CN117750964A - 含有成纤维细胞的肾疾病治疗用医药组合物 - Google Patents

Abstract

通过发现成纤维细胞在具有肾疾病的大鼠模型中抑制肾纤维化并使肾脏功能恢复，从而能够提供一种含有成纤维细胞的肾疾病治疗用医药组合物。

Description

含有成纤维细胞的肾疾病治疗用医药组合物

技术领域

本发明涉及一种含有成纤维细胞的肾疾病治疗用医药组合物。

背景技术

急性肾损伤(AKI)、慢性肾脏病(CKD)以及肾替代治疗法(RRT)的患者总数超过8.5亿人。随着老龄化和生活方式病的增加，患者人数处于增加的趋势，成为近年来公共卫生上的问题。

AKI是一种在受到损伤后肾小球过滤量迅速且进行性减少，肾功能下降的疾病(非专利文献1)。尽管对AKI进行了临床治疗，但部分患者仍出现进行性CKD的症状。CKD是指肾脏损伤或不能像健康的肾脏一样过滤血液的疾病。若放任CKD不管，则肾纤维化会逐渐进行，在广范围内肾单位坏死，肾脏的过滤能力下降。在肾脏的功能下降到正常时的30％以下的情况下(CKD的重症度分类不足G4的情况(此外，CKD的重症度分类有G1-G5的区分，G1表示正常肾功能，G5表示晚期肾衰竭))，需要人工透析或RRT。人工透析是补充患者的部分肾功能的治疗方法，不会使肾功能恢复。需要定期的门诊治疗，另外，可能还需要对于长期的透析治疗所伴随的并发症进行追加的部分治疗。另外，唯一的治疗方法即RRT由于提供者压倒性的不足，因此无法适用于所有的透析患者。在这样的背景下，不仅从提高患者的生活质量(QOL)的观点出发，还从减轻社会保障的巨大负担的观点出发，需要开发新的治疗方法。

为了应对该临床课题，正在开发各种各样的对策。例如，可以举出使用间充质干细胞(MSC)(非专利文献2、3)、多能干细胞(非专利文献4)的细胞疗法。但是，这些方法的功能恢复的效果是有限的。

近年来，关注到肾淋巴管形成不仅维持损伤后的肾脏体液的恒常性，还输送免疫细胞或抗原，导致肾纤维化的减轻(非专利文献5)。肾纤维化被认为对肾功能衰竭的进行起着核心作用，为了延缓慢性肾功能衰竭的进行，经常使用抑制纤维化发病的降压剂。

迄今为止，本发明人等已经报告了通过添加TNF-α与IL-4的混合物来促进VCAM1(CD106)和Thy-1(CD90)在心脏成纤维细胞(CF)中的表达(专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2020/045547号

非专利文献

非专利文献1：美国肾脏病学会杂志(J.Am.Soc.Nephrol.)16,3149-3150(2005)

非专利文献2：肾病学与高血压的现代见解(Curr.Opin.Nephrol.Hypertens.)25,372-377(2016)

非专利文献3：干细胞研究与治疗(Stem Cell Res.Ther.)5,83(2014)

非专利文献4：细胞-干细胞(Cell Stem Cell)21,730-746.e6(2017)

非专利文献5：自然评论肾脏病学(Nat.Rev.Nephrol.)16,289-303(2020)

发明内容

发明要解决的问题

本发明的课题在于提供一种含有成纤维细胞的肾疾病治疗用医药组合物。

用于解决问题的手段

本发明人等为了解决上述课题进行了研究，发现成纤维细胞在具有肾疾病的大鼠模型中抑制肾纤维化并使肾脏的功能恢复，从而想到了本发明。

即，本发明包括以下的第一侧面(发明A)。

(A1)一种医药组合物，用于治疗肾疾病，含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞，其中，

所述医药组合物中的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞相对于全部成纤维细胞的比例超过1.08％。

(A2)根据(A1)所述的医药组合物，其中，所述成纤维细胞来源于心脏。

(A3)根据(A1)或(A2)所述的医药组合物，其中，所述成纤维细胞来源于成体。

(A4)根据(A1)～(A3)中任一项所述的医药组合物，其中，所述肾疾病为急性肾损伤或慢性肾脏病。

(A5)根据(A1)～(A4)中任一项所述的医药组合物，其中，所述医药组合物为注射用组合物。

(A6)根据(A1)～(A4)中任一项所述的医药组合物，其中，所述细胞构是被筑为平面或立体形状的细胞组织而构成的。

(A7)一种肾疾病治疗剂，其中，包括心脏来源成纤维细胞而构成。

(A8)根据(A7)所述的治疗剂，其中，所述心脏来源成纤维细胞含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞，

所述治疗剂中的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞相对于全部成纤维细胞的比例超过1.08％。

(A9)根据(A7)或(A8)所述的治疗剂，其中，所述心脏来源成纤维细胞来源于成体。

(A10)根据(A7)～(A9)中任一项所述的治疗剂，其中，所述肾疾病为急性肾损伤或慢性肾脏病。

(A11)根据(A7)～(A10)中任一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂为注射用组合物。

(A12)根据(A7)～(A10)的任一项所述的治疗剂，其中，所述细胞是被构筑为平面或立体形状的细胞组织而构成的。

另外，本发明包括以下的第二侧面(发明B)。

(B1)一种在对象中治疗肾疾病的方法，包括将含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的医药组合物施用或移植到该对象。

另外，本发明包括以下的第三侧面(发明C)。

(C1)一种含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的医药组合物作为注射剂的应用，其中，为了治疗肾疾病，所述注射剂用于施用到肾脏组织以及/或其周边区域。

(C2)一种含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的医药组合物作为移植材料的应用，其中，为了治疗肾疾病，所述移植材料用于移植到肾脏组织以及/或其周边区域。

发明的效果

根据本发明，能够提供一种含有成纤维细胞的肾疾病治疗用医药组合物。

附图说明

图1是表示心脏成纤维细胞(CF)的特征的图。A是原代培养的心脏成纤维细胞的显微镜照片(标尺：500μm)。B是CF、uCF、u90⁺CF中的CD90以及VCAM1阳性细胞(％)的流式细胞术(FCM)解析的结果图。

图2是示出各种细胞施用组的生存率、尿评价、肾功能评价的图。A示出与IRI(缺血再灌注损伤)大鼠模型的制作以及细胞施用有关的实验计划。对右肾摘除后第7天(图中，表示为0D)的裸大鼠进行IRI处理，分别向大鼠的肾被膜正下方施用了CF、uCF、u90⁺CF或溶剂(vehicle)。B是示出IRI后的各组的生存率的图。各组分别为溶剂对照组(图中，表示为Ctrl，n＝7)、CF施用组(图中，表示为+CFs，n＝7)、uCF施用组(图中，表示为+uCF，n＝2)、u90⁺CF施用组(图中，表示为+u90⁺CFs，n＝4)。C是示出各监测点的体重的图表(平均值±标准误差(SE)，Ctrl：n＝7，+CFs：n＝5，+uCFs：n＝2，以及+u90⁺CFs：n＝4)。D是示出细胞施用后第14天的平均肾脏重量的图表(Ctrl：n＝7，+CFs：n＝5，+uCFs：n＝2，以及+u90⁺CFs：n＝4)。E是示出各监测点的各组的尿量的图表(平均值±标准误差(SE)，Ctrl：n＝7，+CFs：n＝5，+uCFs：n＝2，以及+u90⁺CFs：n＝4)。F和I是示出各监测点的血肌酐浓度(Cre)、血尿素氮浓度(BUN)的图表(平均值±标准误差(SE)，Ctrl：n＝7，+CFs：n＝5，+uCFs：n＝2，以及+u90⁺CFs：n＝4)。G、H、J和K是示出细胞施用后2天以及4天的Cre和BUN的上升值的图表(平均值±标准误差(SE)，Ctrl：n＝7，+CFs：n＝5，+uCFs：n＝2，以及+u90⁺CFs：n＝4)。

图3是示出各种成纤维细胞的施用所起到的纤维化抑制效果的图。A是细胞施用后第14天的肾脏切片的天狼星红(SR)染色的显微镜照片(标尺：2mm)。B是对细胞施用后第14天的平均纤维化面积率进行定量化的图表(Ctrl：n＝7，+CFs：n＝5，+uCFs：n＝2，以及+u90⁺CFs：n＝4)。将肾脏面积分为中心部、背侧及腹侧部、肾脏整体3个部分进行定量化。

图4是表示实施例3中使用的心脏成纤维细胞的特征的图。A是原代培养的各种心脏成纤维细胞(CF、uCF、u90⁺CF)的显微镜照片。B是CF、uCF、u90⁺CF中的CD90以及VCAM1阳性细胞(％)的流式细胞术(FCM)解析的结果图。

图5是各种成纤维细胞(CF、uCF、u90⁺CF)施用1周后的肾脏切片(皮质区域和髓质外层部区域)的SR染色或PAS染色的显微镜照片。图中，Ctrl示出溶剂对照组的染色图像，Sham示出未进行输尿管结扎的左肾组织的染色图像。

具体实施方式

以下，使用具体实施方式对本发明进行详细说明，但本发明不仅限于所示的具体实施方式。

本发明的一实施方式是一种肾疾病治疗用医药组合物，含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞。

成纤维细胞的来源没有限定，可以分化使用胚胎干细胞(ES细胞)、人工多能干细胞(iPS细胞)以及Muse细胞(multilineage differentiating stress enduring cells：多系分化持续应激细胞)等多能干细胞或间充质干细胞等成体干细胞。另外，可以使用从动物(包括人类)采集的原代细胞，也可以使用株化细胞。

成纤维细胞例如可举出来源于心脏、来源于肾脏、来源于皮肤等，优选来源于心脏。

成纤维细胞没有特别限定，优选来源于成体。

作为VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的来源的成纤维细胞可以原本表达一定量的VCAM1以及/或CD90，也可以完全不表达。

另外，在本实施方式中，成纤维细胞可以是指表达通常的成纤维细胞所表达的细胞表面标记的细胞，也可以是指进一步通过后述的本发明的细胞制造方法，额外表达了其他标记或未表达部分标记的细胞。

在来源于人的成纤维细胞中，VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的比例较低，在天然状态下，心脏来源成纤维细胞最多为1.08％(细胞数基准)左右。例如，在本实施方式的医药组合物中，VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞相对于含有的全部成纤维细胞的比例没有特别限定，以细胞数为基准，例如可以为0.82％以上，可以为1.08％以上，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为49.07％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为71.96％以上，可以为79.75％以上，可以为80％以上，可以为89.89％以上，可以为90％以上，可以为95％以上，或者可以为超过0.82％，可以为超过1.08％，可以为超过5％，可以为超过10％，可以为超过20％，可以为超过30％，可以为超过40％，可以为超过49.07％，可以为超过50％，可以为超过60％，可以为超过70％，可以为超过71.96％，可以为超过79.75％，可以为超过80％，可以为超过89.89％，可以为超过90％，可以为超过95％。

在来源于人的成纤维细胞中，VCAM1⁺成纤维细胞的比例没有特别限定，以细胞数为基准，例如可以为1.18％以上，可以为1.53％以上，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为80.86％以上，可以为90％以上，可以为90.28％以上，可以为90.91％以上，可以为93.49％以上，可以为95％以上，或者可以为超过1.18％，可以为超过1.53％，可以为超过5％，可以为超过10％，可以为超过20％，可以为超过30％，可以为超过40％，可以为超过50％，可以为超过60％，可以为超过70％，可以为超过80％，可以为超过80.86％，可以为超过90％，可以为超过90.28％，可以为超过90.91％，可以为超过93.49％，可以为超过95％。

在来源于人的成纤维细胞中，CD90⁺成纤维细胞的比例没有特别限定，以细胞数为基准，例如可以为41.55％以上，可以为50％以上，可以为55.17％以上，可以为56.83％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为76.83％以上，可以为80％以上，可以为86.49％以上，可以为90％以上，可以为94.58％以上，可以为95％以上，或者可以为超过41.55％，可以为超过50％，可以为超过55.17％，可以为超过56.83％，可以为超过60％，可以为超过70％，可以为超过76.83％，可以为超过80％，可以为超过86.49％，可以为超过90％，可以为超过94.58％，可以为超过95％。

本实施方式的医药组合物中的成纤维细胞也可以是含有上述的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的成纤维细胞组。

(成纤维细胞的准备)

在成纤维细胞的准备中，成纤维细胞的来源没有特别限定，如上所述。另一方面，可以为来源于自身的细胞，例如准备从患有心脏疾病的患者的心脏组织分离的心脏成纤维细胞、使患者的成体(体性)干细胞分化而分离的心脏成纤维细胞。另外，也可以是使来源于自身细胞的iPS细胞等多能干细胞分化而回收的成纤维细胞。并且，可以为自身以外的细胞，例如准备来源于提供心脏细胞的提供者的心脏组织、从利用动物等制作的心脏组织分离的心脏成纤维细胞、使提供者的成体(体性)干细胞分化而分离的心脏成纤维细胞。另外，也可以是使来源于提供者的iPS细胞、ES细胞等多能干细胞分化而回收的成纤维细胞。

(成纤维细胞的分离)

所准备的成纤维细胞典型地可以通过如分散酶(Dispase)、胶原酶那样的酶进行处理来分离。分离除了通过如分散酶、胶原酶那样的酶进行以外，只要可以进行所需的分离，也可以是其它处理，例如机械处理。

(VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的制造方法)

包括使TNF-α以及IL-4接触成纤维细胞，以及在VCAM1以及CD90均可以为阳性的条件下培养所述接触的成纤维细胞。

成纤维细胞与TNF-α以及IL-4的接触方法只要VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的诱导不受显著损害就没有特别限定，典型的是向含有成纤维细胞的培养基中添加TNF-α以及IL-4，但不限于此。TNF-α以及IL-4可以仅添加一种，也可以添加多种。在多种的情况下，可以各自分别与成纤维细胞接触，也可以同时接触。例如，可以将TNF-α以及IL-4溶解于水、培养基、血清或者二甲基亚砜(DMSO)之后，再添加到培养基中。

由于能够在添加了TNF-α以及IL-4的培养基中培养成纤维细胞，所以能够在维持成纤维细胞中的VCAM1以及CD90的表达水平的情况下培养成纤维细胞。因此，能够制造具有高VCAM1以及CD90表达水平的成纤维细胞。

向培养基(mL)中添加TNF-α以及IL-4时，TNF-α的添加量没有特别限定，通常为0.1ng/mL以上，可以为0.5ng/mL以上，可以为1ng/mL以上，可以为10ng/mL以上，可以为50ng/mL以上。上限没有特别限定，通常为500ng/mL以下，可以为100ng/mL以下。

另外，IL-4的添加量没有特别限定，通常为0.1ng/mL以上，可以为0.5ng/mL以上，可以为1ng/mL以上，可以为2ng/mL以上。上限没有特别限定，通常为10ng/mL以下，可以为5ng/mL以下，可以为1ng/mL以下。

添加的TNF-α与IL-4之比(重量比)用TNF-α：IL-4表示通常为10000：1～1：1，也可以为50000：1～10：1。另外，可以为1：1～1：10000，也可以为1：10～1：50000。

通过进一步培养与TNF-α以及IL-4接触的成纤维细胞，能够制造VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞。

成纤维细胞的培养只要成纤维细胞在VCAM1以及CD90可以为阳性的条件下就没有特别限定，可通过已知的细胞培养方法进行。

用于培养的培养基可以根据要培养的细胞的种类等适当设定，例如，可以使用DMEM、α-MEM、RPMI-1640、HFDM-1(⁺)等。可以向该培养基中添加FCS(fetal bovine serum：胎牛血清)或FBS(fetal calf serum：胎牛血清)等营养物质、增殖因子、细胞因子、抗生素等。进一步，也可以用含有TNF-α以及IL-4的培养基进行培养。

培养周期能够根据培养的细胞达到所希望的细胞数以及/或直到培养的细胞具有所希望的功能为止等目的适当设定培养时间或培养天数。例如，可举出1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、15小时、18小时、21小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、2周、1个月、2个月、3个月、6个月等周期。

培养温度可以根据要培养的细胞的种类适当设定，例如可以为10℃以上、15℃以上、20℃以上、25℃以上、30℃以上，或者可以为60℃以下、55℃以下、50℃以下、45℃以下、40℃以下。

培养可以进行多次。例如，能够通过选择或浓缩来提高所希望的成纤维细胞的纯度，并且每次进行培养。

在成纤维细胞的制造中，可以进一步包括使用抗CD106抗体以及/或抗CD90抗体选择或浓缩VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞。选择或浓缩的方法没有特别限定，能够以本领域技术人员已知的方法进行。例如，能够通过如下方式进行，即，用人CD106(VCAM-1)-生物素(美天旎生物技术公司)实施一次免疫染色，用抗生物素微珠(美天旎生物技术公司)进行二次免疫染色，将染色的细胞用autoMACS自动磁性细胞分选仪(美天旎生物技术公司)进行回收，另外，还能够通过如下方式进行，即，用CD90-PE抗体(美天旎生物技术公司)实施一次免疫染色，用抗PE微珠(美天旎生物技术公司)进行二次免疫染色，将染色的细胞用autoMACS自动磁性细胞分选仪(美天旎生物技术公司)进行回收。另外，选择或浓缩可以在任何时机进行。

抗CD106抗体能够使用已知的抗体，并能够获得市售产品来使用。

培养的成纤维细胞的回收例如可以通过胰蛋白酶等蛋白酶剥离细胞进行回收，但也可以使用温度响应性培养皿通过温度变化使细胞剥离并进行回收，也可以使用细胞刮刀等器具剥离细胞并进行回收。

通过将本实施方式的医药组合物施用或移植到活体内能够治疗肾疾病。作为肾疾病没有特别限定，例如，能够举出急性肾损伤(AKI)、慢性肾脏病(CKD)、糖尿病性肾病、急性肾小球肾炎(急性肾炎)、慢性肾小球肾炎(慢性肾炎)、急进性肾小球肾炎、肾病综合征、急性肾功能衰竭、慢性肾功能衰竭。优选地，肾损伤为急性肾损伤(AKI)或慢性肾脏病(CKD)。

将本实施方式的医药组合物向活体施用或移植的方法没有特别限定，例如能够通过注射来施用。通过将医药组合物直接施用或移植到肾脏组织以及/或其周边区域(例如，肾被膜下等)，能够治疗上述肾疾病。医药组合物也可以向静脉、动脉、淋巴结、淋巴管、骨髓、皮下、阴茎海绵体、腹腔内施用。向静脉、动脉、淋巴管的施用既可以通过向脉管内的注射，也可以通过导管注入，也可以采用其他已知的方法。

注射的方法没有特别限定，能够采用有针注射、无针注射等已知的注射方法，用于注入的导管的方法也能够采用已知方法，没有特别限定。

另外，本实施方式的医药组合物没有特别限定，可以作为人工脏器材料应用于活体，例如，该人工脏器材料可以是细胞被构筑为平面状或立体状的细胞组织而构成的。该平面状或立体状的细胞组织可以是单独培养成纤维细胞而形成的，或者也可以是在共培养成纤维细胞和其他细胞例如肾细胞的基础上而形成的平面状或立体状的细胞组织。作为平面状或立体状的细胞组织，没有特别限定，例如可以例示出细胞片、细胞纤维、由3D打印机形成的组织等。

在本实施方式中，平面状或立体状的细胞组织的大小或形状只要能够应用于坏死、损伤或纤维化的肾脏组织以及/或其周边区域以及/或病变区域就没有特别限定。另外，平面状是指单层或多层中的任一者。

此外，细胞培养中的培养基组成、温度、湿度等条件只要能够培养VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞且能够构筑平面状或立体状的细胞组织就没有特别限定。

通过将这样的平面状或立体状的细胞组织应用到坏死、损伤或纤维化的肾脏组织以及/或其周边区域，或者通过作为人工脏器与坏死、损伤或纤维化的肾脏组织以及/或其周边区域进行更换，能够治疗肾疾病。

医药组合物所含的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的比例基于向患者施用或移植的方式等适当设定，只要作为有效成分含有治疗上有效量的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞即可。

医药组合物所含的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞数例如能够为1.0×10²cells/mL以上，1.0×10³cells/mL以上，1.0×10⁴cells/mL以上，1.0×10⁵cells/mL以上，5.0×10⁶cells/mL以上，1.0×10⁷cells/mL以上。注射用组合物所含的VCAM1阳性成纤维细胞数可以根据疾病的程度进一步增减。

由医药组合物起到的上述治疗效果的确认方法没有特别限定，例如可例示出与医药组合物的施用前或移植前相比，医药组合物的施用后或移植后的肾功能得到改善等。肾功能的改善能够通过如下方式判断，即，例如因患有肾疾病而增加的尿量在医药组合物施用后朝向正常的尿量减少，或因患有肾疾病而成为高值的血肌酐浓度(Cre)或血尿素氮浓度(BUN)在医药组合物施用后朝向正常的浓度范围下降等。

医药组合物也可以含有生理学上允许的其他成分作为医药组合物。作为这样的其他成分，可以举出生理盐水、细胞保存液、细胞培养液、水凝胶、细胞外基质、冷冻保存液等。

作为本发明的其他实施方式，可以是包括心脏来源成纤维细胞而构成的肾疾病治疗剂。其特征在于将心脏来源成纤维细胞用于肾疾病治疗。

在本实施方式中，心脏来源成纤维细胞可以含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞。另外，VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞相对于所述治疗剂中的全部成纤维细胞的比例没有特别限定，以细胞数为基准，例如可以为0.82％以上，可以为1.08％以上，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为49.07％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为71.96％以上，可以为79.75％以上，可以为80％以上，可以为89.89％以上，可以为90％以上，可以为95％以上，或者可以为超过0.82％，可以为超过1.08％，可以为超过5％，可以为超过10％，可以为超过20％，可以为超过30％，可以为超过40％，可以为超过49.07％，可以为超过50％，可以为超过60％，可以为超过70％，可以为超过71.96％，可以为超过79.75％，可以为超过80％，可以为超过89.89％，可以为超过90％，可以为超过95％。

在本实施方式中，心脏来源成纤维细胞可以含有VCAM1⁺成纤维细胞。在来源于人的成纤维细胞中，VCAM1⁺成纤维细胞的比例没有特别限定，以细胞数为基准，例如可以为1.18％以上，可以为1.53％以上，可以为5％以上，可以为10％以上，可以为20％以上，可以为30％以上，可以为40％以上，可以为50％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为80％以上，可以为80.86％以上，可以为90％以上，可以为90.28％以上，可以为90.91％以上，可以为93.49％以上，可以为95％以上，或者可以为超过1.18％，可以为超过1.53％，可以为超过5％，可以为超过10％，可以为超过20％，可以为超过30％，可以为超过40％，可以为超过50％，可以为超过60％，可以为超过70％，可以为超过80％，可以为超过80.86％，可以为超过90％，可以为超过90.28％，可以为超过90.91％，可以为超过93.49％，可以为超过95％。

在本实施方式中，心脏来源成纤维细胞可以含有CD90⁺成纤维细胞。在来源于人的成纤维细胞中，CD90⁺成纤维细胞的比例没有特别限定，以细胞数为基准，例如可以为41.55％以上，可以为50％以上，可以为55.17％以上，可以为56.83％以上，可以为60％以上，可以为70％以上，可以为76.83％以上，可以为80％以上，可以为86.49％以上，可以为90％以上，可以为94.58％以上，可以为95％以上，或者可以为超过41.55％，可以为超过50％，可以为超过55.17％，可以为超过56.83％，可以为超过60％，可以为超过70％，可以为超过76.83％，可以为超过80％，可以为超过86.49％，可以为超过90％，可以为超过94.58％，可以为超过95％。

本实施方式的治疗剂中的成纤维细胞可以为含有上述的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的成纤维细胞组。

在本实施方式中，当心脏来源成纤维细胞含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞时，能够通过上述的肾疾病治疗用医药组合物中记载的(VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的制造方法)项中记载的制造方法来制造。

在本实施方式中，能够引用上述的肾疾病治疗用医药组合物中记载的(成纤维细胞的准备)、(成纤维细胞的分离)的项中的记载、进而肾疾病的种类、施用或移植方法、成纤维细胞数、治疗效果的确认方法等记载。

在本实施方式中，“包括心脏来源成纤维细胞而构成”是指除了心脏来源成纤维细胞以外，还可以含有作为治疗剂生理学上允许的其他成分。作为这样的其他成分，可以举出生理盐水、细胞保存液、细胞培养液、水凝胶、细胞外基质、冷冻保存液等。

作为本发明的其他实施方式，可以是通过将上述含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的医药组合物施用或移植到肾脏组织以及/或其周边区域来治疗肾疾病的方法。

另外，作为本发明的其他实施方式，能够将上述含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞的医药组合物作为注射剂或移植材料应用，为了治疗肾疾病，所述注射剂或移植材料用于施用或移植到肾脏组织以及/或其周边区域。

实施例

通过以下实施例更详细地说明本发明，但当然本发明的范围不仅限于实施例。

＜成纤维细胞的分离、增殖以及细胞分选＞

为了分离人成人心脏成纤维细胞(CF)，首先购入人成人的全心脏(Science Care，菲尼克斯，亚利桑那州)。然后，从右心耳获得5片约2mm²的新鲜人心肌组织。之后，用磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗该心肌组织，用500U/mL的liberase(罗氏公司，巴塞尔，瑞士)进行了1小时的酶消化。使用添加了20％(v/v)新生牛血清(NBCS)的HFDM-1(+)培养基(株式会社细胞科学研究所，宫城，日本)，在T25烧瓶上培养了消化的组织。播种10天后，将CF传代培养至其他细胞培养烧瓶，用添加了1％(v/v)NBCS的HFDM-1(+)培养基培养并使其增殖。将该增殖后的CF用于以下实验。

为了分离VCAM1⁺且CD90⁺CF，首先，用50ng/mL的TNF-α(派普泰克公司，克兰伯里，新泽西州)和2ng/mL的IL-4(富士胶片和光纯药株式会社，大阪，日本)培养CF，如已报告的(专利文献1)那样，使CF上的VCAM1的表达上调。之后，用CD90-PE抗体(美天旎生物技术公司，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)以及抗PE微珠(美天旎生物技术公司)标记后，用autoMACS ProSeparator(美天旎生物技术公司，贝尔吉施格拉德巴赫，德国)以CD90为指标从uCF分离了CD90⁺CF。

＜流式细胞术解析＞

将CF、uCF以及u90⁺CF与CD90-PE抗体(美天旎生物技术公司)以及CD106(VCAM1)-BV421抗体(BD Biosciences，圣何塞，加利福尼亚州)培养了30分钟。将REA对照(S)-PE(美天旎生物技术公司)以及小鼠IgG1、κ同型对照-BV421(BD Biosciences)作为同型对照使用。FCM解析使用MACSQuant Analyzer按照制造商的指示书进行(美天旎生物技术公司)。

＜动物实验＞

实施例2中的动物实验是在东京女子医科大学的动物实验委员会的批准下实施的(批准编号：AE21-017)。购入8-9周龄的雄性胸腺缺损裸大鼠(F344/NJcl-rnu/rnu)(日本clea株式会社，东京，日本)，饲养至10-11周龄，体重200-250g。为了把动物的痛苦降到最低而进行了最大努力。所有的动物实验都是用盲态审核的方法进行的。

用汽化器将大鼠通过3～4％的异氟醚麻醉，手术过程中在保持为37℃的加热板上维持1.5～2％的异氟醚。虽然没有使用镇痛剂，但尽量减少了切开部分。所有大鼠都在缺血再灌注损伤(IRI)处理前1周接受了右肾摘除手术。通过切开侧腹使右肾露出，将肾动脉、肾静脉及输尿管从周围的脂肪小心地分离，并在结扎后切除，从而摘除了右肾。另外，在右肾摘除后第7天对大鼠进行正中切开，使左肾、左肾动脉及左肾静脉露出。之后，用一次性血管夹(TKM-1；株式会社bearmedic，东京，日本)夹住肾蒂40分钟。取下夹子，目视确认了再灌注。之后，如下所示，将细胞或溶剂注入到了肾被膜的正下方。

将动物随机分为3组，分别施用了不同的受试物质：人CF的注入(CF：将3×10⁶细胞添加到50μL的Bambanker细胞冻存液(日本genetics株式会社，东京，日本)；n＝7)中，人VCAM1⁺CF的注入(uCF：将3×10⁶细胞添加到50μL的Bambanker细胞冻存液；n＝2)中，人VCAM1⁺以及CD90⁺CF的注入(u90⁺CF：将3×10⁶细胞添加到50μL的Bambanker细胞冻存液中；n＝4)，以及溶剂的注入(对照组：50μL的Bambanker细胞冻存液；n＝7)。通过血肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)监测了肾功能。血液样本是以细胞施用日为第0天时，在第-2天、第2天、第4天、第7天、第14天从尾静脉采集的。另外，采尿是以细胞施用日为第0天时，在第-2天、第4天、第14天进行的。体重是以细胞施用日为第0天时，在第-7天、第-2天、第0天、第2天、第4天、第7天、第14天进行监测的。在监测期结束时(第14天)杀死动物，摘除左肾脏并测量重量，用4％多聚甲醛(武藤化学株式会社，东京，日本)固定。IRI处理失败以及/或术后立即死亡的动物被排除在试验之外。术后观察期间死亡的大鼠虽然包括在生存率分析中，但从其他实验排除。

实施例3中的动物实验是在东京女子医科大学的动物实验委员会的批准下实施的(批准编号：AE22-002)。购入9周龄的雄性SD大鼠(日本SLC，静冈，日本)。经过数天的驯化后实施了实验。为了把动物的痛苦降到最低而进行了最大努力。

对SD大鼠进行麻醉，小心分离右输尿管并进行了结扎。在输尿管结扎后，对所有动物均在肾被膜的正下方局部施用了受试物质。

将动物随机分为4组，分别施用了不同的受试物质：溶剂的注入(对照组：70μL的含有0.33％透明质酸的生理盐水，n＝2)，CF的注入(CF，将3×10⁶细胞添加到70μL的溶剂中，n＝1)，用TNF-α和IL-4处理的CF的注入(uCF，将3×10⁶细胞添加到70μL的溶剂中，n＝1)，以及VCAM1⁺及CD90⁺CF的注入(u90⁺CF，将3×10⁶细胞添加到70μL的溶剂中，n＝2)。在受试物质施用的1周后杀死动物，采集了肾脏。

＜组织染色＞

实施例2中的组织染色以如下方式进行。将摘除后固定的肾脏包埋在石蜡中。为了进行组织学分析，将组织以10μm的厚度薄切，用天狼星红进行了染色。用ImageJ/FIJI软件定量化了天狼星红染色阳性区域的间质纤维化。

另外，实施例3中的组织染色以如下方式进行。将摘除后固定的肾脏包埋在石蜡中。为了进行组织学分析，将组织以5μm的厚度薄切，用天狼星红或者PAS(Periodic acidSchiff：过碘酸-雪夫)进行了染色。

＜实施例1：原代培养的人成人来源心脏成纤维细胞的特征＞

从人心肌组织分离人心脏成纤维细胞(CF)并进行培养，CF伸长并增殖，作为成纤维细胞的表型，成为了典型的平坦且纺锤形的形状(图1中的A)，上述人心肌组织是从全心脏的右心耳采集的。流式细胞术解析的结果表明，CF分别表达1.07±0.46％的VCAM1、46.11±9.06％的CD90，它们的双阳性(DP)的比例为0.74±0.34％(n＝2，平均值±标准偏差(SD)，图1中的B)。为了提高CF的VCAM1和CD90的表达，如已报告的(专利文献1)那样，将CF用50ng/mL的TNF-α和2ng/mL的IL-4进行了3天的处理。通过该处理，VCAM1和CD90均表达提高，用TNF-α和IL-4培养的CF(uCF)表达90.91％的VCAM1，表达76.83％的CD90，DP的比例为71.96％(n＝1；图1中的B)。接着，从uCF分离VCAM1⁺以及CD90⁺的CF(u90⁺CF)，VCAM1表达为95.43±1.94％，CD90表达为97.47±2.89％，DP的比例为93.57±3.68％(n＝6，平均值±SD；图1中的B)。

＜实施例2：uCF以及u90⁺CF在通过IRI诱发了AKI的大鼠模型中使肾功能改善＞

为了评价uCF以及u90⁺CF在通过IRI诱发了AKI的大鼠模型中是否改善肾功能，向该大鼠模型施用了CF、uCF或u90⁺CF。实验步骤的概要如图2中的A所示。在各个细胞施用组与溶剂对照组(图中，表示为Ctrl)之间进行比较的结果，uCF施用组(图中，表示为+uCFs)、u90⁺CF施用组(图中，表示为+u90⁺CFs)或者溶剂对照组的生存率比CF施用组(图中，表示为+CFs)高(图2中的B)。体重在CF施用组以及uCF施用组中减少，在溶剂对照组和u90⁺CF施用组中示出同样的倾向(图2中的C)。另一方面，肾脏的平均重量在+u90⁺CF施用组中最少(图2中的D)，尿量则是溶剂对照组在细胞施用日第4天最多(图2中的E)。关于肾功能，在细胞施用后第2～7天，CF、uCF或u90⁺CF施用组的Cre和BUN的值变低(图2中的F、G、H、I、J以及K)。

进一步地，通过SR染色，明确了各组的肾脏组织中的纤维化结构的存在(图3中的A)。纤维化的程度(即，在中心部、背侧及腹侧部、肾脏整体中的通过SR染色的表面积的比例)在CF施用组或u90⁺CF施用组中有减少的倾向(图3中的B)。由以上可知，uCF或u90⁺CF的施用在通过IRI诱发了AKI的对象中示出高生存率，可改善肾功能。进一步地，可知u90⁺CF还具有抑制纤维化的效果。

＜实施例3：肾纤维化大鼠模型中的CD90⁺以及VCAM1⁺人心脏成纤维细胞所起到的纤维化的预防和改善效果＞

由于肾脏病在初期几乎没有自觉症状，所以作为本发明的对象的患者的一部分是进行了重构(remodeling)的慢性肾脏病(CKD)患者。因此，着眼于对CKD中的肾脏重构的主要反应即纤维化的治疗效果，目的在于确认成人心脏成纤维细胞对CKD的效果。具体地，对于作为肾纤维化的模型而广泛使用的单侧输尿管梗阻(UUO)模型，注入成人心脏成纤维细胞，从病理学方面评价了对于肾纤维化的治疗效果以及抑制效果。

首先，确认了原代人成人心脏成纤维细胞的特征。从人心肌组织分离人心脏成纤维细胞(CF)并进行了培养，CF伸长增殖，作为成纤维细胞的细胞形态示出了典型的平坦且纺锤形的形状(图4中的A)，上述人心肌组织是从心脏的右心耳采集的。流式细胞术解析的结果如图4中的B所示。CF分别表达1.18％的VCAM1，41.55％的CD90，它们的双阳性(DP)的比例为0.82％(n＝1)。用TNF-α和IL-4处理的CF(uCF)分别表达80.86％的VCAM1，56.83％的CD90，它们的双阳性(DP)的比例为49.07％(n＝1)。接着，将uCF以CD90为指标进行细胞分选并回收阳性份数(positive fraction)，结果分离了VCAM1⁺以及CD90⁺的CF的u90⁺CF分别表达90.28％的VCAM1，86.49％的CD90，它们的双阳性(DP)的比例为79.75％(n＝1)。

为了评价CD90⁺以及VCAM1⁺人成人心脏成纤维细胞对肾纤维化的有效性，首先，用外科手术制作UUO大鼠模型，施用了各种的心脏成纤维细胞(CF、uCF或u90⁺CF)。在细胞施用1周后采集肾脏，将各组的皮质区域以及髓质外层部区域用天狼星红染色以及PAS染色并且观察的结果如图5所示。在图5中，Ctrl示出溶剂对照组的染色图像，Sham示出未进行输尿管结扎的左肾组织的染色图像。作为天狼星红染色的结果，在Sham和u90⁺CF施用组中，在皮质区域以及髓质外层部区域的两个区域中几乎未示出纤维化，但在其他组中观察到广泛的纤维化区域。另外，在PAS染色中，在Sham和u90⁺CF施用组中，示出在皮质区域以及髓质外层部区域的两个区域中近端小管损伤及曲小管扩张较少。另一方面，在其他组中，观察到很多近端小管损伤及曲小管扩张，确认了曲小管的萎缩、坏死的观察结果。确认到刷状缘在除Sham和u90⁺CF施用组以外的所有组中均剥离，仅残留少量。

这些结果表明，u90⁺CF有助于肾纤维化的预防以及治疗，对伴随肾损伤的肾组织结构发挥有益效果。因此，表明u90⁺CF不仅对纤维化有效，而且对慢性肾脏病的恶化所伴随的结构缺陷导致的肾功能也有效。

Claims (12)

1.一种医药组合物，用于治疗肾疾病，含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞，其中，

所述医药组合物中的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞相对于全部成纤维细胞的比例超过1.08％。

2.根据权利要求1所述的医药组合物，其中，

所述成纤维细胞来源于心脏。

3.根据权利要求1或2所述的医药组合物，其中，

所述成纤维细胞来源于成体。

4.根据权利要求1～3中的任一项所述的医药组合物，其中，

所述肾疾病为急性肾损伤或慢性肾脏病。

5.根据权利要求1～4中的任一项所述的医药组合物，其中，

为注射用组合物。

6.根据权利要求1～4中的任一项所述的医药组合物，其中，

所述细胞是被构筑为平面或立体形状的细胞组织而构成的。

7.一种肾疾病治疗剂，其中，包括心脏来源成纤维细胞而构成。

8.根据权利要求7所述的治疗剂，其中，

所述心脏来源成纤维细胞含有VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞，

所述治疗剂中的VCAM1⁺且CD90⁺成纤维细胞相对于全部成纤维细胞的比例超过1.08％。

9.根据权利要求7或8所述的治疗剂，其中，

所述心脏来源成纤维细胞来源于成体。

10.根据权利要求7～9中的任一项所述的治疗剂，其中，

所述肾疾病为急性肾损伤或慢性肾脏病。

11.根据权利要求7～10中的任一项所述的治疗剂，其中，

为注射用组合物。

12.根据权利要求7～10中的任一项所述的治疗剂，其中，

所述细胞是被构筑为平面或立体形状的细胞组织而构成的。