DE69327587T2

DE69327587T2 - Konjugate von schwach immunogenen antigenen und synthetischen peptidträgern und impfstoffe diese enthaltend

Info

Publication number: DE69327587T2
Application number: DE69327587T
Authority: DE
Inventors: R. Cohen; Matityahu Fridkin; Stephanie Konen-Waisman
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 2000-09-07
Anticipated expiration: 2013-07-29
Also published as: FI950405A7; HU218425B; HU9500270D0; JP4087898B2; NZ255143A; WO1994003208A1; CA2141454C; IL102687A0; CA2141454A1; PL307297A1; FI950405L; PL174082B1; AU683421B2; NO950328D0; EP0658120A4; SK11295A3; KR100290632B1; EP0658120B1; RU95105991A; ATE188612T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft Konjugate mit verstärkter Immunogenität auf der Basis synthetischer Peptidträger, die T- Zell-Epitope darstellen, die Herstellung der Konjugate und geeignete Impfstoffe für die Immunisierung, die diese Konjugate umfassen.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Antikörperreaktionen wurden in zwei Hauptklassen, basierend auf dem Erfordernis für T-Zellen, eingeteilt. Die primäre humorale Immunantwort auf T-Zell-abhängige Antigene (T-dep) ist durch die Aktivierung und Vermehrung von B- und T-Zellen charakterisiert, was auf der einen Seite zur Differenzierung von Plasmazellen und zur Immunoglobulin-Sekretion führt, und auf der anderen Seite zur Bildung von germinalen Zentren und zum immunologischen Gedächtnis. Bei der Restimulierung durch ein Antigen spielen diese Gedächtniszellen die führende Rolle bei der sekundären Antikörperreaktion. Die grundlegenden Merkmale der sekundären Reaktion auf T-abhängige Antigene sind die Schnelligkeit der Antikörperbildung, der größere Umfang der Reaktion im Vergleich zu der primären Reaktion und ein Immunoglobulin-Klassenwechsel von IgM zu IgG.
Es gibt jedoch eine kleine Anzahl von Antigenen, die in der Lage sind, B-Zellen unabhängig von T-Helferzellen zu aktivieren, die als T-Zell-unabhängige (T-ind) Antigene bezeichnet werden. Sie schließen u. a. bakterielle Kapsel-Polysaccharide, wie das Kapsel- Polysaccharid von Streptococcus pneumoniae, polymerisiertes Salmonella Flagellin, Poly-D-Aminosäuren und die Lipopolysaccharide von E. coli ein. T-ind-Antigene weisen ein hohes Molekulargewicht mit einer sich wiederholenden Struktur auf und werden in den meisten Fällen langsam abgebaut. Sie bleiben an der Oberfläche spezialisierter Makrophagen für lange Zeitperioden bestehen und können mit hoher Bindungsstärke an antigenspezifische B-Zellen über ihre mehrwertigen Bindestellen an die komplementären Immunoglobulinrezeptoren, die sie vernetzen, binden. Bei einer ausreichend hohen Konzentration weisen sie die Fähigkeit auf, einen beträchtlichen Anteil des B-Zellpools polyklonal zu aktivieren, d. h. ohne Bezug auf die Antigenspezifität der hypervariablen Rezeptoroberflächenregion. Im allgemeinen veranlassen die T-ind-Antigene hauptsächlich IgM- Reaktionen, etwas IgG3 in der Maus und relativ wenig Gedächtnis, wenn überhaupt.
Verkapselte Bakterien wie Haemophilus influenza Typ b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Gruppe B Streptokokken und E. coli Typ K1 verursachen zahlreiche invasive Krankheiten bei Menschen, insbesondere bei Kindern und bei Personen mit geschwächtem Immunsystem. Es wurde gezeigt, daß Plasma-Antipolysaccharid Antikörper gegen invasive Krankheiten schützen, die durch diese Pathogene verursacht werden, und es wurden Impfstoffe, die gereinigte Kapsel-Polysaccharide (CPS) enthalten, entwickelt, um solche Antikörper bei gefährdeten Personen zu erzeugen. Jedoch sind Polysaccharide bei Kindern schwache Immunogene und dadurch in ihrer Verwendung als Impfstoffe stark eingeschränkt. Es wird angenommen, daß der Grund für ihre geringe Immunogenität damit zusammenhängt, daß sie zu der Gruppe der T- ind-Antigene gehören.
Die Entdeckung von Avery & Goebel (1929), daß das Kuppeln von Polysacchariden an Proteinträger die Immunogenität erhöht, wurde kürzlich zur Herstellung von Impfstoffen für die Verwendung bei Menschen verwendet. Diese Konjugate verhalten sich sowohl bei Menschen wie auch bei Nagetieren wie T-dep-Antigene, indem sie eine Induktion des immunologischen Gedächtnisses zeigen. Zwischen konjugierten Polysaccharidimpfstoffen und Proteinträger-Haptensysteme gibt es Ähnlichkeiten. Somit sind die CPS-Konjugate in der Lage, einen schützenden Gehalt von CPS-Antikörpern bei Kindern zu induzieren, während dagegen CPS alleine dazu nicht in der Lage ist. Es ist möglich, daß die höhere Immunogenität der Konjugate im Vergleich zu der von reinen Polysacchariden auf die Unterstützung durch trägerspezifische T-Zellen zurückzuführen ist, wie es in dem Träger-Haptensystem bei Nagetieren gezeigt worden ist.
In den meisten Fällen wurden T-ind-Antigene mit großen immunogenischen Proteinen, wie Tetanus-Toxoid, Cholera-Toxin oder Diphtherie-Toxoid gekuppelt. Dennoch ist die immunologische Reaktion auf Trägermoleküle mit hohem Molekulargewicht, die sowohl stimulierende als auch suppressive T-Zell-Epitope enthalten, schlecht vorherzusagen. Es wurde gezeigt, daß die Antikörperreaktion auf ein Hapten, das mit einem Trägerprotein gekuppelt ist, auch inhibiert werden kann, wenn der Patient zuvor mit dem nichtmodifizierten Protein immunisiert worden ist. Dieses Phänomen wurde als trägerinduzierte Epitop-Suppression bezeichnet und es wurde kürzlich gezeigt, daß es bei einer Vielzahl von Hapten-Protein-Konjugaten auftritt. Da die Entwicklung von wirksameren Konjugat-Impfstoffen gegen eine große Zahl extrem infektiöser Organismen weiterhin wichtig ist, wurden Anstrengungen unternommen, um nach geeigneteren Trägermolekülen zu suchen, die die notwendigen T-Zell-Epitope bereitstellen. Universelle immunogene T-Zell-Epitope, die als spezifische Peptide mit deutlich umrissenen immunologischen Merkmalen definiert sind, könnten eine neue Generation von solchen alternativen Molekülen darstellen. Proteine, die gut von dem Immunsystem erkannt werden, könnten eine geeignete Quelle für Peptide darstellen, die diesem Zweck dienen.
Studien unter Verwendung einer großen Vielzahl an Proteinen, sowohl von solchen, die sehr nahe verwandt sind, als auch solchen, die phylogenetisch entfernt verwandt sind, haben gezeigt, daß sich die Mehrzahl der T-Zellen auf wenige immunodominante Epitope richten, wobei eine Minderheit auf andere subdominante Determinanten reagiert. Diese Determinantenhierarchie bei der T-Zellen-Nutzung könnte aus einer Kombination von Faktoren resultieren, die unterschiedliche Affinitäten für die zugänglichen MHC-Moleküle, die Diversität des T-Zellrepertoires, die innere Kompetition um MHC-Bindungsstellen und feine Unterschiede beim Verarbeiten einschließen.
Es häufen sich die Beweise, daß Proteine, die zu der Familie der Hitzeschock-Proteine (hsp) gehören, wesentliche Antigene für viele Pathogene sind (Young et al. 1988). Die hsp wurden zuerst beschrieben und später aufgrund ihrer Bildung in Zellen, wenn diese plötzlichen Temperaturerhöhungen ausgesetzt werden, so bezeichnet. Die hsp schließen Proteine von verschiedenen Molekulargewichten, einschließlich 20kD, 60kD, 65-68kD, 70kD, 90kD, 110kD und andere ein. Es ist jetzt offensichtlich, daß die hsp in allen Zellen durch viele verschiedene Umwelteinflüsse, einschließlich oxidativem Streß, unzureichende Ernährung und eine Infektion mit intrazellulären Pathogenen erzeugt werden; wobei die hsp-Reaktion der Zelle ermöglicht, unter ansonsten ungünstigen Bedingungen zu überleben. Obwohl der zelluläre Streß die Synthese der hsp erhöht, werden viele hsp konstitutiv exprimiert und spielen bei der normalen Zellfunktion eine essentielle Rolle. Die hsp-Reaktion ist über den pro- und eukaryotischen Bereich ubiquitär und die hsp gehören zu einigen der am meisten konservierten Moleküle. Trotz der evolutionären Divergenz von über eine Billion Jahren sind zum Beispiel die menschlichen und die mycobakteriellen hsp65-Moleküle zu etwa 50% ihrer Aminosäurereste identisch. Diese chemische Konservierung schließt viele Aminosäureabschnitte mit übereinstimmender oder ähnlicher Identität ein. Als Konsequenz wird jeder Organismus die immunologische Cross-Reaktivität mit dem hsp65 von irgendeiner fremden Zelle teilen. Somit wird das hsp65-Molekül von irgendeinem infektiösen zellulären Mittel teilweise körpereigen und teilweise körperfremd für irgendeinen Wirt mit einem Immunsystem sein. Deswegen würde man voraussagen, daß hsp65 und andere hsp schwach immunogen sind. Im Gegensatz dazu weisen die Befunde darauf hin, daß die hsp einige der am meisten dominanten Immunogene darstellen.
Hsp65, ein repräsentativer Vertreter der Proteine, die zu der hsp-Familie gehören, kann als ein dominantes Antigen betrachtet werden, da die Infektion oder Immunisierung mit vielen verschiedenen Bakterien Antikörper und T-Zellen erzeugt, die für das hsp65-Molekül spezifisch sind (Young et al. 1988). Bei Mäusen, die mit dem Mycobacterium tuberculosis immunisiert sind, sind 20% aller T-Zellen, die auf das Bakterium reagieren, für hsp65 spezifisch. Interessanterweise wurden T-Zellen mit einer Reaktivität auf hsp65 auch bei normalen gesunden Personen identifiziert, die keine klinischen Anzeichen einer Krankheit aufweisen (Munk et al. 1988). Unter Verwendung von synthetischen Peptiden zeigten Lamb et al. (1987) und Munk et al. (1988), dass die T- Zellen auf gemeinsame Epitope des Mycobakteriums und des menschlichen hsp65 reagieren; was die Existenz von T-Zellen gegen körpereigene Epitope von hsp65 bei normalen Personen formal beweist.
Als Konsequenz dieser Immunodominanz ist es nicht überraschend, daß das hsp65-Molekül anscheinend an autoimmunologischen Vorgängen beteiligt ist. Die Immunität bezüglich hsp65 kann bei Mäusen einen Autoimmun-Diabetes verursachen, und kann mit der Autoimmun-Arthritis bei Ratten und bei Menschen verbunden sein (Ellas et al. 1990; Pearson, 1964). Somit ist die Immunität bezüglich hsp65 mit einer Autoimmunerkrankung assoziiert, aber auch mit dem Zustand der Gesundheit.
Während einer Infektion erhöhen sowohl das Pathogen wie auch der Wirt ihre Synthese von hsp beträchtlich, um gegen den Streß, der durch den anderen verursacht wird, Schutz zu liefern. In Analogie zu B-Zellreaktionen auf Autoantigene ist es möglich, sich vorzustellen, daß körpereigene hsp-reaktive T-Zellen, wie die T- Zellen, die spezifisch das hsp65 erkennen, vorteilhaft am Abklingen einer Entzündung beteiligt sind, indem sie Streßzellen entfernen. Jedoch könnte vielleicht eine Autoimmunerkrankung auftreten, wenn die Reaktion nicht korrekt gesteuert wird. Cohen & Young (1991) schlugen vor, daß das Vorherrschen der "natürlichen Immunität" bei gesunden Personen durch ein Immunsystem gewährleistet wird, das auf einer Reihe von hochkontrollierten und gesteuerten Immunnetzwerken basiert, die gegen eine limi tierte Anzahl kontrollierter Eigenantigene gerichtet sind. Es wird vorgeschlagen, daß das hsp65-Molekül eines dieser Antigene ist, gegen das solch eine hochorganisierte Immunantwort natürlich auftritt (Elias et al. 1990).
Cox et al (1988) zeigten, daß ein Dimer des 65-85 Peptids des 65kDa Proteins von Mycobacterium tuberculosis nicht die Fähigkeit beeinflußt, die T-Zell-Vermehrung zu induzieren, aber die Antikörperbildung erhöhte, und es wurde vorgeschlagen, daß eine Kombination heterologer Peptide mit dem N-Terminus der mycobakteriellen 65-85 Sequenz allgemein zur Herstellung von Peptidimpfstoffen geeignet ist. Lussow et al. (1990) und Barrios et al. (1992) zeigten, daß das hsp65 und das hsp70 des Mycobacterium bovis als Trägermoleküle für die Induzierung von Anti-Hapten- Antikörpern bei Mäusen verwendet werden können. Zusätzlich wurden viele T-Zell-Epitope des hsp65 von M. bovis identifiziert und es wurde gezeigt, daß das gesamte Protein bei einer Vielzahl von Mäusestämmen mit verschiedenen MHC-Haplo-Typen immunogen ist (Brett et al. 1989).
Es kann angenommen werden, daß einige T-Zell-Epitope innerhalb der Sequenz des hsp65 Proteins (von einem Wirt bzw. einem Parasit) eine Immunodominanz zeigen, und daß sie in der Lage sind, ein immunologisches Gedächtnis zu erzeugen, während andere nicht die privilegierte immunologische Erkennung zeigen oder an der Erzeugung der Autoimmunität beteiligt sind. Die Unterscheidung zwischen diesen funktionell verschiedenen T-Zell- Epitopen kann zu der Identifizierung von universell immunogenen Peptiden führen, die als sichere, definierte und potente Alternativen für Trägermoleküle der T-ind-Antigene dienen können.
Das europäische Patent EP 262 710 und das US-Patent Nr. 5 154 923 beschreiben Peptide mit einer Aminosäuresequenz, die den Positionen 171-240 bzw. 172-192 eines 64kD-Polypeptids von Mycobacterium bovis entsprechen, die als Immunogene zur Erzeugung einer Resistenz gegenüber Autoimmunarthritis und ähnlichen Autoimmunerkrankungen nützlich sind.
Die PCT-Patentanmeldung Nr. WO 90/10449 beschreibt ein Peptid, das als p277 bezeichnet wird, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die mit den Positionen 437-460 des menschlichen hsp65- Moleküls übereinstimmt, das als Immunogen zur Erzeugung von Resistenz gegenüber insulinabhängigem Diabetes mellitus (IDDM) nützlich ist. Ein Kontrollpeptid, das als p278 bezeichnet wird, das mit den Positionen 458-474 des menschlichen hsp65 übereinstimmt, erzeugte keine Resistenz gegenüber IDDM.
Lussow et al (1990) zeigten, daß die Sensibilisierung von Mäusen mit dem lebenden Mycobacterium tuberculosis var. bovis (BCG) und die Immunisierung mit dem synthetischen repetitiven Malaria- Peptid (NANP)&sub4;&sub0;, das mit dem gereinigten Proteinderivat (PPD) konjugiert ist, zur Erzeugung von hohen und langanhaltenden Titern von Antipeptid-IgG-Antikörpern führt. Später zeigten Lussow et al. (1991), dass mycobakterielle Hitzeschock-Proteine (hsp) von 65kDa (GroEL-Typ) und 70kDa (DnaK-Typ) als Trägermoleküle bei Mäusen, die zuvor mit dem Mycobacterium tuberculosis var. bovis (bacillus Calmette-Guerin, BCG) sensibilisiert wurden, zur Induktion von hohen und langanhaltenden Titern von IgG gegen das synthetische repetitive Malaria-Peptid (NANP)40 führten. Es wurden Anti-Peptid-Antikörper erzeugt, wenn das Malaria-Peptid, das mit dem mycobakteriellen hsp konjugiert ist, in Abwesenheit von irgendeinem Zusatzstoff verabreicht wurde.
Barrios et al (1992) zeigten, daß Mäuse, die mit Peptiden oder Oligosacchariden, die mit 70kDa hsp konjugiert sind, immunisiert wurden, hohe Titer an IgG-Antikörper in Abwesenheit einer vorherigen Sensibilisierung mit BCG erzeugten. Die Anti-Peptid- Antikörper-Reaktion hielt für wenigstens 1 Jahr an. Dieser Effekt des Adjuvans-freien Trägers des 70kDa hsp war T-zellabhängig, da weder Anti-Peptid- noch Anti-70kDa IgG-Antikörper bei athymischen nu/nu-Mäusen erzeugt wurden. Eine vorherige Immunisierung der Mäuse mit dem 65kDa oder 70kDa hsp gab keinen negativen Einfluß auf die Erzeugung der Anti-Peptid-IgG-Antikörper nach der Immunisierung mit hsp-Peptid-Konjugaten in Abwesenheit eines Adjuvans. Darüber hinaus könnte die Präimmunisierung mit dem 65kDa hsp BCG im Hinblick auf eine effektive Sensibilisierung zur Induzierung von Anti-(NANP)&sub4;&sub0;-Antikörper ersetzen. Schließlich wurden sowohl das 65kDa wie auch das 70kDa hsp als Trägermoleküle zur Erzeugung der IgG-Antikörper gegenüber Gruppe C Meningoccoccal-Oligosacchariden in Abwesenheit von Adjuvantien verwendet, wobei vorgeschlagen wird, daß die Verwendung von hsp als Träger in konjugierten Konstrukten für die Erzeugung von Anti- Peptid- und Anti-Oligosaccharid-Antikörpern bei der Entwicklung neuer Impfstoffe zur schließlichen Verwendung bei Menschen wertvoll sein könnte.
R. Lussow in Eur. J. Immunol., 1991, 21: 2297-2302 offenbart, daß die Sensibilisierung von Mäusen mit Mycobacterium Tuberculosis var. bovis (BCG) und die Immunisierung mit dem synthetischen repetitiven Malaria-Peptid (NANP)40, das mit gereinigten Proteinderivaten (PPD) konjugiert ist, zur Erzeugung von hohen und langanhaltenden Titern von Anti-Peptide-IgG-Antikörpern führt. Jedoch offenbarte Lussow die Verwendung des früheren E. coli GroEL hsp-Protein, nicht die Verwendung eines Peptidfragments des Proteins wie die vorliegende Erfindung.
Das US-Patent Nr. 5 196 512, das am 23. März 1993 veröffentlicht worden ist, wie auch die EP-Anmeldung Nr. 0 378 881 beschreiben immunogene Konjugate, die aus spezifischen Peptiden bestehen, die sich von denen der Erfindung unterscheiden, und einem natürlichen oder synthetischen Hapten, das von einem interessierenden pathogenen Mittel abgeleitet ist. Doch sind die spezifischen Konjugate der Erfindung weder offenbart noch in diesen Dokumenten vorgeschlagen.
Keine der zuvor erwähnten Druckschriften beschreibt spezifische T-Zell-Epitope des menschlichen hsp65, die mit schwach immunogenen Molekülen konjugiert sind.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verstärkung der Immunogenität von schwach immunogenen Antigen- Molekülen bereitzustellen, so daß diese in für die Immunisierung geeignete Antigene überführt werden.
Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung Konjugate eines schwach immunogenen Antigens und eines synthetischen Peptidträgers bereit, der ein T-Zell-Epitop darstellt, das von der Sequenz des menschlichen hsp65 abgeleitet ist, oder ein Analogon davon, wobei das Peptid oder das Analogen in der Lage ist, die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich zu verstärken.
Säugetier-hsp65, einschließlich menschliches und Mäuse-hsp65 werden oft von anderen Autoren als "hsp60" bezeichnet, da sie zu der allgemeinen hsp60 Familie gehören. In dieser Beschreibung ist es beabsichtigt, daß dann, wenn menschliche oder das Maushsp65 erwähnt werden, diese Moleküle die mit der Bezeichnung "hsp60" oder mit irgendeiner anderen Bezeichnung, die dem Fachmann bekannt ist, einschließen.
Es kann in dieser Erfindung irgendein Peptid oder ein Analogon davon, das von dem menschlichen hsp65 abgeleitet ist und das ein T-Zell-Epitop enthält und in der Lage ist, die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich zu verstärken, verwendet werden.
Gemäß der Erfindung stimmt ein bevorzugtes Peptid, hier als Pep278h oder 278h bezeichnet, mit den Positionen 458-474 des menschlichen hsp65-Moleküls überein, und weist die Sequenz auf:
Bevorzugte Analoga von Pep278h sind die Peptide, die hier als Pep278 m oder 278m bezeichnet werden, bei denen der Rest T&sup4;&sup7;¹ des Pep278h durch A&sup4;&sup7;¹ ersetzt ist, und Pep278mt oder 278mt mit der folgenden Sequenz:
EGDEATGANIVKVALEA
Ein anderes T-Zell-Epitop der Erfindung, das von dem menschlichen hsp65-Molekül abgeleitet ist, das hier als Peptid II oder Pepil bezeichnet wird, stimmt mit den Positionen 437-448 des -menschlichen hsp65-Moleküls überein, bei dem die beiden Cystein- Einheiten bei den Positionen 442 und 447 durch Serin ersetzt worden sind und weist die Sequenz auf:
Das schwach immunogene Antigen-Molekül kann ein Peptid, ein Polypeptid oder ein Protein sein, z. B. ein Peptid, das vom HIV- Virus oder vom Malariaantigen abgeleitet wird, oder ein bakterielles Polysaccharid, z. B. Kapsel-Polysaccharide von Haemophilus influenzae-Typ b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Gruppe B Streptococci, E. coli Typ K1, Salmonella, wie Salmonella typhi, etc.
Das Trägerpeptid ist mit dem schwach immunogenen Antigenmolekül entweder direkt oder über einen Spacer kovalent verbunden.
Die Erfindung betrifft ferner Impfstoffe, die ein Konjugat der Erfindung oder eine Mischung des schwach immunogenen Antigens und des geeigneten Peptidträgers umfassen.
Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Immunisierung eines Säugetierwirts, das die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Konjugats der Erfindung oder die Co-Verabreichung wirksamer Mengen eines schwach immunogenen Antigen-Moleküls und eines synthetischen Peptidträgers umfaßt, der ein T-Zell-Epitop enthält, das von der Sequenz des menschlichen hsp65 abgeleitet ist, oder ein Analagon davon, wobei das Peptid oder das Analogon geeignet sind, die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich zu verstärken.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1-1a zeigen die Serum-Anti-Vi-Antikörperreaktion, die bei Mäusen durch Vi alleine, 12 und 24 Tage nach der ersten Immunisierung und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung erzeugt werden bei einer Serumverdünnung von 1 : 50(1) und 1 : 500(1a):
Fig. 2a-f zeigen die Anti-Vi-Antikörperreaktion, die bei Mäusen durch Vi alleine oder durch Vi-Konjugate Vi-Pep II, Vi-Pep278h und Vi-Pep348h ((a-c) 2,5 ug und (d-f) 0,25 ug Vi injiziert pro Maus) 12 (a und d) und 24 Tage (b und e) nach der ersten Immunisierung und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung (c und f) induziert wurden.
Fig. 3a, 3ab, 3b und 3bb zeigen die Kinetik der Anti-Vi-Antikörperproduktion, die durch Vi-Protein/Peptidkonjugate (3a und 3b) und durch Vi alleine (3ab und 3bb) (2,5 ug (Fig. 3a und 3ab) und 0,25 ug (Fig. 3b und 3bb) Vi-injiziert pro Maus) 12 und 24 Tage nach der ersten Immunisierung und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung induziert wurden.
Fig. 4a-b zeigen die Spezifität der Anti-Vi-Antikörper, die bei Mäusen hervorgerufen werden, die mit Vi alleine oder mit Konjugaten ViPep II und Vi-Pep278h immunisiert wurden. Die Antikörper wurden in ELISA-Platten bestimmt, die mit 2,5 ug (Fig. 4a) oder 1,25 ug Vi pro Loch (Fig. 4b) beschichtet waren.
Fig. 5a-b zeigen die Isotypcharakterisierung der Anti-Vi-Antikörper, die in Mäusen durch Vi alleine oder durch das Konjugat Vi- Pep278h hervorgerufen wurden. Fig. 5a - Anti-Vi-IgM-Isotyp Reaktion auf Vi und Vi-Pep278h; Fig. 5b - Anti-Vi-IgG-Isotyp Reaktion auf Vi und Vi-Pep278h.
Fig. 6a-b zeigen den Zeitverlauf der Anti-Vi-Antikörperproduktion bei Mäusen, die mit Vi alleine oder mit den Konjugaten Vi-Pep II und Vi-Pep278h immunisiert wurden, bei einer Serumverdünnung von 1 : 100 (Fig. 6a) und 1 : 1000 (Fig. 6b).
Fig. 7aa, 7ab, 7ba, 7bb, 7ca und 7cb zeigen den Effekt des Adjuvans und der Immunisierungsweise auf die Anti-Vi-Antikörperproduktion die durch Vi-Pep II induziert wurde, die subkutan (sc) injiziert wurden (Fig. 7aa, 7ba und 7ca) oder (Fig. 7ab, 7bb und 7cb) intramuskulär (im) in Mäusen, 12 (Fig. 7aa und 7ab) und 24 Tage (Fig. 7ba und 7bb) nach der ersten Immunisierung und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung (Fig. 7ca und 7cb).
Fig. 8a-c zeigen die Anti-Vi-Antikörperproduktion, die bei Mäusen durch das Vi-Pep II Konjugat oder durch freies Pep II, das mit Vi vor der Immunisierung gemischt worden war, erzeugt wird, 12 (Fig. 8a) und 24 Tage (Fig. 8b) nach der ersten Immunisierung und 12 Tage (Fig. 8c) nach der zweiten Immunisierung.
Fig. 9 zeigt den Einfluß des Trägers beim Sensibilisieren auf die Anti-Vi-Antikörperproduktion bei Mäusen, die mit dem konjugierten Vi-Pep II immunisiert worden sind, die sc 14 Tage vor der Immunisierung mit freiem Pep II in IFA (links) sensibilisiert wurden oder nicht-sensibilisiert (rechts) sind.
Fig. 10a-d zeigen die Anti-Vi-Immunreaktion, die in der gleichen individuellen Maus durch Vi-Pep277(s)(Antigen A) durch ViPep278h (Antigen B, nachdem die Mäuse mit Vi-Pep277 (s) injiziert wurden), durch Vi alleine (Antigen C, nachdem die Mäuse mit ViPep277(s) injiziert wurden) und ViPep278h (Antigen D), 12 Tage nach der ersten (Fig. 10a und 10c) und 12 Tage nach der zweiten (Fig. 10b und 10d) Immunisierung erzeugt worden sind, bei einer Serumverdünnung von 1 : 50 (Fig. 10a und 10b) und 1 : 1000 (Fig. 10c und 10d).
Fig. 11a-f zeigen ein Screenen der Erkennung von Vi alleine (Fig. 11b) und der Konjugate Vi-Pep II (Fig. 11c), Vi-Pep278h (Fig. 11d), Vi-Pep II*(Fig. 11e) und Vi-PCRP77-83 (Fig. 11f), die auf ELISA-Platten beschichtet waren, durch das Referenz-Anti-Vi-Serum Burro 260 (Fig. 11a).
Fig. 12a-e zeigen die Immunreaktion verschiedener Mäusestämme auf Vi und Vi-Konjugate. Fig. 12a: Reaktion der BALB/c-Mäuse auf Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-Res, Vi-348 und Vi-277(S); Fig. 12b: Reaktion der BALB/k-Mäuse auf Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi- 278mt, Vi-277(S) und Vi-Res; Fig. 12c: Reaktion der BALB/b-Mäuse auf einige Antigene von Fig. 12b; Fig. 12d: Reaktion der NOD- Mäuse auf Vi, Vi-278h, Vi-278 m, Vi-278mt und Vi-Res; Fig. 12e: Reaktion der NON.NOD = Mäuse auf Vi, Vi-278h und Vi-278mt.
Fig. 13a-c zeigen die IgG-Isotyp-Serenverteilung der Mäuse, die mit dem Vi-278h-Konjugat, das in IFA emulgiert war, mit Vi in IFA bzw. mit IFA/PBS immunisiert wurden.
Fig. 14 zeigt die Immunreaktion von Mäusen auf Vi-Fragmente und auf Vi-Fragmente-278h-Konjugat.
Fig. 15 zeigt die Immunogenität von Vi und der Konjugate Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt und Vi-SerRes bei Mäusen.
Fig. 16 zeigt die IgG-Immunreaktion, die bei Mäusen nach der Immunisierung mit dem Polypeptid FEPX alleine oder konjugiert mit den Peptiden 278h und 348h erhalten wurde.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Es wurden erfindungsgemäß bevorzugte Konjugate gebildet, indem man Pep278h oder Pep II mit einem bakteriellen Polysaccharid, z. B. dem CPS Vi von Salmonella typhi, nachstehend als Vi bezeichnet, einem linearen Homopolymer des Poly-α(1-4)GalNAc, das variabel an der C&sub3;-Position O-acetyliert ist, wie es in Schema 1 gezeigt ist, kovalent verknüpfte. Vi alleine, wie andere CPS, ruft keine Booster-Reaktion bei Säugetieren, sowohl bei Tieren wie auch bei Menschen hervor, wenn es reinjiziert wird, aber es wird die Immunogenität erhöht, wenn es als ein erfindungsgemäßes Konjugat, gekuppelt an ein geeignetes Peptid, das von dem menschlichen hsp65 oder ein Analogon davon abgeleitet ist, oder in einer Mischung mit solch einem Peptid oder Analogon vorhanden ist. Die Reinjektion des Vi-Peptidkonjugats erzeugt eine Zunahme des Spiegels der Anti-Vi-Antikörper (Booster-Effekt), die hauptsächlich dem IgG-Isotyp angehören.
Im Fall von Pep278h sind die erfindungsgemäßen aktiven Peptide dadurch gekennzeichnet, daß sie hochgeladen sind, d. h., daß sie starke elektrische Eigenschaften aufweisen (7 der 17 wesentlichen Aminosäurereste von Pep278h sind entweder negativ oder positiv geladen) und daß sie stark hydrophob sind (6 Aminosäurereste). Das Peptid Pep278h ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß es einen polaren negativ geladenen N-terminalen Bereich aufweist, einen polaren positiv geladenen C-terminalen Bereich und einen stark hydrophoben Kern. Diese gesamten Eigenschaften sollten aufrechterhalten werden, um die Wirksamkeit zu erhalten. Somit sollte unter Berücksichtigung der oben genannten allgemeinen Übersicht die Substitution von bestimmten Aminosäuren zu aktiven Peptiden führen. Das bedeutet konkret, daß die Positionen 6, 8, 10, 11, 15 und 17 in der Pep278h-Peptidkette (die den Positionen 463, 465, 467, 468, 472 und 474 des menschlichen hsp65-Moleküls entsprechen) durch entweder I oder L oder durch andere natürliche hydrophobe Aminosäuren wie V, M oder F oder nicht-natürliche Aminosäuren wie Norleucin (Nle) oder Norvalin (Nva) besetzt werden können. Die Positionen 5, 12, 13 und 16 in der Pep278h- Kette (die den Positionen 462, 469, 470 und 473 des menschlichen hsp65-Moleküls entsprechen), können durch entweder K oder R oder durch nicht-natürliche positiv geladene Aminosäuren wie Ornithin (Orn) besetzt werden. Der Austausch von E und D kann ebenfalls zu aktiven Derivaten führen.
Der Ausdruck "Analoga" in der vorliegenden Erfindung betrifft Peptide, die durch Austausch, Deletion oder Zusatz von Aminosäureresten zu der Sequenz des T-Zell-Epitops erhalten wurden, solange wie sie die Fähigkeit aufweisen, die Immunogenität der schwach immunogenen Antigenmoleküle wesentlich zu verstärken.
Es können zum Beispiel stabile Derivate erhalten werden, indem originale Cysteinreste durch Serinreste, wie in dem Fall bei Pep II, ersetzt werden. Analoga im Falle von Pep278h sind Peptide, bei denen wenigstens 70%, vorzugsweise 90-100% der elektrischen Eigenschaften und der Hydrophobizität des Peptidmoleküls bewahrt worden sind. Diese Peptide können gemäß den Anweisungen in dem vorhergehenden Abschnitt erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Peptide weisen alle optisch aktive Aminosäurereste in L- oder in D-Form auf, oder einige der Aminosäurereste liegen in L-Form und andere in D-Form vor.
Unter "wesentliche Verstärkung der Immunogenität eines schwach immunogenen Antigenmoleküls" versteht man, daß sowohl die Induktion einer Erhöhung des Antikörper-Spiegels gegen das Antigen wie auch das Vorhandensein von Antikörpern hauptsächlich des IgG-Isotyps umfaßt wird.
Der Peptidträger kann mit dem Antigenmolekül direkt oder über einen Spacer verbunden werden.
Eine direkte Verknüpfung zwischen Peptid und Vi wird im Schema 1 gezeigt, wobei das Konjugat durch das Verfahren 3, das später beschrieben wird, erhalten wird.
Der Spacer kann die Formel-O-R-CO- oder -NH-R-CO- aufweisen, wobei ein Ester bzw. ein Amid mit der Carboxylgruppe von Vi und eine Peptidbindung mit der terminalen Aminogruppe des Peptids gebildet wird; -O-R-NH- oder -NH-R-NH-, wobei ein Ester bzw. ein Amid mit der Carboxylgruppe von Vi und ein Amid mit der terminalen Carboxylgruppe des Peptids gebildet wird; oder -NH-R-CH&sub2;-, wobei R eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffkette ist, die gegebenenfalls substituiert und/oder von einem oder mehreren aromatischen Resten oder durch Heteroatome wie O, S oder N unterbrochen wird. R ist vorzugsweise eine aliphatische Kohlenstoffwasserkette mit 3-16 Kohlenstoffatomen, wie der Rest von - Aminocapronsäure.
Das Konjugat der Formel:
in dem Ac Acetyl ist, AC der Rest der e-Aminocapronsäure ist, Pep der Rest des Peptidträgers Pep278h oder Pep II ist und der Saccharidrest eine sich wiederholende Einheit des Vi-Kapselpolysaccharids von Salmonella typhi ist, kann nach drei verschiedenen Verfahren 1, 2 und 4, die in Schema 1 abgebildet sind, hergestellt werden und wird im Detail später beschrieben.
Die Konjugate, bei denen der Spacer -NH-R-CH&sub2;- ist, werden durch Reduktion der -NH-R-CO-Gruppen erhalten.
Die Erfindung betrifft ferner Impfstoffe, die ein Konjugat der Erfindung umfassen. Diese Impfstoffe werden vorzugsweise subkutan in geeigneten Trägern für menschliche und tierärztliche Zwecke verabreicht. Die Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele beschrieben, die die Erfindung nicht einschränken:

BEISPIELE

Bei den Beispielen werden die folgenden Materialien und Verfahren verwendet.

MATERIALIEN UND VERFAHREN

a. Materialien:

Alle Lösemittel und Chemikalien waren vom analytischen Grad und wurden von Aldrich, USA, erhalten, sofern nicht anders angegeben.

b. Peptidsynthese:

Die Peptide wurden durch Festphasensynthese unter Verwendung der t-Boc-Schutzgruppe für α-N-terminale Aminogruppen erhalten. Ein Merrifield-Harz mit 0,5-0,7 meq/g aktiven Chlor pro g wurde von Chemalog. N. J., USA, käuflich erworben. Boc-geschützte Aminosäuren mit geeignetem Seitenkettenschutz wurden von Baechem, Ca., USA, käuflich erworben. Die Kupplung der ersten Aminosäuren an das Harz wurden über Cäsiumsalze der Aminosäurederivate durchgeführt. Die Peptidkettenverlängerung wurde manuell gemäß den allgemeinen Prinzipien der Festphasen-Methodologie (Merrifield, 1963) durchgeführt. Die Abspaltung der Peptide von dem Harz und die Entfernung der Schutzgruppen an der Seitenkette wurde durch das HF-verfahren durchgeführt. Die Sequenzen der synthesisierten Peptide und Analoga sind in Tabelle 1 angegeben.
Das Peptid-Analogon 278 m stimmt mit den Positionen 458-474 des Maushsp65 überein und das Analogon 278mt stimmt mit den Positionen 431-447 des mycobakteriellen hsp65 überein.
Es wurden auch die folgenden Kontrollpeptide synthetisiert: Peptid 277(S), ein Analogon des Peptids p277, das mit den Positionen 437-460 des menschlichen hsp65 (WO90/10449) übereinstimmt, bei dem die Cys (C)-Reste an den Positionen 342 und 347 durch Ser(S)-Reste ersetzt wurden; das Peptid 348h stimmt mit den Positionen 449-460 des menschlichen hsp65 überein; das Peptid CRP 77-83 stimmt mit den Positionen 77-83 des menschlichen C-reaktiven Proteins überein und das Peptid SerRes stammt vom Seeigel.
Peptide II, 277(S), SerRes, 278mt und CRP 77-83 wurden wie oben synthesisiert. Die Peptide 278h, 278m und 348h wurde mit einem automatischen Synthesizer hergestellt (Applied Biosystem model 430A) unter Verwendung der Bedienungsanleitung der Firma für die t-Butyloxycarbonyl(t-Boc)- Strategie.

c. Umkehrphasen-HPLC:

Die endgültige Reinigung der Peptidprodukte wurde unter Verwendung der semi-präparativen HPLC-Kolonne RP18 (Merck, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt, wobei das 5P8750 Flüssigchromatographiesystem verwendet wurde, das mit einem SP8733 variablen Wellenlängendetektor in Wasser-Acetonitril-Gradienten ausgerüstet war, die 0,1% Trifluoressigsäure enthalten (TFA). Die Effluenten wurden als dekadische UV-Extinktion bei 220 nm aufgezeichnet. Acetonitril vom HPLC-Grad wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) gekauft. HPLC-reine Peptide wurden durch Aminosäureanalyse charakterisiert.

d. Vi:

Das Vi, das aus Citrobacter freundii WR7011 gereinigt wurde (freundlicherweise von J. B. Robbins und S. C. Szu, National Institute of Health, Bethesda, Maryland zur Verfügung gestellt), enthielt < 1% (jedes) Protein, Nukleinsäure und Lipopolysaccharid. Das Molekulargewicht des Vi wurde auf 3 · 10³ kDa geschätzt. Tabelle 1
* Peptide Nr. 5, 6, 7 und 8 wurden als Kontrollen verwendet
** Peptid 277(S) ist ein stabiles Analogon des Peptids 277 (WO 90/10449), das mit den Positionen 437-460 des menschlichen hsp65 übereinstimmt, bei dem Cysteinreste (C) bei den Positionen 442 und 447 durch Serin (S)-Reste ersetzt worden sind. Schema 1: Kupplungsverfahren
*** AC -Aminocapronsäure
** sDCC = wasserlösliches DCC
* HOSU = N-Hydroxysuccinimid
* pep/Prot. = Peptid/Protein
** Boc-AC = Boc- -Amino-Capronsäure
*** TFA = Trifluoressigsäure

e. Konjugation von Vi mit den synthetischen Peptiden:

Die verschiedenen Konjugationsverfahren sind im Schema 1 zusammengefaßt

Verfahren 1:

Kuppeln von Vi mit dem Peptid über Spacer (a):

Während der Festphasensynthese wurde das Peptid II an dem N- Terminus unter Verwendung des gewöhnlichen Verfahrens für die Anfügung eines Aminosäurerestes, wobei t-Boc- -Aminocapronsäure (AC) als Spacer in dem Vi-Peptidkonjugat fungiert, verlängert. Es wurden gleiche Mengen an Vi und Peptid II-AC in einem geringen Volumen von doppelt destilliertem Wasser (ddw) aufgelöst und der pH-Wert wurde auf etwa 6 eingestellt. Zwei Äquivalente (eqv.) des wasserlöslichen Carbodiimids (CDI: 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimidhydrochlorid) wurden zweimal in einem Verlauf von mehreren Stunden zugefügt und die Reaktionmischung wurde für die Inkubation über Nacht (ON) stehengelassen. Das Rohkonjugat wurde gegen Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) dialysiert und die Peptiddichte in Vi, d. h. die Peptidlänge, die an Vi gebunden ist, über Aminosäureanalyse (siehe Tabelle 2) bestimmt.
Die Berechnung der Vi-Menge, die kovalent an das Peptid gebunden ist, wurde durch Fourier-transformierte Infrarot-Spektroskopie (FTIR) bestimmt.

Verfahren 2:

Kupplung des N-Hydroxysuccinimid-activierten Vi mit dem Peptid über einen Spacer.

Vor der Konjugierung des Peptids II-AC wurden die Carboxylfunktionen von Vi über eine Reaktion mit N-Hydroxysuccinimid (Sigma) aktiviert. Ein Äquivalent Vi wurde in NMP (N-Methyl-pyrrolidon, Riedel De. Haen, Deutschland) suspendiert, gewirbelt und für 5 min in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Das Pellet wurde in NMP wieder suspendiert, anschließend 5 Äquivalente N-Hydroxysuccinimid bzw. 5 Äquivalente wasserlösliches Carbodiimid (CDI) hinzugefügt und unter leichtem Rühren inkubiert. Nach einigen Stunden wurde die Reaktionsmischung zentrifugiert und die überstehende Lösung, die den N-Hydroxysuccinimidester von Vi enthält, mit 1 Äquivalent Peptid II-Ac vermischt, das in wäßriger Lösung bei einem pH-Wert von 7,5 aufgelöst wurde. Nach einigen Stunden Inkubation wurde das Konjugat gegen ddw dialysiert und die Peptiddichte wurde über Aminosäureanalyse (siehe Tabelle II) bestimmt. Tabelle 2
1 Kupplungsverfahren 1-4, beschrieben in Material & Methods
2 Die Peptiddichte wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt
3 Ova = Ovalbumin Tabelle 3

Verfahren 3:

Konjugation von Vi mit einem Protein/Peptid ohne Spacer.

Ein Äquivalent Vi und ein Äquivalent Protein/Peptid wurden in einem geringen Volumen ddw aufgelöst und für 12 Stunden bei Raumtemperatur (RT) bei einem pH-Wert von 6 in Anwesenheit von 2 Äquivalenten wasserlösliches CDI (für die Konjugierung der Peptide) bzw. 60 Äquivalente wasserlösliches CDI (im Falle des Proteins) inkubiert. Nach der Dialyse der Reaktionsmischung wurde die Protein/Peptid-Dichte in dem Konjugat durch Aminosäureanalyse (siehe Tabelle 2) bestimmt.
Verfahren 4:

Kupplung von Vi mit dem Peptid und anschließende Peptidkettenverlängerung mit Spacer in Lösung (b).

Um die Carboxylfunktion der t-Boc- -Aminocapronsäure (t-Boc-AC) durch N-Hydroxysuccinimid zu aktivieren, wurden 1 mmol t-Boc-AC mit 1,15 mmol N-Hydroxysuccinimid in einem geringen Volumen Dioxan (Merck, Deutschland) vermischt; es wurden 1,15 mmol N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Dioxan aufgelöst, zugegeben und nach 3 Stunden wurde die Reaktonsmischung gefiltert und mit Dioxan gewaschen. 0,1 mmol des gewünschten Peptids wurden in einer kleinen Menge ddw aufgelöst und mit 0,2 mmol KHCO&sub3; (Merck) vermischt. Die Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von t-Boc-AC und die hergestellte Peptidlösung wurden vermischt und reagierten für 1 Stunde unter heftigem Mischen. Die Reaktionsmischung wurde sodann mit ddw (10 ml) verdünnt, gekühlt und mit 1 N KHSO&sub4;-Lösung angesäuert. Das Produkt wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Lösung wurde mit ddw gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und bis zum Trocknen verdampft. Nach 2 Stunden Trocknen des Produkts über P&sub2;O&sub5; wurde es mit 4-5 ml TFA (Merck) aufgelöst und reagierte für 10 min. dann wurde die Flüssigkeit im Vakuum bei 30ºC verdampft. Die Verbindung wurde zweimal mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und das Fluid verdampft, bevor es 2-3 Stunden über P&sub2;O&sub5; getrocknet wurde. Danach wurde das Peptid-AC-Produkt in ddw aufgelöst und der pH-Wert wurde auf 8 eingestellt. Es wurden fünf mg N-Hydroxysuccinimidester von Vi (hergestellt wie in dem Verfahren 2 beschrieben) zugegeben. Nach einigen Stunden Inkubation wurde das entstandene Vi-AC-Peptid-Konjugat gegen ddw dialysiert. Die Peptiddichte in dem Konjugat wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.

f. Konjugation ds Vi-Fragments mit dem synthetischen Peptiden.

Die Vi-Fragmente (freundlicherweise von Dominique Schulz, Pateur- Merieux, Frankreich zur Verfügung gestellt) wurde mittels synthetischen Peptiden, wie in dem Verfahren 3 oben beschrieben, gekuppelt.

g. Konjugation des gesamten D-synthetischen Polypeptids poly (Phe, DGlu) -poly (Pro) -poly (Lys) (nachstehend als FEPK bezeichnet) mit den synthetischen hsp65 Peptiden.

Das synthetische willkürlich verzweigte Polypeptid FEPK (freundlicherweise von der Gruppe von Prof. Edna Mozes und Michael Sela, Weizmann Institute of Science, Israel zur Verfügung gestellt) wurde mit den synthetischen hsp65-Peptiden nach Verfahren 3 gekuppelt.

h. Immunisierung

BALB/c weibliche Mäuse (erhalten von Olac), 2-3 Monate alt, wurden subkutan (sc) bzw. intramuskulär (im) ein, zwei oder drei Mal in 12 Tageintervallen mit Vi alleine, mit dem Vi-Konjugat, oder mit Vi, das mit dem Peptid vermischt ist, immunisiert. Die injizierte Menge des Antigens wie auch das verwendete Adjuvans unterschieden sich von Experiment zu Experiment. Die Mäuse von jeder experimentellen Gruppe wurden 12 Tage nach jeder Injektion (72 Tage nach der letzten Injektion für die Langzeituntersuchung der Anti-Vi-Antikörperproduktion) ausgeblutet.

i. Serologie

Es wurden Vi-Antikörper-Spiegel, die bei Mäusen mit nativen oder konjugierten Vi erzeugt wurden, durch einen Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) bestimmt. Da die negativ geladenen Polysaccharide nicht gut an das Polystyrol, das normalerweise beim Festphasen-ELISA verwendet wird, binden, wurde positiv geladenes methyliertes Bovinserumalbumin (BSA) verwendet, um das Vi an der festen Oberfläche mit sehr geringer, nicht spezifischer Bindung zu beschichten. Im Detail wurden 0,5 mg Vi in 1 ml PBS aufgelöst und für 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Zehn mg methyliertes BSA (Sigma) wurden in 1 ml H&sub2;O suspendiert und die erhaltene Lösung wurde auf einem 0,8 um Filter gefiltert. Um die Beschichtungslösung herzustellen, wurden 1 ml aufgelöstes Polysaccharid für 20 min bei Raumtemperatur mit 50 ul methylierter BSA-Lösung gerührt und danach 1 : 20 in PBS verdünnt. Es wurden Nunclon delta Si Mikrotiterplatten für 3 Stunden bei 37ºC mit 100 ul Beschichtungslösung pro Loch (2,5 ug Vi/Loch) beschichtet. Die Platten wurden 5 mal mit PBS gewaschen, das 0,33% Brij35 (Sigma) enthält und mit einer Lösung aus PBS und 1% getrockneter Magermilch für 2 Stunden bei 37ºC blockiert. Nach dem Waschen wurden 100 ul Aliquots aus verdünnten unbekannten Seren und aus verdünntem Standardserum (Verdünnungspuffer, der 1% Magermilch und 0,33% Brij35 in PBS enthält) zugefügt und die Platten wurden für 1 Stunde bei 37ºC inkubiert. Referenz- und Testseren wurden zweimal auf die Platten aufgetragen. Die nichtgebundenen Antikörper wurden durch Waschen entfernt und eine geeignete Verdünnung des Ziege-Anti-Maus-IgG-Fab&sub2;-Alkaliphosphatasekonjugats (Sigma) im Fall der Testserien und Ziege-Anti-Pferd-IgG-Fab&sub2;- Enzymkonjugat (Sigma) im Falle des Standardserums wurde zu den Platten gegeben (100 M1 pro Loch). Nach einer Inkubation von 2 Stunden bei 37ºC wurden die Platten gewaschen und es wurde die Farbe durch Zugabe von 100 ul Substratlösung, die 0,6 mg/ml p- Nitrophenylphosphat (Sigma) in Diethanolamin-H&sub2;O bei einem pH- Wert von 9,8 enthält, entwickelt. Die Enzymreaktion wurde 20 min später durch Zugabe von 10 ul 5 N NaOH pro Loch gestoppt. Die optischen Dichten wurden bei 405 nm bestimmt. Das Anti-Vi- Standardserum Burro 260, das 550 mg Vi-Antikörper/ml enthält, wurde durch multiple intravenöse Inkektionen des formalinfixierten S. typhi Ty2 (freundlicherweise von J. B. Robbins and S. C. Szu, NIH, Maryland zur Verfügung gestellt) hergestellt. Die erhaltenen Ergebnisse sind als optische Dichte ausgedrückt, die bei 405 nm gelesen wurden, oder als ug Vi-Antikörper/ml.

BEISPIELE

Beispiel 1. Herstellung der Vi-Peptid/Protein-Konjugate.

Die Konjugate von Vi mit dem Peptid II wurden nach dem Kupplungsverfahren 1 (Vi-Pep II) oder 2(Vi-Pep II*) hergestellt. Die Konjugate von Vi mit den Peptiden 278, 278m, 278mt, 348h und Ovalbumin (Ova) wurden nach dem Kupplungsverfahren 3 und die Konjugate von Vi mit CRP 77-83 und 277(S) nach dem Kupplungsverfahren 4 hergestellt.
Die Zusammensetzung einiger der Vi-Konjugate wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die Ergebnisse, die in Tabelle 2 dargestellt sind, zeigen, daß das molare Verhältnis von Peptid/Protein pro Vi-Monomer variabel war. Die Peptiddosierungen von 0,1-2,0 ug, injiziert pro Maus als Zucker-Peptidkonjugat waren die wirksamsten. Tabelle 4

BEISPIEL 2. Immunologische Merkmale von Vi und der Vi-Konjugate.

2.1. Antigenität von nativen Vi. Um die Antikörper-Reaktion, die durch Vi erzeugt wird, zu testen, wurden 2-3 Monate alte weibliche BALB/c (vier bis fünf Mäuse pro Gruppe) subkutan (sc) mit unterschiedlichen Dosierungen des Vi-Antigens allein in nicht kompletten Freund'schen Adjuvans (IFA) in Abstand von 2 Wochen injiziert. Die Mäuse wurden 12 und 24 Tage nach der ersten und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung ausgeblutet. Die Seren aller Mäuse, die zu einer Gruppe gehören, wurden gesammelt. Die Anti-Vi-Antikörper wurden über ELISA, wie in Material & Methods beschrieben, gemessen und die spezifischen Antikörper-Level wurden als dekadische Extinktion&sub4;&sub0;&sub5; (A&sub4;&sub0;&sub5;) ausgedrückt.
Wie in Fig. 1-1a gezeigt, ruft eine Injektion mit Vi eine Vi-Antikörperreaktion bei den Mäusen hervor. Die Reinjizierung erzeugte keinen Booster-Effekt, wie es für die T-ind- Antigene erwartet wird. Die subkutane Immunisierung mit 2,5 ug Vi pro Maus in IFA gab die stärkste spezifische Antikörperbildung: eine höhere Dosierung führte nicht zu einer verstärkten Immunreaktion.
Die Vi-Herstellung, die in diesem Experiment verwendet wurde, enthielt restliche Proteinmengen (< 1%). Die relativ hohe Vi-Immunreaktion kann dadurch erklärt werden.

2.2. Antigenität der Vi-Konjugate.

2.2.1 Relation zu der injizierten Antigendosierung. Es wurde der Einfluß verschiedener Dosierungen auf die Immunogenität von nativen und konjugierten Formen von Vi untersucht. Die Anti-Vi-Antikörper-Reaktion in Mäusen wurde durch Injektion von 2,5 ug oder 0,25 ug Vi alleine oder von Vi-Konjugaten Vi-Pep II, Vi-Pep278h, Vi-Pep348h, die 2,5 ug oder 0,25 ug Vi umfassen, erzeugt. Es wurden vier weibliche BALB/c-Mäuse pro Gruppe subkutan mit 2,5 ug Vi alleine oder als ein Konjugat in IFA in einem Abstand von 2 Wochen immunisiert (für injizierte Peptidmengen als Konjugat siehe Tabelle 3). Die Anti-Vi-Antikörper-Reaktion wurde mit ELISA gemessen und die Größe der spezifischen Immunreaktion ist in Fig. 2a-f als A&sub4;&sub0;&sub5; angegeben. Jedes Feld zeigt geometrische Mittelwerte der Seren, die von 4 individuellen Mäusen, die mit dem gleichen Antigen injiziert wurden, erhalten wurden. Die gesammelten Seren der 4 Mäuse, die mit Vi alleine oder bzw. mit PBS in IFA immunisiert wurden, dienten als Kontrollen.
Die Ergebnisse, die in Fig. 2a-f abgebildet sind, zeigen, daß zwölf Tage nach der ersten Injektion von 2,5 ug Vi alleine oder als Konjugat (für die korrespondierenden injizierten Peptidmengen siehe Tabelle 3b) alle Vi-Peptid- Konjugate Anti-Vi-Immunreaktionen zeigten, die niedriger sind, als die, die durch Vi in seiner nativen Form (Fig. 2a) hervorgerufen werden. Die Überwachung der Vi-Antikörper-Level für eine zusätzliche Zeitperiode von 12 Tagen ohne neue Immunisierung zeigten eine deutliche Erhöhung der Vi-spezifischen Antikörper bei Mäusen, die mit Vi-Pep278h injiziert wurden (Fig. 2b). Die Reinjizierung erzeugte eine definierte Booster-Reaktion nach der Immunisierung mit ViPep II bzw. Vi-Pep278h, aber nicht mit Vi alleine (Fig. 2c).
Die Erniedrigung der Dosis des injizierten Vi auf 0,25 g pro Maus (für korrespondierende injizierte Peptidmengen siehe Tabelle 3a) führte nur zu kleinen Vi-Antikörper- Leveln, die durch Vi alleine und durch Vi-Pep II erzeugt wurden (Fig. 2d-f). Dagegen zeigte die Immunreaktion, die durch das Vi-Pep278h-Konjugat erzeugt wurde, nach einer zweiten Immunisierung einen deutlichen Booster-Effekt (Fig. 2f). Interessanterweise betrug die injizierte Peptidmenge in diesem Konjugat nur 0,17 ug pro Tier (siehe Tabelle 3a).
2.2.2. Es wurde die Kinetik der Anti-Vi-Antikörperproduktion, die durch Vi und Vi-Konjugate bei Mäusen induziert wurde, die wie oben beschrieben immunisiert wurden, untersucht. Anti-Vi-Antikörper-Level, die höher waren, als die durch Vi allein erzeugt, werden als positive Werte betrachtet. Anti-Vi-Antikörper-Level, die niedriger sind als die durch Vi alleine erzeugt, werden als negative Werte betrachtet. Es wurden die Seren auf Vi-Antikörper mittels ELISA untersucht. Die Ergebnisse sind wie in den Fig. 3a, 3ab, 3b und 3bb als A&sub4;&sub0;&sub5; angegeben und zeigen die geometrischen Mittelwerte ±SD die von den Seren der 4 Mäuse, die mit dem Antigen injiziert wurden, erhalten wurden.
Die Fig. 3a, 3ab, 3b und 3bb zeigen die Entwicklung der Vi-Antikörperbildung nach zwei nachfolgenden Injektionen mit Vi und Vi-Konjugaten in zwei verschiedenen Antigendosierungen. Fig. 3a: 2,5 ug Vi injiziert pro Maus mit Vi-Pep II, Vi-Pep278h, Vi-Ova, ViPep348 und Vi-CRP77-83; Fig. 3b: 0,25 ug Vi injiziert pro Maus mit Vi-Pep II und Vi- Pep278h. Fig. 3ab und 3bb - zum Vergleich, Vi-Antikörper-Level erzeugt durch 2,5 ug alleine. Wie in Fig. 3a gezeigt ist, zeigten zwölf Tage nach der ersten Immunisierung alle Konjugate deutlich die Erzeugung von geringeren Vi-Antikörper-Leveln als die von Vi alleine hervorgerufen, obwohl die gleiche Menge Vi injiziert wurde. Nach einer "lag"-Phase von etwa 12 Tagen zeigten die Seren der Tiere, die mit den Vi-Konjugaten immunisiert wurden, einen deutlichen Zuwachs in dem spezifischen Vi-Antikörper-Level. Dieser Effekt ist insbesondere für das Konjugat Vi-Pep278h in beiden angewandten Dosierungen (Fig. 3a und 3b) offensichtlich. Die Reinjizierung nach 24 Tagen löste eine Booster-Reaktion aus, die typisch ist für T-abhängige- Antigene (zum Vergleich siehe Fig. 3ab und 3bb). Vi-Pep II, Vi-Pep278h und Vi-Ova erzeugten höhere Vi-Antikörper-Level als die, die durch Injektion von Vi alleine erzeugt wurden. Beachtlicherweise ergab das Konjugat Vi-Pep278h eine stärkere Anti-Vi-Immunreaktion als das Vi-Protein-Konjugat Vi-Ova (Fig. 3a).
Die Immunisierung mit einer zehnmal geringeren Antigendosis unterstrich den beschriebenen Effekt der Vi-Antikörperbildung, die durch Vi-Pep 278h induziert wurde (Fig. 3b).
Vi-Antikörperkonzentrationen, die in Mäusen durch das Vi- Pep278h-Konjugat hervorgerufen wurden, sind in Tabelle 4 angegeben. Die spezifischen Antikörper-Level, die von Vi- Pep278h induziert wurden, zeigten eine 30-fache Zunahme vom Tag 13 zum Tag 24 nach der ersten Immunisierung. Die Reinjizierung führte zur Verdopplung der Vi-Antikörperkonzentration auf etwa 3 ug/ml, was 55-mal soviel ist als durch Vi alleine erzeugt.
2.2.3. Anti-Vi-Antikörperspezifität. Die Immunreaktion auf T-dep-Antigene ist duch die Bildung von germinalen Zentren gekennzeichnet, die mit dem Konzept des immunologischen Gedächtnisses verbunden sind. Es wird angenommen, daß sie eine besondere Mikroumgebung bereitstellen, die den B- Zellen ermöglicht, eine V-Gen-Hypermutation zu erfahren, um Antikörper mit Rezeptoren mit höherer Affinität und einer veränderten Isotypverteilung zu exprimieren.
Um zu testen, ob Vi-spezifische B-Zellen, die durch die Vi- Peptid-Konjugate erzeugt wurden, diesen Reifungsprozeß durchlaufen, wurde die Spezifität der Vi-Antikörper, die durch Vi in nativer und konjugierter Form erzeugt wurden, verglichen. Es wurden vier bis fünf weibliche BALB/c Mäuse mit den Antigenen Vi, Vi-Pep II und vi-Pep278h(sc) in IFA immunisiert, wobei jedes 2,5 ug Vi entweder alleine oder als Konjugat enthält. Die Tiere wurden 12 Tage nach der zweiten Injektion ausgeblutet und die Vi-Antikörper wurden mittels ELISA bestimmt. Die Symbole in Fig. 4a-b definieren ein Loch für eine individuelle repräsentative Maus (Fig. 4a) oder mit 1,25 ug Vi pro Loch (Fig. 4b); Fig. 4a von jeder Gruppe. Die ELISA-Platten wurden mit 2,5 ug Vi beschichtet, wobei gezeigt wird, daß die Vi-spezifischen Antikörpertiter, die von Vi alleine erzeugt wurden, niedriger sind, als die, die durch Vi-Pep278 erzeugt wurden Die Verminderung der Antigenmenge, die auf die ELISA-Platte beschichtet wurde (Fig. 4b) zeigt ein noch klareres Bild. Vi-Antikörper, die durch Vi-Peptidkonjugate erzeugt wurden, erkennen bei signifikanten Leveln den verminderten Vi- Anteil, wobei Seren von Mäusen, die mit dem nativen Vi immunisiert wurden, nur schwach irgendeine Bindung zeigen.
Um weiter die T-dep-Merkmale der Vi-Peptidkonjugate zu bestimmen, wurde die Isotypverteilung der erzeugten Vi- Antikörper bei Mäusen, die wie oben mit Vi alleine oder mit Vi-Pep278h immunisiert worden sind, bestimmt. Die IgM- und IgG-Zusammensetzung der Anti-Vi-Antikörper bei immunisierten Mäusen wurde mittels ELISA überprüft. Spezifische IgM- Antikörper, die Vi erkennen, wurden unter Verwendung eines Ziege-Anti-Maus-Fab&sub2;-IgM-Peroxidäsekonjugats bestimmt (Fig. 5a) und spezifische IgG-Antikörper wurden durch ein Ziege- Anti-Maus-Fab&sub2;-IgG-Alkaliphosphatasekonjugat bestimmt (Fig. 5b). Ergebnisse sind für einzelne repräsentative Mäuse gezeigt.
Die Isotypspezifität der Anti-Vi-Seren, die nach einer wiederholten Immunisierung erhalten wurden, ist in Fig. 5a- b gezeigt. Antikörper des nativen Vi-Moleküls scheinen hauptsächlich auf die IgM-Isotypklasse beschränkt zu sein, wohingegen das Vi-Pep278-Konjugat zusätzlich zu dem Vi- Antigen eine deutliche IgG-Antikörper-Reaktion erzeugte, was anzeigt, daß das Kuppeln eines ausgewählten T-Zell- Epitops (in diesem Fall Peptid 278h) mit einem T-ind- Antigen, wie Vi, zu einem Isotypklassenwechsel einer Vi- spezifischen B-Zellpopulation führt, was typischerweise für T-dep-Antigene beobachtet wird.
Um die langanhaltende Anti-Vi-Antikörperproduktion zu verfolgen, wurden die Tiere für ein drittes Mal immunisiert, und es wurde die spezifische Immunreaktion für eine Zeitperiode von 72 Tagen überwacht. Die Gruppen der 4-5 weiblichen BALB/c Mäuse wurden subkutan mit dem Vi alleine, mit Vi-Pep II und Vi-Pep278h-Antigenen in IFA zu Zeitpunkten injiziert, die in Fig. 6a-b angegeben sind. Die Immunreaktion wurde über eine Zeitperiode von 108 Tagen überwacht (72 Tage nach der letzten Immunisierung), indem der Vi-Antikörper-Level in den verschiedenen Seren mittels ELISA bestimmt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse werden als geometrische Mittel angezeigt und sind bei einer Serumverdünnung von 1 : 100 (Fig. 6a) und 1 : 1000 (Fig. 6b) gezeigt. Nach dieser zusätzlichen Injektion der Vi-Peptidkonjugate Vi-Pep II und Vi-Pep278h konnte kein Booster-Effekt beobachtet werden. Anti-Vi-Level, die durch die Konjugate injiziert wurden, waren höher als die durch Vi alleine erzeugt, und verringerten sich nicht 2 1/2 Monate (Fig. 6) und sogar 6 Monate (Daten nicht gezeigt) nach der letzten Injektion.
2.2.4. Einfluß des Adjuvans und der Immunisierungsart auf die Anti-Vi-Antikörperproduktion, die durch Vi-Pep II induziert wurde. Um den Einfluß des Adjuvans auf die Vi- spezifische Antikörperbildung durch natives und modifiziertes Vi zu testen, wurden die Antigene entweder subkutan in IFA oder PBS injiziert. Das Vi-PepII-Konjugat wurde in IFA und in PBS hergestellt. Eine Gruppe aus 4 Mäusen wurde subkutan injiziert (Fig. 7aa, 7ba und 7ca) und eine zweite Gruppe intramuskulär (Fig. 7ab, 7bb und 7cb) mit jeder Antigenzubereitung (2,5 ug Vi pro Maus injiziert). Die Seren wurden nach 12 (Fig. 7aa und 7ab) und 24 Tagen (Fig. 7ba und 7bb) nach der ersten Immunisierung und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung (Fig. 7ca und 7cb) erhalten. Die Anti-Vi-Antikörper wurden mittels ELISA gemessen, gezeigt als A&sub4;&sub0;&sub5; und in Mittelwerten ±SC angegeben. Die Ergebnisse, die in den Fig. 7aa, 7ba und 7ca gezeigt sind, zeigen, daß das IFA notwendig ist, um die Kinetik einer T-dep- Immunantwort auszudrücken.
Die Änderung der Immunisierungsart durch Verabreichung von Vi intramuskulär (im) zeigt 2 Sachverhalte (wie in den Fig. 7ab, 7bb und 7cb gezeigt). Erstens führt die intramuskuläre Verabreichung des Vi-Konjugats zu einer höheren primären Vi-Immunreaktion, als sie durch subkutane Verabreichung der gleichen Antigenzubereitung hervorgerufen wird. Zweitens führt diese Injektionsroute nicht zu einem Booster-Effekt, wie er für die subkutane Immunisierung beobachtet wird. Der gleiche Trend wurde beobachtet, indem Vi-Pep II in PBS, entweder subkutan oder intramuskulär (Fig. 7aa, 7ab, 7ba, 7bb, 7ca und 7cb) injiziert wurde.
Bei weiteren Experimenten mit Mäusen, die mit dem Konjugat Vi-278h in IFA, PBS oder CFA (komplettes Freund'sches Adjuvanz) immunisiert wurden, wurden vergleichbare Titer der Anti-Vi-Antikörper mit den drei Adjuvantien (Daten nicht gezeigt) erhalten.
2.2.5. Anti-Vi-Antikörperbildung, die durch freie Peptide II, die mit dem Vi vor der Immunisierung gemischt wurden, induziert wurden. Um die Notwendigkeit der kovalenten Bildung von Vi an die Peptid-Epitope vor der Immunisierung bewerten zu können, wurden Vi- und Pep II physikalisch gemischt und subkutan in IFA einer Gruppe aus weiblichen BALB/c-Mäusen injiziert und mit der Immunisierung mit dem Konjugat Vi-Pep II verglichen. Es wurden beide Antigenzubereitungen subkutan in die Gruppen der 4 Mäuse in IFA injiziert (die Mischung aus Pep II und Vi wurde mit 1 Spritze injiziert). Die Tiere wurden 12 und 24 Tage nach der ersten (Fig. 8a und bzw. 8b) und 12 Tage nach der zweiten Immunisierung (Fig. 8c) ausgeblutet. Die Anti-Vi- Antikörper wurden mittels ELISA bestimmt und die Ergebnisse sind als A&sub4;&sub0;&sub5; gezeigt. Jede Kurve zeigt den geometrischen Mittelwert ±SD.
Wie in Fig. 8a-c gezeigt, führt das Mischen von Vi mit dem Peptid II zu exakt der gleichen Immunreaktion, wie für das Vi-PepII-Konjugat beschrieben. Eine erste Immunisierung führte nur zu geringen Vi-Antikörper-Level, wobei die Reinjektion Anlaß zu einem deutlichen Booster-Effekt gab.
2.2.6. Einfluß der "Träger"-Sensibilisierung auf die Anti- Vi-Antikörperbildung. Um die Wirkung der Sensibilisierung mit freien Peptiden auf die Polysaccharid-Reaktion zu testen, die durch Vi-Peptidkonjugate erzeugt wurden, wurde eine Gruppe aus 4 weiblichen BALB/c-Mäusen subkutan mit 1 ug Peptid II in IFA pro Tier sensibilisiert. Zwei Wochen später wurden die Tiere mit dem Vi-PepII-Konjugat injiziert, das 2,5 ug Vi enthält. Es wurden die Seren zu Zeitpunkten, die in Fig. 9 angegeben sind, entnommen und mittels ELISA analysiert. Anti-Polysaccharid-Antikörper- Level, die zu den angegebenen Zeitpunkten gemessen wurden, sind in Fig. 9 gezeigt. Die Sensibilisierung mit einer Dosis aus 1 ug Peptid II pro Maus führte zu einer stärkeren primären Immunreaktion auf Vi im Vergleich zu den Antikörper-Leveln, die in nicht sensibilisierten Tieren erzeugt wurden. Dennoch wurde kein Sensibilisierungseffekt bei der sekundären Immunreaktion beobachtet.
2.2.7. Eine Anti-Vi-Immunreaktion kann durch Vi-Pep278h erzeugt werden, aber nicht durch Vi-Pep277(S) in der gleichen individuellen Maus. Es wurde eine Gruppe aus 4 weiblichen BALB/c-Mäusen' subkutan mit Vi-Pep277(S) in IFA im Abstand von 2 Wochen injiziert (Vi-Gehalt in dem injizierten Konjugat für jede Maus betrug 2,5 ug). Es wurde die Anti-Vi-Immunreaktion 12 Tage nach der ersten (Fig. 10a und 10b) und 12 Tage nach der zweiten Injektion mittels ELISA (Fig. 10b bzw. 10d) bestimmt. Zwei dieser Tiere wurden mit Vi-Pep278h, die anderen 2 mit Vi alleine (2,5 ug Vi alleine oder als Konjugat) reinjiziert. Wieder wurden die Mäuse 12 Tage nach der ersten und zweiten Immunisierung ausgeblutet und es wurden die Vi-Antikörper-Level bestimmt. Zum Vergleich ist die Immunreaktion, die in Tieren erzeugt wird, die mit Vi-Pep278h alleine injiziert wurden, in der gleichen Figur angegeben. Die Ergebnisse sind als A&sub4;&sub0;&sub5; angegeben und werden in 2 verschiedenen Serumverdünnungen 1 : 50 (Fig. 10a und 10b) und 1 : 1000 (Fig. 10c und 10d) präsentiert. Die Daten zeigen geometrische Mittelwerte ±SD, Antigen A = Vi-Pep277(S), Antigen B = Vi-Pep278h (nachdem die Mäuse mit Vi-Pep277(S) injiziert wurden), Antigen C = Vi alleine (nachdem die Mäuse mit Vi-Pep277(S) injiziert wurden), Antigen D = Vi-Pep278h.
Wie in Fig. 10a-d gezeigt, führte die Immunisierung der weiblichen BALB/c-Mäuse mit Vi-Pep277(S) nicht zu einer detektierbaren Vi-Antikörperreaktion (Antigen A). Um zu untersuchen, ob dieses Ausbleiben der Reaktion auf die individuellen Mäuse zurückzuführen ist, oder sich auf Merkmale bezieht, die in dem spezifischen Konjugat liegen, wurden die gleichen Mäuse, die nicht auf Vi-Pep277(S) ansprachen, mit Vi-Pep278h (Antigen B) bzw. mit dem nativen Vi (Antigen C) immunisiert. Die Reinjizierung mit Vi- Pep278h konnte definitiv die Vi-Antikörper-Level erhöhen, wie es für Mäuse, die nur mit Vi-Pep278h (Antigen D) injiziert wurden, gezeigt ist. Die Reinjizierung mit Vi alleine erhöhte auch die Vi-Immunreaktion, jedoch zu einem geringeren Ausmaß als die, die durch das Vi-Konjugat erzeugt wird.
2.2.8 Erkennung der Vi-Peptidkonjugate durch verschiedene Anti-Vi-Seren. Vi- und Vi-Peptidkonjugate Vi-Pep II, Vi-Pep II*, Vi-Pep278h und Vi-CRP77-83 wurden als Immunogene verwendet, die auf ELISA-Platten beschichtet waren und für die Erkennung durch Seren getestet wurden, die von immunisierten Tieren mit dem korrespondierenden Konjugat erhalten wurden, oder mit Seren, die von Tieren erhalten wurden, die mit anderen Vi-Konjugaten immunisiert wurden. Die Menge der gebundenen Antikörper wurde mittels ELISA bestimmt und ist in Fig. 11a-f als A&sub4;&sub0;&sub5; angegeben. Das Standard-Anti-Vi-Serum Burro 260 (Fig. 11a) wurde in einer Serumverdünnung von 1 : 12000 verwendet, die anderen Seren (Fig. 11b-f) wurden 1 : 200 verdünnt.
Um zu analysieren, ob die Kupplung der Peptide die antigene Struktur des Vi-Anteils in dem Konjugat verändert, wurden die verschiedenen Vi-Konjugate wie auch das native Vi für die Erkennung mit dem Referenz-Anti-Vi-Serum Burro 260 (Fig. 11a) gescreent. Die Bindung des Peptids an Vi beein flußte sichtbar die antigene Aktivität des Vi-Moleküls, da alle Konjugate im Vergleich zu dem nativen Vi eine verminderte Erkennung durch das Burro 260 Antiserum zeigten. Für die Peptidmenge, die auf das Vi-Molekül geladen war (siehe Tabelle 2) wurde keine Korrelierung beobachtet. Dennoch können diese Ergebnisse teilweise die Unterschiede, die in der antigenen Aktivität gefunden wurden sind, die durch verschiedene Vi-Peptidkonjugate gezeigt werden, erklären. Vi-Pep II und Vi-Pep278h scheinen höhere Mengen des Vi-Antikörpers, der innerhalb des Burro 260 Antiserums enthalten ist, zu binden als die weniger immunogenen Konjugate Vi-PepII* und Vi-Pep CRP77-83.
Die Charakterisierung der Vi-Antikörper, die durch die verschiedenen Konjugate erzeugt worden sind, ist in Fig. 11b-f gezeigt. Antiseren, die durch Vi-Pep II und Vi- Pep278h erzeugt wurden, zeigten die höchste Kreuzreaktivität mit dem nativen Vi-Molekül, zeigten aber überraschenderweise nur eine geringe Erkennung des Konjugats, gegen das sie gebildet wurden. Antiseren, die nach der Injektion mit Vi-Pep II* und Vi-Pep CRP77-83 erhalten wurden, zeigten keine Bindung zu dem nativen Vi-Molekül oder zu den anwesenden Konjugat-Antigenen. Abgesehen von der Natur des gewählten Peptids zeigen diese Ergebnisse einen Einfluß der Peptidbeladung und des Kupplungsverfahrens auf die immunogenen Eigenschaften der Vi-Peptid-Konjugate an.
2.2.9 Immunreaktionen auf Vi-Peptid-Konjugate bei verschiedenen Mäusestämmen. Um die Immunogenität der Vi- Peptid-Konjugate bei verwandten Mäusestämmen zu untersuchen, die sich nur in ihrem MHC-Genen unterscheiden, wurden BALB/c(H-2a)-, BALB/k(H-2k)- und BALB/b(H-2b)-Mäuse mit Vi alleine oder mit den Konjugaten Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-277(S), Vi-SRes(ViSerBes) immunisiert. Es wurden fünf Mäuse pro Gruppe von jedem der Stämme BALB/c, BALB/k, BALB/b, NOD und NON.NOD (Fig. 12a-e, bzw.) subkutan mit 2 ug der Konjugate, die in der Figur angegeben sind, in IFA emulgiert, injiziert. Nach 4 Wochen erhielten die Mäuse einen Booster der gleichen Antigendosis und wurden 12 Tage später ausgeblutet. Die Seren der individuellen Mäuse wurden auf Vi-Antikörper mittels ELISA untersucht. Es wurden spezifische Antikörper-Level in den Fig. 12a-e als Prozentsatz eines Standard-Anti-Vi-Serums (Burro 260) ausgedrückt.
Die Ergebnisse in Fig. 12 zeigen, daß die Vi-278h- wie auch die Vi-278m Konjugatreaktionen nicht auf eine bestimmte MHC-Beschränkung eingeschränkt sind. Die Peptide zeigten erhöhte Anitkörpertiter gegen den Zuckeranteil des Konjugats sowohl bei BALB/c- als auch bei BALB/k-Mäusen. Dagegen reagierten die BALB/b-Mäuse nicht mit irgendeinem der injizierten Konjugate. Somit reagieren 2 der 3 MHC- Gentypen.
NOD und NON.NOD Mäuse, die die gleichen MHC-Gene (H-2NNOD) aufweisen, zeigen ein unterschiedliches Muster der immunologischen Reaktivität auf Vi-Peptidkorijugate. Nur das mycobakterielle 278mg Homolog war in der Lage, einen Vi- spezifischen Helfereffekt zu erzeugen.
2.2.10. IgG-Isotypverteilung der Anti-Vi-Seren. Es wurden fünf BALB/c Mäuse pro Gruppe subkutan mit 2 ug Vi alleine oder mit Vi-278h Konjugate, in IFA emulgiert, immunisiert. Vier Wochen später wurden die Mäuse mit der gleichen Antigendosis geboostert und wurden 12 Tage später ausgeblutet. Es wurden individuelle Serumproben auf Antipolysaccharid-IgG-Antikörper unter Verwendung biotinylierter Hase- Anti-Maus-Unterklassen-spezifischer Antiseren und Streptavidin-konjugierter Alkaliphosphatase mit ELISA analysiert. Vi-Antikörper-Level sind als dekadische Extinktion bei 405 nm (A&sub4;&sub0;&sub5;) angegeben.
Die Untersuchung der Unterklasseneinteilung der Mäuse- Antikörper, die gegen bakterielle Kohlenhydrate gerichtet sind, führte zu der überraschenden Beobachtung, daß die Kohlenhydrate alleine IgG-Reaktionen, die im weitesten Sinne auf die seltene IgG3-Unterklasse beschränkt sind, stimulieren. Trägerproteine wie BSA oder Tetanustoxoid, das mit bakteriellen Kapsel-Polysacchariden konjugiert war, neigten dazu, Anti-Zucker-Antikörper in erster Linie des IgGl-Isotyps bei Mäusen zu erzeugen.
Um die Wirkung des Peptids 278h, das mit Vi konjugiert ist, zu untersuchen, wurde die IgG-Unterklassenverteilung der Anti-Vi-Seren bestimmt. Wie in Fig. 13a-c angegeben, erzeugte immunisiertes Vi alleine eine Immunreaktion, die hauptsächlich auf die IgG3-Unterklasse beschränkt ist, wohingegen das Peptid-Zucker-Vi278h-Konjugat die Unterklassenverteilung deutlich auf eine Verteilung, die von IgG1 dominiert wurde, verschob.
Durch die Konjugation des hsp65-Peptids mit einem T-ind- Antigen scheint es möglich zu sein, beträchtliche qualitative Änderungen bei der Immunreaktion, die gegen den T-ind- Anteil des Komplexes gerichtet ist, zu erzeugen.

Beispiel 3

3.1 Antigenität der Vi-Fragment-Peptid-Konjugate. Es wurde die Immunogenität der Polysaccharide, die das Vi-Antigen einschließen, zu ihren molekularen Größen in Beziehung gesetzt. Vi-Fragmente (etwa 45KDa), die durch Ultraschallspaltung hergestellt wurden, was die Struktur der monomeren Einheiten nicht verändert und die ein vergleichbares homogenes Polysaccharid erzeugen, sind weniger immunogen als das native Vi (etwa 3 · 10³ kDa) (Szu et al. 1989). Es wurden fünf BALB/c Mäuse pro Gruppe subkutan mit 2 ug Vi- Fragmenten alleine oder als Konjugat mit dem Peptid 278h, in IFA emulgiert, injiziert. Am 12. Tag nach dem Booster wurden die Serumproben gesammelt und mittels ELISA auf Vi- Fragmentantikörper getestet. Es wurden spezifische Antikör per-Level als Prozentsatz eines Standard-Anti-Vi-Serums ausgedrückt.
Wie in Fig. 14 gezeigt, führte die Immunisierung der BALB/c-Mäuse mit 2 ug der Vi-Fragmente allein nicht zu irgendeiner Anti-Vi-Immunreaktion. Im Gegensatz dazu zeigten Vi-Fragmente, die mit dem Peptid 278h konjugiert sind, eine verstärkte Antigenität, wobei signifikante Titer der Anti-Vi-Antikörper erzeugt werden.

Beispiel 4

4.1. Antigenität von Vi, das mit dem Homologen des Peptids 278h konjugiert ist. Um zu bestimmen, ob die Peptide, die von dem hsp65 abgeleitet sind, selbst genauso gut wie fremde Epitope als T-Zellträger oder T-ind-Antigene bei Mäusen fungieren können, haben wir die Peptide 278 m bzw. 278mt in Übereinstimmung mit der Maus- und den mikrobakteriellen Varianten der menschlichen 278 Sequenz (siehe Tabelle 1) synthesisiert und mit Vi konjugiert. Es wurden vier BALB/c- Mäuse subkutan mit 2 ug Vi alleine oder mit dem Vi-278h-, Vi-278m-, Vi-278mt- und dem Vi-SerRes-Konjugat, in IFA emulgiert, injiziert. Zwölf Tage nach dem Booster wurden die Mäuse ausgeblutet und die Seren mittels ELISA auf Vi- Antikörper getestet. Spezifische Antikörper-Level wurden als Prozentsatz eines Standard-Anti-Vi-Serums ausgedrückt.
Fig. 15 zeigt deutlich, daß ein eigenes Epitop, wie es durch das Maus-278m-Homologe repräsentiert ist, die Immunreaktion auf das T-ind-Antigen-Vi, das in BALB/c Mäuse injiziert wurde, verstärken kann. Das mycobakterielle 278 Epitop zeigte keine unterstützende Wirkung bei BALB/c-Mäusen, war aber das einzig untersuchte Peptid, das als T-Zellträger bei NOD- wie auch bei NON.NOD-Mäusen fungiert (Fig. 12).

Beispiel 5

5.1. Fähigkeit des Peptids 278h, als T-Zellträger für D-Isomere von synthetisch wahllos verzweigten Polypeptiden fungieren. Es ist bekannt, daß synthetische Polymere, die aus D- Isomeren von Aminosäuren bestehen, zu der Gruppe der T-ind- Antigene gehören. Um herauszufinden, ob hsp65 abgeleitete Peptide als T-Zellträger auch für diese Gruppe Antigene fungieren können, haben wir die Immunreaktion bei Mäusen auf Konjugate aus hsp65 Peptide 278h oder 348 h und auf das synthetische Polypeptid Poly(Phe,Glu)-poly-(Pro)-poly- (Lys)(FEPK) bei BALB/c Mäusen untersucht. Es wurden drei BALB/c Mäuse subkutan mit dem Polypeptid FEPK alleine oder mit dem Peptid 278h oder 348 h konjugiert, in IFA emulgiert, immunisiert. Zehn Tage nach einem Booster mit der gleichen Antigenzubereitung wurden Serumproben der individuellen Mäuse entnommen und auf FEPK spezifische Antikörper mittels eines modifizierten ELISA-Verfahrens untersucht. Die Platten wurden mit 2,5 ptg FEPK beschichtet und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Das restliche Verfahren wurde wie in Material and Methods beschrieben, durchgeführt. Die Ergebnisse werden als optische Dichte 405 (OD&sub4;&sub0;&sub5;) ausgedrückt.
Der Vergleich der IgG1-Immunreaktion, die durch das Polypeptid alleine hervorgerufen wird, mit der, die von dem Polypeptid hervorgerufen wird, das mit dem Peptid 278h konjugiert ist, zeigt eine bessere Immunogenität des Konjugats. Das Kontrollpeptid 348 h zeigte keine unterstützende Wirkung, was mit den Ergebnissen, die mit der Konjugation von diesem Peptid mit dem Polysaccarid Vi erhalten wurden, konsistent ist (Fig. 16). Das Peptid 278h kann somit nicht nur für T-Zell-unabhängige Zuckerantigene als ein T-Zellträger fungieren, sondern auch für synthetische Polypeptide, die aus Aminosäuren bestehen.
Die obigen Experimente liefern den Beweis, daß die Vi-Peptidkonjugate der Erfindung in der Lage sind, einen T-Lymphozyt- Helfereffekt in Anspruch zu nehmen, der zu einer Immunreaktion führt, die für T-abhängige Antigene charakteristisch ist. Dieser Beweis kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:
(i) Die Immunogenität von Vi wurde erhöht, wenn es als ein Konjugat, gekuppelt mit spezifischen Peptidkandidaten vorlag: diese Wirkung kann nicht von einer kovalenten Bindung abhängig sein, da das einfache Mischen der beiden Bestandteile zu einer ähnlichen Immunreaktion führte.
(ii) Die Immunogenität des Vi-Bestandteils des Konjugats kann zu der Identität der Peptide, die mit dem Polysaccharid gekuppelt sind, in Beziehung gesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Peptide Pep II und Pep278h verstärkten die Immunogenität von Vi, während die Kontrollpeptide 348h, 277(S) und CRP77-83 bei der Erzeugung einer Serum-anti-Vi- Reaktion versagten.
(iii) Die Reinjektion der Vi-Peptidkonjugate erzeugte eine Zunahme des Anti-Vi-Antikörper-Levels (Booster-Effekt).
(iv) Anti-Vi-Antikörper, die durch Vi-Peptidkonjugate erzeugt wurden, scheinen eine höhere Antigenspezifität aufzuweisen als die, die von Vi alleine erzeugt wurden und werden hauptsächlich durch den IgG-Isotyp präsentiert.
(v) "Peptid-Sensibilisierung", erzeugt durch das Peptid II, führte zu einer verstärkten Serum-Anti-Vi-Antikörperreaktion auf die anfängliche Immunisierung mit dem korrespondierenden Vi-Peptidkonjugat.
(vi) Sowohl die Antigenverabreichung über die Subkutan- Route als auch die Verwendung von IFA scheint notwendig zu sein, um eine Anti-Vi-Immunreaktion, die charakteristisch für T-abhängige Antigene ist, zu erzeugen.
Alle obigen Ergebnisse unter Verwendung des menschlichen Pep278h wurden unter Verwendung der Mausvariante Pep278m-Sequenz wiederholt, die sich von dem menschlichen Pep278h durch eine Substitution von A für T bei Position 471 unterscheidet. Ungeachtet der Tatsache, daß Pep278m ein eigenes Epitop für Mäuse ist, fungiert es als ein T-Zellträger beim Erhöhen der Immunogenität von Vi. Somit zeigt die Mäuse-Reaktion auf sowohl Maus- wie auch auf menschliche Sequenzen, die körpereigen oder nahezu körpereigen sind, daß Menschen auf die menschliche Sequenz auf die gleiche Weise reagieren, wie die Mäuse auf die Maussequenz reagieren.
Dies alles zeigt, daß die Vi-Komponente des Polysaccharid-Peptid- Konjugats von einem Thymus-unabhängigen in ein Thymus-abhängiges Immunogen umgewandelt worden ist.
Es ist nicht offensichtlich, daß Peptide, die sich von dem menschlichen hsp65 ableiten, verwendet werden können, um die Immunogenität von schwach immunogenen Antigenmolekülen zu verstärken, erstens weil ein eigenes menschliches Protein hsp65 bei Menschen nicht als immunogen betrachtet wird und zweitens, weil früher gezeigt wurde, daß Peptide der menschlichen Sequenz wie Pep278 keinen Einfluß auf die Erzeugung der Toleranz/Tief- Regulierung der Autoimmun-Reaktionen hatten (WO 90/10449).

LITERATURSTELLEN

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Claims

1. Konjugat, das aus einem schwach immunogenen Antigen, das kovalent an einen synthetischen Peptidträger gebunden ist, der ein T-Zell-Epitop von hsp65 darstellt, besteht, bei dem besagter synthetischer Peptidträger aus der Gruppe von Peptiden ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h),

(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278m),

(c) EGDEATGANIVKVALEA (Pep278mt),

(d) VLGGGSALLRSI (Pep II), und

(e) einem analogen Peptid zum Pep278h

das wenigstens 70% der elektrischen und der Hydrophilie/Hydrophobie-Merkmale von menschlichem hsp65 von Position 458 bis Position 474 aufweist, wobei besagtes Peptid oder analoges Peptid geeignet ist, die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich zu verstärken.

2. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem das synthetische Peptid ein analoges Peptid zum Pep278h

ist, in dem der Rest 459 E oder D ist; der Rest 460 D oder E ist; der Rest 462 K oder R oder Ornithin (Orn) ist; der Rest 463 I oder L, V, M, F Norleucin (Nle) oder Norvalin (Nva) ist; der Rest 465 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 466 E oder D ist; der Rest 467 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 468 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 469 K oder R oder Orn ist; der Rest 470 R, K oder Orn ist; der Rest 472 L oder I, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 473 K oder R oder Orn ist; und der Rest 474 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist.

3. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem das schwach immunogene Antigen ein Peptid, ein Protein oder ein Polysaccharid ist.

4. Konjugat gemäß Anspruch 3, bei dem das schwach immunogene Peptid von einem HIV-Virus oder von einem Malaria-Antigen stammt.

5. Konjugat gemäß Anspruch 3, bei dem das schwach immunogene Polysaccharid ein bakterielles Polysaccharid ist.

6. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem der synthetische Peptidträger, der hierin als Pep278h bezeichnet wird, den Positionen 458-474 des menschlichen hsp65 Moleküls mit der Sequenz entspricht

7. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem der synthetische Peptidträger, der hierin als Pep278 m bezeichnet wird, den Positionen 458-474 des menschlichen hsp65 Moleküls entspricht, in dem der Rest T&sup4;&sup7;¹ durch A&sup4;&sup7;¹ ersetzt ist.

8. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem der synthetische Peptidträger, der hierin als Pep278mt bezeichnet wird, folgende Sequenz aufweist:

EGDEATGANIVKVALEA.

9. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem der synthetische Peptidträger, der hierin als Pep II bezeichnet wird, den Positionen 437-448 des menschlichen hsp65 Moleküls entspricht, in dem zwei Cystein-Einheiten in den Positionen 442 und 447 durch Serin-Einheiten ersetzt wurden, und folgende Sequenz aufweist:

10. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem der synthetische Peptidträger oder das Analoge direkt kovalent an das schwach immunogene Antigenmolekül angehängt ist.

11. Konjugat gemäß Anspruch 10, bei dem das schwach immunogene Antigen-Molekül ein bakterielles Polysaccharid ist.

12. Konjugat gemäß Anspruch 11, bei dem das bakterielle Polysaccharid ein Kapsel-Polysaccharid (CPS) Vi von Salmonella typhi ist.

13. Konjugat gemäß Anspruch 1, bei dem der synthetische Peptidträger oder das Analoge kovalent mittels eines Spacers an das schwach immunogene Antigen-Molekül angehängt ist, der aus -O-R-CO-, -NH-R-CO-, -NH-R-NH-, -O-R-NH- oder -NH-R-CH&sub2;- ausgewählt ist, worin R eine gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoff-Kette ist, die gegebenenfalls durch einen oder mehrere aromatische Reste oder durch aus N, O oder S ausgewählte Heteroatome substituiert und oder unterbrochen ist.

14. Konjugat gemäß Anspruch 13, bei dem R eine aliphatische Kohlenwasserstoff-Kette ist, die 3-16 Kohlenstoffatome enthält.

15. Konjugat gemäß Anspruch 14, bei dem R der Rest der e-Aminocapronsäure ist.

16. Konjugat gemäß Anspruch 15 der Formel

in der Ac Acetyl ist, AC der Rest der e-Aminocapronsäure ist, Pep der Rest des Peptidträgers Pep278h oder Pep II ist und der Saccharid-Rest für eine sich wiederholende Einheit des Vi Kapsel-Polysaccharids von Salmonella typhi steht.

17. Konjugat gemäß Anspruch 1, das geeignet ist, einen Helfereffekt von T-Lymphozyten zu produzieren, der zu einer für T-abhängige Antigene typischen Immunreaktion führt.

18. Konjugat gemäß Anspruch 16, das hauptsächlich Antikörper des IgG Isotyps induziert.

19. Impfstoff, der ein Konjugat gemäß Anspruch 1, 10 oder 13 umfaßt.

20. Impfstoff gemäß Anspruch 19, der ein Adjuvans umfaßt.

21. Verfahren zur Verstärkung der Immunogenität eines schwach immunogenen Antigen-Moleküls, das seine Verknüpfung mit einem synthetischen Peptidträger umfaßt, der ein T-Zell- Epitop des hsp65 darstellt, wobei besagter synthetischer Peptidträger aus der Gruppe von Peptiden ausgewählt ist, die besteht aus:

(a) NEDQKIGIEIIKRTLKI (Pep278h)

(b) NEDQKIGIEIIKRALKI (Pep278 m)

(c) EGDEATGANTVKVALEA (Pep27Bmt)

(d) VLGGGSALLRSI (Pep II) und

(e) einem analogen Peptid zu Pep278h

das wenigstens 70% der elektrischen und der Hydrophilie/Hydrophobie-Merkmale von menschlichem hsp65 von Position 458 bis Position 474 aufweist, wobei besagtes Peptid oder analoges Peptid geeignet ist, die Immunogenität des schwach immunogenen Antigens wesentlich zu verstärken, wenn das Konjugat in vivo verabreicht wird.

22. Verfahren gemäß Anspruch 21, bei dem der synthetische Peptidträger ein analoges Peptid zu Pep278h ist, in dem der Rest 459 E oder D ist; der Rest 460 D oder E ist; der Rest 462 K oder R oder Ornithin (Orn) ist; der Rest 463 I oder L, V, M, F Norleucin (Nle) oder Norvalin (Nva) ist; der Rest 465 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 466 E oder D ist; der Rest 467 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 468 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 469 K oder R oder Orn ist; der Rest 470 R, K oder Orn ist; der Rest 472 L oder I, V, M, F, Nle oder Nva ist; der Rest 473 K oder R oder Orn ist; und der Rest 474 I oder L, V, M, F, Nle oder Nva ist.

23. Verfahren gemäß Anspruch 21, bei dem das schwach immunogene Antigen-Molekül ein Peptid, ein Protein oder ein Polysaccharid ist.

24. Verfahren gemäß Anspruch 21, bei dem das schwach immunogene Antigen-Molekül ein bakterielles Polysaccharid ist.

25. Verwendung des Konjugats der Ansprüche 1, 10 oder 13 bei der Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Säugetier-Wirts.