CH615194A5

CH615194A5 - Process for the preparation of amidated immunoglobulins

Info

Publication number: CH615194A5
Application number: CH1147275A
Authority: CH
Inventors: Rudolf Schmidtberger
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1974-09-06
Filing date: 1975-09-04
Publication date: 1980-01-15
Also published as: IE41671L; JPS5161623A; NZ178580A; DE2442655B2; NL7510289A; AT342763B; DK399175A; BR7505721A; SE7509898L; IL48049A; CA1056819A; AU8453675A; IL48049A0; FR2283695B1; ZA755687B; FR2283695A1; GB1517026A; IE41671B1; EG11813A; BE833186A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung amidierter Immunglobuline. Derart modifiziete Immunglobuline eignen sich insbesondere für die Verwendung in Arz- 60 neimitteln für die intravenöse Applikation. The invention relates to a method for producing amidated immunoglobulins. Modified immunoglobulins of this type are particularly suitable for use in medicinal products for intravenous application.

Durch Fraktionierung aus Serum, insbesondere aus menschlichem Serum, hergestellte Immunglobuline haben die wesentliche Eigenschaft, als Antikörper gegen körperfremde Antigene wirksam zu sein. 65 Immunoglobulins produced by fractionation from serum, in particular from human serum, have the essential property of being effective as antibodies against foreign antigens. 65

Immunglobulin-Präparationen erwiesen sich bislang als im wesentlichen nur für die intramuskuläre Verabreichung geeignet. Bei intravenöser Applikation reagierten die Empfänger mehr oder weniger ausgeprägt mit anaphylaktoiden Erscheinungsformen. Immunoglobulin preparations have so far proven to be essentially only suitable for intramuscular administration. When administered intravenously, the recipients reacted more or less pronounced with anaphylactoid manifestations.

Es wird angenommen, dass diese Nebenreaktionen auf der Bindung des Serumkomplements durch das verabreichte Immunglobulun beruhen. Andererseits ist ein intravenöses Immunglobulin-Präparat erwünscht, da es im Organismus rascher zur Wirkung kommt. These side reactions are believed to be due to the binding of the serum complement by the immunoglobulun administered. On the other hand, an intravenous immunoglobulin preparation is desirable because it works more quickly in the organism.

Man hat bereits mehrfach versucht, die Immunglobuline derart zu modifizieren, dass ihre Antikörperaktivität erhalten bleibt, das Mass der Komplementbindung jedoch soweit verringert wird, dass die modifizierten Immunglobuline für eine intravenöse Applikation eingesetzt werden können. Beispielsweise lassen sich Immunglobulinmoleküle durch enzy-matischen Abbau dahingehend verändern, dass die Bindungsstellen für das Komplement abgespalten werden, der Rest der Moleküle jedoch noch in der Lage bleibt, Antigene zu binden. Ein solches Präparat wird mit gutem Erfolg intravenös appliziert. Attempts have been made several times to modify the immunoglobulins in such a way that their antibody activity is retained, but the degree of complement binding is reduced to such an extent that the modified immunoglobulins can be used for intravenous administration. For example, immunoglobulin molecules can be modified by enzymatic degradation in such a way that the binding sites for the complement are split off, but the rest of the molecules remain able to bind antigens. Such a preparation is administered intravenously with good success.

Auch die Umsetzung von Immunglobulinen mit alkylie-renden und acylierenden Mitteln führt zu einem zur intravenösen Anwendung geeigneten Immunglobulin. Die Verminderung der Komplementbindung von Immunglobulinen ist durch N-Alkylierung und Benzylierung ebenfalls zu erreichen. The implementation of immunoglobulins with alkylating and acylating agents also leads to an immunoglobulin suitable for intravenous use. The reduction in complement binding of immunoglobulins can also be achieved by N-alkylation and benzylation.

Es ist weiter ein Verfahren bekannt, wonach Immunglobuline durch Reduktion von intramolekularen Disulfidbin-dungen teilweise gespalten und die gebildeten Sulfhydrilgruppen anschliessend alkyliert werden. Bei diesem Verfahren bleibt die ursprüngliche Molekülgrösse erhalten. A method is also known, according to which immunoglobulins are partially cleaved by reducing intramolecular disulfide bonds and the sulfhydrile groups formed are then alkylated. The original molecular size is retained in this process.

Diese Verfahren beruhen im wesentlichen auf der Veränderung der freien Aminogruppen bzw. Disulfidbindungen der Immunglobulinmoleküle. These processes are essentially based on the change in the free amino groups or disulfide bonds of the immunoglobulin molecules.

Obwohl diese Verfahren zu Produkten mit ziemlich zufriedenstellenden Eigenschaften führen, verbleiben Probleme, die in verbesserter Weise gelöst werden sollten, insbesondere weil die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Moleküle durch die beschriebenen Verfahren wesentlich verändert werden. Although these processes lead to products with fairly satisfactory properties, problems remain which should be solved in an improved manner, in particular because the physico-chemical properties of the molecules are significantly changed by the processes described.

Es wurde nun gefunden, dass Immunglobuline, bei denen einige Carboxylgruppen modifiziert wurden, ihr Bindungsverhalten gegenüber dem Komplement wesentlich ändern, ohne ihre Wirksamkeit als Antikörper zu verlieren. Derart modifizierte Immunglobuline, die wenig oder nicht nachweisbar Komplement zu binden vermögen, sind als Arzneimittel für die intravenöse Applikation geeignet. It has now been found that immunoglobulins, in which some carboxyl groups have been modified, change their binding behavior towards the complement significantly without losing their effectiveness as antibodies. Modified immunoglobulins of this type, which have little or no detectable complement to bind, are suitable as drugs for intravenous administration.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von amidierten Immunglobulinen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man Immunglobuline mit einem molaren Überschuss eines primären Monoamins und einem Carbodiimid oder dessen Salz in schwach saurer bis neutraler wässriger Lösung umsetzt. The invention therefore relates to a process for the preparation of amidated immunoglobulins, which is characterized in that immunoglobulins are reacted with a molar excess of a primary monoamine and a carbodiimide or its salt in weakly acidic to neutral aqueous solution.

Als besonders zweckmässig hat es sich erwiesen, das molare Verhältnis von Monoamin zu Immunglobulinen auf mindestens 50:1 und das von Carbodiimid zu Immunglobulinen auf mindestens 1:1 einzustellen. It has proven particularly expedient to adjust the molar ratio of monoamine to immunoglobulins to at least 50: 1 and that of carbodiimide to immunoglobulins to at least 1: 1.

Als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemässe Verfahren eignen sich aus Seren, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten oder aus Organextrakten gewonnene Immunglobu-lin-Fraktionen. Bevorzugt werden bezüglich Immunglobulin G angereicherte Fraktionen eingesetzt. Eine vorteilhafte Methode zu deren Herstellung ist diejenige nach Levy und Sober mittels Chromatographie an DEAE-Zellulose. Selbstverständlich können auch die reinen Immunglobuline mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens amidiert werden. In der Praxis spielen jedoch die 100%igen reinen Immunglobuline wegen der zu ihrer Gewinnung notwendigen aufwendigen Reinigungsverfahren zurzeit keine bedeutende Rolle. Suitable starting materials for the method according to the invention are immunoglobulin fractions obtained from sera, plasma or other body fluids or from organ extracts. Fractions enriched for immunoglobulin G are preferably used. An advantageous method for their production is that according to Levy and Sober by means of chromatography on DEAE cellulose. Of course, the pure immunoglobulins can also be amidated using the method according to the invention. In practice, however, the 100% pure immunoglobulins currently do not play a significant role because of the complex purification processes required to obtain them.

Es hat sich gezeigt, dass die Komplementbindung der It has been shown that the complement fixation of the

55 55

3 3rd

615194 615194

Immunglobuline besonders niedrige Werte ergibt, wenn das Verhältnis Carbodiimid zu Immunglobulinen 5:1 bis 20:1 beträgt. Immunoglobulins result in particularly low values if the ratio of carbodiimide to immunoglobulins is 5: 1 to 20: 1.

Als primäre Monoamine eignen sich Verbindungen der Formel R-NH2, worin R einen Rest bedeutet, der nach bekannten Vorstellungen in der Immunologie kein markantes antigenes Motiv darstellt. Geeignete primäre Monoamine sind beispielsweise Methylamin oder Äthylamin. sowie höhere aliphatische Amine mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen. In den zur Anwendung gelangenden schwach sauren wässrigen Lösungen liegen diese Amine in der Regel als Ammoniumkationen vor. Unter den erfindungsgemäss zu verwendenden primären Monoaminen sind diejenigen bevorzugt, die noch weitere funktionelle Gruppen, insbesondere hydrophile Gruppen, wie Hydroxygruppen oder Acetalgruppierungen, tragen, da derartige Amine, zu denen beispielsweise Äthanolamin, Trishydroxymethylaminomethan und Glukosamin zählen, die Löslichkeit des Umsetzungsproduktes in physiologisch verträglichen wässrigen Medien günstig beeinflussen. Suitable primary monoamines are compounds of the formula R-NH2, in which R is a radical which, according to known ideas in immunology, is not a striking antigenic motif. Suitable primary monoamines are, for example, methylamine or ethylamine. as well as higher aliphatic amines with up to 10 carbon atoms. These amines are generally present as ammonium cations in the weakly acidic aqueous solutions used. Among the primary monoamines to be used according to the invention, preference is given to those which carry further functional groups, in particular hydrophilic groups, such as hydroxyl groups or acetal groups, since such amines, which include, for example, ethanolamine, trishydroxymethylaminomethane and glucosamine, the solubility of the reaction product in physiologically tolerated aqueous Influence media favorably.

Da das Verfahren im wässrigen System unter Bedingungen, unter denen die Antikörperaktivität des Immunglobulins nicht geschädigt werden darf, durchgeführt werden sollte, ist es zweckmässig, die Umsetzung in an sich bekannterWeise in Gegenwart eines Carbodiimids als Aktivator auszuführen. Als Carbodiimide eignen sich hier alle Vertreter dieser Verbindungsklasse, die in der Lage sind, bei der Bildung von Peptidbindungen aktivierend zu wirken. Beispiele für solche Carbodiimide sind das l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid-Hydrochlorid (EDC) oder das l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoäthyl)-carbodiimid-Metho-p-toluolsulfonat (CMC). Ebenso wie die primären Monoamine werden auch die Carbodiimide in den zur Anwendung kommenden schwach-sauren wässrigen Lösungen allgemein als Salze vorliegen. In der Regel werden die Carbodiimide ohnehin als Salze zum Einsatz gebracht, weil sie in dieser Form beständiger und leichter zu handhaben sind. Prinzipiell können aber auch die freien Carbodiimide zur Anwendung kommen, die dann beim Auflösen in der wässrigen Lösung in die Salzform übergehen. Since the process should be carried out in the aqueous system under conditions under which the antibody activity of the immunoglobulin must not be damaged, it is expedient to carry out the reaction in a manner known per se in the presence of a carbodiimide as an activator. Suitable carbodiimides here are all representatives of this class of compounds which are capable of activating the formation of peptide bonds. Examples of such carbodiimides are l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) or l-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p-toluenesulfonate (CMC). Like the primary monoamines, the carbodiimides will generally be present as salts in the weakly acidic aqueous solutions used. As a rule, the carbodiimides are used as salts anyway, because in this form they are more stable and easier to handle. In principle, however, the free carbodiimides can also be used, which then change to the salt form when dissolved in the aqueous solution.

Die Komplementbindung kann nach der Methode von A. Nowotny, Basic Exercises in Immunochemistry 1969, S. 160 ff. getestet werden. Complement fixation can be tested according to the method of A. Nowotny, Basic Exercises in Immunochemistry 1969, p. 160 ff.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch mit Erfolg auf Immunglobuline mit mindestens zwei Sulfhydrilgruppen angewendet werden, welche man erhält, indem Disulfid-gruppen aufweisende Immunglobuline mit einem Reduktionsmittel behandelt, wobei mindestens eine Disulfidbindung in zwei Sulfhydrilgruppen übergeführt wird. The process according to the invention can also be successfully applied to immunoglobulins with at least two sulfhydril groups, which are obtained by treating immunoglobulins containing disulfide groups with a reducing agent, at least one disulfide bond being converted into two sulfhydril groups.

Die ausgehend von diesen derart reduzierten Immunglobulinen hergestellten amidierten Immunglobuline zeichnen sich durch die gleichen vorteilhaften Eigenschaften aus. The amidated immunoglobulins produced on the basis of these reduced immunoglobulins are distinguished by the same advantageous properties.

Für die Reduktion von Disulfidbindungen kann beispielsweise Dithiothreitol oder Dithioerythrit besonders vorteilhaft verwendet werden. Die Disulfidbindungen können aber auch nach einem bekannten Verfahren mit Reduktionsmitteln, wie 2-Mercaptoäthanol oder Mercaptoäthylamin, unter Einsatz hoher Konzentrationen des Reduktionsmittels reduziert werden. For example, dithiothreitol or dithioerythritol can be used particularly advantageously for the reduction of disulfide bonds. However, the disulfide bonds can also be reduced by a known method using reducing agents, such as 2-mercaptoethanol or mercaptoethylamine, using high concentrations of the reducing agent.

Auch die von Cleland beschriebenen Reduktionsmittel der folgenden Formeln Also the reducing agents of the following formulas described by Cleland

H H H H ! I I I H S C C C C SH H H H H! I I I H S C C C C SH

I I I I I I I I

H OH OH H H OH OH H

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

können für die Reduktion der Immunglobuline eingesetzt werden. can be used for the reduction of immunoglobulins.

Amidierte Immunglobuline mit einer hinreichenden Verringerung der Komplementbindung können intravenös appliziert werden. Sie lassen sich mit physiologisch verträglichen Lösungsmitteln zu entsprechenden Zubereitungen verarbeiten. Amidierte Immunglobuline enthaltende Arzneimittel können in flüssiger oder gefriergetrockneter Form zur Verfügung gestellt werden. Amidated immunoglobulins with a sufficient reduction in complement binding can be administered intravenously. They can be processed into appropriate preparations with physiologically compatible solvents. Drugs containing amidated immunoglobulins can be provided in liquid or freeze-dried form.

Die Erfindung soll an nachstehend angeführten Beispielen näher erläutert werden. The invention will be explained in more detail using the examples given below.

Beispiel 1 example 1

Herstellung des Ausgangsmaterials 22,1 Liter Humanserum, gewonnen aus spontan geronnenem Blut, werden zur Umsalzung über eine mit 0,0175 M Natriumphosphat pH 6,3 äquilibrierte Säule, gefüllt mit Sephadex G-25® «medium» (eingetragenes Warenzeichen der Firma Pharmacia für quervernetztes Dextran) geleitet. Mit einem Durchflussphotometer wird im Säuleneluat die Absorption bei 280 nm gemessen. Der erste, von den Serumproteinen gebildete Gipfel wird getrennt von den nachfolgenden niedermolekularen Anteilen aufgefangen und über eine mit dem oben genannten Phosphatpuffer gespülte Säule aus 15 kg DEAE-Zellulose mit 1 Moläquivalent/g Austauscherkapazität geleitet. Die Säule wird mit 1,5 Säulenvolumen Puffer nachgespült. Die im Durchfluss der Säule befindlichen Immunglobuline werden durch Zugabe von festem Ammonsulfat bis zu einer Konzentration von 2,2 M ausgefällt. Der grösste Teil der überstehenden Flüssigkeit wird nach 24stündigem Stehen abgehebert, der Rest durch Zentri-fugieren bei 5200 g entfernt. Der Zentrifugen-Rückstand wird durch Dialyse gegen 0,1 M NaCl-Lösung von Ammonsulfat befreit. Das Volumen der dialysierten Immunglobulinlösung wird mit NaCl-Lösung auf 2000 ml aufgefüllt. Sie enthält insgesamt 155 g Protein. Production of the starting material 22.1 liters of human serum, obtained from spontaneously clotted blood, are salted over a column equilibrated with 0.0175 M sodium phosphate pH 6.3, filled with Sephadex G-25® "medium" (registered trademark of Pharmacia for cross-linked dextran). The absorption at 280 nm is measured in the column eluate using a flow photometer. The first peak formed by the serum proteins is collected separately from the subsequent low-molecular fractions and passed over a column of 15 kg of DEAE cellulose with 1 molar equivalent / g of exchange capacity which has been rinsed with the above-mentioned phosphate buffer. The column is rinsed with 1.5 column volumes of buffer. The immunoglobulins in the flow through the column are precipitated by adding solid ammonium sulfate to a concentration of 2.2 M. Most of the supernatant liquid is siphoned off after standing for 24 hours, the rest is removed by centrifugation at 5200 g. The centrifuge residue is freed from ammonium sulfate by dialysis against 0.1 M NaCl solution. The volume of the dialysed immunoglobulin solution is made up to 2000 ml with NaCl solution. It contains a total of 155 g of protein.

Amidierung des Immunglobulins 1000 ml der nach dem oben beschriebenen Vogehen erhaltenen Immunglobulinlösung werden 24 Stunden unter Rühren gegen 1000 ml 1 M Tris-Hydroxymethyl-amino-methan-(«Tris»)-HCl-Puffer pH 5,4 dialysiert, in ein Glas-gefäss übergeführt und unter Rühren mit 0,96 g l-Äthyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid • HCl versetzt. Der Ansatz wird zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Amidation of the immunoglobulin 1000 ml of the immunoglobulin solution obtained according to the method described above are dialyzed for 24 hours with stirring against 1000 ml of 1 M Tris-hydroxymethylamino-methane ("Tris") - HCl buffer pH 5.4, in a glass transferred to the vessel and 0.96 g of l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide • HCl were added with stirring. The mixture is stirred for two hours at room temperature.

Das mit Tris-Hydroxymethyl-aminomethan amidierte Immunglobulin wird danach über eine 8 Liter Sephadex G-25® enthaltende Säule geleitet, die vorher mit einer Lösung gespült worden ist, die 0,15 M NaCl und 0,3 M Glycin sowie einen pH-Wert von 7,3 hatte. Die optische Dichte des Säuleneluates wird bei 280 nm mit einem Durchflussphotometer gemessen. Der das amidierte Immunglobulin enthaltende Teil des Eluates wird vereinigt und mit einem Ultrafilter bis zu einem Proteingehalt von 5 % konzentriert. The immunoglobulin amidated with tris-hydroxymethylaminomethane is then passed over a column containing 8 liters of Sephadex G-25®, which has previously been rinsed with a solution containing 0.15 M NaCl and 0.3 M glycine and a pH value of 7.3. The optical density of the column eluate is measured at 280 nm with a flow photometer. The part of the eluate containing the amidated immunoglobulin is combined and concentrated with an ultrafilter to a protein content of 5%.

Die folgende Tabelle zeigt eine Gegenüberstellung Aus-gangs-Immunglobulin zu amidiertes Immunglobulin in bezug auf Komplementbindung und Antikörper-Aktivität: The following table shows a comparison of starting immunoglobulin with amidated immunoglobulin with regard to complement binding and antibody activity:

£0 £ 0

HS- HS-

H H

I I.

-C-I -C-I

H H

I I.

-C I I OH H -C I I OH H

OH H OH H

i-t 1 À i-t 1 À

65 65

-SH -SH

615194 615194

4 4th

Tabelle 1 Table 1

Tabelle 2 Table 2

Antikörper-Spezifität Komplement-Röteln- Diphtherie Tetanus bindung1 Titer IE/ml IE/ml Antibody specificity Complement rubella diphtheria tetanus binding 1 titer IU / ml IU / ml

Ausgangs- Output

Immun- Immune-

globulin globulin

22.0/0 , 22.0 / 0,

1:1024 . 1: 1024.

>0,5 > 0.5

<1,0 <1.0

>1 > 1

<2 <2

Amidiertes Amidated

Immun Immune

globulin globulin

Oo/o Oo / o

1:1024 1: 1024

>0,5 > 0.5

<1,0 <1.0

>1 > 1

<2 <2

Beispiel 2 Example 2

,1000 ml Immunglobulinlösung, gewonnen nach Beispiel 1, , 1000 ml immunoglobulin solution, obtained according to Example 1,

mit 75,5 g Protein werden mit 890 ml einer 52,5 g Glukos- with 75.5 g protein are mixed with 890 ml of a 52.5 g glucose

amin ■ HCl enthaltenden Lösung versetzt und der pH-Wert mit 2 M NaOH auf 6,0 eingestellt. Unter Rühren werden der Lösung 2,06 g l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ätbyl)-carbo-diimid Metho-p-toluolsulfonat zugesetzt und, der Ansatz 1 Stunde weiter gerührt. Die Reaktionstemperatur beträgt . 25° C. Die Überführung des amidierten Immunglobulins in " eine 0,15 M NaCl und 0,3 M Glycin, enthaltende Losung von pH 7,3: erfolgt in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise, jedoch mit einer 10 Liter. Sephadex G-25® enthältenden Säule. Auch die Konzentrierung auf 5 °/o Protein, erfolgt wie in Beispiel .1. Die Ergebnisse der Auswertung des nach Beispiel 2 erhaltenen amidierten Immunglobulins sind denen des Ausgangs-Immunglobulins, in Tabelle 2 gegenübergestellt. amine containing HCl solution and the pH is adjusted to 6.0 with 2 M NaOH. While stirring, 2.06 g of l-cyclohexyl-3- (2-morpholinyl-4-ätbyl) -carbodiimide metho-p-toluenesulfonate are added and the mixture is stirred for 1 hour. The reaction temperature is. 25 ° C. The amidated immunoglobulin is converted into a solution of pH 7.3 containing 0.15 M NaCl and 0.3 M glycine: in the manner described in Example 1, but with a 10 liter. Sephadex G- The column containing 25® is also concentrated as in Example 1. The results of the evaluation of the amidated immunoglobulin obtained according to Example 2 are compared with those of the starting immunoglobulin in Table 2.

Antikörper-Spezifität Komplement- Röteln Diphtherie Tetanus bindung Titer IE/ml IE/ml Antibody specificity Complement rubella Diphtheria tetanus binding Titer IU / ml IU / ml

Ausgangs-Immun-globulin io Amidiertes globulin Initial immune globulin io Amidated globulin

22 o/o 1:1024 >0,5 <1,0 >1 <2 l,5o/o - 1:1024 >0,5 <1,0 >1 <2 22 o / o 1: 1024> 0.5 <1.0> 1 <2 l, 5o / o - 1: 1024> 0.5 <1.0> 1 <2

1 Die Auswertung der Komplementbindung erfolgte nach Nowotny, A., Basic Exercises in Immunochemistry, 1969, S. 160ff. 15 1 Complement fixation was evaluated according to Nowotny, A., Basic Exercises in Immunochemistry, 1969, pp. 160ff. 15

Beispiel 3 Example 3

Reduktion und Amidierung der Immunglobuline Reduction and amidation of immunoglobulins

Die in Beispiel 1 und 2 beschriebene Amidierung der Immunglobuline lässt sich in gleicher Weise mit reduzierten Immunglobulinen vornehmen. Die Reduktion wird wie folgt 20 vorgenommen: The amidation of the immunoglobulins described in Examples 1 and 2 can be carried out in the same way with reduced immunoglobulins. The reduction is carried out as follows 20:

Eine Lösung von 3,3 g Immunglobulin in 330 ml 0,15 M NaCl-Lösung wird mit Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) auf pH 8,2 eingestellt. Der Immunglobulinlösung werden 15,3 mg Dithioerythrit (DTE) gelöst in 2 ml Wasser zu-25 gesetzt. Nach 60 Minuten wird der Immunglobulinlösung 20 ml einer 5 g Tris enthaltenden Tris-HCl-Lösung vom pH 1,0 unter Rühren zugesetzt. Der pH-Wert der Mischung wird mit HCl auf 5,0 eingestellt und wie in Beispiel 1 beschrieben nach Zugäbe von 82,2 mg N-Äthyl-N'-(3-dimethylamino-30 propyl)-cärbodiimid • HCl amidiert. A solution of 3.3 g of immunoglobulin in 330 ml of 0.15 M NaCl solution is adjusted to pH 8.2 with tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris). 15.3 mg of dithioerythritol (DTE) dissolved in 2 ml of water are added to the immunoglobulin solution. After 60 minutes, 20 ml of a pH 1.0 1.0 Tris-HCl solution containing 5 g of Tris is added to the immunoglobulin solution with stirring. The pH of the mixture is adjusted to 5.0 with HCl and amidated as described in Example 1 after addition of 82.2 mg of N-ethyl-N '- (3-dimethylamino-30 propyl) -carbodiimide • HCl.

Die Reduktion der Immunglobuline kann statt mit Dithioerythrit mit Dithiothreitol (DTT) bei gleichen Versuchs-bedingungen vorgenommen werden. The immunoglobulins can be reduced with dithiothreitol (DTT) instead of with dithioerythritol under the same experimental conditions.

POOR QUALITY POOR QUALITY

Claims

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1. A process for the preparation of amidated immunoglobulins, characterized in that immunoglobulins are reacted with a molar excess of a primary monoamine and a carbodiimide or its salt in a weakly acidic to neutral aqueous solution.

2. The method according to claim 1, characterized in that the molar ratio of monoamine to immunoglobulins is set to at least 50: 1 and that of carbodiimide to immunoglobulins to at least 1: 1. 10th

2nd

PATENT CLAIMS

3. The method according to claim 2, characterized in that the molar ratio of cabodiimide to immunoglobulins is set to 5: 1 to 20: 1.

4. The method according to claim 1, characterized in that an aliphatic 15 monoamine having 1 to 10 carbon atoms per molecule, which can carry hydroxyl groups and / or acetal groups as a further functional group, is used as the primary monoamine.

5. The method according to claim 1 or 4, characterized in that there is used as the aliphatic monoamine ethanol 20 amine, trishydroxymethylaminomethane or glucosamine.

6. The method according to claim 1, characterized in that the carbodiimide is l-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride or l-cyclohexyl-3- 25 (2-morpholinoethyl) carbodiimide metho-p -toluenesulfonate used.

7. The method according to claim 1, characterized in that one carries out the reaction at a pH of 3 to 7. 30th

8. The method according to claim 1 or 7, characterized in that one carries out the reaction at a temperature of 5 to 50 ° C.

9. The method according to claim 1, characterized in that human immunoglobulin 35 line is used as the immunoglobulin.

10. Application of the method according to claim 1 to immunoglobulins with at least two sulfhydril groups, which are obtained by treating disulphide-containing immunoglobulins with a reducing agent, where at least one disulfide bond is converted into two sulfhydride groups.

11. Application according to claim 10, characterized in that one carries out the treatment with the reducing agent at a weakly basic pH. 45

12. Application according to claim 10, characterized in that the treatment with the reducing agent is carried out at a weakly basic pH, that the reducing agent is used in a concentration of 0.01 mol / 1 and that the molar ratio of protein to reductant Adjustment agent to a value of 2.5 to 50: 1.

13. Application according to claim 10 or 12, characterized in that dithioerythritol or dithiothreitol is used as the reducing agent.