JP3423955B2 - 腫瘍細胞のアポト−シス誘導組成物 - Google Patents
腫瘍細胞のアポト−シス誘導組成物Info
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Description
アポト−シスを誘導する組成物に関し、より具体的には
癌の予防および治療に使用される組成物、ならびに該組
成物の有効成分として使用できる新規タンパク質に関す
る。
毒素や酵素等の多種多様な生理活性物質を含むことが知
られている。そして、コブラ科(Elapidae)や
ウミヘビ科(Hydrophiae)に属する毒ヘビに
由来する毒液は、一般的に末梢神経に作用して神経麻痺
をひき起こす神経毒を含み、一方マムシ科(Crota
lidae)やクサリヘビ科(Viperidae)に
属する毒ヘビに由来する毒液は、一般的に出液、壊死、
浮腫を生じる局所性毒素や血液障害作用物質等を含むこ
とも知られている。
ヘビ毒について多角的な研究が行われ、興味深い知見の
報告もある。そのようなものとしては、S.Araki
ら、Biochemical and Biophys
ical ResearchCommunicatio
ns, Vol.190,pp.148−153(19
93)による、ヘビ毒、特にクサリヘビ(Viper
ammodytes)、マムシ(Agkistrodo
nhalys blonhottli)の出血性ヘビ毒
による血管内皮細胞に対するアポト−シスの誘導、およ
びガラガラヘビ(Crotalus atrox)の出
血性ヘビ毒によるヒト臍帯静脈内皮細胞に対するアポト
−シスの誘導に関する報告がある。
uduraiら、Archivesof Bioche
mistry and Biophysics,Vo
l.313,pp.373−378(1994)があ
る。Ponnuduraiら、マライ毒蛇[Malay
an Pit Viper(Calloselasma
rhodostoma)]の毒液から、Sephade
x(商標)G−200によるゲル濾過で、分子量13
2,000(二量体として存在)を示し、ドデシル硫酸
ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS
−PAGE)で、分子量66,000を示す、電気泳動
的に均質な糖タンパク質を得ている。そして、この糖タ
ンパク質は、L−アミノ酸オキシダーゼ(EC1.4.
3.2)に分類され、当該酵素活性の他に強い浮腫誘導
活性を有することも示唆している。さらに、ヘビ毒の癌
治療への使用を検討されている。
着目し、ヘビ粗毒またはヘビ毒の構成成分の、殊に各種
培養細胞に対する作用機作等について検討してきた。
ern Diamondback Rattlesna
ke (Crotalus atrox)]の粗毒よ
り、電気泳動的に均質なタンパク質を単離したところ、
このものがL−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するとと
もに、ある一定の腫瘍細胞に対してアポト−シス誘導活
性を有することを見い出した。このような単離物または
精製されたタンパク質は、化学療法に使用する場合に、
目的の治療目的に悪影響を及ぼさないことが予期され、
重要である。またさらに、他のL−アミノ酸オキシダー
ゼ活性物質も、若干、それらの特異性、活性等に変動が
みられるものの、共通して腫瘍細胞に対しアポト−シス
誘導活性を有することが推測される。
してL−アミノ酸オキシダーゼ活性を示す精製された成
分を含むことを特徴とする哺乳動物の腫瘍細胞に対して
アポト−シスを誘導するための組成物が提供される。
態様の本発明として、L−アミノ酸オキシダーゼ活性を
示す精製された成分が、ヘビ毒に由来することを特徴と
する腫瘍細胞に対してアポト−シスを誘導するための組
成物が提供される。
発明者らによって初めて単離同定された、ガラガラヘビ
(Crotalus atrox)のヘビ毒に由来し、
(a) N−末端アミノ酸一次構造として次式 AHDRNPLEEXFRETDYEEFL (式中、Xは未同定アミノ酸残基を示し、他のアミノ酸
残基は、それぞれα−アミノ酸の一文字記号で示されて
いる。なお:Xはシステイン[Cys]残基である可能
性が高い。そのアミノ酸配列は配列番号(SEQ I
D:NO1)を参照されたい)で表されるアミノ酸配列
を有し、(b) 等電点(pKI)が、6.0〜6.5を
示し、(c) 分子量(SDS−PAGEによる)が、
55KDaである、タンパク質は、データペースの検索
において同一のN−末端アミノ酸配列を有するものが報
告されておらず新規であるので、そのような新規タンパ
ク質も本発明により提供される。
ノ酸オキシダーゼ活性」の語は、L−α−アミノ酸の酸
化的脱アミノ化により対応するα−ケト酸の生成を触媒
する活性を意味する。このような活性を有するものとし
ては、L−α−アミノ酸オキシダーゼ(EC1.4.
3.2)が知られており、脊椎動物や鳥類の腎臓、肝臓
または脳、或いはヘビ毒、細菌、カビ、軟体動物などの
広範な起源に由来することも知られている。
ノ酸オキシダーゼ(以下、LAOと略記する場合あり)
活性を示す精製された成分は、前記の広範な起源に由来
するものであって、本発明の目的に沿うものを全て含
む。また、「精製された成分」の語は、少なくとも本発
明の目的に使用する上で悪影響を及ぼさない程度まで、
精製されている成分を意味し、例えば電気泳動的に均質
であるものが挙げられる。
す精製された成分としては、C.H.Millerら、
The Journal of Biological
Chemistry, Vo;.244,pp.42
73−4276(1969)に記載されている方法で精
製された酵素調製物が、また微生物に由来するものとし
ては、O.Vallonら、Eur.J.BioChe
m.Vol;.215,pp.351−360(199
3)に記載された緑藻類クラミドモナス レインハラテ
ィー(Chlamydomonas reinhard
tii)配偶子特異的(gamete−specifi
c)ポリペプチド等が挙げられる。
明の目的上好適なものは、ヘビ毒由来の精製された成分
である。またかかるヘビ毒は、クサリヘビ科(Vipe
ridea)、マムシ科(Crotalidae)に代
表される出血毒をその毒の主成分とする種に属する毒蛇
の唾液腺からの分泌液に由来するものが好ましい。本発
明で使用できるヘビ毒から精製された成分としては、下
述の実施例に示されるガラガラヘビのヘビ毒から精製さ
れたタンパク質を含むものや、上述のG.Ponnud
uraiら、Archives of Biochem
istry and Biophysics, V
o;.313,pp.373−378(1994)に記
載されたマライ毒蛇(Malayan Pit Vip
er)由来のL−アミノ酸オキシダーゼを具体的なもの
として挙げることができる。またこれらと同様に、他の
ヘビ毒から精製されたLAO活性を示すものも本発明で
使用することができる。
源により糖タンパク質として得ることもできるので、糖
タンパク質を包含する概念で使用している。また、精製
されたタンパク質は、複数のサブユニットからなるもの
であってもよく、必要により、補酵素が組み合わさった
形態のものであってもよい。
なものがより好ましく、ガラガラヘビのヘビ毒由来のも
のを例に挙げれば、少なくともSDS−PAGEを単−
バンドを示すまで精製されたものである。このような成
分の代表的なものとしては、SDS−PAGEで単−バ
ンドを示し、(A) N−末端アミノ酸一次構造として
次式 AHDRNPLEEXFRETDYEEFL (式中、Xは未同定アミノ酸残基を示し、他のアミノ酸
残基は、それぞれα−アミノ酸の一文字記号で示されて
いる)で表されるアミノ酸配列を有し、(B) 等電点
(pKI)が、6.0〜6.5を示し、そして(C) 分
子量(SDS−PAGEによる)が、55KDaであ
る、タンパク質が挙げられる。このタンパク質の活性は
補酵素の存在下で認められるようである。
oxin]Iと略記する場合あり)のL−α−アミノ酸
オキシダーゼ活性は、フリーラジカル(H2O2由来)の
捕捉剤であるカタラーゼにより阻害されることにより、
さらに特徴付けられる。なお、本発明者らによる予備的
な阻害試験では、前記タンパク質のL−α−アミノ酸オ
キシダーゼ活性は、シクロヘキシミドによって阻害され
ないようである。
は、L−α−アミノ酸オキシダーゼとして市販されてい
るものを、必要により精製するか或いは、前記文献に記
載された精製方法によって得ることができる。
ヒト急性前骨髄性白血病細胞HL−60、ヒト単球性白
血病細胞U937、ヒト白血病細胞K562、ヒト卵巣
癌細胞A2780およびマウス血管内皮細胞KN−3が
挙げられ、本発明に従う組成物は、前記細胞の少なくと
も1種に対してアポト−シスを誘導する活性を有する。
から、各種癌の予防または治療用の医薬組成物として使
用することができる。
ス誘導活性に悪影響を及ぼさない限り、医薬の分野で常
用されている製薬学的許容されるいずれかの助剤と組み
合わせて使用することができる。このような助剤の他
に、LAOの基質となりうるL−アミノ酸またはそれら
のオリゴペプチド等を本発明の組成物に含めてもよい。
本発明の組成物を使用して癌を予防または治療するに
は、投与法に応じて、液剤または固形剤として調製し、
非経口または経口投与することができるかも知れない。
固形癌の治療に使用する場合には、本発明の組成物をそ
れ自体公知の生体内移植製剤とすることが適するかも知
れない。
の種類に応じて、最適量は変動するので限定されるもの
ではない。
を例に、本発明をより具体的に説明する。
(SIGMA Chemical Company,P
roduct No.V 7000)100mgを脱イ
オン水5mlに溶解した。溶液を0.45μmの径を備
えたフィルターを介して濾過し、不溶性物質や夾雑物質
を除去した。得られた濾液を、セファデックス[Sep
hadex(商標)]G−100カラム(3×60c
m)にかけ、流速0.41ml/分の50mMリン酸ナ
トリウム緩衝化生理食塩水(pH7.0+0.15NaC
l)でゲル濾過し、4mlずつ分画した。溶出液を28
0nmにて吸光度測定し、画分25〜31にアポトーシ
ス誘導活性が認められた。
ltra PURE(GIBCO製)を用い蒸留水に対
して72時間透析を行い、次いで、等電点電気泳動装置
(BioRad社製)にかけた。等電点電気泳動は、両
性担体としてアンホライト(Ampholyte)3/
10を3ml添加し、定電圧12Wにて6時間泳動し
た。こうして得られた画分をpH試験紙により測定する
一方、各画分のアポトーシス誘導活性も測定したとこ
ろ、等電点(pKI)6.0〜6.5にアポトーシス誘導
活性が認められた。
画分を集め、FPLC装置(Phamacia社製)に
接続したゲル濾過カラム(Superdex 200H
R10/30+TSK−GEL G3000PWXL直
列連結)にかけ、50mMリン酸ナトリウム緩衝化生理
食塩水(pH7.0+0.15NaCl)を流速0.2m
l/分でゲル濾過し、1mlずつ分画した。約190分
後のピークに、後述するアポトーシス誘導活性試験によ
り、アポトーシス誘導活性が認められた(図1参照)。
このピークに相当する画分をSDS−PAGEによって
電気泳して、約55KDaに単一のタンパク質としてア
ポトーシス誘導活性物質を同定した。なお、SDS−P
AGEの分子量マーカーは、それぞれ97KDaがウシ
血清由来のホスホリラーゼ、66KDaがアルブミン、
46KDaがオブアルブミンそして30KDaがカルボ
ニックアンヒドラーゼである。前記約55KDaのタン
パク質は、出発原料の粗毒から、約8.88%の収率で
得られた。
対する作用 この実施例では、Apoxin Iの正常細胞および癌
細胞(下記)に対するアポトーシス誘導活性が確認され
る。
前骨髄性白血病細胞(HL−60)、ヒト卵巣癌細胞
(A2780)、マウス血管内皮細胞(KN−3)アッセイ方法 核DNA染色:ある一定の細胞は、アポトーシスを起こ
すと顕微鏡観察により細胞の核DNAが凝集、分断化す
ることが知られている。各種細胞にApoxin I処
理によりアポトーシス誘導し、DNA染色試薬であるD
API試薬にて染色を行い細胞の核DNAの凝集を観察
した。
ml、一定時間(HL−60:3時間、HUVEC、A
2780、KN−3:18時間)にて処理した細胞を7
5%エタノール、25%酢酸溶液にて細胞固定を行い、
その後DAPI試薬(1μg/ml)によりDAPI染
色を行い、蛍光顕微鏡にて観察した(顕微鏡像の写真を
図3に示す)。
胞の像である。
C,Apoxin I 10μg/ml18時間処理細
胞、c:HL−60未処理細胞、d:HL−60,Ap
oxin I 10μg/ml 3時間処理細胞、e:A
2780,Apoxin I 10μg/ml 18時間
処理細胞 f:KN−3,Apoxin I 10μg/
ml 18時間処理細胞 Apoxin I処理細胞からは、それぞれ核DNAの
凝集が認められる。
トーシスを起こした細胞の核DNAは分断化されオリゴ
ヌクレオゾーム単位にDNAが切断される(フラグメン
ト化)ことが知られている。ここでは、HL−60細胞
を用いてApoxin Iを各濃度、各時間、処理する
ことによって核DNAの分断化を検討したところ、濃度
依存的(図4a)、時間経過的(図4b)に核DNAの
フラグメント化が観察された。
た。Apoxin Iを各濃度、各時間で処理したHL
−60細胞(0.5×106個細胞)を3000rpm、
5min遠心処理にて集め、培養液除去後、Prote
inase K溶液[10mMEDTA,0.5mg/m
lのproteinase K:50mM Tris−H
Cl(pH8.0)中]20μlを添加後1時間処理を
行いタンパク分解処理し、RNase溶液(0.5μg
/mlのRNase:蒸留水中)10μlを添加後1時
間処理にてRNA分解処理を行う。処理後の溶液(核D
NAが残っている)を2%アガロースゲルにて電気泳動
を行うことにより、核DNAのフラグメント化を観察し
た。DNA染色はエチヂウム・ブロマイドにて行い、U
V照射にて観察した。
として、L−ロイシンおよびD−ロイシンを使用し、A
poxin Iによるオキシダーゼ活性を観察した。
ビペルオキシダーゼ(100unit/mg)50μ
l、67.5μgのO−ジアニシジンおよび適当量基質
(10μMのL−ロイシンまたはD−ロイシン)、10
0mM Tris−HCl(pH8.5)0.9ml中混
合液を、室温(約20℃)下でインキュベーションし、
436nmおける吸光度を測定した。結果を図5に示
す。
対照を表し、ならびに四角印のプロットはApoxin
I 1μg/ml+L−ロイシンの系を、三角印のプロ
ットはApoxin I 2μg/ml+L−ロイシンの
系を、そしてバツ印(*)のプロットはApoxin
I 2μg/ml+D−ロイシンの系における吸光度の
変化を表す。
ス誘導活性およびL−α−アミノ酸オキシダーゼ活性
は、ともにカタラーゼにより有意に抑制されることも確
認されている。
ゼ活性物質の作用によってもたらされる過酸化水素(H
2O2)が、腫瘍細胞のアポトーシス誘導に密接に関連す
るものとみなされ、こうして本発明に従えば、広く、L
−α−アミノ酸オキシダーゼ活性を示す(H2O2を発生
しうる)物質の哺乳動物における腫瘍細胞に対してアポ
トーシスを誘導するための組成物が提供される。
得られたpKI6.0〜6.5の画分を、FPLC処理し
たときの溶出パターンを表す図である。
S−PAGE(ポリアクリルアミドゲル電気泳動)の結
果を示す図に代わる写真である。
DNAの凝集)を示す図に代わる写真である。
DNAフラグメント化アッセイの結果を示す2%アガロ
ースゲル電気泳動の泳動挙動図に代わる写真である。
アミノ酸オキシダーゼ活性を示すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項1】 ガラガラヘビ(Crotalus at
rox)に属する毒ヘビの毒液から得ることができるL
−α−アミノ酸オキシダーゼ活性を有するタンパク質で
あって、 (A) N−末端アミノ酸一次構造として、次式 AHDRNPLEEXFRETDYEEFL (式中、Xは未同定アミノ酸残基を示し、他のアミノ酸
残基は、それぞれα−アミノ酸の一文字記号で示されて
いる)で表されるアミノ酸配列を有し、 (B) 等電点(pKI)が、6.0〜6.5を示し、そ
して (C) 分子量(SDS−PAGEによる)が、55K
Daであることを特徴とするタンパク質。 - 【請求項2】 請求項1記載のタンパク質を有効成分と
する哺乳動物の腫瘍細胞のアポト−シス誘導剤。
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---|---|---|---|
JP27392096A JP3423955B2 (ja) | 1996-09-26 | 1996-09-26 | 腫瘍細胞のアポト−シス誘導組成物 |
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