HU194916B - Process for producing new type of active compound of selective inhibiting activity for intake of food - Google Patents
Process for producing new type of active compound of selective inhibiting activity for intake of food Download PDFInfo
- Publication number
- HU194916B HU194916B HU832718A HU271883A HU194916B HU 194916 B HU194916 B HU 194916B HU 832718 A HU832718 A HU 832718A HU 271883 A HU271883 A HU 271883A HU 194916 B HU194916 B HU 194916B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- solution
- hours
- lyophilized
- added
- gel
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 title description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 title 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 18
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 11
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 10
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 10
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 10
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 8
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 6
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 claims description 5
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 claims description 5
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 claims 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims 1
- 108010091872 satietin Proteins 0.000 description 13
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 3
- 235000012631 food intake Nutrition 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000036186 satiety Effects 0.000 description 3
- 235000019627 satiety Nutrition 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 230000000578 anorexic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 206010061428 decreased appetite Diseases 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L disodium;3-aminonaphthalene-1,5-disulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C2=CC(N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 UZUODNWWWUQRIR-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
- Y10S530/83—Plasma; serum
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Obesity (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- General Preparation And Processing Of Foods (AREA)
- Grain Derivatives (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Description
A találmány tárgya eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható új hatóanyag elkülönítésére vérszérumból.
A 178 703 lajstromszámú magyar bejelentésünkben ismertettünk egy eljárást, amelynek segítségével egy eddig nem ismert új hatásmódú szelektív anorexiás, azaz a táplálékfelvételt gátló anyagot állítottunk elő emberi plazmából. Ez az anyag a szatietin nevet kapta, amely egy részlegesen tisztított termék volt, amely azonban hatékonysága révén már messze felülmúlta az eddig ismert hasonló hatású anyagokét.
A termék tisztítása a plazma ultraszűrése és két lépéses gélkromatográfia Sephadex G—15 és Bio—Gél P—2 géleken történt.
Sikerült az anyag peptid természetét és a nagyobb mennyiségben előforduló aminosav mennyiségi viszonyokat is igazolni. Az aminosavak mellett a termék hidrolízise után cukorkomponenseket is találtunk, így már akkori feltételezésünk szerint a specifikusan a táplálkozási központra ható terméket egy glikoproteinnek tartottuk.
A találmány továbbfejlesztéseként azt találtuk, hogy további eljárás segítségével a hatékony frakció tovább bontható, azaz tisztítható, és a 183 590 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerint háromszor-négyszer hatékonyabb termék állítható elő, amely kémiai összetétel szempontjából lényegesen eltér a korábbiakban említett eljárással kapott hatékony terméktől, és ez már kémiailag tiszta, egységes, homogén hatóanyagnak tekinthető, amelynek fizikai jellemzőit és elemi összetételét is meghatároztuk.
A fentiekben említett találmány értelmében az emberi plazmát az ultraszűrés után egy lényeges lépésnek vetettük alá, nevezetesen a plazmaszűrletet triklór-ecetsavval kezeltük azon célból, hogy a még jelenlévő szérumfehérjéket (albumin stb.), amelyek bizonyos mennyiségben képesek átjutni az Amicon membránon, eltávolítsuk. A triklór-ecetsavas kezelés után a kicsapódott szérumfehérjéket centrifugálással ülepítettük, és a tiszta felülúszót, amely a biológiailag aktív szatietin frakciókat tartalmazta, géloszlopokon tovább tisztítottuk. Első lépésben Sephadex G—15 oszlopon ámmónium-acetát puffért használva az elúcióhoz, a kizárási térfogatnál összegyűjtöttük azokat a frakciókat, amelyek aktivitást mutattak és megfelelő töményítés után Bio-Gel P—2 oszlopon sótalanítottuk. A sómentes aktív frakciók már nagytisztaságú anyagként voltak kezelhetők, ez az anyag a biológiai kísérletekhez — beleértve az összes táplálékfelvételt jelentő kísérleteket — teljes mértékben alkalmas volt.
Ebben a fázisban már csak a szatietin aktivitást nem befolyásoló, kisebb molekulájú peptidek és glikopeptidek voltak jelen, amelyeket ezután elektroforézíssel és affinitási kromatográfia segítségével távolítottunk el. Az affinitási kromatográfiával Con—A Sepharose 2 oszlopon történő frakcioqálás és ismételt Bio—
Gél P—2 oszlopon történő sótalanítás után a tiszta hatóanyagot liofilizálás útján nyertük. Az így előállított anyag glikoproteinnck bizonyult, amelynek peptidtartalma alacsony (5—25%) és szénhidráttartalma magas (60—90%) volt. A hatóanyag molekulasúlya az 50 000—70 000 dalion tartományba esett és izoelektromos pontját neutrálisnak, nevezetesen pl: 7,0—7,1-nak találtuk.
Űjabb vizsgálataink során azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti eljárással a korábbi két eljárással kapott terméktől fizikai tulajdonságaiban eltérő, új terméket kapunk, amely kémiailag egységes és ugyancsak szelektíven gátolja a táplálék felvételét. Ezt az anyagot szatietin-D-nek nevezt ik el. A szatietin-D kinyerés legfontosabb műveleti lépéseit az 1. ábra alapján mustjuk be.
Emberi és/vagy emlős állatokból szárma- 1 zó vérszérumot vagy plazmát 50 000 dalton molekulasúly tartományig átengedő szűrőn ’ megszűrjük. Ezt az ultraszűrést oszlopon 'ún. Hollow fiber technika) végezzük. Ezután a szürletet pároljuk, és a koncerrtrátumból az oldhatatlan részt, célszerűen centrifugáiással vagy szűréssel eltávolítjuk, rtiajd a folyadékhoz 0°C és 10°C közötti hőmérsékle’en 5—25 tömeg/tf.%, előnyösen 9—11 töneg/tf.% koncentrációig triklórecetsavat idunk, a kicsapódott fehérjéket, célszerűen :entrifugálással vagy szűréssel eltávolítjuk, és a kapott tiszta oldatot 4 000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk,
5,0—7,0 pH tartományú pufferoldattal eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat koncentráljuk — célszerűen liofilizálással, illetve vákuumbepárlással —, majd 3 000—4 000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen újból kromatografáljuk, desztillált vízzel eluáljuk (sómentesítjük), és a kapott nyersterméket liofilizált formában tisztítjuk, illetve kezeljük a továbbiakban. *
A találmány szerinti eljárás értelmében ezt a liofilizált nyersterméket 8,1—8,2 pH-tartományú pufferben, célszerűen 0,1 m trisz-hidrokloridban (2-amino-2-hidroxi-metil-l,3-propándiol-hidrogén-klorid) oldjuk, és az össztömeg 0,01—0,2, előnyösen egy tized tömegének megfelelő tripszint és ugyanolyan mennyiségű kimotripszint adunk hozzá. A reakcióelegyet ezután emésztésnek vetjük alá 36—39°C hőmérsékleten 20—30, célszerűen 24 órán át, előnyösen időszakos keverés vagy folyamatos rázás mellett. Az első
2—10 óra elmúltával az elegyhez még fele mennyiségű tripszint és kimotripszint adunk, és folytatjuk az emésztést. A reakcióelegyből ezután hideg triklór-ecetsavas kezeléssel és 3000—4000 dalton alatti kizárási térfogatú gélen történő kromatografálással a hatóanyagot sómentes formában elkülönítjük (2. ábra).
A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitelezése során a tisztítási műveletet
-2194916 ultraszűréssel kezdjük Amicon „hollow fiber“ készüléken egy 50 000 daltonnal szeparáló oszlopon, célszerűen nyomás, illetve megfelelő szivattyú alkalmazásával. Az így kapott ultraszűrletet ezután vákuum-bepárlással töményítjük, és az oldhatatlan részt preparatív centrifugán elkülönítjük, vagy Zeiss lapon vákuum segítségével kiszűrjük. A kapott csapadékmentes elegyet 0°C és 10°C közötti hőmérsékletre hütjük, és 55 tömeg%-os triklór-ecetsavból annyit adunk hozzá, hogy az elegy triklór-ecetsav koncentrációja 5 tömeg/tf.% és 25 tömeg/tf.% között, előnyösen 9—11 tömeg/tf.% legyen. Az így kezelt oldatot ezután 0°C és 5°C közötti hőmérsékleten, előnyösen 1 óráig állni hagyjuk, majd a kivált csapadékot, illetve zavarosságot ugyanilyen hőmérsékleten ultracentrifugálással vagy Zeiss szűrőlapon vákuummal történő szűréssel elkülönítjük, amikor is tiszta, éles, sárgás színű oldatot kapunk. Mint az előző szabadalmi leírásokból ismeretes a triklór-ecetsav eltávolítója az ultraszűrés után még jelenlévő fehérjéket, így az albumint is, amíg viszont a hatóanyag, a szatietin oldatban marad.
A következő tisztítási lépésként preparatív gélkromatográfiát alkalmazunk 4000 dalton molekulatömeg alatti kizárási térfogatú géloszlopon. Ez történhet Sephades G—15, G—10 vagy G—25 géllel töltött oszlopon. Az elúcióhoz előnyösen 0,1 M ammónium-aeetát oldatot használunk, mivel ez illékonysága miatt liofilizálással viszonylag könnyen eltávolítható. Emellett 0,9 tömeg%-os fiziológiás nátrium-klorid oldat vagy különféle foszfát pufferek is alkalmazhatók az eluáláshoz. Az aktív frakciók a géloszlop kizárási térfogatánál jelennek meg (kízáródnak a gélből az oszloptérfogat kb. egyharmadát jelentő eluens térfogatnál), amelyeket egyesítünk és liofilizálással töményítünk.
A következő tisztítási lépésnél is gélkromatográfíát használunk 3000 dalton molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen, célszerűen Bio—Gél P—2 oszlopon desztillált vizes közegben. Ez a tisztítási lépés azt eredményezi, hogy eltávolítjuk a jelenlévő sókat és az esetleges jelenlévő egyéb kismolekulasúlyú szennyezéseket. A kizárási térfogatnál megjelenő szatietin aktivitású frakciókat egyesítés után liofilízáljuk, a nyers termék halványsárgás, vagy fehér por, melynek izoelektromos pontja pl: 7,0-7,1 Ezúton 1 liter emberi szérumból vagy plazmából kiindulva 8—10 mg liofilizált nyersterméket kapunk, amely már alkalmas étvágyszabályozó-szerként való felhasználásra, mivel szatietin aktivitása 25 Sz.E./mg körül van.
A termék szatietin-aktivitását az általunk kidolgozott biológiai értékmérési módszerrel mérjük; 1 szatietin-egységen (Sz.E.) azt a hatóanyag-mennyiséget értjük, amely 96 óra hosszat éheztetett 200—240 g súlyú CFY nőstény patkányoknak intracerebroventrikulá4 risan beadva a standard tápdugó fogyasztását a táplálékadás első napján az átlagos 24,04 ± 0,76 g-ról 10 g-ra csökkenti.
Az így nyert szatietin aktivitású nyersanyag kémiailag még nem tekinthető egységes homogén terméknek, mivel elektroforetikus módszerekkel vizsgálva, pl. poliakrilamid gélelektroforézis nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében vagy izoelektromos fókuszálás stb., még több fehérjefestésre pozitív sávot mutat.
Az egységes hatóanyag előállítására irányuló törekvéseink során a korábbiaktól eltérő hatékonyabb és egyszerűbb módszert dolgoztunk ki. A találmány szerinti eljárás a lépéseként proteolitikus emésztést alkalmaznunk, abból a meggondolásból, hogy az emész'és során a szennyező komponensként még előforduló peptidek és fehérjék lebomlanak, viszont a szatietin, mint glikoprotein sokkal stabilabb a fehérjeemésztési eljárásokkal szemben. A találmány szerinti eljárás gyakorlati kivitelezése során tehát az előzetesen ismertetett tisztítási módszerekkel nyert nagytisztaságú terméket kissé lúgos kémhatású 8,1—8,2 pH-tartományú pufferben, előnyösen 0,1 M trisz-hidrokloridban rázogatás vagy keverés közben feloldjuk, és az oldathoz a liofilizált termék össztömegére számított 0,01—0,2 előnyösen egytized tömegű tripszint és ugyanannyi kimotripszint adunk. Ezután az elegyet 36—39, előnyösen 37— 38°C-on 20—30 előnyösen 24 órán át tartjuk. A reakcióelegyet előnyösen rázzuk, illetve keelteltével újabb mennyiségű tripszint és kimotripszint adunk az elegyhez, de most már az eredeti enzimennyiség felét, és folytatjuk az emésztést. Körülbelül 24 óra elteltével az elegyet 0°C és !0°C közé hűtjük, és annyi triklór-ecetsavat adunk hozzá, hogy az elegy triklór-ecetsav koncentrációja 4—6, előnyösen 5 tömeg/tf.% körül legyen. Az elegyet ezután — 15°C és + 5°C között legalább 1 óra hosszat és legfeljebb 24 órán át állni hagyjuk. Ezután a kivált oldhatatlan részt, előnyösen ultracentrifugálással vagy Zeiss lapon történő szűréssel eltávolítjuk.
A tisztítás következő lépésében a jelenlévő triklörecetsavtól, sóktól, az alkalmazott puffertől és egyéb kismolekulatömegű fragmensektől szabadulunk meg miután az emésztéshez használt enzimfelesleget a triklórecetsavas kezelés eltávolította. Ezt a találmány értelmében úgy végezzük, hogy a tiszta, éles reakcióelegyet egy 300Ö—4000 dalton molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen, előnyösen vizes közeggel eluálunk. A tiszta, homogén szatietin-D kizáródik a gélből, és a géloszlop térfogatú gélen, előnyösen vizes közeggel eluálunk. A tiszta homogén szatietin-D kizáródik a gélből, és a géloszlop térfokat egyharmadának megfelelő térfogatnál jelenik meg az elúció során (2. ábra). Az ionmentes vízzel eluált, hatóanyag-tartalmú frakciókat egyesítjük és liofi3
-3194916 lizáljuk. Hófehér jólkezelhető port kapunk, amely már teljesen egységes. Ezt a hatóanyagot szatietin-D-nek neveztük el, miután fizikai és kémiai sajátságai révén különbözik a korábban már előállított homogén szatietin termékünktől.
A találmány szerinti eljárással izolált egységes és tiszta szatietin-D hatóanyag molekulatömegét SDS/nátrium-dodecil-szulfát/-gél-elektroforézissel határoztuk meg. E szerint az anyag molekulatömege a 40 000— 50 000 dalion tartományba esik. Ugyancsak az SDS-gél-elektroforetikus vizsgálat bizonyította a termék egységes voltát, mivel egyetlen sávot mutatott fehérjefestésre és szénhidrátfestésre is. Ez ugyancsak a termék glikoprotein természetére utal. Az anyag izoelektromos fokuszálása 3-10, illetve 3-5 pH értékű amíolin jelentésben történő futtatással azt eredményezte, hogy izoelektromos pontja pl: 2,9—3,1 körüli értéknél van. Ez az eddigiektől eltérő, és így egyúttal új termékként kezelhető anyag jelenlétére utal vérszérumban.
A termék elemi analízise az alábbi összetételt adta:
Fehérjetartalom: 20—23%
Szénhidráttartalom: 56—60%
Kémiailag nem kötött víztartalom: 6—10%.
A fehérjetartalmat mikrobiuret módszerrel és hidrolízis után aminosav analízissel határoztuk meg. Az aminosav analízis eredménye a következő: Asp 2,83%, Thr 1,61 % Ser 1,25%, Glu 3,60%, Pro 1,36%, Gly 0,87%, Ala 1,18%, Cys 0,16%, Val 0,93 %, Met 0,17% Ile 0,76%, Leu 1,25%, Tyr 1,42%, Phe 0,77%, Lys 3,67%, His 0,22%, Arg 0,67%; tehát az összes aminosav: 22,71%; a glükózamin 4,90%.
A szénhidráttartalom megoszlása például egy mintában a következő: ramnóz: 4,5%, mannóz 8,05%, galaktóz 30,3%, glükóz 14,4%; összesen 56,5%.
A fenti elemzési és jellemzési adatokból jól, illetőleg egyértelműen kiderül, hogy az emésztéses eljárással előállított termékünk új, eddig nem ismert glikoprotem, amelyet vérszérumból különítünk el, és hozzávetőlegesen 1 liter vérszérumból 4—6 mg egységes terméket nyerünk, amelynek szatietin aktivitása 50—100 Sz.E./mg körül van.
A találmány szerinti eljárás gyakorlati kiviteli módját az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példák szemléltetik.
1. példa
a.) 3000 ml humán szérumot Amicon UM—10 membránon állandó keverés közben,
3—4 atm. nyomás alkalmazásával átszűrünk. A kapott, mintegy 2000 ml ultraszűrletet vákuumban 60 ml térfogatra betöményítjük. A csapadékos koncentrátumot 9000 g-vel 30 percig centrifugáljuk, majd a szupernatáns folyadékot elkülönítjük, keverés és hűtés közben cseppenként hozzáadunk 12 ml 55 tö4 meg%-os triklór-ecetsavat, és az elegyet 5— 10’C hőmérsékleten 1 óra hosszal állni hagyjuk. A kicsapódott fehérjék eltávolítása végett az elegyet 5°C körüli hőmérsékleten 30 000 g-vel ultracentrifugáljuk, míg optikailag teljesen tiszta szupernatáns folyadékot nem kapunk. Ezt a folyadékot egy 5,90 cm méretű Sephadex G—15 oszlopon kromatografáljuk, majd 0,1 mólos ammónium-acetát-puffer-o dattal (pH=6,6) eluálunk. Az 500 és 600 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált maradékot 10 ml desztillált vízben oldjuk és egy 2,5=90 cm méretű Bio-Gel P—2 gél-oszlopra visszük. Az oszlopot desztillál vízzel eluáljuk, és a 130 és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 25 mg nyers, sómentes szatietint kapunk sárgásfehér por alakjában.
b.) 100 g fenti módon kapott nyerste mékből 0,1 M trisz-hidroklorid, pH: 8,2 értékű pufferoldattal 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk szobahőmérsékleten rázogatással vagy keveréssel. Az így kapott kissé vagy gyengén opálos oldathoz 10 mg tripszint és egyidejűleg 10 mg kimotripszint adunk, majd az elegyet jól felkeverjük. Ezután a még kissé csapadékos elegyet 37°C-os fürdőbe helyezzük és időként felrázzuk, illetve felkeverjük. 5 óra elteltével újabb mennyiségű erzimet, nevezetesen 5 mg tripszint és 5 mg ki motripszint adunk az elegyhez, és folytatjuk a 37°C-on történő inkubálást további 19 órán át, azaz összesen 24 óráig inkubáljuk a reakcióelegyet. Az emésztés befejezése után az elegyet Ó°C és +5°C közé hűtjük, és hozzáadunk 0,1 tf./tfazaz 2 ml 55 tömeg/tf.% hideg, -j-5°C körüli triklór-ecetsavat, majd az elegyet összerázzuk,és lefagyasztva egy éjjelen át, de legalább 1 óráig 0°C és 5°C között állri hagyjuk. Ezután a kissé zavaros esetenként csapadékos elegyet 15—2 000 g-vel 25 percig a fent említett hőmérsékleten ültre centrifugáljuk. A tiszta felülúszót ezután szobahőmérsékleten egy 5,0x45 cm méretű NBio-Gel P—2 géloszlopra visszük, és az oszlcpot desztillált vízzel eluáljuk. A 250 és 320 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 58 mg hófehér, sómentes szatietint kapunk, melynek biológiai aktivitása 50—100 Sz.E./mg.
2. példa
a.) 3000 ml humán szérumot Amicon „holkw fiber“ 30000-es oszlopon állandó keverés közben, 3—4 atm. nyomás alkalmazásáv rl átszűrünk. A kapott,mintegy 2000 ml ultras'.űrletet vákuumban 60 ml térfogatra betöményítjük. A csapadékos koncentrátumot 9)00 g-vel 30 percig centrifugáljuk, majd a s'upernatáns folyadékot elkülönítjük, keverés é ; hűtés közben cseppenként hozzáadunk 12 ml 55%-os triklórecetsavat, és az elegyet 5— 1)°C hőmérsékleten 1 óra hosszat állni hagyjuk. A kicsapódott fehérjék eltávolítása végett az elegyet 5°C körüli hőmérsékleten
3) 000 g-vel ultracentrifugáljuk, míg optikai-4194916 lag teljesen tiszta szupernatáns folyadékot nem kapunk. Ezt a folyadékot egy 5,90 cm méretű Sephadex G—15 oszlopon kromatografáljuk, majd 0,1 mólos ammónium-acetát-puffer-oldattal (pH = 6,6) eluálunk. Az 500 és 600 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. A liofilizált maradékot 10 ml desztillált vízben oldjuk.és egy 2,5X90 cm méretű Bio-Gel P—2 géloszlopra visszük. Az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk, és a 130 és 180 ml közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 30 mg nyers, sómentes szatietin-D-t kapunk, sárgásfehér por alakjában.
b.) 100 mg fenti módon kapott nyerstermékből 0,1 M trisz-hidrokiorid, pH: 8,2 értékű pufferoldattal 5 mg/ml koncentrációjú oldatot készítünk szobahőmérsékleten rázogatással vagy keveréssel. Az így kapott, kissé vagy gyengén opálos oldathoz 10 mg tripszint és egyidejűleg 10 mg kimotripszint adunk, majd az elegyet jól felkeverjük. Ezután a még kissé csapadékos elegyet 37°C-os fürdőbe helyezzük és időnként felrázzuk, illetve felkeverjük. 5 óra elteltével újabb mennyiségű enzimet, nevezetesen 5 mg tripszint és 5 mg kimotripszint adunk az elegyhez, és folytatjuk a 37°C-on történő inkubálást további 19 órán át, azaz összesen 24 óráig inkubáljuk a reakcióelegyet. Az emésztés befejezése után az elegyet 0°C és -J-5°C közé nűtjük, és hozzáadunk 0,1 tf./tf.%, azaz 2 ml 55 tötneg/tf.% hideg 4-5°C körüli triklór-ecetsavat, majd az elegyet összerázzuk és lefagyasztva egy éjjelen át, de legalább 1 óráig 0°C és 5°C között állni hagyjuk. Ezután a kissé zavaros, esetenként csapadékos elegyet 15— 20 000 g-vel 25 percig a fent említett hőmérsékleten ultracentrifugáljuk. A tiszta felülúszót ezután szobahőmérsékleten egy 5,0X45 cm méretű Bio-Gel P—2 géloszlopra visszük, és az oszlopot desztillált vízzel eluáljuk. A 250 és 320 ml - közötti frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk. Ily módon 62 mg hófehér, sómentes szatietin-D-t kapunk, amelynek b iológiai aktivitása 50— 100 Sz.E./mg.
Claims (9)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás specifikusan a táplálkozási központra ható, új hatóanyag elkülönítésére vérszérumból, azzal jellemezve, hogy a vérszérumot 50000 molekulatömegig átengedő ultraszűrésnek vetjük alá, a szűrletet 0,01—0,1-szeresére bepároljuk, és a kapott koncentrátumból az oldhatatlan részt eltávolítjuk, majd a folyadékfázishoz 0°C és 10°C közötti hőmérsékleten 5—25 tömeg/tf.%, célszerűen 9—11 tömeg/tt.% koncentrációig triklór-ecetsavat adunk, a kicsapódott fehérjéket eltávolítjuk, a kapott oldatot 4 000 molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen kro8 niatografáljuk, 6,0—7,0 pH-tartományú oldatul eluálunk, a biológiailag aktív frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, majd 3000— 4000 molekulatömeg alatti kizárási térfogatú5 gélen újból kromatografáljuk, vízzel eluál\a frakcionáljuk, az aktív frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk, a liofilizált frakciókat 8,1—8,2 pH-tartományú vizes pufferben oldjuk, az oldathoz a liofilizált termék össz10 tömege 0,01—0,2-szeresének megfelelő menynyiségű tripszint és ugyanannyi kimotripszint adunk, az elegyet 36—39°C hőmérsékleten 20—30 órán át, előnyösen időszakos keve-és mellett, emésztésnek vetjük alá, az emész15 '.és során az első 2—10 óra elmúltával az elegyhez további, az eredeti enzimmennyiség felének megfelelő mennyiségű tripszint és kimotripszint adunk, majd a reakcióelegyhez 0°C és 10°C közötti hőmérsékleten
- 2o 4—6 tőmeg/tf.%, célszerűen 5 tömeg/tf.% koncentrációig triklór-ecetsavat adunk, az elegyet — 15°C és 5°C közötti hőmérsékleten1—24 órán keresztül állni hagyjuk, az oldhatatlan részt eltávolítjuk, a reakcióelegyet25 3000—4000 molekulatömeg alatti kizárási térfogatú gélen kromatografáljuk, desztillált vízzel eluálva frakcionáljuk, és a biológiailag aktív frakciókat egyesítjük és liofilizáljuk._0 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal * jellemezve, hogy a vérszérum ultraszűrését síkmembránon végezzük.
- 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vérszérum ultraszűrését 3g oszlopon végezzük.
- 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eljárás során az oldhatatlan részek és/vagy a kicsapódott fehérjék eltávolítását ultracentrifugálással vagy szürés4θ sel végezzük.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 6,0—7,0 pH-fartományú eluáló oldatként 0,1 mólos ammónium-acetát-oldatot használunk.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, az45 zal jellemezve, hogy a 6,0—7,0 pH-tartományú oldattal végzett eluálást követően a biológiailag aktív frakciók koncentrálását liofilizálással vagy vákuumbepárlással végezzük.
- 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 50 jellemezve, hogy 8,1—8,2 pH-tartományú vizes pufferként 0,1 mólos 2-amino-2-hidroxi-metil-1,3-propándiol-hidrogén-kloridot használunk.
- 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal θ® jellemezve, hogy a liofilizált termék összsúlya egy tized súlynak megfelelő tripszint és ugyanannyi kimotripszint adunk az oldathoz.
- 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal 6C jellemezve, hogy az emésztést 37—38°C hőmérsékleten 24 órán át végezzük.
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU832718A HU194916B (en) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | Process for producing new type of active compound of selective inhibiting activity for intake of food |
US06/632,439 US4588685A (en) | 1983-07-29 | 1984-07-19 | Process for the preparation of a new-type active substance selectively inhibiting food intake |
AT84108919T ATE32515T1 (de) | 1983-07-29 | 1984-07-27 | Appetitregulierender wirkstoff und verfahren zur herstellung desselben. |
DE8484108919T DE3469359D1 (en) | 1983-07-29 | 1984-07-27 | Agent for controlling the appetite and process for its preparation |
JP59157084A JPS60136517A (ja) | 1983-07-29 | 1984-07-27 | 食物摂取の選択的阻害物質の製造方法 |
AU31271/84A AU572534B2 (en) | 1983-07-29 | 1984-07-27 | Food intake suppressant substance |
DK369184A DK161153C (da) | 1983-07-29 | 1984-07-27 | Fremgangsmaade til fremstilling af et appetitregulerende aktivt stof, satietin d, ud fra humant og/eller animalsk blodserum |
EP84108919A EP0133308B1 (de) | 1983-07-29 | 1984-07-27 | Appetitregulierender Wirkstoff und Verfahren zur Herstellung desselben |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU832718A HU194916B (en) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | Process for producing new type of active compound of selective inhibiting activity for intake of food |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT34767A HUT34767A (en) | 1985-04-28 |
HU194916B true HU194916B (en) | 1988-03-28 |
Family
ID=10960797
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU832718A HU194916B (en) | 1983-07-29 | 1983-07-29 | Process for producing new type of active compound of selective inhibiting activity for intake of food |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4588685A (hu) |
EP (1) | EP0133308B1 (hu) |
JP (1) | JPS60136517A (hu) |
AT (1) | ATE32515T1 (hu) |
AU (1) | AU572534B2 (hu) |
DE (1) | DE3469359D1 (hu) |
DK (1) | DK161153C (hu) |
HU (1) | HU194916B (hu) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HUT45903A (en) * | 1986-12-17 | 1988-09-28 | Rixhter Gedeon Vegyeszeti Gyar | Cleaned active substances of biological origin hindering the nutrition selectively, their antibodies and immune complexes of these active substances and the proper antibodies |
US5858967A (en) * | 1995-01-20 | 1999-01-12 | University Of Washington | Appetite supression factor and related methods |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU178703B (en) * | 1978-08-29 | 1982-06-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for separating appetite-controlling fraction from human or animal sera,of activity specifically on the nutrient center |
HU183590B (en) * | 1981-09-28 | 1984-05-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for the isolation of an active suastance influencing specifically the nutrition centre with a regulative effect on the appetite from human and/or animal blood serum |
-
1983
- 1983-07-29 HU HU832718A patent/HU194916B/hu not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-07-19 US US06/632,439 patent/US4588685A/en not_active Expired - Fee Related
- 1984-07-27 AU AU31271/84A patent/AU572534B2/en not_active Ceased
- 1984-07-27 DK DK369184A patent/DK161153C/da not_active IP Right Cessation
- 1984-07-27 EP EP84108919A patent/EP0133308B1/de not_active Expired
- 1984-07-27 DE DE8484108919T patent/DE3469359D1/de not_active Expired
- 1984-07-27 AT AT84108919T patent/ATE32515T1/de not_active IP Right Cessation
- 1984-07-27 JP JP59157084A patent/JPS60136517A/ja active Granted
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US4588685A (en) | 1986-05-13 |
DK161153C (da) | 1991-11-18 |
DE3469359D1 (en) | 1988-03-24 |
AU572534B2 (en) | 1988-05-12 |
DK369184A (da) | 1985-01-30 |
EP0133308A3 (en) | 1986-01-02 |
EP0133308A2 (de) | 1985-02-20 |
DK161153B (da) | 1991-06-03 |
DK369184D0 (da) | 1984-07-27 |
ATE32515T1 (de) | 1988-03-15 |
EP0133308B1 (de) | 1988-02-17 |
AU3127184A (en) | 1985-01-31 |
JPS60136517A (ja) | 1985-07-20 |
JPH0533240B2 (hu) | 1993-05-19 |
HUT34767A (en) | 1985-04-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Trelstad et al. | Isolation of two distinct collagens from chick cartilage | |
US4761471A (en) | Bone morphogenetic protein composition | |
US4619989A (en) | Bone morphogenetic protein composition | |
ELLIS | Studies on the serial extraction of pituitary proteins | |
JPH04505014A (ja) | 新規の蛋白質及びその製法 | |
EP0101063B1 (de) | Neues Polypeptid mit Wirkung auf das Immunsystem, Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung, seine Verwendung und dieses enthaltende Mittel | |
DE3587526T2 (de) | Serinproteaseinhibitoren und isolierungsverfahren dazu. | |
HU194916B (en) | Process for producing new type of active compound of selective inhibiting activity for intake of food | |
Kino et al. | Purification and characterization of three mitogenic lectins from the roots of pokeweed (Phytolacca americana) | |
Kuboki et al. | Detection of collagen degradation products in bone | |
JPH06135996A (ja) | アンジオジェニンの単離方法 | |
US4430264A (en) | Process for the preparation of a selective anorexogenic substance regulating food intake | |
Francis et al. | Isolation and characterization of acidic structural glycoproteins in pulmonary tissues | |
Barman | The Isolation of an α‐Lactalbumin with Three Disulphide Bonds | |
Burley | Isolation and properties of a low-molecular-weight protein (apovitellenin I) from the high-lipid lipoprotein of emu egg yolk | |
EP0042560B1 (en) | A process for producing and obtaining anaphylatoxin- and cocytotaxin-containing leucotaxine preparations and of anaphylatoxin and cocytotaxin proteins in molecularly homogeneous, biologically active form | |
SE446302B (sv) | Anorektisk substans vilken isolerats ur humant och/eller animalt blodserum samt sett for dess framstellning | |
Samuelsson | Chromatography of Viscotoxin and oxidized Viscotoxin on phosphate cellulose | |
DE69921505T2 (de) | Serinprotease-inhibitor | |
JP4304267B2 (ja) | 機能性蛋白質及びその製造方法 | |
Neumüller | Chemical studies on the influenza hemagglutination inhibitor normal allantoic fluid | |
SU997298A1 (ru) | Способ получени полипептидов | |
RU2112523C1 (ru) | Способ получения полипептидов тимуса для усиления антибактериальной резистентности | |
JPS6310733A (ja) | 癌細胞傷害活性物質及びその製法 | |
JPS625129B2 (hu) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HU90 | Patent valid on 900628 | ||
HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: DR. KNOLL, JOZSEF, HU |
|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |