JPH0393730A

JPH0393730A - 減感作剤

Info

Publication number: JPH0393730A
Application number: JP1228085A
Authority: JP
Inventors: Sunao Matsuhashi; 松橋　直; Mitsuko Usui; 臼井　美津子; Masakazu Mihashi; 三橋　正和; Shunsaku Ando; 安藤　駿作
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1989-09-02
Filing date: 1989-09-02
Publication date: 1991-04-18
Anticipated expiration: 2013-12-16
Also published as: EP0416816B1; DE69014498D1; EP0416816A1; CA2024167A1; US5073628A; KR910005881A; KR0155383B1; JP2838800B2; DE69014498T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〈産業上の利用分野〉本発明は、減感作剤に関する。更に詳細には、新規スギ
花粉アレルゲン、とりわけ、部分アミノ酸配列としてそ
のＮ末端から順に、Ａｌａ−１１ｅ−Ａｓｎ　−Ｉ　ｌ
ｅ　−　Ｐｈｅ　−　Ａｓｎ−の配列を有している花粉
アレルゲンと糖質とを共有結合せしめた減感作剤に関す
る。

〈従来の技術〉スギ花粉症は、スギの開花時に飛散する花粉によって引
き起されるアレルギー症である。

近年、我国においては、スギの植林面積の増大につれて
、スギ花粉症患者数は漸増しており、季節的な発症とは
いえ公衆衛生上無視できない状態になっている。

従来、スギ花粉症の治療法としては、ステロイドホルモ
ンやクロモグリク酸ナトリウムなどの投与が行なわれて
きたが、これらはいずれも対症療法であって、単に患者
の症状を一時的に和げるにすぎない。

一方、スギ花粉症の原因物質であるスギ花粉アレルゲン
を投与して減感作し、スギ花粉症を根治しようとする試
みが行なわれている。

しかしながら、この減感作療法では、スギ花粉アレルゲ
ンによるアナフィラキシーの危険が伴うだけでなく、こ
の危険を回避しようとしてアレルゲンを少量ずつ投与す
ることを必須とし、その治療期間は約３年もの長期に亙
る欠点がある。

また、スギ花粉アレルゲンは、ガラス容器、金属器具な
どに極めて吸着され易く、減感作に際して、スギ花粉ア
レルゲンを一定量ずつ投与することが極めて困難であり
、その取扱いに細心の注意を必要としている。

〈発明が解決しようとする課題〉本発明者等は、スギ花粉症の予防または治療を目的とし
て、スギ花粉アレルゲンの改質に着目し、新しい減感作
剤の確立をめざして鋭意研究し、既に、特開平１−１５
６９２６号公報でスギ花粉アレルゲンと糖質とを共有結
合せしめた減感作剤を出願した。

しかしながら、この減感作剤は、大部分の患者の症状を
和らげることが判明したものの、一部になおこの減感作
剤で減感作し難い患者のいることが判明した。

そこで、スギ花粉に含まれるアレルゲン自体について更
に研究を続け、新規アレルゲンの検索と、このアレルゲ
ンと糖質とを結合せしめた減感作剤の確立をめざして鋭
意研究を続けてきた。

く課題を解決するための手段〉本発明は上記課題を解決するためになされたものであっ
て、新規スギ花粉アレルゲン、とりわけ、部分アミノ酸
配列としてそのＮ末端から順に、Ａｌａ−１　１ｅ　−
　Ａｓｎ　−　Ｉ　ｌｅ　−　Ｐｈｅ　−　Ａｓｎ−の
配列を有している花粉アレルゲンが花粉中に少量存在す
ることを見いだし、この新規花粉アレルゲンが、特開平
１−１５６９２６号公報で開示した部分アミノ酸配列と
してそのＮ末端から順に、Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｉ
１ｅ−Ａｓｐ　−Ｓｅｒ　−の配列を有している花粉ア
レルゲンの約１／５ｏ乃至１／５量混在していることを
見いだし、更に、この新規アレルゲンと糖質とを共有結
合せしめた減感作剤が本目的を満足することを見いだし
、本発明を完成した。

本発明で言うスギ花粉アレルゲンは、ニッポンスギ（オ
モテスギ、ウラスギ）の花粉から調Ｈざれるアレルゲン
で、その構造が、部分アミノ酸配列として、そのＮ末端
から順に、Ａｌａ−１１ｅ−Ａｓｎ−＝Ｉ１ｅ　−　Ｐ
ｈｅ　−　Ａｓｎ一の配列を有し、更に望ましくは、Ｎ
末端から順に、Ａｌａ−Ｉ１ｅ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｐｈ
ｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ一の配
列を有しているアレルゲンが好適である。

本発明で言う糖質とは、例えば、澱粉、アミロース、デ
キストラン、ポリシュクロース、ブルラン、エルシナン
、カードラン、アラビアガム、トラガカントガム、グア
ーガム、ザンタンガム、カラギーナン、ベクチン、セル
ロース、グルコマンナン、キトーサン、リボポリサッヵ
ライドなどの各種単純若しくは複合多糖類、これら多糖
類誘導体、またはこれら多糖類の部分加水分解物などが
自由に利用でき、その平均分子量は、通常５００〜ｉｏ
．ｏｏｏ，ｏ００、とりわけ、１０．０００〜１　，　
０００　，　０００の範囲のものが望ましい。

なかでも、ブルラン、エルシナンまたはこれらの部分加
水分解物などのマルトトリオース残基を繰り返し単位と
する水溶性中性多糖類の使用は、スギ花粉アレルゲンと
共有結合させることにより、スギ花粉アレルゲンによる
アナフィラキシーを防止できるとともに、より効果の高
いスギ花粉症減感作剤を容易に製造できるので好都合で
ある。

また、大ｍｖａ，サルモネラ菌、セラチア菌などの微生
物由来のリボポリサッカライドなどの複合多糖類または
これらの部分加水分解物の使用は、スギ花粉アレルゲン
と共有結合させることにより、粘膜などへの結合性が優
れていることから、経皮、経粘皮型減感作剤として好都
合である。

本発明で言う共有結合方法は、スギ花粉アレルゲンと糖
質とが共有結合し得る各種の方法を採用でき、例えばジ
アゾ法、ベブチド法、アルキル化法、架橋法、アミド結
合法、過沃素ｒｍｗＩ化法、Ｓ−Ｓ結合法などがある。

ジアゾ法としては、例えばｐ−アミノベンジル基、ｐ−
アミノベンゾイル基、ｍ−アミノベンジル基、ｍ−アミ
ノベンゾイル基、ｍ−アミノアニソール基、ｍ−アミノ
ベンジルオキシメチル基、３一（ｐ−アミノフェノキシ
）−２−ヒドロキシプ口ビオニル基、３−（ｐ−アミノ
ーｍ−メチルアニリノ）一５−クロ０トリアジニル基な
どの芳香族アミノ基を公知の方法によって導入して得た
活性化糖質とスギ花粉アレルゲンとを反応させればよい
。

ベブチド法としては、例えば、カルポキシル基を有する
糖質を例えば、アジド、酸クロリド、カルボジイ４ド、
イソシアナートなどの誘導体とした糖質カルボナート、
臭化シアン活性化糖質などの活性化糖質とスギ花粉アレ
ルゲンとを反応させればよい。

アルキル化法としては、例えば、クロロアセチル基、プ
ロモアセチル基、ヨードアセチル基、ハロゲン化トリア
ジニル基などを導入した糖質八〇ゲン化アルキル誘導体
とスギ花粉アレルゲンとを反応させればよい。

架橋法としては、スギ花粉アレルゲンと糖質との共存下
に、例えば、グルタルアルデヒド、グリオキザール、サ
クシンアルデヒド、ヘキサメチレンジイソシアナート、
トルエン−２．４−ジイソシアナート、ビスアゾベンジ
ジン、Ｎ，Ｎ’一エチレンビスマレインイミドなどの架
橋試薬を反応させればよい。

アミド結合法としては、例えば、アミノ基を有する糖質
を、例えば、プロモアセチルブロマイド、クロロプチリ
ルクロライド、フルオロブロビオニルフルオライド、ヨ
ードバレリルアイオダイドなどの八口アシルハライドと
反応せて得られる活性化糖質とスギ花粉アレルゲンとを
反応させればよいＯ反応時のスギ花粉アレルゲンと糖質との重量比は、通常
はｔ　＋　ｏ．ｏｏｔ〜Ｌ０００、望ましくは、１：０
．０１〜１００から選ばれる。

反応条件は、生成するスギ花粉アレルゲン糖質結合物が
スギ花粉アレルゲン本来のイムノグ口ブリンＧおよびイ
ムノグ口ブリンＭ抗体産生能を実質的に低下せしめるこ
となく、アナフィラキシーおよびアレルギーを惹起する
イムノグロブリンＥ抗体産生能を著減し得る条件であれ
ばよく、通常は温度約０〜１００℃、ｐＨ約３〜１２で
約０．１〜５０時間の範囲が選ばれる。

このようにして生成したスギ花粉アレルゲン糖質結合物
を、通常、例えば濾過、洗浄、遠心分離、塩析、透析、
吸脱着、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー　ア
フィニティクａマトグラフィー、電気泳動などの方法で
分離精製した後、濃縮して溶液状またはシラップ状で採
取するか、更に乾燥し粉末状で採取してスギ花粉症に対
する減感作剤を得る。

本減感作剤は、そのままで、または必要に応じて、例え
ば安定剤、防腐剤、アジュパント、賦形剤などを添加し
、スギ花粉症の予防剤、治療剤などとして有利に利用で
きる。

このようにして製造される減感作剤は、従来使用されて
いるスギ花粉アレルゲンの墳合と比較して、該アレルゲ
ンに特異的なイムノグ口ブリンＧ１イムノグ口ブリンＭ
抗体産生を著しく増大し、一方、アレルギーやアナフィ
ラキシーを惹起する該アレルゲンに特異的なイムノグロ
ブリンＥ抗体産生を著しく低減できる。また、スギ花粉
症患者に投与して、該アレルゲンに特異的なイムノグ口
ブリンＥ抗体量を著減させることもできる。

更に、本発明の減感作剤は、スギ花粉アレルゲンと比較
してガラス容器、金属器具などへの吸着損失もなく、安
定性良好であり、また、アナフィラキシーの恐れなく投
与でき、更に、減感作に要する時間も約１７３〜１／２
００に短縮できるなどの長所を有している。

本発明の減感作剤は、例えば、凍結乾燥注射剤、溶液注
射剤などの注射剤として製造され、皮肉、皮下、筋肉内
、腹腔内などに成人１回当り約０．０１〜１００，ＯＯ
Ｏｎｇの範囲から選ばれる量を、毎週１〜２回程度約１
〜１２ケ月間投与することによって減感作の目的を達成
することができる。

更に、本発明の減感作剤は、例えば、トローチ、舌下錠
、点眼剤、鼻腔内噴霧剤、バップ剤、クリーム剤、ａ−
シ９ン剤などの経皮、経粘皮薬としても製造され、その
投与量、投与頻度などを適宜選択することにより、その
減感作の目的を有利に達成することができる。

この局所投与方法の場合には、本発明の減感作剤がスギ
花粉症患者の組織に結合しているイムノグ口ブリンＥと
アレルゲンとの結合を阻止することもできることから、
その作用は、投与ざれた局所で即効性であり、患者の苦
痛を直ちに和らげることができる。

また、本発明の減感作剤は、スギ花粉症の予防剤、治療
剤のみならず、ヒノキ花粉症の予防剤、治療剤としても
有利に使用できる。

更に、本減感作剤は、先願待開平１−１５８９２６号公
報で開示されている減感作剤と併用することにより、適
応患者を広げることも有利に実施できる。

以下、本発明を実験により詳細に説明する。

実験Ｉ−１　　スギ花粉アレルゲンの調製千葉県産のス
ギ（オモテスギ）から採取したスギ花粉に、重量で約１
５倍量の０．１２５Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液（ｐＨ
８．０）を加え、４℃でゆっくり１時間撹拌抽出した後
、遠心分離して上清を得た。

残渣を同様に再度抽出し遠心分離した。これらの上清を
硫安塩析（８０％飽和）し、塩析物を透析、濾過し、濾
液をＤＥＡＥ−セファデックス力ラムにかけ、非吸着画
分を採取し、これを、ＣＭ−セファデツクス力ラムにか
け、リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で溶出し、次いで、
｝ｌｏｎｏ　Ｓカラムにかけ、トリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．０）存在下、塩化ナトリウム濃度勾配で分＃ｌ溶出
してヒト花粉症患者のイムノグロブリンＥ抗体および抗
スギ花粉アレルゲンマウス抗体と強い親和性を示す精製
スギ花粉アレルゲン液を、原料のスギ花粉に対して、固
形物当り約０．００１％の収率で掃た。

なお、本発明のアレルゲンの調製方法において、Ｍｏｎ
ｏ　Ｓカラムからの分＃溶出に際し、先願の特開平１−
１５６９２６号公報で開示したスギ花粉アレルゲンが塩
化ナトリウム濃度約０．２５Ｍで信出されたのに対し、
本発明のアレルゲンは、塩化ナトリウム濃度約０．４０
Ｍで溶出され、その収量は先願アレルゲンの約１／２０
であった。

本品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定したところ、分子量約
４０，０００±ｓ　，　ｏｏｏ　テ、等電点は約９．５
附近であった。

本品を用いて、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｆｃａＪ　Ｃｈｅｍｆｓｔｒｙ）、第２５６巻
、第７９９０　〜７９９７頁（１９８１年）の記載に準
じて、気相プロテイン　シークエンサーにより分解し、
高速液体クロマトグラフィーで同定して、部分アミノ酸
配列を調べたところ、そのＮ末端から順に、アラニンー
イソロイシンーアスパラギンーイソロイシンーフェニル
アラニンーアスパラギンーパリンーグルタミン酸一リジ
ンーチロシンーの配列を有していることが判明した。こ
の配列を構成するアミノ酸残基はいずれも光学異性体Ｌ
体であって、本明細書では、Ａｌａ−Ｉ１ｅ−Ａｓｎ−
Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−
Ｔｙｒ一と省略記号で示すこともある。

実験１−２　　スギ花粉アレルゲンとブルランとの共有
結合物の調製ブルラン（平均分子量２００．０００）の２ｗ／ｖ％水
溶液１００糺に１．７ｖ／ｖ％塩化シアヌルアセトン溶
液２■Ｌを加え、氷水中で５℃以下に保つと共に５％炭
酸ナトリウム水溶液でＰＨを７．０に保ちつつ２時間反
応させた後、そのｐ｝ｌを保ちつつ４℃の水で一夜透析
して活性化ブルラン液を得た。この活性化プルラン液３
０−Ｌに実験１−１の方法で得た精製スギ花粉アレルゲ
ン液４０ｍＬ　（璽し当り約１厘ｇのアレルゲンを含む
）を加え、撹拌しつつｐＨ７。０、３７℃に５時間保ち
、次いで、５℃で一夜放置し、これにグリシン６ｇを加
えて撹拌しつつ１０時間保った。これをＯ．．ＯＩＭ酢
酸緩衝液（ｐＨ５．０）で透析し、次いでＣＭ−セファ
デックス力ラムにかけ、その非吸着画分を精密濾過して
アレルゲンブルラン共有結合物を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約６０％であった。

本品は、スギ花粉アレルゲンの場合とは違って、ガラス
容器、金属器具への吸着損失もなく、安定性良好で取扱
い容易である。

実験Ｉ−３　動物への投与テスト実験Ｉ−３−　１　　予防剤テストマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ，１０〜１２週令、メス、１群６
匹）を用いて、実験Ｉ−２の方法で得たアレルゲンブル
ラン共有結合物をアレルゲンとしてｌｕｇ含有した生理
食塩水０．２ｍＬを毎週１回、３週に亙って腹腔内投与
し、その１週間後に、実験Ｉ−１の方法で得たスギ花粉
アレルゲン１μｇとアジュバントとして水酸化アルａニ
ウム４−ｇとの混合物を含有する生理食塩水０．２重し
を同様に投与した。

スギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグ口ブリンＧ１イ
ムノグロブリンＭ抗体量およびイムノグ口ブリンＥ抗体
量は、アレルゲンと水酸化アルミニウム混合物の投与直
前と投与終了ｔｉ！！間経過後に採血して測定した。

対照として、アレルゲンブルラン共有結合物の代りに、
実験！−１の方法でＩＩ製したスギ花粉アレルゲン】μ
ｇと実験１−２で用いたブルラン４０μｇとの混合物を
使用した以外は同様に行った。

なお、イムノグ口ブリンＧ，イムノグ口プリンＭ抗体量
は、ザ・ジャーナル・オブ●パイオケミストリー（Ｔｈ
ｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
）、第９２巻、第１４１３〜１４２４頁（１９８２年）
に報告されている酵素免疫吸着測定法（Ｅ　Ｉ　Ａ）に
よる抗体価で、イムノグ口ブリンＥ抗体量は、ライフ・
サイエンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、第８巻、
バートｌＬ第８１３〜８２０頁（１９６９年）に報告さ
れているＰＣＡ反応による抗体価で比較した。結果は第
１表に示す。

第　　　　１　　　　表（ω 数値は、マウス１稍囮蛋に産生されたイムノグ口プリン
抗体価の平均値。

第１表の結果から明らかなように、本発明のスギ花粉ア
レルゲンとブルランとの共有結合物は、それらの単なる
混合物とは違って、スギ花粉症を予防する減感作剤とし
て好適である。

実験Ｉ−３−２　　治療剤テストマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ，１０〜１２週令、メス、１群６
匹）を用いて、実験Ｉ−１の方法で得たスギ花粉アレル
ゲン１μｇとアジュバントとして水酸化アルミニウム４
■ｇとの混合物を含有する生理食塩水０．２ｍＬを毎週
１回、３週に亙って腹腔内投与し、その２週間後に、実
験Ｉ−２の方法で得たアレルゲンブルラン共有結合物を
アレルゲンとして１μｇ含有した生理食塩水０．２ｍＬ
を毎週３回、３週に互って同様に投与した。

更に、イムノグ口ブリンＥ抗体産生の再誘導をアレルゲ
ン水酸化アルミニウム混合物で同様に行った。

イムノグ口ブリンＧ１イムノグロブリンＭ抗体量および
イムノグ口ブリンＥ抗体量は、アレルゲンプルラン共有
結合物投与直前と投与終了１週間経過後、更にイムノグ
ロブリンＥ抗体再誘導１週間経過後に採血して測定した
。

対照実験は、実験１　−３−１の場合と同様に、アレル
ゲンブルラン共有結合物の代りにスギ花粉アレルゲンと
プルランとの混合物を使用した。

結果は、第２表に示す。

第２表の結果から明らかなように、本発明のスギ花粉ア
レルゲンとブルランとの共有結合物は、それらの単なる
混合物とは違って、スギ花粉症を治療する減感作剤とし
て好適である。

また、アレルゲン水酸化アルξニウム混金物の投与によ
り予め感作させ、イムノグ口ブリンＥ産生の認められた
モルモット、ラットまたはマウスを用いて、上記のアレ
ルゲンブルラン共有結合物を含有する生理食塩水を口腔
内、鼻腔内、皮内または皮下に投与し、その１時間後に
スギ花粉アレルゲンを口腔内、鼻腔内、皮内または皮下
に投与したところ、本来起こるべきアレルギー反応は観
察されなかった。

以上述べてきたように、本発明のスギ花粉アレルゲンと
糖質との共有結合物は、アナフイラキシーの恐れもなく
、高い減感作効果を発揮するので、スギ花粉症を予防ま
たは治療するための減感作剤として好適である。

実験ＩＩ　−　１　　スギ花粉アレルゲンとりボボリサ
ッカライドとの共有結合物の調製大腸薗由来のりボポリサッカライド１０鳳ｇを含ｔｒｌ
ｏｍＭ　！Ｊ　ン酸カルシウム溶Ｗ１曽ＬＬ−、１００
ｍＭ過沃素酸ナトリウム６０μＬを加え、室温で２０分
間反応させリポボリサッカライドの糖鎖を開裂させた後
、４℃のＩＭ−グリシン塩酸ｔｉｌＪ衛液（ｐＨ４．４
）で一夜透析し、過剰量の過沃素酸ナトリウムを除去し
、これに０．１Ｍ−炭酸水素ナトリウム緩衝液を加えて
ＰＨを約９．５に調整した。

又、リン酸ａｔ衝ｉ（ｐＨ９．５）１＋ｅＬニ、実ＤＩ
　−１の方法で得た精製スギ花粉アレルゲン１０ｍｇを
溶解し、これに上記のリボポリサッカライド溶液を混合
し、シップ塩基（Ｓｃｈｉｆｆ　ｂａｓｅ）を形成させ
た。

更に、水素化硼素ナトリウムを加えて複合体の形成反応
を完了させ、次いでセファデックスＧ−１００カラムに
かけ、アレルゲンリポポリサッカライド共有結合物を含
有する画分を採取し、その画分を精密濾過してアレルゲ
ンリボポリサッカライド共有結合物を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約４０％であった。

本品は、スギ花粉アレルゲンの場合とは違って、ガラス
容器などへの吸着損失もなく、安定性良好で取扱い容易
である。

実験！！−２動物への投与テスト治療剤テストマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ，１０〜１２週令、メス、１群６
匹）を用いて、実験１１−１の方法で得たアレルゲンリ
ポボリサツカライド共有結合物をアレルゲンとして１０
μｇ含有した生理食塩水１■Ｌをマウスに毎週３回、３
週に互って経口投与し、次いでその投与１週間経過後に
採血してスギ花粉アレルゲンに特異的なイムノグロブリ
ンＡ１イムノグ口ブリンＧ抗体量およびイムノグ口ブリ
ンＥ抗体量を測定した。

対照実験は、アレルゲンリボポリサツカライド共有結合
物の代わりに、アレルゲンとりボポリサッカライドとの
混合物を使用した以外は、同様に行った。なお、イムノ
グ口ブリンＡおよびイムノグ口ブリンＧ抗体量は、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジカル●メソツズ（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ）　、第６巻、第３５５　〜３６２頁（１９７５年
）に報告されているＥＩＡ法による抗体価で、イムノグ
ロブリンＥ抗体量は、実９Ｉ　−３−１で用いたＰＣＡ
反応による抗体価で比較した。結果は、第３表に示す。

第　　　　３　　　　表（注）数値は、マウス１群６匹に産生きれたイムノグ口
プリン抗体価の平均値。

第３表の結果から明らかなように、本発明のアレルゲン
リポポリサッカライド共有結合物は、それらの単なる混
合物とは違って、スギ花粉症を予防または治療する減感
作剤として好適である。

また、アレルゲン水酸化アルミニウム混合物の投与によ
り予め感作させ、イムノグ口プリンＥ産生の認められた
マウスを用いて、上記のアレルゲンリポポリサッカライ
ド共有結合物を含有する生理食塩水を口腔内および轟腔
内に噴霧し、その３０分後にスギ花粉アレルゲンを口腔
内および鼻腔内に噴霧したところ、本来起こるべきアレ
ルギー反応は観察されなかった。

一般に、アレルゲンリポボリサッカライド共有結合物な
どのスギ花粉アレルゲンと複合多糖類との共有結合物は
、アレルゲンブルラン共有結合物などのスギ花粉アレル
ゲンと単純多糖類との共有結合物の場合と比較して、粘
膜結合性に優れ、局所に止どまる時間が長いことから、
粘膜での吸収率が高く経口、経鼻腔など経皮、経粘皮型
の減感作剤としてより優れた効果を発揮する。

以下、本発明の実施例を述べる。

実施例１（１）スギ花粉アレルゲンの調製秋田県産のスギ（ウラスギ）から採取したスギ花粉を用
いて、実験Ｉ−１の方法に準じて、精製スギ花粉アレル
ゲン液を調製し、原料のスギ花粉に対して、固形物当り
約０．００１％の収率で得た。

本品をＳＤＳ−ＰＡＧＥで渕定したところ、分子量約４
０，０００土ｓ．ｏｏｏで、等電点は約９．５付近であ
った。

また、本品を用いて、実験１−１の方法に準じて、部分
アミノ酸配列を調べたところ、そのＮ末端から１０番目
までのアミノ酸配列が、実験Ｉ−１で述べたオモテスギ
由来の花粉アレルゲンの部分アミノ酸配列と同一結果を
得た。

（２）減感作剤ブルラン（平均分子量約１４０．０００）５ｇを水４０
０ｗＬに溶解し、ＩＮ−水酸化ナトリウム液でｐＨを１
０．７とした後、このＰＨを保ちつつ臭化シアン３ｇを
徐々に加え、１時間反応させた。次いでＩＮ一塩酸でｐ
Ｈを５．０にした後、このｐＨを保ちつつ冷水で透析し
て活性化ブルラン液を調製した。

この活性化ブルラン液に、（１）の方法で調製したウラ
スギ由来の花粉アレルゲンｌ［２００ｍＬを加えて室温
下で２４時間反応させた。反応後、反応液の３倍量のア
セトンを加えて沈澱物を採取し、これｅｏ．ｏＩＭ酢酸
緩ＩＩ　ＷＲ　（ｐＨ５．０）　ニ溶解シ、遠心分離し
て不溶物を除去し、上清をＣＭ−セファデツクス力ラム
にかけその非吸着画分を精密濾過し、アンプル詰めして
、アレルゲンブルラン共有結合物を含有する液状減感作
剤を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約７０％であった。

本品は、アナフイラキシーの恐れもなく、高い減感作効
果を発揮するのでスギ花粉症の予防剤、治療剤として好
適である。

また、本品は、スギ花粉アレルゲンの場合とは違って、
ガラス容器、金属器具への吸着損失もなく、安定性良好
で取扱い容易である。

実施例２ブルラン部分加水分解物（平均分子量約１０，０００）
５２ｇをジメチルホルムアミド１１０＋ｓＬに加温しつ
つ溶解し、次いで室温に冷却してこれに１０厘Ｌのビリ
ジンを加え、撹拌しつつ、４−ニトロベンゾイルクロリ
ド１．０ｇを添加し、室温下で１７時間保った。これに
２倍容量のｎ−プロビルアルコールを加え沈澱物を採取
し、ジメチルホルムアａドに溶解した。この操作を３回
繰り返して得た沈澱を５ｖ／ｖ％八イドロサルファイト
ナトリウム水溶液１００ｍＬに溶解して８０℃に３０分
間保った後、活性炭で脱色し、２倍容量のｎ−プロビル
アルコールで沈澱したものを水に溶解して、一夜水道水
で透析した。この溶液を２℃以下に冷却し、撹拌しつつ
塩酸を最終濃度約０．ＩＮになるように加えて、次に亜
硝酸ナトリウムを約１ｗ／ｖ％になるように加え、その
後３０分間反応させ、次いで２℃以下の蒸留水で２時間
透析して活性化ブルラン部分加水分解物を得た。

この活性化プルラン部分加水分解物溶液に実験Ｉ−１の
方法で得たオモテスギ由来の花粉アレルゲン［２０ｍＬ
を加え、炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ８．５として４℃
に保ち、撹拌しつつ２時間結合反応させた後、実施例１
と同様に精製し、アンプル詰めしてアレルゲンプルラン
部分加水分解物共有結合物を含有する液状減感作剤を得
た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約６０％であつたＯ本品は、実施例１の場合と同様にスギ花粉症の予防剤、
治療剤として好適であり、ガラス容器、金属器具への吸
着損失もなく、安定性良好でその取扱いも容易である。

実施例３エルシナン（平均分子量約２００，０００）　１０ｇを
２００ｍＬ蒸留水中に加温しつつ溶解し、次いで室温ま
で冷却して、これにヘキサメチレンジアミン５ｇを添加
し、ＩＮ−水酸化ナトリウム液でＰＲを１１．０とした
。これを氷水中で２０℃以下に保つとともにｐＨを維持
しつつ臭化シアン５ｇを添加し、撹拌しながら３０分間
反応させ、続いて４℃の蒸留水で１時間透析して活性化
エルシナン溶液とした。

この活性化エルシナン溶液に２５ｖ／ｖ％グルタルアル
デヒド液２重しと実験Ｉ−１の方法で調製したオモテス
ギ由来のスギ花粉アレルゲン液６０ｍＬを加え、更にＩ
Ｍ酢酸塩緩ｍ液（ｐＨ５．０）を１０ｍＬ添加し、４℃
で２４時間撹拌しつつ結合反応させ、次いでグリシンを
濃度ｌＭになるように添加し、室温で２４時間保ち、更
に遠心分離し、上溝をゲル濾過してアレルゲンエルシナ
ン共有結合物の画分を採取した。これを濃縮し、精密濾
過し、ビン詰、凍結乾燥し、キャツブシールしてアレル
ゲンエルシナン共有結合物を含有する固状減感作剤を得
た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約５０％であった。

本品は、実施例１の場合と同様にスギ花粉症の予防剤、
治療剤として好適であり、その取扱いも容易である。

実施例４ｌｖ／ｖ％カルポキシメチルセルロース（平均分子量約
２０．０００）水溶Ｐｌ！２００ｍＬニ１　−工ｆ　）
Ｌｔ　−３　−　（３　−ジメチルアミノブロビル）カ
ルポジイミドーメチオジド２ｇｔ−添加し、ＩＮ−塩酸
でｐｎを４．０に維持して撹拌しつつ室温下で２時間反
応させた後、蒸留水で一夜透析し、活性化力ルボキシメ
チルセルロース溶液を調製した。

この活性化力ルボキシメチルセルロースｉＷＭに、実施
例ｌ（１）の方法で調製したウラスギ由来の花粉アレル
ゲン液５０糺を添加し、ＰＨを４．５に維持して撹拌し
つつ室温下で一夜反応させた後、実施例３と同様に精製
し、アンプル詰めしてアレルゲンカルボキシメチルセル
ロース共有結合物を含有する液状減感作剤を得た。

収率は、アレルゲン蛋白質当り約３０％であった。

本品は、アレルゲンプルラン共有結合物、アレルゲンエ
ルシナン共有結合物の場合よりもスギ花粉アレルゲンに
特異的なイムノグロブリンＧ１イムノグ口プリンＭ抗体
産生量がやや劣るものの、該アレルゲンに特異的なイム
ノグロブリンＥ抗体の産生はなく、スギ花粉症の予防剤
、治療剤として使用しろるものであり、その取扱いも容
易である。

実施例５サルモネラ菌由来のりポポリサッカライド１００１ｇを
約４℃の５０％飽和酢酸ナトリウム２５ｍＬに加え、０
．５Ｎ−水酸化ナトリウムを用いてｐＨ９．０とし、こ
れにプロモアセチルブロマイド２０ｕＬと無水ジオキサ
ン１■Ｌとの混合溶液（ｐＨ約８６５）を徐々に添加し
た。次いで、６Ｎ一塩酸を用いてｐｏ約４．５に調整し
、４℃の水で５日間透析し、活性化リポポリサッカライ
ド溶液を調製した。

この活性化リポポリサッカライド溶液に、実施例１（１
）の方法で調製したウラスギ由来の花粉アレルゲン液４
０ａＬを添加し，　ＰＨを４．５に維持して撹拌しつつ
、２５℃で２日間反応させた後、実施例３と同様に精製
し、アンプル詰してアレルゲンリボボリサッカライド共
有結合物を含有する液状減感作剤を得た。

収率ぱ、アレルゲン蛋白質当り約３５％であった。

本品は、スギ花粉症の予防剤、治療剤として好適であり
、その取扱いも容易である。

また、糖質としてリボボリサッカライドを使用する本品
は、粘膜結合性に優れ局所に止どまる時間が長いことか
ら、粘膜での吸収が高く経口経鼻腔などの経皮、経粘皮
型減感作剤としてより優れた効果を発揮する。

く発明の効果〉上記したことから明らかなように、本発明の新規スギ花
粉アレルゲン、とりわけ、部分アミノ酸配列としてその
Ｎ末端から順に、＾ｌａ−Ｉ１ｅ−Ａｓｎ　−Ｉ　ｌｅ
　−　Ｐｈｅ　−　Ａｓｎ−の配列を有している花粉ア
レルゲンと糖質とを共有結合せしめた減感作剤は、スギ
花粉アレルゲンの場合と比較して、スギ花粉アレルゲン
に特異的なイムノグ口ブリンＧ１イムノグ口プリン間抗
体産生を著しく増大するとともに、アレルギーやアナフ
ィラキシーを惹起する該アレルゲンに特異的なイムノグ
口ブリンＥ抗体産生を著しく低減できるので、アナフィ
ラキシーの恐れなく投与でき、減感作に要する期間も約
１７３〜１／２００に短縮できる。

また、本発明の減感作剤は、スギ花粉症患者の組織に結
合してぃるイムノグロブリンＥと花粉アレルゲンとの抗
原抗体反応を阻止し、患者の局所での苦痛を即効的に和
らげることができることから、経皮、経粘皮薬などの局
所投与剤としても有利に利用できる。

更に、本発明の減感作剤は、ガラス容器、金属器具など
への吸着損失もなく、スギ花粉アレルゲンと比較して安
定性良好であり、取扱いも容易でその工業的意義は大き
い。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）部分アミノ酸配列としてそのＮ末端から順に、Ａ
ｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−の配
列を有しているスギ花粉アレルゲンと糖質とを共有結合
せしめた減感作剤。
（２）スギ花粉アレルゲンの部分アミノ酸配列が、その
Ｎ末端から順に、Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｐ
ｈｅ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−の配
列を有していることを特徴とする特許請求の範囲第（１
）項記載の減感作剤。
（３）スギ花粉アレルゲンが、ニッポンスギの花粉から
調製したものであることを特徴とする特許請求の範囲第
（１）項または第（２）項記載の減感作剤。
（４）糖質が、マルトトリオースを繰り返し単位とする
多糖類またはリボポリサッカライドであることを特徴と
する特許請求の範囲第（１）項、第（２）項または第（
３）項記載の減感作剤。
（５）減感作剤が、スギ花粉症治療のための減感作剤で
あることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項、第（
２）項、第（３）項または第（４）項記載の減感作剤。