JPH03135767A - ジカチオンエーテル類を使用するポリマー粒子への化合物の付着方法およびそれを含有するキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 ポリマー粒子のような不溶性材料に付着されている生活
性ポリペプチド類またはタンパク質は多方面で使用され
ている。例えば、人間および動物における病理学的症状
または他の状態の診断では、人間または動物の体液にお
ける免疫学的反応性種、例えば抗体または抗原の測定の
ための免疫学的原理を利用することがしばしば行われて
いる。抗原は、薬物、ハプテン、毒素、レクチン、ポリ
ペプチドまたはタンパク質のように外来物質であり、体
内に入ったとき抗体産生をもたらす。

他のタンパク質およびアミン含有化合物類、例えば酵素
、アビジン、ビオチンまたは多糖類は、アフィニティー
クロマトグラフィー、酵素反応、特異的パインディング
反応およびイムノアッセイで使用するために各種担体材
料に共有結合されてきた。

カルボキシル化ラテックス粒子は診断薬を調製するため
に使用されている（米国特許筒４，１８１，６３６号）
。

［発明が解決しようとする課題〕 表面カルボキシル基を有する粒子に免疫学的反応性種を
共有結合する常法は、水溶性カルボジイミドの使用を伴
う。このような方法はすべての構造物中で使用するのに
適さないとの課題がある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、Ａ、　（１）粒子表面にペンダントカルボキ
シル基を有するポリマー粒子の水性懸濁液を、（２）試
薬と接触させてペンダント中間反応性基を有する反応性
中間体ポリマー粒子を形成する工程、ならびに Ｂ、工程Ａで形成される反応性中間体ポリマー粒子を、
前記中間反応性基と反応する反応性アミン基もしくは反
応性スルフヒドリル基をそれぞれ有するアミンもしくは
スルフヒドリル含有化合物と接触させて前記粒子と前記
反応性化合物との間で共有結合を形成する工程を含んで
なり、かつ前記試薬がジカチオンエーテルであることを
特徴とするポリマー粒子への反応性アミンもしくはスル
フヒドリル含有化合物の特殊な付着方法を提供する。

この発明はまた、（１）粒子表面にペンダントカルボキ
シル基を有するポリマー粒子、および（２）ジカチオン
エーテルを含んでなるキットも提供する。

シカチオン類は前記反応性化合物の反応性アミン基また
はスルフヒドリル基を無差別に失活させるであろうと殆
ど予期されている。意外にも、本発明者らはこのことが
事実でないことを見い出し、それによって本明細書に開
示し特許請求する非常に有用でそして有効な付着方法を
発見した。

以下本発明を具体的に説明する。

本発明の方法により調製される物質は、多様な化学的お
よび生物学的手段に使用することができる。例えば、そ
れらはアフィニティークロマトグラフィー、酵素によっ
て触媒される反応、水の浄化、被分析物が付着したポリ
ペプチドやタンパク質に特異的パインディング親和性を
有する免疫学的反応性種である場合のイムノアッセイ、
ならびに当該技術分野の当業者に既知の他の手段に使用
することができる。ある例では、本発明を使用して、さ
らに生物学的標的化合物、例えば薬物、ホルモン類、酵
素類、抗生物質または他のタンパク質もしくは多し！類
と反応することができる中間的な結合性成分を付着する
ことができる。

本発明によって調製される材料の使用の一つは、凝集ア
ッセイにおける凝集免疫試薬としてであり、この場合の
検出されるべき被分析物または物質は、ヒトまたは動物
の生物学的流体、細胞または組織抽出物であり、これら
に対する免疫学的相対物（または受容体）は入手可能で
あるかまたは生産することができる。限定されるもので
ないが、本発明の試薬を使用して検出することができる
代表的な免疫学的または生物学的反応性種としては、生
菌体（細菌、プロトシア、ファンジー、ウィルスおよび
リケッチア）、臓器特異性抗原を初めとする組織抗原、
ホルモン、酵素、血液中に見い出される血液細胞抗原も
しくは他の物質、血漿タンパク質、乳タンパク質、唾液
タンパク質、尿タンパク質、病理学上のタンパク質、自
己抗体を初めとする抗体および薬物が挙げられる。この
ような例では、この発明の方法で使用される反応性アミ
ンもしくはスルフヒドリル含有化合物が標的被分析物に
対する受容体である免疫学的化合物となる。

もう一つの態様では、本明細書で開示される材料は粒子
に付着した酵素を有することができる。

この様式で付着することができる酵素には、本発明によ
って酵素活性を失うことなくその粒子上の活性ペンダン
ト基と反応することができる反応性アミン基または反応
性スルフヒドリル基を有するものが包含される。

さらにもう一つの態様では、この発明によって調製され
る材料は、溶液もしくは乾式（乾式分析要素）のいずれ
か、あるいはイムノメトリックアッセイ、例えば「サン
ドインチ」アッセイのような当該技術分野で既知のいず
れかの競合的パインディングアッセイで使用することが
できる。

この発明の方法は、ジカチオンエーテル化合物を使用し
て、外表面反応性カルボキシル基を有するポリマー粒子
に、それぞれ反応性アミン基または反応性スルフヒドリ
ル基を有する反応性アミンまたはスルフヒドリル含を化
合物を付着する工程を伴う二段階の方法である。

有用なジカチオンエーテル類は、次式ＣＩ）でこの式に
おいて、Ｒ，は水素、アルキル、アラルキル、アリール
、アルケニル、−ＹＲ７、を表わすと共に、Ｙはイオウ
または酸素を表わしており、そしてＲ７＋　Ｒ８＋　Ｒ
９＋　ＲＩ　ＯおよびＲ１１は、それぞれ独立してアル
キル、アラルキル、アリールまたはアルケニルを表わし
ている。また、Ｒ８とＲ９、もしくはＲ３゜とＲ５１は
一緒になって環構造を形成してもよい。Ｒ１゜とＲ１１
はまた、それぞれ水素であってもよい。また、Ｒ＋　と
Ｒ２は一緒になって複素環式環を形成してもよい。

Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立してアルキル、アラルキル
、アリールまたはアルケニルを表わすか、あるいはＲ８
と組み合わさるか、または相互に組み合わさって複素環
式環を形成する。

Ｒａ、ＲｓおよびＲ６は、それぞれＲ１Ｒ２およびＲ３
と同様に定義され、そしてＲ，、Ｒ，またはＲ３と同一
または相違する。

Ｘθは分子内塩を形成するような化合物のアニオンまた
はアニオン部分を表わす。

式（１）のジカチオンエーテル類は、以下にさらに詳細
に記載される。

Ｒ，は水素、アルキル、アラルキル、アリール、アルケ
ニル、−ＹＲ，、 または酸素を表わしており、そしてＲ７１Ｒ８＋　Ｒｑ
＊Ｒ１゜およびＲ１１は、それぞれ独立してアルキル、
アラルキル、アリールまたはアルケニルを表わしている
。また、Ｒ８とＲ９、もしくはＲ１゜とＲＩ＋は一緒に
なって環構造を形成してもよい。Ｒ８゜とＲ１１はまた
、それぞれ水素を表わすこともできる。

また、Ｒ１はＲ２と一緒になって複素環式環（この環は
さらに他の環と縮合していてよい）を形成してもよい。

好ましくは、Ｒ１は、水素、炭素原子１〜２０個のアル
キル（例えば、メチル、エチル、ブチル、２−エチルヘ
キシルもしくはドデシル）、炭素原子７〜２０個のアラ
ルキル（例えば、ベンジル、フェネチル）、炭素原子６
〜２０個のアリール（例えば、フェニル、ナフチル）、
炭素原子２〜２０個のアルケニル（例えば、ビニル、プ
ロペニル）、Ｒ８はＲ２またはＲ３と組み合わさって原
子５〜８個の複素環式環を形成することもできる。この
環はＲ２とＲ１が式（Ｉ）で結合されている窒素原子を
含み、そして追加の窒素原子、または酸素もしくはイオ
ウ原子を含んでよい。このような環の具体例としては、
ピリジン、キノリン、イソキノリン、チアゾール、ベン
ゾチアゾール、チアゾリン、オキサゾール、ベンゾオキ
サゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾールおよびオ
キサゾリンが挙げられる。

Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，、Ｒ，。およびＲ１１は、好ましくは
炭素原子１〜２０個のアルキル（例えば、メチル、エチ
ル、ブチル、２−エチルヘキシルもしくはドデシル）、
炭素原子７〜２０個のアラルキル（例えば、ベンジル、
フェネチル）、炭素原子６〜２０個の了り−ル（例えば
、フェニル、ナフチル）または炭素原子２〜２０個のア
ルケニル（例えば、ビニル、プロペニル）である。

Ｒ８とＲ１、またはＲｔｏとＲ１１は組み合わさって原
子５〜８個の環構造を形成することもできる。

このＲ，−Ｒ，の環は、ＲａとＲ９が結合した窒素原子
を含み、そしてまた追加の窒素原子または酸素もしくは
イオウ原子も含むことができる。

ＲＩＯＲ，１１の環はまた、１個以上の窒素原子、酸素
原子、イオウ原子またはこれらのいずれかの組み合わせ
たものを含んでよい。このような環の例としては、ピロ
リジン、ピペリジンおよびモルホリンが挙げられる。

Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立してアルキル、アリー
ル、アラルキル、アルケニルを表わすか、あるいはＲ１
と組み合わさって、または相互に組み合わさって複素環
式環を形成してもよい。好ましくは、Ｒ２またはＲ３は
、それぞれ炭素原子１〜２０個のアルキル（例えば、メ
チル、エチル、ブチル、２−エチルヘキシルもしくはド
デシル）、炭素原子７〜２０個のアラルキル（例えば、
ベンジル、フェネチル）、炭素原子６〜２０個のアリー
ル（例えば、フェニル、ナフチル）または炭素原子２〜
２０個のアルケニル（例えば、ビニル、プロペニル）で
ある。Ｒ２およびＲ３はまた、好ましくは相互に組み合
わさって原子５〜８個の複素環式環を形成する。この環
はＲ２とＲ１が結合した窒素原子を含み、また追加の窒
素原子または酸素もしくはイオウ原子を含んでもよい。

このような環の具体例としては、ピロリジン、ピペリジ
ンおよびモルホリンが挙げられる。Ｒ４について上記で
言及したように、Ｒ２またはＲ３のいずれかはＲ１と組
み合わさって複素環式環を形成することができる。

Ｒ４，Ｒ５およびＲ６は、それぞれＲ３，ＲｚおよびＲ
３について上述したのと同様に定義される。

Ｒ，、Ｒ３およびＲ６は、それぞれＲ，、Ｒ，およびＲ
３と同一または相違していてよい。

ｘｅは前記化合物のアニオンまたはアニオン部分を表わ
しており、それが分子内塩を形成する。

本発明に従い生物学的試薬および診断薬を形成するのに
有用である式（Ｉ）の塩化合物を生成するすべてのアニ
オンが使用可能である。好ましいアニオンには、メチル
スルホネー）、ｐ−１ルエンスルホネートもしくはＣＦ
３５Ｏ３ｅのようなスルホネートイオン、ＢＦ４ｅ、　
　ＰＦｂｅオよびｃＩｌｏ４ｅカ包含される。

前記アルキル、アラルキル、アリール、アルケニルおよ
び複素環式基に加え、Ｒ＋　＋　Ｒｔ＋　Ｒ３１Ｒａ＋
Ｒｓ、　Ｒｈ、　Ｒ７およびＲ６として有用な基はまた
、置換されたアルキル、アラルキル、アリール、アルケ
ニルおよび複素環式基をも含む。有用な置換基としては
、ハロゲン、炭素原子１〜２０個のアルコキシ、スルホ
基、Ｎ、Ｎ−ジ置換カルバモイル、Ｎ、Ｎ−ジ置換スル
ファモイルおよび本発明の反応性中間体として機能化す
ることがら化合物を妨げないものとして当業者に既知の
他の基が挙げられる。

式（１）の具体的な化合物は次の第１表に示される。

第１表 第１表（続き） 第１表（続き） 第１表（続き） 第１表（続き） １、、Ｉ：１３ 第１表 （続き） 第１表（続き） 第１表（続き） 第１表 （続き） 第１表（続き） 式（１）のエーテル類は、化学合成技術分野の熟練者に
既知の技法で製造することができる。有用な合成法とし
ては、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａ
ｎＣｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、　１０３．４８
３９　（１９８１）に記載されるものが挙げられる６式
（りの化合物の製造法は、さらに下記合成例で記載され
る。

金威■土：ビス（テトラメチルホルムアミジニウム）エ
ーテルジトリフラート（第１表のエーテル１） ＣＩＩｚＣｌ　ｚ１００ｄ中テトラメチルウレア１１．
６ｇ溶液にＣＩ！ｚＣｅ　２５０ｍ１中トリフリツク酸
無水物１６．８ｄを滴下した。この混合物を室温下口−
タリーエバポレーターで蒸発させて黄色がかった油状残
渣を得た。この残渣をＣＩｌ□ＣＩ−ｇｌｏｏｒｎｌに
溶解し、次いでＣＨｚＣｌ　ｚ　５０ｄ中テトラメチル
ウレア１１．６　ｇを加えたところ、沈殿が生じた。混
合物を窒素雰囲気下で一夜撹拌し、沈殿を濾過した後に
ＣＨｚＣｌｔで洗浄し、次いで乾燥して融点２５８〜２
６０℃を有する無色結晶物質を得た。ＩＲおよびＮＭＲ
分析は、この結晶物質がビス（テトラメチルホルムアミ
ジニウム）エーテルジトリフラートであることを示した
。

金底斑ｌ：ビス（１−メチル−２−ピリジニウム）エー
テルジトリフラート（第１表のエ ーテル２） ＣＨｚＣｉ！ｄ５０ｄ中Ｎ−メチル−２−ピリドン０．
２モル溶液にトリフリック酸無水物１６．８１Ｉｄｌを
滴下した。生じた沈殿と混合物を窒素雰囲気上室温で７
２時間撹拌した。沈殿物を濾過し、ＣＨ２Ｃｌ、で洗浄
し、乾燥して融点１９３〜１９５℃を有する無色結晶物
質を得た。ＩＲおよびＮＭＲ分析は、この妻悸物質がビ
ス（１−メチル−２−ピリジニウム）エーテルジトリフ
ラートであることを示した。

ポリマーＪ　の人 この発明の方法で使用可能なポリマー粒子は、約０．０
１〜約１００μ、好ましくは０．１〜３μの範囲内に粒
子サイズを有する一般に水不溶性粒子である。それらは
、それらの全体が同一のポリマーからなることを意味す
る均質ポリマー粒子であることができ、あるいはそれら
が１種より多くのポリマーからなる、例えば、米国特許
第３，７００．６０９号明細書に記載されるようなグラ
フトコポリマーおよび、例えば米国特許第４．４０１．
７６５号明細書に記載されるようなコアー−シェルポリ
マーから構成される粒子であることができる。このポリ
マー粒子は、反応性アミンもしくはスルフヒドリル含有
化合物のアタッチメントとして利用可能な表面カルボキ
シル基を持つことが必須である。このような基は、この
ような基を含有するモノマー（例えば、アクリル酸、メ
タクリル酸およびイタコン酸など）をポリマーに組み込
むことによって粒子に好ましくは付加される。別法とし
て、カルボキシル基に転化することができる他の前駆体
反応性基を有するポリマーのさらなる化学反応によって
（例えば、マレイン酸無水物のような酸無水物の加水分
解によって、または表面メチロール基やアルデヒド末端
基の酸化によって）粒子に付加することができる。

一般に使用可能なポリマー粒子は、乳化重合（回分式、
半連続式および連続式を含む）、懸濁重合、グラフト共
重合および当業者に既知の他の方法を初めとするいずれ
かの適当な重合法を使用して製造することができる。連
続乳化重合は、それが、例えば米国特許第４，４１５．
７００号明細書およびＲｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏ
ｓｕｒｅ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　１５９６３（１９
７７年、７月）に記載されるように界面活性剤または乳
化剤を伴わない概してより小さな粒子を提供することが
できるので好ましい。Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌ。

５ｕｒｅは、Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｍａｓｏｎ　Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ、　Ｌｔｄ　（ＴｈｅＯｌｄ　Ｈａｒｂ
ｏｕｒｓａｓｔｅｒ’ｓ＋　８　Ｎｏｒｔｈ　５ｔｒｅ
ｅｔ、　Ｅｍｓｗｏｒｔｈ。

Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ　Ｐｏ１ｏ　７ＤＤ、　Ｅｎｇｌａ
ｎｄ）より入手可能な刊行物である。前述した、Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎに記載されるような連続乳化重合が最も好ましい技
法である。

使用可能なカルボキシル化粒子は、カルボキシル化スチ
レンおよびその誘導体、カルボキシル化スチレン−ブタ
ジェンコポリマー、アクリル酸およびメタクリル酸ポリ
マーならびに他の材料から製造され、これらの多くは市
販されている。

好ましくは、これらのポリマー粒子は次式で示されるポ
リマーからなる。

→Ａｈｒ＋Ｂ七η〕 上式中、Ａはカルボン酸基もしくは塩または前記基の前
駆体を含有する１種以上のエチレン系不飽和重合性モノ
マーに由来する反復単位を表わし、そしてＢは１種以上
のエチレン系不飽和重合性モノマーに由来する反復単位
を表わす。

限定されるものでないが、Ａを誘導することができるモ
ノマー類としては、アクリル酸、メタクリル酸、イタコ
ン酸、アコニット酸、フマール酸、マレイン酸、β−カ
ルボキシエチルアクリレート、β−カルボキシエチルメ
タクリレート、ｍ−＆ｐ−ｐ−カルボキシメチルスチレ
ンタクリルアミドヘキサン酸およびＮ−（２−カルボキ
シ−１，１ジメチルエチル）アクリルアミドもしくはそ
れらの塩またはそれらの無水物前駆体が挙げられる。

この発明を実施する際には、アクリル酸、メタクリル酸
、イタコン酸、アコニット酸、フマール酸、マレイン酸
、β−カルボキシエチルアクリレート、β−カルボキシ
エチルメタクリレートもしくはそれらの塩またはそれら
の無水物前駆体が好ましい。

Ｂを誘導することができる七ツマー類としては、限定さ
れるものでないが、スチレンおよびスチレン誘導体（例
えば、ビニルトルエン、４−も−ブチルスチレン、ジビ
ニルベンゼンおよび２−クロロメチルスチレン）、アク
リル酸エステルおよびメタクリル酸エステル（例えば、
メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、ｎ−ブ
チルアクリレート、２−エチルへキシルメタクリレート
、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタク
リレート、メタクリルアミド、エチレンジメタクリレー
トおよび２−ヒドロキシエチルアクリレート）、２−ア
クリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウ
ム、３−アクリロイルオキシプロパンスルホン酸ナトリ
ウム、ｐ−スチレンスルホネートまたはアクリロニトリ
ルが挙げられる。好ましくは、Ｂはスチレンもしくはス
チレン誘導体またはアクリル酸エステルもしくはメタク
リル酸エステルから誘導される。

ＡモノマーおよびＢモノマーの両方について、使用され
る具体的なモノマーおよびそれらの割合が水不溶性粒子
となるように選ばれることが重要である。

前記で示される構造では、Ｘが約０．１〜約７０゜好ま
しくは約１〜約２０（モル％）である。

これらのポリマー粒子が構成される代表的なポリマー類
としては、ポリ（スチレンーコービニルベンジルクロラ
イドーユーアクリル酸）（８５：１０：５、モル比）、
ポリ（スチレン−ニーアクリル酸）（９９：１モル比）
、ポリ（スチレンーコーメタクリル酸）（９０：　１０
．モル比）、ポリ（スチレンーコーアクリル酸−ｖ−ｍ
＆ｐ−ジビニルベンゼン）（８９：１０：１、モル比）
、ポリ（スチレン−コク−カルボキシエチルアクリレー
ト）（９０：１０、モル比）、ポリ（メチルメタクリレ
ートーコーアクリル酸）（７０：３０、モル比）および
ポリ（スチレンーコープチルアクリレートーコーメタク
リル酸）（４５：　４５　：　１０、モル比）が挙げら
れる。

−の態様では、粒子は、コアーが第一のポリマーからな
りそしてシェルが第二のポリマーからなるコアー−シェ
ル粒子である。第二のポリマーは、反応性カルボキシル
基またはポリペプチドもしくはタンパク質の付着前にカ
ルボキシル基に転化することができる基を有さねばなら
ない。

本明細書に記載されるポリマー粒子は、いずれかの使用
または興味に応じて再懸濁することのできる乾燥粉末と
して供給することができる。しかしながら、それらは約
０．１〜約３５％の固体を一般に有する水性懸濁液とし
て供給することが好ましい。沈殿防止剤、緩衝剤または
他の添加剤を必要により前記懸濁液に含めることができ
る。

本発明のジカチオンエーテル類が、アミンもしくはスル
フヒドリル基と反応するためのカルボキシル含有ポリマ
ーを活性化する機構は次のごとくである。

この機構に基づけば、前記式（１）で特定されるジカチ
オンエーテルは、同様にカルボキシポリマー類すべてを
活性化するであろうと思われる。

この部類のすべてのジカチオンエーテル類は、それらの
特有な構造〔孤立電子対を含むペテロ原子に結合するビ
ス（カルベニラムイオン）〕ニ起因する同一の機構を介
してカルボキシポリマーを活性化するであろう。

どのような反応性アミンもしくはスルフヒドリル含有化
合物でも、その化合物がポリマー粒子上のカルボキシル
基とジカチオンエーテル化合物の反応によって形成され
る中間体と反応しうる反応性アミン基もしくはスルフヒ
ドリル基をそれぞれ含む限りは、本発明のポリマー粒子
に結合することができる。限定されるものでないが、こ
のような化合物としては、モノフミン類、モノヒドラジ
ド類、ジアミン類、ジヒドラジド類、酵素、ビオチンも
しくはその誘導体、アビジンもしくはその誘導体、アミ
ノ酸類、ペプチド類、ポリペプチド類、タンパク質類、
単ｔｌ類、オリゴＩＪ！類、多糖類ならびに当業者に自
明な他の化合物が挙げられる。

特定の態様では、反応性アミンもしくはスルフヒドリル
含有化合物は、生活性を有するポリペプチドまたはタン
パク質である。「生活性」の語は、生理学的流体で見い
出されうる他の成分との相互作用に対するその能力を意
味する。このような相互作用は、その物質が酵素である
場合には触媒活性であることができる。さらに、この相
互作用はアビジンとビオチンまたは抗体と抗原などのよ
うに相互に親和性を有する物質量で生ずる複合体形成反
応であってもよい。もう一つの態様では、反応性アミン
もしくはスルフヒドリル含有化合物は、粒子に第二の化
合物を結合するための連結部分であることができるジア
ミン、多糖、アミノ酸、ペプチドまたはタンパク質であ
る。限定されるものでないが、このような第二の化合物
としては、酵素類、抗体類、抗原類、薬物類、ビオチン
もしくはその誘導体類および当業者に自明な他の化合物
が挙げられる。

好ましくは、この反応性アミンもしくはスルフヒドリル
含有化合物は、限定されるものでないが前述した生物学
的化合物および化学的化合物を初めとする免疫学的反応
性種である。より具体的には、それは、薬物、ホルモン
、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）
　Ａ抗原、クラミジア抗原、淋菌抗原、ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモンまたはヘルペスウ
ィルスに対して向けられる抗体のような抗体である。ま
た、免疫学的反応性種は、）ＩＴＬシーＩまたはＨＩＶ
−１の抗原のような抗原であることができる。

特定の態様では、この発明の方法で調製される物質はそ
れらと組み合わさったトレーサーを有することができる
。トレーサーは試薬を検出可能にする検出性種である。

有用なトレーサーとしては、放射性同位体、発色性化合
物、蛍光性化合物、酵素、化学発光化合物、リン光化合
物および当業者に既知の他のトレーサーが挙げられる。

特に有用なトレーサーは、発色性化合物および蛍光性化
合物である。トレーサーはいずれか適当な方法で試薬と
組み合わせることができる。例えば、トレーサーは反応
性アミンもしくはスルフヒドリル含有化合物と（例えば
、共有結合またはイオン結合的に）組み合わせることが
できる。また好ましくは、トレーサーは、容積の一部ま
たは全体に分布するそれらの外表面もしくは内部または
両方に（共有的または吸着的に）結合してポリマー粒子
と組み合わさってもよい。

発色色素または蛍光色素を前記粒子内に組み込むことが
特に好ましい。このような組み込みは、重合性ビニル基
に結合された色素または色素前駆体を有する重合性モノ
マーによって達成することができる。しかしながら、色
素類は特開平１−１０４６２１号（１９８９年４月２１
日公開）公報に記載されるような前駆体を使用して粒子
の形成後にそれらに［装入（ｌｏａｄｅｄ）　Ｊするこ
とが好ましい。

粒子に組み込むことができる特に有用なトレーサー類と
しては、シアン色素、イエロー色素およびマゼンタ色素
、ユウロピウムおよび他の希土類のキレート（例えば、
ユウロピウム−テノイルトリフルオロアセトネートとト
リオクチルホスフィンオキシトの混合物）、蛍光色素〔
例えば、２゜５−ビス（６−プチルー２−ベンゾオキサ
ゾールイル）チオフェンおよび３−（２−ベンゾチアゾ
ールイル）−７−ジニルアミノクマリン〕ならびに当該
技術分野で既知の他のトレーサーが挙げられる。色素の
組み込みは、米国特許第４，１９９，３６３号および特
開昭６２−５０１６４８号（１９８７年７月２日、公開
）公報に記載されている技法を使用して行うことができ
る。

本発明の方法は２工程で実施することができ、その第一
工程はジカチオンエーテルと前記ポリマー粒子の水性懸
濁液を接触させて、カルボキシル基に代わり中間反応性
基を有する反応性中間体ポリマー粒子を形成する工程を
伴う。この工程は、所定のｐＨを提供するために適当な
酸または緩衝剤を使用して適当なｐＨで行われる。一般
にｐＨは６．０以下であるが、反応が進行する限りこれ
を限定するものでない。より好ましくは、ｐＨは３．５
と６との間にある。ジカチオンエーテル対粒子表面上の
カルボキシル基のモル比は、１ｏ：１〜１０００：ｌで
あり、好ましくは５ｏ：１〜４００：１である。

本発明の方法の第二の工程は、第一の工程で形成された
反応性中間体が、この反応性中間体の中間反応性基と反
応しうる反応性アミン基もしくはスルフヒドリル基をそ
れぞれ有する反応性アミンもしくはスルフヒドリル含有
化合物と接触される。

こうして、前記粒子と前記反応性化合物との間で共有結
合が形成される。

この第二工程は、早期凝集を伴うことなく所期の反応が
起こるような適切なｐＨで行うことができる。このｐＨ
は、含まれる反応体および反応媒体中のそれらの濃度に
応じて変動するがもじれない。

多くのアミノもしくはスルフヒドリル含有化合物では、
このｐＨは６を越えるであろう。タンパク質対ポリマー
粒子の重量比は、１：２００〜１：１０゜好ましくは１
ニア５〜１：２ｏの範囲とすることができる。

本発明の方法は、一般に１０〜６０°Ｃ１好ましくは１
５〜３０°Ｃの温度で行われる。温度はこの方法の２つ
の工程について同一または相違してもよい。

この発明に関するさらなる詳細は、以下に記載される代
表例から当業者にとって容易に明らかとなるであろう。

前述のポリマー粒子は、本明細書に開示されるような１
種以上のジカチオンエーテルをも含むキットに供給する
ことができる。これらの粒子はトレーサーを含まないか
またはそれらと組み合わさったトレーサーを有すること
ができる。有用なトレーサーは前述されているが、好ま
しいトレーサーとしては適当な様式で粒子中に組み込ま
れた発色色素および蛍光色素が挙げられる。これらの粒
子は、それが目的のいずれかの使用のために再懸濁する
ことができる限り粉末として供給することができる。前
述したように、それらは水性懸濁液として供給すること
が好ましい。

場合によって、これらのキットはこの発明の方法におけ
るポリマー粒子に付着するための反応性アミン基または
反応性スルフヒドリル基を有する化合物を含めてもよい
。その他の任意の材料には、ピペット、試験管、説明書
、緩衝剤または他の試薬ならびにこの発明の実施に役立
つ可能性のある備品が含まれる。

〔実施例〕

以下の例でこの発明ω実施を具体的に説明する。

劃」ヒジカチオンエーテル塩によるカルボキシル基含有
ビーズの活性化およびウシガンマグロブリン抗体の共有
結合反応 ５０Ｉｄのポリプロピレン遠心管の０．１Ｍ　ｐＨ６，
０リン３、緩衝液またハ０．１Ｍ　ｐＨ６，０２−（４
−−Ｔ−ルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）　緩
衝液中ポリ（スチレン−ニーメタクリル酸）（モル比９
０／１０）　１００■（乾燥重量）にジカチオンエーテ
ル塩（番号１、表■表）（６６■、０．１３ミリモル）
を加えた。この遠心管を４５°の角度で据えつけられた
回転盤に設置しながら３０〜３５ｒｐｍで１ｏ分間くる
くると回転させた。次に、この反応混合物にトリチウム
標識ウシガンマグロブリンＣＨＢＧＧ）　１■を加えた
。回転をさらに２４時間続けた。過剰のウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）　（１００■、５０■／−前述のリン酸
緩衝液中）を加えて反応を抑制した。この試料をさらに
２４時間インキュベーションした。

前記実験の変法として、ジカチオンエーテル塩の添加後
１０分間反応物を遠心（１０，０００ｒｐｍ、　３０分
）した。遠心後、上澄を廃棄し次いで適当な緩衝液３０
ｍ１でビーズを再懸濁した。次いで、前述のようにこの
ものに３ＨＢＧＧ　１■を加えそして反応を抑制した。

対照の反応は、ビーズをジカチオンエーテル塩で最初に
活性化しなかったことを除き３ＨＢＧＧ　１■を用い前
記と同じ量のビーズをインキュベーションすることによ
って調製した。この対照物を前述のように（るくる回転
させ、次いでＢＳＡで反応を抑制した。

結合した抗体（’ＨＢＧＧ）の総量は、ａ）反応物のア
リコート５０ＯＩｔｌ中の総ｃｐｍ（１９当たりのカウ
ント数）、ｂ）反応試料１雌の遠心後に上澄に残存する
ｃｐｓ　、およびｃ）ｂ）で得られたペレットの反復洗
浄後にラテックスに結合したｃｐｓ　、を測定すること
によって決定した。ビーズに共有結合した’ＨＢＧＧの
百分は、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯ５）の存在
下で前記反応ビーズをくるくる回転させながら約２４時
間３７°Ｃでインキュベーションした後に測定した。結
合した抗体の総量を測定するについて前述したのと同様
の手順を使用し、共有結合した抗体の量を決定した。結
果を第■表および第ｍ表に示す。

第■表 第■表 １　シカチオンニー　　ＭＥＳ　　　有　　７０．４チ
ル１（第１表） ２　シカチオンニー　　ＭＥＳ　　　無　　８７．５チ
ル１（第１表） ３　シカチオンニー　　リン酸　有　　６５．４チル１
（第１表） ４　シカチオンニー　　リン酸　無　　６７．８チルｌ
（第１表） この例は、”Ｈ−ＢＧＧが活性化剤としてジカチオンエ
ーテル塩を用いたカルボキシル化ビーズに共有結合する
ことを示す。ビーズとジカチオンエーテル塩との間の反
応性中間体は遠心に対して安定であり、遠心後に３８−
　ＢＧＧにあるものを加えたとしても今だ共有結合した
抗体か高レベルで残存することができる。

次の例２は、この発明の方法が酵素標識パインディング
試験において抗体の活性を維持することを示す。

■又 モノクローナル抗フェノバルビタール抗体を、例１で使
用した第１表のジカチオンエーテル塩１で活性化したカ
ルボキシルビーズと反応させた。

使用した抗体は、フェノバルビタール（Ｐｈｅｌ、９）
に対して特異的な社内調製モノクローナル抗体であった
。この抗体は、フェノパルビタールーヒト血清アルブミ
ンの接合体によるＢａ１ｂ　Ｃマウスの免疫感作によっ
てＥａｓｔ＋＋＋ａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙで
調製した。この感作したマウスの肺臓をミエローマ（Ｓ
Ｐ２１０−Ａｇ　１４）細胞と融合させてハイブリドー
マを発生させた。この調製法は公知の手法を使用した。

ビーズに結合した抗体の量は、”Ｈ−ＢＧＧを抗フェノ
バルビタール抗体で置き換えた平行試験で測定した。各
ビーズに結合した活性抗体の量は、下記の酵素標識パイ
ンディング試験で比較した。

例１で使用したポリマービーズ試料（乾燥重量３０■）
を、０．１Ｍ　ｐＨ６，０台ＢＳ緩衝液１０Ｉｌｄｌ中
の例１で使用したジカチオンエーテル塩（２３■、　　
０．０４５ミリモル）で活性化した。この調製品をＰｈ
ｅ　１．９抗体１．５■と混合した。

ビーズの第二の試料を、０．１Ｍ　ｐＨ６，ＯＭＥＳ緩
衝液１０１ｄ中の第１表のジカチオンエーテル塩２　　
（２２，５■、　　０．０４５ミリモル）で活性化し、
次いでＰｈｅｌ、９抗体１．５■と混合した。

追加のビーズ試料３は、活性化剤の添加後、試料３を遠
心（１０，００Ｏｒｐｍ、　３０分間）したことを除き
、試料ｌおよび２と全く同様に活性化した。遠心後、上
澄は廃棄し、ビーズは同じ緩衝液１０　ｍｆｌで再懸濁
した。次に、このものにＰｈｅ　１．９抗体１．５■を
加え試料１および２と同様に分離した。

全試料を２４時間室温でくるくる回転させながらインキ
ュベーションした。各試料の反応はＢＳＡ　（３０■、
３０■／ｄ）を添加して停止した。インキュベーション
をさらに約４時間続けた。各試料を遠心した。それぞれ
上澄を廃棄した。これらのペレットをＰＢＳ　（リン酸
緩衝溶液、ｐＨ７，４）で２度洗浄した後ＰＢＳに再懸
濁した。

各試料においてそれぞれビーズに結合した抗体量を、前
述と全く同じ手順でカルボキシルビーズに結合した’Ｈ
ＢＧＧを有する試料１〜３と同じ量の試料１〜３につい
て平行して行った試料に対するカウント数を測定するこ
とによって決定した。共有結合／総量の比は、ＳＤＳイ
ンキュベーション後例１に記載したように計算した。

各調製品における活性抗体の相対的な量は、ビーズの連
続希釈物（結合された抗体の量に基づく理論的なフェノ
バルビクールパインデイング部位、６、３　Ｘｌ０−１
０Ｍ〜２．　ＯｘｌＯ−’Ｍ）を、一定濃度のフェノパ
ルビタールーグルコースオキシダーゼ酵素標識（５ＸＩ
Ｘｌｏ−１Ｏと混合するアッセイで測定した。これらの
ビーズ希釈物と標識は、１％ウシ血清アルブミン含有リ
ン酸緩衝溶液中で室温下一定に撹拌しながら約２時間イ
ンキュベーションした。遠心後、溶液中に残存するフェ
ノパルビタールーグルコースオキシダーゼ標識を測定し
、そしてこの酵素標識５０％を結合するのに必要なフェ
ノバルビタールのパインディング部位の濃度を決定した
。これらの結果を第■表と第７表にまとめ第■表 平均的なパインディング試験 を使用して、カルボキシル化ビーズに抗体を共有結合し
うることを示す。さらに、抗体活性を維持したままジカ
チオンエーテル活性化カルボキシル化ビーズに抗体を結
合しうることも示す。反応混合物が遠心される場合、ジ
カチオンエーテル塩が共有結合したタンパク質量が向上
するとの利益を提供する。

これは、 第７表 ラテックス−酵素滴定 活性化剤としてジカチオンエーテル塩 〔発明の効果〕 本発明は、不溶性ポリマー粒子に生活性ポリペプチドま
たはタンパク質のような反応性アミンもしくはスルフヒ
ドリル含有化合物を迅速に付着する手段を提供するので
、イムノアッセイ、診断試験、アフィニティークロマト
グラフィー、酵素反応および他の生物学的もしくは化学
的な手段にとって有用な材料を形成する。この付着は付
着される反応性化合物に悪影響を及ぼすことなく達成さ
れる。すなわち、前記粒子のペンダントカルボキシル基
との共有結合の形成に関与する反応性化合物中の反応性
アミノ基または反応性スルフヒドリル基の架橋または失
活は極わずかである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ａ、（１）粒子表面にペンダントカルボキシル基を
   有するポリマー粒子の水性懸濁液を、（２）試薬と接触
   させてペンダント中間反応性基を有する反応性中間体ポ
   リマー粒子を形成する工程、ならびに Ｂ、工程Ａで形成される反応性中間体ポリマー粒子を、
   前記中間反応性基と反応する反応性アミン基もしくは反
   応性スルフヒドリル基をそれぞれ有するアミンもしくは
   スルフヒドリル含有化合物と接触させて前記粒子と前記
   反応性化合物との間で共有結合を形成する工程を含んで
   なり、かつ前記試薬がジカチオンエーテルであることを
   特徴とするポリマー粒子への反応性アミンもしくはスル
   フヒドリル含有化合物の付着方法。 ２、前記ジカチオンエーテルが次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｒ＿１およびＲ＿４は、それぞれ独立して水
   素、アルキル、アラルキル、アリール、アルケニル、−
   ＹＲ＿７、 基▲数式、化学式、表等があります▼、 基▲数式、化学式、表等があります▼を表し、Ｙはイオ
   ウまたは酸 素を表わしており、そしてＲ＿７、Ｒ＿８、Ｒ＿９、Ｒ
   ＿１＿０およびＲ＿１＿１はそれぞれ独立してアルキル
   、アラルキル、アリールまたはアルケニルを表わしてい
   るか、あるいはＲ＿８とＲ＿９またはＲ＿１＿０とＲ＿
   １＿１は一緒になって環構造を形成してもよく、またＲ
   ＿１＿０とＲ＿１＿１はそれぞれ水素を表わしていても
   よく、 Ｒ＿１とＲ＿２は一緒になって複素環式環を形成しても
   よく、そして Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｒ＿５およびＲ＿６はそれぞれ独立し
   てアルキル、アラルキル、アリールもしくはアルケニル
   を表わすかまたはＲ＿２もしくはＲ＿３はＲ＿１と、も
   しくは相互に組み合わさるか、またはＲ＿５もしくはＲ
   ＿６はＲ＿４と、もしくは相互に組み合わさって複素環
   式環を表わし、 Ｘ＾■は分子内塩を形成するような化合物のアニオンま
   たはアニオン性部分を表わす）で示される請求項１記載
   の方法。 ３、（１）粒子表面にペンダントカルボキシル基を有す
   るポリマー粒子および（２）ジカチオンエーテルを含ん
   でなるキット。 ４、前記ジカチオンエーテルが、次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （上式中、Ｒ＿１およびＲ＿４は、それぞれ独立して水
   素、アルキル、アラルキル、アリール、アルケニル、−
   ＹＲ＿７、 基▲数式、化学式、表等があります▼、 基▲数式、化学式、表等があります▼を表し、Ｙはイオ
   ウまたは酸 素を表わしており、そしてＲ＿７、Ｒ＿８、Ｒ＿９、Ｒ
   ＿１＿０およびＲ＿１＿１はそれぞれ独立してアルキル
   、アラルキル、アリールまたはアルケニルを表わしてい
   るか、あるいはＲ＿８とＲ＿９またはＲ＿１＿０とＲ＿
   １＿１は一緒になって環構造を形成してもよく、またＲ
   ＿１＿０とＲ＿１＿１はそれぞれ水素を表わしていても
   よく、 Ｒ＿１とＲ＿２は一緒になって複素環式環を形成しても
   よく、そして Ｒ＿２、Ｒ＿３、Ｒ＿５およびＲ＿６はそれぞれ独立し
   てアルキル、アラルキル、アリールもしくはアルケニル
   を表わすかまたはＲ＿２もしくはＲ＿３はＲ＿１と、も
   しくは相互に組み合わさるか、またはＲ＿５もしくはＲ
   ＿６はＲ＿４と、もしくは相互に組み合わさって複素環
   式環を表わし、 Ｘ＾■は分子内塩を形成するような化合物のアニオンま
   たはアニオン性部分を表わす）で示される請求項３記載
   のキット。