JP2002501495A

JP2002501495A - ウロニウム塩複合体ワクチン

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Publication number: JP2002501495A
Application number: JP54586298A
Authority: JP
Inventors: リーズ，アンドリュー; モンド，ジェームズ，ジェイ．
Original assignee: リーズ，アンドリュー; モンド，ジェームズ，ジェイ．
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2002-01-15
Also published as: EP0971945A1; DE69826843D1; CA2283762A1; WO1998042721A1; US6299881B1; AU6473798A; AU739631B2; ES2230679T3; ATE278703T1; DE69826843T2; EP0971945B1

Abstract

(57)【要約】複合体ワクチンを製造する方法はウロニウム塩試薬を第１成分（例えば多糖類）と混合することを含む。本発明によれば、ウロニウム塩試薬は式（Ｉ）［式中、R¹は(a)（ここで、R⁶は炭素、水素、そして任意に１以上のヘテロ原子をも示し、それらの原子はそれらが結合されている窒素原子とともに５〜10員環の複素環を構成している）と定義され、置換されていても置換されていなくてもよく；R²、R³、R⁴およびR⁵は、それぞれ独立に、水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示す。］で表される化学構造を有する。また、R²およびR³は、一緒になって、それらが結合される窒素原子とともに５〜７員環の複素環を完成するのに必要な炭素、水素、硫黄、窒素、または酸素原子を示し得る。それと同様に、R⁴およびR⁵も、一緒になって、同様の複素環を示し得る。X^-は酸アニオン（例えばCl^-、Br^-、F^-、I^-、PF₆ ^-、およびBF₄ ^-）を示す。また、本方法においては、第２成分（例えばタンパク質、ペプチドまたはリポタンパク質）を第１成分と混合する。第１成分と第２成分は互いに反応して複合体を形成する。

Description

【発明の詳細な説明】ウロニウム塩複合体ワクチン関連出願データ本出願は、1997年３月24日に出願した米国仮特許出願第60/041,781号（この出願は参照により本明細書に含まれるものである）に基づいて35 U.S.C.§119による優先権の利益を主張するものである。発明の背景ワクチンは、ウイルス、細菌、または真菌によって引き起こされる広範な種類の疾患から人々を防御するのに非常に有効である。そのような広範な病原生物に対する特異的防御を誘導するワクチンの能力は、特異的体液性抗体応答、ならびに細胞性応答を刺激するそれらの能力に起因するものである。本発明は、そのようなワクチンの調製方法、特にワクチンの調製に使用する複合体の製造方法に関する。さらに、本発明の方法を使用することにより、免疫原およびその他の貴重な免疫学的試薬、治療試薬、または診断試薬を製造することができる。本発明はさらに、本発明にしたがって製造された複合体から製造されたワクチン、免疫原、および試薬、ならびにこれらの生成物の使用に関する。多糖類に対して免疫応答を誘導することが非常に望ましいことが多い。例えば、細菌性莢膜多糖類に対する抗体はその細菌に対する防御を提供し得る。しかしながら、多くの多糖類は特に幼児および小児において免疫原性が乏しい。さらに、小児、成人のいずれにおいても、通常、繰り返し多糖類免疫感作によるブースター免疫効果はなく、主要抗体クラスはIgMである。これらの特徴は全て、所謂「Ｔ細胞依存性」（「TI」）抗原の特徴である。多くの場合、多糖類の免疫原性はタンパク質またはＴ細胞エピトープ含有ペプチドを多糖類に共有結合することにより増強され得る。脂質、脂肪酸、リポ多糖類、およびリポタンパク質のようなある一定のその他の成分も、多糖類の免疫原性を増強することが知られている。MondおよびLeesの特許出願「二元複合体(dua l conjugate)」に記載されているように、タンパク質と多糖類の複合体はタンパク質ならびに多糖類に対する免疫応答を増強し得る。米国特許第5,585,100号、米国特許出願第08/444,727号（1995年５月19日出願）、および米国特許出願第08 /468,060号（1995年６月６日出願）を参照されたい。これらの特許出願はそれぞれ参照により本明細書に含まれるものである。かかる効果は、A.Leesら，"Enhan ced Immunogenicity of Protein-Dextran Conjugates:I．Rapid Stimulation of Enhanced Antibody Responses to Poorly Imnlunogenic Molecules"，Vaccine ，Vol.12，No.13，(1994)，pp.1160-1166にも記載されている。この論文は参照により本明細書に含まれるものである。多糖類に対する免疫応答の向上についてのこのような可能性に鑑みて、当技術分野においてはタンパク質またはその他の成分（moieties）を多糖類に共有結合するための方法が必要である。理想的には、多糖類に成分を共有結合する方法は、多糖類とタンパク質成分の両方の免疫原性を維持し、各成分の必要なエピトープに対する損傷を最小にするような様式で行わなければならない。さらに、この結合は安定であるべきである。したがってタンパク質、ペプチド、ハプテン、有機分子、またはその他の成分を多糖類に結合するための温和で穏やかな手段が必要である。分子同士を結合するための改良方法から利益を得ることができる産物はワクチンだけではない。例えば、ある一定の診断または治療試薬は、多糖類、高分子量の炭水化物、および低分子量の炭水化物を固相材料（例えば、固体粒子または表面）に結合することによって製造される。よって、当技術分野では、多糖類、高分子量の炭水化物、および低分子量の炭水化物を固相材料に結合するための改良方法が必要である。分子同士を結合するには２つの主な方法が用いられる。第１の方法においては、結合方法は、タンパク質（もしくはペプチドまたはその他の成分）を多糖類（または何らかのその他の成分）に直接架橋することを必要とする。しかしながら、化学プロセスを促進し、および／またはタンパク質および／または多糖類に対する免疫応答を増強するために、結合される成分間にスペーサー分子が必要である場合もある。どちらの方法においても、通常、架橋が生じる前に多糖類を活性化または官能基化することが必要である。多糖類を活性化または官能基化するいくつかの方法は、W.E.Dickら，"Glycoconjugates of Bacterial Carbohydrate A ntigens:A Survey and Consideration of Design and Preparation Factors"，C onjugate Vaccines(Cruseら編)，Karger，Basel，1989，Vol.10，pp.48-114に記載されている。この抜粋は参照により本明細書に含まれるものである。その他の活性化方法は、R.W.Ellisら（編者），Development and Clinical Uses of Ha emophilus B Conjugate Vaccines ，Marcel Dekker，New York(1994)に記載されており、この本は参照により本明細書に含まれるものである。多糖類を活性化する一つの好ましい方法は、Leesの、米国特許出願第08/124,4 91号（1993年９月22日出願。現在は放棄されている。）、米国特許第5,651,971 号、米国特許第5,693,326号、および米国特許出願第08/482,666（1995年６月７日出願）のCDAP特許出願に記載されている。これらの米国特許および特許出願はそれぞれ参照により本明細書に含まれるものである。またCDAPの使用は、Leesら，"Activation of Soluble Polysaccharides with 1-Cyano-4-Dimethylamino Py ridinium Tetrafluoroborate for USA in Protein-Polysaccharide Conjugate V accines and Immunological Reagents"，Vaccine，Vol.14，No.3(1996)，pp.190 -198にも記載されている。この論文も参照により本明細書に含まれるものである。一つの特定の複合体調製方法は、カルボジイミドを用いたアミン（またはヒドラジド）およびカルボキシルのアミドへの縮合によるものである。カルボキシル求核試薬はカルボジイミドと反応して高反応性であるが不安定な中間体を形成し、この中間体はその後加水分解するかアミンと反応して安定なアミド結合を形成し得る。1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド（「EDC」）は、このクラスのカルボジイミド試薬についての水溶性の例である。この反応の一つの例として、Robbinsは、Haemophilusインフルエンザ（「PRP 」）多糖類をヒドラジドを用いて官能基化し、破傷風トキソイド上でこの官能基化多糖類をカルボキシルと縮合させることを記載している。C.Chuら，Infection and Immunity，Vol.40，1983，pg.245〜を参照されたい。さらに、一般的な方法によるカルボキシル化多糖類のジフテリアトキソイドへの結合もRobbinsにより記載されている。S.C.Szuら，Journal of Experimental Medicine，Vol.166， 1987，1510ページ〜を参照されたい。これらの論文はそれぞれ参照により本明細書に含まれるものである。しかしながら一般的に、活性化可能な基および求核試薬の両方を含む多価リガンド（例えば、タンパク質および多糖類）を結合するのにカルボジイミドを用いようと試みる場合、無数の問題が存在する。この反応は制御するのが難しく、広範なホモポリマー形成、鎖間架橋、および抗原性の低下が生じることが多い。さらなる問題は、カルボキシル−カルボジイミド中間体がＯからＮへのアシルシフトを受けて、タンパク質に新たなエピトープを加える安定な非反応性の付加生成物が生じるということである（G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Acad emic Press，San Diego，California，(1996)（これは参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい）。複合体を形成する別の方法は、活性エステル中間体を使用するものである。活性エステル中間体を形成する試薬としては、ノルボラン(norborane)、p-ニトロ安息香酸、NHS(N-ヒドロキシスクシンイミド)、およびS-NHS（スルホ-N-ヒドロキシスクシンイミド）が挙げられる。NHSエステル（またはその他の適当な試薬）は、アミン、ヒドラジド、およびチオールのような求核試薬と反応し得る。NH Sエステルとアミンおよびヒドラジドとの反応生成物は特に安定であり、アミド結合を形成する。NHSエステル中間体は、カルボジイミド（カルボキシルを活性化するためのもの）およびNHS（またはS-NHS）を用いて一段階プロセスで生成し得る。このプロセスでは、NHS（またはS-NHS）、カルボキシル含有成分、およびアミン含有成分を混合して、それにカルボジイミドを加える。結合効率はこの反応のほうがNHSが存在しない場合よりも高いことが多いが、このプロセスにおいてはホモポリマー形成、鎖間架橋、および過剰架橋のような問題が発生し得る。さらに、その他の好ましくない副反応が生じ、下記により詳細に記載するような問題を引き起こし得る。また、二段階活性化プロセスを用いることができる。この操作においては、架橋されるべき成分を加える前に残留するカルボジイミドの除去または破壊が試みられる。EDCおよびNHSを用いる一つのプロトコルにおいては、タンパク質を加える前に残留するカルボジイミドをチオール（例えば、メルカプトエタノール）で失活させる。GrabarekおよびGergely，Analytical Biochemistry，Vol.185(1990 )，pg.131〜（この論文は参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい。この方法によれば、タンパク質添加中に存在するカルボジイミドの量は最小になる。しかしながら、チオールを添加すると所望されるNHSエステル中間体も加水分解され得る。この二段階プロセスにおいては、NHSエステル中間体を単離することが好ましい。しかしながら、かかる中間体は水性媒体においてのみ適度に安定であるので、これを単離することは困難であり得る。カルボジイミド／NHS法に伴うその他の問題は、ロッセン転位においてカルボジイミドと２モルのNHSとの反応から生じるβ−アラニン誘導体の生成の可能性があることである（WilchekおよびMiron，Biochemistry，Vol.26，pg.2155〜，1 987（この論文は参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい。）。この誘導体はアミンと反応して不安定な架橋を形成し得る。カルボジイミドおよびNHSはオリゴ糖の活性化にも用いられている。そのような操作においては、オリゴ糖の還元末端をカルボキシル基で官能基化し、その後カルボジイミドおよびNHSを用いて有機溶媒中で活性エステルに転化させる。次にこれらの官能基化オリゴ糖をタンパク質に結合させる。この操作をNeisseria meningiditisＣ型多糖類由来のオリゴ糖で使用するPorroの米国特許第5,153,312 号（1992年10月６日）を参照されたい。この特許は参照により本明細書に含まれるものである。しかしながら、報告された全体的な結合効率は低く、低分子量のオリゴ糖が用いられている。低結合効率の一つの理由はオリゴ糖が一分子当たり NHSを一つしか持たないということである。それは加水分解するか結合する。 NHSエステルの導入に関して種々のその他の試薬が公知であるが、これらの大部分は乾燥有機溶媒を必要とし、水性媒体における使用には適していない。一つの例外としては、試薬O-(N-スクシンイミジル)N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（TSTU）などの一定のウロニウム塩が挙げられ、このウロニウム塩は水中で幾分安定であるが、混合有機／水性媒体中ではより安定である。TSTUを用いることにより有機溶媒中で低分子量のNHSエステルが形成されている（Mollerら，"Versatile Procedure of Multiple Introduction of 8-Ami nomethylene Blue into Oligonucleotides"，Bioconjugate Chemistry，Vol.6(1 995)，pp.174-178;Lefevreら，"Texas Red-X and Rhodamine Red-X，New Deriva tives of Sulforhodamine 101 and Lissamine Rhodamine B with Improved Labe ling and Fluorescence Properties"，Bioconjugate Chemistry，Vol．7(1996) ，pp.482-489;ならびにBannwarthら，"219，Bathophenanthroline-ruthenium(II )Complexes as Non-Radioactive Labels for Oligonucleotides which can be M easured by Time-Resolved Fluorescence Techniques，"Helvetica Chimica Act a，Vol.71(1988)，pg.2085〜（これらの論文は参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい）。さらに、TSTUおよびその他のウロニウム塩を用いることにより混合有機／水性媒体中で低分子量のNHSエステルが形成されている（Knorrら，"New Coupling Reagents in Peptide Chemistry"，Tetrahedron Let ters，Vol．30，No.15(1989)，pp.1927-1930；ならびにBannwarthおよびKnorr， "Formation of Carboxamides with N,N,N',N'-Tetramethyl(Succinimido)Uroniu m Tetrafluoroborate in Aqueous/Organic Solvent-Sytems,"Tetrahedron Lette rs，Vol.32，No.9(1991)，pp.1157-1160（これらの諭文も参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい）。 TSTUを用いることにより、有機溶媒中で固相カルボキシル化ビーズの活性エステルも調製されている（Wilchekら，"Improved Method for Preparing N-Hydrox ysuccinimide Ester-Containing Polymers for Affinity Chromatography,"Bioc onjugate Chemistry，Vol.5(1994)，pp.491-492（この論文は参照により本明細書に含まれるものである）を参照されたい）。TSTUのような試薬は、ＯからＮへのシフト反応またはロッセン転位のような種々の副反応の可能性が低いのでカルボジイミド/NHS法において都合がよい。 M.A.Anderssonら，"Synthesis of oligosaccharides with oligoethylene gly col spacers and their conversion into glycoconjugates using N,N,N',N'-te tramethyl(succinimido)uronium tetrafluoroborate as a coupling reagent,"G lycoconjugate Journal，Vol.10(1993)，pp.461-465（この論文は参照により本明細書に含まれるものである）には、TSTUを使用して混合水性／有機溶媒中でカルボキシル化糖類を活性化し、その後この活性化糖類をタンパク質に結合することが記載されている。Anderssonはこの方法をワクチンの製造に使用することは記載していない。ヨーロッパ特許出願第0,569,086A2（S.J.Danielsonら）には、不溶性カルボキシル化基質および粒子の活性エステルの調製にTSTUおよび同様の試薬を使用することが記載されている。その後これらの活性化固体を生物学的に関連のある分子に結合することにより診断試薬を調製している。この文献は参照により本明細書に含まれるものである。種々の結合および活性化法が上記の様々な文献に記載されているにもかかわらず、当技術分野では生物学的に関連のある分子を互いに結合してワクチンを製造するための改良方法が必要とされている。さらに、当技術分野では生物学的に関連のある分子をカルボキシル化されていない表面および粒子に結合させて種々の試薬を製造するための改良方法が必要である。本発明は、ワクチンおよび免疫原用の複合体を製造するための改良結合方法を提供することを目的とする。さらに、これらの方法は免疫学的試薬、診断試薬、および治療試薬の製造に有用である。発明の概要本発明は、複合体、および都合がよいことには複合体ワクチンを製造する方法に関する。この方法においては、第１成分（例えば多糖類、高分子量または低分子量の炭水化物、ヒドロキシル化化合物（ポリビニルアルコールなど）など）をウロニウム塩試薬で活性化する。ウロニウム塩試薬は、第１成分に存在するカルボキシル基またはヒドロキシル基を活性化するものと考えられるが、出願人らは任意の特定の化学機構または作用の理論に縛られるつもりはない。第１成分は水性媒体中、水性／有機媒体の混合物中、または有機媒体中に存在し得る。本発明の方法によれば、ウロニウム塩試薬は式Ｉ：で表される化学構造を有する。［式中、上のヘテロ原子をも示し、それらの原子はそれらが結合されている窒素原子とともに５〜10員環の複素環を構成している。）と定義され、置換されていても置換されていなくてもよい。 R²およびR³は下記のように定義され： R²は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか； R³は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか；または R²およびR³は、一緒になって、それらが結合される窒素原子とともに５〜７員環の複素環を完成するのに必要な炭素、水素、硫黄、窒素、および／または酸素原子を示し、ここで複素環は置換されていても置換されていなくてもよい。 R⁴およびR⁵は下記のように定義され： R⁴は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか； R⁵は、水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか；または R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合される窒素原子とともに５〜７員環の複素環を完成するのに必要な炭素、水素、硫黄、窒素、および／または酸素原子を示し、ここで複素環は置換されていても置換されていなくてもよい。 X^-は酸アニオン（例えばCl^-、Br^-、F^-、I^-、PF₆ ^-、およびBF₄ ^-）を示す。本発明における使用に適したその他の酸アニオンは、ヨーロッパ特許出願第0,569,08 ６号に記載されている。］また、本発明の方法においては、第２成分（例えばタンパク質、ぺプチド、ハプテン、リポタンパク質、炭水化物、有機分子、スペーサー分子、固相材料、ホモ二官能性試薬、ヘテロ二官能性試薬など）を第１成分と混合する。第１成分は活性化され、第２成分と反応して複合体または官能基化第１成分を生成する。本発明に使用するためのウロニウム塩試薬の一つの好ましいクラスとしては、からなる群から選択される基である式Ｉの塩が挙げられる。このクラスの特有の試薬としては、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3 ,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（「HBTU」）；2-(1H- ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（「TBTU」）；2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3- テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（「TNTU」）；およびO-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（「 TSTU」）が挙げられる。本発明における使用に適したその他のウロニウム塩活性化試薬は、ヨーロッパ特許出願第0,569,086号に記載されている。本発明の方法においては、ウロニウム塩試薬は、第２成分を第１成分と混合する前に第１成分と混合し得る。これにより、ウロニウム塩試薬と第１成分との間の活性反応が開始される。この第１の工程においては、第１成分をウロニウム塩試薬により活性化し、その後第２成分を活性化された第１成分と混合する。任意に、活性化された第１成分を、第２成分を混合する前に反応混合物から単離することができ、次いで第２成分を、ウロニウム塩で活性化した第１成分を含む単離された生成物と混合することができる。別の代替の操作として、第２成分を、ウロニウム塩試薬を第１成分と混合する前に第１成分と混合することができる。この方法では、ウロニウム塩を第１および第２成分の混合物と混合すると、第１成分はウロニウム塩試薬により活性化され、活性化された第１成分と第２成分の間の反応は一段階で進行する。一段階反応プロセスは、ウロニウム試薬および第２成分を同時に第１成分と混合する場合にも生じ得る。所望により、第１成分は、ウロニウム塩により活性化され得る１個以上の化学基で官能基化することができる。例えば、多糖類はカルボキシルで官能基化することができる。これは、例えば、第１成分（例えば、多糖類または高分子量もしくは低分子量の炭水化物）を、CNBr、CDAP、およびビニルスルホン試薬からなる群から選択される試薬で活性化した後、6-アミノヘキサン酸と反応させることにより行うことができる。本発明はさらに、本発明の方法により製造された反応生成物に関する。これらの反応生成物には、複合体（タンパク質／多糖類複合体など）および複合体ワクチン（タンパク質／多糖類複合体ワクチンなど）が含まれ得る。また本発明を用いることにより、免疫原、免疫学的試薬、治療試薬、または診断試薬を製造することもできる。また本発明は、これらの反応生成物をそれらの所期の目的に使用する方法にも関する。例えば、複合体ワクチンを被検体に投与することにより被検体において免疫応答を誘導する方法に関する。本発明を使用することにより、種々の疾患または病気の症状を防御し、治療し、診断し、または改善することができる。本発明による複合体の製造方法は、上記の文献に開示された種々の方法およびプロセスに勝るいくつかの利点を有する。上記の文献はどれもウロニウム塩試薬を用いて複合体ワクチンを生成させることを記載していない。一方、本発明の方法は、複合体ワクチンの直接的で簡単な製造方法である。本発明の方法は、都合がよいことに溶液相で行うことができ、カルボキシル化された多糖類およびカルボキシル化されていない多糖類の両方に使用することができる。さらに、この反応は少量の試薬を用いて進行させることができ、最適反応条件を迅速に、効率的に、安価に決定することができる。多くの公知の結合方法と異なり、本発明の方法は第１および第２成分（例えばタンパク質と多糖類材料）を直接結合することもできる。これによりさらに反応操作が簡単になり、費用が低減される。さらに、本発明の方法は、比較的安全な試薬と温和な反応条件（例えば低pH、フードまたはその他の特別な設備が不要）を用いるので都合がよい。PRP多糖類のような多くの多糖類は極端なpHで容易に加水分解される。ウロニウム塩活性化および結合中に用いられる条件は比較的温和で穏やかであるので、重要なエピトープが多糖類上に保持される（すなわちタンパク質および多糖類出発原料に誘導される修飾が最小である）。一方、CNBr活性化にはフード下での高pHと高毒性試薬の使用が必要である。本発明の別の利点は上記の一段階操作に関する。タンパク質および多糖類成分（またはその他の成分）を活性化および結合が開始される前に混合することができるので、本発明の方法は、十分な所望のレベルの結合が得られるまで新たな試薬の添加および過剰の試薬の除去を続けることができる。これは、その他の活性化方法、特に多糖類を活性化した後タンパク質を加えることが必要な方法ではなかなか可能なことではない。また本発明の方法は、複合体化操作中に結合の進行を監視することも可能であり、それによって種々の試薬の無駄なまたは過剰な使用を制限することができる。図面の簡単な説明下記の詳細な説明および添付の図面とともに熟考すれば、本発明の有利な面がより十分に理解され、認識されるであろう。図１は、下記の実施例１の試料IAおよびICについてのHPLC実行結果を示すものである。発明の詳細な説明本発明によれば、多糖類、高分子量もしくは低分子量炭水化物、またはその他の成分は、それらがタンパク質、ハプテン、ペプチド、またはその他の成分と結合され得るように、TSTU、TNTU、HBTU、またはTBTUのようなウロニウム塩試薬で活性化される。本発明はさらに、本発明の方法により製造される複合体に関し、この複合体はワクチン、免疫学的試薬、診断試薬、治療試薬、免疫原などの調製に用いられ得る。また本発明は、ワクチンまたは試薬のような本発明の複合体の使用方法にも関する。本発明の複合体ワクチンを被検体に投与することにより免疫応答を誘導することができる。本発明の操作は一般的に下記のとおりである。第１成分を適当な環境下においてウロニウム塩試薬と反応させてNHS-エステルを第１成分に転移させる。例えば、本発明にしたがって、多糖類はジメチルアミノピリジン（「DMAP」）塩基などの塩基中でTSTU試薬と反応し得る。この反応は、水性媒体中、混合有機／水性媒体、または有機媒体中で生じ得る。アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（「 DMF」）、N-メチルピロリジノン（「NMP」）などの種々の有機溶媒が使用され得る。反応中は一般的に必要に応じてさらに塩基を加えることにより穏やかな塩基性pHに維持する（例えば、８〜9.5）。この操作の間のいずれかの時点で第２成分（例えばタンパク質）を第１成分と混合する。ウロニウム塩試薬の量を調節し、活性化時間を変更することにより、活性化および結合の効率を最適化することができる。ウロニウム塩試薬の添加時間をずらすことにより任意の所与の時間での反応における過剰のウロニウム塩試薬を最小にすることができる。所望により、古いまたは過剰のウロニウム塩試薬を、新たな試薬をタンパク質／多糖類混合物に混合する前に、例えば透析または限外濾過によって除去することができる。この手法においては、混合物中の有機溶媒の量および割合を最小にし、タンパク質および多糖類濃度を最適レベルに維持することにより良好な結合を促進することもできる。この試薬の除去工程により、少量の活性化試薬を必要に応じて添加することができるので結合の間一定レベルの制御がもたらされ、複合体化反応工程の進行を監視することができる（例えば反応混合物のアリコートを分析することにより監視する）。またこの手順により、複合体化工程のスケールアップの可能性ももたらされる。当業者は、日常的な実験を通じて最適反応条件（pH、反応時間など）、試薬の量、および試薬の濃度を決定することができる。任意の複合体化操作を本発明から逸脱することなく行うことができる。例えば、一つの操作においては、カルボキシル化された多糖類を出発原料として用いる。これは、Neisseria meningiditisＣ型多糖類（「NeisseriaPsC」）のような天然でカルボキシル基を含む多糖類から出発することにより行われ得る。また、カルボキシル基を多糖類に付加することができる。当業者には、多糖類をカルボキシル化するための種々の操作が公知である。例えば、多糖類はCNBrまたはCDAPを用いて活性化することができ、6-アミノヘキサン酸のような適切な試薬を用いてカルボキシル化することができる。CNBr活性化はW.E.Dick（上記のとおり）により記載されており、CDAP活性化は上記のLeesの特許出願および論文に記載されている。また、1996年５月９日に出願されたAndrew Lees名義の米国仮特許出願第6 0/017,103号および1997年５月７日に出願された米国特許出願第08/852,733号（これらの出願は参照により本明細書に含まれるものである）に記載されているように、ビニルスルホン試薬を用いることにより多糖類を活性化することもできる。本発明による一段階プロトコルにおいては、まず第１成分と第２成分を混合し、その後ウロニウム塩試薬をそれに混合する。ウロニウム塩試薬は複数の異なる時期に少量加えることができる。第１成分は活性化されて第２成分と反応する。この一段階プロトコルを、下記の一般的な例でより詳細に説明する。まず、第１成分（例えば多糖類）を第２成分（例えばタンパク質）と混合する。次いで、ウロニウム塩試薬（例えばTNTUまたはTSTU）をこの混合物と混合し、その後塩基物質（例えばトリエチルアミン（「TEA」）を加える。この操作中、十分な、または所望のレベルの結合が観察されるまでTNTUおよび／またはTEAをさらに添加し続けることができる。実際、反応の進行にしたがって反応混合物のアリコートを分析することにより、この反応操作および結合の程度を種々の異なる時間に測定することができる。本発明による二段階プロトコルにおいては、第１成分（例えば多糖類）をウロニウム塩試薬で活性化し、その後第２成分（例えばタンパク質）を活性化された第１成分と混合する。緩衝液、試薬濃度、時間、温度条件などは、第２成分（すなわち結合されるべき成分）をそこに混合する時点で活性化試薬の濃度が低すぎてその成分の有意な重合を引き起こすことができなくなるように選択され得る。 NHS-エステルの相対的な安定性および第１成分上でのそれらの重複度により、結合を生じさせるために第２成分が混合される時点で、第１成分分子上に依然として十分な数の活性化された基が存在し得る。この方法では、第１成分の活性化中間体を単離する必要性を回避することができる。しかしながら、所望により、そして中間体が安定である場合、ウロニウム塩と第１成分の反応の反応生成物（例えばウロニウム塩活性化多糖類）を、第２成分（例えばタンパク質）をそれと混合する前に単離することができる。また、本発明にしたがって、単離および保存条件下で安定である限り、第１成分をウロニウム塩試薬で活性化し、単離し、後の使用のために保存することができる。第２成分を混合する時点での少量のウロニウム塩試薬の存在は、その試薬が成分を活性化し続けることによって第２成分の第１成分への結合を促進し得るので有害ではない。実際に、この二段階プロトコルで第２成分を加える場合に少し過剰のウロニウム塩試薬が存在することにより、全体的な手順をいくぶん一段階および二段階操作の「ブレンド」にし得る。一般的に、第１成分を活性化するには少なくとも二種の機構を利用することができる。一つの機構においては、第１成分上のカルボキシル基を活性化し、他方の機構においてはヒドロキシル基を活性化する。多くの多糖類はカルボキシル化またはヒドロキシル化されているか、またはされ得るので、本発明の方法は多くの多糖類に用いることができる。多くの多糖類、例えばNeisseriaPsCは天然でその繰り返し単位の一部としてカルボキシル基を含むので、別途カルボキシル化することは必ずしも必要ではない。典型的には、これらのカルボキシル基のいくつかは、多糖類の抗原性を破壊せずに修飾され得る。これらの天然カルボキシルを用いることができ、または実施例で記載されるようにカルボキシル化「アーム」を多糖類に簡単に付加することができる。その他の場合においては、カルボキシル基は簡単に、特にCDAPを用いて導入することができる。例えば、CDAPを用いることによりPneumococcal多糖類14型（「Pn14」）を6-アミノヘキサン酸で誘導体化することができる。アミン含有多糖類はグルタル酸無水物を用いてカルボキシル化することができる。Inman，Journal of Immunology，Vol.114，第704頁（19 75）（この論文は参照により本明細書に含まれるものである）に記載されているように、カルボキシメチルデキストランは塩基中でデキストランおよびクロロ酢酸から簡単に調製することができる。種々の官能基をカルボキシル基に転化する方法も周知である。G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press ，San Diego，California，(1996)pg.187の考察を参照されたい。したがって、多くの多糖類をカルボキシル化し、本発明の方法により活性化することができる。しかしながら、上記のように、第１成分出発原料がカルボキシルを含む必要はない。第１成分上のヒドロキシル基もウロニウム塩試薬で活性化することができる。下記の実施例に示したように、本発明の方法はカルボキシルを含まない出発原料（例えばPn14）に使用し得る。したがって、カルボキシルを含む第１成分物質を用いることは任意であると考えるべきである。種々の出発原料を本発明の方法に用いることができる。例えば、第１成分は、多糖類、高分子量もしくは低分子量炭水化物、またはヒドロキシル化化合物（例えば、ポリビニルアルコールもしくはポリエチレングリコールのような合成ヒドロキシル化化合物）であり得る。さらに、第１成分は水に溶解性であるか不溶性である天然または合成物質であり得る。本発明の方法に使用するための具体的な多糖類としては、例えば、デキストラ、カルボキシル化デキストラン（カルボキシメチルデキストランなど）、Neisse ria meningiditis Ｃ型多糖類、Pneumococcal多糖類（Pn14、Pn6、Pn19、Pn23など）、およびHaemophilusインフルエンザ（「PRP」）多糖類が挙げられる。本発明における使用に適した高分子量または低分子量炭水化物としては、例えば、スクロース、PRPオリゴ糖、リポ多糖類、およびリポオリゴ糖が挙げられる。本発明における使用に適したヒドロキシル化化合物としては、例えば、ポリビニルアルコール、フィコール（Ficoll）、およびポリエチレングリコールが挙げられる本発明の反応プロセスにおいては、活性化された第１成分は反応混合物中に存在する第２成分と反応する。第２成分として用い得る物質の適当な例としては、タンパク質、ハプテン、ペプチド、リポタンパク質、炭水化物、有機分子、スペーサー分子、固相材料、ホモ二官能性試薬、またはヘテロ二官能性試薬が挙げられる。この第２成分は、水に溶解性または不溶性の天然または合成物質であり得る。本発明の方法を用いることにより、これらの第１および第２成分の複合体、例えばタンパク質／多糖類複合体、グリコシル化(glycosolated)タンパク質／タンパク質複合体などを製造することができる。さらに、活性化された第１成分（例えば活性化多糖類）を本発明の方法においてアミノまたはヒドラジド表面に結合することにより試薬を製造することができる。本発明における使用に適した具体的なタンパク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、リブ(rib)タンパク質、インチミン(intimin)、およびgDタンパク質が挙げられる。本発明における使用に適したペプチドとしては、例えば、LHRHペプチドおよびCF A/Iコンセンサスペプチドが挙げられる（F.J.Casselsら，Journal of Industria l Microbiology，1996 Annual Meeting for the Society of Industrial Microb iologyを参照されたい）。本発明における使用に適したリポタンパク質としては、例えば、リポOspAおよびリポDが挙げられる。適当なハプテンとしては、例えば、PamCysおよびモノリン脂質（monophospholipid）Ａが挙げられる。本発明で使用するためのその他の炭水化物としては、例えば、グリコシル化タンパク質および西洋ワサビペルオキシダーゼが挙げられる。本発明における使用に適した有機分子としては、例えば、ビオチンヒドラジドが挙げられる。適当なスペーサー分子としては、例えば、ヘキサンジアミンおよびアジピン酸ジヒドラジドが挙げられる。本発明における使用に適した固相材料としては、例えば、ELISA（「固相酵素免疫検定法」）プレート、ビーズ、およびクロマトグラフィー媒体が挙げられる。適当なヘテロ二官能性試薬としては、例えば、ヒドラジド[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート]およびメルカプトエチルアミンが挙げられる。本発明における使用に適したホモ二官能性試薬としては、例えば、シスタミンが挙げられる。本発明による使用に好ましいウロニウム塩試薬としては、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（「HBTU」）；2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（「TBTU」）；2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（「TNTU 」）；およびO-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（「TSTU」）からなる群の基が挙げられる。これらのウロニウム塩は、NovaChemから入手可能である。さらに、TSTUはAldrichから入手できる。TSTUおよびTNTUは特に好ましいウロニウム塩試薬である。TSTUは比較的温和な試薬であるのでカルボジイミドよりも害の少ない架橋剤である。本出願人らは、 TSTUが誘導するタンパク質のホモポリマー形成はEDCよりもかなり低いことが明らかであることを観察した。本発明の方法により製造した複合体を用いて種々のワクチンを製造することができる。ワクチンとしては、限定するものではないが、下記のワクチンが挙げられる：ジフテリアワクチン百日咳（サブユニット）ワクチン破傷風ワクチン H.influenzae、ｂ型（ポリリボースホスフェート） S.pneumoniae、全血清型 E.coli、エンドトキシンまたはJ5抗原（LPS、脂質Ａおよびゲンタビオース） E.coli、０多糖類（血清型特異的） Klebsiella、多糖類（血清型特異的） S.aureus、５および８型（血清型特異的および通常の防御抗原） S.epidermidis、血清型多糖類Ｉ、IIおよびIII（および通常の防御抗原） N.meningiditis、血清型特異的またはタンパク質抗原ポリオワクチンおたふくかぜ、はしか、風疹ワクチン RSウイルス狂犬病Ａ型、Ｂ型、Ｃ型およびその他の肝炎ヒト免疫不全ウイルスＩおよびII（GP120、GP41、GP160、p24、その他）単純ヘルペス１型および２型 CMV EBV 水痘／帯状疱疹マラリア結核 Candida albicans、その他のカンジダ Pneumocystis carinii マイコプラスマインフルエンザウイルスＡ型およびＢ型アデノウイルスＡ群連鎖球菌Ｂ群連鎖球菌、血清型Ia、Ib、II、およびIII Pseudomonas aeroginosa（血清型特異的）ライノウイルスパラインフルエンザ、１型、２型および３型コロナウイルスサルモネラ赤痢菌ロタウイルスエンテロウイルス Chlamydia trachomatisおよびpneumoniae（TWAR）糖タンパク質 Neo-formans cryptococcus。本発明の方法の一つの具体例として、ウロニウム塩を用いることによりリポ多糖類またはリポオリゴ糖を下記の実施例により詳細に記載した手法で活性化することができる。その後、ワクチンにおいて使用するために活性化リポ多糖類またはリポオリゴ糖をタンパク質に結合することができる。リポ多糖類またはリポオリゴ糖に対する抗体はセプシスおよび非分類型(non-typeable)Haemophilusインフルエンザに対する防御を付与し得る。リポ多糖類またはリポオリゴ糖とタンパク質（例えば破傷風トキソイド）とのそのような複合体は本発明に含まれるものである。本発明の方法においては、複合体中の第２成分の第１成分に対する重量割合が 0.05mg／mg（例えば多糖類１mg当たリタンパク質0.05mg）以上の複合体が製造され得る。タンパク質／多糖類複合体ワクチンについては、タンパク質の多糖類に対する重量割合は0.05以上であり得るものであり、0.05〜７の範囲が好ましく、多糖類１mg当たリタンパク質0.1〜２mgの範囲が特に好ましい。本発明を、種々の好ましい態様および具体例に関して以下により具体的に記載する。これらの好ましい態様および具体例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定するものと解されるものではない。さらに、一定の実施例ではモデルタンパク質としてウシ血清アルブミン（BSA）および／またはモデル多糖類としてデキストランを使用する。もちろん、生物学的に関連のあるタンパク質および多糖類も本発明の実施に用いることができる。生物学的に関連のあるタンパク質および多糖類を含む具体例も本出願に含まれるものである。下記の具体例の多くは、反応プロセスにおいて塩基としてDMAPの使用を含む。しかしながらその他の多くの塩基も使用することができる。例えば、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、またはジエチルイソプロピルアミンも本発明から逸脱することなく使用することができる。下記の実施例には当業者に周知の種々の略語、標準操作、および材料も含まれている。下記の情報は、下記の実施例に含まれる情報をより簡単に理解するのに役立つであろう。これらの定義は、そうではないという指摘がない限り、下記の実施例に適用されるものである。単量体タンパク質を使用すると結合プロセスを分子量のシフトとして観察することがより容易になるので、単量体BSAが一定の実施例で用いられる。これらの実施例で使用した単量体BSAは、Leesら，Vaccine，Vol.14，No.3，(1996)pp.190 -198（上記したもの）に記載されているように、CohnフラクションV BSA（Sigma Chemical Co.製）またはIntergen低エンドトキシンBSA（Intergen Corp.製）から、HEPES緩衝液（下記したもの）中でpH7.3にて10mMのヨードアセトアミドで短時間処理をし、次いで2.5×100cm S100HRカラム（Pharmacia製）にてゲル濾過をすることにより調製した。デキストランはPharmaciaから入手したT2000デキストランである。いくつかの実験では、T2000デキストランの高分子量画分を用いた。この材料は、デキストランを上記のようにゲル濾過カラム（2.5×100cm S400H R）に通すことによって得られた。破傷風トキソイド、種々のPneumococcal多糖類、Neisseria meningiditis多糖類、およびPRP多糖類はSmithKline Beecham（R ixensart、ベルギー）から入手した。本発明で用いるのに適したタンパク質および多糖類の供給元としては、メリーランド州ロックビルのAmerican Tissue Cult ure CollectionとフロリダのBerna Laboratoriesが挙げられる。「HEPES緩衝液」（または「HE緩衝液」）は、本出願で用いられる場合、pH7.3 の溶液を得るための0.15ＭのヒドロキシエチルピペラジンN'-2-エタンスルホン酸（「HEPES」）と２mMのエチレンジアミン四酢酸塩（「EDTA」）の混合物を示すものである。「HEPES」は、EDTAを含まないHEPES単独（pH＝８）を意味するものである。「５×HEPES緩衝液」（または「５×HE緩衝液）は、pH7.3の溶液を得るための0.75Ｍ HEPESと10mMのEDTAの混合物を示すものである。「2.5×HEPES緩衝液」は、５×HEPES緩衝液と生理的食塩水の等容量の混合物を示すものである。「生理的食塩水」は0.15ＭのNaClの水溶液を示すものである。高速液体クロマトグラフィー（「HPLC」）を行う場合、そうではないという指摘がない限り、Watersモデル626ポンプをモデル600Sコントローラおよびモデル４86吸光度検出器とともに使用した。ＨＰＬＣクロマトグラフを実行する前に、全試料を超遊離(ultrafree)MC 0.45μｍフィルターユニットを用いて遠心濾過した。そうではないという指摘がない限り、用いたサイズ排除HPLCカラムはPhenom enex Biosep G4000カラム（300×7.8mm）であり、0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液を用いてpH7.3に平衡化した。移動速度は１ml/分であった。いくつかの実行は、同一材料のガードカラムの使用を含んでいた。滅菌濾過は、実施する場合、そうではないという指摘がない限りMillex GV装置にて行った。「pH」は、本出願で用いられる場合、Ross電極（Orion Researchから入手可能）により測定されるか、カラーファスト（colorfast）pH試験紙（EM Scienceから入手可能）で概算されるような見掛けのpHを意味する。さらに、本出願においては、そうではないという指摘がない限り、アミンの存在は、J.VidalおよびC.Franci，J.Immunol．Meth.，Vol.86，pg.155(1986)に記載されているように、トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）アッセイを用いて測定した。またヒドラジドの存在も、Qiら，Anal．Chem.，Vol.275，pg.139(198 8)に記載されているように、TNBSアッセイを用いて測定した。多糖類の存在は、関連のある多糖類標準を用いるMonslgnyら，Anal．Chem.，Vol.175，pg.525(198 8)のレゾルシノール／硫酸法を用いることにより測定した。タンパク質の存在はクーマシー・プラス・タンパク質アッセイ試薬（イリノイ州ロックポートのPier ce Chemical Co.から入手可能）を用いて測定した（BSAまたは破傷風トキソイドのような適当なタンパク質を標準として用いた。）。これらの引用文献は全て参照により本明細書に含まれるものである。最後に、HPLCを複合化の程度（例えば多糖類１mg当たりのタンパク質のmg量）の測定に用いる場合、出発原料における初期のタンパク質／多糖類比と、HPLCにより測定されるような複合体タンパク質ピークのUV吸光度のパーセント（タンパク質の全体的なUV吸光度に基づくもの）から計算される。実施例１この第１の実施例では、デキストラン多糖類成分をBSAタンパク質成分に結合して複合体を製造した。デキストラン成分としてはカルボキシル化されているものとカルボキシル化されていないものを使用した。カルボキシメチルデキストラン（「CMデキストラン」）を、上記のようなInma nの方法により、生理的食塩水中で39mgデキストラン／mlの濃度で調製した。非カルボキシル化デキストランは74mg/mlの濃度の生理的食塩水溶液であった。単量体BSAタンパク質は32mg/mlの濃度の、pH7.3の2.5×HEPES緩衝液の溶液であった。TSTUおよびDMAP試薬はそれぞれ0.2MのDMF溶液であった。試料1A この試料では、82μlのCMデキストランを82μlの水および86μlのDMFと混合した。時間ｔ＝０に、10μlのTSTUと10μlのDMAPをデキストランに加えた。時間ｔ＝１分に、さらに10μlのTSTUを加えて、時間ｔ＝２分にさらに10μlのTSTUを加えた。この部分の操作中、溶液のpHを８〜９に維持するために、必要に応じてDM APを加えた。合計で約50μlのDMAPを加えた。時間ｔ＝５分に、100μlのBSA材料を反応混合物に加えて、混合物を４℃にて一晩反応させて複合体を製造した。試料1B 試料1Bにおいては、CMデキストラン材料の代わりにT2000デキストランを用いた以外は試料1Aの操作にしたがった。試料1C 試料1Cでは、試料1Aで用いたCMデキストラン材料を82μlの生理的食塩水に置換した以外は試料1Aの操作にしたがった。この試料は、多糖類材料がない場合の効果を説明する対照試料である。試料1A〜1Cの反応生成物を、pH7.3の0.1M KPO₄中で平衡化したPhenomenex Bio sep SEC3000、7.8×150cmにおけるHPLCにより分析した。CMデキストランを用いる試料1Aにより、デキストラン1mg当たり約0.67mgのBSAを有するBSA／デキストラン複合体が製造されたことが分かった。出発原料として非カルボキシル化デキストランを用いる試料1Bにより、デキストラン１mg当たり約0.87mgのBSAを有するBSA／デキストラン複合体が得られた。デキストラン多糖類を含まない対照試料である試料1Cは高分子量タンパク質が５％未満であった。このことから、ほんの少量のタンパク質の二量体化が、この反応操作から生じたことが分かる。図１は試料1Aおよび1CについてのHPLC実行結果を示すものである。試料1AについてのHPLCに示されているように、複合体についての非常に明白な高分子量吸光度ピークが観察された。この高分子量ピークは、試料1AのBSA／TSTU／CMデキストラン複合体を示すものである。CMデキストラン多糖類を生理的食塩水で置換した対照試料1CについてのHPLC実行結果では、複合体に対応するこの高分子量ピークが示されなかった。本実施例は、ウロニウム塩を用いることにより、タンパク質と、カルボキシル化多糖類および非カルボキシル化多糖類の両方との複合体を製造することができるということを示すものである。この反応プロセスにおけるタンパク質成分のホモポリマー形成は最小である。実施例２本実施例は、種々の異なる多糖類をウロニウム塩試薬で活性化することができるということを示すものである。さらに、本実施例における多糖類は、一度活性化されるとアミンまたはヒドラジドのいずれかにより官能基化された。試料2Aおよび2Hについては、非カルボキシル化デキストランを多糖類として使用した。この多糖類をウロニウム塩試薬により活性化し、アミン（試料2A）およびヒドラジド（試料2H）で誘導体化した。試料2B〜2Eは、臨床上関連のあるPneumococcal（「Pn」）莢膜多糖類を使用する。試料2Fおよび2Gは、ウロニウム塩試薬を用いることによりカルボキシル化多糖類を活性化することができることを示すものであり、試料2Fはこのクラスの試薬が植物多糖類を活性化し得ることをさらに示すものである。試料21は、臨床上関連のあるPRP多糖類を用いた本発明の使用を示すものである。活性化および誘導体化を行うための実験プロトコルを下記により詳細に示す。そうではないという指摘がない限り、下記の試薬を調製して下記の種々の実験で使用した：(a)TSTU試薬は0.5MのDMF溶液として調製し：(b)DMAP試薬は0.5Mの水溶液として調製し；(c)エチレンジアミン試薬は1Mの水溶液として調製し；そして(d)アジピン酸ジヒドラジド溶液は0.5Mの水溶液として調製した。試料2A 試料2Aを下記のプロトコルにしたがって調製した。74mg/mlの濃度のT2000デキストラン65μlを生理的食塩水35μlおよび水100μlと混合した。時間ｔ＝０にTS TU（0.5MのDMF溶液）20μlを溶液に加えた。時間ｔ＝20秒にDMAP（0.5Mの水溶液）20μlを加え、次いでｔ＝１分およびｔ＝1.5分にTSTUをさらに20μl反応混合物に加えた。合計で60μlのTSTUをデキストラン出発原料に加えた。操作中、必要に応じてDMAPを加えて反応溶液のpHを8〜8.5に維持した。時間ｔ＝２分に、0.67Mエチレンジアミン水溶液300μlを加えた。１時間後、反応混合物を、生理食塩水で平衡化したP6DGカラム（BioRad製）にて脱塩し、プールした。得られた材料をアミンおよびデキストランについてアッセイしたところ、得られた活性化多糖類は9.4NH₂/100kDaデキストランを含有すると測定された。試料2B 本試料は、本発明の方法におけるウロニウム塩を用いた生物学的に関連のある多糖類の活性化を記載するものである。時間ｔ＝０に、20μlのTSTUを、水１ml当たりPn14を10mgの濃度で溶かしたPn1 4多糖類溶液0.5mlに加えた。その直後、20μlのDMAPを溶液に加えた。時間ｔ＝１分に、20μlのTSTUをさらに加え、時間ｔ＝1.5分に、20μlのTSTUをさらに加えた。この操作中、反応溶液のpHを約8.5に維持するために適当な量のDMAPを加えた。時間ｔ＝２分に、200μlの1Mエチレンジアミン溶液を加えた。約１時間後、反応混合物を、生理的食塩水で平衡化したP6DGカラム（BioRadから入手可能）にて脱塩した。アミン（NH₂）および多糖類の存在を測定するためにアッセイを行ったところ、この活性化多糖類は7.6NH₂/100kDa Pn14を含有すると測定された。試料2C この試料においては、出発原料として10mg/mlの濃度のPn6水溶液0.5mlを用いた以外は試料2Bの操作にしたがった。最初のアッセイ後、試料をプールしてCent ricon装置（Amiconから入手可能）を用いて濃縮した。試料をP6DGカラムに再度流して再アッセイした。得られた活性化Pn6多糖類は10.4NH₂/100kDa Pn6を含有すると測定された。試料2D この試料においては、出発原料として10mg/mlの濃度のPn19生理的食塩水溶液0 .5mlを用いた以外は試料2Bの操作にしたがった。得られた活性化Pn19多糖類は9. 9NH₂/l00kDa Pn19を含有すると測定された。試料2E この試料においては、出発原料として10mg/mlの濃度のPn23生理的食塩水溶液0 .5mlを用いた以外は試料2Cの操作にしたがった。得られた活性化Pn23多糖類は3. 4NH₂/100kDa Pn23を含有すると測定された。試料2F この試料では、多糖類溶液は、10mg/mlの濃度のペクチン（Sigmaから入手可能な柑橘系果物のペクチン）の水溶液0.5ml＋pH約9.6の炭酸ナトリウム（1M）200 μlであった。時間ｔ＝０に0.5MのTSTU（DMF溶液）20μlをこの多糖類溶液に加えた。次いで、時間ｔ＝１分に、20μlのTSTUをさらに加え、pHは1M炭酸ナトリウム溶液を用いて９〜9.5の範囲に維持した。時間ｔ＝３分に、1Mエチレンジアミン（水溶液）500μlを加えた。この反応混合物を室温で一晩放置して、次いで P6DGカラム（BioRadから入手可能）にて脱塩した。得られた活性化多糖類は8.4N H₂/100kDaペクチンを含有すると測定された。試料2G この試料については、48mg/mlの濃度のCMデキストラン（7.5カルボキシル／10 0kDaを含有）の生理的食塩水溶液200μlを水200μlと混合した。時間ｔ＝０に、 TSTU（0.5MのDMF溶液）20μlを前記溶液に加えた。時間ｔ＝20秒に、DMAP（0.5M の水溶液）20μlを加え、次いでｔ＝１分およびｔ＝1.5分に反応混合物にTSTUをさらに20μl加えた。合計で、60μlのTSTUをCMデキストラン出発原料に加えた。操作中、必要に応じて、反応溶液のpHを８〜8.5に維持するためにDMAPを加えた時間ｔ＝２分に、0.5Mのエチレンジアミン（水溶液）200μlを加えた。1時間後、反応混合物を、生理的食塩水で平衡化したP6DGカラム（BioRad製）で脱塩し、プールし、Centricon30装置（Amiconから入手可能）で濃縮し、再び脱塩した。得られた物質をアミンおよびデキストランについてアッセイしたところ、得られた活性化多糖類は10.6NH₂/100kDa CMデキストランを含有すると測定された。試料2H この試料においては、出発原料として55mg/mlの濃度のT2000デキストラン水溶液100μlを用いた以外は試料2Bの操作にしたがった。また、反応操作中、時間ｔ＝２分に、試料2Bの方法において加えた1Mエチレンジアミン溶液200μlの代わりに0.5Mアジピン酸ジヒドラジド溶液200μlを加えた。得られた活性化T2000デキストラン多糖類は8.9ヒドラジド(「Hz」)/100kDaデキストランを含有すると測定された。試料21 この試料においては、PRP多糖類をTNTUウロニウム塩試薬を用いて活性化した。そうするために、0.3M TNTU（NMP溶液）80μlおよび0.5M TEA（NMP溶液）48μ lを、2M NaCl中にPRP（10mg/mlの濃度）を加えた溶液0.5mlに混合した。２分後、0.5Mヘキサンジアミンの0.1Mホウ酸ナトリウム溶液（pH9.3）250μlを上記の混合物に加えた。反応を４℃の温度で一晩進行させた。その後反応混合物を、生理的食塩水で平衡化したP6DGカラム（BioRadから入手可能）にて脱塩した。反応生成物をアミンおよび多糖類についてアッセイしたところ、得られた物質は11.4NH₂基/100kDa PRPを含有すると測定された。実施例２に関する結諭本実施例により、ウロニウム塩試薬を用いることにより種々の異なる多糖類を誘導体化し、アミンまたはヒドラジドのいずれかにより多糖類を官能基化することができるということが分かる。タンパク質または任意のその他の第２成分でジアミンまたはジヒドラジドを置換して活性化多糖類に結合させることができる。また、本実施例により、臨床上関連のある多糖類ならびに植物多糖類を本発明の方法により官能基化することができるということも示される。実施例３本実施例は、タンパク質を活性化多糖類に結合する前にウロニウム塩試薬を除去する本発明の方法を示すものである。多糖類出発原料としては、溶液１ml当たり74mgの濃度で存在する、T2000デキストラン材料５mg（デキストラン溶液約68μlに相当）を用いた。水68μl、NMP 135μl、0.2M TSTU（NMP溶液）50μl、および0.2M DMAP（NMP溶液）50μlをこのデキストラン溶液に加えた。出発時のpHは約9.6であり、pHはこのレベルから低下した。時間ｔ＝30分に約１mlの水を加えた。次いで過剰の試薬をFiltron Omega 30K 膜、サイズ10mlを用いて限外濾過により除去し、最終容量0.5mlを得た。その後、さらに水１mlを加え、得られた混合物を約400μlまで濃縮した。多糖類を装置から取り除き、さらに水100μlを用いて膜をすすいで合計容量約500μlにした。 BSA単量体をこの活性化多糖類溶液にデキストラン１mgあたりBSA 1.7mgの割合で加えた。最終BSA濃度は約7.3mg/mlであった。この反応混合物を約４℃の温度で一晩放置した。HPLCを行って（OD280nm）BSA /デキストラン複合体の存在および複合体反応生成物中に存在するBSAの量を測定した。HPLCは、0.1M KPO₄、pH＝7.3で平衡化したPhenomenex SEC3000、150×7.8 cmにて、移動速度１ml／分で行った。HPLCから、複合体の高分子量ピークにはタンパク質の35％存在するということが分かった（65％は遊離タンパク質として存在）。したがって、得られた複合体はデキストラン１mg当たりBSAを0.6mg含むことが分かった。実施例４本実施例では、ウロニウム塩試薬および種々のその他の試薬を種々の時間に多糖類材料に加えた。ウロニウム塩試薬の各添加の合間に、過剰の試薬は限外瀘過により除去した。デキストラン15mg、BSA単量体15mg、および生理的食塩水3.33mlを含む溶液を調製した。時間ｔ＝０に、0.3M TNTU（NMP溶液）40μlおよび1M TEA（NMP溶液） 12μlを溶液に加えた。次いで時間ｔ＝２分に、TEA６μlをさらに加えた。時間ｔ＝１時間に、下記の洗浄プロトコルを行った。混合物を限外濾過（Filt ron Omega 30、サイズ10mlを用いた）により洗浄した。濾過した混合物を生理的食塩水を用いて10mlに希釈し、その後３mlまで濃縮した。この溶液の0.6mlを分析用に取り出した。残りの多糖類溶液に、TNTUおよびTEAを上記と同様の様式で加えた。１時間反応させた後、洗浄プロトコルを再び繰り返した。このとき、0.6mlを再び分析用に取り出した。 TNTUおよびTEA添加操作を３回目、４回目と繰り返した。これらの操作の間には上記の洗浄プロトコルを行った。但し、これらの３および４回目の添加に関してはTNTUおよびTEAの量は２倍であった。 TNTUおよびTEAの４回目の添加の後、反応を1.5時間進行させ、その後反応混合物を1.5mlまで濃縮し、この溶液の0.5mlを分析用に取り出した。残りの溶液を0. 6mlまで濃縮した。 TNTU 40μlおよびTEA 10μlを残りの0.6mlの溶液に加えた。1時間後、混合物をS400HRゲル濾過カラムに通した。試料の分析により、最初の添加後に得られた複合体はデキストラン１mg当たりBSAを約0.043mg含んでいることが分かった。４回目の添加後、複合体はデキストラン１mg当たりBSAを0.17mg含んでいた。本実施例は、タンパク質および多糖類を希釈した場合、それらがより濃縮された場合よりも結合が少ないということを示すものである。試薬を繰り返し添加することにより、結合の量を有意に増大させることが可能であった。使用した試薬および溶媒を除去することにより、それらが多数回加えられる場合でさえそれらの濃度が低く維持された。実施例５本実施例においては、炭水化物をTSTUを用いてタンパク質に結合させて複合体を形成させた。この操作では、0.5M TSTU20μl（DMF溶液、約10μモルのTSTUに相当）および0.5M DMAP（水溶液）20μlをスクロース200μl（約30μモルに相当）に混合した。時間ｔ＝１分に、さらに20μlのTSTU溶液および20μlのDMAP溶液を加えた。時間ｔ＝1.5分に、さらに20μlのTSTU溶液および20μlのDMAP溶液を加えた。次いで、時間ｔ＝2分に、32.2mg/mlのBSA（単量体）の生理的食塩水溶液200μlを活性化スクロース溶液に加えた。約20秒後、1M炭酸ナトリウム20μl を加え、次いでさらに1M炭酸ナトリウム20μlを加えた。約20分後、得られた反応混合物を、PBSで平衡化した１×l5cm P6DGカラム（Bi oRadから入手可能）にて脱塩し、空隙容量をプールした。次いで、溶液をCentri con 30装置（Amiconから入手可能）を用いて濃縮し、再び脱塩し、最終的に空隙容量をプールした。タンパク質含量をBioRadアッセイにより測定し、炭水化物含量を標準としてスクロースを用いるレゾルシノールアッセイにより測定した。得られた複合体はBSA １モル当たリスクロースを17.5モル含んでいることが分かった。このことから、低分子量の炭水化物がタンパク質に結合していることが分かった。実施例６本実施例では種々の塩を用いて本発明の方法における多糖類を活性化することができるということを示すために、種々のウロニウム塩を用いた。合計４つの異なるウロニウム塩、すなわちTSTU、TNTU、HBTU、およびTBTUを本実施例で試験した。出発ウロニウム塩は全て、0.3MのNMP溶液で製造した。この操作で用いたDMAP も0.3MのNMP溶液であった。BSAタンパク質材料は、１ml当たりBSA 64.4mgの濃度の単量体である。このBSA材料を５×HEPES緩衝液（pH約7.3の溶液を製造するための0.75M HEPESおよび５mM EDTAに相当）と1:1（重量基準）で混合した。本実施例の反応操作を実行するために、４本の異なる試験管中で、それぞれ、 74.4mg/mlの濃度のT2000デキストラン54μl（デキストラン4mgに相当）を28μl の生理的食塩水、82μlの水および86μlのNMPと混合した。次いで、時間ｔ＝０に各試験管が異なるウロニウム塩を含むように一種類のウロニウム塩を10μlずつ各試験管に加えた。10μlのDMAPもウロニウム塩とともに各試験管に加えた。時間ｔ＝１分に、さらに10μlの適切なウロニウム塩を対応する試験管に加え、再び時間ｔ＝２分にさらに10μlの適切なウロニウム塩を対応する試験管に加えた。この部分の反応操作中、溶液のpHをDMAPを用いて８〜９に維持した。この範囲のpHに維持するには、各試験管において合計約50μlのDMAPが必要であった。時間ｔ＝10分に、100μlのBSA溶液を各試験管に加えた（この量はデキストラン１mg当たりBSA約１mgに相当する）。各試験管における反応は約20時間進行させ、その際、反応生成物をPhenomenex BioSep G4000（150×7.8cm、50％0.1M KP O₄、pH＝7.3、50％0.5M KCl、１ml/分）にて280nmで監視するHPLCによりアッセイした。このアッセイの結果を下記の表に示す。これらの試験結果から、試験されたウロニウム塩試薬は全て多糖類を活性化するように作用し、活性化多糖類のタンパク質への結合をサポートするということが分かる。実施例７本実施例は、TNTUを用いて合成ポリビニルアルコール（「PVA」）を活性化し得ることを示すものである。PVAはAldrichから入手した（カタログNo.36,062-7 ）。このPVAは80％加水分解されており、平均分子量は9000〜10,000であった。P VAを、穏やかに加熱することにより、水に20mg/mlの濃度になるまで溶解した。このPVA溶液250μl（PVA約５mgに相当）を250μlのヘキサンジアミンと混合して pH約８の溶液を得た。時間ｔ＝０に、0.3M TNTUの40μlと1M TEAのNMP溶液24μl をPVA溶液に加えた。次いで、時間ｔ＝１分にさらに12μlの1M TEA溶液を加えた反応を一晩進行させた。固体の塊が溶液中に生成し、混合物を温めてその固体を再溶解させた。次いで得られた溶液を生理的食塩水に徹底的に透析した（容量＝約3.5ml）。TNTUで活性化された得られたPVA溶液はNH₂が約0.113mMであり、これは6NH₂/100kDa以上に相当する。本実施例は、ウロニウム塩（例えば本実施例ではTNTU）が第２級アルコールを活性化し得るということを示すものである。PVAは合成ポリマー（カルボキシル基を含まない）であるので、これにより本発明の方法を用いて合成非カルボキシル化ポリマーを活性化し得ることが分かる。実施例８本実施例は、臨床上関連のあるタンパク質と多糖類を同時に活性化し、結合するための一段階操作を示すために提供される。実施例8A この試料では、タンパク質出発原料である破傷風トキソイドは16.8mg/mlの濃度の生理的食塩水溶液であった。用いた多糖類はPRP多糖類であり、2M NaClに室温で1時間回転（rotate）することにより10mg/mlの濃度で溶解した。TNTU活性化剤は0.3MのNMP溶液であった。本実施例で用いたTEAは2MのNMP溶液であった。最後に、用いたグリシンはpH８に調整した2M濃度の水溶液であった。この反応操作では、PRP溶液0.5ml（PRP 5mgに相当）を297μlの破傷風トキソイド溶液（TT 5mgに相当）と混合した。次いで、この混合物をCetricon 50装置（Amicon製）を用いて0.5mlまで濃縮した。その後、時間ｔ＝０に、50μlのTNTU活性化剤を加えた。約15秒後、20μlのTE Aを加えた。2時間後、100μlのグリシン試薬を加えた。反応混合物を一晩放置した。その後、試料を、生理的食塩水で平衡化した１× 50cm S400HRゲル濾過カラムに通した。高分子量画分をプールし、破傷風トキソイドおよびPRPについてアッセイした。この物質は、PRP１mg当たり破傷風トキソイドを0.78mg含むことが分かった。実施例8B この試料では、Neisseria PsCを活性化するための活性化剤としてTNTUを用いて破傷風トキソイド/Neisseria PsC複合体を調製した。この反応操作は、まずタンパク質と多糖類を混合し、その後この混合物にウロニウム塩活性化剤を加える一段階反応プロトコルにしたがった。まず、238μlの破傷風トキソイド（16.8mg/mlの濃度を有する）を0.4mlのNeis seria PsC（生理的食塩水中、10mg/mlの濃度を有する）に加えた。次いで、この混合物をFiltron Omega 30加圧濾過装置を用いて約0.3mlまで濃縮した。次に、50μlの0.3M TNTU（NMP溶液）を濃縮タンパク質／多糖類混合物に加えた。その後、50μlの1M TEA（NMP溶液）を加えて、そのすぐ後にさらに25μlの1 M TEAを加えた。反応を4℃で一晩進行させた。混合物を、PBSで平衡化したS400HRゲル濾過カラム（Pharmacia）、１×50cmに通した。次いで、混合物をMillex GVで滅菌濾過して高分子量画分を得た。この反応生成物をアッセイして破傷風トキソイドおよびNeisseria PsC含量を測定した。得られた複合体はNeisseria PsC１mg当たりTTを0.32mg含んでいることが分かった。試験結果から明らかなように、本実施例は、多糖類が一段階法で活性化され、タンパク質と結合する本発明の方法を示すものである。さらに、本実施例は、カルボキシル含有多糖類との臨床上関連のある複合体の製造におけるTNTUの有用性を示すものである。実施例９本実施例は、固相試薬を調製するためのウロニウム塩試薬の使用を記載するものである。一般的に、液体媒体（例えば、水性媒体、有機／水性混合媒体、または有機媒体）中の多糖類はウロニウム塩試薬で活性化され、アミノビーズ、ELIS Aプレート、またはその他の固相材料と結合する。結合した多糖類および固相材料は、例えば、特異的抗体を吸収させるための分析用固相材料のような診断試薬として有用であり得る。より具体的な例を下記に示す。 Pn14の生理的食塩水溶液（10μg/ml）100μlをアミノ官能基化ELISAプレート（例えば、Nunc「Covalink」）のウェルにピペットで入れる。５μlの0.3M TSTU （NMP溶液）を各ウェルにピペットで入れた後、５μlの0.3M TEA（NMP溶液）をピペットで入れる。対照として、生理的食塩水のみ、TSTUおよびTEAのみ、またはPn14のみを別のウェルに入れる。1時間後、ウェルを生理的食塩水で洗浄する。上記のLeesら，Vaccine，1996にしたがって、ウェルを、公知の抗Pn14陽性抗血清を用いてELISAプレートに結合したPn14の存在について試験する。次いで、ELISAプレートを抗Pn14抗血清の評価に使用する。その他の多糖類は同様に固相材料に結合し得る。当業者は、アミノもしくはヒドラジドマイクロビーズ（Bangs Laboratoriesから入手可能）およびアミノもしくはヒドラジドクロマトグラフィー媒体（Pharmaclaから入手可能）のような、その他の固相試薬についての結合スキームを案出することができるであろう。実施例10 種々のPneumococca114に基づく試薬および複合体を本実施例で調製した。Pneu mococcaに基づく試薬には活性化多糖類にスペーサーを介して（試料10A）または直接（試料10B）結合されているビオチン−Pn14複合体が含まれている。試料10A この操作の出発原料は、Pneumococca114型（メリーランド州、ロックビルのAm erican Tissue Culture Collectionから入手可能）の10mg/mlの濃度の水溶液0.5 mlであった。時間ｔ＝０に、20μlの0.5M TSTU（DMF溶液）を多糖類に加え、その直後に20μlのDMAP（0.5M水溶液）を加えた。時間ｔ＝１分にさらに20μlのTS TUを加え、ｔ＝1.5分にさらに20μlのTSTUを加えた。200μlの1Mエチレンジアミン（水溶液）をｔ＝2分に加えた。この操作中、反応溶液のpHを約8.5に維持するためにDMAPを溶液に定期的に加えた。約1時間後、反応混合物をP6DGカラム（BioRad製、生理的食塩水で平衡化）で脱塩し、得られた溶液をアミンおよび多糖類についてアッセイした。エチレンジアミン／TSTU／Pn14を含む溶液は、２mg/mlの濃度で7.6アミン／100kDa Pn14を含有すると測定された。次いでビオチン複合体を製造した。上記の300μlのエチレンジアミン／TSTU／ Pn14混合物（２mg/ml）を50μlの５×HEと混合した。次いでスルホNHS LCビオチン（BioAffinity Systemsから入手可能）1.6mgを60μlの50％DMFに溶かした溶液を混合物に加えた。1時間後、反応混合物は依然としてTNBS陽性であるので、さらに固体LCビオチンを加えた。合計2時間後、反応混合物を、PBSで平衡化したP6 DGカラム（BioRad製）にて脱塩し、空隙容量をプールした。試料10B この試料は、時間ｔ＝２分にビオチンカプロン酸ヒドラジド（Sigmaから入手可能）を50％DMFに溶かした溶液250μlを加えた（原料ビオチンは溶解性が低い）以外は試料10Aと同じ方法で製造した。1時間後、不溶物質を遠心分離により除去し、得られた溶液を、生理的食塩水で平衡化したP6DGカラム（BioRadから入手可能）にて脱塩した。これらの試料におけるビオチンとPn14の結合を確認するために、E.A.BayerおよびM.Wilchek，Methods of Enzymology，Vol.184(1990)，pp.49-51（この論文は参照により本明細書に含まれるものである）に一般的に記載されているようにしてビオチンについてのアッセイをELISAにより行った。この操作に関して簡単に述べると、ELISA免疫アッセイストリップウェルプレート（Nunc Maxisorpから入手可能）をストレプトアビジン（Zymedから入手可能）の１μg/mlのPBS溶液で被覆し、次いで表示した濃度のビオチニル化Pn14または対照Pn14とともにドラフトを用いない環境下でインキュベートした。その後モノクローナル抗Pn14を用いてストレプトアビジン被覆プレートへのPn14の結合について試験した。下記の表にその試験結果を示す。一次抗体：モノクローナル抗Pn14、1:2000 二次抗体：ウサギ抗マウスIgG-3−HRP 基質：TMB ブロッキング：無しこれらのアッセイ結果から明らかなように、標識されていない対照Pn14はバックグラウンドレベルの吸光度により示されているとおり、ストレプトアビジン被覆ELISAプレートに結合しなかった。しかしながら、複合体試料は１ng/mlという低い濃度でさえプレートに脱離可能なように結合した。これにより、試料10Aおよび10Bはビオチンで標識されたPn14を含んでいたことが分かる。試料10C この試料では、破傷風トキソイドタンパク質がスペーサーによりPn14多糖類に結合された、臨床上関連のある複合体ワクチンを合成した。この操作には、試料 10Aで製造したNH₂/TSTU/Pn14材料を用いた。この結合反応操作を下記のようにして行った。これは上記のA.Leesら，Vaccine，Vol.12，No.13，(1994)，pp.1160- 1166に記載されたものと同じ一般的な結合操作である。この結合操作では、0.75M HEPES、10mM EDTA、pH7.3の100μlおよび0.1M N-ヒドロキシスクシンイミジルヨードアセテート（「SIA」、BioAffinity Systemsから入手可能）のDMF溶液75μlを、1.66mgのNH₂/TSTU/Pn14材料を1.15mlの生理的食塩水に溶かした溶液と混合した。この反応により、ヨードアセチル化Pn14反応生成物（Pn14-SIA）が生成した。別の操作においては、３mgの破傷風トキソイド（16.8mg/mlの濃度の生理的食塩水溶液、溶液180μlに相当）を、HE 100μlおよび0.1M N-スクシンイミジルS- アセチルチオアセテート（「SATA」、BioAffinityから入手可能）のDMF溶液と混合した。この反応により保護チオールを有する破傷風タンパク質（「TT-SATA」）が生成した。 3時間後、反応生成物を、破傷風トキソイド生成物についてはPBS中で、Pn14生成物については生理的食塩水中で平衡化した１×15cmP6DGカラム（BioRad製）にて別々に脱塩した。各画分の空隙容量を、Centricon 30装置（Amiconから入手可能）で（別々に）濃縮した。このとき、125μlのTT-SATA反応生成物を、約300μlのPn14-SIA反応生成物ならびに50μlの５×HEおよび0.5Mヒドロキシルアミンと混合した。反応を一晩進行させた。次いで、10μlの10mMメルカプトエタノール（「BME」）を加えることにより反応を停止させ、1時間放置した。その後、10μlの0.5Mヨードアセトアミドを加え、この混合物を10分間放置した。得られた反応混合物をS400HRゲル濾過カラム（Pharmaciaから入手可能）（１×50cm、PBSで平衡化、0.25ml/分、約１m l/管）を通して、空隙容量画分を得た。得られた複合体はPn14 １mg当たり破傷風トキソイドを約1.5mg含むことが分かった。試料10D この試料では、破傷風トキソイドタンパク質を、活性化剤としてTNTUを用いて Pn14多糖類に直接結合させた。したがって、この試料は、臨床上関連のあるタンパク質／多糖類複合体をTNTU活性化剤を用いて製造し得ることを示すものであるまず、Pn14多糖類および破傷風トキソイドタンパク質をそれぞれ、生理的食塩水溶液に各約6.3mg/mlの濃度で混合した。次いで、時間ｔ＝０に0.5M TNTUのNMP 溶液24μlを混合物に加えた。その後１M TEAのNMP溶液12μlを加えた。時間ｔ＝ 1分に、さらに６μlの1M TEAを混合物に加えた。時間ｔ＝75分に150μlの1Mグリシン（pH８）を加えることにより反応を停止させた。混合物をS400HRカラム（PBSで平衡化）で分画し、高分子量画分をプールし、滅菌濾過し、アッセイした。得られた複合体はPn14 1mg当たり破傷風トキソイドを0.44mg含んでいることが分かった。 TNTUウロニウム塩活性化剤を用いることにより臨床上関連のある複合体を製造することができることが示されたことに加えて、本実施例は、活性化工程および結合工程が一段階の操作で生じ得るということを示すものである。特に、本実施例の操作においては、まずタンパク質と多糖類を混合し、その後活性化剤（TNTU ）をこの混合物に加えている。多糖類は活性化剤により活性化されるので、タンパク質はすぐに便利な一段階操作で結合に利用することができる。実施例11 本実施例では、ウロニウム活性化剤を用いて製造した一定の複合体の免疫原性を試験した。試料11A 複合体調製操作を始めるために、Pn14多糖類2.5mgと破傷風トキソイドタンパク質2.5mgを合計容量350μlで混合した。時間ｔ＝０に、24μlの0.5M TNTU（NMP 溶液）を加え、次いで12μlの1M TEA（NMP溶液）を加えた。時間ｔ＝1分に、さらに６μlの1M TEAを加えた。時間ｔ＝75分に1Mグリシン（pH＝８）150μlを加えることにより反応を停止させた。反応混合物をPBSで平衡化したS400HRゲル濾過カラムに通し、高分子量画分をプールし、滅菌濾過し、アッセイした。得られた複合体はPn14 1mg当たりTT を0.44mgを含んでいると測定された。試料11B この試料では、実施例10Cで調製した破傷風トキソイド-SATA-SIA-NH₂/TSTU/Pn 14複合体を用いた。上記のようにこの複合体はPn14 1mg当たりTTを1.5mg含んでいることが分かった。免疫原性データ試料11Aおよび試料11Bをマウスモデルに使用して得られた複合体の免疫原性を試験した。3群のマウス（各群４匹）を種々の異なる免疫原で処置した。1群のマウスをワクチン複合体試料11Aで処置し、1群をワクチン複合体試料11Bで処置し、1群をPn14単独で処置した。0日目に、各マウスにプライミング(priming)用量のそれぞれの免疫原（各免疫原は５μgのPn14を単独でまたは複合体の一部として含んでいた）を接種した。14日目に、各マウスを同一免疫原を用いて追加免疫感作した。28日目にマウスから採血した。群のマウス由来の血清をプールし、抗 Pn14 IgG力価測定により下記の結果を得た。これらの試験結果により示されたように、ウロニウム塩を用いて本発明にしたがって製造した二つの試料は、その群のマウスに優れた免疫原性応答を誘導した。予想通り、Pn14単独ではほとんど免疫原性応答を誘導しなかった。実施例12 本実施例では、本発明による複合体の免疫学的特性および殺菌特性を調べた。この場合、破傷風トキソイド/Neisseria PsC複合体を活性化剤としてTNTUを用いて調製した。まず、４mgの破傷風トキソイド溶液（19.8mg/mlの濃度）を0.4mlのNeisseria PsC（10mg/mlの濃度の生理的食塩水溶液）に加えた。破傷風トキソイドはMass P ublic Health Labsから入手した。時間ｔ＝０に、50μlの0.3M TNTU（NMP溶液）をタンパク質と多糖類混合物に加えた。その後、25μlの2M TEA（NMP溶液）を加えた。反応を4℃で一晩進行させた。次いで、混合物をPBSで平衡化したS400HRゲル濾過カラム（Pharmacia）に通した。高分子量画分をプールし、その後混合物をMil lex GV装置（Mi11ipore Corp.から入手可能）に通すことにより滅菌濾過した。得られた複合体生成物はNeisseria PsC 1mg当たりTTを0.29mg含んでいると測定された。次いでこの複合体をマウスモデルで用いることにより得られた複合体の免疫原性を試験した。0日目に4匹のマウスのそれぞれに2.5μgのNeisseria PsCを含む複合体のプライミング用量を接種した。14日目に各マウスを同一の量の複合体でブースター免疫感作した。28日目にマウスから採血した。マウス由来の血清をプールし、ELISA（0.10D終点）により抗PsC抗体についてアッセイした。さらに、殺菌アッセイを、K.H.Wongら，Journal of Biological Standards，Vol.5(1977) ，p.197〜（この論文は参照により本明細書に含まれるものである）に記載された操作にしたがって行った。下記の試験結果が得られた。抗PsC IgG力価＝31,019 殺菌力価＝1:320 このデータから明らかなように、本発明の複合体はその群のマウスに優れた免疫原性応答を誘導した。さらに、優れた殺菌効果が本発明の複合体により誘導された（1:40よりも大きい殺菌力価が典型的に防御的であると考えられる）。本発明のその他の特徴本発明はさらに、本発明にしたがって製造された複合体から調製され得るワクチン、免疫原、ならびに免疫学的試薬、治療試薬、および診断試薬に関する。ワクチン、免疫原、またはその他の免疫学的試薬、治療試薬もしくは診断試薬においては、本発明にしたがって製造された複合体を、当業者に公知の通常の技術により医薬上許容される媒体または送達ビヒクルと混合し得る。そのようなワクチンおよび試薬は、有効量の本発明の複合体を、被検体への適正な投与またはその他の所期の使用のための剤形を得るための適当な量のビヒクルとともに含む。ワクチンはミョウバンまたはその他のアジュバントを含み得る。代表的な医薬上許容される媒体またはビヒクルとしては、例えば、水および油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの石油、動物、植物、合成起源の油のような滅菌液が挙げられる。医薬組成物が静脈内投与される場合、生理的食塩水が好ましいビヒクルである。水性デキストロースおよびグリセロール溶液も特に注射可能な溶液用に液体ビヒクルとして使用することができる。E.W.Ma rtin，Remington's Pharmaceutical Sciences（この参考文献は参照により本明細書に含まれるものである）に記載されているもののような適当な医薬ビヒクルが、当技術分野では周知である。本発明は、免疫刺激量の本発明のワクチンを投与することにより被検体を治療し、免疫応答を誘導する方法にも関する。本発明の複合体は、哺乳動物、特にヒト、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、シカ、イヌ、およびネコ、ならびにニワトリのようなその他の動物などの治療が有益であり得る任意の被検体に投与し得る。「免疫刺激量」は、疾患の予防、改善、診断、または治療のために被験者の免疫応答を刺激することができるワクチンの量を意味する。本発明のワクチンは、任意の適当な経路により投与し得るものであるが、好ましくは静脈内、筋肉内、鼻腔内、または皮下注射による投与が好ましい。さらに、本発明のワクチン、免疫原、または免疫学的試薬は、治療目的、予防目的、または診断目的のような任意の適当な目的のために投与し得る。本発明の説明において、本出願人らは、それが作用する様式で本発明が如何にまたは何故作用するかを開示しようと一定の理論を記載した。これらの理論は情報目的のためだけに記載されている。本出願人らは、任意の特定の化学的もしくは物理的機構または作用の理論に縛られるものではない。さらに、本出願人は、本発明にしたがい、いくつかの実施例および複合体を製造する方法を記載した。これらの操作はさらに最適化され得るが（例えば結合中のpH条件を最適化することなど）、そのような方法および反応条件の最適化は日常実験の問題である。本発明は種々の好ましい態様および具体的な実施例に関して記載されているが、当業者には、添付の請求の範囲に規定されたような本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の変更および改良がなされ得るということが認識されるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者モンド，ジェームズ，ジェイ. アメリカ合衆国 20854 メリーランド州, ポトマック，グリーンリーフアベニュー 11804

Claims

【特許請求の範囲】１．式Ｉ：［式中、上のヘテロ原子をも示し、それらの原子はそれらが結合されている窒素原子とともに５〜10員環の複素環を構成している。）と定義され、置換されていても置換されていなくてもよく； R²およびR³は下記のように定義され： R²は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか； R³は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか；または R²およびR³は、一緒になって、それらが結合される窒素原子とともに５〜７員環の複素環を完成するのに必要な炭素、水素、硫黄、窒素、または酸素原子を示し、ここで５〜７員環の複素環は置換されていても置換されていなくてもよく； R⁴およびR⁵は下記のように定義され： R⁴は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか； R⁵は、水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか；または R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合される窒素原子とともに５〜７員環の複素環を完成するのに必要な炭素、水素、硫黄、窒素、または酸素原子を示し、ここで５〜７員環の複素環は置換されていても置換されていなくてもよく；そして X^-は酸アニオンを示す。］で表される化学構造を有するウロニウム塩試薬を、多糖類および炭水化物からなる群から選択される第１成分と混合すること；ならびにタンパク質、ペプチド、リポタンパク質、ハプテンおよび炭水化物からなる群から選択される第２成分を第１成分と混合し、これによって第１成分と第２成分を反応させて複合体ワクチンを形成させることを含む、複合体ワクチンの製造方法。からなる群から選択される基である、請求項１に記載の方法。３．ウロニウム塩試薬を、第２成分を第１成分と混合する前に第１成分と混合し、反応をウロニウム塩試薬と第１成分との間で開始させる、請求項１に記載の方法。４．第１成分が多糖類の溶液である、請求項３に記載の方法。５．ウロニウム塩試薬と多糖類との反応の生成物を、第２成分を該生成物と混合する前に単離する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。６．ウロニウム塩試薬を、第２成分を第１成分と混合する前に、少なくとも２回の異なる時期に第１成分と混合する、請求項３に記載の方法。７．第２成分を、ウロニウム塩試薬を第１成分と混合する前に第１成分と混合する、請求項１に記載の方法。８．第２成分を、ウロニウム塩試薬を第１成分と混合すると同時に第１成分と混合する、請求項１に記載の方法。９．ウロニウム塩試薬を、少なくとも２回の異なる時期に第１成分と混合する、請求項１に記載の方法。 10．酸アニオンがCl^-、Br^-、F^-、I^-、PF₆ ^-、およびBF₄ ^-からなる群から選択されるアニオンである、請求項１に記載の方法。 11．ウロニウム塩試薬が、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；およびO-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の方法。 12．第１成分が多糖類の溶液である、請求項１に記載の方法。 13．多糖類が少なくとも１個のカルボキシル基を含む、請求項12に記載の方法。 14．第１成分が、Neisseria meningiditis Ｃ型多糖類、Haemophilusインフルエンザ多糖類、Pneumococcal多糖類、デキストラン、およびカルボキシル化デキストランからなる群から選択される多糖類である、請求項１に記載の方法。 15．第１成分が多糖類であり、ウロニウム塩試薬に混合する前および第２成分に混合する前に多糖類をカルボキシル化する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。 16．多糖類をCNBr、CDAP、およびビニルスルホン試薬からなる群から選択される試薬と反応させることにより該多糖類を活性化し、次いでカルボキシル化する、請求項15に記載の方法。 17．第２成分がタンパク質である、請求項12に記載の方法。 18．ウロニウム塩試薬が、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフエート；2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート：2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；およびO-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートからなる群から選択されるものである、請求項12に記載の方法。 19．第１成分が少なくとも１個のカルボキシル基を含む、請求項１に記載の方法。 20．第１成分が少なくとも１個のヒドロキシル基を含む、請求項１に記載の方法。 21．請求項１の方法により製造された複合体ワクチン。 22．請求項12の方法により製造された複合体ワクチン。 23．請求項17の方法により製造されたタンパク質／多糖類複合体ワクチン。 24．被検体に請求項21に記載の複合体ワクチンを投与することを含む、被検体に免疫応答を誘導する方法。 25．被検体に請求項22に記載の複合体ワクチンを投与することを含む、被検体に免疫応答を誘導する方法。 26．被検体に請求項23に記載の複合体ワクチンを投与することを含む、被検体に免疫応答を誘導する方法。 27．式Ｉ：［式中、上のヘテロ原子をも示し、それらの原子はそれらが結合されている窒素原子と上もに５〜10員環の複素環を構成している。）と定義され、置換されていても置換されていなくてもよく； R²およびR³は下記のように定義され： R²は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか； R³は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか；または R²およびR³は、一緒になって、それらが結合される窒素原子とともに５〜７員環の複素環を完成するのに必要な炭素、水素、硫黄、窒素、または酸素原子を示し、ここで５〜７員環の複素環は置換されていても置換されていなくてもよく； R⁴およびR⁵は下記のように定義され： R⁴は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか； R⁵は水素原子、１〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルキル、２〜６個の炭素原子を有する置換もしくは非置換のアルケニル、または２〜６個の炭素原子を有するアルキニルを示すか；または R⁴およびR⁵は、一緒になって、それらが結合される窒素原子とともに５〜７員環の複素環を完成するのに必要な炭素、水素、硫黄、窒素、または酸素原子を示し、ここで５〜７員環の複素環は置換されていても置換されていなくてもよく；そして X^-は酸アニオンを示す。］で表される化学構造を有するウロニウム塩試薬を、多糖類、非カルボキシル化高分子量炭水化物、非カルボキシル化低分子量炭水化物、およびヒドロキシル化化合物からなる群から選択される第１成分と混合すること；ならびにタンパク質、ペプチド、リポタンパク質、ハプテン、炭水化物、有機分子、スペーサー分子、固相材料、ホモ二官能性試薬、およびヘテロ二官能性試薬からなる群から選択される第２成分を第１成分と混合し、これによって第１成分と第２成分を互いに結合させること、を含む、分子を互いに結合させる方法。からなる群から選択される基である、請求項27に記載の方法。 29．ウロニウム塩試薬を、第２成分を第１成分と混合する前に第１成分と混合し、反応をウロニウム塩試薬と第１成分との間で開始させる、請求項27に記載の方法。 30．第１成分が多糖類の溶液である、請求項29に記載の方法。 31．ウロニウム塩試薬と多糖類との反応の生成物を、第２成分を該生成物と混合する前に単離する工程をさらに含む、請求項30に記載の方法。 32．ウロニウム塩試薬を、第２成分を第１成分と混合する前に、少なくとも２回の異なる時期に第１成分と混合する、請求項29に記載の方法。 33．第２成分を、ウロニウム塩試薬を第１成分と混合する前に第１成分と混合する、請求項27に記載の方法。 34．第２成分を、ウロニウム塩試薬を第１成分と混合すると同時に第１成分と混合する、請求項27に記載の方法。 35．ウロニウム塩試薬を、少なくとも２回の異なる時期に第１成分と混合する、請求項27に記載の方法。 36．酸アニオンがCl^-、Br^-、F^-、I^-、PF₆ ^-、およびBF₄ ^-からなる群から選択されるアニオンである、請求項27に記載の方法。 37．ウロニウム塩試薬が、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；およびO-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートからなる群から選択されるものである、請求項27に記載の方法。 38．第１成分が多糖類の溶液である、請求項27に記載の方法。 39．多糖類が少なくとも１個のカルボキシル基を含む、請求項38に記載の方法。 40．第１成分が、Neisseria meningiditis Ｃ型多糖類、Haemophilusインフルエンザ多糖類、Pneumococcal多糖類、デキストラン、およびカルボキシル化デキストランからなる群から選択される多糖類である、請求項27に記載の方法。 41．第１成分が多糖類であり、ウロニウム塩試薬に混合する前および第２成分に混合する前に多糖類をカルボキシル化する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。 42．多糖類をCNBr、CDAP、およびビニルスルホン試薬からなる群から選択される試薬と反応させることにより該多糖類を活性化し、次いでカルボキシル化する、請求項41に記載の方法。 43．第２成分がタンパク質である、請求項38に記載の方法。 44．ウロニウム塩試薬が、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；2-(1H-ベンゾトリアゾール-1- イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；2-(5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート；およびO-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートからなる群から選択されるものである、請求項38に記載の方法。 45．第１成分が少なくとも１個のヒドロキシル基を含む、請求項27に記載の方法。 46．請求項27の方法により製造された複合体。 47．請求項38の方法により製造された複合体。 48．請求項43の方法により製造されたタンパク質／多糖類複合体。 49．請求項27の方法により製造された免疫原。 50．請求項38の方法により製造された免疫原。 51．請求項27の方法により製造された診断試薬。 52．請求項38の方法により製造された診断試薬。 53．請求項27の方法により製造された治療試薬。 54．請求項38の方法により製造された治療試薬。