기 78 내지 121에 해당함)로부터 유도된 짧은 변이체이다.

본 발명자들에 의해 수행된 선행 실험, 예컨대 본원에 그것의 전체 내용이 참조로 포함되는 공동-계류중인 출원 US 13/428,996에 개시된 것들 및 아래에 제공되는 실험들은 39-량체로부터 유도된 여러 개의 짧은 합성 PEDF 펩티드가 대상의 근육 또는 힘줄 재생 및/또는 동맥형성을 촉진할 수 있음을 드러낸다.

예를 들어 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험을 토대로, ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:2)의 서열을 가지는 34-량체의 합성 펩티드가 대상의 근육 또는 힘줄 재생 및/도는 동맥형성을 촉진하는 데 효과적이다. 이 34-량체의 펩티드는 인간 PEDF의 잔기 88 내지 121에 해당한다. 상기에서제공된 어떠한 두 개의 주어진 서열 사이의 서열 동일성의 백분율을 추정하기 위한 방법에 따르면, 34-량체는 39-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 34-량체의 6 내지 25 아미노산 잔기는 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 대해 100% 아미노산 서열 동일성을 가진다.

추가로, 아래의 다양한 실시예에 따르면, SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT (SEQ ID NO:3)의 서열을 가지는 29-량체의 합성 펩티드는 대상의 동맥형성뿐 아니라 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하는데 효과적인 것으로 확인되었다. 이 29-량체 펩티드는 39-량체에 대해 100% 아미노산 서열 동일성을 가지는 인간 PEDF의 잔기 93 내지 121에 해당한다. 또한 29-량체의 첫 번째부터 20번째의 아미노산 잔기는 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 대해 100% 아미노산 서열 동일성을 가진다.

어떤 실시예에서, 24-량체는 대상의 힘줄 재생 및 동맥형성을 촉진하는데 효과적인 것으로 확인되었다. 24-량체는 SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP(SEQ ID NO:5)의 서열을 가지고, 그것은 인간 PEDF의 잔기 93 내지 116에 해당한다. 이 24-량체는 39-량체에 대해 100% 아미노산 서열 동일성을 가지는데, 이때 그것의 처음 20개의 아미노산 잔기는 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 대해 100% 아미노산 서열 동일성을 가진다.

다른 실례에서, 20-량체는 대상의 동맥형성뿐 아니라 근육 또는 힘줄 재생을 촉진할 수 있는 것으로 수립되었다. 20-량체는 SLGAEQRTESIIHRALYYDL(SEQ ID NO:6)의 서열을 가지며, 그것은 인간 PEDF의 잔기 93 내지 112에 해당한다. 이 20-량체 펩티드는 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 완전히 동일하고(100% 아미노산 서열 동일성), 39-량체에 대해 100% 아미노산 서열 동일성을 가진다.

마우스 PEDF로부터 유도된 두 개의 합성 펩티드가 또한 선행 출원과 본 출원 둘 다에 개시된 실험을 토대로 대상의 근육 또는 힘줄 재생 및/또는 동맥형성을 촉진할 수 있다. 첫 번째 마우스-유도 펩티드는 본 발명에서 "Mo 29-량체"로서 언급된다. Mo 29-량체는 SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST(SEQ ID NO:8)의 서열을 가지며, 그것은 39-량체에 대해 83%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 그것의 처음 20개의 아미노산 잔기는 39-량체의 11 내지 30 아미노산 잔기에 대해 90%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 또 다른 마우스-유도 펩티드 Mo 20-량체는 SLGAEHRTESVIHRALYYDL(SEQ ID NO:9)의 서열을 가진다. Mo 20-량체는 39-량체 또는 39-량체의 11 내지 30 아미노산 잔기 중 어느 하나에 대해 90%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

임의로, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 동일한 4개의 연속적인 잔기를 포함한다. SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14(즉 SLGA)는 짧은 PEDF 펩티드의 생물학적 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 담당하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 아래에 제공되는 다양한 실시예에 따르면, SLGA 잔기가 없는 18-량체 펩티드(EQRTESIIHRALYYDLIS; SEQ ID NO:7)는 대상에서 어떠한 동맥형성도 유도하지 못한다. 또한 선행 출원 및 본 출원에 개시된 실험들을 토대로, 25-량체 펩티드(EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT; SEQ ID NO:4)는 대상의 근육 또는 힘줄 재생 및/또는 동맥형성을 촉진하는 데 비효과적인 것이 시사된다.

본 발명의 합성 펩티드는 알파-아미노 기의 t-BOC 또는 FMOC 보호와 같은 통상적으로 사용되는 방법들에 의해 합성될 수 있다. 두 가지 방법 모두 단계식 합성을 포함함으로써 단일 아미노산은 펩티드의 C 말단으로부터 시작하여 각 단계에서 첨가된다. 본 발명의 펩티드는 또한 잘 알려져 있는 고체상 펩티드 합성 방법에 의해 합성될 수 있다.

39-량체와 관련하여 보존성 변화를 포함하는 다른 합성 펩티드가 또한 고려된다. 본원에서 사용되는 용어 "보존성 변화"는 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 한 아미노산 잔기가 대체되는 것을 나타낸다. 보존성 변화의 실례로는 아이소로이신, 발린, 로이신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기의 다른 것에 대한 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 다른 것에 대한 치환, 예컨대 아르기닌의 라이신에 대한 치환, 글루탐산의 아스파트산에 대한 치환 또는 글루타민의 아스파라긴에 대한 치환 등을 포함한다. 용어 "보존성 변화"는 또한 치환되지 않은 원래의 아미노산 대신에 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함하며, 단 치환된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체 또한 치환되지 않은 폴리펩티드와 면역학적으로 반응해야 한다.

상기 언급된 구체예에 따르는 합성 펩티드는 본 발명의 다른 측면에 속하는, 대상의 근육 또는 힘줄 재생 및/또는 동맥형성을 촉진하기 위한 약학적 조성물로 제형될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드를 포함하고, 그 합성 펩티드는 대상의 근육 또는 힘줄 재생 및/또는 동맥형성을 촉진하기에 충분히 효과적인 양으로 존재한다. 약학적 조성물은 또한 합성 펩티드에 대해 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

합성 펩티드와 함께 사용될 수 있는 약학적으로 허용되는 담체의 선택은 기본적으로 약학적 조성물이 투여될 방법에 의해 결정된다. 본 발명의 하나의 임의의 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 근육 내 주사를 통해 국소 투여될 수 있다. 이 경우에 합성 펩티드는 바람직하게는 수용체의 혈액과 등장성인 멸균 수용액과 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 제형될 수 있다. 그런 제형은 고체 활성 성분을 생리적으로 부합하는 물질, 예컨대 염화나트륨, 글리신 등을 함유하고 수용액을 생성하기 위해 생리적 조건과 부합하는 완충된 pH를 가지며, 상기 용액을 멸균성으로 만드는 물에 용해 또는 현탁시킴으로써 제조될 수 있다.

여전히 임의로, 합성 펩티드는 치료의 더 연장된 치료 작용을 보장하기 위해 지속성 방출 형태로 제형될 수 있다. 약물 방출을 연장하기에 적당한 여러 중합체 물질이 있는데, 그것의 실례로는 알긴산염, 젤라틴, 콜라겐 및 폴리(락타이드-코-글리코라이드)가 있고, 그것들에 한정되지 않는다.

본 발명의 어떤 작업 실시예에 따르면, 본 발명의 합성 펩티드는 교차-결합된 알긴산염 겔의 메트릭스에 삽입되고, 합성 펩티드의 최종 농도는 약 1 내지 100μM, 바람직하게는 약 10μM이다. 예를 들면 합성 펩티드의 농도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100μM이다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 해당 기술분야의 숙련자들에게 공지된 다양한 첨가제를 포함할 수 있다. 예를 들어 상대적으로 소량의 알코올을 포함하는 용매는 특정 약물 물질을 용해시키기 위해 사용될 수 있다. 다름 임의의 약제학적으로 허용되는 첨가제는 불투명체, 항산화제, 방향제, 착색제, 겔화제, 농축제, 안정화제, 계면활성제 등을 포함한다. 다른 제제, 예컨대 보관 시에 부패를 방지하기 위한, 즉 효모 및 곰팡이와 같은 미생물의 성장을 억제하기 위한 항미생물제가 첨가될 수 있다. 침투 증강제 및/또는 염증-완화 첨가제가 또한 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 손상된 영역에 있거나 인접한 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 방법에 관련되며; 여전히 또 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 허혈성 영역에 있거나 인접한 동맥형성을 촉진하기 위한 방법에 관련된다. 어느 하나의 구체예에서, 대상은 포유류로서 분류된 어떠한 동물, 이를테면 인간일 수 있다. 이들 두 측면 중 하나 또는 둘 다에 적용할 수 있는 구체예는 아래에서 논의된다.

한 구체예에서, 대상의 손상된 영역에 있거나 인접한 근육 또는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 방법은 대상의 치료 영역에 본 발명의 합성 펩티드의 치료적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하고, 이때 치료 영역은 손상된 영역에 인접하여서 대상의 손산된 영역에 있거나 인접한 근육 또는 힘줄의 재생이 촉진된다.

또 다른 구체예에서, 대상의 허혈성 영역에 있거나 인접한 동맥형성을 촉진하기 위한 방법은 대상의 치료 영역에 본 발명의 합성 펩티드의 치료적으로 효과적인 양을 투여하는 것을 포함하며, 이때 치료 영역은 허혈성 영역에 인접하여서 대상의 허혈성 영역에 있거나 인접한 동맥형성이 촉진된다.

임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예에 따르른 약학적 조성물로 제형된다. 실제로 약학적 조성물은 근육 내 주사를 통해 투여될 수 있다.

어떤 구체예에 따르면 대상은 근육 부상, 근육 폐기, 근육 이영양증, 근위축성 측색 경화증, 힘줄 부상, 조직 허혈, 뇌 허혈, 하지 동맥 질환 또는 심근 경색으로 고생할 수 있고, 이것들은 허혈 영역에서 혈류가 방해되거나 차단되는 것을 유발한다.

다음의 실시예는 본 발명의 특정 측면들을 설명하고 본 발명을 실시하는 데 있어 해당 기술분야의 숙련자들을 보조하기 위해 제공된다. 이들 실시예는 어떤 방식으로든지 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 더 이상의 설명 없이 해당 기술분야의 숙련자는 본원의 설명을 토대로, 본 발명을 충분한 정도로 활용할 수 있는 것으로 여겨진다. 본원에 인용된 모든 공보는 본원에 그것의 전체 내용이 참조로 포함된다.

실시예

재료 및 방법

재료

둘베코 변형 이글스 배지(DMEM), 우태아 혈청(FBS), 0.25% 트립신, 항-BrdU 항체, MCDB131 배지, TRIzol 및 다이나비드(Dynabeads)를 Invitrogen(Carlsbad, CA)으로부터 구매하였다. 초고순도의 알긴산염(6000 Da), 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 우태아 혈청(BSA), 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU), Hoechst 33258 염료 및 Masson 3색을 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)로부터 구하였다. 콜라게나제 유형 I 및 디스파제 II를 Roche(Indianapolis, IN)로부터 얻었다. 모든 형광 염료-포합된 이차 항체를 BioLegend(San Diego, CA)로부터 구입하였다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염료를 량체ck(Rayway, NJ, USA)로부터 구입하였다. 항-콜라겐 1A1 항체를 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)로부터 얻었다. 매트리겔을 BD Biosciences(Bedford, MA)로부터 구입하였다. 항-알파-평활근 액틴(항-α-SMA) 항체(ab5694) 및 항-뉴클레오스테민 항체를 Abcam(Cambridge, MA)으로부터 얻었다. 항-Pax7 항체(GTX62311)를 GeneTex(Taipei, Taiwan)로부터 얻었다. 아이소렉틴 B4(IB4)-Alexa Fluor 568을 Molecular Probes(Eugene, OR)로부터 얻었다.

29-량체(SEQ ID No:3), 25-량체(SEQ ID No:4), 24-량체(SEQ ID No:5), 20-량체(SEQ ID No:6), 18-량체(SEQ ID No:7), MO 29-량체(SEQ ID No:8) 및 MO 20-량체(SEQ ID No:9)를 포함하여 짧은 합성 PEDF 펩티드를 합성하고 안정성을 위해 NH₂ 말단에서 아세틸화하고 COOH 말단에서 아미드화하여 변형시킨 후 필요에 따라 GenScript (Piscataway, NJ)에서 질량 분석에 의해 특성확인하였다(>95% 순도).

본 발명의 구체예에서 사용된 모든 동물은 온도 제어 하에(24 내지 25℃) 12:12시간의 명암 주기로 동물 방에서 하우징하였다. 표준 실험실 식사 및 수돗물은 임의로 제공하였다. 실험 과정을 Mackay Memorial Hospital Review Board(New Taipei City, Taiwan, R.O.C.)에 의해 승인받았고, 국제 동물 복지 규정에 부합하게 수행하였다.

PEDF 펩티드/ 알긴산염 겔 제형 및 볼루스 제형

각각의 PEDF-유도된 짧은 합성 펩티드(29-량체, 25-량체, 24-량체, 20-량체, 18-량체, MO 29-량체 또는 MO 20-량체; 이하 PEDF 펩티드)를 스톡으로서 DMSO(5mM)에 재구성하였다. 그런 다음 초고순도의 알긴산염을 스톡과 혼합하여 10μM의 최종 농도로 PEDF를 포함하는 2% wt/vol의 알긴산염 용액을 얻었다. 그런 다음 알긴산염 용액을 멤브레인 필터(기공 크기, 0.22㎛)에 의해 여과하고, 여과된 황산 칼슘(0.21g의 CaSO₄/dH2O mL)과 25:1의 비율로 혼합하였다(여과된 알긴산염 용액 1mL당 40μL의 CaSO₄). 그 혼합물을 RT에 1시간 동안 방치하여 알긴산염의 교차 결합을 허용하였다. 그 결과의 지속성 방출형 제형을 근육 또는 힘줄 손상 및 허혈의 치료에 사용하였다.

볼루스 전달을 위해, 10μM의 최종 PEDF 농도를 5mM 스톡 용액으로부터의 연속 희석을 수행함으로써 사용하였다.

조직학, 면역조직화학 및 정량

박근, 큰 모음근, 비장근 및 경골 근육을 4% 파라폼알데하이드에 고정시키고, 등급별 에탄올 시리즈로 탈수한 후, 파라핀 처리하였다. 고정된 샘플을 자일렌에서 파라핀 제거하고, 등급별 에탄올 시리즈로 재탈수하였다. 조직을 5-㎛ 단편으로 슬라이스하였다. 일반적인 조직학을 H&E 염료를 사용하여 수행하였다.

파라핀 제거된 조직 구획을 10% 염소 혈청으로 1시간 동안 차단하였다. 염색을 BrdU (1:50 희석; GTX42641) 또는 유형 I 콜라겐 1A1(1:50 희석)에 대한 일차 항체를 사용하여 밤새 4℃에서 시행한 후, 적절한 과산화효소-표지된 당나귀 면역글로불린과 함께 30분 동안 인큐베이션한 다음 크로모겐 기질(3,3'-다이아미노벤지딘)과 함께 2분 동안 인큐베이션한 후 헤마톡실린으로 대비염색하였다. 정량을 Nikon Eclipse 80i 광현미경을 사용하여 캡춰된 고품질 영상(1208×960 픽셀)을 토대로 추정하였다.

근섬유 크기를 H&E-염색된 근육 횡단면 상에서 측정하고 반대의 입자 경계선에서 평행 탄젠트의 최소 거리를 사용하여 정량하였다(최소 "Feret 직경"). 사진을 Nikon Eclipse 80i 광현미경을 사용하여 캡춰하고, 최소 Feret 직경을 Image-Pro Plus 4.5.1 소프트웨어(Media Cybernetics)를 사용하여 측정하였다. 5㎛의 각각의 섬유 Feret 클래스의 섬유의 수의 표준화는 각 사진의 근섬유의 총 수를 토대로 하였다.

중심이 핵화된 근섬유의 수를 확인하기 위하여, 구획들을 H&E로 염색한 후 상기에서 기술한 것과 같이 사진촬영하였다. 적어도 100개의 염색된 섬유를 각각의 사진으로부터 무작위로 선택하였다. 근섬유는 만약 하나 또는 그것보다 많은 핵이 섬유의 말단에 위치하지 않았다면 중심이 핵화된 것으로 판단하였다. 데이터를 계수된 근섬유의 총 수의 %로서 표시하였다. 그 결과를 근육 구획당 6 구획으로부터, 그리고 각 그룹당 10마리 마우스로부터 평가하였다.

파라핀 제거된 힘줄 조직 구획을 제조업체의 지시를 따라 Masson 3색으로 염색하였다. 콜라겐 영역의 반-정량 분석을 위해, 각 슬라이드로부터 10개의 필드를 광현미경 하에 무작위로 선택하고, 횡단면(mm²/mm²)의 무상 힘줄 영역당 복원 영역을 Image-Pro Plus 4.5.1 시스템을 사용하여 측정하였다.

힘줄 줄기세포의 분리 및 배양

뉴질랜드 백색 토끼(6 내지 8개월, 3.0 내지 4.0kg)를 이 연구에 사용하였다. 토끼의 뼈 부착물을 통해 절단함으로써 아킬레스건을 토끼로부터 제거하였다. 건초를 벗겨내고 힘줄의 핵심 부분을 작은 단편으로 갈았다. 그런 다음 각 100mg의 단편을 1ml의 둘베코 변형 이글 배지(DMED-높은 글루코스)에 3mg/mL의 유형 I 콜라게나제 및 4mg/mL의 디스파제를 함유하고 있는 용액에 37℃에서 2시간 동안 소화시켰다. 그 결과의 세포 현탁액을 1,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 세포 펠릿을 얻은 후 10%의 열 비활성화된 우태아 혈청(FBS), 100μM의 2-머캅토에탄올 및 100U/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM으로 이루어진 성장 배지에 재현탁시켰다. 계대를 위해, 집밀도에 가까운 세포를 0.25%의 트립신으로 수확한 후 1×10⁵의 하위배양된 세포를 추가로 배지에서 배양하였다.

TSC 증식 분석

계대 4에서 TSC를 6-웰 플레이트의 젤라틴-코팅된 슬라이드에 2×105 세포/웰의 밀도로 시딩하고 성장 배지(DMEM + 10% FBS)에서 24시간 동안 배양한 후 5% FBS 단독(대조표준 그룹) 또는 5% FBS와 추가의 50nM PEDF-유도 펩티드(즉 29-량체, 24-량체, 20-량체, 18-량체, Mo 29-량체 또는 Mo 20-량체)가 첨가된 기본 성장 배지로 24시간 동안 교체하였다. BrdU 표지화 분석을 위해, BrdU(최종 농도, 10μM)를 4시간 동안 배양액에 첨가하였다. 4% 파라폼알데하이드로 고정한 후, 세포를 저온 메탄올에 2분 동안 노출한 후, 1N HCl로 RT에서 1시간 동안 처리한 다음 면역형광을 수행하였다. 계대 4 TSC를 뉴클레오스테민과 유형 I 콜라겐의 면역세포화학에 의해 측정하였다. 거의 모든 확대된 TSC는 뉴클레오스테민 및 유형 I 콜라겐-이중 포지티브 세포였다.

DNA 합성의 생체 내 검출

세포 팽창의 검출을 위해 BrdU를 DMSO에 스톡으로서 재구성하였다(80mM). 90㎕의 PBS와 혼합한 10㎕의 BrdU를 마우스에 복강 내 주사하고 16시간 후에 안락사시켰다. 또한 350㎕의 PBS와 혼합한 150㎕의 BrdU를 쥐에 복강 내 주사하고 16시간 후에 안락사시켰다. DNA 합성을 항-BrdU 항체를 사용하여 BrdU 표지화에 의해 평가하였다.

면역형광 분석

파라핀 제거된 조직 단편 또는 4% 파라폼알데하이드 고정된 토끼 힘줄 줄기 세포(TSC)를 10%의 염소 혈청 및 5% BSA로 1시간 동안 차단하였다. 이중 염색을 α-SMA에 대한 일차 항체(1:100 희석), IB4(5㎍/ml), Pax7(1:100 희석), 뉴클레오스테민(1:100 희석) 및 유형 I 콜라겐 1A1(1:50)을 사용하여 37℃에서 2시간 동안 수행한 후, 적절한 로다민- 또는 FITC-포합된 당나귀 IgG와 함께 1시간 동안 RT에서 인큐베이션하였다. 핵은 Hoechst 33258로 7분 동안 대비염색함으로써 위치를 찾았다. 영상을 CCD 카메라가 부착된 Zeiss 에피형광 현미경을 사용하여 캡춰하였다.

소동맥 밀도(혈관의 전체 주변을 둘러싸고 있는 α-SMA 포지티브 세포)를 측정하고, 영상을 각 샘플 중의 큰 모음근 근육의 10개의 무작위로 선택된 영역으로부터 취하고(200×배율), 블라인드 정량을 삼중으로 각 구획 내에서 수동으로 계수함으로써 수행하였다; 5개의 구획으로부터의 값의 평균을 구하고 mm²당 소동맥 밀도로서 표시하였다.

골수-유도된 간엽 줄기 세포( BM - MSC ) 분리, 세포 배양 및 처리

수컷 스프라그-도울리 쥐(300 내지 450g)의 대퇴부로부터 일차 쥐 BM-MSC를 분리하였다. 대퇴부를 무균 제거하고 고착하는 조직이 없게 절개한 후, 골수강을 DMEM 배지를 주사함으로써 플러싱하였다. 수집한 골수 세포를 100×15-mm 페트리 접시에서 10% FBS, 100U/ml의 페니실린 및 100㎍/ml의 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 2주 동안 5% CO₂, 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지를 매 2 내지 3일마다 교체하였다. 계대를 위해, 집밀도에 가까운 세포를 0.25% 트립신에 의해 분리한 후, 2×10⁵개의 하위배양된 세포를 6-웰 플레이트의 웰에 시딩한 후, 추가로 10% FBS-DMEM에서 배양하였다. 처리 전에 세포를 12시간 동안 1% FBS가 첨가된 DMEM에서 굶긴 후 새로운 1%의 FBS-DMEM 중의 50nM의 PEDF-유도 펩티드(29-량체 또는 20-량체)로 24 또는 48시간 동안 처리하였다.

RNA 추출 및 역전사 -중합효소 사슬 반응

총 RNA를 TRIzol을 사용하여 세포로부터 추출하고, RNase-free DNase I(Qiagen, Santa Clarita, CA)로 처리하여 게놈 DNA를 제거한 다음 RNA 정제 키트(Dynabeads)를 사용하여 정제하였다. BM-MSC로부터 회수한 총 RNA 중 1㎍을 0.25㎍의 무작위 프라이머 및 0.8mM의 dNTP를 함유하고 있는 20㎕의 반응 완충액 중에서 200 유닛의 확대된 역전사효소(Roche, Mannheim, Germany)에 의해 42℃에서 1시간 동안 cDNA로 역전사하였다. 2㎕의 cDNA를 후속되는 PCR 반응에서 주형으로서 사용하였다.

PCR을 15㎕의 EconoTaq® PLUS GREEN 2x 마스터 믹스(Lucigen® Corp.), 1μM의 각 프라이머 및 2㎕의 주형 DNA를 함유하고 있는 30㎕의 반응 부피를 사용하여 수행하였다. cDNA를 18 내지 22 주기의 증폭 반응으로 합성하였다(변성 20초, 94℃; 아닐링 30초, 57℃; 및 중합반응 40초, 72℃). 각 프라이머 세트에 대한 주기 수는 증폭의 선형 범위에 있도록 수립하였따. 쥐 테노모듈린 유전자(TNMD; 승인 번호: NM_022290)의 증폭에 대한 프라이머 세트는 AGAATGAGCAATGGGTGGTC(SEQ ID No:10)의 전방 프라이머와 CTCGACCTCCTTGGTAGCAG(SEQ ID No:11)의 역 프라이머를 포함하였고, 약 240 bp의 PCR 생성물을 관찰하였다. 쥐 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH; 승인 번호:X02231.1) 유전자의 분석을 발현 수준의 표준화를 위한 하우스키핑 유전자로서 사용하였다. GAPDH 유전자의 증폭을 위해 AGACAGCCGCATCTTCTTGT(SEQ ID No:12)의 전방 프라이머와 CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT(SEQ ID No:13)의 역 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 사용하였고, 약 207 bp의 PCR 생성물을 관찰하였다.

PCR 생성물을 에티듐 브로마이드를 함유하는 2% 아가로스 겔에서 전기영동하였고 UV 조명에 의해 가시화하였다. PCR 생성물의 세기를 FUJI LAS-3000 시스템 및 Multi Gauge Ver. 1.01 소프트웨어(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 농도계를 이용하여 정량하였다.

통계학

결과를 평균±평균의 표준 오류로서 표시하였다(SEM). 1-방식 ANOVA를 통계적 비교를 위해 사용하였다. P<0.05는 다른 표시가 없는 한 유의미한 것으로 간주하였다.

실시예 1

알긴산염 겔로부터 PEDF 펩티드의 지속성 방출

29-량체 및 20-량체의 방출 동역학을 측정하기 위하여, 100㎍의 FITC-포합된 PEDF 펩티드를 100μL의 알긴산염 용액과 혼합한 후, 하이드로겔을 "재료 및 방법" 단원에서 설명한 것과 같이 제조하였다. 그런 다음, 100mg의 하이드로겔은 미세원심분리 튜브에 1.5ml의 PBS(pH 7.4)중에서 인큐베이션하고, 6-일의 기간에 걸쳐 37℃에서 궤도 진동 인큐베이터에 넣어두었다. 튜브를 각각의 예정된 시간 지점에 원심분리한 후 200μL의 PBS를 튜브에 첨가하여 따라 버린 상층액을 대신하였다. ㅅ수집한 상층액에 존재하는 TC-포합된 PEDF 펩티드의 농도를 96-웰 방식의 형광계를 사용하여 측정하였다. 공지된 비-캡슐화된 FITC-펩티드를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 삼중 데이터를 분석에 사용하였다.

도 1에 요약한 것과 같은 분석의 결과는 삽입된 PEDF 펩티드가 6-일의 기간에 걸쳐 지속적인 방식으로 방출되었음을 나타냈다. 구체적으로, 대략 48%의 29-량체 및 20-량체 펩티드가 24시간 후에 알긴산염 겔 매트릭스에 남아있었다. 29-량체 펩티드의 대부분(90%)은 처음 4일 이내에 방출되었고, 그 후에 방출 속도는 상당히 감소됨으로써 누적 방출 곡선의 평원을 초래하였다. 20-량체 펩티드는 약간 더 빠른 속도로 방출되어 로딩된 20-량체의 약 90%가 처음 3일 내에 방출되었다.

실시예 2

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 허혈성 손상을 감소시킨다

허혈성 근육 부상은 전형적으로 조직과 기능의 괴사 및 손실을 유도한다. 그러므로 허혈성 동물 모델을 본 실시예에서 사용하여 PEDF 펩티드/알긴산염 제형(본원에서 "지속성-방출 제형")의 국소 전달이 조직 또는 기관 손상의 경우에 조직 또는 기관 기능의 회복을 촉진할 수 있는 가능성을 조사하였다. 허혈성 손상과 관련된 다양한 질환, 예컨대 사지 관류, 조직 괴사, 동맥형성 및 새로운 혈관 생장을 다음과 같이 실시예에서 분석하였다.

6주령의 암컷 C57B/6 야생형 마우스들을 졸레틸(6mg/kg)과 자일라진(3mg/kg)의 혼합물의 복강 내 주사에 의해 마취시켰다. 털을 제모 크림으로 후사분체로부터 제거하였다. 뒷다리 허혈을 수립하기 위하여, 한쪽의 외부 장골과 대퇴부 동맥 및 정맥을 결찰하고, 절단하고, 절제하였다. 수술 후에 마우스들을 무작위로 여러 실험그룹으로 나누고(n=6, 각 그룹에 대해) 다음과 같이 치료하였다. 블랭크 대조표준 그룹에서는 마우스를 50㎕의 블랭크 알긴산염 겔로 치료한 한편, 볼루스 대조 그룹에서는 마우스에게 29-량체, 24-량체 또는 20-량체를 함유하는 볼루스 제형을 주었다. 추가로, PEDF 18-량체 대조 그룹에서, 마우스들을 PEDF 18-량체 펩티드를 함유하는 지속성 방출 제형으로 치료하였다. 치료를 대퇴부 동맥 및 정맥 적출 수술 직후에 박근 근육에 단일 근육 내 주사에 의해 적용하였다. 절개부는 멸균 식염수로 상처를 세척한 후에 닫았다.

실시예 2.1

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 사지 관류를 증강시킨다

레이저 도플러 관류 영상화(LDPI) 분석기(Moor Instruments, USA)를 사용하여 수술 전(OP 전), 수술 직후(OP 후) 및 수술 후 시간이 경과한 후의 뒷다리 혈액 관류를 정량하였다. 마취 열 손실에 의한 혈관수축을 최소화하기 위하여, 동물을 37℃에서 5분 동안 가열 플레이트 상에 유지한 후 측정하였다. 4주의 기간에 걸쳐 허혈성 뒷다리의 혈액 관류를 나타내는 대표적인 LDPI 영상은 도 2에 제공되고, 도면에서 진한 푸른색은 낮은 혈류를 나타낸다. 혈액 관류는 동일한 마우스의 작동(허혈성) 대 비-작동(비-허혈성) 사지 혈류의 비율을 나타내는 LDPI 지수로서 표시되고, 그 결과는 도 3 및 표 1에 요약하였다(n≥6). 혈류를 상이한 색 픽셀에 의해 표시된, 레이저 주파수의 변화로서 나타냈다.

치료		허혈성/비-허혈성 관류 비율 (%)
	OP 전	OP 후	7 일	14 일	21 일	28 일
블랭크	99.4±1.5	8.1±0.87	30.6±1.9	28.4±3.9	46.3±3.8	50.0±6.5
볼루스	112.9±6.2	9.0±0.80	22.9±4.6	31.6±2.1	44.1±8.4	55.3±2.8
18-량체	104.5±2.5	7.5±0.67	23.8±4.5	30.3±0.94	46.8±4.3	52.8±7.4
29-량체	108.2±8.8	7.0±3.1	44.8±2.0*	77.6±6.8*	101±7.0*	105±4.8*
24-량체	91.5±5.6	8.0±0.03	53.1±0.37*	67.2±5.8*	86.1±5.9*	91.8±5.5*
20-량체	98.0±7.8	4.6±0.64	43.3±7.2*	60.0±9.0*	75.5±5.2*	92.7±3.0*

*블랭크 대조표준에 비해 P<0.05.

도 3에 예시한 것과 같이, 수술 후에 지엽적인 혈류(OP 후)는 예상했던 바대로 모든 그룹의 동일한 동물의 비-허혈성 사지의 약 8%로 즉시 감소하였다. 블랭크(알긴산염 겔 단독) 대조표준은 시간이 경과함에 때라 재관류의 느린 증가를 유도하였다. 볼루스 전달로부터의 결과는 블랭크 대조표준의 결과와 유사하였고, 그것은 PEDF 펩티드의 지속성 방출이 그것의 보호 효과를 나타내기에 필수적임을 나타내는 것이라는 것이 주지되어야 한다. 또한 대조 18-량체 펩티드를 함유하는 지속성 방출 제형으로 치료된 마우스들은 블랭크 대조표준 또는 볼루스 대조표준의 그것과 비교하여 개선된 혈액 관류를 나타내지 못하였고, 그것은 18-량체 펩티드가 허혈을 치료하는 데 비효과적인 것을 시사한다. 대조적으로 본 발명의 PEDF 치료는 블랭크, 볼루스 및 PEDF 18-량체 대조 그룹의 그것을 능가하는 혈액 관류를 상당히 개선시켰다. 특히, 29-량체, 24-량체 또는 20-량체를 함유하는 지속성 제형으로 치료된 동물들은 수술 후 둘째 주 정도부터 시작하여 혈류에 현저한 증가(적어도 정상 사지의 60%)를 나타냈다. 수술 후 4주에는 29-량체, 24-량체 또는 20-량체를 함유하는 지속성 방출 제형으로 치료된 동물들의 관류는 블랭크 대조표준의 50% 및 볼루스 대조표준의 55%와 비교하여 각각 정상 사지의 105%, 92% 및 93%의 최종 회복을 유도하였다.

실시예 2.2

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 허혈-유도 조직 괴사를 방지한다

대부분의 뒷다리 허혈 모델에서, 조직 괴사는 일반적으로 무릎 아래의 근육에서 발생한다. 예를 들어 치료제가 투여되는 박근 근육에서 멀리 떨어져 있는 전경골 동맥 근육은 자주 대퇴부 동맥 적출 후에 재생되면서 광범위한 괴사가 진행된다. Masson 3색 푸른색 염색의 세기는 조사된 조직의 콜라겐 섬유의 함량에 좌우되었고, 섬유증은 괴사의 결과이다. 그러므로 수술 및 치료 후 2주 및 7주 후에, 전경골 동맥 근육으로부터의 샘플을 Masson 3색 염색에 의해 분석하여 섬유증 및 괴사의 정도를 평가하였다. 대표적인 샘플로부터의 결과를 도 4a 및 4b에 예시한다.

도 4a에 도시된 것과 같이, 수술 후 2주째에 블랭크 대조 그룹으로부터의 근육 조직은 광범위한 섬유증을 나타냈고(푸른 색 염색에 의해 표시됨), 반면 본 발명의 지속성 방출 제형으로 치료된 근육 조직은 상대적으로 더 작은 섬유증 영역을 나타냈다. 또한 도 4A에서 수술 후 7주째에, 본 발명의 지속성 방출 제형으로의 치료는 괴사 및 섬유증의 영역을 효과적으로 감소시켰고, 따라서 근육 조직의 완전한 회복을 이루었음이 주지된다.

허혈성 부상 후에, 근섬유 재생은 위성 세포의 증식에 의해 이루어진다. 새롭게 형성된 근섬유는 중심에 위치한 핵에 의해 뚜렷해진다. 또한 괴사 면적은 부종을 가지는 창백한 호산성 세포질과 말초 핵의 상실을 나타내는 괴사성 근섬유에 의해 증명된다. 도 4b에서 나타난 것과 같이, 수술 후 2주 후에 중심에 위치한 핵을 가지는 근섬유의 재생은 블랭크 대조표준으로 치료된 마우스에서보다 본 발명의 지속성 방출 제형으로 치료된 마우스에서 더 상당하였다. 도 4b의 상부 패널을 참조하면, 블랭크 대조 그룹으로부터의 샘플의 창백한 적색 면적이 20-량체 치료 군으로부터의 샘플과 비교하여 크고, 그것은 또한 본 발명의 지속성 방출 제형이 괴사를 방지하는 데 효과적이었음을 시사하였다. 수술 후 7주째에, 지방 방울이 산재한 근섬유의 작은 번들은 블랭크 대조표준으로 치료된 그룹의 전경골 동맥 근육의 근육 면적의 15%로 유지되었다(도 4b; 하부 좌측 패널).

손상된 면적(괴사 면적 + 섬유증 면적) 및 중심에 핵화된 섬유의 수와 관련된 통계학적 분석을 또한 수술 후 2주째에 수행하였고, 그 결과를 표 2에 요약하였다. 손상된 면적은 총 염색된 면적의 퍼센트(%)로서 표시하고, 중심에 핵화된 섬유는 계수된 근섬유의 총 수(%)로서 표시한다.

표 2에 요약한 결과는 본 발명의 지속성 방출 제형의 주사가 실질적으로 블랭크 또는 볼루스 대조표준과 비교하여 조직 손상을 감소시킬 수 있음을 나타냈다. 구체적으로, PEDF 치료 그룹의 손상된 면적은 블랭크 또는 볼루스 대조 그룹의 손상된 면적의 약 45 내지 48%로 감소되었다. 또한 이들 데이터는 29-량체, 24-량체 또는 20-량체 제형을 사용한 치료가 블랭크 또는 볼루스 대조표준의 그것과 비교하여 전경골 동맥 근육의 중심에 핵화된 섬유의 수의 증가(약 3 내지 3.7-배)를 초래하였음을 시사하였다.

치료	손상된 지역 (%)	중심에 핵화된 섬유 (%)
블랭크	81.0±3.3	19.5±2.2
볼루스	80.1±4.1	20.2±3.2
18-량체	78.5±5.1	20.5±3.3
29-량체	39.5±4.2*	72.5±5.2†
24-량체	36.8±5.5*	67.8±5.3†
20-량체	38.0±5.2*	61.2±5.8†

*블랭크 대조표준에 비해 P<0.001.

†블랭크 대조표준에 비해 P<0.02.

요약하면, 실시예 2.2의 결과는 29-량체, 24-량체 또는 20-량체 중 어느 하나를 함유하는 본 발명의 지속성 제형으로의 치료가 허혈에 의해 유도된 괴사 및 섬유증을 방지할 수 있고, 그로써 근육 조직의 회복을 개선할 수 있음을 시사하였다. 또한, 본 발명의 지속성 방출 제형으로 치료된 마우스의 경골 근육의 회복의 증가는 허혈성 사지의 혈액 관류의 촉진에 대한 그것의 효과(상기 실시예 2.1)를 지지하는 추가의 증거를 제공한다.

실시예 2.3

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 부행 순환을 가지는 허혈성 조직을 보충하는 동맥형성을 자극한다

주요 동맥(예컨대 관상 동맥 또는 대퇴부 동맥)의 급성 폐색의 경우에, 기존의 소동맥 연결은 폐색 부위를 우회하기 위하여 보충될 수 있다. 이 과정은 혈관형성과는 많은 측면에서 상이한 동맥형성으로 명명된다. 해부학적 측면으로부터, 이들 기존의 부행 동맥은 혈관형성중에 형성된 모세관과는 달리 내피 라이닝, 내부 탄성 라미나 및 평활근 세포의 하나 또는 두 개의 층으로 구성되는 미세 혈관의 얇은 벽 도관이다. 정상적인 조건 하에서, 이들 내재하는 기존의 얇은 벽의 소동맥은 관류를 제공하기 위해 활용되지 못할 수 있다. 그러나, 주요 동맥의 폐색에 이어서, 이들 혈관은 폐색 부위의 성장, 우회에 의해 그것의 루멘을 극적으로 증가시킬 수 있어서 위태로워진 허혈성 영역에 증대된 관류를 제공할 수 있다. 주요 동맥의 만성 또는 급성 폐색 중에 부행 동맥은 신체의 많은 영역(뒷다리, 심장, 뇌, 신장 등)에서 잇따르는 해로운 효과를 개선할 수 있다. 동맥형성은 기존의 부행 동맥의 수동 확장의 단순한 과정이 아니라, 오히려 그것은 기존의 소동맥 연결부의 실제 부행 동맥의 능동적인 증식과 리모델링과 관련되었음을 인지하는 것이 중요하다. 혈관 직경은 혈류에 대한 우세한 영향이고, 따라서 부행 동맥은 적응성 성장 후에 시간 단위당 상대적으로 큰 혈액 부피를 수행할 수 있는 것으로 수립된다. 그러므로, 동맥형성의 자극은 아마도 혈관형성과 비교하여, 심장 및 뇌와 같은 허혈성 사지 또는 내부 기관의 생존을 위한 보다 효과적인 메커니즘이다. 대조적으로, 혈관형성은 기존의 혈관으로부터 내피 세포로 구성된 모세관의 형성이고; 이들 모세관은 손상된 허혈성 영역에 더 높은 관류를 제공하는 데 있어서는 성과가 없다. 그러므로, 잠재적으로 허혈성 조직으로의 혈류의 증가는, 둘 또는 세 개의 큰 부행 동맥의 발달에 의해 유발되는 것과 같이, 새롭게 형성된 모세관과 동등할 수는 없지만 수없이 많다.

본 발명의 지속성 방출 제형의 동맥형성 효과를 조사하기 위하여, 큰 모음근 근육(대퇴부 동맥 적출과 동일한 수준에 위치하고, 그때에 동맥형성은 부행 순환이 발견될 것으로 예상되는 것을 수립하는 데 기여한다)을 각 실험 조건에서 수술 후 2주 후에 동물로부터 수확하였다. 근육 횡단면의 소동맥을 혈관 평활근 세포에 대한 면역조직학적 염색에 의해 확인하였고(α-SMA; 갈색), 핵은 헤마톡실린으로 표지하였으며; 대표적인 사진을 도 5에 제시하였다. 정량 분석을 또한 수행하였고, 그 결과를 아래의 표 3에 요약하였으며, 데이터를 말초-손상 영역의 mm²당 α-SMA 포지티브 소동맥으로서 표시하였다.

치료	mm 2 당 소동맥 밀도
블랭크	3.3±0.88
볼루스	3.7±1.2
18-량체	4.0±0.58
29-량체	11.7±1.5*
24-량체	10.0±0.58*
20-량체	10.7±1.2*

*블랭크 대조표준에 비해 P < 0.001.

이들 데이터는 본 발명의 지속성 방출 제형의 투여가 블랭크 및 볼룻, 대조 군의 그것과 비교하여, 대퇴부 동맥 적출부에 인접한 큰 모음근 근육의 소동맥 밀도를 증가시킨 것을 드러냈다. 그러므로 PEDF 펩티드의 지속성 방출은 혈액 공급의 급성 파괴 후에 부행 순환을 수립하기 위한 동맥형성 활성을 제공한다. 성장에 의한 이들 혈관의 루멘의 극적인 증가는 위태로운 허혈성 영역으로의 관류를 증대시켰다. 이렇게 잘 발달된 부행 네트워크는 허혈 사건으로부터의 회복을 유도한다.

실시예 2.4

PEDF 펩티드는 생체 외 신생혈관 생장을 자극한다

PEDF 펩티드에 의해 촉진된 신생혈관 발달을 추가로 확인하기 위하여, 쥐 대동맥 고리 생장 분석을 수행하였다. 흉부 대동맥을 안락사시킨 쥐로부터 제거하여 말초-대동맥 섬유지방 조직을 부드럽게 벗겨냈다. 대동맥을 약 2-mm 길이의 고리로 절단한 다음, 그것들을 성장 인자-환원 매트리겔에 끼워넣었다. 대동맥 고리를 함유한 겔을 37℃에서 30분 동안 인큐베이션한 12-웰 플레이트에서 중합하였다. 100 유닛/ml의 페니실린 및 100ng/ml의 스트렙토마이신, 1% FBS 및 보충제(50ng/ml의 VEGF-A, 20ng/ml의 FGF-2 또는 50ng/ml의 29-량체, 24-량체, 20-량체, Mo 29-량체, Mo 20-량체, 25-량체 또는 18-량체)가 첨가된 1ml의 MCDB131 배지를 매트리겔-함유 절편체에 첨가하였다. 배양물을 37℃에서 보습 인큐베이터에서 최대 4일 동안, 배지를 격일마다 교환하면서 증식시켰다. 신생혈관 생장을 4일째까지 명시야 광학을 가지는 반전 현미경 플랫폼(Leica)을 사용하여 평가하였고; 대표적인 사진을 도 6에 제시하였다. 신생혈관 생장의 정량을 Image- Pro Plus 6.0 소프트웨어(Dendrites program)를 사용하여 평가하였다. 그 결과를 미처리 대동맥 고리의 배수로서 표시하였고, 표 4에 요약하였다. 실험을 3중으로 반복하였다.

보충 인자가 투여되지 않은 미처리 대조표준(UT)에서, 최소한의 신생혈관 생장이 4일째에 관찰되었다. 또한 대조 PEDF 대조표준(즉 25-량체 및 18-량체)은 미처리 대조표준과 비교하여 실질적으로 신생혈관 생장을 증대시키지 못하였다.

치료	신생혈관 생장 배수
미처리	1
VEGF	3.4*
FGF2	3.5*
18-량체	0.97
25-량체	0.89
29-량체	5.6*
24-량체	6.2*
20-량체	6.5*
Mo 29-량체	6.1*
Mo 20-량체	6.4*

* 미처리 대조표준에 비해 P < 0.02

예상했던 것과 같이, 잘 알려진 혈관형성 인자, VEGF 및 FGF2는 신질적인 신생혈관 생장을 유도하였다. VEGF 및 FGF2로 처리된 샘플 중의 신생혈관 생장은 UT 대조표준의 그것과 비교하여 각각 약 3.4-배 및 3.5-배로 증가하였다.

표 4의 데이터는 또한 본 발명의 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체, 20-량체, Mo 29-량체 및 Mo 20-량체를 포함함)가 VEGF나 FGF2 중 어느 것보다도 더 많은 신생혈관 생장을 자극한 것을 가리켰다. 이들 신생혈관을 α-평활근 액틴(소동맥 벽 평활근 세포(SMC)의 마커) 및 아이소렉틴 B4(ㅑㅠ4, 내피 세포의 마커)에 대해 이중-염색 면역형광 분석에 의해 조사하였고, 대표적인 사진을 도 7에 제시하였다. 도 7에서 알 수 있는 것과 같이, 본 발명의 PEDF 펩티드(29-량체 또는 20-량체)로 처리된 샘플은 SMC 코팅을 가지는 소동맥 표현형을 나타냈다. 대조적으로, 내피 관의 형성 및 SMC 증식은 PEDF 18-량체로 처리할 때에는 거의 검출되지 않았다. 이 결과는 본 발명의 구체예에 따르는 PEDF 펩티드가 배양중에 내피 세포만을 함유하는 모세관의 혈관형성 이상으로 신생혈관 형성을 자극할 수 있음을 가리킨다. 그러므로 그것은 본 발명의 PEDF 펩티드가 생체 내에서 동맥형성을 자극한다는 개념을 지지한다.

결론적으로, 실시예 2(실시예 2.1 내지 2.4를 포함하여)에 제공한 데이터는 본 발명의 PEDF 펩티드가 사지 관류의 증강, 조직 괴사 및 섬유증의 감소 및 동맥형성 및 신생혈관 생장의 촉진에 효과적이었고, 그러므로 PEDF 펩티드(특히 PEDF 펩티드 중 어느 하나를 함유하는 지속성 방출 제형)의 투여는 허혈성 손상을 감소시키고 조직 또는 기관의 구조적 및 기능적 회복을 용이하게 할 것임을 증명하였다. PEDF의 34-량체 단편(잔기 44 내지 77)은 항-혈관형성 특성을 가지며, PEDF의 44-량체 단편(잔기 78 내지 121)은 신경영양성 특성을 가지는 것으로 수립되었음이 주지되어야 한다. 그러나 본 발명은 먼저 짧은 PEDF 단편(적어도 29-량체, 24-량체, 20-량체, Mo 29-량체 및 Mo 20-량체)이 동맥형성 활성을 나타내는 것을 확인하는 것이다.

실시예 3

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 근육 재생을 촉진한다

근육 재생에 미치는 본 발명의 PEDF 펩티드의 효과를 조사하기 위하여, 부피바카인을 비장근 근육에 일회 주사하는 쥐 근괴사 모델을 사용하였다. 다 자란 10주령의 스프라그-도울리 쥐(초기 체중 = 312±11g)를 자일라진(10mg/kg)을 복강 내 주사함으로써 마취시켰다. 그런 다음 비장근 근육을 26-게이지 바늘이 달린 일회용 주사기를 사용하여 0.5ml의 부피바카인(AstraZeneca)을 한쪽 측면에 주사함으로써 부상을 입혔다. 간단하게 설명하면, 바늘을 비장근 근육에서 먼 부분에 삽입한 후 가까운 곳까지 세로 방향으로 물러나면서 부피바카인 용액을 고르게 주사하였다. 그런 다음 용액을 바늘이 느리게 철회됨에 따라 근육의 전체 길이를 통해 주사하였다.

부피바카인을 주사한 후, 쥐를 똑같이(n=10/그룹) 4개의 실험 그룹으로 나투고 다음과 같이 처리하였다. 블랭크 대조 그룹에서는 마우스들을 50㎕의 블랭크 알긴산염 겔로 처리하였다. 치료 그룹에서는 마우스들에게 50㎕의 지속성 방출 제형(29-량체 또는 20-량체)을 주었다. 볼루스 대조 그룹의 마우스들에게는 볼루스 제형(29-량체)을 주었다. 치료는 부피바카인 관류 직후에 비장근 근육에 일회 근육 내 주사에 의해 적용하였다.

부피바카인 주사 후 4일째에 비장근 근육 구획의 조직학은 일반적 괴사로 이루어졌는데, 근섬유가 파괴되었고 풍부한 침투성 염증 세포가 거의 대부분의 비장근 근육을 차지하였다(사진을 제시하지 않음). 단지 말초에서 상대적으로 정상적인 구조를 가지는 약간의 근섬유가 남아있었다. 근섬유 괴사의 정도는 블랭크 대조 그룹과 펩티드 처리 군에서 동일하였다. 이 결과는 상이한 그룹에서 부피바카인에 의해 유도된 괴사 수준이 실질적으로 동일하였음을 나타냈다.

실시예 3.1

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 세포 증식을 촉진한다

근육 재생은 근섬유 또는 근세포의 증식을 포함한다. 근섬유 증식을 증식하는 핵의 BrdU의 통합에 의해 평가하였다. 위성 세포 증식은 근육 재생의 핵심 단계이다. 드러므로 위성 세포 표본을 또한 위성세포 마커인 Pax7로 염색하여 근육 재생 활성을 조사하였다. 상세한 분석 과정은 "재료 및 방법"에서 기술된 것과 같다. BrdU-포지티브 세포의 수준을 표지화 지수(%)로서 표시하였고, 그것을 체포의 총 수로 나눈 표지된 세포의 수로서 계산하였다. Pax7-포지티브 세포의 표지화 지수(%)를 핵을 가지는 세포의 총 수로 나눈 표지된 세포의 수로서 계산하였다. 정량 결과를 근육 구획당 6개의 구획으로부터 및 각 그룹에서 10마리로부터 평가하였고, 표 5에 요약하였다.

치료	BrdU 표지화 지수 (%)	Pax7 표지화 지수 (%)
블랭크	4.2±0.9	2.0±0.71
볼루스	4.4±1.4	2.6±0.68
29- 량체	15.4±1.7	16.2±2.0
20- 량체	13.6±3.0	14.6±1.9

이들 결과는 29-량체- 또는 20-량체-함유 지속성 방출 제형으로 치료된 상처의 BrdU-포지티브 세포의 수가 블랭크 또는 볼루스 대조표준으로 치료된 상처와 비교하여 상당히 증가하였음을 드러냈다. 위성 세포의 증식 활성과 관련하여, 데이터는 본 발명의 지속성 방출 제형이 블랭크 및 볼루스 대조표준과 비교하여 더 높은 백분율의 Pax7-포지티브 세포를 유도하였음을 드러냈다. 이들 데이터는 함께, 본 발명의 지속성 방출 제형의 투여가 근섬유 및/또는 위성 세포의 증식 활성을 증강시키고, 그것은 계속해서 근육의 재생을 촉진할 수 있음을 시사하였다.

실시예 3.2

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 근섬유 재생을 촉진한다

근육 재생 과정에서 새롭게 재생된 근섬유는 전형적으로 중심에 위치한 핵을 함유한다. 그러므로 그렇게 중심에 핵화된 근섬유의 백분율은 또한 근육의 재생 활성의 지표이다. 중심에 핵화된 섬유의 백분율과 관련된 통계학적 분석을 부피바카인 주사 후 7일째에 수행하였고, 그 결과를 표 6에 요약하였다.

치료	중심에 핵화된 섬유 (%)
블랭크	11.0±1.7
볼루스	13.82±.2
29- 량체	75.2±7.0
20- 량체	63.3±7.4

표 6에서 알 수 있는 것과 같이, 29-량체- 또는 20-량체-함유 제형으로 치료된 동물에서 중심에 위치한 핵을 함유하는 근섬유의 백분율은 블랭크 또는 볼루스 대조 그룹의 그것과 비교하여 더 높았다. 이들 결과는 본 발명의 지속성 방출 제형이 근육 재생을 촉진하는 데 효과적이었음을 가리켰다.

또한, 부피바카인 주사 후 14일째에 모든 실험 그룹에서 비장근 근육의 괴사성 근섬유를 새롭게 형성된 근관에 의해 대체하였다. 그러나, 많은 중심에 핵화된 섬유는 블랭크 또는 볼루스 대조표준으로 치료된 재생하는 근육에 남아있었고(도 8), 그것은 불완전한 근육 재생을 시사하였다. 대조적으로, 29-량체 또는 20-량체를 함유하는 지속성 방출 제형으로 치료된 동물로부터의 근육 구획들은 훨씬 더 적은 중심에 핵화된 섬유를 나타냈다. 이들 데이터는 함께, 근섬유 재생이 PEDF 펩티드의 지속성 방출에 의해 용이해졌음을 가리켰다.

실시예 3.3

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 재생된 근섬유의 성숙을 촉진한다

근육 재생의 후기 단계에서, 새롭게 새성된 근섬유는 크기가 커지기 시작한다. 근육 표본을 손상 후 14일째에 수집하고, 각각의 섬유 직경을 "재료 및 방법" 단원에서 설명한 과정에 따라 측정하였다. 그 결과를 도 9에 요약하였다.

평균적으로, 29-량체 또는 20-량체를 함유하는 지속성 방출 제형으로 치료된 동물로부터의 근섬유 직경은 블랭크 또는 볼루스 대조 그룹의 동물로부터의 그것보다 더 컸다. 또한, 20-량체-치료된 근육의 크기 분포는 손상되지 않은 무상의 근육의 그것과 매우 닮아있었다. 구체적으로, 20-량체로 치료된 동물로부터의 약 56.6%의 근섬유와 약 53.2%의 무상 근섬유는 15 내지 25㎛의 최소한의 Feret 직경을 가졌던 한편, 블랭크 및 볼루스 대조 그룹으로부터의 약 59.6% 및 약 56.2%의 재생된 섬유는 약 10 내지 20㎛의 최소 Feret 직경을 가졌다. 이들 데이터는 본 발명의 지속성 방출 제형의 투여가 재생된 근육의 질량 증가에 효과적이었음을 가리켰다.

결론적으로, 실시예 3(실시예 3.1 내지 3.3을 포함함)에서 제공된 데이터는 본 발명의 PEDF 펩티드가 근섬유 및 위성 세포의 증식, 근섬유의 재생 및 재생된 근섬유의 성숙을 촉진하는 데 효과적이었고, 그러므로 PEDF 펩티드(특히 PEDF 펩티드 중 어느 하나를 함유하는 지속성 방출 제형)의 투여는 근육 재생 과정을 촉진하고 근육 조직의 구조적 및 기능적 회복을 용이하게 할 수 있을 것임을 증명하였다. 본 발명은 먼저 짧은 PEDF 단편(적어도 29-량체 및 20-량체)이 근육 재생을 촉진할 수 있다는 것을 발견하는 것이다.

실시예 4

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 힘줄 재생을 촉진한다

힘줄 재생에 미치는 본 발명의 PEDF 펩티드의 효과를 조사하기 위하여, 힘줄 부상이 있는 쥐 모델을 다음과 같이 수립하였다. 다 자란 10주령의 수컷 스프라그-도울리 쥐(총 n=50; 초기 체중=312±11g)를 자일라진(10mg/kg)의 복강 내 주사에 의해 마취시켰다. 그런 다음 좌측 아킬레스건 부상을 18-게이지 바늘을 사용하여 아킬레스건을 통해 종골 안으로 바늘의 삽입부 쪽으로 1cm 근처에 바늘의 전체 두께 삽입에 의해 만들었다. 이것으로 절단된 단부의 수축을 방지하기 위하여 양 쪽에 무상 힘줄 조직이 있는 수평(transaction) 상처가 생성되었다.

쥐를 무작위로 5개의 실험 그룹으로 배정하고(n=10/그룹) 다음과 같이 치료하였다. 블랭크 대조 그룹에서는 마우스를 150㎕의 블랭크 알긴산염 겔로 치료하였다. 볼루스 대조 그룹에 대해서는 150㎕의 볼루스 제형(29-량체)을 투여하였다. 치료 그룹에서는 마우스들에게 150㎕의 지속성 방출 제형(29-량체, 24-량체 또는 20-량체)을 주었다. 치료제를 부상 직후에 힘줄 병변 가까이의 피하에 주사하였고, 절개부는 상처를 멸균 식염수로 세척한 후에 닫았다.

실시예 4.1

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 힘줄 치유를 촉진한다

힘줄 부상 후 3주 후에, 조직학적 분석을 수행하여 힘줄의 치유를 관찰하였다. 대표적인 사진을 도 10에 제시하였다. 도 10의 상부 패널에서 알 수 있는 것과 같이, 블랭크 대조표준으로 처리된 동물에서, 해체된 섬유상 흉터의 넓은 밴드가 두 개의 절단 단부 사이에 형성되었고, 분홍색으로 염색된 콜라겐 번들은 흉터 조직에서 최소였다. 대조적으로, 29-량체를 함유하는 지속성 방출 제형으로 치료된 힘줄의 절단 단부는 치유되어 블랭크 대조 표본의 그것과 비교하여 훨씬 더 적은 흉터 조직을 나타냈고, 성숙한 콜라겐 번들의 분홍색을 띤 얼룩은 힘줄의 손상된 영역으로 확대되었으며; 또한 절단 단부로부터의 힘줄 섬유는 어떤 지역에서는 함께 결합하는 것으로 보였다(도 10; 하부 패널). 또한 흉터의 섬유상 조직은 29-량체 치료 그룹에서 보다 조직화되었고 평행 방향이었다.

도 11은 보다 높은 배율에서 조직학적 분석의 대표적인 사진을 제시한다. 정상적인 힘줄은 콜라겐 섬유 중에서도 세포의 상대적인 부족을 나타냈고 핵은 대부분 신장되었다. 블랭크 및 볼루스 대조 그룹에서는, 3주 후에 섬유아세포(둥근- 또는 축-모양의 섬유아세포-유사 핵)가 더 많이 풍부하게 존재하는 것이 힘줄에서 관찰되었으며, 새롭게 형성된 콜라겐 섬유는 구조적으로 해체되었다(손상되지 않은 조직은 *로 표시하였다). 이들 형태학상의 변화는 블랭크 및 볼루스 대조 그룹에서 힘줄 상처의 불량한 치유를 시사하였다.

대조적으로, 여전히 도 11을 참조하면, 본 발명의 지속성 방출 제형으로 치료된 힘줄에서는, 치유 영역이 형태학적으로 성숙한 힘줄세포의 핵과 유사한 얇고 신장된 핵을 나타냈고, 콜라겐 섬유는 잘 조직화되었고 ??래의 힘줄에 평행하였으며(진한 분홍색); 그것은 힘줄 상처의 더 좋은 치유를 시사하였다. 이들 결과는 힘줄 상처 치유 과정이 본 발명의 지속성 방출 제형으로부터 유익할 수 있음을 가리켰다.

추가로, Masson 3색 염색을 수행하여 콜라겐 섬유의 구조 및 조직화를 평가하였고, 표본의 대표적인 사진을 도 12에 제시하였다. 손상되지 않은 힘줄에서는 콜라겐 섬유는 실질적으로 서로간에 평행하였다(도 12; 좌측 패널). 대조적으로, 블랭크 대조표준으로 치료된 손상된 힘줄은 치유된 영역에서 해체된 콜라겐 섬유를 가졌다9도 12; 중간 패널; 상처 가장자리를 *로 표시하였다). 그러나 본 발명의 지속성 방출 제형으로 치료된 손상된 힘줄은 상처 가장자리를 지나 실질적으로 손상되지 않은 힘줄 조직과 동일한 방향으로 배열된 잘-조직화된 콜라겐 섬유를 가졌다(도 12; 우측 패널; 상처 가장자리는 *로 표시하였다). 이들 고도로 배향되고 조직화된 콜라겐 섬유는 본 발명의 지속성 방출 제형으로 치료된 동물에서 더 좋은 힘줄 상처 치유 효과를 시사하였다.

정량 분석을 또한 수행하여 재생된 지역의 콜라겐의 백분율(%)을 평가하였고, 그 결과를 표 7에 요약하였다.

치료	재생된 지역의 콜라겐 (%)
블랭크	56.0±6.87
볼루스	58.25±8.84
29-량체	88.75±1.89
24-량체	85.75±2.56
20-량체	82.01±6.55

표 7에서 알 수 있는 것과 같이, PEDF 펩티드 그룹(29-량체, 24-량체 또는 20-량체)의 동물들은 블랭크 및 볼루스 대조 그룹의 동물들과 비교하여 재생된 지역에서 더 높은 콜라겐 함량을 나타냈다. 이들 데이터는 상처 영역에서의 콜라겐 합성이 본 발명의 지속성 방출 제형의 투여에 의해 촉진될 수 있음을 시사하였다.

표본에 대해 또한 유형 I 콜라겐의 면역염색을 수행하고, 핵을 헤마톡실린으로 표지하였다. 대표적인 사진을 도 13에 제시하는데, 도면에서 하부 패널은 상부 패널의 쇄선에 의해 각각 표시된 부분의 확대된 영역의 사진들이다. 인정되는 것과 같이, 손상되지 않은 힘줄의 콜라겐 소섬유는 서로간에 잘 교차-결합되어 있고, 그러므로 그것들은 항-콜라겐 1A1 항체에 의해 인지되지 않는 것으로 보였다. 그러므로, 단지 최소량의 유형 I 콜라겐(갈색 얼룩)만이 도 13의 좌측 패널에서 관찰되었다. 블랭크 대조 그룹(도 13; 중간 패널) 및 PEDF 치료 그룹(도 13; 우측 패널)의 사진들과 비교하면, 유형 I 콜라겐(갈색)은 블랭크 대조 그룹에서보다 PEDF 치료 그룹에서 더 풍부한 것이 확실하였다.

종합적으로 이들 결과는 본 발명의 PEDF 펩티드를 함유하는 지속성 방출 제형의 투여가 손상된 힘줄 조직의 세포에서 유형 I 콜라겐 합성을 자극하고, 치유된 조직의 콜라겐 침착을 용이하게 하며, 콜라겐 섬유의 보다 많은 조직화된 배열을 촉진하고, 그로써 힘줄 재생을 촉진한다는 것을 시사하였다.\

실시예 4.2

PEDF 펩티드는 시험관 내에서 TSC 증식을 유도한다

힘줄 치유 과정 중에 힘줄 줄기 세포(TSC)는 증식하고 힘줄세포로 분화하는 것으로 보고되었다. 본 발명의 PEDF 펩티드가 시험관 내에서 TSC의 증식을 유도하는 지의 여부를 조사하기 위하여, 힘줄 줄기 세포를 "재료 및 방법" 단원에서 기술한 것과 같이 분리하고 배양하였다. TSC의 순도를 TSC 마커, 뉴클레오스테민에 의해 확인하였고, 뿐만 아니라 유형 I 콜라겐의 TSC에 의한 발현을 확인하였고, 이들 분석 결과는 함께, 거의 100%에 가까운 TSC 순도를 나타냈다(데이터는 제시하지 않음). TSC의 증식을 2시간 동안 BrdU 펄스-표지화에 의해 확인하였다. BrdU-포지티브 세포의 수준의 정량 분석을 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였고, 그 결과를 표 8에 요약하였다.

치료	BrdU 표지화 지수 (%)
대조표준	9.6±2.1
29-량체	31.8±3.6*
24-량체	29.0±4.6*
20-량체	33.2±6.6*
Mo 29-량체	33.2±6.6*
Mo 20-량체	31.8±3.1*

* 미처리 대조 세포에 비해 P < 0.002.

이들 데이터는 대조 배지에서 배양된 TSC와 비교하여, 본 발명의 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체, 20-량체, Mo 29-량체 또는 Mo 20-량체)를 함유하는 배지에서 배양된 TSC가 보다 증식성이 있었음을 드러냈다. 또한 Mo 29-량체 및 Mo 20-량체는 마우스 PEDF 펩티드로부터 유도되고, 39-량체의 11 내지 30 아미노산 잔기에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖지 않음이 주지되어야 한다. 그러나 그것들은 각각 인간 PEDF로부터 유도된 짧은 PEDF 펩티드(예컨대 29-량체, 24-량체 및 20-량체)에 대해 유사한 유사분열 촉진 활성을 나타냈다.

실시예 4.3

PEDF 펩티드의 지속성 방출은 힘줄 부상 후 생체 내 TSC 중식을 촉진한다

실시예 4.1의 상이한 실험 그룹의 동물로부터 얻어진 표본들을 뉴클레오스테민으로 염색하여(녹색) 생체 내 TSC 증식이 힘줄 상처 치유 과정 중에 본 발명의 지속성 방출 제형에 의해 촉진될 수 있는지의 여부를 조사하였다. 정량 분석에서 각 실험 그룹의 무작위로 선택된 현미경 장을 사진촬영하고, 총 세포(Hoechst 33258에 의해 대비염색됨; 푸른색)당 뉴클레오스테민-포지티브 세포의 백분율을 계산하였다. 정량 분석의 결과를 표 9에 요약하였다.

치료	뉴클레오스테민 표지화 지수 (%)
블랭크	5.8±1.8
볼루스	5.6±1.4
29-량체	16.4±2.9*
24-량체	16.8±4.2*
20-량체	15.0±3.9*

* 블랭크 대조표준에 비하여 P < 0.001.

이들 데이터는 29-량체, 24-량체 또는 20-량체로 치료된 동물에서 뉴클레오스테민-포지티브 TSC 세포의 수준이 블랭크 및 볼루스 대조 그룹의 그것가 비교하여 상승되었음을 드러냈다. 이들 결과를 실시예 4.1 및 4.3으로부터의 결과와 함께 취합하면, 본 발명의 지속성 방출 제형의 투여에 의해 촉진된 TSC의 생체 내 확대는 원래의 치유 과정과 비교하여 보다 현저한 힘줄 치유 효과와 일치하였음을 시사하였다.

실시예 4.4

PEDF 펩티드는 골수-유도된 간엽 줄기 세포(BM-MSC)로부터의 힘줄세포-유사 세포 생성을 유도한다

최근에, 성인의 간엽 줄기 세포(MSC)가 기능성 힘줄을 재생시키기 위해 사용될 수 있는 것으로 수립되었다. 이 실시예에서는, 본 발명의 PEDF 펩티드가 BM-MSC의 힘줄 세포로의 분화를 촉진하는 능력을 조사하기 위하여 BM-MSC를 대조 배지 또는 PEDF 29-량체 또는 20-량체를 함유하는 배지에서 배양하였다. 테노모듈린 유전자(TNMD)는 힘줄에서 우세하게 발현되는 유전자이고, 힘줄세포 계통의 가장 신뢰할만한 표현형 마커인 것으로 여겨진다. 그러므로, 힘줄세포 분화를 TNMD의 발현을 토대로 평가하였다. RT-PCR 분석으로부터의 대표적인 영상을 도 14에 제시하였다.

그 결과는 본 발명의 PEDF 펩티드(29-량체 또는 20-량체)가 배양된 BM-MSC에서 힘줄세포-유사 세포 분화의 효과적인 유도자임을 드러냈다. BM-MSC의 이동 및 분화가 생체 내에서의 힘줄 복원의 제시된 메커니즘이기 때문에, 이런 관찰은 본 발명의 PEDF 펩티드가 BM-MSC의 힘줄 세포로의 분화를 촉진함으로써 힘줄 손상을 복원할 수 있음을 시사하였다. 또한 BM-MSC의 스캐폴드 매트릭스 배양으로부터 인공 힘줄의 합성을 용이하게 하는 본 발명의 PEDF 펩티드의 가능성이 표시되었다.

결론적으로, 실시예 4(실시예 4.1 내지 4.4를 포함함)에 제시된 데이터는 본 발명의 PEDF 펩티드가 잘-조직화된 콜라겐(특히 유형 I 콜라겐) 소섬유의 합성 및 힘줄 줄기 세포의 증식을 촉진하는 데 효과적이었고, 그러므로 본 발명의 PEDF 펩티드(특히 본 발명의 PEDF 펩티드 중 어느 하나를 함유하는 지속성 방출 제형)의 투여는 힘줄 재생 과정을 촉진하고 힘줄 조직의 구조적 및 기능적 회복을 용이하게 할 수 있다는 것을 증명하였다. 본 발명은 먼저 짧은 PEDF 단편(적어도 29-량체 및 20-량체)이 힘줄 재생 및 BM-MSC의 힘줄 세포로의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 발견하는 것이다.

종합적으로, 전술한 실시예로부터의 결과들은 본 발명의 합성 PEDF 펩티드(예컨대 29-량체, 24-량체, 20-량체, Mo 29-량체 및 Mo 20-량체)가 허혈성 영역에 있거나 인접한 동맥형성, 손상된 영역에 있거나 인접한 근육 및 힘줄 재생을 촉진할 수 있음을 수립하였다. 따라서, 본 발명의 합성 PEDF 펩티드는 근육 및 힘줄 상처-치유를 촉진하고 허혈성 손상을 감소시키기 위한 치료제로서 사용하기에 적당하다.

상기 실시예의 설명은 단지 실례로서 제시되며 다양한 변형이 해당 기술분야의 숙련자들에 의해 이루어질 수 있다는 것이 인지될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 구체예의 구조 및 용도에 대한 완전한 설명을 제공한다. 비록 본 발명의 다양한 구체예가 상기에서 특별히 특정한 정도로 또는 하나 또는 그것보다 많은 개별적인 구체예를 참조로 기술되었지만, 해당 기술분야의 숙련된 지식을 가진 사람들은 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어남이 없이 개시된 구체예에 대한 많은 변형을 만들 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Mackay Memorial Hospital <120> USE OF PEDF-DERIVED POLYPEPTIDES FOR PROMOTING MUSCLE OR TENDON REGENERATION OR ARTERIOGENESIS <130> 18326/002001 <150> PCT/CN2012/079897 <151> 2012-08-09 <160> 14 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala Glu Gln 1 5 10 15 Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser 20 25 30 Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 35 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile 1 5 10 15 Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His 20 25 30 Gly Thr <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 20 25 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu 20 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ser <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Ser Leu Gly Ala Glu His Arg Thr Glu Ser Val Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Thr Asn Pro Asp Ile His Ser Thr 20 25 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Ser Leu Gly Ala Glu His Arg Thr Glu Ser Val Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 agaatgagca atgggtggtc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 ctcgacctcc ttggtagcag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 agacagccgc atcttcttgt 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 cttgccgtgg gtagagtcat 20 <210> 14 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His 1 5 10 15 Ser Ser Cys Gln Asn Pro Ala Ser Pro Pro Glu Glu Gly Ser Pro Asp 20 25 30 Pro Asp Ser Thr Gly Ala Leu Val Glu Glu Glu Asp Pro Phe Phe Lys 35 40 45 Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr Asp 50 55 60 Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr Thr Asn Val Leu Leu 65 70 75 80 Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala 85 90 95 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 100 105 110 Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Val Thr Ala Pro Gln Lys Asn Leu Lys Ser Ala Ser Arg Ile Val Phe 130 135 140 Glu Lys Lys Leu Arg Ile Lys Ser Ser Phe Val Ala Pro Leu Glu Lys 145 150 155 160 Ser Tyr Gly Thr Arg Pro Arg Val Leu Thr Gly Asn Pro Arg Leu Asp 165 170 175 Leu Gln Glu Ile Asn Asn Trp Val Gln Ala Gln Met Lys Gly Lys Leu 180 185 190 Ala Arg Ser Thr Lys Glu Ile Pro Asp Glu Ile Ser Ile Leu Leu Leu 195 200 205 Gly Val Ala His Phe Lys Gly Gln Trp Val Thr Lys Phe Asp Ser Arg 210 215 220 Lys Thr Ser Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Arg 225 230 235 240 Val Pro Met Met Ser Asp Pro Lys Ala Val Leu Arg Tyr Gly Leu Asp 245 250 255 Ser Asp Leu Ser Cys Lys Ile Ala Gln Leu Pro Leu Thr Gly Ser Met 260 265 270 Ser Ile Ile Phe Phe Leu Pro Leu Lys Val Thr Gln Asn Leu Thr Leu 275 280 285 Ile Glu Glu Ser Leu Thr Ser Glu Phe Ile His Asp Ile Asp Arg Glu 290 295 300 Leu Lys Thr Val Gln Ala Val Leu Thr Val Pro Lys Leu Lys Leu Ser 305 310 315 320 Tyr Glu Gly Glu Val Thr Lys Ser Leu Gln Glu Met Lys Leu Gln Ser 325 33 335 Leu Phe Asp Ser Pro Asp Phe Ser Lys Ile Thr Gly Lys Pro Ile Lys 340 345 350 Leu Thr Gln Val Glu His Arg Ala Gly Phe Glu Trp Asn Glu Asp Gly 355 360 365 Ala Gly Thr Thr Pro Ser Pro Gly Leu Gln Pro Ala His Leu Thr Phe 370 375 380 Pro Leu Asp Tyr His Leu Asn Gln Pro Phe Ile Phe Val Leu Arg Asp 385 390 395 400 Thr Asp Thr Gly Ala Leu Leu Phe Ile Gly Lys Ile Leu Asp Pro Arg 405 410 415 Gly Pro

Claims (30)

1. 20 내지 39개의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 아미노산 서열로 이루어진 합성 펩티드를 포함하는, 대상의 근육 재생, 힘줄 재생 또는 동맥형성을 촉진하기 위한 약학적 조성물로서, 이때 아미노산 서열은 적어도 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 합성 펩티드의 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 동일한 것을 특징으로 하는 대상의 근육 재생, 힘줄 재생 또는 동맥형성을 촉진하기 위한 약학적 조성물.
3. 삭제
4. 제 1항에 있어서, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 또는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 대상의 근육 재생, 힘줄 재생 또는 동맥형성을 촉진하기 위한 약학적 조성물.
5. 20 내지 39개의 아미노산 잔기의 길이를 가지는 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩티드, 이때 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8 및 SEQ ID NO:9로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
   약학적으로 허용되는 담체를 포함하는,
   대상의 근육 재생, 힘줄 재생 또는 동맥형성을 촉진하기 위한 약학적 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체는 알긴산염, 젤라틴, 콜라겐 및 폴리락타이드-코-글리코라이드(poly(Lactide-co-Glycolide))로 이루어진 군으로부터 선택되는 중합체 물질인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 중합체 물질은 알긴산염인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
8. 제 5항에 있어서, 약학적 조성물은 지속성 방출 형태로 제형되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
9. 제 5항에 있어서, 약학적 조성물은 근육 내 주사를 위해 제형되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
   
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제

Images