JP3365635B2 - キトサン誘導性免疫強化 - Google Patents

キトサン誘導性免疫強化

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Description

【発明の詳細な説明】 本出願は、現在係属中の米国特許出願番号第08/311,5
32号（1994年９月23日出願）の一部継続出願である。
発明の分野 本発明は、一般に、動物における免疫応答を強化する
ための方法、強化を達成する組成物、およびこの組成物
の製造方法に関する。より詳細には、本発明は、免疫応
答を強化するためのタンパク質／キトサン結合物または
タンパク質／キトサン懸濁液の使用を包含する方法、強
化を達成するタンパク質／キトサン結合物またはタンパ
ク質／キトサン懸濁液、およびタンパク質／キトサン結
合物またはタンパク質／キトサン懸濁液の調製方法を提
供する。
発明の背景 近年のバイオテクノロジーの進歩により、複合抗原中
の成分の同定が容易になり、このことにより、安全かつ
実用的なワクチンの開発の成功が期待される。しかし、
しばしば、これらの単離された選択成分は、それらが由
来した完全な複合抗原ほどには免疫原性でない。受容動
物における弱い抗原性の免疫原に対する免疫応答を高め
るために、免疫原とともにアジュバントが投与されるこ
とが多い。しかし、アジュバントは全般的に容認されて
いるとはいえ、ヒトでの使用に適したものの数は限られ
ている。
理想的には、アジュバントは、機能的に活性な抗体の
長期にわたる発現を強化し、細胞媒介性免疫（CMI）を
誘発し、そして侵入した抗原に対する高度の特異的免疫
反応性を有する記憶Ｔリンパ球およびＢリンパ球の産生
を増強すべきである。外部抗原を用いる即時抗原投与
（challenge）に際して防御を提供することに加えて、
これらの応答は、特定の抗原による宿主の任意の将来的
遭遇に対する防御を提供するはずである。より重要なこ
とは、最小限の有害な副作用で免疫応答を高めるアジュ
バントの能力である。従って、アジュバントの効力は、
アジュバントが正の影響（免疫の強化）および負の影響
（毒性）をどのようにバランスさせるかという見地から
説明される。
Ｂ細胞による抗体産生を刺激する目的のための制御さ
れた免疫化は、抗原自体および免疫される動物の両方に
固有の無数の因子に依存する。一般に、抗原またはその
源が侵入される宿主から進化論的にみて離れているほ
ど、その抗原によって誘発される免疫応答はより効果的
である。近縁種に由来する抗原は、宿主の免疫系が外来
抗原を内因性抗原または自己抗原から明確に識別できな
いという事実のために、抗体産生を誘発する能力がほと
んどない。さらに、抗原の投与量、抗原の純度、および
抗原の投与頻度もまだ、得られる抗体力価および得られ
る抗体の特異性に顕著に寄与する要因である。さらに他
の要因としては、抗原の形態、または複合度（complexi
ty）、および抗原の投与方法があげられる。最後に、免
疫される動物の遺伝的体質および全身的な生理学的状態
が、免疫応答が発動される大きさに寄与する。これらの
要因の中で、抗原の形態または複合度は、アジュバント
を用いる免疫化により直接影響される。
現在の理解では、アジュバントは種々の異なる機構で
免疫応答を増強するように作用すると示唆されている。
１つの機構においては、アジュバントは、TH1またはTH2
と呼ばれるCD4+ヘルパーＴ細胞サブ集団のいずれか１つ
を直接刺激する［MosmannおよびCoffman,Ann.Rev.Immun
ol.7:145−173（1989）］。ヘルパーＴ細胞は、ほとん
どの抗原に対するＢ細胞抗体応答のために必要とされ
る。適切な免疫応答において、抗原は捕捉され、そして
抗原提示細胞（APC）、例えば、循環マクロファージま
たは組織マクロファージによってプロセスされ、そして
APC表面上にクラスII主要組織適合（MHC）分子と会合し
て提示される。この形態で、抗原はヘルパーＴ細胞の表
面上のレセプターと相互作用し得、その結果、細胞の特
定のサブ集団を活性化して、多くのサイトカインのうち
のどれかを発現および分泌する。サイトカイン産生の性
質は、アジュバントの選択によってある程度調節され得
る結果である、活性化ヘルパーＴ細胞のサブセットに依
存する。例えば、アルミニウム塩であるミョウバンアジ
ュバントは、ヒトにおける臨床的使用が認められてお
り、マウスにおいてTH2細胞を選択的に活性化すること
が報告されている［GrunおよびMaurer、Cell.Immunol.1
21:134−145（1989）］。他方、ミコバクテリア死菌を
含む鉱物油の乳濁液であるフロイント完全アジュバント
（FCA）［Freundら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.37:509（1
937）］は、マウスTH1細胞を優先的に活性化する［Grun
およびMaurer、Cell.Immunol.121:134−145（198
9）］。
免疫応答が増強される別の機構は、例えばグラム陰性
細菌由来のリポ多糖（LPS）によるＢ細胞の直接刺激を
伴う［Geryら、J.Immunol.108:1088（1972）］。LPSは
また、インターフェロンγ（INF−γ）の分泌を刺激す
ることが示されている［TomaiおよびJohnson、J.Biol.R
esp.Med.8:625−643（1989）］。これは、TH2細胞の増
殖の阻害とTH1細胞の分化の刺激の両方を行う［Gajewsk
iら、J.Immunol.143:15−22（1989）;Gajewskiら、J.Im
munol.146:1750−1758（1991）］。従って、LPSが免疫
応答を強化する機構は、Ｂ細胞の直接的な刺激、および
TH1細胞集団とTH2細胞集団の両方の間接的な調節によ
る。
さらに他の免疫強化の様式が他のアジュバントについ
て報告されている。油乳濁液（すなわち、フロイント完
全アジュバント［FCA］、フロイント不完全アジュバン
ト［FIA］）およびリポソームは、ミョウバンと同様に
貯蔵所（depot）の形成により作用し、そのため抗原を
遅延放出（slow relase）させる。抗原の遅延放出は、
抗原の免疫系への曝露を延長することができ、そしてま
た、一度に投与すると、通常は抗体形成に対して効果の
ない用量の抗原での初期免疫化を可能とする。抗原の初
期用量が高いと高い即時力価の抗体が産生されるが、時
間の関数としての抗体力価の増大と抗体特異性の増大
は、抗原をより低用量かつより高頻度投与の抗原で観察
される程には大きくないことが、既に報告されている
［Siskind,G.,Pharm.Rev.25:319−324（1973）］。従っ
て、免疫系に対する抗原の提示を制御するアジュバント
は、抗原の形態または複合度を変化させることに加え
て、抗原用量を調節する。
現在までに、唯一のアジュバント、ミョウバン［ALK
（SO4）２・H2O］が、ヒトにおいて使用できるに十分非
毒性であることが証明されている。ミョウバンは、免疫
化に続くTH2細胞活性化、抗原の貯蔵所形成、および抗
原の遅延放出［Edelman,Rev.Infect.Dis.2:370−383（1
980）;Warrenら、Ann.Rev.Immunol.4:369−388（198
6）］を通じてのみならず、免疫能力のある細胞を引き
つけることによる肉芽腫形成［Whiteら、J.Exp.Med.10
2:73−82（1955）］、および補体の活性化［Ramanathan
ら、Immunol.37:881−888（1979）］を通じてもまた作
用する。しかし、ミョウバンは、紅斑、皮下結節、接触
過敏症、および肉芽腫性炎症を包含するその負の副作用
を伴わないわけではない。ヒトへの適用以外には広く用
いられている他のアジュバントもまた、ヒトにおいて使
用するための許容できる代替物を開発するための継続的
な研究の焦点となっている。これに含まれるものには、
上記油乳濁液（すなわちFCAおよびFIA）、細菌産物（す
なわち、LPS、コレラ毒素、ミコバクテリア成分、およ
び完全死滅Corynebacterium parvum、Corynebacterium
granulosum、およびBordetella pertussis、リポソー
ム、免疫刺激複合体（ISCOM）、および他の細菌源から
の天然由来および誘導体化された多糖類）が挙げられ
る。
多糖類の免疫強化能は、これらの化合物が、（例え
ば、細菌の細胞壁の構造成分、ならびに昆虫および甲殻
類の外骨格として）広く天然に存在するので、過去数年
来の研究の焦点である。リポ多糖（LPS）のアジュバン
ト特性は主として分子のリピドＡ領域由来であり、そし
て分子のｏ−特異的多糖またはコアオリゴ糖領域由来で
はないとしても、ある種のグラム陰性細菌から単離され
るLPSはそのような多糖の１つである。LPSは、体液性免
疫［Johnsonら、J.Exp.Med.103:225−246（1956）］お
よび細胞媒介性免疫［Ohtaら、Immunobiology 53:827
（1984）］の両方を増強し、多くの生物学的活性を有す
るが、Guptaら、Vaccine 11:291−306（1993）によって
総説されているように、その固有の毒性のためにヒトに
使用するには実用的ではない。従って、とりわけキトサ
ンを含む他の多糖類が注目された。
キトサン［β−（１−４）−２−アミノ−２−デオキ
シ−Ｄ−グルカン］は、キチンの誘導体であり、そして
一部にはそのリゾチームによる生分解性およびヒトにお
ける低毒性のため、生物医学用途に広く使用されてい
る。これらの同じ特性のため、免疫強化剤としてのキト
サンに関心が高まっている。例えば、Matuhashiらは、
米国特許第4,372,883号においてキトサンを含む可溶性
の多糖類の通常の毒性抗原への結合体（それによって抗
原を解毒し、そして免疫原としての使用を可能にする結
合体）を開示した。しかし、Matuhashiらは、キトサン
の不溶性形態の使用を述べておらず、またMatuhashi
は、得られる血清抗体力価を他の既知のアジュバントに
よる免疫化から得られる血清抗体力価と比較してもいな
い。
同様に、Suzukiらは、米国特許第4,971,956号におい
て、細菌感染および真菌感染の処置ならびに腫瘍の処置
のための治療薬としての水溶性キトサンオリゴマーの使
用を開示した。Suzukiらは、キトサンを修飾して適切な
水溶性形態を生成することの困難さについて議論し、水
不溶性形態は治療用途に実用的ではないことを開示し
た。さらに、Suzukiらは、抗原のキトサンへの結合が増
強された免疫応答を達成することを開示していない。
Mituhashiらは、米国特許第4,814,169号において、非
ヒト動物におけるヒトタンパク質に対する抗体の産生の
ために、キトサンを包含する可溶性多糖類に結合したヒ
トタンパク質の使用を開示した。ヒトタンパク質／多糖
溶液の投与は、静脈内、腹腔内または皮下注射によって
行われた。経口投与および直腸投与を包含する他の経路
は、この開示の中で述べられていなかった。
Nishimuraら［Vaccine 2:93−99（1984）］は、キチ
ン誘導体の免疫学的特性を、インビボでの腹腔マクロフ
ァージの活性化、マウスにおける腫瘍増殖の抑制、およ
び細菌感染に対する防御の見地から報告した。結果は、
キチンおよびキトサンの両方とも、腫瘍細胞または細菌
による抗原投与に対する宿主の耐性の有効な刺激剤では
なかったが、キトサンは細胞傷害性マクロファージを中
程度に誘導することを示唆した。水性環境中でゲルを形
成する修飾された脱アセチル化キトサンによる結果は、
マクロファージをより効果的に活性化し、腫瘍増殖を抑
制し、そして細菌感染に対する耐性を刺激することを示
した。
Marcinkiewiczら［Arch.Immunol.Ther.Exp.39:127−1
32（1991）］は、水不溶性キトサンの免疫アジュバント
活性を試験し、そしてＴ依存性体液性応答を顕著に増強
するが、Ｔ非依存性体液性応答を中程度に増強するのみ
であることを報告した。増強された体液性応答は、100m
g/kg用量で静脈内または腹腔内のいずれかで投与された
キトサンで検出された。皮下および経口投与は、効果的
ではないことが特に報告された。さらに、Marcinkiewic
zらは、抗原の不溶性キトサンへの結合を示唆せず、キ
トサンが「抗原と一緒でも抗原と別々のどちらでも、投
与部位とは関わりなく同様の応答を生じる」ことを述べ
た。
ヒトでの使用が認容されるアジュバントがたった１つ
しか存在しないという事実を考慮すると、ヒトにおける
潜在的な適用のための新規で毒性のいっそう低いアジュ
バントを提供する当該分野での必要性がある。改良され
たアジュバントは、より効果的なワクチンの生産を可能
とし、そして治療能力のあるモノクローナル抗体の生産
を向上させる。
発明の要旨 １つの局面において、本発明は免疫応答を強化する方
法を提供し、本方法は抗原をキトサンアジュバントに結
合させる工程およびタンパク質／キトサン結合物を動物
に投与する工程を包含する。この免疫応答は、IgM産生
からIgG産生への迅速なクラススイッチにより特徴付け
られる。本発明は、タンパク質、炭水化物、脂質、糖タ
ンパク質、あるいはそれらの組合わせの形態の抗原を包
含する抗原を含む。キトサンアジュバントは、可溶性ま
たは不溶性であり得る；不溶性アジュバントは、膠状あ
るいは粒子状（particulate）形態のいずれかである。
抗原の結合は、化学架橋、イオン性相互作用、物理的イ
ンターカレーション、疎水性相互作用、親水性相互作
用、あるいは共有結合性修飾により行われ得る。抗原を
アジュバントへ架橋させる好適な方法は、グルタルアル
デヒドの使用を介する。グルタルアルデヒドが架橋に用
いられる場合、得られる抗原／キトサン免疫原は、架橋
度に依存して粒子状あるいは膠状のいずれかであり得
る。抗原とキトサンとの比率は、1:100〜100:1の範囲で
あり得るが、好適には1:4〜1:10の範囲であり、全ての
比率はキトサンの湿重量に対する抗原の重量である。別
の好適な比率は10:1である。抗原は、粒子状のキトサン
アジュバントに、粒子の外表面上、粒子の内表面上、あ
るいは内外両方の結合物の組合わせで、結合され得る。
抗原／キトサン結合物は動物に、経口的に、鼻内に、膣
内に、直腸内に、あるいは、腹腔内、静脈内、または皮
下注射を介して投与され得る；投与は、単一経路あるい
は複数経路を包含し得る。抗原／キトサン結合物は、単
独で、あるいは多数の他のアジュバントのうちいずれか
を組合わせて投与され得る。免疫化は単回投与または複
数回投与を包含し得る。
別の局面において、本発明は、キトサンとキレート金
属イオンとの組合わせを包含するアジュバントを提供す
る。金属イオンは、例えば、鉄あるいは遷移金属（例え
ば、銅、ニッケル、または亜鉛）であり得る。
免疫原もまた提供され、本免疫原は、キレート化金属
イオンおよび抗原とともにキトサンを含む。抗原は、タ
ンパク質、炭水化物、脂質、糖タンパク質、あるいはこ
れらの組合わせを包含し得るが、これらに限定されな
い。タンパク質抗原は、天然に存在し得るかあるいは組
換え型であり得る。抗原は、共有結合により、アジュバ
ントに結合され得る。好適な共有結合はグルタルアルデ
ヒドを用いる架橋を介する。得られる架橋免疫原は、架
橋度に依存して、粒子状あるいは膠状であり得る。抗原
は、またイオン性相互作用によってアジュバントに結合
され得る。例えば、抗原がポリヒスチジン（ポリ−HI
S）アミノ酸配列を含有する組換え型タンパク質である
場合、ポリ−HIS領域はキレート化金属イオンと相互作
用し得る。抗原がタンパク質である場合、ポリ−HISア
ミノ酸配列は、カルボキシルまたはアミノ末端、あるい
はそのタンパク質の天然に存在する三次または四次構造
に顕著な変化を与えないタンパク質内部領域に配置され
得る。
アジュバント生成方法もまた提供され、本方法は、キ
トサン溶液を調整する工程、金属イオンをキトサンにキ
レート化し、金属／キトサン錯体を生成する工程、およ
び金属／キトサン錯体を単離する工程を包含する。金属
イオンを包含する方法が包含され、この金属イオンは、
鉄あるいは遷移金属（例えば、銅、亜鉛、またはニッケ
ル）であり得るが、これらに限定されない。
本発明はまた、免疫原を生成する方法を提供し、本方
法は、キトサン溶液を調製する工程、金属イオンをキト
サンにキレート化し、金属／キトサン錯体を生成する工
程、および抗原を金属／キトサン錯体と結合させる工程
を包含する。免疫原中の金属イオンは、鉄あるいは遷移
金属（例えば、銅、ニッケル、または亜鉛）を包含し得
るが、これらに限定されない。抗原は、タンパク質、炭
水化物、脂質、糖脂質、あるいはこれらの組合わせであ
り得るが、これらに限定されない。タンパク質抗原は、
天然に存在し得るかあるいは組換え型であり得る。抗原
は共有結合によりアジュバントに結合され得る。好適な
共有結合は架橋により行われる。架橋のための好適な薬
剤は、グルタルアルデヒドである。得られる架橋免疫原
は、架橋度に依存して粒子状あるいは膠状であり得る。
あるいは、抗原は、イオン性相互作用によってアジュバ
ントに結合され得る。好適なイオン性相互作用は、キレ
ート化金属イオンと相互作用するポリ−HISアミノ酸配
列を含有する組換え型タンパク質抗原を介して行われ
る。タンパク質抗原上のポリ−HIS配列は、タンパク質
のカルボキシルあるいはアミノ末端のいずれかに配置さ
れ得る。あるいは、ポリ−HIS領域は、天然に存在する
タンパク質の三次または四次構造に顕著な変化を与えな
いタンパク質内部領域に配置され得る。得られる免疫原
は投与され得る。
本発明により以下の工程を包含する、免疫原生成方法
もまた提供される。本方法は、キトサン溶液と調製する
工程、抗原をキトサンに結合し、抗原／キトサン複合体
を形成させる工程、および抗原／キトサン複合体に金属
イオンをキレート化する工程を包含する。免疫原中の金
属は、鉄あるいは遷移金属（例えば、銅、ニッケル、ま
たは亜鉛）であり得るが、これらに限定されない。好適
な方法において、抗原はキトサンに架橋を介して共有結
合される。架橋を行うための好適な薬剤は、グルタルア
ルデヒドである。抗原は、タンパク質、炭水化物、脂
質、糖タンパク質、あるいはこれらの組合わせであり得
るが、これらに限定されない。抗原がタンパク質である
場合、天然に存在するものかあるいは組換え型のいずれ
かであり得る。
別の局面として、本発明は免疫応答を強化する方法を
提供し、本方法は抗原とキトサン免疫強化剤とを混合す
る工程および懸濁液を動物に投与する工程を包含する。
この免疫応答は、IgM産生からIgG産生への迅速なクラス
スイッチにより特徴付けられる。抗原とキトサンとの比
率は、1:100〜100:1の範囲であり得るが、好適には10:1
〜1:10の範囲である。キトサンアジュバントは、可溶性
または不溶性であり得る；不溶性アジュバントは、粒子
状あるいは膠状形態のいずれかである。抗原／キトサン
懸濁液は動物に、経口的に、鼻内に、膣内に、直腸内
に、あるいは、腹腔内、静脈内、または皮下注射を介し
て投与され得る；投与は、単一経路あるいは複数経路を
包含し得る。抗原／キトサン混合物は、単独で、あるい
は他のアジュバントと組合わせて投与され得る。免疫化
は単回投与または複数回投与を包含し得る。
別の局面として、本発明は免疫応答を強化する方法を
提供し、本方法はキトサンおよびキレート化金属イオン
を含有するアジュバントを形成し、金属／キトサン錯体
を形成させる工程、抗原を金属／キトサン錯体と結合
し、免疫原を形成させる工程、および免疫原を動物に投
与する工程を包含する。免疫原の金属イオン成分は、鉄
あるいは遷移金属（例えば、銅、ニッケル、または亜
鉛）であり得るが、これらに限定されない。免疫原の抗
原成分は、タンパク質、炭水化物、脂質、あるいはこれ
らの組合わせであり得るが、これらに限定されない。抗
原とキトサンとの重量比は100:1〜1:100であり得る。好
適な比率は10:1であり、これは金属／キトサン錯体の湿
重量に対する抗原の重量により決定される。抗原は金属
／キトサン錯体に共有結合され得る；共有結合のための
好適な方法は架橋を介する。好適な架橋剤はグルタルア
ルデヒドであり、そして得られる架橋免疫原は架橋度に
依存して、粒子状あるいは膠状であり得る。あるいは、
抗原は、イオン性相互作用を介してアジュバントに結合
され得る。イオン性相互作用を用いる結合のための好適
な方法は、ポリ−HISアミノ酸配列を含有する組換えタ
ンパク質抗原を使用することによる。ポリ−HIS配列は
キレート化金属イオンと相互作用し得る。タンパク質の
ポリ−HIS領域は、そのタンパク質に対しカルボキシル
あるいはアミノ末端に存在させ得るか、あるいは、タン
パク質の天然に存在する三次または四次構造を顕著に変
化させることのないような様式で、タンパク質に対し内
部に存在させ得る。免疫原は動物に、経口的に、鼻内
に、膣内に、直腸内に、あるいは、腹腔内、静脈内、ま
たは皮下注射を介して投与され得る；投与は、単一経路
あるいは複数経路を包含し得る。免疫原懸濁液は、単独
で、あるいは他のアジュバントと組合わせて投与され得
る。免疫化は単回投与または複数回投与を包含し得る。
本発明の別の局面において、動物に投与された場合、
免疫応答を強化する組成物が提供され、本組成物は、タ
ンパク質とキトサンとの間の結合物を含有する。キトサ
ン成分は、可溶性あるいは不溶性であり得る；不溶性ア
ジュバントは、抗原がアジュバントに結合される方法に
依存して、その形態が膠状あるいは粒子状である。結合
は、化学架橋、イオン性相互作用、物理的インターカレ
ーション、あるいは共有結合を介して行われ得る。タン
パク質とキトサンとの比率は、1:100〜100:1の範囲であ
り得るが、好適には1:4〜1:10の範囲である。得られる
組成物は、経口的、鼻内、膣内、直腸内投与、あるい
は、腹腔内、静脈内、または皮下注射を介する投与に適
している。
本発明の別の局面において、動物に投与された場合、
免疫応答を強化する組成物が提供され、本組成物は、タ
ンパク質およびキトサンの懸濁液を含有する。タンパク
質とキトサンとの比率は、1:100〜100:1の範囲であり得
るが、好適には1:4〜1:10の範囲である。得られる組成
物は、経口的、鼻内、膣内、直腸内投与、あるいは、腹
腔内、静脈内、または皮下注射を介する投与に適してい
る。
本発明の別の局面において、免疫応答を強化する化合
物を調製するための方法が提供され、この方法におい
て、抗原はキトサンアジュバントに結合され、その後得
られる結合物は、動物に投与するために適している。結
合は、化学架橋、イオン性相互作用、物理的インターカ
レーション、疎水性相互作用、親水性相互作用、あるい
は共有結合により行われ得る。タンパク質とキトサンと
の比率は、1:100〜100:1の範囲であり得るが、好適には
1:4〜1:10の範囲である。
本発明の別の局面において、免疫応答を強化する化合
物を調製するための方法が提供され、ここで抗原は、キ
トサンアジュバントと混合されて懸濁液を形成し、この
懸濁液が、引き続き動物に投与され得る。タンパク質と
キトサンとの比率は1:100〜100:1の範囲であり得るが、
好適には1:4〜1:10の範囲である。
図面の説明 本発明の多数の他の局面および利点が、それについて
の引き続く説明の考慮に基づいて明らかとなり、図面に
対して以下の言及がなされる： 図１は、オボアルブミンおよび種々の市販されている
アジュバントを用いた免疫化７日後のマウス血清中のIg
Mの平均力価を比較したものである；そして 図２は、オボアルブミンおよび種々の市販されている
アジュバントを用いた免疫化７日後のマウス血清中のIg
Gの平均力価を比較したものである。
発明の詳細な説明 本発明は、タンパク質／キトサン結合物またはタンパ
ク質／キトサン懸濁液を利用する免疫強化方法、ならび
にこの結合物および／または懸濁液を調製するための方
法に関する以下の実施例により例示される。特に、実施
例１は、インターカレートした抗原を有するキトサン粒
子の調製に関する。実施例２では、キトサン粒子への抗
原の結合を扱う。実施例３は、一般的免疫化プロトコル
を記載する。実施例４は、血清抗体力価を決定するため
に全ての測定において利用した酵素免疫測定法（ELIS
A）に関する。実施例５は、他の頻繁に用いられるアジ
ュバントの免疫応答刺激能に対するキトサンの免疫応答
刺激能の比較分析を記載する。実施例６は、インビトロ
でのキトサンのマクロファージ刺激能を示す。実施例７
は、投与経路の機能としてのキトサンの免疫強化に関す
る。実施例８は、市販されているアジュバントの免疫応
答刺激能に対するキトサンの免疫応答刺激能の比較を提
供する。実施例９は、抗原／キトサン会合形態の機能と
してのキトサンの免疫強化を記載する。実施例10は、金
属／キトサン錯体アジュバントの調製に関する。実施例
11は、種々の金属／キトサンアジュバントと結合させた
ブタ透明帯タンパク質を用いる免疫強化を扱う。実施例
12は、別のブタ透明帯タンパク質をともなう亜鉛／キト
サンアジュバントの使用を示す。実施例13は、鉄／キト
サンアジュバントの調製を記載する。実施例14は、金属
／キトサン錯体のパルミチル化（palmitylation）を扱
う。実施例15は、金属／キトサンアジュバントのパルミ
チル化を有する場合および有しない場合の免疫応答を記
載する。
実施例１ キトサン会合抗原の調製 以下の手順は、ニワトリアルブミン／キトサン免疫原
の処方に関して例示されるが、当業者は、多数の他の抗
原のうちのいずれかが用いられ得ることを容易に理解す
る。
カニの甲羅由来の実用等級のキトサン（Sigma,St.Lou
is,MO）の２％溶液を、pH5.0で0.5Nの酢酸ナトリウム中
に調製した。約10〜14mgのアルブミンを、４〜5mlの0.5
M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）、および2mlの２％キ
トサン溶液中に溶解させた。この抗原／キトサン混合物
を、酢酸ナトリウムで飽和させた25mlの２−ブタノール
を含有するビーカーに、同時に撹拌および超音波処理し
ながら滴下した。混合した後、2mlの1N NaOHを１回につ
き１滴混合物に添加し、そして超音波処理を１〜３分間
継続した。得られた乳濁液を、50mlのビーカーに移し、
そして時折振盪しながら５分間氷上で冷却した。乳濁液
を、＃６の設定でIEC遠心機（International Equipment
Company,Needham Heights,MA）を用いて３〜５分間の
遠心分離により分離し、上部のブタノール層を廃棄し、
そして25mlの滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）を、
界面の沈殿物を含有する水層に添加した。得られた乳濁
液を完全に混合し、そしてキトサン−抗原粒子を３〜５
分間の遠心分離によりペレット化した。上清をデカント
し、そしてペレットを各々25mlのPBSで２回洗浄した。
洗浄液をデカントし、25mlのPBSを添加し、そして得ら
れた懸濁液を完全に混合した。20μｌの25％グルタルア
ルデヒド（Sigma,St.Louis,MO）を添加しながら、懸濁
液を連続的に超音波処理した。２分間の超音波処理後、
15mlの冷却した滅菌PBSを添加し、そして懸濁液を５〜1
0分間氷上で冷却した。キトサン会合抗原粒子を、５分
間の遠心分離によりペレット化し、上清をデカントし、
そして得られたペレットを、25mlの滅菌PBSで３回洗浄
した。最終的な洗浄物から上清をデカントし、そしてペ
レットを２〜3mlの滅菌PBS中に再懸濁し、そして完全に
混合した。キトサン会合抗原のこの懸濁液を、免疫化の
ために用いるか、または実施例２に記載されるさらなる
改変に曝した。
本方法により調製された抗原／キトサン粒子は、一般
にキトサン粒子の多孔性構造内にインターカレートおよ
び架橋された抗原を含む。
実施例２ キトサン粒子に対するペプチド抗原の結合 以下の手順は、ニワトリアルブミン／キトサン免疫原
の処方に関して例示されるが、当業者は、多数の他の抗
原のうちのいずれかが用いられ得ることを容易に理解す
る。
キトサン粒子の表面に抗原を共有結合させるために、
実施例１で得られたキトサン粒子／抗原懸濁液を、以下
の改変に曝した。ジメチルスルホキシド（DMSO）（Sigm
a）中の5mg/mlのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピ
リジルジチオ）プロピオネート（SPDP）（Pierce Chemi
cal Company,Rockford,IL）の1.667μｌのアリコートを
1mlの懸濁液に添加し、そして時折混合しながら、少な
くとも30分間、そして通常１時間までキトサン粒子と反
応させた。懸濁液を遠心分離し、そして上清をデカント
した。ペレットを、1mlのPBSで３回洗浄し、そして最後
の洗浄の後、懸濁液を遠心分離し、そしてPBSを廃棄し
た。アルブミン溶液（約１〜2mgペプチド/mlで1ml）を
ペレットに添加し、懸濁液を超音波処理し、そして混合
物を穏やかに混合しながら室温で一晩反応させた。一晩
のインキュベーションの後、懸濁液を５分間遠心分離
し、そして上清をデカントした。ペレットを一回の洗浄
当たり1mlのPBSで３回洗浄した。最後の洗浄の後、懸濁
液を遠心分離し、そして上清をデカントした。PBS（約1
ml）を添加し、そして懸濁液を超音波処理した。最終的
な懸濁液を、使用するまで４℃で保存した。
実施例３ 免疫化プロトコル 実施例中で他に明記しない限り、以下の免疫化プロト
コルを終始用いた。
マウスを、金属キトサンと複合体化した所望の組換え
タンパク質を有する腹腔内注射、皮下注射、または筋肉
内注射のいずれかにより、100μｌ容量中の種々の量の
抗原で一般に免疫化した。最初の免疫化の前に動物を採
血し、コントロールの血清を得た。最初の免疫化の後、
動物を週一回の間隔で採血し、そして抗原力価を実施例
４に記載されるELISAにより測定した。全ての動物を、
最初の免疫化の３〜４週間後に、最初の免疫原と同一の
注射で追加免疫した。
実施例４ 酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA） 免疫応答を増強し得る、抗原と結合したキトサンの程
度の評価を、当該分野で周知の酵素結合免疫吸着アッセ
イ（ELISA）を利用して行った。用いたプロトコルは以
下の通りであった。
平底のポリ塩化ビニル96ウェルアッセイプレート（Fa
lcon ＃3912）を、炭酸水素塩緩衝液（pH 9.6）中の抗
原（５〜10μg/mlで50μl/ウェル）で４℃にて一晩コー
トした。プレートを、0.5％ポリオキシエチレン（20）
ソルビタンモノラウレート（Tween 80）（Mallinckrodt
Specialty Chemical Company,Paris KY）を含有するPB
S（PBS−Ｔ）で洗浄し、そして２％の脱脂粉乳を含有す
るPBS−Ｔ（PBS−NFDM）で２時間室温でコート後処理し
（postcoat）、非特異的結合を阻害した。PBS−Ｔで三
回洗浄した後、PBS−Ｔ中に希釈した50μｌのサンプル
またはコントロール血清を各ウェルに添加し、プレート
を覆い、１時間室温でインキュベートした。プレートを
空にし、PBS−Ｔで３回洗浄し、そしてPBS−Ｔ中に1:10
00希釈したビオチン標識ヤギ抗マウスIgG（Ｈペプチド
鎖およびＬペプチド鎖の両方を含む）（Zymed Laborato
ries,South San Francisco,CA）またはビオチン標識ヤ
ギ抗マウスIgM（Southern Biotechnology Associates,B
irmingham,AL）50μｌを各ウェルに添加した。室温で１
時間後、プレートをPBS−ＴおよびVectastain ABCキッ
ト（Vector Laboratories,Inc.,Burlingame,CA）由来の
西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンビオチン複合
体を含む50μｌのPBS−Ｔで洗浄した。酵素基質は、50
μｌの400μg/mlのｏ−フェニレンジアミン（Sigma）で
あった。プレートを、室温で20分間暗所で発色させた。
450nmでの吸光度（OD）を、ブランクとして水を用い
て、Dynatec Laboratories MR 700（Chantilly,VA）で
読み取った。
実施例５ キトサン会合抗原での相対的な免疫強化 キトサンが免疫強化に影響し得る相対的な程度を測定
するために、比較研究を行った。ここで、マウスの群
を、キトサン（実施例１に記載のように調製された）、
リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、フロイントの完全お
よび不完全なアジュバント（各々、CFAおよびIFA）（Si
gma,St.Louis,MO）、リン脂質複合体（PLC）（Emulsige
n;MVP Laboratories,Ralston NE）、グルコサミニルム
ラミルジペプチド（GMPD）（C.C.Biotech Corp.,Poway,
CA）、水酸化アルミニウムゲルアジュバント（alum）
（Seargent Pulp and Chemical Co.,Clifton,NJ）、ま
たはゼラチン（Knox Gelatine,Englewood Cliffs,NJ）
のいずれかと組み合わせたニワトリオボアルブミンで個
々に免疫化した。血清力価を、実施例３に記載のように
血液回収物からELISAにより決定した。
マウスを、表１に示した組成物で１日目に腹腔内注射
により免疫化した。群７（１匹のみを含有）以外の各群
は３匹のマウスを含有した。さらに、群５の２匹のマウ
スは、最初の注射の後に死亡した。各群において、他に
明記しない限り最初の注射と同一の２回目の注射を、最
初の注射後21日目に投与した。３つの時期でマウスから
血液を回収した:i）最初の注射後21日目;ii）最初の注
射後31日目；およびiii）最初の注射後43日目。
記載された免疫化に応答した抗体産生を、ELISAによ
り測定し、そして最初の２回の採血由来の結果を表２に
示す。
これらの結果は、腹腔内注射により投与される場合、
実施例１に記載されるように調製されたキトサンが他の
より一般的に用いられるアジュバントよりも強く免疫応
答を増強することを示した。異なる分光光度計を利用す
る、ELISAによる終点滴定（表３）は、表２に示した結
果と一致した結果を与えた。表３の終点測定は、一般に
0.20未満の値であると考えられ得る。
実施例６ インビトロでのマクロファージのキトサン刺激 キチンの種々の可溶性および不溶性の誘導体が、イン
ビボで腹膜のマクロファージを活性化するという観察
（Nishimuraら、前出）から考えて、粒子状のキトサン
が同じ生物学的特性を保有するか否かを決定するために
アッセイを行った。
腹膜のマクロファージを、未処置BALB/cマウスおよび
既知のマクロファージ活性化因子で処置したマウスの両
方から単離した。用いたマクロファージ活性化因子は、
鉱油、スターチ、およびポリカルボフィル（polycarbop
hil）（B.F.Goodrich Company,Breaksville,OH）であっ
た。マクロファージを、RPMIで洗浄することにより、マ
ウス腹腔から取り出し、シリコン処理チューブ中に回収
し、そしてハンクス緩衝化生理食塩水溶液（HBSS）で３
回洗浄した。次いで、洗浄した細胞を、実施例１に記載
されるように調製された、オボアルブミン、カルボキシ
フルオレセン（fluorescene）、またはフルオロイソチ
オシアネート（FITC）標識Staphylococcus aureusを含
有するキトサンビーズのいずれかとともにチューブに割
り当てた。カルボキシフルオレセンおよびFITCのウェル
はオバルブミン抗原を含まなかった。マクロファージお
よび抗原を、小さなシリコン処理チューブ中で１時間イ
ンキュベートした後、96ウェルプレートに割り当てた。
観察を、可視光および紫外光の両方の下で、蛍光顕微鏡
を用いて異なる時点で行った。
オボアルブミン／キトサン粒子は蛍光を発しなかっ
た。これは、キトサン単独では蛍光を発しないことを示
す。５時間以内に、蛍光キトサン粒子が、カルボキシフ
ルオレセンまたはFITC標識S.aureusを含有する全てのマ
クロファージ培養物（予め活性化されていないものを含
む）において観察され得た。30時間で、培養物中にマク
ロファージの散在性の蛍光染色が観察され得た。この観
察は、マクロファージが予め活性化されているか否かに
関わらず、タンパク質／キトサン粒子が、インビトロで
腹膜のマクロファージにより食され、そして消化されて
いたことを示唆する。予備的なデータはまた、食された
抗原が次いでプロセスされたことを示唆した。
実施例７ 投与経路の機能としての免疫強化 刺激された抗体産生に対する抗原／キトサンの投与経
路の影響を評価するために、免疫原を腹腔内注射、経口
摂取、または直腸デポー（rectal deposition）のいず
れかによりマウスに投与した。
すべての投与経路について、オボアルブミン／キトサ
ン粒子を実施例１に記載のように調製した。腹腔内注射
には、マウスを100μｇのオボアルブミンで１回免疫し
た。経口および直腸投与には、マウスを、腹腔内免疫化
を受けたマウスと同日に100μｇのオボアルブミンで免
疫し、さらに２日後に同じオボアルブミン用量で２回目
の免疫化を行った。
これらの種々の投与経路の機能としての刺激された抗
体産生のレベルは、実施例３に記載されたELISAにより
測定され、表４に呈示される。
腹腔内注射後、抗原のみに対して測定されたバックグ
ラウンド力価は実験間で一致しており、そして投与経路
の機能として有意に変化しなかった。
これらの結果は、投与の腹腔内、経口、または直腸経
路のいずれかによるキトサンビーズ中のオボアルブミン
の投与が、マウスにおいて比較し得るレベルの血清抗体
を生じることを示した。さらに、抗原およびキトサンビ
ーズの単純な混合、または別の部位に投与されたキトサ
ンビーズと抗原（データは示さず）とは、キトサン粒子
中に、カプセル化、またはインターカレートされた抗原
により誘導されるレベルに比較し得るレベルの抗体産生
を誘導しなかった。これらの結果は、不溶性キトサンの
経口投与が、免疫応答の強化には効果的でない、という
従前の報告（Marcinkiewiczら、前掲）を考慮すれば特
に驚きであった。
実施例８ 市販のアジュバントに対するキトサン免疫強化の比較 ニワトリオボアルブミン（OVA）がマウスで免疫応答
を惹起する能力を、実施例１に記載のように調製された
抗原／キトサン粒子、または他の市販のアジュバントと
共に投与されたオボアルブミンを用いた免疫化の後に測
定した。投与は、腹腔内注射および皮下注射の両方によ
り実施した。IgGおよびIgMの両方を含む抗体力価を、表
５に示されるように、単回免疫の後、複数日に測定し
た。この研究のプロトコルは以下の通りである。
６週齢のBALB/cマウス（１群あたり３匹）を、試験さ
れた各アジュバント中の200μｇ鶏卵アルブミン（Sigm
a,St.Louis,MO）を用いて腹腔内または皮下経路により
免疫した。オボアルブミン／アジュバント処方物を製造
業者の示唆するプロトコルに従って調製した。
詳細には、各注射について、100μｌの完全フロイン
トアジュバント（CFA;Sigma）を、200μｇのOVAを含む1
00μｌの滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）と混合
し、そして安定なエマルジョンが形成されるまで超音波
処理した。このCFA処方物200μｌを各マウスに与えた。
Ribi Immunochem Research,IncのMPL＋TDM＋CWS−Rib
iアジュバントシステム（RAS）（Sigma Immunochemical
s）を、100μｌの加湿再調製アジュバントと、200μｇ
のオボアルブミンを含む滅菌PBS100μｌとを混合するこ
とにより調製した。この処方物200μｌを各マウスに与
えた。
HunterのTiterMaxアジュバントもまた、Sigma Immuno
chemicalsから得た。各用量は、25μｌのアジュバント
を、200μｇのオボアルブミンを含む滅菌PBS25μｌと混
合し、安定なエマルジョンが形成されるまで超音波処理
することにより調製した。この処方物50μｌを各マウス
に与えた。
AdjuPrime Immune Modulatorは、Pierce（Rockford,I
L）から得、製造業者の示唆する乾燥抗原プロトコルを
用いて調製した。AdjuPrime粉末を、オボアルブミン粉
末と、1:15（w/w）の抗原:AdjuPrime比で混合し、そし
て均一になるまで、秤量紙のシート間においてフラスコ
の底で微細に砕いた。次いでこの混合物を、滅菌PBSを
用いて１μg/μｌの最終オボアルブミン濃度に再調製し
た。従って、最終の免疫化用量は、200μｇのオボアル
ブミンを含む200μｌであった。同一のブースター免疫
調製物を必要とされるまで−20℃で凍結貯蔵した。
オボアルブミン／キトサン免疫原を実施例１に記載の
ように調製した。抗体力価を実施例３に記載のようにEL
ISAにより測定した。
図１は、免疫後７日目（dpi）の各マウス群によるIgM
抗オボアルブミン抗体産生の幾何平均力価を示す。図１
において、個々の群は、オボアルブミンおよびアジュバ
ントで以下のように免疫した：第１群、AdjuPrime Immu
ne Modulatorを用いた腹腔内注射；第２群、PBSを用い
た腹腔内注射；第３群、キトサンを用いた腹腔内注射；
第４群、Ribiアジュバントシステムを用いた腹腔内注
射；第５群、TiterMaxを用いた腹腔内注射；第６群、完
全フロイントアジュバントを用いた腹腔内注射；第７
群、完全フロイントアジュバントを用いた皮下注射；第
８群、PBSを用いた皮下注射；第９群、キトサンを用い
た皮下注射；第10群、Ribiアジュバントシステムを用い
た皮下注射；第11群、TiterMaxを用いた皮下注射。これ
らのデータは、キトサン会合抗原が、初期（７日目）Ig
M抗体産生をあまり刺激しないことを示す。その他のア
ジュバント調製物の多くは、より高いレベルのIgM抗体
産生を生じたことに注目すべきである。対照的に、図２
に示されるIgG抗オボアルブミン抗体データの幾何平均
力価により証明されるように、キトサン会合抗原は、よ
り迅速かつより高いレベルのマウスによるIgG抗体産生
を刺激する。図２におけるデータは、図１について記載
されたように免疫化された群（前掲）由来であった。こ
の結果は、キトサンと会合した抗原が、IgMを産生しな
いＢ細胞への免疫グロブリンのクラススイッチをより迅
速に刺激することを示す。記憶Ｂ細胞はIgGを産生する
ので、迅速かつ増加したレベルのIgG産生は、キトサン
の会合は、増加した免疫学的記憶を生じ得ることを示唆
する。
各アジュバント中の200μｇオボアルブミンの単回腹
腔内注射後、21日、28日、および35日目の抗体総力価を
表５に示す。値は、３匹のマウスを含む処置群からの幾
何平均力価を表す。注目すべき点は、多くの免疫プロト
コルが、免疫後21日目（dpi）に、ブースター免疫を必
要とし、しかも21dpiでキトサン会合オボアルブミンに
より誘導された抗体応答が、投与経路に拘わらず、すべ
ての他のアジュバント処方物に対して優れていたことで
ある。同様の結果が、単回皮下注射後に得られた。結果
を表６に示し、ここで値は、３匹の個々のマウス群から
の幾何平均力価である。
実施例９ キトサン／抗原会合の性質の機能としての免疫強化 免疫強化に対して有するタンパク質／キトサン会合の
形態の影響を測定するために、種々の方法により調製さ
れたタンパク質／キトサンアジュバントをマウスに投与
する研究を実施した。１つの事例では、免疫原を実施例
１に記載のように調製した（第１群）。別の事例では、
キトサン粒子を、調製物中で抗原を用いなかったことを
除いて、実施例１に記載のように調製した（第２群）。
さらに別の事例では、調製物中でキトサンを用いなかっ
たことを除いて、実施例１に記載のように抗原を調製し
た。この最後の事例では、キトサン粒子を、実施例１に
記載のように調製したアルブミン抗原に添加した（第３
群）。免疫プロトコルは以下のようであった。
９匹のBALB/cマウスを、３匹のマウス（ｎ＝３）の３
つの群に分けた。各群に、100μｇの抗原を腹腔内注射
した。第１群には、実施例１に記載のように調製された
200μｇのキトサン粒子と共に100μｇのオボアルブミン
を含む抗原を投与した。第２群には、同じ方法を用いて
調製した100μｇのオボアルブミンのみを投与した。第
３群には、100μｇのオボアルブミン粒子と200μｇのキ
トサン粒子との単純な混合物を投与した。ELISAにより
測定した、21dpiでのこれらの群のマウスの抗オボアル
ブミン抗体力価の幾何平均を表７に示す。
この実験の結果は有益である。何故なら、それらは、
観察されたアジュバント活性が、キトサンカップリング
手順の間のその粒子状化から生じるオボアルブミンの物
理化学的改変に単純に起因しないことを確立するからで
ある。これらの知見はまた、オボアルブミン／キトサン
調製物のアジュバント活性がそれらの結合から生じ、し
かも最大活性にカップリングが必要であることを示す。
従って、これらの結果は、Marcinkiewiczら［前
掲］、およびSuzukiら［前掲］により記載された結果と
は異なる。何故なら、これらのグループのいずれも、抗
原のキトサンへの結合に対する必要性または利点を報告
していないからである。これらのグループは、一連のキ
トサン注射を用いた前処理、またはそれを抗原として同
時に投与することのいずれかにより、マクロファージの
非特異的免疫刺激剤としてキトサンを適用した。実施例
５に示した結果は、これらの先に報告した観察と一致
し、腹膜マクロファージの活性化およびキトサン会合蛍
光抗原の食作用を示す（データは示さず）。しかし、よ
り重要なことは、表７における結果は、粒子状または膠
状キトサンと抗原との共有結合的な会合が、本発明者ら
のマウスによる抗体産生の最大誘導に必要であることを
示す。
さらなる差異が、これらの結果と、Marcinkiewiczら
［前掲］、およびSuzukiら［前掲］の研究との間に存在
する。両方のグループは、脾臓中のIgM抗体産生性プラ
ーク形成細胞（PFC）を定量するために、Jerne溶血プラ
ークアッセイを用いた。しかし、本明細書では、IgGお
よびIgMアイソタイプ抗体の濃度に加えて、血清中の総
抗体レベルを測定した。Marcinkiewiczら、およびSuzuk
iらはまた、粒子状抗原であるヒツジ赤血球細胞（SRB
C）に対するPFC応答を記載し、その一方、本発明は、不
溶性キトサン粒子と会合する可溶性抗原であるニワトリ
オボアルブミンを利用して例示されている。Marcinkiew
iczら、およびSuzukiらはまた、注射の腹膜腔内経路の
みの効力を報告した；本明細書では、成功した免疫強化
が、注射の腹腔内および皮下経路の両方を用いて得られ
た。
先に述べたように、上記の表７で示した結果は、キト
サンの粒子状または膠質形態と共有結合的に会合した抗
原について測定された血清力価である。可溶性キトサン
を用いた別の実験では、反対の結果が得られた。簡潔に
記載すると、酢酸中の１％キトサン溶液を記載のように
調製し、そして熱変性ブタ透明帯総タンパク質と混合し
た。混合物のpHを、NaOHを用いて6.8まで上昇させ、そ
して約200μｇの抗原をマウスに皮下注射した。結果
は、帯タンパク質に対する血清力価が、抗原／キトサン
をグルタルアルデヒドを用いて架橋したときより、抗原
を可溶性キトサンに架橋しないときに、より高かったこ
とを示した。さらに、免疫応答は、架橋の非存在下でか
なり急速であった。
実施例10 亜鉛、銅、またはニッケルのいずれかを含有する金属／
キトサン錯体の調製 ポリ−HIS−タグ化透明帯（ZP）タンパク質をニッケ
ル（Ni）−Sepharoseクロマトグラフィーを使用して精
製する間に見られた先の観察は、精子が、他のアフィニ
ティカラム上に固定化されたZPタンパク質により検出さ
れる結合と比較して、Ni固定化ZPタンパク質と容易に結
合することを示唆した。この観察は、ZPタンパク質が精
子の卵母細胞への結合における役割を担うので、特に興
味深いものである。この観察は、この方法で固定化した
場合、ポリ−HIS−タグ化ZPタンパク質がより自然な構
造を維持し得ることを示唆した。キチンが遷移金属イオ
ンをキレート化する能力を有するという先の観察と組み
合わせた場合に、この観察は、ポリ−HIS−タグ化抗原
を結合するための、および免疫強化剤としての金属／キ
トサンキレートの使用の可能性の研究を導いた。一般に
遷移金属イオンは毒性であるため、いくつかの異なるイ
オンを最初に試験して、金属／キトサン錯体を生成し
た。
亜鉛、銅、またはニッケルのいずれかを含有する金属
／キトサン錯体アジュバントを調製するために、2gのキ
トサン（CTC Organics,Atlanta,GA）を100mlの２％酢酸
に溶解することにより２％キトサン溶液を最初に調製
し、得られた溶液をオートクレーブにより滅菌した。代
替として、2gを100mlの0.5M酢酸ナトリウム（pH4.5）中
に溶解することによってもキトサン溶液は調製され得
る。酢酸亜鉛溶液、硫酸ニッケル溶液、または硫酸銅溶
液を、脱イオン水中、0.001〜0.2Mの間のモル濃度で調
製し、そして濾過滅菌した。２％キトサン溶液を脱イオ
ン水で1:1に希釈し、そして得られた１％キトサン溶液
の4mlを10mlの所望の金属塩溶液に添加した。得られた
懸濁液を、室温で２〜４時間、往復振盪機（end to end
shaker）で混合した。混合物をBranson Sonifier 250
を使用して３〜５分間超音波処理し、そして混合物のpH
を、超音波処理の間に10N NaOHで12.0〜12.5に調整し
た。亜鉛塩を利用した場合には、白色錯体沈殿が形成さ
れ、ニッケル塩を使用した場合には、錯体は淡緑色であ
り、そして銅塩を使用した場合には、錯体は青色であっ
た。超音波処理後、混合物を2000rpm（1000×ｇ）で10
分間遠心分離し、そして上清を流し出した。ペレットを
PBS（pH7.2）で２回洗浄し、各洗浄後に遠心分離し、ペ
レットの湿重量を測定し、そして金属／キトサン錯体ペ
レットを8M尿素（pH7.8〜8.0）に再懸濁した。金属／キ
トサン錯体をすぐに抗原と結合させるか、あるいは8M尿
素またはPBSのいずれかの中で室温で保存した。保存し
た金属／キトサン錯体は、この方法で保存した場合、６
ヶ月まで安定であることが示された。
抗原を、２つの代替法のうちの１つにより金属／キト
サン錯体と会合させた。第１の方法では、タンパク質
を、実施例13および以下の実施例に記載のようにグルタ
ルアルデヒドを使用して金属／キトサン錯体と架橋し
た。別の方法では（本実施例に記載される）、組換えタ
ンパク質はＣ末端ポリヒスチジン領域を含み、精製を容
易にし、そしてタンパク質と金属／キトサン錯体の金属
成分との会合を可能にした。この手順を以下に記載す
る。
６つのヒスチジン（ポリ−HIS）を含むように改変さ
れた組換えタンパク質を、細菌、酵母、昆虫、またはCH
O細胞のいずれかで発現させ、そしてNi−Sepharoseまた
はコバルト（Co）−Sepharoseクロマトグラフィー（こ
れらの両方は当該分野で周知である）を使用して精製し
た。組換えタンパク質を8M尿素で平衡化し、そして室温
で１〜３時間、プラスチックチューブ中で金属／キトサ
ン錯体とともにインキュベートした。インキュベーショ
ン後、タンパク質／金属／キトサン複合体を、10分間、
1000×ｇで遠心分離することによりペレット化し、そし
て錯体結合タンパク質の量を、遠心分離後の上清中のタ
ンパク質濃度を測定し、そして最初に結合反応に添加し
た量を差し引くことにより概算した。一般に、得られた
抗体（mg）：金属／キトサンの湿重量（mg）の比は、平
均して10:1であった。ペレットをPBSで２回洗浄し、PBS
中に再懸濁し、そして濃度を1mg抗原/ml緩衝液に調整し
た。
免疫原としての抗原／亜鉛／キトサンの特異的な使用
および使用結果を、以下の実施例11および12に記載す
る。
実施例11 ニッケル、銅、または亜鉛のいずれかと錯体化したキト
サンと複合体化した組換えブタ透明帯タンパク質Ｂ（Pi
g−ｂ）に対する免疫応答 細菌で発現させた組換えブタ透明帯タンパク質Pig−
ｂを、実施例10に上記するようにニッケル／キトサン、
銅／キトサン、または亜鉛／キトサンのいずれかと複合
体化した。マウスの独立した群を、ニッケル／キトサン
および亜鉛／キトサンの場合、腹腔内で５、25、100、
または250μｇのタンパク質／マウスのいずれかで免疫
化し、あるいは銅／キトサンの場合、腹膜内で５または
25μｇタンパク質／マウスのいずれかで免疫化した。各
群を、初期免疫化後21日目に、同量の抗原および金属／
キトサンで追加免疫した。マウスを初期免疫化後８、2
1、28、および49日目に採血し、そして血清力価を実施
例４に上記するようにELISAにより決定した。細菌で発
現させた透明帯Pig−ｂおよび熱可溶化した全天然ブタ
透明帯に対して測定された血清力価を、表８および表９
にそれぞれ示す。これらの結果は、免疫強化に関してキ
レートアジュバント間にほとんど差がないことを示唆す
る。
実施例12 亜鉛／キトサンと複合体化し細菌で発現させた透明帯pi
g−ｃタンパク質での免疫化 Balb/Cマウスを、以下のプロトコルにより、細菌で発
現させた組換えブタ透明帯Ｃタンパク質（pig−ｃ）で
免疫化し、そして亜鉛／キトサンに複合体化した。
最初にpig−ｃ抗原をE.coliで発現させ、そしてそこ
から精製し、続いて実施例10に上記するように調製され
た亜鉛／キトサンと複合体化した。マウスを腹腔内で10
0μｇ抗原／マウス（群Ｉ）で免疫化した。１つのコン
トロール群（群II）では、マウスを精製タンパク質単独
で100μg/マウスで免疫化し、そして別のコントロール
群（群III）では、マウスを沈殿した酢酸亜鉛と会合し
たpig−ｃタンパク質で、亜鉛／キトサンを作製するた
めの実施例10と同様のプロトコルに従って（１％キトサ
ンを溶液に加えなかったことを除く）免疫化した。マウ
スを、21日目に、100μg/マウスで、亜鉛／キトサンと
複合体化したpig−ｃ抗原で、初期免疫化で使用したも
のと同じ調製物により追加免疫した。マウスを21、28、
および49日目に眼窩後方穿刺（retro−orbital punctur
e）により採血し、そして血清力価を実施例４に記載の
ようにELISAにより測定した。結果を表10に示す。
21日目において、群IIについては250k未満であり群II
Iについては1kの力価であるのに対して群Ｉにおける血
清力価は平均して64kであった。初期免疫化後21日目の
追加免疫化後、28日目に採取された血液で測定された血
清力価は、群Ｉについては64kより多く、群IIおよび群I
IIの両方については4kであることが見出された。これら
のデータは、抗原単独も、アジュバントの金属／抗原成
分もが、観察された免疫応答の原因ではなく、期間中に
保持する免疫応答を迅速に刺激するために、免疫応答が
適切な抗原／金属／キトサン複合体を必要とすることを
示す。
実施例13 鉄を含有するキトサン−金属錯体の調製 鉄／キトサン錯体免疫原の調製のために、4gのクエン
酸アンモニウム第二鉄を、100μｌの11.6N HClを用いて
10mlの蒸留水に溶解した。上記のように調製した１％キ
トサン溶液の4mlを超音波処理し、そして200μｌのクエ
ン酸アンモニウム第二鉄溶液を超音波の間添加した。得
られた溶液を遠心分離し、そして鉄／キトサン錯体を含
有するペレットを脱イオン水中で一回洗浄した。8M尿素
を添加しなかった以外は上述のように、６つのヒスチジ
ン残基を含むように改変した組換えタンパク質を、鉄／
キトサン錯体に結合させた。あるいは、ポリヒスチジン
配列を含まない卵オボアルブミンまたは細菌／ウイルス
タンパク質のようなタンパク質とは、抗原を、以下に記
載の方法の１つにより、鉄／キトサン錯体に結合させ
た。
第１の方法において、鉄／キトサン錯体を上述のよう
に調製した。PBSpH7.4中のタンパク質溶液を添加して、
得られた懸濁液をボルテックスして一様な混合物を得
た。25％のグルタルアルデヒド溶液をPBSで1:4に希釈
し、そして抗原／キトサン混合物1ml当たり20μｌの容
量で、抗原／キトサン混合物に添加した。得られた懸濁
液を、少なくとも４時間、往復振とう機上で混合した。
混合した後、PBS中の1Mグリシン100μｌを添加し、未反
応のグルタルアルデヒドを中和し、そしてインキュベー
ションを室温で１時間続けた。混合物を10分間、1000×
ｇで遠心分離し、そして得られたペレットを２回PBSで
洗浄した。最後の洗浄後、ペレットをPBS中1mg/mlの抗
原濃度で再懸濁させ、そして直ぐに動物を免疫するため
に使用した。
前述のプロトコルの代替において、上述のように調製
し、鉄と錯体化しない１％のキトサンを、所望のタンパ
ク質に添加し、そして得られた混合物を穏やかに振とう
して一様な混合物を調製した。上述のように、25％のグ
ルタルアルデヒド溶液をPBSで1:4に希釈し、そして、抗
原／キトサン混合物1ml当たり20μｌの容量で、抗原／
キトサン混合物に添加した。得られた溶液を、室温で約
２時間〜６時間インキュベートして、混合物がゲル化し
た時点の後に、制限された（limited）グルタルアルデ
ヒド誘導架橋を生成するようにした。緩やかに架橋した
物質は、ほぼ透明であり、流動的であり（flowable）顕
微鏡下で観察した場合、粒子状ではないようであった。
得られた物質を、400μｌの4g/mlのクエン酸アンモニウ
ム第二鉄溶液を添加して、これがその中に抗原が取り込
まれる微細な黄色がかった茶色の粒子の形成を誘導する
２〜３分の間、超音波処理した。抗原／鉄／キトサン粒
子を、10分間、1000×ｇでの遠心分離によりペレット化
し、得られたペレットを約1mg/mlの抗原濃度で再懸濁し
た。この溶液を使用して、実施例３に記載したプロトコ
ルにより、マウスを免疫した。
実施例14 パルミチル化鉄キトサンの調製 免疫刺激複合体（ISCOM）についての以前の報告（複
合体がパルミチル化される場合により高い力価が誘導さ
れることが示されている）を考慮して、以下の手順を行
って、免疫化の前に抗原／金属／キトサン複合体を改変
した。
タンパク質抗原を上述の任意の方法により鉄キトサン
粒子に取り込ませ、そしてパルミチン酸基（palmitic g
roup）を以下の手順により添加した。20mgのパルミチン
酸無水物を1mlのトリエチルアミンに溶解し、そしてこ
の溶液を、鉄／キトサン錯体溶液中の抗原1mgにつき、1
0μｌのパルミチン酸無水物の割合で、タンパク質／金
属／キトサン複合体溶液に添加した。得られた溶液を穏
やかにタッピングすることにより混合し、そして調製物
を希釈して免疫化に使用する前に少なくとも２時間、室
温で放置した。
実施例15 パルミチル化を伴ったまたは伴わない、鉄／キトサン粒
子中に取り込まれたpig−ｃでの免疫 E.coliで発現させた精製透明帯pig−ｃタンパク質
を、鉄／キトサン粒子に以下のように取り込ませた。２
％酢酸中の１％キトサン溶液10mlを、超音波処理の間連
続的に400μｌの0.4g/mlクエン酸アンモニウム第二鉄溶
液を添加しながら、２〜３分間超音波処理した。得られ
た鉄／キトサン粒子を遠心分離によりペレット化し、そ
してペレットを脱イオン水を用いて、２回洗浄した。E.
coliで発現させたpig−ｃタンパク質を含有する溶液
を、PBSでpH7.8に調整し、そして鉄／キトサン粒子とと
もにインキュベートした。インキュベーションを、往復
振とう機上で混合させて一晩継続させた。インキュベー
ションの後、抗原／金属／キトサン粒子を10分間、1000
×ｇでの遠心分離によりペレット化し、そして上清中の
タンパク質濃度を当該分野において公知のブラッドホー
ド法により測定した。金属／キトサンに対する抗原の最
終割当を、鉄−キトサンの湿重量1gあたり3.7mg pig−
ｃタンパク質の結合であると測定した。免疫原として使
用する前に、pig−ｃ鉄を1mgの抗原/mlの濃度に調整し
た。
パルミチル化pig−c/鉄／キトサン免疫原を生成する
ために、上述のように生成した粒子を、初めに8M尿素中
でインキュベートした。20mgのパルミチン酸無水物の溶
液を1mlのトリエチルアミン中に調製し、そして10μｌ
の溶液を、1mgに等価な（タンパク質）pig−c/鉄／キト
サンに添加した。混合物を穏やかに振とうし、そして免
疫原として使用する前に少なくとも２時間、室温でイン
キュベートした。
Balb/cマウスを、鉄／キトサン粒子中に取り込まれた
pig−ｃまたはパルミチル化したpig−c/鉄／キトサン粒
子のいずれかで腹腔内免疫した。マウスの独立した群を
100μｇのタンパク質で初期に免疫し、そして各群を、
初期免疫後、22日目に、同一の用量および調製物で追加
免疫（booted）した。初期免疫後、７、14、22、42、5
6、および63日目にマウスを採血し、そして血清抗体力
価を組換えpig−ｃタンパク質に対するELISAにより評価
した。両方の群におけるpig−ｃに対する血清力価の比
較を表３にまとめる。
血清力価は、一次応答において同程度であったが、追
加免疫後、パルミチル化抗原で注射したマウスの群中の
血清力価は、非パルミチル化群について決定した力価
（64k）よりも有意に高かった（＞128k）。
本発明を、好ましい実施態様の型において記載してき
たが、本発明は本明細書中での開示、特に請求の範囲お
よびそれらの要求の最も広く正確な解釈の中にあるそれ
らの実施態様を考慮して、当業者がなし得る全ての改
変、および変形を包含する。
フロントページの続き (72)発明者 ボーガル，バルバー アメリカ合衆国 テキサス 77381，ザ ウッドランズ，ナイトフォール プレ イス 34 (72)発明者 シン，ガープリート アメリカ合衆国 テキサス 77059，ヒ ューストン，アイビー デル コート 2602 (56)参考文献 特開 平５−294846（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−156926（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−311385（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−217631（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−39022（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−130922（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／15635（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 39/39 A61K 39/385 A61K 38/00 - 38/58

Claims (45)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】キトサンおよびキレート化金属イオンを組
    み合わせて含むアジュバント組成物であって、ここで、
    該金属イオンが、鉄あるいは亜鉛、銅、ニッケル、また
    は別の遷移金属である、アジュバント組成物。
  2. 【請求項２】前記金属イオンが遷移金属である、請求項
    １に記載のアジュバント組成物。
  3. 【請求項３】前記遷移金属が、銅、亜鉛、およびニッケ
    ルからなる群から選択される、請求項２に記載のアジュ
    バント組成物。
  4. 【請求項４】前記金属イオンが鉄である、請求項１に記
    載のアジュバント組成物。
  5. 【請求項５】抗原を請求項１から４のいずれかに記載の
    アジュバント組成物と組み合わせて含む免疫原組成物。
  6. 【請求項６】前記抗原がタンパク質である、請求項５に
    記載の免疫原組成物。
  7. 【請求項７】前記抗原がアジュバント組成物に共有結合
    で架橋している、請求項５に記載の免疫原組成物。
  8. 【請求項８】架橋がグルタルアルデヒドを用いて行われ
    る、請求項７に記載の免疫原組成物。
  9. 【請求項９】前記架橋免疫原が粒子状である、請求項８
    に記載の免疫原組成物。
  10. 【請求項１０】前記架橋免疫原が膠状である、請求項８
    に記載の免疫原組成物。
  11. 【請求項１１】前記タンパク質が組換えタンパク質を含
    む、請求項５に記載の免疫原組成物。
  12. 【請求項１２】前記組換えタンパク質がポリヒスチジン
    アミノ酸配列をさらに含む、請求項11に記載の免疫原組
    成物。
  13. 【請求項１３】前記ポリヒスチジンアミノ酸配列がタン
    パク質のカルボキシル末端に連結されている、請求項12
    に記載の免疫原組成物。
  14. 【請求項１４】前記ポリヒスチジンアミノ酸配列がタン
    パク質のアミノ末端に連結されている、請求項12に記載
    の免疫原組成物。
  15. 【請求項１５】前記タンパク質が、前記ポリヒスチジン
    アミノ酸配列と前記金属イオンとの相互作用により、前
    記アジュバント組成物に結合されている、請求項12に記
    載の免疫原組成物。
  16. 【請求項１６】アジュバント組成物を生成する方法であ
    って、該方法は、以下の工程： ａ）キトサン溶液を調製する工程； ｂ）金属イオンを該キトサンにキレート化し、金属／キ
    トサン錯体を形成させる工程；および ｃ）該金属／キトサン錯体を単離する工程 を包含し、ここで、該金属イオンが、鉄あるいは亜鉛、
    銅、ニッケル、または別の遷移金属である、方法。
  17. 【請求項１７】前記金属イオンが遷移金属である、請求
    項16に記載の方法。
  18. 【請求項１８】前記遷移金属が、銅、ニッケル、および
    亜鉛からなる群から選択される、請求項17に記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】前記金属イオンが鉄である、請求項16に
    記載の方法。
  20. 【請求項２０】免疫原組成物を生成する方法であって、
    該方法は、以下の工程： ａ）キトサン溶液を調製する工程； ｂ）金属イオンを該キトサンにキレート化し、金属／キ
    トサン錯体を形成させる工程；および ｃ）抗原を該金属／キトサン錯体と組み合わせる工程 を包含し、ここで、該金属イオンが、鉄あるいは亜鉛、
    銅、ニッケル、または別の遷移金属である、方法。
  21. 【請求項２１】前記金属イオンが遷移金属である、請求
    項20に記載の方法。
  22. 【請求項２２】前記遷移金属が、銅、ニッケル、および
    亜鉛からなる群から選択される、請求項21に記載の方
    法。
  23. 【請求項２３】前記金属イオンが鉄である、請求項20に
    記載の方法。
  24. 【請求項２４】前記抗原がタンパク質である、請求項20
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】前記抗原が前記金属／キトサン錯体に共
    有結合で架橋している、請求項20に記載の方法。
  26. 【請求項２６】前記架橋がグルタルアルデヒドを用いて
    行われる、請求項25に記載の方法。
  27. 【請求項２７】前記架橋金属／キトサン錯体が粒子状で
    ある、請求項26に記載の方法。
  28. 【請求項２８】前記架橋金属／キトサン錯体が膠状であ
    る、請求項26に記載の方法。
  29. 【請求項２９】前記タンパク質が組換えタンパク質を含
    む、請求項25に記載の方法。
  30. 【請求項３０】前記組換えタンパク質がポリヒスチジン
    アミノ酸配列を含む、請求項29に記載の方法。
  31. 【請求項３１】前記ポリヒスチジンアミノ酸配列がタン
    パク質のカルボキシル末端に連結されている、請求項30
    に記載の方法。
  32. 【請求項３２】前記ポリヒスチジンアミノ酸配列が前記
    タンパク質のアミノ末端に連結されている、請求項30に
    記載の方法。
  33. 【請求項３３】前記タンパク質が、前記金属イオンと前
    記タンパク質のポリヒスチジンアミノ酸配列との相互作
    用により、前記金属／キトサン錯体に会合されている、
    請求項30に記載の方法。
  34. 【請求項３４】免疫原組成物を生成する方法であって、
    該方法は、以下の工程： ａ）キトサン溶液を調製する工程； ｂ）抗原を該キトサンと組み合わせて、抗原／キトサン
    複合体を形成させる工程；および ｃ）金属イオンを該抗原／キトサン複合体にキレート化
    する工程 を包含し、ここで、該金属イオンが、鉄あるいは亜鉛、
    銅、ニッケル、または別の遷移金属である、方法。
  35. 【請求項３５】前記金属イオンが遷移金属である、請求
    項34に記載の方法。
  36. 【請求項３６】前記遷移金属が、銅、ニッケル、および
    亜鉛からなる群から選択される、請求項35に記載の方
    法。
  37. 【請求項３７】前記金属イオンが鉄である、請求項34に
    記載の方法。
  38. 【請求項３８】前記抗原がタンパク質である、請求項34
    に記載の方法。
  39. 【請求項３９】前記抗原が前記キトサンに共有結合で架
    橋している、請求項34に記載の方法。
  40. 【請求項４０】前記架橋がグルタルアルデヒドを用いて
    行われる、請求項39に記載の方法。
  41. 【請求項４１】前記架橋抗原／キトサン複合体が粒子状
    である、請求項40に記載の方法。
  42. 【請求項４２】前記抗原／キトサン複合体が膠状であ
    る、請求項40に記載の方法。
  43. 【請求項４３】前記タンパク質が組換えタンパク質を含
    む、請求項39から42のいずれかに記載の方法。
  44. 【請求項４４】免疫応答を刺激する方法であって、非ヒ
    ト動物に請求項５から15のいずれかに記載の免疫原組成
    物を投与する工程を包含する、方法。
  45. 【請求項４５】免疫応答を刺激するための医薬を製造す
    るための、請求項５から15のいずれかに記載の免疫原組
    成物の使用。
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