JPH0533240B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ハンガリー特許第178703号には、選択的な食欲
減退物質、すなわち食物摂取を選択的に抑制する
物質の製造法が記載されている。この物質はそれ
まで全く知られていなかつた物質で、新しい作用
機構で働き、ヒトの血漿から製造され、サチエチ
ンと命名された。この物質は部分的に精製されて
いるにすぎなかつたが、それまで知られていた類
似作用をもつ物質よりはるかに強い作用を示し
た。

この物質は血漿の限外ろ過と、セフアデツクス
Ｇ−15およびBio−Gel Ｐ−２ゲル上での２工程
クロマトグラフイーを用いて精製された。

この物質がペプチドとしての性質をもつこと、
またアミノ酸の定量的な関係も確認された。アミ
ノ酸のほか、加水分解後に糖成分も認められ、し
たがつて、この満腹中枢に特異的に作用する物質
は糖蛋白であると考えられた。

この発明はさらに改良され、活性分画はさらに
分割できること、すなわち付加的工程を加えるこ
とで精製できることが明らかにされた。1982年３
月３日付で補正されたハンガリー特許出願2783／
81号によれば、前述の特許の方法で得られた活性
物質に比べて、３〜４倍有効で、化学的組成もか
なり異なる物質が得られている。この物質は、化
学的に純粋かつ均一な活性物質と思われる。その
物理的特性および最終的組成も明らかにされてい
る。

上述の方法によれば、血漿は限外ろ過後に重要
な操作に付された。すなわち、血漿ろ過はトリク
ロロ酢酸で処理され、存在する血清蛋白（アルブ
ミン等）が除去された。その一定部分はアミコン
（Amicon）膜を通過できた。トリクロロ酢酸処
理後、沈澱した血清蛋白を遠心分離によつて沈降
させ、生物学的に有効なサチエチン分画を含有す
る純粋な上清をゲルカラム上でさらに精製した。
最初の工程では、セフアデツクスＧ−15カラムか
らの溶出に酢酸アンモニウム緩衝液を用いた。活
性を含む分画は空〓容量に捕集され、適当に濃縮
したのちBio−Gel Ｐ−２カラム上で脱塩され
た。この塩を含まない分画は純度の高い物質と考
えることができた。この生成物は食物摂取に関す
るすべての実験を含めた生物学的研究にきわめて
有用であつた。

この工程では、サチエチンの活性に影響しない
低分子量のペプチドおよびグリコペプチドが残つ
たのみで、これは次に電気泳動および親和性クロ
マトグラフイーによつて除去された。純粋な活性
物質は、Con−Ａセフアロースカラム上での親和
性クロマトグラフイーによる分画とBio−Gel Ｐ
−２カラム上での反復脱塩後に凍結乾燥して得ら
れた。この方法で得られた物質は、ペプチド含量
が低く（５〜25％）、炭水化物含量が高い（60〜
90％）糖蛋白であることが明らかにされた。活性
物質の分子量は50000〜70000ダルトンの範囲で、
等電点は中性、すなわちpI7.0〜7.1であつた。

本発明は最近の研究中に、上述の公知方法が著
しく単純化できることを発見し、完成されたもの
である。ある特定の工程を挿入することにより、
物理的性状の異なる、選択的食欲摂取阻害物質を
得ることができた。この物質は化学的に均一で、
したがつて全く新規な生成物と考えることができ
た。この物質は、サチエチン−Ｄと命名された。
その単離方法は第１図に示すとおりである。以下
にその方法について詳述する。

ヒトおよび（または）動物の血清または血漿
を、分子量50000ダルトンまでの範囲を通過させ
る膜フイルターを通してろ過する。この膜ろ過
（または限外ろ過）は、それぞれ平坦な膜または
カラムを通すことによつて実施できる（いわゆる
中空繊維法−hollow fibre technics−による）。
ついでろ液を蒸発させ、濃縮物から遠心分離また
はろ過により不溶部分を適当に除去し、この液体
に、温度０℃〜10℃で、濃度が５〜25w／ｖ（重
量／容量）％、好ましくは９〜11w／ｖ％になる
ようにトリクロロ酢酸を加える。沈澱した蛋白
を、遠心分離またはろ過によつて適当に除去し、
得られた純粋な溶液を、分子量4000ダルトン以下
の空〓容量のゲル上クロマトグラフイーに付し、
PH6.0〜7.0の緩衝液で溶出し、生物学的活性分画
を減圧下に凍結乾燥または蒸発させ適当に濃縮
し、再び分子量3000〜4000ダルトン以下の空〓容
量のゲル上クロマトグラフイーに付し、蒸留水
（脱塩）で溶出し、得られた粗生成物は凍結乾燥
物とし、さらに精製または処理する。

本発明の方法によれば、この凍結乾燥粗生成物
をPH8.1〜8.2の緩衝液、適当には２−アミノ−２
−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール
塩酸塩（Tris塩酸塩）の0.1モル溶液に溶解し、
総重量に対して0.01〜0.2重量、適当には0.1重量
部のトリプシン、ならびに同量のキモトリプシン
を加える。ついで、反応混合物を37〜38℃で、20
〜30時間、適当には24時間、好ましくは間欠的攪
拌もしくは連続的振盪下に、消化に付す。反応開
始５時間後に、半量（前述の量に対して）のトリ
プシンおよびキモトリプシンを混合物に追加し、
消化を続ける。この混合物から、トリクロロ酢酸
での冷時処理、ついで分子量3000〜4000ダルトン
以下の空〓容量のゲル上クロマトグラフイーによ
り、純粋な活性物質を塩を含まない形で分離す
る。

本発明の方法の一実施態様によれば、精製操作
は、Amicon YM−10平坦膜上、あるいは50000
ダルトンで分離するカラム上Amicon中空繊維デ
バイス中、適当には圧力もしくは適当なポンプを
用いる限外ろ過によつて始める。得られた限外ろ
過液を減圧下に蒸発させて濃縮し、不溶部分は製
造遠心分離によつて分離するか、減圧下にZeiss
ろ板でろ去する。かくして得られた、沈殿を含ま
ない混合物を温度０〜10℃に冷却し、55％トリク
ロロ酢酸を、濃度が５〜25w／ｖ％、好ましくは
９〜11w／ｖ％になるように加える。このように
処理した溶液を温度０〜５℃に好ましくは１時間
保持し、沈殿または白濁を同温度で超遠心分離す
るかまたは減圧下にZeissろ板を通してろ過して
除去すると、純粋な、鮮明な黄色の溶液が得られ
る。上述の特許の記載から明らかなように、限外
ろ過後に存在する蛋白、たとえばアルブミンもト
リクロロ酢酸によつて除去されるが、活性物質、
すなわちサチエチンは溶液中に残る。

精製の次の工程としては、分子量4000ダルトン
以下の空〓容量のゲルカラム上におけるゲルクロ
マトグラフイーが採用される。この工程はセフア
デツクスＧ−15，Ｇ−10またはＧ−25ゲルを充填
したカラム上で実施できる。溶出には、揮発性で
凍結乾燥により比較的除去しやすい酢酸アンモニ
ウムの0.1モル溶液が使用される。そのほか、生
理食塩水（0.9％塩化ナトリウム溶液）や各種の
リン酸塩緩衝液も分離のために使用できる。活性
な分画はカラムの空〓容量に現われ（この分画は
カラム容量の３分の１に相当する溶出容量でケル
から排出される）、これを合して、凍結乾燥によ
り濃縮する。

精製の次の工程も、分子量3000ダルトン以下の
空〓容量のゲル上クロマトグラフイーである。
Bio−Gel Ｐ−２カラム上、メジウムとして蒸留
水を用いるのが適当である。この精製工程では、
塩および存在する可能性がある他の低分子量夾雑
物が除去される。サチエチン活性を有し、空〓容
量に現れる分画を合して凍結乾燥すると、淡黄色
または白色の粉末の形で粗生成物が得られる。等
電点pIは、7.0〜7.1である。この方法により、ヒ
ト血清または血漿１から、凍結乾燥粗生成物８
〜10mgが得られ、その１mgは25SU（サチエチン単
位）のサチエチン活性を示し、食物摂取調節剤と
して使用できる。

この生成物のサチエチン活性は、生物学的活性
の測定用に本発明者らが作成した方法によつて測
定できる。サチエチン１単位（SU）とは、96時
間絶食させた体重200〜240ｇのCFY雌性ラツト
に脳室内投与した場合、栄養開始初日における標
準固型飼料の消費が平均の24.4±0.76ｇから10ｇ
に低下する量を意味する。

かくして得られた、サチエチン活性を有する粗
生成物は、電気泳動法たとえばドデシル硫酸ナト
リウム（SDS）の存在下におけるアクリルアミド
ゲル電気泳動または等電点電気泳動によつて検討
した場合、蛋白染色によつて数個のバンドが検知
されることから、まだ均一な物質とは考えられな
い。

均一な活性物質の製造を目的とした努力の過程
で、従来の方法とは異なる、より効率的かつ単純
な方法が案出された。本発明の方法におけるこの
工程には、蛋白分解のための消化が採用されてい
る。これは夾雑物として認められるペプチドや蛋
白は消化によつて分解されるが、糖蛋白であるサ
チエチンは蛋白消化に対してはるかに安定であろ
うとの考えに基づくものである。すなわち、本発
明の方法の一態様によれば、上述の精製方法によ
つて得られた高純度の生成物を、PH8.1〜8.2の緩
和なアルカリ性緩衝液、好ましくはTris塩酸塩
の0.1モル溶液に溶解し、凍結乾燥生成物の総重
量に対して計算して0.01〜0.2、好ましくは0.1重
量部のトリプシン、および等量のキモトリプシン
をこの溶液に加える。ついで、この混合物を、温
度36〜39℃、好ましくは37〜38℃に20〜30時間好
ましくは24時間保持する。反応混合物は振盪また
は攪拌するのが好ましい。消化開始から５時間後
に、最初加えた量の半量のトリプシンおよびキモ
トリプシンを混合物中に追加し、消化を続ける。
約24時間後に、混合物を温度０〜10℃まで冷却
し、トリクロロ酢酸を濃度が４〜６、好ましくは
約5w／ｖ％になるように加える。ついで混合物
を−15〜５℃に、少くとも１時間、最高24時間ま
で保持する。沈殿した不溶部分を好ましくは超遠
心分離またはZeissろ板を通したろ過により除去
する。

精製の次工程では、消化に用いた過剰の酵素を
トリクロロ酢酸で除去したのち、トリクロロ酢
酸、塩、使用した緩衝液および他の低分子量フラ
グメントを除去する。本発明の方法によれば、こ
の工程は、分子量3000〜4000ダルトン以下の空〓
容量を有するゲル上、水性メジウムで純粋な澄明
反応混合物を溶出させることによつて行うのが好
ましい。純粋かつ均一なサチエチンはゲルから排
出され、カラムの容量の３分の１に等しい容量に
出現する。脱イオン水によつて得られた、活性物
質含有分画を合し、凍結乾燥する。純白色の、完
全に純粋な、取り扱いやすい、均一な粉末が得ら
れる。これはサチエチン−Ｄと命名され、以前に
得られた均一のサチエチン生成物とは異なるもの
である。

本発明の方法によつて単離された、均一かつ純
粋なサチエチン−Ｄ活性物質の分子量を、ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）を用いるゲル電気泳動
によつて測定したところ、40000から50000ダルト
ンであつた。この生成物の純度および均一性は、
SDSゲル電気泳動において蛋白、炭水化物の両染
色に対し感受性を示す単一のバンドを与えること
によつても証明された。この事実はこの生成物が
糖蛋白の性質をもつことを示すものでもある。生
成物をPH３〜10および３〜５の両性電解質、それ
ぞれの存在に展開した等電点電気泳動では、等電
点はpI値として約2.9〜3.1であつた。この値は前
述の値と異なり、ヒト血清中に存在する新規物質
と考えることができる。

この生成物の最終組成は次のとおりであつた。

蛋白含量 20〜23％ 炭水化物含量 56〜60％ 非結合水 ６〜10％ 蛋白含量はマイクロビユレツト法で測定し、加
水分解後にアミノ酸分析を行つた。アミノ酸分析
の結果は次のとおりであつた。

Asp 2.86％，Thr 1.61％，Ser 1.25％， Glu 3.60％，Pro 1.36％，Gly 0.87％， Ala 1.18％，Cys 0.16％，Val 0.93％， Met 0.17％，Ile 0.76％，Leu 1.25％， Phe 0.77％，Lys 3.67％，His 0.22％， Arg 0.67％ すなわち、総アミノ酸含量は22.71％、グリコ
サミン含量は、4.90％であつた。

サンプル中の炭水化物含量の１例を示すと次の
とおりである。

フコース4.5％、マンノース8.05％、ガラクト
ース30.3％、グルコース14.4％、合計56.5％ 以上の分析結果および性状から、消化過程を経
て得られた生成物が新規で、これまでヒト血清か
ら分離されたことのない物質であることは明白で
ある。ヒト血清１から、サチエチン活性約50〜
100SU／mgの純粋かつ均一な生成物約４〜６mgが
得られる。

次に本発明を実施例によりさらに詳細に例示す
るが、これは本発明を限定するものではない。

例 １ ａ ヒト血清3000mlを、たえず攪拌しながら３〜
４気圧下に、Amicon UM−10の膜を通してろ
過する。得られた限外ろ液、約2000mlを減圧下
に60mlまで蒸発させる。沈殿を含む濃縮液を
9000ｇで30分間遠心分離したのち上清液を分離
し、冷却、攪拌下に55％トリクロロ酢酸12mlを
滴加し、ついで混合物を温度５〜10℃に１時間
保持する。沈殿した蛋白を除去するため、混合
物を約５℃、30000ｇで、光学的に完全に澄明
な上清液が得られるまで超遠心分離に付す。こ
の液体をセフアデツクスＧ−15カラム（5.90
cm）上クロマトグラフイーに付し、0.1モル酢
酸アンモニウム緩衝液（PH6.6）で溶出する。
500〜600mlの分画を合して、凍結乾燥する。凍
結乾燥残渣を10mlの蒸留水に溶解し、Bio−
Gel Ｐ−２ゲルカラム（2.5×90cm）に導入す
る。カラムを蒸留水で溶出し、130〜180mlの分
画を合し、凍結乾燥すると、塩を含まない粗サ
チエチン25mgが、わずかに黄色を帯びた白色粉
末として得られる。

ｂ 粗生成物（上記ａで得られた）100mgを0.1モ
ルTris塩酸塩緩衝液PH8.2に室温で振盪、攪拌
しながら溶解し、濃度５mg／mlの溶液を調製す
る。得られたわずかに蛋白光を発する液に、ト
リプシン10mgとキモトリプシン10mgを加え、つ
いで混合物を十分に攪拌する。わずかに沈殿を
含む混合物を37℃に保持した浴上に置き、とき
どき振盪または攪拌する。５時間後に、トリプ
シン５mgとキモトリプシン５mgを混合物に加
え、37℃でのインキユベーシヨンを19時間続け
る。すなわち、反応混合物は計24時間インキユ
ベーシヨンする。消化終了後、混合物を温度０
〜５℃に冷却し、0.1w／ｖ％、すなわち２ml
の冷（約５℃）55w／ｖ％トリクロロ酢酸を加
え、混合物を完全に振盪したのち、一夜凍結す
るかまたは少なくとも１時間温度０〜５℃に保
持する。次に、沈殿を含むことがある、わずか
に蛋白光を帯びた混合物を、上述の温度、
15000〜20000ｇで25分間超遠心分離を行う。澄
明な上清をBio−Gel Ｐ−２ゲルカラム（5.0×
45cm）に通し、カラムを蒸留水で溶出する。
250〜320mlの分画を合し、凍結乾燥すると、塩
を含まない純粋なサチエチン−Ｄ（生物学的活
性50〜100SU／mg）58mgが純白色の粉末として
得られる。

例 ２ ａ ヒト血清3000mlを、たえず攪拌しながら３〜
気圧下に、Amicon 中空繊維30000カラムを
通してろ過する。得られた限外ろ液約2000mlを
減圧下に60mlまで蒸発させる。沈殿を含む濃縮
液を9000ｇで30分間遠心分離したのち上清液を
分離し、冷却、攪拌下に55％トリクロロ酢酸12
mlを滴加し、ついで混合物を温度５〜10℃に１
時間保持する。混合物を温度約５℃、30000ｇ
で、光学的に完全に澄明な上清液が得られるま
で超遠心分離して沈殿した蛋白を除去し、上清
をセフアデツクスＧ−15カラム（5.90cm）上ク
ロマトグラフイーに付し、0.1モル酢酸アンモ
ニウム緩衝液（PH6.6）で溶出する。500〜600
mlの分画を合して、凍結乾燥する。凍結乾燥残
渣を10mlの蒸留水に溶解し、Bio−Gel Ｐ−２
ゲルカラム（2.5×90cm）に導入する。カラム
を蒸留水で溶出し、130〜180mlの分画を合し、
凍結乾燥すると、塩を含まない粗サチエチン30
mgがわずかに黄色を帯びた白色粉末として得ら
れる。

ｂ 粗生成物（上記例２のａで得られた）100mg
を0.1モルTris塩酸塩緩衝液PH8.2に室温で振
盪、攪拌しながら溶解し、濃度５mg／mlの溶液
を調製する。得られたわずかに蛋白光を発する
液に、トリプシン10mgとキモトリプシン10mgを
加え、ついで混合物を十分に攪拌する。わずか
に沈殿を含む混合物を37℃に保持した浴上に置
き、ときどき振盪または攪拌する。５時間後
に、トリプシン５mgとキモトリプシン５mgを混
合物に追加し、37℃でのインキユベーシヨンを
19時間続ける。すなわち、反応混合物は計24時
間インキユベーシヨンする。消化終了後、混合
物を温度０〜５℃に冷却し、0.1w／ｖ％、す
なわち２mlの冷（約５℃）55w／ｖ％トリクロ
ロ酢酸を加え、混合物を完全に振盪したのち、
一夜凍結するかまたは少なくとも１時間温度０
〜５℃に保持する。次に、沈殿を含むことがあ
るわずかに蛋白光を帯びた混合物を、上述の温
度、15000〜20000ｇで24分間超遠心分離を行
う。澄明な上清をBio−Gel Ｐ−２ゲルカラム
（5.0×45cm）に通し、カラム（5.0×45cm）に
通し、カラムを蒸留水で溶出する。250〜320ml
の分画を合し、凍結乾燥すると、塩を含まない
純粋なサチエチン−Ｄ（生物学的活性50〜
100SU／mg）62mgが純白色の粉末として得られ
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の一態様を示すサチエチ
ン−Ｄ単離工程図であり、第２図は本発明の方法
の一態様における最終ゲルクロマトグラフイーで
のサチエチン活性の溶出位置を示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒトおよび（または）動物血液から、満腹中
   枢に選択的に作用して食物摂取を調節する物質を
   単離するにあたり、ヒトおよび（または）動物血
   清または血漿を最高50000ダルトンまでの分子量
   を透過させる限外ろ過に付し、ろ液の一部を蒸発
   させ、得られた濃縮物から不溶部分を除去し、温
   度０℃〜10℃で液相に対し５〜25、適当には９〜
   11w／ｖ（重量／容量）％になるようにトリクロ
   ロ酢酸を加え、沈澱した蛋白質を除去し、得られ
   た溶液を空〓容量が分子量4000ダルトン以下のゲ
   ル上クロマトグラフイーに付し、PH6.0〜7.0の溶
   液で溶出し、生物学的に活性な分画を濃縮し、再
   び空〓容量が分子量4000ダルトン以下のゲル上ク
   ロマトグラフイーに付し、水で溶出して分画し、
   活性な分画を凍結乾燥し、凍結乾燥分画をPH8.1
   〜8.2の緩衝液に溶解し、この溶液に凍結乾燥生
   成物の総重量から計算して0.01〜0.2重量の等量
   のトリプシンおよびキモトリプシンを加え、この
   混合物を温度36℃〜39℃で好ましくは時々振盪し
   ながら20〜30時間消化し、１〜10時間後にはじめ
   の酵素量から計算して半分のトリプシンおよびキ
   モトリプシン等量を加えて消化を続け、ついで反
   応混合物に温度０℃〜10℃で濃度４〜6w／ｖ％
   好ましくは5w／ｖ％になるようにトリクロロ酢
   酸を加え、混合物を−15℃〜５℃に１〜24時間保
   持し、不溶部分を除去し、反応混合物を空〓容量
   が分子量4000ダルトン以下のゲル上クロマトグラ
   フイーに付し、水で溶出して分画し、生物学的に
   活性な分画を凍結乾燥することを特徴とする製造
   方法。 ２ ヒトおよび（または）動物血清の限外ろ過は
   平坦な膜を通して行う特許請求の範囲第１項記載
   の製造方法。 ３ ヒトおよび（または）動物血清の限外ろ過は
   カラム上で行う特許請求の範囲第１項記載の製造
   方法。 ４ 不溶部分および（または）沈澱した蛋白質の
   除去は超遠心または減圧ろ過によつて行う特許請
   求の範囲第１項記載の製造方法。 ５ PH6.0〜7.0の緩衝液は0.1モル濃度の酢酸アン
   モニウム溶液を用いて溶出を行う特許請求の範囲
   第１項記載の製造方法。 ６ PH6.0〜7.0の溶液で溶出後、生物学的に活性
   な分画を凍結乾燥または減圧下蒸発によつて行う
   特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ７ PH8.1〜8.2の緩衝液として２−アミノ−２−
   ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール塩
   酸塩の0.1モル溶液を用いる特許請求の範囲第１
   項記載の製造方法。 ８ 溶液へのトリプシンおよびキモトリプシンの
   添加は、凍結乾燥生成物の総重量から計算して
   0.1重量の等量行う特許請求の範囲第１項記載の
   製造方法。 ９ 消化は温度37℃〜38℃で24時間行う特許請求
   の範囲第１項記載の製造方法。