CZ22995A3

CZ22995A3 - Conjugate of little immunogenic antigen and synthetic peptide carrier, vaccine containing thereof and method of increasing immunogenity

Info

Publication number: CZ22995A3
Application number: CZ95229A
Authority: CZ
Inventors: Irun R Cohen; Matityahu Fridkin; Stephanie Konen-Waisman
Original assignee: Yeda Res & Dev
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-07-28
Publication date: 1995-09-13
Also published as: FI950405A; DE69327587T2; HU218425B; EP0658120A4; NO950328D0; NZ255143A; NO950328L; HU9500270D0; SK11295A3; PL174082B1; DE69327587D1; JPH08500102A; AU4790093A; HUT70983A; AU683421B2; BR9306820A; ATE188612T1; KR100290632B1; WO1994003208A1; IL102687A0

Description

Oblast technikv

Předkládaný vynález se imunogenitě, jejichž základem nosiče, tvořící epitop T-buněk, týká konjugátů o zvýšené jsou synthetické peptidové jejich přípravy a vakcín vhodných k imunisaci, obsahujících uvedené konjugáty.

Dosavadní stav technikv

Odpovědi protilátek byly roztříděny na dva hlavní podtypy na základě jejich požadavků vůči T-buňkám. Primární humorální imunitní odpověď na antigeny, závislé na T-buňkách (T-cell dependent, T-dep), je charakterisována aktivací a proliferací B a T buněk, vedoucí na jedné straně k diferenciaci plasmatických buněk a sekreci imunoglobulinů, a na druhé straně k tvorbě germinálních (zárodečných) center a imunologické paměti. Po opětovné stimulaci antigenem mají tyto paměťové buňky vedoucí úlohu v sekundární protilátkové odpovědi. Základní charakteristikou sekundární odpovědi na antigeny T-dep je rychlost tvorby protilátek, větší rozsah odpovědi ve srovnání s primární odpovědí a přesmyk třídy imunoglobulinů z IgM na IgG.

Existuje ovšem malé množství antigenů, schopných aktivovat B buňky nezávisle na pomoci T buněk. Takové antigeny jsou označovány jako antigeny, nezávislé na T buňkách (T cell-índependent, T-ind). Patří mezi ně kromě dalších bakteriální kapsidové polysacharidy, jako kapsulární polysacharid Streptococcus pneujnoniae, polymerizovaný salmonelární flagelin, poly-D-aminokyseliny a lipopolysacharid E. coli. Antigeny T-ind se vyznačují vysokou molekulovou hmotností, opakující se strukturou a ve většině případů jsou pomalu odbouratelné. Po dlouhou dobu přetrvávají na povrchu specialisovaných makrofágů a mohou se, díky svému mnohačetnému přichycení na odpovídající receptory imunoglobulinů, které síťově propojují, vázat na antigenně specifické B buňky s vysokou aviditou. V s dostatečně vysoké koncentraci jsou schopné polyklonální aktivace podstatného podílu zásoby (poolu) B buněk, tj. bez vztahu k antigenní specifitě povrchového receptoru hypervariabilní oblasti. Antigeny T-ind obecně vyvolávají převážně odpovědi zprostředkované imunoglobuliny IgM, u myší také některými IgG3 a poměrně slabou, pokud vůbec nějakou, paměťovou odpověď.

Bakterie s kapsidovým obalem, jako je Haemophilus influenzae typu b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, skupina streptokoků B a E. coli typu K1 vyvolávají u člověka vážná invasivní onemocnění, zvláště pak u dětí a u jedinců se sníženou imunitou. Bylo prokázáno, že plasmatické protilátky vůči polysacharidům působí jako ochrana proti invasivním onemocněním, vyvolávaným většinou z těchto patogenů a k indukci takových protilátek u ohrožených jedinců byly připraveny vakciny, tvořené vyčištěnými kapsulárními polysacharidy (CPS). Polysacharidy jsou ovšem slabými imunogeny u dětí a tato skutečnost je • vážnou překážkou jejich využití jako vakcín. Předpokládá se, že příčina jejich slabé imunogenity souvisí s jejich

- příslušností ke skupině antigenů nezávislých ha T buňkách, antigenům T-ind.

Objev Averyho a Goebela (1929), že připojení polysacharidů na bílkovinné nosiče zvyšuje imunogenitu, byl nedávno využit k přípravě vakcín pro humání použití. Jak u člověka, tak i u hlodavců se tyto konjugáty chovají jako antigeny T-dep, neboť vyvolávají indukci imunologické paměti.

Existují podobnosti mezi konjugovanými polysacharidovými vakcínami a systémy bílkovinného nosiče a haptenu. Konjugáty CPS jsou tedy schopny indukovat u dětí ochranné hladiny protilátek vůči CPS, zatímco CPS samotné tuto schopnost nemají. Je možné, že lepší imunogenita konjugátů ve srovnání s čistými polysacharidy je způsobena pomocným účinkem nosičově specifických T buněk, jak bylo prokázáno na systému nosič-hapten u hlodavců.

Ve většině případů byly antigeny T-ind připojeny na větší imunogenní bílkoviny jako na tetanový toxoid, toxin cholery nebo záškrtový toxoid. Nicméně imunologickou odpověď vůči molekulám nosiče o vysoké molekulové hmotnosti, obsahujícím epitopy stimulujících i supresivních T buněk, nelze dobře předpovědět. Bylo prokázáno, že odpověď protilátek na hapten, připojený na bílkovinný nosič, je možné inhibovat, pokud byl příjemce předem imunisován nepozměněnou bílkovinou. Tento jev byl nazván nosičem indukovanou supresí epitopu a nedávno bylo prokázáno, že k němu dochází účinkem mnoha konjugátů haptenu a bílkoviny. Vývoj účinnějších konjugovaných vakcín vůči velkému počtu extremně infekčních organismů je stále velmi důležitý a proto bylo značné úsilí věnováno hledání vhodnějších nosičových molekul, poskytujících potřebné epitopy T buněk. Všeobecně imunogenní T buněčné epitopy, definované specifickými peptidy s ostře vymezenými imunologickými charakteristikami, by mohly představovat generaci takových alternativních molekul. Bílkoviny dobře rozeznávané imunitním systémem by mohly být vhodným zdrojem peptidů, sloužících k tomuto účelu.

Studie za použití širokého výběru bílkovin, jak těch vzájemně blízce příbuzných, tak i bílkovin fylogeneticky příbuzných jen vzdáleně, prokázaly, že většina T buněk je soustředěna do několika imunodominantních epitopů, s menší částí odpovídající jiným, subdominantním determinantám. Tato hiearchie využívání determinant T buňkami může být způsobena kombinací různých faktorů včetně odlišných afinit k dostupným molekulám HHS (hlavního histokompatibilního systému) , rozmanitosti programu T buněk, vnitřní kompetice o vazná místa na HHS a jemných odlišností v procesování (úpravě).

Hromadí se důkazy, že bílkoviny, patřící do skupiny bílkovin tepelného šoku (heat shock proteins, hsp), jsou hlavními antigeny mnoha patogenů (Young se spoluautory, 1988). Bílkoviny označované hsp byly nejdříve popsány a poté pojmenovány díky jejich produkci buňkami, vystavenými náhlým vzestupům teploty. Mezi hsp patří bílkoviny o různých molekulových hmotnostech, jako 20 kD, 60 kD, 65-68 kD, 70 kD, 90 kD, 110 kD a další. Je nyní zřejmé, že hsp jsou indukovány ve všech buňkách mnoha různými vnějšími vlivy, včetně oxidativního poškození, výživového vyčerpání a infekce nitrobuněčnými patogeny; odpověď prostřednictvím hsp umožňuje buňce přežít v jinak nepříznivých podmínkách. Ačkoli buněčný stres zvyšuje synthesu hsp , exprese mnoha těchto bílkovin je také vrozená a mají podstatnou roli v normálním fungování buňky. Odpověď hsp je všudypřítomná ve světě prokaryont a eukaryont a hsp patří k nejzachovávanéjším molekulám. Navzdory vývojovému rozrůznění v průběhu miliard let se například molekuly lidské a mykobakteriální hsp65 shodují přibližně v 50% aminokyselinových zbytků. Toto chemické zachovávání, konservování, zahrnuje mnoho úseků aminokyselin o plné nebo blízké totožnosti. Proto bude každý organismus nevyhnutelně sdílet imunologickou křížovou reaktivitu s hsp 65 kterékoli cizí buňky. Molekula hsp65 jakéhokoli infekčního buněčného agens bude tedy částečně vlastní a částečně cizí vůči kterémukoli hostiteli, majícímu imunitní systém. Z těchto důvodů by se předpokládalo, že hsp65 a jiné bílkoviny hsp budou slabě imunogenní. Důkazy zcela naopak nasvědčují tomu, že hsp mohou patřit k nej silnějším imunogenům.

Hsp65, jako typický představitel bílkovin, patřících do skupiny hsp, může být považován za dominantní antigen, neboť infikace či imunisace mnoha různými bakteriemi indukují protilátky a T buňky, charakteristické pro molekulu hsp65 (Young se spoluautory, 1988). U myší, imunisovaných prostřednictvím Mycobacterium tuberculosis, je 20% všech T buněk, poskytujících odpověd’ vůči bakterii, specifických vůči hsp65. Je zajímavé, že T buňky, vykazující reaktivitu vůči hsp65, byly nalezeny u normálních zdravých jedinců, postrádajících jakoukoli klinickou známku onemocnění (Munk se spoluautory, 1988). Za použití synthetických peptidů prokázali Lamb se spoluautory (1987) a Munk se spoluautory (1988) odpovědi T buněk vůči sdíleným epitopům mykobakteriální a lidské bílkoviny hsp ; to formálně potvrdilo existenci T buněk vůči vlastním epitopům hsp65 u normálních jedinců.

V důsledku této imunodominance není překvapující, že se molekula hsp65 zřejmě účastní autoimunologických dějů. Imunita vůči hsp65 může u myší vyvolávat autoimunitní diabetes a může být ve vztahu k autoimunitní arthritidě u krys a u lidí (Elias se spoluautory, 1990; Pearson 1964). Imunita vůči hsp65 je tedy spojena s autoimunitním onemocněním, je však spojena také se stavem zdraví.

Během infekce dochází u patogenů i u hostitele k dramatickému nárůstu synthesy jejich hsp k ochraně před stresem, působeným tím druhým. Analogicky jako v případě odpovědi B buněk na autoantigeny je možné uvažovat o tom, že by samotné hsp-reaktivní T buňky mohly být, jako buňky specificky rozpoznávající hsp65, prospěšně zapojeny v rozptýlení zánětu tím, že odstraňují stresované buňky. Autoimunitní onemocnění může možná vzniknout tehdy, pokud tato odpověď není správně regulována. Cohen a Young (1991) předpokládají u zdravých jedinců převahu přirozené imunity, zajišťované imunitním systémem, založeným na principu vysoce kontrolovaných a řízených imunitních sítí, namířených vůči omezenému počtu kontrolovaných vlastních antigenů. Molekula hsp je považována za jeden z těchto antigenů, vůči kterému takové vysoce organisovaná imunitní odpověď přirozeně existuje (Elias se spolupracovníky, 1990).

Cox se spoluautory (1988) prokázal, že dimer peptidu 65-85 bílkoviny o 65 kDa z Mycobacterium tuberculosis neovlivňuje jeho schopnost indukovat proliferaci T buněk, ale zvyšuje tvorbu protilátek a ukázali, že kombinace peptidů, heterologních s N-koncem mykobakteriální sekvence 65-85, může být obecně použitelná k posílení peptidových vakcín. Lussow se spoluautory (1990) a Barrios se spoluautory (1992) ukázali, že hsp65 a hsp70 Mycobacteria bovis mohou jako nosičové molekuly vyvolávat u myší indukci protilátek vůči haptenům. Kromě toho bylo na hsp65 z M. bovis identifikováno mnoho epitopů T buněk a u široké škály myších kmenů s rozdílnými haplotypy HHS bylo prokázáno imunogenní působení celé bílkoviny.

Lze předpokládat, že některé T-buněčné epitopy, postrádající sekvenci bílkoviny hsp65 (hostitele, popřípadě parasita), vykazují imunodominanci a jsou schopné indukovat imunologickou pamět, zatímco jiné nevykazují privilegované imunologické rozpoznávání nebo zapojení v indukci autoimunity. Rozlišování těchto funkčně odlišných epitopů T-buněk může vést k identifikaci všeobecně imunogenních peptidů, které lze vymezit jako bezpečné, definované a účinné alternativy nosičových molekul antigenů T-ind.

Evropský patent EP 262 710 a US patent č. 5 154 923 popisují peptidy se sekvencí aminokyselin, která odpovídá poloze 171-240 a poloze 172-192 polypeptidu o velikosti 64 kD Mycobacteria bovis BCG, které se používají jako imunogeny, vyvolávající odolnost vůči autoimunitní

Ί arthritidě a podobným autoimunitním onemocněním.

Patentová přihláška PCT č. WO 90/10449 popisuje peptid označený jako p277, se sekvencí aminokyselin, která odpovídá polohám 437-460 molekuly lidské bílkoviny hsp65, používaný jako imunogen, který vyvolává odolnost vůči na insulinu závislém diabetů mellitus (insulin dependent diabetes mellitus, IDDM; cukrovce). Kontrolní peptid, označený jako p278, odpovídající polohám 458-474 lidské hsp65, odolnost vůči IDDM neindukoval.

Lussow se spoluautory (1990) ukázal, že primování myší živým Mycobacteriem tuberculosis typu bovis (BCG) a imunisace prostřednictvím synthetického peptidu opakující se malárie (NANP)_4Q, konjugovaného s vyčištěným bílkovinným derivátem (purified protein derivative, PPD), vede k indukci vysokých a dlouho přetrvávajících titrů protilátek IgG vůči peptidu. Později Lussow se spoluautory (1991) ukázal, že mykobakteriální bílkoviny teplotního šoku (hsp) o velikosti 65 kD (typ GroEL) a 70 kD (typ DnaK) vyvolávají jako nosičové molekuly u myší, předem primovaných Mycobacteriem tuberculosis typu bovis (Bacillus Calmette-Guerin, BCG) indukci vysokých a dlouho přetrvávajících titrů IgG vůči synthetickému peptidu opakující se malárie (NANP)₄₀. Pokud byl malarický peptid, konjugovaný s mykobakteriálním hsp, podán v nepřítomnosti jakékoli adjuvantní látky, byly indukovány protilátky vůči peptidu.

Barrios imunisované pomocí konjugovaných se 70 kD tilátek IgG i bez prostřednictvím BCG. přetrvává nejméně 1 rok se spoluautory (1992) prokázal, že myši, peptidů nebo oligosacharidů hsp, vytvářejí vysoké titry projakéhokoli předchozího primování Odpověď protilátek vůči peptidu Tento nosičový efekt 70 kD hsp bez potřeby adjuvantní látky byl závislý na T buňkách, neboř u myší typu nu/nu bez thymu nedošlo k indukci protilátek IgG ani proti peptidu, ani proti 70 kDa hsp. Předchozí imunisace myší 65 kD nebo 70 kDa hsp neměla žádný záporný účinek na indukci IgG protilátek vůči peptidu po imunisaci hsp-peptidovými konjugáty v nepřítomnosti adjuvantní látky. Kromě toho může preimunisace pomocí 65 kD hsp nahradit BCG při zajištění účinného primování pro indukci protilátek anti(NANP)_40> Konečně jak 65 kDa hsp, tak i 70 kDa hspslouží jako nosičové molekuly při indukci protilátek IgG vůči meningokokovým oligosacharidům skupiny C, v nepřítomnosti adjuvantních látek, což naznačuje, že použití bílkovin hsp jako nosičů v konjugovaných prostředcích k indukci protilátek vůči peptidu a vůči oligosacharidu může být cenné při vytváření nových vakcín pro případné humání použití.

Žádný z výše uvedených odkazů nepopisuje specifické epitopy T buněk lidské hsp65, konjugované se slabě imunogenními molekulami.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je poskytnutí metody ke zvýšení imunogenity slabě imunogenních antigenních molekul, tedy jejich přeměny na antigeny vhodné k imunisaci.

K tomuto účelu vynález předkládá konjugáty slabě imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče, tvořícího T buněčný epitop, odvozený od sekvence lidské hsp65, nebo analogu takového nosiče, a uvedený peptid nebo jeho analog mají schopnost zásadně zvýšit imunogenitu slabě imunogenního antigenu.

Savčí bílkoviny hsp65, včetně lidských a myších, jsou jinými autory často označovány jako hsp60, neboť patří do druhové skupiny hsp60. Kdekoli je v tomto popisu zmiňována lidská nebo myší hsp65, je zamýšleno zahrnout tyto molekuly pod označení hsp60 nebo kterékoli jiné označení, které se pro ně v oboru používá.

Kterýkoli peptid, nebo jeho analog, odvozený od lidské hsp65, vytvářející T buněčný epitop a schopný zásadně zvýšit imunogenitu slabě imunogeního antigenů, může být ve vynálezu použit.

Peptid podle vynálezu, kterému se dává přednost, označený zde Pep278h nebo 278h, odpovídá polohám 458-474 molekuly lidské hsp65 a má sekvenci:

458 474

NEDQKIGIEIIKRTLKI

Upřednostňovanými analogy Pep278 jsou peptidy, označené zde Pep278m nebo 278m, v nichž je zbytek T⁴⁷¹peptidů Pep278h nahražen zbytkem A⁴⁷¹, a Pep278mt nebo 278mt, mající následující sekvenci:

EGDEATGANIVKVALEA

Jiný T-buněčný epitop podle vynálezu, odvozený od molekuly lidské hsp65, který je zde označen jako Peptid II nebo Pep II, odpovídá polohám 437-448 molekuly lidské hsp65, u níž byly dva cysteinové zbytky v polohách 44 2 a 447 nahraženy serinem, a má sekvenci:

437 448 VLGGGSALLRSI

Slabě imunogenní antigenní molekulou může být peptid, polypeptid nebo bílkovina, například bílkovina odvozená od viru HIV nebo od malarického antigenů či bakteriálního polysacharidu, jako kapsulárního polysacharidu z Haemophilus influenzae typu B, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Streptococci skupiny Β, E. coli typu ΚΙ,

Salmonelly, jako je Salmonella Typhi, a pod.

Nosičový peptid je kovalentně vázán na slabě imunogenní antigenní molekulu, buď přímo anebo prostřednictvím raménka.

Vynález se dále týká vakcín, obsahujících konjugát podle vynálezu nebo směs slabě imunogenního antigenů a vhodného peptidového nosiče.

V jiném ztělesnění se vynález týká způsobu imunisace savčího příjemce, k němuž patří podání účinného množství konjugátu podle vynálezu uvedenému příjemci, anebo společné podání účinných množství slabě imunogenní antigenní molekuly a synthetického peptidového nosiče, vytvářejícího epitop T buněk, odvozený od sekvence lidské hsp65, nebo jeho analogu, a uvedený peptid nebo analog mají schopnost zásadně zvyšovat imunogenitu slabě imunogenního antigenů.

Konjugáty podle vynálezu, jimž se dává přednost, jsou tvořeny Pep278h nebo Pep II kovalentně vázaným na bakteriální polysacharid, například CPS Vi ze Salmonella typhi, uváděný zde jako Vi, lineární homopolymer poly-a(l-4)GalNAc, proměnlivě O-acetylovaný v poloze C₃, jak je znázorněno na schématu 1. Vi samotný, tak jako jiné CPS, nevyvolává po opakované injikaci savcům, jak zvířatům, tak i lidem, stupňující se odpověď, ale jeho imunogenita se zvyšuje, pokud je podáván ve formě konjugátu podle vynálezu, spojený s vhodným peptidem, odvozeným od lidské hsp 65 nebo s jeho analogem, anebo ve směsi s takovým peptidem či jeho analogem. Opakovaná injikace konjugátu peptidů a Vi indukuje zvýšení hladiny protilátek anti-Vi (zesilovací účinek), představovaných zvláště isotypem IgG.

V případě Pep278h jsou aktivní peptidy podle vynálezu charakterisovány jako silně nabité, tj. s vlastnostmi silně elektrické látky (7 ze 17 aminokyselinových zbytků, tvořících Pep278h, je buď negativně nebo positivně nabitých) a jako silně hydrofobní (6 aminokyselinových zbytků). Peptid Pep278h je dále charakterisován tím, že obsahuje polární, negativně nabitou oblast N-konce, polární, positivně nabitou oblast C-konce a silně hydrofobní jádro. Tyto celkové rysy by měly být udržovány k zachování účinnosti. Výše obecně zmíněná substituce některých aminokyselin tedy následně povede k aktivním peptidům. Přesněji, polohy 6, 8, 10, 11, 15 a 17 peptidového řetězce Pep278h (odpovídající polohám

463, 465, 467, 468, 472 a 474 být obsazeny I nebo L molekuly lidské hsp65) mohou nebo jinými hydrofobními aminokyselinami, buď přirozeně se vyskytujícími jako V, M nebo F, nebo takovými, které se v přírodě nevyskytují, jako je norleucin (Nle) nebo norvalin (Nva). Polohy 5, 12, 13 a 16 řetězce Pep 278h (odpovídající polohám 462, 469 , 470 a 473 molekuly lidské hsp65) mohou být obsazeny buď K nebo R nebo v přírodě se nevyskytujícími kladně nabitými aminokyselinami, jako je ornithin (Orn). K aktivním derivátům může vést také záměna E a D.

Výraz analogy se v tomto vynálezu vztahuje na peptidy, získané nahražením, delecí nebo adicí aminokyselinových zbytků v sekvenci T-buněčného epitopu, pokud mají schopnost podstatně zvýšit imunogenitu molekul slabě imunogenního antigenu. Stabilní deriváty lze například získat nahražením původních cysteinových zbytků serinovými zbytky,jako v případě Pep II. Analogy jsou v případě Pep278h takové peptidy, u nichž je zachováno nejméně 70%, lépe pak 90-100% elektrických vlastností a hydrofobnosti peptidové molekuly. Takové peptidy lze získat podle pokynů v dříve uvedeném odstavci.

Peptidy podle vynálezu mohou mít všechny zbytky opticky aktivních aminokyselin ve formě L nebo D, anebo jsou některé z aminokyselinových zbytků ve formě L a jiné ve formě D.

Podstatným zvýšením imunogenity molekuly slabě imunogenního antigenů se rozumí jak indukce zvýšení hladiny protilátek proti uvedenému antigenů, tak i presentace (předložení) uvedených protilátek ve formě zejména isotypu IgG.

Peptidový nosič může být spojen s antigenní molekulou přímo nebo prostřednictvím raménka.

Přímá vazba mezi peptidem a Vi je znázorněna na schématu 1, kde je konjugát

získán dále popsaným Postupem 3.

Raménko může mít vzorec -O-R-CO- nebo -NH-R-CO-, kdy tvoří s karboxylovou skupinou Vi ester nebo amid a peptidovou vazbu se koncovou aminoskupinou peptidů; -O-R-NH- nebo -NH-R-NH-, kdy tvoří s karboxylovou skupinou Vi ester nebo amid a amid vytváří také s koncovou karboxylovou skupinou peptidů; nebo -NH-R- CH₂~, kdy R je nasycený nebo nasycený uhlovodíkový řetězec, volitelně substituovaný a/nebo přerušený jedním nebo více aromatickými radikály nebo heteroatomy, jako je O, S nebo N.

R je s výhodou alifatický uhlovodíkový řetězec, obsahující 3-16 atomů uhlíku, tak jako zbytek kyseliny e-aminokapronové.

Konjugát o vzorci:

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

kde Ac je acetyl, AC je zbytek kyseliny e-aminokapronové, Pep je zbytek peptidového nosiče Pep278h nebo Pep II a cukerný zbytek představuje opakující se jednotku kapsulárního polysacharidů Vi ze salmonely tyfu, lze připravit třemi rozdílnými postupy 1, 2 a 4, znázorněnými na schématu l a podrobně popsanými v dalším textu.

Konjugáty, jejichž raménko má vzorec -NH-R-CH₂“, se získávají redukcí skupin -NH-R-CO-.

Vynález se dále týká vakcín, obsahujících konjugáty podle vynálezu. Tyto vakcíny budou s výhodou podávány podkožně (subkutáně) ve vehikulech (ředících prostředcích), vhodných pro humání a veterinární použití.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázky la,b znázorňují odpověď protilátek anti-Vi v séru, indukovanou u myší samotným Vi, 12 a 24 dní po první imunisaci a 12 dní po druhé imunisaci, při naředění séra 1:50 (a) a 1:500 (b).

Obrázky 2a,b (A-C) znázorňují odpověď protilátek antiVi, indukovanou u myší pomocí Vi samotného nebo konjugátů

Vi-Pep II, Vi-Pep278h a Vi-Pep348h [(a) 2,5 μg a (b) 0,25 μρ

Vi, injikováno na myš], 12 (A) a 24 dní (B) po první imunisaci a 12 dní po druhé imunisaci (C).

Obrázky 3a,b (A-B) znázorňují kinetiku tvorby protilátek anti-Vi, indukované konjugáty bílkoviny Vi a peptidu (A) a samotným Vi (B) (2,5 gg (a) a 0,25 ug (b) Vi injikováno na myš, 12 a 24 dní po první imunisaci a 12 dní po druhé imunisaci).

Obrázky 4a,b znázorňují specifičnost protilátek anti-Vi, tvořících se u myší, imunisovaných Vi samotným nebo konjugáty Vi-Pep II a Vi-Pep278h. Protilátky byly stanovovány pomocí destiček ELISA, pokrytých 2,5 gg (obr.4a) nebo 1,25 μg Vi na jamku (obr.4b).

Obrázky 5a,b znázorňují charakterisaci isotypu protilátek anti-Vi, jejichž tvorba byla u myší vyvolána samotným Vi anebo konjugátem Vi-Pep278h. Obrázek 5a: odpověď isotypu anti-Vi IgM na Vi a Vi-Pep278h; obrázek 5b: odpověď isotypu anti-Vi IgG na Vi a Vi-Pep278h.

Obrázky 6a,b znázorňují časový průběh tvorby protilátek anti-Vi u myší, imunisovaných samotným Vi nebo konjugáty Vi-Pep II a Vi-Pep278, při zředění séra 1:100 (obr.6a) a 1:1000 (obr. 6b).

Obrázky 7a-c(A,B) znázorňují vliv způsobu podání adjuvantní látky a způsobu imunisace na tvorbu protilátek anti-Vi, indukovanou u myší pomocí Vi-Pep II, injikovaného (A) podkožně (subkutáně, sc) nebo (B) do svalu (intramuskulárně, im) , 12 (obr.7a) a 24 dní (obr.7 b) po první imunisaci a 12 dní po druhé imunisaci (obr. 7c).

Obrázky 8a-c znázorňují tvorbu protilátek anti-Vi, indukovanou u myší pomocí konjugátu Vi-Pep II nebo volným

Pep II, smíšeným s Vi před imunisaci 12 (obr. 8a) a 24 dní (obr. 8b) dní po první imunisaci a 12 dní po druhé imunisaci (obr. 8c).

Obrázek 9 znázorňuje účinek nosiče jako primeru na tvorbu protilátek anti-Vi u myší, imunisovaných konjugovaným Vi-Pep II, primovaných podkožně (sc) 14 dní před imunisací volným Pep II v IFA (vlevo), nebo u myší, kterým nebyl primer aplikován (vpravo).

Obrázky 10a,b (A,B) znázorňují imunitní odpověď anti-Vi, indukovanou u téže jednotlivé myši pomocí Vi-Pep277(S) (antigen A), Vi-Pep278h (antigen B, po injikaci Vi-Pep277(S)), samotným Vi (antigen C, po injikaci Vi-Pep277(S)) a Vi-Pep278h (antigen D), při zředění séra 1:50 (a) a 1:1000 (b), 12 dní po první (obr. A) a 12 dní po druhé (obr. B) imunisaci.

Obrázky lla-f znázorňují testování rozpoznání samotného Vi (obr. b) a konjugátů Vi-Pep II (obr. c), Vi-Pep278h (obr. d), Vi-Pep II* (obr. e) a VÍ-PCRP77-83 (obr. f), nanesených na destičky ELISA, srovnávacím anti-Vi sérem Burro 260 (obr. a).

Obrázky 12a-e znázorňují imunitní odpověď rozdílných myších kmenů na Vi a konjugáty s Vi. Obrázek a: odpověď myší BALB/c na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-SRes, Vi-348 a Vi-277(S); obrázek b: odpověď myší BALB/k na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-277(S) a Vi-SRes; obr. c: odpověď myší BALB/b na stejné antigeny jako u obr.B? obr. d: odpověď NOD myší na Vi, Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt a Vi-SRes; obr. e: odpověď NOD.NOD myší na Vi, Vi-278h a Vi-278mt.

Obrázky 13a-c znázorňují rozdělení isotypů IgG v séru myší, imunisovaných konjugátem Vi-278h, emulsifikovaným v IFA, Vi v IFA a IFA/PBS (PBS = fosfátem pufrovaný solný roztok).

Obrázek 14 znázorňuje imunitní odpověď myší na fragmenty Vi a konjugát Vi fragmenty-278h.

Obrázek 15 znázorňuje imunogenitu Vi a konjugátů Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt a Vi-SerRes u myší.

Obrázek 16 znázorňuje imunitní odpověď IgGl, vyvolanou u myší po imunisaci polypeptidem FEPK samotným nebo konjugovaným s peptidy 278h a 3 48h.

Příklady provedení vvnálezu

Vynález bude nyní dokreslen pomocí následujících příkladů, na které se však neomezuje.

V příkladech bude použito dále uvedených látek a postupů.

POUŽITÉ LÁTKY A METODY

a) Látky: Veškerá rozpouštědla a chemikálie byly analytického stupně čistoty a pokud není uvedeno jinak, byly získány od firmy Aldrich, USA.

b) Synthesa peptidů: Peptidy byly získány synthesou v pevné fázi a pro aminoskupinu α-N-konce byla použita ochranná skupina t-Boc. Merrifieldova pryskyřice s obsahem 0,5-0,7 meq/g aktivního chlóru v 1 gramu byla získána od firmy Chemalog, N.J., USA. Boc-skupinou chráněné aminokyseliny s vhodnými ochranami postraního řetězce byly získány od firmy Baechem, Ca., USA. Navázání první aminokyseliny na pryskyřici bylo provedeno cestou cesiových solí aminokyselinových derivátů. Rozšiřování peptidového řetězce bylo prováděno ručně, podle obecných principů metodologie práce na pevné fázi (Merrifield, 1963). Uvolnění peptidů z pryskyřice a odstranění ochrany postraního řetězce bylo provedeno HF postupem. Sekvence synthetisovaných peptidů a analogů jsou uvedeny v Tabulce 1.

Peptidový analog 278m odpovídá polohám 458-474 myší hsp a analog 278mt odpovídá polohám 431-447 mykobakteriální hsp65.

Synthetisovány byly rovněž následující kontrolní peptidy: peptid 277(S), analog peptidu p277, odpovídající polohám 437-460 lidské hsp65 (W090/10449), u něhož byl cysteinový zbytek (C) v polohách 342 a 347 nahražen zbytky šeřinu (S); peptid 348h, odpovídající polohám 449-460 lidské hsp65; peptid CRP 77-83, odpovídající polohám 77-83 lidské C-reaktivní bílkoviny a peptid SerRes, získávaný z mořských ježků.

Peptidy II, 277(S), SerRes, 278mt a CRP 77-83 byly synthetisovány jak bylo výše uvedeno. Peptidy 278h, 278m a 348h byly vytvořeny na automatickém synthetisátoru (Applied Biosystem model 430A) za použití firemních protokolů k t-butyloxykarbonyl(t-Boc) postupu.

c) HPLC na reversní fázi: Konečné vyčištění peptidových produktů bylo provedeno za použití polopreparativního sloupce RP18 pro HPLC (Merck, Darmstadt, Německo), s využitím kapalinového chromatografického systému SP8750, vybaveného variabilním detektorem vlnové délky, v gradientech voda-acetonitril, obsahujících 0,1% kyseliny trifluorooctové (TFA). Vytékající kapaliny byly monitorovány měřením absorbance v UV oblasti při 220 nm. Acetonitril v čistotě pro HPLC byl získán od firmy Merck (Darmstadt, Německo). Peptidy, vykazující čistotu při testování HPLC, byly charakterisovány stanovením analysy aminokyselin.

d) Vi: Vi, vyčištěný z Citrobacter freundii WR7011 (laskavě věnovaný J.B. Robbinsem a S.C. Szu, National

TABULKA 1: SEKVENCE SYNTHETICKÝCH PEPTIDŮ

č.	původ peptidů	název p.	sekvence
1	lidská hsp65 (458-474)	278h	NEDQKIGIEIIKRTLKI
2	analog hsp65	278m	NEDQKIGIEIIKRALKI
3	analog hsp65	278mt	EGDEATGANIVKVALEA
4	lidská hsp65 (437-448)	pep II	VLGGGSALLRSI
5* ^**		_Λ — \ 277(S)	VLGGGSALLRSIPALDSLTPANED
6	lidská hsp65 (449-460)	348h	PALDSLTPANED
7	lidská C-reaktivní bílkovina (77-83)	CRP77-83	VGGSEIL
8	mořský ježek	SerRes	LRGGGVCGPAGPAGTVCS

* Peptidy číslo 5, 6, 7 a 8 byly použity jako kontrolní ** Peptid 277(S) je stálý analog peptidů 277 (WO 90/10449), odpovídající poloze 437-460 na lidské hsp65, v níž byly cysteinové zbytky (C) v polohách 442 a 447 nahraženy serlnovými (S) zbytky.

SCHÉMA 1: Postupy navázání

Struktura opakující se podjednotky kapsulárního polysacharidu Vi ze SalmonellaTyphi (1) HOSU*/sDCC** (2) AC/Pep

Postup 2 cO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

AC-Pep

SDCC

Postup 1 \r.A-n

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

NAc *** AC = e-aminokapronová kyselina ** sDCC = vodou rozpustný DCC * HOSU = N-hydroxysukcinimid

Pep/bílk sDCC

CO-NH-Pep-COOH (1) Boc-AC** + HOSU + SDCC i

Boc-AC-OSU (2) Boc-AC-OSU + Pep t

Boc-AC-CO-NH-Pep-COOH Λ * *

TFA

H₂-AC-CO-NH-Pep-COOH sDCC

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH

-°\

OAc /U-_n

NAC

NAc * Pep/bílk. = peptid/bílkovina ** Boc/AC = Boc-e-aminokapronová kyselina *** TFA = kyselina trifluoroctová

Institute of Health, Bethesda, Maryland) obsahoval <1% každé z následujících látek: bílkoviny, nukleové kyseliny a lipopolysacharidu. Molekulová hmotnost Vi byla stanovena na 3xl0³kDa.

e) Konjugace Vi a synthetických peptidů: Odlišné postupy konjugace jsou shrnuty na Schématu 1.

Postup 1:

Spojení Vi a peptidu prostřednictvím raménka (a): Během syntnesy v pevné fázi byl Peptid II za použití obvyklého postupu pro přidání aminokyselinového zbytku prodloužen na N-konci t-Boc-e-aminokapronovou kyselinou (AC), působící jako raménko v konjugátu Vi-peptid. Stejná množství Vi a peptidu II-AC byla rozpuštěna v minimálním objemu redestilované vody (double distilled water, ddw) a pH bylo upraveno na hodnotu přibližně 6. Dva ekvivalenty (eqv.) vodou rozpustného karbodiimidu (CDI; hydrochlorid

3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimidu) byly přidány dvakrát po sobě v intervalu několika hodin a reakční směs byla ponechána inkubovat přes noc (ON). Surový konjugát byl dialysován vůči fosfátem pufrovanému solnému roztoku (PBS) a hustota peptidu ve Vi, tj. množtví peptidu, vázaného na Vi, byla stanovena analysou aminokyselin (viz Tabulka 2).

Hodnocení množství Vi, kovalentně vázaného k peptidu, bylo prováděno pomocí Fourierovy transformace infračervené (FTIR) spektroskopie.

Postup 2:

Spojení N-hydroxysukcinimidem aktivovaného Vi a peptidu pomocí raménka: Před konjugcí s Peptidem II-AC byly karboxylové skupiny Vi aktivovány reakcí s N-hydroxysukcinimidem (Sigma). Jeden ekvivalent Vi byl suspendován v NMP (N-methylpyrrolidon, Riedel De Haen, Německo), zamíchán a odstředěn po dobu 5 minut v odstředivce Eppendorf. Pelet byl rozsuspendován v NMP, pak bylo přidáno 5 eqv. jak N-hydroxysukcinimidu, tak i vodou rozpustného karbodiimidu (Cl) a reakční směs byla inkubována za mírného míchání. Po několika hodinách pak byla odstředěna a supernatant, obsahující N-hydroxysukcinimidový ester Vi, byl smíchán s 1 eqv. Peptidů II-AC, rozpuštěným ve vodném roztoku při pH 7,5. Po několika hodinách inkubace byl konjugát dialysován vůči ddw a hustota peptidů byla stanovena analysou aminokyselin (viz Tabulka II).

TABULKA 2: KONJUGÁTY, POUŽITÉ JAKO IMUNOGENY

konjugát Vi-peptidů	postup připojení¹	peptid/Vi monomer²(molární poměr)
Vi-Pep II	1	1/127
Vi Pep II*	2	1/400
Vi-Pep 278h	3	1/25
Vi-Pep 348h	3	1/22
Vi-Pep CRP77-83	4	1/14
Vi-Pep 277(S)	4	1/10
Vi-Ova³	3	1/175

¹ Postup připojení 1-4, popsaný v odstavci Použité látky a Metody

Hustota peptidů byla stanovována analysou aminokyselin Ova = ovalbumin

TABULKA 3: MNOŽSTVÍ KONJUGOVANÉHO PEPTIDU,

INJIKOVANÉHO JEDNÉ MYŠI

a) při imunisaci 0,25 pg Vi/myš

konjugát Vi-peptid	injikované množství peptidu/myš
Vi-Pep .11	0,010 pg
Vi-Pep 278h	0,170 pg

b) při imunisaci 0,25 pg Vi/myš

konjugát Vi-peptid	injikované množství peptidu/myš
Vi-Pep II	0,100 pg
Vi Pep II*	0,030 pg
Vi-Pep 278h	1,000 pg
Vi-Pep 348h	0,600 pg
Vi-Pep CRP77-83	0,510 pg
Vi-Pep 277(S)	2,200 pg
Vi + Pep II (smíchč	Lno) 2,500 pg
Vi-Ova	2,200 pg

Postup 3:

Spojení Vi a bílkoviny či peptidu bez pomoci raménka: jeden eqv. Vi a 1 eqv. bílkoviny či peptidu byly rozpuštěny v minimálním objemu ddw a inkubovány 12 hodin při laboratorní teplotě (LT) a pH 6 v přítomnosti 2 ekvivalentů vodou rozpustného CDI (pokud jde o bílkovinu) a 60 eqv. vodou rozpustného CDI (pokud jde o protein). Po dialyse reakční směsi byla stanovena hustota bílkoviny či peptidu v konjugátu analysou aminokyselin (viz Tabulka 2).

Postup 4:

Spojení Vi a peptidu následně po prodloužení peptidového řetězce raménkem v roztoku (b):

K aktivaci karboxylové skupiny t-Boc-e-aminokapronové kyseliny (t-Boc-AC) pomocí N-hydroxysukcinimidu byl 1 mmol t-Boc-AC smíchán s 1,15 mmolu N-hydroxysukcinimidu v minimálním objemu dioxanu (Merck, Německo); poté bylo přidáno 1,15 mmolu N, Ν'-dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), rozpuštěného v dioxanu a po 3 hodinách byla reakční směs zfiltrována a promyta dioxanem. 0,1 mmolu požadovaného peptidů bylo rozpuštěno v malém nožství ddw a smícháno s 0,2 mmolu KHCO3 (Merck). Roztok N-hydroxysukcinimidového esteru t-Boc-AC a připravený roztok peptidů byly smíchány a ponechány reagovat 1 hodinu za důkladného míchání. Pak byla reakční směs naředěna ddw (10 ml), ochlazena a okyselena roztokem IN KHSO₄. Produkt byl extrahován ethylacetátem. Organický roztok byl promyt ddw, vysušen pod Na₂SO₄ a odpařen do sucha. Po dvouhodinovém vysoušení produktu pomocí P₂O₅, jeho rozpuštění v 4-5 ml TFA (Merck) a 10 minutách reakce byla tekutina vakuově odpařena při 30°C. Sloučenina byla dvakrát promyta CH₂C1₂, tekutina byla odpařena a produkt byl vysoušen 2-3 hodiny za pomoci P₂O₅. ^Vzniklý peptid-AC byl následně rozpuštěn v ddw a pH bylo upraveno na hodnotu 8. Pak bylo přidáno 5 mg N-hydroxysukcinimidového esteru Vi (připraveného podle Postupu 2). Po několika hodinách inkubace byl vzniklý konjugát Vi-AC-peptid dialysován vůči vodě. Hustota peptidů v konjugátu byla stanovena pomocí analysy aminokyselin a výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2.

f) Spojení Vi fragmentů a syntetických peptidů: Fragmenty Vi (laskavě poskytnuté Dominiquem Schulzem, Pasteur-Merieux, Francie) byly spojeny se synthetickými peptidy výše popsaným Postupem 3.

g) Konjugace plně D synthetického polypeptidu poly(Phe, D-Glu)-poly(Pro)-poly(Lys) (zde označovaného jako FEPK) a syntetických peptidů hsp65: Syntetický, náhodně rozvětvený polypeptid FEPK (laskavě poskytnutý skupinou profesorů Edny Moses a Michaela Sela, Weitzman Institute of Science, Izrael) byl spojen se synthetickými peptidy hsp65 pomocí Postupu 3.

h) Imunisace: Samice myší BALB/c (od firmy Olac) ve stáří 2-3 měsíce byly imunisovány podkožně (sc) anebo nitrosvalově (im) a to jednou, dvakrát nebo třikrát ve 12 denních intervalech samotným Vi, Vi-konjugátem nebo Vi, smíšeným s peptidem. Podávané množství antigenů a použité adjuvantní látky se v každém pokusu lišilo. Myším z každé pokusné skupiny byla odebrána krev 12 dní po každé injikaci (72 dní po poslední aplikaci při dlouhodobém sledování tvorby protilátek anti-Vi).

i) Sérologie: Hladina protilátek vůči Vi, jejichž tvorba byla u myší vyvolána čistým nebo konjugovaným Vi, byla stanovována enzymovým imunosorbentním testem (ELISA). Protože negativně nabité polysacharidy se na polystyren, obecně používaný při testu ELISA v pevné fázi, příliš dobře nepřipojují, byl k pokrytí pevného povrchu (s velmi slabou nespecifickou vazbou) polysacharidem Vi použit kladně nabitý hovězí sérový albumin (BSA). Přesněji, 0,5 mg Vi bylo rozpuštěno v 1 ml PBS a mícháno 1 hodinu při laboratorní teplotě (LT) . 10 mg methylovaného BSA (Sigma) bylo suspendováno v 1 ml H₂O a výsledný roztok byl zfiltrován filtrem o průměru pórů 0,8 μτη. K přípravě potahovacího roztoku byl 1 ml rozpuštěného polysacharidu 20 minut míchán při LT s 50 μΐ roztoku methylovaného BSA a následně byl zředěn PBS v poměru 1:20. Nunclon delta Si mikrotitrační destičky byly 3 hodiny při 37'C překryty 100 μΐ potahovacího roztoku na jamku (2,5 μg Vi/jamku). Pak byly pětinásobně promyty PBS s obsahem 0.33% Brij35 (Sigma) a 2 hodiny při 37°C blokovány roztokem PBS a 1% sušeného odstředěného mléka. Po promytí byly do jamek přidány 100 μΐ alikvoty zředěného neznámého séra a zředěného standardního séra (ředící pufr obsahoval 1% odstředěné mléko a 0,33% Brij35 v PBS) a destičky byly inkubovány 1 hodinu při 37°C. Referenční a testované sérum byly na destičku nanášeny dvojmo. Protilátky bez schopnosti se navázat byly odstraněny promytím a na destičky byl přidán, v případě testovaného séra, konjugát kozí anti-myší IgG Fab₂ a alkalické fosfatázy (Sigma) ve vhodném naředění a v případě standardního séra kozí anti-koňský IgG Fab₂enzymový konjugát (Sigma) v objemu 100 μΐ na jamku. Po dvouhodinové inkubaci při 37 °C byly destičky promyty a přídavkem 100 μΐ roztoku substrátu, obsahujícího 0,6 mg/ml p-nitrofenylfosfátu (Sigma) v diethanolaminu-H₂O o pH 9,8 bylo vyvoláno jejich zabarvení. Enzymová reakce byla po 20 minutách ukončena přídavkem 10 μΐ 5 N NaOH na jamku. Optické hustoty byly odečítány při 405 nm. Anti-Vi standardní sérum Burro 260, obsahující 550 mg Vi protilátek na 1 ml, bylo připraveno mnohonásobnými nitrožilními injekcemi ve formalínu fixovaného S. typhi Ty2 (laskavě poskytnutého J.B. Robbinsem a S.C. Szu, NIH, Maryland). Získané výsledky jsou vyjádřeny jako optická hustota při 405 nm nebo jako μg protilátek vůči Vi/ml.

PŘÍKLADY

Příklad 1. Příprava konjugátů Vi-peptid/bílkovina.

Konjugáty Vi s peptidem II byly připraveny spojením podle Postupu 1 (Vi-Pep II) nebo 2 (Vi-Pep II*). Konjugáty Vi s peptidy 278, 278m, 278mt, 348h a ovalbuminem (Ova) byly připraveny spojením podle Postupu 3 a konjugáty Vi s CRP 77-83 a 277(S) podle Postupu 4.

Složení některých z konjugátů s obsahem Vi bylo určeno analysou aminokyselin. Výsledky uvedené v Tabulce 2 ukazují, že molární poměr peptidu či bílkoviny na monomer Vi byl proměnlivý. Dávky peptidů 0,1-2,0 μg na myš, injikované jako konjugát cukru a peptidu, se ukázaly jako nejúčinnější.

TABULKA 4: ODPOVĚĎ SÉROVÝCH PROTILÁTEK MYŠÍCH SAMIC KMENE BALB/c, JIMŽ BYL APLIKOVÁN Vi NEBO KONJUGÁT Vi A PEPTIDU

vakcína	dávka Vi (mg)	protilátky vůči Vi (mg/ml)
po 1. imunisaci	po 2. imunisaci
12 dní	24 dní	12 dní
vi	0,25	0,194	0,005	0,053
Vi-Pep 278h	0,25	0,049 0,000-0,0	1,455 78 0,296-1,	2,959 906 1,533-3,148
BALB/c PBS	—	0,223	0,205	0,233

Myším samicím kmene BALB/c ve stáří 2-3 měsíce byly podkožně injektovány s prodlevou 2 týdnů 0,2 ml každé vakcíny v IFA. Pokusnou skupinu tvořilo 5 myší. 12 a 24 hodin po první a 12 hodin po druhé imunisaci jim byla odebrána krev a v jejich séru byla pomocí testu ELISA, popsaného v odstavci Použité látky a metody, stanovována přítomnost rotilátek vůči Vi. Výsledky jsou vyjádřeny jako geometrický průměr, v jednom případě s udáním změny koncentrace protilátek vůči Vi v každé skupině.

Příklad 2. Imunologické charakteristiky Vi a konjugátů s obsahem Vi.

2.1. Antigennost čistého přírodního Vi. Ke stanovení protilátkové odpovědi, indukované pomocí Vi, byly myší samige kmene BALB/c ve stáří 2-3 měsíce podkožně injektovány ve dvoutýdenním intervalu rozdílnými dávkami samotného Vi-antigenu ve Freundové nekompletním adjuvans (IFA). Myším byla odebrána krev 12 a 24 dní po první a 12 dní po druhé imunisaci. Séra všech myší v jedné skupině byla spojena. Protilátky anti-Vi byly měřeny ve výše popsaném testu ELISA a hladiny specifických protilátek byly vyjádřeny jako absorbance₄₀₅ (A₄₀₅).

Jak je vidět na obrázcích 1, jedna injekce Vi vyvolala u myší odpověď protilátek vůči Vi. Opakovaná injikace Vi nezpůsobila zesílení účinku, očekávané u antigenů T-ind. Podkožní imunisace pomocí 2,5 mg Vi v IFA na jednu myš vyvolala nejsilnější tvorbu specifických protilátek; zvýšení dávky nepřineslo zvýšení imunitní odpovědi.

Přípravek Vi, použitý v tomto pokusu, obsahoval zbytkové množství bílkoviny (< 1%). Poměrně vysokou imunitní odpověď vůči Vi by mohla být vysvětlena touto skutečností.

2.2. Antigennost konjugátů s obsahem Vi.

2.2.1. Vztah k dávce aplikovaného antigenu. Studován byl účinek různých dávek na imunogennost přírodních a konjugovaných forem. Odpověď protilátek Vi byla u myší indukována aplikací 2,5 μ9 nebo 0,25 μ9 samotného Vi nebo jeho konjugátů Vi-Pep II, Vi-Pep 278h a Vi-Pep 348h, obsahujících rovněž 2,5 μ9 nebo 0,25 μ9 Vi. Čtyři myší samice kmene BALB/c, představující jednu skupinu, byly s dvoutýdenním intervalem podkožně imunisovány 2,5 μg Vi buď samotného, nebo ve formě konjugátu v IFA ( podávaná množství peptidů ve formě konjugátu jsou uvedena v Tabulce 3). Odpověď protilátek anti-Vi byla měřena testem ELISA a velikost specifické imunitní odpovědi je vyjádřena na Obrázcích 2a,b jako A_4Q5. Obrázky ukazují geometrické průměry sér, získaných od 4 jednotlivých myší, kterým byl aplikován stejný antigen. Spojené sérum 4 myší, imunisovaných Vi samotným nebo PBS v IFA, sloužilo jako kontrola.

Výsledky znázorněné na Obrázcích 2 ukazují, že 12 dní po první aplikaci 2,5 ^g Vi samotného nebo jako konjugátu (odpovídající aplikované peptidy jsou uvedeny v Tabulce 3b) všechny konjugáty Vi-peptid vykázaly imunitní odpovědi anti-Vi nižší než pokud byla vyvolána Vi v jeho přírodní formě (Obrázek 2a, část A). Sledování hladiny protilátek po další dvanáctidenní období bez obnovení imunisace prokázalo jasný nárůst specifických protilátek vůči Vi u myší injikovaných Vi-Pep278h (Obr.2a, část B). Opakovaná injikace vyvolala určité zvýšení odpovědi při imunisaci Vi-Pep II a Vi-Pep278h, ne však v případě Vi samotného (Obr.2a, část C).

Snížení dávky aplikovaného Vi na 0,25 ^g/myš (odpovídající množství aplikovaných peptidů jsou uvedena v Tabulce 3a) vyvolalo jen nižší hladiny protilátek vůči Vi, indukované Vi samotným a Vi-Pep II (Obr. 2b, části A-C). Naproti tomu imunitní odpověď, vyvolaná konjugátem Vi-Pep278h, vykázala při druhé imunisaci jasný zesílený účinek (Obr. 2b, část C). Pozornost by měla být věnována tomu, že množství peptidů, podávaného v tomto konjugátu, činilo pouze 0,17 μg na 1 zvíře (viz Tabulka 3a).

2.2.2. Studována byla také kinetika tvorby protilátek anti-Vi, indukovaných prostřednictvím Vi a konjugátů s Vi u myší, imunisovaných výše popsaným způsobem. Hladiny protilátek vyšší než hladina, indukovaná Vi samotným, jsou brány jako kladné hodnoty, hladiny protilátek, nedosahující hladiny, indukované Vi samotným, jsou brány jako hodnoty záporné. Sérové protilátky vůči Vi byly stanovovány testem ELISA. Výsledky jsou v Obrázcích 3a,b vyjádřeny jako A₄₀₅ a ukazují geometrické průměry ± SD, získané v séru 4 myší, jimž byl aplikován antigen.

Obrázky 3 a,b znázorňují rozvoj tvorby protilátek anti-Vi během dvou následných aplikací Vi a konjugátů s Vi při dvou rozdílných dávkách antigenu. Obr. 3a(A): 2,5 gg Vi, aplikovaných na 1 myš ve Vi-Pep II, Vi-Pep278h, Vi-Ova, Vi-Pep348 a Vi-CRP 77-83; Obr. 3b(A); 0,25 gg Vi, aplikovaných na 1 myš ve Vi-Pep II a Vi-Pep278h. Části B - pro srovnání, hladiny protilátek anti-Vi, indukované 2,5 gg Vi samotného. Jak je zřejmé z obrázku 3a(A), 12 dní po první imunisaci všechny konjugáty indukovaly jasně nižší hladiny protilátek vůči Vi než jaké indukoval Vi samotný, ačkoli bylo aplikováno stejné množství Vi. Po dvanáctidenní lag-fázi séra zvířat, imunisovaných konjugáty Vi, vykázala značné zvýšení hladiny specifických protilátek vůč Vi. Tento účinek je zvláště zřejmý u konjugátu Vi-Pep278h u obou podávaných dávek (Obr. 3a,b, části A). Opakované podání po 24 dnech spustilo zvýšenou odpověď, která je typická pro antigeny T-dep (pro srovnán viz části B Obr. 3a,b). Vi-Pep II, Vi-Pep278h a Vi-Ova indukovaly vyšší hladiny protilátek anti-Vi, než jaké vyvolalo podání Vi samotného. Zvláště konjugát Vi-Pep278h vyvolal silnější imunitní odpověď anti-Vi než Vi-bílkovinný konjugát Vi-Ova (Obr. 3a, část A).

Imunisace desetinásobně nižší dávkou antigenu zdůraznila popisovaný efekt tvorby protilátek vůči Vi, indukovaný prostřednictvím Vi-Pep278h (Obr. 3b, část A).

Koncentrace protilátek vůč Vi, indukovaných u myší konjugátem Vi-Pep278h, jsou uvedeny v Tabulce 4. Hladina specifických protilátek, indukovaných Vi-Pep278h, vykázala třicetinásobné zvýšení od dne 13 do dne 24 po první imunisaci. Opakovaná aplikace měla za následek zdvojení koncentrace protilátek anti-Vi na hodnotu přibližně 3 μ9/πι1, 55krát vyšší než jakou vyvolává Vi samotné.

2.2.3. Specifita protilátek anti-Vi. Imunitní odpověď na antigeny T-dep je charakterisována tvorbou germinálních (zárodečných) center, která byla spojována s představou imunologické paměti. Existuje domněnka, že zvláštní mikroprostředí, umožňující B buňkám hypermutaci V genu k expresi protilátek s vysoce afinitními receptory a pozměněným rozdělením isotypu.

vytvářej i podstoupit protilátky anti-Vi byly Obrázcích 4a,b definují

Ke zjištění, zda Vi-specifické B buňky, indukované konjugáty Vi-peptid, podstupují tento maturační proces, byla srovnávána specifičnost protilátek anti-Vi, indukovaných Vi v přírodní a v konjugované formě. Čtyři až pět myších samic kmene BALB/c bylo podkožně imunisováno antigeny Vi, Vi-Pep II a Vi-Pep278h v IFA, přičemž každý z nich obsahoval 2,5 μg Vi (samotného nebo jak konjugát). Zvířatům byla 12 dnů po druhé aplikaci odebrána krev a stanoveny testem ELISA. Údaje v jednotlivé myši, representující každou ze skupin. Destičky ELISA byly pokryty 2,5 μg Vi/jamku (4a) nebo 1,25 μg Vi/jamku (4b); Obrázek 4a ukazuje, že titry specifických protilátek anti Vi, indukovaných samotným Vi, jsou nižší než po indukci Vi-Pep278. Snížení množství antigenu, pokrývajícího destičku ELISA, poskytlo ještě jasnější obraz. Protilátky vůči Vi, indukované konjugáty Vi-peptid, rozeznávají na signifikantních úrovních snížené množství Vi, zatímco séra myší, .imunisovaných přírodním Vi, sotva vykazují nějakou vazbu.

K dalšímu potvrzení toho, že konjugáty Vi-peptid vykazují charakteristiky typu T-dep, bylo stanoveno rozdělení isotypů protilátek anti-Vi u myší, imunisovaných, jak bylo výše uvedeno, pomocí Vi samotného nebo Vi-Pep278h.

Rozložení IgM a IgG u protilátek anti-Vi imunisovaných myší bylo stanoveno metodou ELISA. K detekci specifických protilátek IgM, rozpoznávajících Vi, byl použit kozí anti-myší Fab₂ IgM peroxidasový konjugát (Obrázek 5a) a specifické protilátky IgG byly stanoveny za použití konjugátu kozího anti-myšího Fab₂ IgG a alkalické fosfatasy (Obr. 5b). Výsledky jsou udány pro jednotlivé myši.

Isotypová specifita anti-Vi séra, získaného po opakované imunisaci, je znázorněna na Obrázcích 5. Protilátky vůči přírodní molekule Vi se zdají být omezeny hlavně na třídu IgM, zatímco konjugát Vi-Pep278 kromě toho vyvolal i čistou odpověď protilátek IgG vůči antigenů Vi. To ukazuje, že výsledkem spojení vybraného T-buněčného epitopu (v tomto případě peptidu 278h) s antigenem typu T-ind, jako je Vi, je přesmyk isotypové třídy Vi-specifické populace B buněk, obvykle pozorovaný u anigenů T-dep.

Pro udržení dlouhodobé produkce protilátek anti-Vi byla zvířata imunisována potřetí a specifická imunitní odpověď byla sledovány v průběhu 72 dnů. Skupinám 4 až 5 myších samic kmene BALB/c byly podkožně injikovány antigeny Vi samotný, Vi-Pep II a Vi-Pep278h v IFA v časových intervalech, uvedených na Obrázcích 6. Imunitní odpověď byla sledována v období 108 dnů (72 dnů po poslední imunisaci) stanovením hladiny protilátek vůči Vi v různých sérech testem ELISA. Získané výsledky jsou vyjádřeny jako geometrické průměry a jsou uvedeny pro zředění séra 1:100 a 1:1000 (Obrázky 6a a 6b). Po této dodatečné aplikaci Vi-peptidových konjugátů Vi-Pep II a Vi-Pep278h nelze pozorovat žádný zesilující účinek.

indukované konjugáty, byly samotným Vi, k jejich poklesu nedošlo po 2,5 měsících (Obr. 6a,b) a dokonce ani po 6 měsících (údaje neuváděny) po poslední injikači.

Hladiny anti-Vi vyšší než hladiny, protilátek, indukované

2.2.4. Vliv způsobu podání adjuvantní látky a typu imunisace na tvorbu anti-Vi protilátek, indukovanou Vi-Pep

II. K testování účinku adjuvantní látky na tvorbu Vi-specifických protilátek, vyvolanou přírodním a modifikovaným Vi, byly antigeny podávány podkožně buď v IFA, nebo v PBS. Konjugát Vi-Pep II byl připraven v IFA i v PBS. Jedné skupině 4 myší byl každý z antigenových přípravků (2,5 Vi aplikovaného na myš) injikován podkožně (část A) a druhé skupině nitrosvalově (část B). Séra byla získána 12 (Obrázek 7a) a 24 dnů (Obrázek 7b) po první imunisací a 12 dnů po druhé imunisací (Obr.7 c). Protilátky anti-Vi byly měřeny v testu ELISA, což je znázorněno jako A₄₀₅ a pomocí průměrů ±SD. Výsledky uvedené v A částech obrázků ukazují, že IFA je nezbytné k vyjádření kinetiky imunitní odpovědi typu T-dep.

Změna způsobu imunisace podáním Vi nitrosvalově (im) dokládá dvě skutečnosti (jak je znázorněno na Obrázcích 7 v části B). Za prvé, nitrosvalová aplikace Vi-konjugátů vede k vyšší primární imunitní odpovědi vůči Vi než v případě podkožního podání týchž antigenních prostředků. Za druhé, tento způsob aplikace nevyvolává zesilovací účinek, který byl pozorován u podkožní aplikace. Stejná tendence byla pozorována i po aplikaci Vi-Pep II v PBS, jak podkožní, tak nitrosvalově (Obr. 7a-c).

V dalších pokusech na myších, imunisovaných konjugátem Vi-278h v IFA, PBS nebo CFA (kompletní Freundovo adjuvans) byly s těmito třemi adjuvantními látkami získány srovnatelné titry protilátek anti-Vi (údaje nejsou uváděny).

2.2.5. Tvorba protilátek anti-Vi, indukovaná volným peptidem II, smíšeným s Vi před imunisací. Ke zhodnocení nezbytnosti kovalentního navázání Vi na peptidové epitopy před imunisací byly Vi a Pep II fysikálně smíseny, v IFA podkožně aplikovány skupině myších samic BALB/c a srovnány s imunisací konjugátem Vi-Pep II. Oba antigenní prostředky byly skupině 4 myší aplikovány podkožně v IFA (směs Pep II a Vi byla injikována v jedné stříkačce). Krev byla odebrána 12 a 24 dnů po první (Obr. 8a,b) a 12 dnů po druhé imunisaci (Obr. 8c). Protilátky anti-Vi byly stanoveny pomocí testu ELISA a výsledky jsou udány jako A₄₀₅. Každá křivka představuje geometrické průměry ± SD.

Jak je znázorněno na Obrázcích 8, smísení Vi a peptidů II poskytlo přesně stejnou imunitní odpověď, jaká byla zaznamenána i v případě konjugátu Vi-Pep II. První imunisace vyvolala pouze nižší hladiny protilátek vůči Vi, zatímco opakovaná aplikace měla jasný zesilující účinek.

2.2.6. Účinek nosiče jako primeru na tvorbu protilátek anti-Vi. Ke zjištění účinku primeru v podobě volného peptidů na odpověď vůči polysacharidu, indukovanou konjugáty Vi-peptid, byl skupině 4 myších samic BALB/c jako primer podkožně podán peptid II v IFA v množství 1 μg na zvíře. Po dvou týdnech byl zvířatům aplikován konjugát Vi-Pep II, obsahující 2,5 ^g Vi. Séra byla získána v časových intervalech, uvedených v Obrázku 9 a byla analysována pomocí testu ELISA. Hladiny anti-polysacharidových protilátek, měřené v naznačených časových bodech, jsou znázorněny na Obrázku 9. Primování dávkou 1 μg peptidů II na myš mělo za následek silnější primární imunitní odpověď vůči Vi ve srovnání s hladinou protilátek, indukovanou u zvířat bez použití primeru. Nicméně nebyl pozorován žádný účinek primování, který by se týkal sekundární imunitní odpovědi.

2.2.7. Imunitní odpověď anti-Vi může být u stejné jednotlivé myši indukována pomocí Vi-Pep278h, ne však Vi-Pep277(S). Skupině myších samic BALB/c byl podkožně aplikován konjugát Vi-Pep277(S) v IFA v dvoutýdenním intervalu (množství Vi v konjugátu, aplikovaném každé myši, činilo 2,5 μg). Imunitní odpověď anti-Vi byla stanovována 12 dní po první a 12 dní po druhé aplikaci pomocí testu ELISA

Vi-Pep2777(S), antigen Vi-Pep277(S)), antigen Vi-Pep277(S)), antigen D (Obrázky 10a,b, části A a B). Dvěma z těchto zvířat byl poté aplikován Vi-Pep278h, druhým dvěma pak samotný Vi (2,5 μ9 Vi samotného nebo v konjugátu). Myším byla opět odebrána krev 12 dnů po první a druhé imunisaci a byly stanoveny hladiny protilátek vůči Vi. Pro srovnání byla do stejného obrázku zanesena imunitní odpověď, indukovaná u zvířat, kterým byl aplikován pouze Vi-Pep278h. Výsledky vyjádřené jako A₄₀₅ jsou předkládány při dvou odlišných zředění séra, 1:50 (Obrázek 10 a) a 1:100 (Obrázek 10 b). Údaje vyjadřují geometrické průměry ± SD. Antigen A =

B = Vi-Pep278h (po aplikaci C = Vi samotný (po aplikaci = Vi-Pep278h.

Jak je znázorněno na Obrázcích 10, imunisace myších samic BALB/c prostřednictvím Vi-Pep277(S) nevyvolala měřitelnou protilátkovou odpověď anti-Vi (antigen A). K ověření, zda neodpovídavost může být vlastností jednotlivých myší nebo charakteristikou, vlastní specifickému konjugátu, byly stejné myši, které nereagovaly na podání Vi-Pep277(S), imunisovány prostřednictvím Vi-Pep278h (antigen B) nebo přírodním Vi (antigen C). Nová aplikace Vi-Pep278h by mohla definitivně zvýšit hladiny protilátek anti-Vi, jak bylo ukázáno u myší, kterým byl aplikován pouze Vi-Pep278h (antigen D). Nová aplikace Vi samotného rovněž zvýšila imunitní odpověď vůči Vi, jakkoli v menším rozsahu než po indukci Vi-konjugátem.

2.2.8. Rozpoznání konjugátů Vi-peptid různými anti-Vi séry. Vi a Vi-peptidové konjugáty Vi-Pep II, Vi-Pep II*, Vi-Pep278h a VÍ-CRP77-83 byly použity jako imunogeny, pokrývající destičky ELISA a testované na rozpoznání séry, získanými od zvířat, imunisovaných odpovídajícími konjugáty nebo séry, získanými od zvířat imunisovaných jinými Vi-konjugáty. Množství navázaných protilátek bylo stanovováno pomocí testu ELISA a je znázorněno na Obrázcích imunisovány samotným Vi nebo konjugáty Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-277(S), Vi-SRes (Vi-SerRes). 5 myší ve skupině každého z kmenů BALB/c, (Obr. 12a - e) obdrželo obsaženého v konjugátech, emulsifikovaných IFA. Po

BALB/k, BALB/b, NOD a NON.NOD podkožně (sc) injekci 2 μg Vi které jsou uvedeny na obrázcích, 4 týdnech byla myším aplikována povzbuzující injekce stejné dávky antigenů a 12 dní poté jim byla odebrána krev. V sérech jednotlivých myší byly testovány protilátky vůči Vi pomocí testu ELISA. Hladiny specifických protilátek jsou na Obrázcích 12 znázorněny v procentech standardního anti-Vi séra (Burro 260). Výsledky v Obr. 12 ukazují, že reakce konjugátu Vi-278h, stejně jako Vi-278m, není ohraničena na určité HHS omezení. Peptidy indukují zvýšené titry protilátek vůči cukerné částici konjugátu jak u BALB/c, tak i u BALB/k myší. Naproti tomu, myši BALB/b nereagovaly na žádný z podaných konjugátů. Dva ze tří genotypů HHS tedy byly schopné odpovědi.

NOD a NON.NOD myši, sdílející stejné HHS geny (H-2^N0D), vykázaly rozdílný model imunologické reaktivity vůči konjugátům Vi-peptid. Pouze mykobakteriální homolog 278mt byl schopný poskytovat Vi-specifický pomocný účinek.

2.2.10. Rozdělení IgG isotypů anti-Vi séra. 5 myší BALB/c na skupinu bylo podkožně imunisováno 2 μg Vi samotného nebo konjugátem Vi-278h, emulsifikovaného v IFA. Po čtyřech týdnech byla myším aplikována zesilující injekce stejné dávky antigenů a po 12 dnech jim byla odebrána krev. V jednotlivých vzorcích séra byly analysovány antipolysacharidové protilátky IgG za použití biotinylovaného králičího anti-myšího antiséra, specifického vůči podtřídám, a za použití se streptavidinem konjugované alkalické fosfatázy v testu ELISA. Hladiny protilátek vůči Vi jsou vyjádřeny jako ^a405·

Zkoumání rozdělení podtříd myších protilátek,

- 36 imunisovány samotným Vi nebo konjugáty Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt, Vi-277(S), Vi-SRes (Vi-SerRes). 5 myší ve skupině každého z kmenů BALB/c, (Obr. 12a - e) obdrželo obsaženého v konjugátech, emulsifikovaných IFA. Po

BALB/k, BALB/b, NOD a NON.NOD podkožně (sc) injekci 2 Vi které jsou uvedeny na obrázcích, 4 týdnech byla myším aplikována povzbuzující injekce stejné dávky antigenu a 12 dní poté jim byla odebrána krev. V sérech jednotlivých myší byly testovány protilátky vůči Vi pomocí testu ELISA. Hladiny specifických protilátek jsou na Obrázcích 12 znázorněny v procentech standardního anti-Vi séra (Burro 260). Výsledky v Obr. 12 ukazují, že reakce konjugátu Vi-278h, stejně jako Vi-278m, není ohraničena na určité HHS omezení. Peptidy indukují zvýšené titry protilátek vůči cukerné částici konjugátu jak u BALB/c, tak i u BALB/k myší. Naproti tomu, myši BALB/b nereagovaly na žádný z podaných konjugátů. Dva ze tří genotypů HHS tedy byly schopné odpovědi.

NOD a NON.NOD myši, sdílející stejné HHS geny (H-2^nod), vykázaly rozdílný model imunologické reaktivity vůči konjugátům Vi-peptid. Pouze mykobakteriální homolog 278mt byl schopný poskytovat Vi-specifický pomocný účinek.

2.2.10. Rozdělení IgG isotypů anti-Vi séra. 5 myší BALB/c na skupinu bylo podkožně imunisováno 2 μg Vi samotného nebo konjugátem Vi-278h, emulsifikovaného v IFA. Po čtyřech týdnech byla myším aplikována zesilující injekce stejné dávky antigenu a po 12 dnech jim byla odebrána krev. V jednotlivých vzorcích séra byly analysovány antipolysacharidové protilátky IgG za použití biotinylovaného králičího anti-myšího antiséra, specifického vůči podtřídám, a za použití se streptavidinem konjugované alkalické fosfatázy v testu ELISA. Hladiny protilátek vůči Vi jsou vyjádřeny jako ^A405·

Zkoumání rozdělení podtříd myších protilátek, působících vůči bakteriálnímu uhlovodíku, přineslo překvapující zjištění, že samotné uhlovodíky stimulují odpovědi IgG, omezené převážně na nezvyklou podtřídu IgG3. Nosičové bílkoviny jako BSA nebo tetanový toxoid, spojené s bakteriálními kapsulárními polysacharidy, mají sklon u myší indukovat protilátky Vůči cukru o převládajícím isotypu IgGl.

Pro zjištění účinku peptidu 278h, konjugovaného s Vi, bylo určeno rozdělení podtříd IgG v anti-Vi sérech. Jak je znázorněno na Obrázcích 13a-c, Vi podávaný samostatně vyvolal u myší imunitní odpověď, omezenou zejména na podtřídu IgG3, zatímco konjugát peptidu a cukru Vi-278h posunul rozdělení podtříd jasně k převaze IgGl.

Spojení peptidu hsp65 s antigenem typu T-ind se tedy zdá být schopné indukce značných kvalitativních změn imunitní odpovědi, zacílené vůči části T-ind komplexu.

Příklad 3

3.1. Antigenita konjugátů Vi fragmentu a peptidu. Imunogenita polysacharidů, včetně antigenu Vi, je ve vztahu k jejich molekulárním rozměrům. Vi-fragmenty (přibližně 45 kDa), připravené štěpením ultrazvukem, které vytváří srovnatelně homogení polysacharid a nezmění strukturu jeho monomerních jednotek, jsou méně imunogenní než přírodní Vi (přibližně 3 x 10³ kDa) (Szu se spoluautory, 1988). Pěti myším BALB/c ve skupině byly podkožně aplikovány 2 μΐ Vi fragmentů buď samotných, nebo ve formě konjugátu s peptidem 278h, emulsifikovaného v IFA. Po 12 dnech byly shromážděny vzorky zvýšeného séra a byla v nich testována přítomnost protilátek vůči Vi-fragmentu. Hladiny specifických protilátek jsou vyjádřeny v procentech standardního anti-Vi séra.

Obrázku 14, imunisace myší BALB/c samotných Vi-fragmentů nevyvolala anti-Vi. Naproti tomu Vi-fragmenty, 278h, prokázaly zvýšenou antigennost, titry protilátek anti-Vi.

Jak je zřejmé z prostřednictvím 2 pg žádnou imunitní odpověď konjugované s peptidem vyvolávající významné

Příklad 4

4.1. Antigenita Vi, konjugovaného s homology peptidu 278h. Pro určení, zda peptidy, odvozené od hsp65, představující vlastní i cizí epitopy, mohou u myší sloužit jako T-buněčné nosiče antigenů typu T-ind, autoři synthetisovali peptidy 278m a 278mt, odpovídající myší a mykobakteriální variantě lidské sekvence 278 (viz Tabulka 1) a konjugovali je s Vi. Čtyřem myším BALB/c byly podkožně aplikovány 2 pg Vi samotného nebo ve Vi-278h, Vi-278m, Vi-278mt a Vi-SerRes konjugátu, emulsifilovaného v IFA. 12 dní po zvýšení byla myším odebrána krev a v sérech byly testovány pomocí testu ELISA protilátky vůči Vi. Hladiny specifických protilátek jsou vyjádřeny v procentech standardního anti-Vi séra.

Obrázek 15 jasně ukazuje, že vlastní epitop, představovaný homologem myší 278m, může zvyšovat imunitní odpověď na T-ind antigen Vi, aplikovaný myším BALB/c. Mykobakteriální epitop 278 nevykázal u myší BALB/c žádé pomocné působení, ale byl jediným testovaným peptidem, který fungoval jako T-buněčný nosič u NOD i u NON.NOD myší (Obr.

12) .

Příklad 5

5.1. Schopnost peptidu 278h působit jako T-buněčný nosič pro D-isomery synthetických, náhodně větvených polypeptidů. Je známo, že synthetické polymery, složené z

D-isomerů aminokyselin, patří do skupiny antigenů typu

T-ind. Aby zjistili, zda peptidy, odvozené od hsp65, mohou fungovat jako T-buněčné nosiče také u této skupiny antigenů, zkoumali autoři imunitní odpověď vůči konjugátům hsp65 peptidů 278h či 348h a synthetického polypeptidů poly(Phe,Glu)-poly(Pro)-poly(Lys) (FEPK) u myší BALB/c. Tři myši BALB/c byly podkožně imunisovány polypeptidem FEPK, samotným nebo konjugovaným s peptidem 278h či 348h, emulsifikovaným v IFA. 10 dní po zesilovací aplikaci téhož antigenního přípravku byly odebrány vzorky séra jednotlivých myší a byly v nich testovány specifické protilátky vůči FEPK pozměněným testem ELISA. Destičky byly pokryty 2,5 μg FEPK a inkubovány přes noc při 4'C. Další postup byl prováděn podle popisu v oddíle Použité látky a Metody. Výsledky jsou vyjádřeny jako optická hustota 405 (OD₄₀₅).

Srovnání imunitní odpovědi IgGl, vyvolané samotným polypeptidem, s odpovědí indukovanou polypeptidem, konjugovaným s peptidem 278h, prokázalo vyšší imunogennost konjugátu. Kontrolní peptid 348h neměl žádný pomocný účinek, který by se shodoval s výsledky, získanými po připojení tohoto peptidů na polysacharid Vi (Obrázek 16). Peptid 278 tedy může sloužit jako T-buněčný nosič nejen pro cukerné antigeny, nezávislé na T buňkách, ale také pro synthetické polypeptidy, složené z aminokyselin.

Předchozí pokusy poskytují důkaz, že Vi-peptidové konjugáty podle vynálezu jsou schopné vyvolat pomocný účinek T lymfocytů, jehož výsledkem je imunitní odpověď, charakteristická pro antigeny závislé na T buňkách. Tento důkaz lze shrnout následovně:

(i) Imunogenita Vi se zvýšila, když byl předkládán jako konjugát, spojený še specifickými peptidy; tento účinek možná nezávisí na kovalentní vazbě, neboť prosté smísení těchto dvou látek vyvolalo podobnou imunitní odpověď.

(ii) Imunogenita Vi složky konjugátu může být ve vztahu k totožnosti peptidu, vázaného na polysacharid. Peptidy podle vynálezu Pep II a Pep278h zvyšují imunogenitu Vi, zatímco kontrolní peptidy 348h, 277(S) a CRP 77-83 neindukují anti-Vi odpověď v séru.

(iii) Opakovaná aplikace Vi-peptidových konjugátů indukuje zvýšení hladiny protilátek anti-Vi (zesilující účinek).

(iv) Protilátky anti-Vi, indukované Vi-peptidovými konjugáty, mají pravděpodobně vyšší antigenní specifitu než protilátky, indukované samotným Vi a jsou představovány hlavně isotypem IgG.

(v) Peptidové primování, indukované Peptidem II, vyvolává zvýšenou odpověď protilátek anti-Vi v séru na počáteční imunisaci odpovídajícím Vi-peptidovým konjugátem.

(vi) Jak podání antigenu podkožně, tak i použití IFA se zdá být nezbytné pro indukci anti-Vi imunitní odpovědi, charakteristické pro antigeny T-dep.

Všechny předchozí výsledky, získané za použití lidského Pep278h, byly zopakovány za použití varianty myší Pep278 sekvence, lišící se od lidského Pep278h nahrazením A pomocí T v poloze 471. Přes skutečnost, že Pep278m je pro myši vlastním epitopem, působí jako T-buněčný nosič, zvyšující imunogenitu Vi. Myší odpověď na myší i lidské sekvence, které jsou vlastní a téměř-vlastní, tedy ukazuje, že lidé budou odpovídat na lidskou’ sekvenci stejným způsobem, jakým myši odpovídají na myší sekvence.

Všechny tyto údaje ukazují, že složka Vi konjugátu polysacharidů s peptidem byla přeměněna z imunogenu nezávislého na thymu na imunogen na thymu závislý (thymic-dependent)

Je neobvyklé, že peptidy, odvozené od lidské hsp65, mohou být použity ke zvýšení imunogenity slabě imunogenních antigenních molekul; jednak proto, že jako vlastní bílkovina není lidská hsp6 5 považována za imunogenní u lidí a za druhé z toho důvodu, že bylo dříve prokázáno, že peptidy, pocházející z lidské sekvence, jako je Pep278, indukci tolerance nebo regulaci snížení odpovědi (WO 90/10449).

neovlivňuj í autoimunitní

Zastupuje:

ODKAZY NA LITERATURU

Avery, O.T. a Goebel, W.F., J. Exp. Med. 50 , 533-550, 1929 .

Barrios, C., se	spoluautory,	Eur.	J.	Immunol.	22 ,
1365-1372, 1992.
Brett, S. J., se	spoluautory,	Eur.	J.	Immunol.	19,

1303-1310, 1989.

Cohen, I. R. a Young, 105-110, 1991.	D.B., Immunol.	Today	12,
Cox se spoluautory, Eur. 1988.	J. Immunol.	18,	2015-2019,
Elias D., se spoluautory, 87, 1576-1580, 1990.	Proč. Nati.	Acad	. Sci. USA
Elias D., se spoluautory, 88 , 3088-3091, 1991.	Proč. Nati.	Acad	. Sci. USA
Lamb, J.R., se spoluautory, EBBO Journal	6,	1245

-1249, 1987.

Lussow, A.R., se spoluautory, Immunol. Letters 25, 255-263, 1990.

Lussow, A.R., se spoluautory, Eur, J. Immunol. 21, 2297-2302, 1991.

Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154,

1963.

Munk, Μ. Ε., se spoluautory, Eur. J. Immunol. 18. 1835-1838, 1988.

Munk, M.E., se spoluautory, J. Immunol. 143, 2844 -2849, 1989.

Pearson, C.M., Arthritis Rheum.7, 80-86, 1964.

Szu, S.C., se spoluautory, Infect. Immun. 57, 3823

-3827, 1989.

Verbon, A., se spoluautory, Clin. Exp. Immun. 86, 6-11, 1991.

Young, D., se spoluautory, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 4267-4270, 1988.

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče, tvořícího T-bunščný epitop, odvozený od sekvence lidské hsp65, nebo jeho analogu, kterýžto peptid nebo analog je schopný podstatného zvýšení imunogenity málo imunogenního antigenů.
2. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1, vyznačující se t i m , že syntetický peptid nebo analog je kovalentně vázán na málo imunogenní antigen.
3. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1 či 2, vyznačující se tím, že málo imunogenním antigenem je peptid, bílkovina nebo polysacharid.
4. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle nároku 3, vyznačující se tím, že málo imunogenní peptid je odvozen od viru HIV nebo od malarického antigenů.
5. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle nároku 3, vyznačující se t i m, že málo imunogenní polysacharid je bakteriálním polysacharidem.
6. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1, vyznačující se t í m, že synthetický peptidový nosič, označený zde Pep278h, odpovídá polohám 458-474 lidské molekuly hsp65, maj ícím sekvenci:

458 474

NEDQKIGIEIIKRTLKI
7. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1, vyznačující se tím, že synthetický peptidový nosič, označený zde Pep278m, odpovídá polohám 458-474 lidské molekuly hsp65, u níž byl zbytek τ⁴⁷¹ nahražen zbytkem A⁴⁷¹.
8. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1, vyznačující se tím, že synthetický peptidový nosič, označený zde Pep278mt, má sekvenci:

EGDEATGANIVKVALEA
9. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že synthetický peptidový nosič, označený zde Pep II, odpovídá polohám 437-448 lidské molekuly hsp65, u níž byly dvě cysteinové částice v polohách 442 a 447 nahrazeny serinovýmt částicemi, a má sekvenci:

437 448 VLGGGSALLRSI
10. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1, vyznačující se tím, že synthetický peptidový nosič či analog je přímo vázán na molekulu málo imunogenního antigenu.
11. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 10, vyznačující se t í m, že molekulou málo imunogenního antigenu je bakteriální polysacharid.
12. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 11, vyznačující se tím, že bakteriálním polysacharidem je kapsulární polysacharid (CPS, capsular polysaccharide) Vi bakterie Salmonella typhi.
13. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 1, vyznačující se tím, že synthetický peptidový nosič nebo analog je vázán na molekulu málo imunogenního antigenu prostřednictvím raménka, zvoleného z -O-R-CO-, -NH-R-CO-, -NH-R-NH-, -O-R-NH- nebo -NH-R-CH₂, kde R je nasycený nebo nenasycený uhlovodíkový řetězec, volitelně substituovaný a/nebo přerušený jedním nebo více aromatickými radikály, anebo heteroatomy, zvolenými z N, O nebo S.
14. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 13,vyznačuj ící se tím, že R je alifatický uhlovodíkový řetězec, obsahující 3-16 atomů uhlíku.
15. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 14, vyznačující se t í m , že R je zbytek e-aminokapronové kyseliny.
16. Konjugát málo imunogenního antigenu a synthetického peptidového nosiče podle nároku 15, vyznačující se tím, že má vzorec

CO-NH-AC-CO-NH-Pep-COOH kde Ac je acetyl, AC je zbytek kyseliny e-aminokapronové, Pep je zbytek peptidového nosiče Pep278h či Pep II a cukerný zbytek představuje opakující se jednotku Vi kapsulárního polysacharidu bakterie Salmonella typhi.
17. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle kteréhokoli z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že je schopný vyvolávat pomocný účinek T lymfocytů, jehož výsledkem je imunitní odpověď, charakteristická pro antigeny závislé na T buňkách.
18. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle kteréhokoli z nároků 1 až 16, vyznačující se tím, že při opakované aplikaci vyvolává zesílenou odpověd, jejíž výsledkem je zvýšení hladiny protilátek vůči molekule slabě imunogenního antigenů.
19. Konjugát málo imunogenního antigenů a synthetického peptidového nosiče podle nároku 18, vyznačující se t i m, že indukuje protilátky převážně isotypu IgG.
20. Vakcina, obsahující konjugát podle nároku 1.
21. Způsob zvýšení imunogenity molekuly málo imunogenního antigenů, vyznačující se tím, že zahrnuje připojení takové molekuly na synthetický peptidový nosič, tvořící T-buněčný epitop, odvozený od sekvence lidské hsp65, nebo na jeho analog, kterýžto peptid nebo analog je schopný podstatně zvýšit imunogenitu molekuly málo imunogenního antigenů.
22. Způsob zvýšeni imunogenity molekuly málo imunogenního antigenů, vyznačující se tím, že zahrnuje její smísení se synthetickým peptidovým nosičem, tvořícím T-buněčný epitop, hsp65, nebo s jeho analogem, schopný podstatně zvýšit imunogenního antigenů.

odvozený od sekvence lidské kterýžto peptid nebo analog je imunogenitu molekuly málo
23. Způsob podle imunogenity bakteriálních nároku 21 nebo polysacharidů.

22 pro zvýšení
24. Způsob imuní jící se tím, že konjugátu podle nárok hostitele, vyznačurnuje podání účinného množství hostiteli.
25. Způsob iiřrmTisace savčího hostiteleý vyznačující se tím ,2^. zahrnuje scrůčasné podání účinných množství molekuly málo imuríbgenpílTo antigenů a synthetického peptidového nosiče, tvořícíhío^T-buněčný epitop, odvozený od sekvence lidské hsp65<nebo jehoa^ialogu, kterýžto peptid nebo analog je schopny podstatného zvýš^epí imunogenity málo imunogenního antigenů.