SK11295A3 - Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic peptide carriers and vaccines comprising them - Google Patents

Description

KOHJUCAiy HALO IMUMOCÚWWf WTJG£MW₍ £X^rKT7OĹE ΡΕ,ΡΠύΟν^ Hostie, a- ι/τΚΓ/Λ/y s tur οκμομ

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka konjugátov so zvýšenou imunogenitou, základom ktorých sú syntetické peptidové nosiče, tvoriace epitop T-buniek, ich prípravy a vakcín vhodných na imunizáciu, obsahujúcich uvedené konjugáty.

w

Doterajší stav techniky

Odpovede protilátok boli roztriedené na dva hlavné podtypy ^na základe ich požiadaviek voči T-bunkám. Primárna humorálna imunitná odpoveď T-bunkách (T-celí dependent, aktiváciou a proL iferáciou B a na antigény, závislé na T-dep), je charakterizovaná T buniek, vedúcich na jednej strane k diferenciácii plazmatických buniek a sekrécii imunoglobulí nov a na druhej st rane k tvorbe germinálnych (zárodkových) centier a imunologickej pamäti. Po opätovnej stimulácii antigénom majú tieto pamäťové bunky vedúcu úlohu v sekundárnej proti látkovej odpovedi. Základnou charakteristikou sekundárnej odpovede na antigény T-dep je rýchlosť

tvorby protilátok, väčší rozsah odpovede v porovnaní s primárnou odpoveďou a prešmyk triedy imunoglobulínov z IgM na

IgG.

Existuje však malé množstvo antigénov, schopných aktivovať B bunky nezávisle na pomoci T buniek. Takéto antigény sú označované ako antigény, nezávislé na T bunkách (T cell-independent, T-ind). Patria medzi ne okrem ďalších bakteriálne kapsidové polysacharidy, ako kapsulárny polysacharid Streptococcus pneumoniae, polymarizovaný salmonelárny flagelín, po l.y-D-aminokyse liny a 1ipopolysacharid E. colí. Antigény T-ind sa vyznačujú vysokou molekulovou hmotnosťou, opakujúcou sa štruktúrou a vo väčšine prípadov sú pomaly odbúrateľné. Po dlhý čas pretrvávajú na povrchu špecializovaných makrofágov a môžu sa, vďaka svojmu mnohopočet nému prichyteniu na zodpovedajúce receptory imunoglobulínov, ktoré sieťovo prepájajú, viazať na antigénne špecifické B bunky s vysokou aviditou. V dostatočne vysokej koncentrácii sú schopné polyklonálnej aktivácie podstatného podielu zásobami (poolu) B buniek, t.j. bez vzťahu k antigénnej špecifickosti povrchového receptora hypervariabiInej oblasti. Antigény T-ind všeobecne vyvolávajú hlavne odpovede sprostredkované imunoglobulinmi IgM, u myší aj niektorými IgG3 a pomerne slabú, pokiaľ vôbec nejakú, pamäťovú odpoveď.

Baktérie s kapsidovým obalom, ako je Haemoph.il us influenzae typu b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, skupina streptokokov B a E. coli typu KÍ vyvolávajú u človeka vážne invazívne ochorenia, zvlášť u detí a u jedincov so zníženou imunitou. Bolo dokázané, že plazmatické protilátky voči polysacharidom pôsobia ako ochrana proti invazívnym ochoreniam, vyvolávaným väčšinou z týchto patogénov a na indukciu takýchto protilátok u ohrozených jedincov boli pripravené vakcíny, tvorené vyčistenými kapsulárnymi polysacharidmi (CPS). Polysacharidy sú však slabými imunogénmi u detí a táto skutočnosť je vážnou prekážkou ich využitia ako vakcín. Predpokladá sa, že príčina ich slabej imunogenity súvisí s ich príslušnosťou k skupine antigénov nezávislých na T-bunkách, antigénom T-ind.

Zistenie Averyho a Goebela (1929), že pripojenie polysacharidov na bielkovinové nosiče zvyšuje imunogenitu, bol nedávno využitý na prípravu vakcín na humánne použitie. Ako u človeka, tak aj u hlodavcov sa tieto konjugáty chovajú ako antigény T-dep, pretože vyvolávajú indukciu imunologickej pamäti. Existujú podobnosti medzi konjugovanými polysacharidovými vakcínami a systémami bielkovinového nosiča a hapténu. Konjugáty CPS sú teda schopné indukovať u deti ochranné hladiny protilátok voči CPS, zatiaľ čo CPS samotné túto schopnosť nemajú. Je možné, že lepšia imunogenita konjugátov v porovnaní s čistými polysacharidmi je spôsobená pomocným účinkom nosičovo špecifických T-buniek, ako bolo dokázané na systéme nosič-haptén u hlodavcov.

Vo väčšine prípadov boLi antigény T-ind pripojené na väčšie imunogénne bielkoviny ako na tetanový toxoid, toxín cholery alebo záškrtový toxoid. Aj napriek tomu imunologickú odpoveď voči molekulám nosiča s vysokou molekulovou hmotnosťou, obsahujúcom epitopy stimulujúcich a supresívnych T-buniek nie je možné dobre predpovedať. Bolo dokázané, že odpoveď protilátok na haptén, pripojený na bielkovinový nosič, je možné inhibovať, pokiaľ bol príjemca vopred imunizovaný nepozmenenou bielkovinou. Tento jav bol nazvaný nosičom indukovanou supresiou epitopu a nedávno bolo dokázané, že k nemu dochádza účinkom mnohých konjugátov hapténu a bielkoviny. Vývoj účinnejších konjugovaných vakcín voči veľkému počtu extrémne infekčných organizmov je stále veľmi dôležitý a preto bolo veľké úsilie venované hľadaniu vhodnejších nosičových molekúl, poskytujúcich potrebné epitopy T buniek. Všeobecne imunogénne T bunkové epitopy, definované špecifickými peptidmi s ostro vymedzenými imunologickými charakteristikami, by mohli predstavovať generáciu takýchto alternatívnych molekúl. Bielkoviny dobre rozoznávané imunitným systémom by mohli byť vhodným zdrojom peptidov, slúžiacich na tento účel.

Štúdie za použitia širokého výberu bielkovín, tých vzájomne blízko príbuzných, ako aj bielkovín fylogenetický príbuzných len vzdialene, dokázali, že väčšina T buniek je sústredená do niekoľkých imunodominantných epitopov, menšou časťou zodpovedajúce iným, subdominantným determinantám. Táto hierarchia využívania determinánt T bunkami môže byť spôsobená kombináciou rôznych faktorov vrátane odlišných afinít k dostupným molekulám HHS (hlavného histokompatib.ilného systému), rozmanitosťou programu T buniek, vnútornej kompe t í cle o väzbové miesta na HHS a jemných odlišností v procesovaní (úprave).

Hromadia sa dôkazy, že bielkoviny, patriace do skupiny bielkovín tepelného šoku (heat shock proteins, hsp), sú hlavnými antigénmi mnohých patogénov (Young so spoluautormi, 1988). Bielkoviny označované hsp boli najskôr opísané a potom nazvané vďaka ich produkcii bunkami, vystavenými náhlym vzostupom teploty. Medzi hsp patria bielkoviny s rôznymi molekulovými hmotnosťami, ako 20 kD, 60 kD, 65 až 68 kD, 70 kD, 90 kD, 110 kD a ďalšie. Teraz je zrejmé, že hsp sú indukované vo všetkých bunkách mnohými rôznymi vonkajšími vplyvmi, vrátane oxidačného poškodenia, výživového vyčerpania a infekcie vnútrobunkovými patogénmi; odpoveď prostredníctvom hsp umožňuje bunke prežiť v inak nepriaznivých podmienkach. Hoci bunkový stres zvyšuje syntézu hsp, expresia mnohých týchto bielkovín je tiež vrodená a majú podstatnú úlohu v normálnom fungovaní bunky. Odpoveď hsp je všade prítomná vo svete prokaryotických a eukaryotických buniek a hsp patrí k najzachovavánejším molekulám. Aj napriek vývojovému rozrôzneniu v priebehu miliárd rokov sa napríklad molekuLy ľudskej a mykobakteriálnej hsp65 zhodujú približne v 50 % am.inokyselinových zvyškoch. Toto chemické zachovávanie, konzervovanie, zahrňuje veľa úsekov aminokyselín s úplnou alebo blízkou totožnosťou. Preto bude každý organizmus nevyhnutne mať imunologickú krížovú reaktivitu s hsp65 ktorejkoľvek cudzej bunky. Molekula hsp65 akéhokoľvek infekčného bunkového agensu bude teda čiastočne vlastná a čiastočne cudzia voči ktorémukoľvek hostiteľovi, majúcemu imunitný systém. Z týchto dôvodov by sa predpokladalo, že hsp65 a iné bielkoviny ”hsp budú slabo imunogénne. Dôkazy celkom naopak nasvedčujú tomu, že hsp môžu patriť k najsilnejším imunogénom.

Hsp65, ako typický predstaviteľ bielkovín, patriacich do skupiny hsp, môže byť považovaný za dominantný antigén, pretože infekcia alebo imunizácia mnohými rôznymi baktériami indukujú protilátky a T bunky, charakteristické pre molekuLu hsp65 (Young so spoluautormi, 1988). U myší, imunizovaných prostredníctvom Mycobacterium tubercuLosis, je 20 % všetkých T buniek, poskytujúcich odpoveď voči baktérii, špecifických voči hsp65. Je zaujímavé, že T bunky, vykazujúce reaktivitu voči hsp65, boli nájdené u normálnych zdravých jedincov, postrádajúcich akúkoľvek klinickú známku ochorenia (Munk so spoluautormi, 1988). Za použitia syntetických peptidov preukázali Lamb so spoluautormi (1987) a Munk so spoluautormi (1988) odpovede T buniek voči podieľajúcim sa epitopom mykobakteriálnej ľudskej bielkoviny hsp; to formálne potvrdilo existenciu T buniek voči vlastným epitopom hsp65 u normálnych jedincov.

V dôsledku tejto imunodominancie nie je prekvapujúce, že sa molekula hsp65 zrejme zúčastňuje autoimunologických dejov. Imunita voči hsp65 môže u myší vyvolávať autoimunitný díabetes a môže byť vo vzťahu k autoimunitnej artritíde u potkanov a u ľudí (Elias so spoluautormi, 1990; Pearson 1964). Imunita voči hsp65 je teda spojená s autoimunitným ochorením, je však spojená aj so stavom zdravia.

Počas infekcie dochádza u patogénu aj u hostiteľa k dramatickému nárastu syntézy ich hsp na ochranu pred stresom, spôsobeným tým druhým. Analogicky ako v prípade odpovede B buniek na autoantigény je možné uvažovať o tom, že by samotné hsp-reaktívne T bunky mohli byť, ako bunky špecificky rozpoznávajúce hsp65, prospešné zapojené v rozptýlení zápalu tým, že odstraňujú stresové bunky. Autoimunitné ochorenie môže možno vzniknúť vtedy, pokiaľ táto odpoveď nie je správne regulovaná. Cohen a Young (1991) predpokladajú u zdravých jedincov prevahu prirodzenej imunity, zaisťovanej imunitným systémom, založenom na princípe vysoko kontrolovaných a riadených imunitných sietí, namierených voči obmedzenému počtu kontrolovaných vlastných antigénov. Molekula hsp je považovaná za jeden z týchto antigénov, voči ktorému takáto vysoko organizovaná imunitná odpoveď prirodzene existuje (Elias so spolupracovníkmi, 1990).

Cox so spoluautormi (1988) dokázal, že dimér peptidu 65 až 85 bielkoviny so 65 kDa z Mycobacterium tuberculosi s neovplyvňuje jeho schopnosť indukovať proliferáciu T buniek, ale zvyšuje tvorbu protilátok a ukázali, že kombinácia peptidov, heterológnych s N-koncom mykobakteriálnej sekvencie 65 až 85, môže byť všeobecne použiteľná na posilnenie peptidových vakcín. Lussow so spoluautormi (1990) a Barrios so spoluautormi (1922) ukázali, že hsp65 a hsp70 Mycobacteria bovis môžu ako nosičove molekuly vyvolávať u myší indukciu protilátok voči hapténom. Okrem toho bolo na hsp65 z M. bovis identifikovaných veľa epitopov T buniek a u širokej škály myšacích kmeňov s rozdielnymi haplotypmi HHS bolo pre ukázané imunogénne pôsobenie celej bielkoviny.

Je možné predpokladať, že niektoré T bunkové epitopy, postrádajúce sekvenciu bielkoviny hsp65 (hostiteľa, prípadne parazita), vykazujú imunodominanciu a sú schopné indukovať imunologickú pamäť, zatiaľ čo iné nevykazujú privilegované imunologické rozpoznávanie alebo zapojenie v indukcii autoimunitmi. Rozlišovanie týchto funkčne odLišných epitopov T buniek môže viesť k identifikácii všeobecne imunogénnych peptidov, ktoré je možné vymedziť ako bezpečné, definované a účinné alternatívy nosičových molekúl antigénov T-ind.

Európsky patent EP 262 710 a US patent č. 5 154 923 opisujú peptidy so sekvenciou aminokyselín, ktorá zodpovedá polohe 171 až 240 a polohe 172 až 192 polypeptidov s veľkosťou 64 kD Mycobacteria bovis BCG, ktoré sa používajú ako imunogény, vyvolávajúce odolnosť voči autoimunitnej artritíde a podobným autoimunitným ochoreniam.

Patentová prihláška PCT č. VO 90/10449 opisuje peptid označený ako p277, so sekvenciou aminokyselín, ktorá zodpovedá polohám 437 až 460 molekuly ľudskej bielkoviny hsp65, používaný ako imunogén, ktorý vyvoláva odolnosť voči na inzulíne závislom diabete mellitus (insulin dependent diabetes mellitus, IDDM; cukrovke). Kontrolný peptid, označený ako p278, zodpovedajúci polohám 458 až 474 ľudskej hsp65, odolnosť voči IDDM neindukoval.

Lussow so spoluautormi (1990) ukázal, že primovanie myší živým Mycobacteriom tuberculosis typu bovis (BCG) a imunizácia prostredníctvom syntetického peptidu opakujúcej sa malárie (NANP^q, konjugovaného s vyčisteným bielkovinovým derivátom (purified protein derivative, PPD), vedie k indukcii vysokých a dlho pretrvávajúcich titrov protilátok IgG voči peptidu. Neskoršie Lussow so spoluautormi (1991) ukázal, že mykobakteriálne bielkoviny tepelného šoku (hsp) s veľkosťou 65 kD (typ GroEL) a 70 kD (typ DnaK) vyvolávajú ako nosičové molekuly u myší, vopred primovaných Mycobacteriom tuberculos is typu bovis (Bacillus Ca Imette-Guerin, BCG) indukciu vysokých a dlho pretrvávajúcich titrov IgG voči syntetickému peptidu opakujúcej sa malárie (ΝΑΝΡ)^θ. Pokiaľ bol malarický peptid, konjugovaný s mykobakteriálnym hsp, podaný v neprítomnosti akejkoľvek adjuvantnej látky, boli indukované protilátky voči peptidu.

Barrios so spoluautormi (1992) dokázal, že myši, imunizované pomocou peptidov alebo oligosacharidov konjugovaných so 70 kD hsp, vytvárajú vysoké titre protilátok IgG aj bez akéhokoľvek predchádzajúceho primovania prostredníctvom BCG. Odpoveď protilátok voči peptidu pretrváva najmenej 1 rok. Tento nosičový efekt 70 kD hsp bez potreby adjuvantnej látky bol závislý na T bunkách, pretože u myší typu nu/nu bez thymu nedošlo k indukcii protilátok IgG ani proti peptidu, ani proti 70 kDa hsp. Predchádzajúca imunizácia myší 65 kD alebo 70 kDa hsp nemala žiadny záporný účinok na indukciu IgG protilátok voči peptidu po imunizácii hsp-peptidovými konjugátmi v neprítomnosti adjuvantnej látky. Okrem toho môže preimunizácia pomocou 65 kD hsp nahradiť BCG na zaistenie účinného primovania na indukciu protilátok ant i(NANP)4Q. Konečne tak 65 kDa hsp, ako aj 70 kDa hsp slúžia ako nosičové molekuly pri indukcii protilátok IgG voči meningokokovým oligosacharidom skupiny C, v neprítomnosti adjuvantných látok, čo naznačuje, že použitie bielkovín hsp ako nosičov v konjugovaných prostriedkoch na indukciu protilátok voči peptidu a voči oligosacharidu môže byť cenné pri vytváraní nových vakcín na prípadné humánne použitie.

Žiadny z vyššie uvedených odkazov neopisuje špecifické epitopy T buniek Ľudskej hsp65, konjugované so slabo imunogénnymi molekulami.

Podstata vynálezu

Predmetom tohto vynálezu je poskytnutie metódy na zvýšenie imunogenity slabo imunogénnych antigénnych molekúl, teda ich premeny na antigény vhodné na imunizáciu.

Na tento účel vynález predkladá konjugáty slabo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča, tvoriaceho T bunkový epitop, odvodený od sekvencie ľudskej hsp65 alebo anaLógu takéhoto nosiča a uvedený peptid alebo jeho analóg majú schopnosť zásadne zvýšiť imunogenitu slabo imunogénneho antigénu.

Cicavčie bielkoviny hsp65, vrátane ľudských a myšacích, sú inými autormi často označované ako hspóO, pretože patria do druhej skupiny hspóO. Tam kde je v tomto opise zmienka o ľudskej alebo myšacej hsp65, je zamýšľané zahrnúť tieto molekuly pod označenie hspóO alebo ktorékoľvek iné označenie, ktoré sa pre ne v danej oblasti techniky používa.

Ktorýkoľvek peptid alebo jeho analóg, odvodený od ľudskej hsp65, vytvárajúci T bunkový epitop a schopný zásadne zvýšiť imunogenitu slabo imunogénneho antigénu, môže byť vo vynáleze použitý.

Peptid podľa vynálezu, ktorému sa dáva prednosť, označený tu Pep278h alebo 278h, zodpovedá polohám 458 až 474 molekuly ľudskej hsp65 a má sekvenciu:

458 474

N E D Q K I G I E I I K R T L K I

Uprednostňovanými analógmi Pep278 sú peptidy, označované tu Pep278m alebo 278m, v ktorých je zvyšok T^?! peptidu Pep278h nahradený zvyškom A⁴?^1- a Pep278mt alebo 278mt, majúci nasledujúcu sekvenciu:

EGDEATGAN I VKVALEA

Iný T bunkový epitop podľa vynálezu, odvodený od molekuly ľudskej hsp65, ktorý je tu označený ako Peptid II alebo Pep II, zodpovedá polohám 437 až 448 moLekuly ľudskej hsp65, u ktorej boli dva cysteínové zvyšky v polohách 442 a 447 nahradené serínom a má sekvenciu:

437 448

VLGGGSALLRSI

Slabo imunogénna antigénna molekula môže byť peptid, polypeptid alebo bieLkovina, napríklad bielkovina odvodená od vírusu HIV alebo od malarického antigénu či bakteriálneho polysacharidu, ako kapsulárneho polysacharidu z Haemophilus influenzae typu B, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococci skupiny B, E. coli typu KÍ, SalmonelLy, ako je Salmonella Typhi a pod.

Nosičový peptid je kovalentne viazaný na slabo imunogénnu molekulu, buď priamo alebo prostredníctvom spojovníka.

Vynález sa ďalej týka vakcín, obsahujúcich konjugát podľa vynálezu alebo zmes slabo imunogénneho antigénu a vhodného peptidového nosiča.

V inom stelesnení sa vynález týka spôsobu imunizácie cicavčieho príjemcu, ku ktorému patrí podanie účinného množstva konjugátu podľa vynálezu uvedenému príjemcovi alebo spoločné podanie účinných množstiev slabo imunogénnej antigénnej molekuly a syntetického peptidového nosiča, vytvárajúceho epitop T buniek, odvodený od sekvencie ľudskej hsp65 alebo iného analógu a uvedený peptid alebo analóg majú schopnosť zásadne zvyšovať imunogenitu slabo imunogénneho antigénu.

Konjugáty podľa vynálezu, ktorým sa dáva prednosť, sú tvorené Pep278h alebo Pep II kovalentne viazaným na bakteriálny polysacharid, napríklad CPS Vi zo Salmonella Typhi, uvádzaný tu ako Vi, lineárny homopolymér poly-α-(1-4)GalNac, premenlivo O-acetylovaný v polohe C-j, ako je znázornené v schéme 1. Vi samotný, tak ako iné CPS, nevyvoláva po opakovanej injikácii cicavcom, tak zvieratám ako aj ľuďom, stupňujúcu sa odpoveď, ale jeho imunogenita sa zvyšuje, pokiaľ je podávaný vo forme konjugátu podľa vynálezu, spojený s vhodným peptidom, odvodeným od ľudskej hsp65 alebo s jeho analógom alebo v zmesi s takýmto peptidom alebo jeho analógom. Opakovaná injikácia konjugátu peptidu a Vi indikuje zvýšenie hladiny protilátok anti-Vi (zosilňovací účinok), predstavovaných zvlášť izotopom IgG.

V prípade Pep278h sú aktívne peptidy podľa vynáLezu charakterizované ako siLne nabité, t.j. s vlastnosťami silne elektrickej látky (7 zo 17 aminokyseli nových zvyškov, tvoriacich Pep278h, je buď negatívne alebo pozitívne nabitých) a ako silne hydrofóbne (6 aminokyselinových zvyškov). Peptid Pep278h je ďalej charakterizovaný tým, že obsahuje polárnu, negatívne nabitú oblasť N-konca, polárnu, pozitívne nabitú oblasť C-konca a silne hydrofóbne jadro. Tieto celkové rysy by mali byť udržované na zachovanie účinnosti. Vyššie všeobecne spomínaná substitúcia niektorých aminokyselín teda následne povedie k aktívnym peptidom. Presnejšie, polohy 6, 8, 10, 11, 15 a 17 peptidového reťazca Pep278h (zodpovedajúce polohám 463, 465, 467, 468, 472 a 474 molekuly ľudskej hsp65) môžu byť obsadené I alebo L alebo inými hydrofóbnymi aminokyselinami, buď prirodzene sa vyskytujúcimi ako V, M alebo F alebo takými, ktoré sa v prírode nevyskytujú, ako je norleucín (Nie) alebo norvalín (Nva). Polohy 5, 12, 13 a 16 reťazca Pep 278h (zodpovedajúce polohám 462, 469, 470 a 473 molekuly ľudskej hsp65) môžu byť obsadené buď K alebo R alebo v prírode sa nevyskytujúcimi kladne nabitými aminokyselinami, ako je ornitín (Orn). K aktívnym derivátom môže viesť aj zámena E a D.

Výraz analógy sa v tomto vynáleze vzťahuje na peptidy, získané nahradením, deléciou alebo adíciou aminokyselinových zvyškov v sekvencii T bunkového epitopu, pokiaľ majú schopnosť podstatne zvýšiť imunogenitu molekúl slabo iinunogénneho antigénu. Stabilné deriváty je možné napríklad získať nahradením pôvodných cysteínových zvyškov serínovými zvyškami., ako v prípade Pep II. Analógy sú v prípade Pep278h také peptidy, u ktorých je zachovaných najmenej 70 %, výhodnejšie 90 až 100 % elektrických vlastností a hydrofóbnosti peptidovej molekuly. Takéto peptidy je možné získať podľa pokynov vo vyššie uvedenom odstavci.

Peptidy podľa vynálezu môžu mať všetky zvyšky opticky aktívnych aminokyselín vo forme L alebo D alebo sú niektoré z aminokyselinových zvyškov vo forme L a iné vo forme D.

Podstatným zvýšením imunogenity molekuly slabo imunogénneho antigénu sa rozumie tak indukcia zvýšenia hladiny protilátok proti uvedenému antigénu, ako aj prezentácia (predloženie) uvedených protilátok vo forme najmä izotypu IgG.

Peptidový nosič môže byť spojený s antigénnou molekulou priamo alebo prostredníctvom spojovníka.

Priama väzba medzí peptidom a Vi je znázornená v schéme 1, kde je konjugát

získaný ďalej opísaným postupom 3.

Spojovník môže mať vzorec -O-R-CO- alebo -NH-R-CO-, kedy tvorí s karboxylovou skupinou Vi ester alebo amid a peptidovú väzbu s koncovou aminoskupinou peptidu; -O-R-NH- alebo -NH-R-NH-, kedy tvorí s karboxylovou skupinou Vi ester alebo amid a amid vytvára aj s koncovou karboxylovou skupinou peptidu; alebo -NH-R-Cl·^-, kedy R je nasýtený alebo nenasýtený uhľovodíkový reťazec, voliteľne substituovaný a/alebo prerušený jedným alebo viacerými aromatickými radikálmi alebo heteroatómami, ako je 0, S alebo N.

R je s výhodou alifatický uhľovodíkový reťazec, obsahujúci 3 až 16 atómov uhlíka, tak ako zvyšok kyseliny e-aminokaprónovej.

Konjugát vzorca

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

kde Ac je acetyl, AC je zvyšok kyseliny e-aminokaprónovej, Pep je zvyšok peptidového nosiča Pep278h alebo Pep II a cukrový zvyšok predstavuje opakujúcu sa jednotku kapsulárneho polysacharidu Vi. zo salmonely týfusu, je možné pripraviť troma rozdielnymi postupmi 1,2 a 4 znázornenými v schéme a podrobne opísanými v ďalšom texte.

Konjugáty, ktorých spojovník má vzorec -NH-R-CH2-, sa získavajú redukciou skupín -NH-R-CO-.

Vynález sa ďalej týka vakcín, obsahujúcich konjugáty podľa vynálezu. Tieto vakcíny budú s výhodou podávané podkožné (subkutánne) vo vehikulách (riediacich prostriedkoch), vhodných na humánne a veterinárne použitie.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázky la, b znázorňujú odpoveď protilátok anti-Vi v sére, indukovanú u myší samotným Vi, 12 a 24 dní po prvej imunizácii a 12 dní po druhej imunizácii, pri zriedení séra 1:50 (a) a 1:500 (b).

Obrázky 2a, b (A-C) znázorňujú odpoveď protilátok anti-Vi, indukovanú u myší pomocou Vi samotného alebo konjugátov Vi-Pep II, Vi-Pep278h a Vi-Pep348h [(a) 2,5 pg a (b) 0,25 μg Vi, injíkované na myš], 12 (A) a 24 dní (B) po prvej imunizácii a 12 dní po druhej imunizácii (C).

Obrázky 3a, b (A-B) znázorňujú kinetiku tvorby protilátok anti-Vi, indukovanej konjugátmi bielkoviny Vi a peptidu (A) a samotným Vi (B) (2,5 pg (a) a 0,25 pg (b) Vi injikované na myš, 12 a 24 dní po prvej imunizácii a 12 dní po druhej imunizácii).

Obrázky 4a, b znázorňujú špecifickosť protilátok anti-Vi, tvoriacich sa u myší, imunizovaných Vi samotným alebo konjugátmi Vi-Pep II a Vi-Pep278h. Protilátky boli stanovované pomocou doštičiek ELISA, pokrytých 2,5 pg (obr. 4a) alebo 1,25 pg Vi na jamku (obr. 4b).

Obrázky 5a, b znázorňujú charakterizáciu izotypu protilátok anti-Vi, ktorých tvorba bola u myší vyvolaná samotným Vi aLebo konjugátom Vi-Pep278h. Obrázok 5a: odpoveď izotypu anti-Vi IgM na Vi a Vi-Pep278h; obrázok 5b: odpoveď izotypu anti-Vi IgG na Vi a Vi-Pep278h.

Obrázky 6a, b znázorňujú časový priebeh tvorby protilátok anti-Vi u myší, imunizovaných samotným Vi alebo konjugátmi Vi-Pep II a Vi-Pep278, pri zriedení séra 1:100 (obr.

6a) a 1:1000 (obr. 6b).

Obrázky 7a-c(A,B) znázorňujú vplyv spôsobu podania adjuvantnej látky a spôsobu imunizácie na tvorbu protilátok anti-Vi, indukovanú u myši pomocou Vi-Pep II, injikovaného (A) podkožné (subkutánne, sc) alebo (B) do svalu (intramuskulárne, im), 12 (obr. 7a) a 24 dní (obr. 7b) po prvej imunizácii a 12 dní po druhej imunizácii (obr. 7c).

Obrázky 8a-c znázorňujú tvorbu protilátok anti-Vi, indukovanú u myší pomocou konjugátu Vi-Pep II alebo voľným Pep II, zmiešaným s Vi pred imunizáciou 12 (obr. 8a) a 24 dní (obr. 8b) po prvej imunizácii a 12 dni po druhej imunizáci i (obr. 8c).

Obrázok 9 znázorňuje účinok nosiča ako priméru na tvorbu protilátok anti-Vi u myší, imunizovaných konjugovaným Vi-Pep II, primovaných podkožné (sc) 14 dní pred imunizáciou voľným Pep II v IFA (vľavo) alebo u myší, ktorým nebol primér aplikovaný (vpravo).

Obrázky 10a, b (A, B) znázorňujú imunitnú odpoveď anti-Vi, indukovanú u tej istej jednotlivej myši pomocou Vi-Pep277(S) (antigén A), Vi-Pep278h (antigén B, po injikácii Vi-Pep277(S)), samotným Vi (antigén C, po injikácii Vi-Pep277(S)) a Vi-Pep278h (antigén D), pri zriedení séra 1: 50 (a) a 1:1000 (b), 12 dní po prvej (obr. A) a 12 dní po druhej (obr. B) imunizácii.

Obrázky 11a až llf znázorňujú testovanie rozpoznávania samotného Vi (obr. b) a konjugátov Vi-Pep II (obr. c), Vi-Pep278h (obr. d), Vi-Pep II* (obr. e) a VÍ-PCRP77-83 (obr. f), nanesených na doštičky ELISA, porovnávacím anti-Vi sérom Burro 260 (obr. a).

Obrázky 12a až 12e znázorňujú imunitnú odpoveď rozdielnych myšacích kmeňov na Vi a konjugáty s Vi. Obrázok a: odpoveď myší BALB/c na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-SRes, Vi-348 a Vi-277(S); obrázok b: odpoveď myší BALB/k na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-277(S) a Vi-SRes; obr. c: odpoveď myší BALB/b na rovnaké antigény ako na obr. B; obr. d: odpoveď NOD myší na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt a Vi-SRes; obr. e: odpoveď NOD.NOD myší na Vi, Vi-278h a Vi-278mt.

Obrázky 13a až 13c znázorňujú rozdelenie izotypov IgG v sére myší, imunizovaných konjugátom Vi-278h, emulzifikovaným v IFA, Vi v IFA a IFA/PBS (PBS = fosfátom pufrovaný soľný roztok).

Obrázok 14 znázorňuje imunitnú odpoveď myší na fragmenty Vi a konjugát Vi fragmenty-278h.

Obrázok 15 znázorňuje imunogenitu Vi a konjugátov Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt a Vi-SerRes u myší.

Obrázok 16 znázorňuje imunitnú odpoveď IgGl, vyvolanú u myší po imunizácii polyp

FEPK samotným alebo konjugovaným s peptidmi 278h a 348h.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález bude teraz dokreslený pomocou nasledujúcich príkladov, na ktoré sa však neobmedzuje.

V príkladoch budu použité, ďalej uvedené látky a postupy·

Použité látky a postupy

a) Látky: všetky rozpúšťadlá a chemikálie boli analytického stupňa čistoty a pokiaľ nie je uvedené inak, boli získané od firmy Aldrich, USA.

b) Syntéza peptidov: Peptidy boli získané syntézou v tuhej fáze a pre aminoskupinu a-N-konca bola použitá ochranná skupina t-Boc. Merrifieldova živica s obsahom 0,5 až 0,7 mekv/g aktívneho chLóru v 1 grame, bola získaná od firmy Chemalog, N. J., USA. Boc-skupinou chránené aminokyseliny s vhodnými ochranami bočného reťazca boli získané od firmy Baechem, Ca., USA. Naviazanie prvej aminokyseliny na živicu bolo vykonané cestou céziových solí aminokyselinových derivátov. Rozširovanie peptidového reťazca bolo uskutočňované ručne, podľa všeobecných princípov metodológie práce na tuhej fáze (Merrifield, 1963). Uvoľnenie peptidov zo živice a odstráne nie ochrany bočného reťazca bolo vykonané HF postupom. Sekvencie syntetizovaných peptidov a analógov sú uvedené v tabuľke 1.

Peptidový analóg 178m zodpovedá polohám 458 a 474 myšacej hsp a analóg 278mt zodpovedá polohám 431 až 447 mykobakteriálnej hsp65.

Syntetizované boli taktiež nasledujúce kontrolné peptidy: peptid 277(S), analóg peptidu p277, zodpovedajúci polohám 437 až 460 ľudskej hsp65 (V090/10449), u ktorého bol cysteínový zvyšok (C) v polohách 342 a 347 nahradený zvyškami serínu (S); peptid 348h, zodpovedajúci polohám 449 až 460 ľudskej hsp65; peptid CRP 77 až 83, zodpovedajúci polohám 77 až 83 ľudskej c-reaktívnej bielkoviny a peptid SerRes, získavaný z morských ježkov.

Peptidy II, 277(S), SerRes, 278mt a CRP 77 až 83 boli syntetizované ako bolo vyššie uvedené. Peptidy 278h, 278m a 348 boli vytvorené na automatickom syntetizátore (Applied Biosystem model 430A) za použitia firemných protokolov k t-butyloxykarbonyl(t-Boc) postupu.

c) HPLC na reverznej fáze: Konečné vyčistenie peptidových . produktov bolo vykonané za použitia polopreparatívneho stĺpca RP18 pre HPLC (Merck, Darmstadt, Nemecko), za využi• tia kvapalinového chromatografického systému SP875O, vybaveného variabilným detektorom vlnovej dĺžky, v gradientoch voda-acetonitri 1, obsahujúcich 0,1 % kyseliny trifLuóroctovej (TFA). Vytekajúce kvapaliny boli monitorované meraním absorbancie v UV oblasti pri 220 nm. Acetonitril s čistotou pre HPLC bol získaný od firmy Merc (Darmstadt, Nemecko). Peptidy, vykazujúce čistotu pri testovaní HPLC, bolo charakterizované stanovením analýzy aminokyselín.

d) Vi: Vi, vyčistený z Citrobacter freundii VR7011 (venova- ný J.B. Robbinsom s S.C, Szu, National Inštitúte of Health, Bethesda, Maryland) obsahoval < 1 % každej z nasledujúcich látok: bielkoviny, nukleovej kyseliny a 1ipopo1ysacharidu.

Molekulová hmotnosť Vi bola stanovená na 3 x 10³ kDa.

Tabuľka 1: Sekvencia syntetických peptidov

č.	pôvod peptidu	názov p.	sekvenci a
1	ľudská hsp65 (458-474)	278h	NEDQKIGIEIIKRTLKI
2	analóg hsp65	278m	NEDQKIGIEIIKRALKI
3	analóg hsp65	278mt	EGDEATGANIVKVALEA
4	ľudská hsp65 (437-448)	pep 11	VLGGGSALLRSI
5* 6	ľudská hsp65 (449-460)	277(S)** 348h	VLGGGSALLRSIPALDSLTPANED PALDSLTPANED
7	ľudská C-reaktívna bielkovina (77-83)	CRP77-83	VGGSEIL
8	morský ježko	SerRes	LRGGGVCGPAGPAGTVCS

* Peptidy číslo 5, 6, 7 a 8 boli použité ako kontrolné ** Peptid 277(S) je stály analóg peptidu 277 (VO 90/10449), zodpovedajúci polohe 437 až 460 na ľudskej hsp65, v ktorej boli cysteínové zvyšky (C) v polohách 442 a 447 nahradené serínovými (S) zvyškami.

Schéma 1: Postup naviazania

Štruktúra opakujúcej sa podjednotky neho polysacharidu Vi zo Salmonel La

kapsulárTyphi

Postup 2

Postup 1 (1) hosu*/sdcc‘* (2) AC/Pep***

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

AC-Pep

SDCC

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

♦ ♦ ♦ A /-ι A C

NAc **sDCC * HOSU = <=-am inokap tónová kyselina = vodou rozpustný DCC = N-hydĽoxysukcí n i m i d

COOH

NAc

Pep/bielk.* sDCC

Postup 4

Postup 3

(1) Boc-AC** + HOSU + sDCC l·

Boc-AC-OSU (2) Boc-AC-OSU + Pep

Boc-AC-CO-NH-Pep-COOH ★ ★ ★

IH₂-AC-CO-NH-Pep-COOH sDCC

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

CO-NH-Pep-COOH

NAc

NAc

Pep/bielk. = peptid/bielkovina Boc/AC = Boc-e-aminokaprónová kyselina

TFA = kysel ina tri fluóroctová

Konjugácia Vi zhrnuté

e) konjugácie sú syntetických peptidov: Odlišné postupy v schéme 1.

Postup 1

Spoj enie Počas syntézy postupu N-kone i

Vi a peptidu prostredníctvom spojovníka (a): v tuhej fáze bol peptid II za použitia známeho na pridanie aminokyselinového zvyšku, predĺžený na t-Boc-e-aminokaprónovou kyselinou (AC), pôsobiacou ako spojovník v konjugáte Vi-peptid. Rovnaké množstvá Vi či peptidu II-AC boli, rozpustené v minimálnom objeme redestilovanej vody (double distilled water, ddw) a pH bolo upravené na hodnotu približne 6. Dva ekvivalenty vodou rozpustného karbodi i midu (CDI; hydrochlorid 3-dimetylaminopropy1)- 3ety1karbodiimidu) boli pridané dvakrát po sebe v intervale niekoľkých hodín a reakčná zmes bola ponechaná inkubovať cez noc (ON). Surový konjugát bol dialyzovaný voči fosfátom pufrovanému soľnému roztoku (PBS) a hustota peptidu vo Vi,

t.j. množstvo peptidu, viazaného na Vi, bola stanovená analýzou aminokyselín (viď tabuľka 2).

Hodnotenie množstva Vi, kovalentne viazaného k peptidu, bolo vykonávané pomocou Fourierovej transformácie infračervenej (FTIR) spektroskopie.

Postup 2

Spojenie N-hydroxysukcínimidom aktivovaného Vi a peptidu pomocou spojovníka: Pred konjugáciou s Petidoin II-AC boli karboxylové skupiny Vi aktivované reakciou s N-hydroxysukcínimidom (Sigma). Jeden ekvivalent Vi bol suspendovaný v NMP (N-metylpyrolidón, Riedel De Haen, Nemecko), zamiešaný a odstredený po dobu 5 minút v odstredivke Eppendorf). Peleta bola rozsuspendovaná v NMP, potom bolo pridaných 5 ekvivalentov tak N-hydroxysukcínimidu ako aj vodou rozpustného karbodiimidu (CI) a reakčná zmes bola inkubovaná za mierneho miešania. Po niekoľkých hodinách potom bola odstredená a supernatant, obsahujúci N-hydroxysukcínimidový ester Vi, bol zmiešaný s 1 ekvivalentom Peptidu II-AC, rozpusteným vo vodnom roztoku pri pH 7,5. Po niekoľkých hodinách inkubácie bol konjugát dialyzovaný voči ddw a hustota peptidu bo La stanovená analýzou aminokyselín (viď tabuľka II).

Tabuľka 2: Konjugáty, použité ako imunogény

konjugát Vi-peptidu	postup pripoj en ia1	9 peptid/Vi monomér (molárny pomer)
Vi-Pep II	1	1/127
Vi Pep II*	2	1 /400
Vi-Pep 278h	3	1/25
Vi-Pep 348h	3	1/22
Vi-Pep CRP77-83	4	1/14
Vi-Pep 277(S)	4	1/10
Vi-Ova^	3	1/175

Postup pripojenia 1 až 4, opísaný v odstavci Použité látky a postupy ² Hustota peptidu bola stanovená analýzou aminokyselín a Ova = ovalbumín

Tabuľka 3: Množstvo konjugovaného peptidu injikovaného jednej myši

a) pri imunizácii 0,25 pg Vi/myš

konjugát Vi-peptid	inji kované množstvo peptidu/myš
Vi-Pep II	0,010 pg
Vi-Pep 278h	0,170 pg

b) pri imunizácii 0,25 pg Vi/myš

konjugát Vi-peptid	injikované množstvo peptidu/myš
Vi-Pep II	0,100 pg
V i Pep 11 *	0,030 pg
Vi-Pep 278h	1,000 pg
Vi-Pep 348h	0,600 pg
Vi-Pep CRP77-83	0,510 pg
Vi-Pep 277(S)	2,200 pg
Vi + Pep II
(zmiešané)	2,500 pg
V i-Ova	2,200 pg

Postup 3

Spojenie Vi a bielkoviny či peptidu bez pomoci spojovníka: jeden ekvivalent Vi ει 1 ekvivalent bielkoviny či peptidu boli rozpustené v minimálnom objeme ddw a inkubované 12 hodín pri laboratórnej teplote (LT) a pH 6 v prítomnosti 2 ekvivalentov vodou rozpustného CDI (pokiaľ ide o bielkovinu) a 60 ekvivalentov vodou rozpustného CDI (pokiaľ ide o proteín). Po dialýze reakčnej zmesi bola stanovená hustota bielkoviny alebo peptidu v konjugáte analýzou aminokyselín (viď tabuľka 2).

• Postup 4 • Spojenie Vi a peptidu následne po predĺžení peptidového reťazca spojovníkom v roztoku (b): Na aktiváciu karboxylovej skupiny t-Boc-e-aminokaprónovej kyseliny (t-Boc-AC) pomocou

N-hydroxysukcínimidu bol 1 mmol t-Boc-AC zmiešaný s 1,15 mmólmi N-hydroxysukcínimidu v minimálnom objeme dioxánu (Merck, Nemecko); potom bolo pridaných 1,15 mmólov N,N’dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), rozpusteného v dioxáne a po 3 hodinách bola reakčná zmes prefiltrovaná a premytá dioxánom. 0,1 mmólu požadovaného peptidu bolo rozpustených v malom množstve ddw a zmiešaných s 0,2 mmólmi KHCO3 (Merck). Roztok N-hydroxysukcínimidového esteru t-Boc-AC a pripravený • roztok peptidu boli zmiešané a ponechané reagovať 1 hodinu za dôkladného miešania. Potom bola reakčná zmes zriedená ddw • (10 ml), ochladená a okyslená roztokom 1 N KHSO4. Produkt boL extrahovaný etylacetátom. Organický roztok bol premytý ddw, vysušený pod Na2SC>4 a odparený do sucha. Po dvojhodinovom vysúšaní produktu pomocou P2O5, jeho rozpustení v 4 až 5 ml TFA (Merck) a 10 minútach reakcie, bola tekutina vákuovo odparená pri 30 °C. Zlúčenina bola dvakrát premytá CH2C12> tekutina boLa odparená a produkt bol vysúšaný 2 až 3 hodiny pomocou P_?0^. Vzniknutý peptid-AC bol následne rozpustený v ddw a pH bolo upravené na hodnotu 8. Potom bolo pridaných 5 mg N-hydroxysukcínimidového esteru Vi (pripraveného podľa postupu 2). Po niekoľkých hodinách inkubácie bol vzniknutý konjugát Vi-AC-peptid dialyzovaný voči vode. Hustota peptidu v konjugáte bola stanovená pomocou analýzy aminokyselín a výsledky sú uvedené v tabuľke 2.

f) Spojenie Vi fragmentov a syntetických peptidov: Fragmenty Vi (poskytnuté Dominiquom Schulzom, Pasteur-Merieux, Francúzsko) boli spojené so syntetickými peptidmi, vyššie opísaným postupom 3.

g) Konjugácia plne D syntetického polypeptidu poly(Phe,DGlu)-poly(Pro)-poly(Lys) (tu označovaného ako FEPK) a syntetických peptidov hsp65: Syntetický, náhodne rozvetvený polypeptid FEPK (poskytnutý skupinou profesorov Edny Moses a Michaele Sela, Veitzman Inštitúte of Science, Izrael) bol spojený so syntetickými peptidmi hsp65 pomocou postupu 3.

h) Imunizácia: Samice myší BALB/c (od firmy Olac) vo veku 2 až 3 mesiace boli imunizované podkožné (sc) alebo vnútrosvaiovo (im) a to raz, dvakrát alebo trikrát v 12 dňových intervaloch samotným Vi, Vi-konjugátom alebo Vi, zmiešaným s peptidom. Podávané množstvo antigénu a použitej adjuvantnej látky sa v každom pokuse líšilo. Myšiam z každej pokusnej skupiny bola odobraná krv 12 dní po každej .injikácii (72 dní po poslednej aplikácii pri dlhodobom sledovaní tvorby protilátok anti-Vi).

i) Serológia: HLadina protilátok voči Vi, ktorých tvorba bola u myší vyvolaná čistým alebo konjugovaným Vi, bola stanovená enzýmovým imunosorbentným testom (ELISA). Pretože negatívne nabité polysacharidy sa na polystyrén, všeobecne používaný pri teste ELISA v tuhej fáze, príliš dobre nepripájajú, bol na pokrytie tuhého povrchu (s veľmi slabou nešpecifickou väzbou) polysacharidom Vi použitý kladne nabitý hovädzí sérový albumín (BSA). Presnejšie, 0,6 mg Vi bolo rozpustených v 1 ml PBS a miešaných 1 hodinu pri Laboratórnej teplote (LT). 10 mg metylovaného BSA (Sigma) bolo suspendovaných v 1 ml H2O a výsledný roztok bol pref i. 11 rovaný filtrom s priemerom pórov 0,8 pm. Na prípravu poťahovacieho roztoku bol. 1 ml rozpusteného polysacharidu 20 minút miešaný pri LT s 50 pL roztoku metylovaného BSA a následne bol zriedený PBS v pomere 1:20. Nuclon delta Si mikroti tračné doš22 tičky boli 3 hodiny pri 37 “C prekryté 100 μΐ poťahovacieho roztoku na jamku (2,5 pg Vi/jamku). Potom boli päťnásobne premyté PBS s obsahom 0,33% Brij35 (Sigma) a 2 hodiny pri 37 ’C blokované roztokom PBS a 1% sušeným odstredeným mliekom. Po premytí bolo do jamiek pridaných 100 μΐ, v pomernom zastúpení, zriedeného neznámeho séra a zriedeného štandardného séra (riediaci pufer obsahoval 1% odstredené mlieko a 0,33% Brij35 v PBS) a doštičky boli inkubované 1 hodinu í pri 37 °C. Referenčné a testovacie sérum bolo na doštičku nanášané dvojmo. Protilátky bez schopnosti sa naviazať boli odstránené premytím a na doštičky bol pridaný, v prípade testovaného séra, konjugát kozej anti-myšacej IgG Fab2 a alkalickej fosfatázy (Sigma) vo vhodnom zriedení a v prípade štandardného séra kozí anti-konský IgG Fab2 enzýmový konjugát (Sigma) v objeme 100 μΐ na jamku. Po dvojhodinovej inkubácii pri 37 °C boli doštičky premyté a prídavkom 100 μΐ roztoku substrátu, obsahujúceho 0,6 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma) v dietanolamíne-F^O s pH 9,8 bolo vyvolané ich sfarbenie. Enzýmová reakcia bola po 20 minútach ukončená prídavkom 10 μΐ 5 N NaOH na jamku. Optické hustoty boli odčítané pri 405 nm. Anti-Vi štandardné sérum Burro 260, obsa« hujúce 550 mg Vi protilátok na 1 ml, bolo pripravené mnohonásobnými vnútrožilovými injekciami vo formalíne fixovaného • S. Typhi Ty2 (poskytnutého J. B. Robbinsom a S. C. Szu, NIH,

Maryland). Získané výsledky sú vyjadrené ako optická hustota pri 405 nm alebo ako μg protilátok voči Vi/ml.

Pr í k 1ady

Príklad 1. Príprava konjugátov Vi-peptid/bielkovina

Konjugáty Vi s peptidom II boli pripravené spojením podľa postupu 1 (Vi-Pep II) alebo 2 (Vi-Pep II*). Konjugáty Vi s peptidmi 278, 278m, 278mt, 348h a ovalbumínom (Ova) boli pripravené spojením podľa postupu 3 a konjugáty Vi s CRP 77 až 83 a 277(S) podľa postupu 4.

Zloženie niektorých z konjugátov s obsahom Vi bolo určené analýzou aminokyselín. Výsledky uvedené v tabuľke 2 ukazujú, že molárny pomer peptidu alebo bielkoviny na monomér Vi bol premenlivý. Dávky peptidov 0,1 až 2,0 gg na myš, injikované ako konjugát cukru a peptidu, sa ukázali ako naj účinnejšie.

Tabuľka 4: Odpoveď sérových protilátok myšacích samíc kmeňa BALB/c, ktorým bol aplikovaný Vi alebo konjugát Vi a peptidu

vakcína	dávka Vi mg	protilátky voči Vi	(mg/ml)
po 1. imunizácii po 2.	munizáci i
12 dní	24 dní	12 dní
Vi	0,25	0,194	0,005	0,053
Vi-Pep 278h	0,25	0,049 0,000-0,078	1,455 0,296-1,906	2,959 1,533-3,148
BALB/c PBS	-	0,223	0,205	0,233

Myšacím samiciam kmeňa BALB/c vo veku 2 až 3 mesiace boli podkožné injikované s oneskorením 2 týždňov 0,2 ml každej vakcíny v IFA. Pokusnú skupinu tvorilo 5 myší. 12 a 24 hodín po prvej a 12 hodín po druhej imunizácii im bola odobraná krv a v ich sére bola pomocou testu ELISA, opísaného v odstavci Použité látky a postupy, stanovovaná prítomnosť protilátok voči Vi. Výsledky sú vyjadrené ako geometrický priemer, v jednom prípade s udaním zmeny koncentrácie protilátok voči Vi v každej skupine.

Príklad 2. Imunologické charakteristiky Vi a konjugátov s obsahom Vi.

2.1. Antigénnosť čistého prírodného Vi.

Na stanovenie proti látkovej odpovede, indukovanej pomocou Vi, boli myšacie samice kmeňa BALB/c vo veku 2 až 3 mesiace podkožné injektované v dvojtýždňovom intervale rozdielnymi dávkami samotného Vi-antigénu vo Freundovom nekompletnom adjuvanse (IFA). Myšiam bola odobraná krv 12 a 24 dní po prvej a 12 dní po druhej imunizácii. Séra všetkých myší v jednej skupine boli spojené. Protilátky anti-Vi boli merané vo vyššie opísanom teste ELISA a hladiny špecifických protilátok boli vyjadrené ako absorbancia4Q5 (A4Q5)·

Ako je vidieť na obrázkoch 1, jedna injekcia Vi vyvolala u myší odpoveď protilátok voči Vi. Opakovaná injikácia Vi nespôsobila zosilnenie účinku, očakávané u antigénov T-ind. Podkožná imunizácia pomocou 2,5 mg Vi v IFA na jednu myš vyvolala najsilnejšiu tvorbu špecifických protilátok; zvýšenie dávky neprinieslo zvýšenie imunitnej odpovede.

Prípravok Vi, použitý v tomto pokuse, obsahoval zvyškové množstvo bielkoviny (< 1%). Pomerne vysoká imunitná odpoveď voči Vi by mohla byť vysvetlená touto skutočnosťou.

2.2. Antigénnosť konjugátov s obsahom Vi

2.2.1. Vzťah k dávke aplikovaného antigénu. Študovaný bol účinok rôznych dávok na imunogénnosť prírodných a konjugovaných foriem. Odpoveď protilátok Vi bola u myší indukovaná aplikáciou 2,5 pg alebo 0,25 pg samotného Vi alebo jeho konjugátov Vi-Pep II, Vi-Pep 278h a Vi Pep 348h, obsahujúcich taktiež 2,5 pg alebo 0,25 pg Vi. Štyri myšacie samice kmeňa BALB/c, predstavujúce jednu skupinu, boli s dvojtýždňovým intervalom podkožné imunizované 2,5 pg Vi buď samotného alebo vo forme konjugátu v IFA (podávané množstvá peptidu vo forme konjugátu sú uvedené v tabuľke 3). Odpoveď protilátok anti-Vi bola meraná testom ELISA a veľkosť špecifickej imunitnej odpovede je vyjadrená na obrázkoch 2a, b ako Α₄θ5. Obrázky ukazujú geometrické priemery sér, získaných od 4 jednotlivých myší, ktorým bol aplikovaný rovnaký antigén. Spojené sérum 4 myší, imunizovaných Vi samotným alebo PBS v IFA, slúžilo ako kontrola.

Výsledky znázornené na obrázkoch 2 ukazujú, že 12 dní po prvej aplikácii 2,5 pg Vi samotného alebo ako konjugátu (zodpovedajúce aplikované peptidy sú uvedené v tabuľke 3b) všetky konjugáty Vi-peptid vykázali imunitnú odpoveď anti-Vi nižšiu než pokiaľ bola vyvolaná Vi v jeho prírodnej forme (obr. 2a, časť A). Sledovanie hladiny protilátok počas ďalšieho dvanásťdňového obdobia bez obnovenia imunizácie dokázalo viditeľný nárast špecifických protilátok voči Vi u myší injikovaných Vi-Pep278h (obr. 2a, časť B). Opakovaná injikácia vyvolala určité zvýšenie odpovede pri imunizácii Vi-Pe II a Vi-Pep278h, nie však v prípade Vi samotného (obr. 2a, časť C).

Zníženie dávky aplikovaného Vi na 0,25 pg/myš (zodpovedajúce množstvá aplikovaných peptidov sú uvedené v tabuľke 3a) vyvolalo len nižšie hladiny protilátok voči Vi, indukované Vi samotným a Vi-Pep II (obr. 2b, čas A až C). Oproti tomu imunitná odpoveď, vyvolaná konjugátom Vi-Pep278h, vykázala pri druhej imunizácii zrejmý zosilnený účinok (obr. 2b, časť C). Pozornosť by mala byť venovaná tomu, že množstvo peptidu, podávaného v tomto konjugáte, bolo len 0,17 pg na 1 zviera (viď tabuľka 3a).

2.2.2. Študovaná bola aj kinetika tvorby protilátok anti-Vi, indukovaných prostredníctvom Vi a konjugátov s Vi u myší, imunizovaných vyššie opísaným spôsobom. Hladiny protilátok vyššie než hladina, indukovaná Vi samotným, sú brané ako kladné hodnoty, hladina protilátok, nedosahujúca hladiny, indukované Vi samotným, sú brané ako hodnoty záporné.

Sérové protilátky voči

3a,

SD,

Výsledky sú na obr. metrické priemery ± aplikovaný antigén.

Obrázky 3a, b anti-Vi počas dvoch s Vi pri dvoch rozdielnych dávkach antigénu. Obr.

Vi boli stanovované testom ELISA.

Α₄θ5 a ukazujú geo4 myší, b vyjadrené ako získané znázorňuj ú nás 1edných v sére rozvoj aplikáci i tvorby Vi a ktorým bol proti látok konj ugátov 3a(A): 2,5 pg Vi, aplikovaných na 1 myš vo Vi-Pep II. Vi-Pep278h, Vi-Ova, Vi-Pep348 a Vi-CRP 77 až 83 a Vi-Pep278h. Časť

B - na porovnanie, hladiny protilátok anti-Vi, indukované

2,5 gg Vi samotného. Ako je zrejmé z obrázku 3a(A), 12 dní po prvej imunizácii všetky konjugáty indukovali viditeľne nižšie hladiny protilátok voči Vi než aké indukoval Vi samotný, hoci bolo aplikované rovnaké množstvo Vi. Po dvanásťdňovej lag-fáze séra zvierat, imunizovaných konjugátmi Vi, vykázali značné zvýšenie hladiny špecifických protilátok voči Vi. Tento účinok je zvlášť zrejmý u konjugátu Vi-Pep278h u oboch podávaných dávok (obr. 3a, b, časť A). Opakované podanie po 24 dňoch spustilo zvýšenú odpoveď, ktorá je typická pre antigény T-dep (pre porovnanie viď časť B obr. 3a, b). Vi-Pep II, Vi-Pep278h a Vi-Ova indukovali vyššie hladiny protilátok anti-Vi, než aké vyvolalo podanie Vi samotného. Zvlášť konjugát Vi-Pep278h vyvolal silnejšiu imunitnú odpoveď anti-Vi než Vi-bielkovinový konjugát Vi-Ova (obr. 3a, časť A).

Imunizácia desaťnásobne nižšou dávkou antigénu zdôraznila opisovaný efekt tvorby protilátok voči Vi, indukovaný prostredníctvom Vi-Pep278h (obr. 3b, časť A).

Koncentrácie protilátok voči Vi, indukovaných u myší konjugátom Vi-Pep278h, sú uvedené v tabuľke 4. Hladina špecifických protilátok, indukovaných Vi-Pep278h, vykázala tridsaťnásobné zvýšenie od dňa 13 do dňa 24 po prvej imunizácii. Opakovaná aplikácia mala za následok zdvojenie koncentrácie protilátok anti-Vi na hodnotu približne 3 gg/m.l, 55-krát vyššiu než akú vyvoláva Vi samotné.

2.2.3. Špecifickosť protilátok anti-Vi. Imunitná odpoveď na antigény T-dep je charakterizovaná tvorbou germinálnych (zárodkových) centier, ktoré bolí spojené s predstavou imunologickej pamäti. Existuje domnienka, že vytvárajú zvláštne mikroprostredie, umožňujúce B bunkám podstúpiť hypermutáciu V génu na expresiu protilátok s vysoko afinitnýmí receptormi a pozmeneným rozdelením izotypu.

Na zistenie, či Vi-špeci f ické B bunky, indukované konjugátmi Vi-pepti.d, podstupujú tento maturačný proces, bola porovnávaná špecifickosť protilátok anti-Vi, indukovaných Vi v prírodnej a v konjugovanej forme. Štyri až päť myšacích samíc kmeňa BALB/c bolo podkožné imunizovaných antigénmi Vi, Vi-Pep II a Vi-Pep278h v IFA, pričom každý z nich obsahoval

2,5 gg Vi (samotného alebo ako konjugát). Zvieratám bola 12 dní po druhej aplikácii odobraná krv a protilátky anti-Vi boli stanované testom ELISA. Údaje na obrázkoch 4a, b definujú jednotlivé myši, reprezentujúce každú zo skupín. Doštičky ELISA boli pokryté 2,5 gg Vi/jamku (4a) alebo 1,25 gg Vi/jamku (4b); Obrázok 4a ukazuje, že titre špecifických protilátok anti Vi, indukovaných samotným Vi, sú nižšie než po indukcii Vi-Pep278. Zníženie množstva antigénu, pokrývajúceho doštičku ELISA, poskytlo ešte jasnejší obraz. Protilátky voči Vi, indukované konjugátmi Vi-Peptid, rozpoznávajú na signifikantných úrovniach znížené množstvo Vi, zatiaľ čo séra myší, imunizovaných prírodným Vi, sotva vykazujú nejakú väzbu.

K ďalšiemu potvrdeniu toho, že konjugáty Vi-peptid vykazujú charakteristiky typu T-dep, bolo stanovené rozdelenie izotypov protilátok anti-Vi u myší, imunizovaných, ako bolo vyššie uvedené, pomocou Vi samotného alebo Vi-Pep278h. Rozloženie IgM a IgG u protilátok anti-Vi imunizovaných myší bolo stanovené metódou ELISA. Na detekciu špecifických protilátok IgM, rozpoznávajúcich Vi, bol použitý kozí anti-myšací Fab₂IgM peroxidázový konjugát (obrázok 5a) a špecifické protilátky IgG boli stanovené za použitia konjugátu kozieho ant i.-myšacieho Fab₂ IgG a alkalickej fosfatázy (obr. 5b). Výsledky sú udané pre jednotlivé myši.

Izotypová špecifickosť anti-Vi séra, získaného po opakovanej imunizácii, je znázornená na obrázkoch 5. Protilátky voči prírodnej molekule VI sa zdajú byť obmedzené hlavne na triedu IgM, zatiaľ čo konjugát Vi-Pep278 okrem toho vyvolal aj čistú odpoveď protilátok IgG voči antigénu Vi. To ukazuje, že výsledkom spojenia vybraného T-bunkového epitopu (v tomto prípade peptidu 278h) s antigénom typu T-ind, ako je Vi, je prešmyk izotypovej triedy Vi-špecifickej populácie B buniek, zvyčajne pozorovaný u antigénov T-dep.

Na udržanie dlhodobej produkcie protilátok anti-Vi boli zvieratá imunizované tretíkrát a špecifická imunitná odpoveď bola sledovaná v priebehu 72 dní. Skupinám 4 až 5 myšacích samíc kmeňa BALB/c boli podkožné injikované antigény Vi samotný. Vi-Pep II a Vi-Pep278h v IFA v časových intervaloch, uvedených na obrázkoch 6. Imunitná odpoveď bola sledovaná v období 108 dní (72 dní po poslednej imunizácii) stanovením hladiny protilátok voči Vi v rôznych sérach testom ELISA. Získané výsledky sú vyjadrené ako geometrické priemery a sú uvedené pre zriedenie séra 1:100 a 1:1000 (obr. 6a a 6b). Po tejto dodatočnej aplikácii Vi-peptidových konjugátov Vi-Pep II a Vi-Pep278h nie je možné pozorovať žiadny zosilňujúci účinok. Hladiny anti-Vi protilátok, indukované konjugátmi, boli vyššie než hladiny, indukované samotným Vi, k ich poklesu nedošlo po 2,5 mesiacoch (obr. 6a, 6b) a dokonca ani po 6 mesiacoch (údaje neuvádzané) po poslednej inj ikáci i.

2.2.4. Vplyv spôsobu podania adjuvantnej látky a typu imunizácie na tvorbu anti-Vi protilátok, indukovanú Vi-Pep II. Na testovanie účinku adjuvantnej látky na tvorbu Vi-špecifických protilátok, vyvolanú prírodným a modifikovaným Vi, boli antigény podané podkožné buď v IFA alebo v PBS. Konjugát Vi-Pep II bol pripravený v IFA aj v PBS. Jednej skupine 4 myší bol každý z antigénových prípravkov (2,5 pg Vi aplikovaného na myš) injikovaný podkožné (časť A) a druhej skupine vnútrosvalovo (časť B). Séra boli získané 12 (obr. 7a) a 24 dní (obr. 7b) po prvej imunizácii a 12 dní po druhej imunizácii (obr. 7c). Protilátky anti-Vi boli merané v teste ELISA, čo je znázornené ako Α^θ^ ^a pomocou priemerov ±SD. Výsledky uvedené v A častiach obrázkov ukazujú, že IFA je nevyhnutné na vyjadrenie kinetiky imunitnej odpovede typu T-dep.

Zmena spôsobu imunizácie podaním Vi vnútrosvalovo (im) dokladá dve skutočnosti (ako je znázornené na obrázkoch 7 v časti B). Za prvé, vnútrosvaiová aplikácia Vi-konjugátov vedie k vyššej primárnej imunitnej odpovedi voči Vi. než v prípade podkožného podania tých istých anti génnych prostriedkov. Za druhé, tento spôsob aplikácie nevyvoláva zosilňovací účinok, ktorý bol pozorovaný u podkožnej aplikácie. Rovnaká tendencia bola pozorovaná aj po aplikácii Vi-Pep II v PBS, tak podkožnej, ako aj vnútrosvalovej (obr. 7a až 7c).

V ďalších pokusoch na myšiach, imunizovaných konjugátom Vi-278h v IFA, PBS alebo CFA (kompletný Freundov adjuvans) boli s týmito tromi adjuvantnými látkami získané porovnateľné citre protilátok anti-Vi (údaje nie sú uvádzané).

2.2.5. Tvorba protilátok anti-Vi, indukovaná voľným peptidom II, zmiešaným s Vi pred imunizáciou. Na zhodnotenie nevyhnutnosti kovalentného naviazania Vi na peptidové epitopy pred imunizáciou boli Vi a Pep II fyzikálne zmiešané, v IFA podkožné aplikované skupine myšacích samíc BALB/c a porovnané s imunizáciou konjugátom Vi-Pep II. Oba antigénne prostriedky boli skupine 4 myší aplikované podkožné v IFA (zmes Pep II a Vi bola injikovaná v jednej striekačke). Krv bola odobraná 12 a 24 dní po prvej (obr. 8a, 8b) a 12 dní po druhej imunizácii (obr. 8c). Protilátky anti-Vi boli stanovené pomocou testu ELISA a výsledky sú udané ako Α^θ^. Každá . krivka predstavuje geometrické priemery ± SD.

Ako je znázornené na obrázkoch 8, zmiešanie Vi a pepti« du II poskytlo presne rovnakú imunitnú odpoveď, aká bola zaznamenaná aj v prípade konjugátu Vi-Pep II. Prvá imunizácia vyvolala len nižšie hladiny protilátok voči Vi, zatiaľ čo opakovaná aplikácia mala jasný zosilňujúci účinok.

2.2.6. Účinok nosiča ako priméru na tvorbu protilátok anti-Vi. Na zistenie účinku priméru v podobe voľného peptidu na odpoveď voči polysacharidu, indukovanú konjugátmi Vi-peptid, bol skupine 4 myšacích samíc BALB(c ako primér podkožné podaný peptid II v IFA v množstve lgg na zviera. Po dvoch týždňoch bol zvieratám aplikovaný konjugát Vi-Pep II, obsahujúci 2,5 gg Vi. Séra boli získané v časových intervaloch, uvedených na obr. 9 a boli analyzované pomocou testu ELISA. Hladiny ant i - po 1ysacharidových protilátok, merané v naznačených časových bodoch, sú znázornené na obr. 9. Primovanie dávkou 1 pg peptidu II na myš malo za následok silnejšiu primárnu imunitnú odpoveď voči Vi v porovnaní s hladinou protilátok, indukovanou u zvierat bez použitia priméru. Aj napriek tomu, nebol pozorovaný žiadny účinok primovania, ktorý by sa týkal sekundárnej imunitnej odpovede.

2.2.7. Imunitná odpoveď anti-Vi môže byť u rovnakej jednotlivej myši indukovaná pomocou Vi-Pep278h, nie však Vi -Pep277(S). Skupine myšacích samíc BALB/c bol podkožné aplikovaný konjugát Vi-Pep277(S) v IFA v dvojtýždňovom intervale (množstvo Vi v konjugáte, aplikovanom každej myši, bolo

2,5 pg). Imunitná odpoveď anti-Vi bola stanovená 12 dní po prvej a 12 dní po druhej aplikácii pomocou testu ELISA (obr. 10a, b, časť A a B). Dvom z týchto zvierat bol potom aplikovaný Vi-Pep278h, druhým dvom potom samotný Vi (2,5 pg Vi samotného alebo v konjugáte). Myšiam bola opäť odobraná krv 12 dní po prvej a druhej imunizácii a boli stanovené hladiny protilátok voči Vi. Na porovnanie bola do rovnakého obrázku zanesená imunitná odpoveď, indukovaná u zvierat, ktorým bol aplikovaný len Vi-Pep278h. Výsledky vyjadrené ako Α^θ^ ^sú predkladané pri dvoch odlišných zriedeniach séra, 1:50 (obr. 10a) a 1:100 (obr. 10b). Údaje vyjadrujú geometrické priemery ± SD. Antigén A = Vi-Pep277(S), antigén B = Vi-Pep278h (po aplikácii Vi-Pep277(S)), antigén C = Vi samotný (po aplikácii Vi-Pep277(S)), antigén D = Vi-Pep278h.

Ako je znázornené na obrázkoch 10, imunizácia myšacích samíc BALB/c prostredníctvom Vi-Pep277(S) nevyvolala merateľnú protilátkovú odpoveď anti-Vi (antigén A). Na overenie, či neodpovedanie môže byť vlastnosťou jednotlivých myší alebo charakteristikou, vlastnou špecifickému konjugátu, boli rovnaké myši, ktoré nereagovali na podanie Vi-Pep277(S), imunizované prostredníctvom Vi-Pep278h (antigén B) alebo prírodným Vi (antigén C). Nová aplikácia Vi.-Pep278h by mohla definitívne zvýšiť hladiny protilátok anti-Vi, ako bolo ukázané u myší, ktorým bol aplikovaný len Vi-Pep278h (antigén D). Nová aplikácia Vi samotného taktiež zvýšila imunitnú odpoveď voči Vi, hoci v menšom rozsahu než po indukcii Vi -konj ugátom.

2.2.8. Rozpoznávanie konjugátov Vi-peptid rôznymi anti-Vi sérami. Vi a Vi-peptidové konjugáty Vi-Pep II, Vi-Pep II*, Vi-Pep278h a V.Í-CRP77-83 boli použité ako imunogény, pokrývajúce doštičky ELISA a testované na rozpoznanie sérami, získanými od zvierat, imunizovaných zodpovedajúcimi konjugátmi alebo sérami, získanými od zvierat imunizovaných inými Vi-konjugátmi. Množstvo naviazaných protilátok bolo stanovené pomocou testu ELISA a je znázornené na obrázkoch 11 ako A4Q5. Štandardné sérum anti-Vi Burro 260 (obr. 11a) bolo podávané v zriedení séra 1 12 000, ostatné séra (obr. 11b až f) boli zriedené v pomere 1:200.

Na zistenie, či naviazanie peptidov zmenilo antigénnu štruktúru Vi-častice v konjugáte, bolo u rozdielnych Vi-konjugátoch, rovnako ako u prírodných Vi, testované ich rozpoznávanie referenčným anti-Vi sérom Burro (obr. 11a). Väzba peptidu na Vi podľa všetkého ovplyvnila antigénnu aktivitu molekuly Vi, pretože všetky konjugáty vykázali v porovnaní s prírodným Vi zníženú rozpoznateľnosť antisérom Burro 260. Nebola nájdená žiadna závislosť na množstve peptidu, naviazaného na molekulu Vi (viď tabuľka 2). Aj napriek tomu, môžu tieto výsledky čiastočne vysvetliť nájdené rozdiely v antigénnej aktivite, vykazovanej jednotlivými konjugátmi Vi-peptid. Vi-Pep II a V.i-Pep278h viažu vyššie množstvá protilátok voči Vi, obsiahnutých v antisérach Burro 260, než slabšie imunogénne konjugáty Vi-Pep II* a Vi-Pep CRP77-83.

Charakteristika protilátok voči Vi, indukovaných rôznymi konjugátmi, je znázornená na obrázkoch 11b až f. Antiséra, indukované Vi-Pep II a Vi-Pep278h, vykazujú najvyššiu krížovú reaktivitu s molekulou prirodzeného Vi, prekvapivo však preukázala len nízke rozpoznanie konjugátu pri postavení navzájom proti sebe. Antiséra, získané po aplikácii Vi-Pep II* a Vi-Pep CRP77-83, nevykazaLi žiadnu väzbu na prírodnú molekulu Vi alebo na predložené antigény vo forme konjugátov. Nehľadiac na povahu zvoleného peptidu, tieto výsledky ukazujú vplyv väzby peptidu a väzbového postupu na imunologické rysy Vi-peptidového konjugátu.

2.2.9 Imunitná odpoveď na Vi-peptidové konjugáty u rôznych myšacích kmeňov. Na zistenie imunogenity Vipeptidových konjugátov u príbuzných myšacích kmeňov, líšiacich sa len génmi hlavného histokompinantného systému (HHS), boli myši BALB/c (H-2^d), BALB/k (H-2^k) a BALB/b (H-2^b) imunizované samotným Vi alebo konjugátmi Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-277(S), Vi-SRes (Vi-SerRes). 5 myší v skupine každého z kmeňov BALB/c, BALB/k, BALB/b NOD a NON.NOD (obr. 12a až e) obdržalo podkožné (sc) injekciu 2 Vi obsiahnutého v konjugátoch, ktoré sú uvedené na obrázkoch, emulziíikovaných IFA. Po 4 týždňoch bola myšiam aplikovaná povzbudzujúca injekcia dávky antigénu a po 12 dňoch im bola odobraná krv. V sérach jednotlivých myší boli testované protilátky voči Vi pomocou testu ELISA. Hladiny špecifických protilátok sú na obrázkoch 12 znázornené v percentách štandardného anti-Vi séra (Burro 260). Výsledky na obr. 12 ukazujú, že reakcia konjugátu Vi-278h, rovnako ako Vi-278m, nie je ohraničená na určité HHS obmedzenie. Peptidy indukujú zvýšené titre protilátok voči cukrovej častici konjugátu tak u BALB/c, ako aj u BALB/k myší. Oproti tomu, myši BALB/b nereagovali na žiadny z podaných konjugátov. Dva z troch genotypov HHS teda boli

NOD a NON.NOD schopné odpovede, myši, majúce rovnaké

HHS gény (H-2^N0D), vykázali rozdielny model jugátoin Vi-peptid. Len imunologickej reaktivity voči konmykobakteriálny homológ 278mt bol schopný poskytnúť Vi.-špecifický pomocný účinok.

2.2.10. Rozdelenie IgG izotypov anti-Vi. séra. 5 myší BALB/c na skupinu bolo podkožné imunizovaných 2 pg Vi samotného alebo konjugátom Vi-278h, emulzifi kovaného v IFA. Po štyroch týždňoch bola myšiam aplikovaná zosilňujúca injekcia rovnakej dávky antigénu a po 12 dňoch im bola odobraná krv. V jednotlivých vzorkách séra boli analyzované antipolysacha ridové protilátky IgG za použitia biotinylovaného králičieho anti-myšacieho antiséra, špecifického voči podtriedam a za použitia streptavidinom konjugovanej alkalickej fosfatázy v teste ELISA. Hladiny protilátok voči Vi sú vyjadrené ako A⁴⁰⁵.

Skúmanie rozdelenia podtried myšacích protilátok, pôsobiacich voči bakteriálnemu uhľovodíku, prinieslo prekvapujúce zistenie, že samotné uhľovodíky stimulujú odpovede IgG, obmedzené prevažne na nezvyčajnú podtriedu IgG3. Nosičové bielkoviny ako BSA alebo tetanový toxoid, spojené s bakteriálnymi kapsulárnymi polysacharidmi, majú sklon u myší indukovať protilátky voči cukru s prevládajúcim izotypom IgGl.

Na zistenie účinku peptidu 278h, konjugovaného s Vi, bolo určené rozdelenie podtried IgG v anti-Vi sérach. Ako je znázornené na obr. 13a až 13c, Vi podávaný samostatne vyvolal u myší imunitnú odpoveď, obmedzenú najmä na podtriedu IgG3, zatiaľ čo konjugát peptidu a cukru Vi-278h posunul rozdelenie podtried viditeľne k prevahe IgGl.

Spojenie peptidu hsp65 s antigénom typu T-ind sa teda zdá byť schopné indukcie značených kvalitatívnych zmien imu„ nitnej odpovede, zacielenej voči časti T-ind komplexu.

* Príklad 3

3.1. Antigenita konjugátov Vi fragmentu a peptidu

Imunogenita polysacharidov, vrátane antigénu Vi, je vo vzťahu k ich molekulárnym rozmerom. Ví-fragmenty (približne 45 kDa), pripravené štiepením ultrazvukom, ktoré vytvárajú porovnateľne homogénny polysacharid a nezmenia štruktúru jeho monomérnych jednotiek, sú menej imunogénne než prírodný Vi (približne 3 x 10^ kDa) (Szu so spoluautormi, 1988). Piatim myšiam BALB/c v skupine boli podkožné aplikované 2 μΐ Vi fragmentov buď samotných alebo vo forme konjugátov s peptidom 278h, emuIzi fikovaným v IFA. Po 12 dňoch boli zhromaždené vzorky zvýšeného séra a bola v nich testovaná pritom nosť protilátok voči Vi-fragmentu. Hladiny špecifických protilátok sú vyjadrené v percentách štandardného anti-Vi séra.

Ako je zrejmé z obr. 14, imunizácia myši BALB/c prostredníctvom 2 pg samotných Vi-fragmentov nevyvolala žiadnu imunitnú odpoveď anti-Vi. Oproti tomu Vi - fragmenty, konjugované s peptidom 278h, dokázali zvýšenú antigénnosť, vyvolávajúcu významné titre protilátok anti-Vi.

. PríkLad 4 • 4.1. Antigenita V.i, konjugovaného s homológmi peptidu 278h

Na určenie, či peptidy, odvodené od hsp65, predstavujú vlastné a cudzie epitopy, môžu u myší slúžiť ako T-bunkové nosiče antigénov typu T-ind, autori syntetizovali peptidy 278m a 278mt, zodpovedajúce myšaciemu a mykobakteriálnemu variantu Ľudskej sekvencie 278 (viď tabuľka 1) a konjugovali ju s Vi. Štyrom myšiam BALB/c boli podkožné aplikované 2 pg Vi samotného alebo vo Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt a Vi-SerRes konjugáte, emulzi f i kovanom v IFA. 12 dní po zvýšení bola myšiam odobraná krv a v sérach boli testované pomocou testu ELISA protilátky voči. Vi. Hladiny špecifických protilátok sú vyjadrené v percentách štandardného anti-Vi séra.

Obrázok 15 jasne ukazuje, že vlastný epitop, predstavovaný homoLógom myšacej 278m, môže zvyšovať imunitnú odpoveď na T-ind antigén Vi, aplikovaný myšiam BALB/c. Mykobakteriálny epitop 278 nevykázal u myší BALB/c žiadne pomocné pôsobenie, ale bol jediným testovaným peptidom, ktorý fungoval ako T-bunkový nosič u NOD aj u NON-NOD myší (obr. 12).

Príklad 5

5.1 Schopnosť peptidu 278h pôsobiť ako T-bunkový nosič pre D-izoméry syntetických, náhodne vetvených polypept idov.

Je známe, že syntetické polyméry, zložené z D-izomérov aminokyselín, patria do skupiny antigénov typu T-ind. Aby zistili, či peptidy, odvodené od hsp65, môžu fungovať ako T-bunkové nosiče aj u tejto skupiny antigénov, skúmali autori imunitnú odpoveď voči konjugátom hsp65 peptidov 278h alebo 348h a syntetického polypeptidu poly(Phe,Glu)-poly(Pro)poly(Lys) (FEPK) u myší BALB/c. Tri myši BALB/c boli podkožné imunizované polypeptidom FEPK, samotným alebo konjugovaným s peptidom 278h alebo 348h, emulziíikovaným v IFA. 10 dní po zosilňovacej aplikácii toho istého antigénneho prípravku boli odobrané vzorky séra jednotlivých myší a boli v nich testované špecifické protilátky voči FEPK pozmeneným testom ELISA. Doštičky boli pokryté 2,5 gg FEPK a inkubované cez noc pri 4 “C. Ďalší postup bol vykonávaný podľa opisu v časti Použité látky a spôsoby. Výsledky sú vyjadrené ako optická hustota 405 (OD^q^).

Porovnanie imunitnej odpovede IgG, vyvolanej samotným polypeptidom, s odpoveďou indukovanou polypeptidom, konjugovaným s peptidom 278h, dokázalo vyššiu imunogénnosť konjugátu. Kontrolný peptid 348h nemal žiadny pomocný účinok, ktorý by sa zhodoval s výsledkami, získanými po pripojení tohto peptidu na polysacharid Vi (obr. 16). Peptid 278 teda môže slúžiť ako T-bunkový nosič nielen pre cukrové antigény, nezávislé na T bunkách, ale aj pre syntetické polypeptidy, zložené z aminokyselín.

Predchádzajúce pokusy poskytujú dôkaz, že Vi-peptidové konjugáty podľa vynálezu sú schopné vyvolať pomocný účinok T lymfocytov, ktorého výsledkom je imunitná odpoveď, charakteristická pre antigény závislé na T bunkách. Tento dôkaz je možné zhrnúť následovne.:

(i) Imunogenita Vi sa zvýšila, keď bol predkladaný ako konjugát, spojený so špecifickými peptidmi; tento účinok možno nezávisí na kovalentnej väzbe, pretože jednoduché zmiešanie týchto dvoch látok vyvolalo podobnú imunitnú odpoveď.

(i i) Imunogenita Vi zložky konjugátu môže byť vo vzťahu k totožnosti peptidu, viazaného na polysacharid. Peptidy podľa vynálezu Pep II a Pep278h zvyšujú imunogenitu Vi, zatiaľ čo kontrolné peptidy 348h, 277(S) a CRP 77-83 neindukujú anti-Vi odpoveď v sére.

(i ii) Opakovaná aplikácia Vi-peptidových konjugátov indukuje zvýšenie hladiny protilátok anti-Vi (zosilňujúci účinok).

(iv) Protilátky anti-Vi, indukované Vi-peptidovými. konjugátmi, majú pravdepodobne vyššiu antigénnu špecifickosť než protilátky, indukované samotným Vi a sú predstavované hlavne izotypom IgG.

(v) Peptidové primovanie, indukované Peptidom II, vyvoláva zvýšenú odpoveď protilátok anti-Vi v sére na počiatočnú imunizáciu zodpovedajúcim Vi-peptidovým konjugátom.

(vi) Tak podanie antigénu podkožné, ako aj použitie IFA sa zdá byť nevyhnutné na indukciu anti-Vi imunitnej odpovede, charakteristickej pre antigény T-dep.

Všetky predchádzajúce výsledky, získané za použitia ľudského Pep278h, boli zopakované za použitia variantu myšacej Pep278 sekvencie, líšiacej sa od ľudského Pep278h nahradením A pomocou T v polohe 471. Cez skutočnosť, že Pep278m je pre myši vlastným epitopom, pôsobí ako T bunkový nosič, zvyšujúci imunogenitu Vi. Myšacie! odpoveď na myšacie a ľudské sekvencie, ktoré sú vlastné a takmer-vlastné, teda ukazuje, že ľudia budú odpovedať na ľudskú sekvenciu rovnakým spôsobom, akým myši odpovedajú na myšacie sekvencie.

Všetky tieto údaje ukazujú, že zložka Vi konjugátu polysacharidu s peptidom bola premenená z imunogénu nezávislého na thyme na imunogén na thyme závislý (thymic-dependent).

Je nezvyčajné, môžu byť použité na antigénnych molekúl;

že peptidy, odvodené zvýšenie imunogenity jednak preto, že ako od ľudskej hsp65, slabo imunogénnych vlastná bielkovina nie je ľudská hsp65 považovaná za imunogénnu u ľudí a za druhé z tohto dôvodu, že bolo skôr dokázané, že peptidy, pochádzajúce z ľudskej sekvencie, ako je Pep278, neovplyvňujú indukciu tolerancie alebo reguláciu zníženia autoimunitnej odpovede (VO 90/10449).

Odkazy na literatúru

- Avery, 0. T. a Gobel, V. F., J. Exp. Med. 50., 533 až 550, 1929.

- Barrios, C., so spoluautormi, Eur. J. Immunol. 22, 1365 až 1372, 1992.

- Brett, S. J., so spoluautormi. Eur. J. Immunol. 19., 1303 až 1310, 1989.

- Cohen, I. R. a Young, D. B. , Immunol. Today 1.2, 105 až 110, 1991.

- Cox so spoluautormi, Eur. J. Immunol. .18, 2015 až 2019, 1988.

- Elias D., so spoluautormi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1576 až 1580, 1990.

- Elias D., so spoluautormi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA .88 3088 až 3091, 1991.

- Mamb, J. R., so spoluautormi, EBBO Journal 6, 1245 až

1249, 1987.

Lussow, A. R.,	so spoluautormi
až 263, 1990.
Lussow, A. R.,	so	spoluautormi
až 2302, 1991.
Merrifield, R.	B. ,	. J. Am. Chem
1963.

Immunol. Lecters 25, 255

Eur, J. Immunol. 21 . 2297

Soc. 85, 2149 až 2154,

- Munk, M. E., so spoluautormi, Eur. J. Immunol. 18, 1835 až 1838, 1988.

- Munk, M. E., so spoluautormi, Eur. J. Immunol. 143. 2844 až 2849, 1989.

- Pearson, C. M., Arthritis Rheum. 7, 80 až 86, 1964.

- Szu, S. C., so spoluautormi, Infect. Immun. 57., 3823 až 3827, 1989.

- Verbon, A., so spoluautormi, Clin. Exp. Immun. 86, 6 až 11, 1991.

- Young, D., so spoluautormi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 4267 až 4270, 1988.

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča, tvoriaceho T-bunkový epitop, odvodený od sekvencie ľudskej hsp65 alebo jeho analógu, ktorý peptid alebo analóg je schopný podstatného zvýšenia imunogenity málo imunogénneho antigénu.
2. 2. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1, vyznačuj úci sa t ý m, že syntetický peptid alebo analóg je kovalentne viazaný na málo imunogénny antigén.
3. 3. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že málo imunogénnym antigénom je peptíd, bielkovina alebo polysacharid.
4. 4. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 3, vyznačuj úci sa t ý m, že málo imunogénny peptid je odvodený od vírusu HIV alebo od antigénu malárie.
5. 5. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 3, vyznačuj úci sa t ý m, že málo imunogénny polysacharid je bakteriálnym po Lysachari dom.
6. 6. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že syntetický peptidový nosič, označený tu Pep278h, zodpovedá polohám 458 až 474 ľudskej molekuLy hsp65, majúcim sekvenciu:

   458 474

   N E D Q K I G I E I IKRTLKI
7. 7. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že syntetický peptidový nosič, označený tu Pep278m, zodpovedá polohám 458 až 474 ľudskej molekuly hsp65, u ktorej bol zvyšok T^l nahradený zvyškom A^l.
8. 8. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že syntetický peptidový nosič, označený tu Pep278mt, má sekvenciu:

   EGDEATGAN I V K V A L E A
9. 9. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1, vyznačuj úci sa t ý m, že syntetický peptidový nosič, označený tu Pep II, zodpovedá polohám 437 až 448 molekuly ľudskej hsp65, u ktorej boli dva cysteínové častice v polohách 442 a 447 nahradené serinovými časticami a má sekvenciu:

   437 448 VLGGGSALLRS I
10. 10. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1, vyznačuj úci sa tým, že syntetický peptidový nosič alebo analóg je priamo viazaný na molekulu málo imunogénneho antigénu.
11. 11. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 10, vyznačuj úc i sa tým, že molekulou málo imunogénneho antigénu je bakteriálny polysacharid.
12. 12. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 11, vyznačuj úci sa tým, že bakteriálnym polysacharidom je kapsulárny polysacharid (CPS, capsular polysaccharide) Vi baktérie SaLmo nella typhi.
13. 13. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 1, vyznačuj úci sa t ý m, že syntetický peptidový nosič alebo analóg viazaný na moLekulu málo imunogénneho antigénu prostredníctvom spojovníka, zvoleného z -O-R-CO-, -NH-R-CO-, -NH-R-NH-, -O-R-NH- alebo -NH~R-CH₂-, kde R je nasýtený alebo nenasýtený uhľovodíkový reťazec, voliteľne substituovaný a/alebo prerušený jedným alebo viacerými aromatickými radikálmi alebo heteroatémami, ako je N, 0 alebo S.
14. 14. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 13, vyznačuj úci sa t ý m, že R je alifatický uhľovodíkový reťazec, obsahujúci 3 až 16 atómov uhlíka.
15. 15. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 14, vyznačuj úci sa tým, že R je zvyšok ε-aminokaprónovej kyseliny.
16. 16. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 15, vyznačuj úc i sa t ý m, že má vzorec

    CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH J---O kde Ac je acetyl, AC je zvyšok kyseliny e-aminokaprónovej, Pep je zvyšok peptidového nosiča Pep278h alebo Pep II a cukrový zvyšok predstavuje opakujúcu sa jednotku Vi kapsulárneho polysacharidu baktérie Salmonella typhi.

    1Ί. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že je schopný vyvolávať pomocný účinok T lymfocytov, ktorého výsledkom je imunitná odpoveď, charakteristická pre antigény závislé na T bunkách.
17. 18. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16, vyznačujúci sa tým, že pri opakovanej aplikácii vyvoláva zosilnenú odpoveď, ktorej výsledkom je zvýšenie hladiny protilátok voči molekule slabo imunogénneho antigénu .
18. 19. Konjugát málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča podľa nároku 18, vyznačuj úci sa tým, že indukuje protilátky najmä izotypu IgG.
19. 20. Vakcína, obsahujúca konjugát podľa nároku 1.
20. 21. Spôsob zvýšenia imunogenity molekuly málo imunogénneho antigénu, vyznačujúci sa tým, že zahrňu- na syntetický peptidový nosič, odvodený od sekvencie ľudskej ktorý peptid alebo analóg je schopný podstatne zvýšiť imunogenitu molekuly málo imunogénneho antigénu.
21. 22. Spôsob zvýšenia imunogenity molekuly málo imunogénneho antigénu, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje jej zmiešanie so syntetickým peptidovým nosičom, tvoriacim T-bunkový epitop, odvodený od sekvencie Ľudskej hsp65 alebo s jeho analôgom, ktorý peptid alebo analóg je schopný podstatne zvýšiť imunogenitu molekuly málo imunogénneho an t igénu.
22. 23. Spôsob podľa nároku 21 alebo 22 na zvýšenie imunogenity bakteriálnych polysacharidov.

    je pripojenie takej molekuly tvoriaci T-bunkový epitop, hsp65 alebo na jeho analóg.

    ^4. Spôsob imunizácie cicavčieho hostiteľa, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje podanie účinného množstva konjugátu podľa nároku 1 uvedenému hostiteľovi.
23. 25. Spôsob imunizácie cicavčieho hostiteľa, vyznačujúci sa tým, že zahrňuje súčasné podanie účinných množstiev molekuly málo imunogénneho antigénu a syntetického peptidového nosiča, tvoriaceho T-bunkový epitop, odvodený od sekvencie ľudskej hsp65 alebo jeho analógu, ktorý peptid alebo analóg je schopný podstatného zvýšenia imunogenity málo imunogénneho antigénu.