BR112018007445A2

BR112018007445A2 - anticorpos fv multivalentes

Info

Publication number: BR112018007445A2
Application number: BR112018007445A
Authority: BR
Inventors: RAJKOVIC Erich; FUCEK Ivica; ELLWANGER Kristina; Treder Martin; Weichel Michael; Mueller Thomas; Ross Thorsten; Usch Uwe
Original assignee: Affimed Gmbh
Priority date: 2015-10-13
Filing date: 2016-10-13
Publication date: 2019-12-10
Also published as: CA3001765A1; JP2018537415A; US11572415B2; US20190040155A1; EP3156417A1; AU2016336866B2; KR20180057720A; IL258638A; MX2018004547A; CN108473577A; AU2016336866A1; IL258638B2; EP3362478A1; SG11201803083XA; ZA201802543B; IL258638B; RU2018126966A3; SG10202004094VA; RU2018126966A; JP6936497B2

Abstract

uma molécula compreendendo uma unidade de diacorpo integrada em uma cadeia polipeptídica possuindo pelo menos seis domínios variáveis ligados um após o outro. em certos casos, dois fragmentos de fv de cadeia simples (scfv) estão ligados distalmente à unidade de diacorpo, proporcionando mais dois locais de ligação ao antígeno.

Description

ANTICORPOS FV MULTIVALENTES

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a um derivado de anticorpo-FV multivalente e multiespecifico, em particular, uma molécula de anticorpo Fv compreendendo uma unidade-diacorpo.

[002] Os anticorpos biespecificos são utilizados para acoplar dois alvos terapêuticos diferentes ou realizar duas funções distintas. Tais anticorpos podem ser utilizados, por exemplo, para recrutar uma célula efetora imune, por exemplo, células T- ou células NK, no sentido de uma célula alvo em particular. Várias moléculas baseadas em anticorpo-fragmentos são conhecidos e sob investigação, por exemplo, na terapia do câncer.

[003] Os anticorpos biespecificos podem ser construídos utilizando apenas domínios variáveis de anticorpos. Por exemplo, a sequência ligante entre os domínios V_H e V_L pode ser encurtado para uma extensão de tal modo que eles não possam dobrar sobre e em pares associado de um modo intramolecular. Esses ligantes curtos, por exemplo, 2-12 resíduos, previnem a referida formação de uma molécula de fragmento variável de cadeia simples monomérica (scFv) e a favorecer emparelhamentos intermoleculares V_H/V_Lentre domínios variáveis complementares a diferentes cadeias polipeptídicas que formam um diacorpo dimérica (Holliger et ai., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90, 6444-6448) . Tal diacorpo pode ser usado para construir anticorpos biespecificos, que são obtidas por associação não-covalente de dois produtos de fusão polipeptídeo de cadeia simples,

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2/90 cada um consistindo de um domínio V_H de um anticorpo ligado por um curto ligante para o domínio V_L de outro anticorpo (ou vice-versa).

[004] O documento WO 03/025018 revela uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica com uma estrutura formada por polipeptídeos de cadeia simples idênticos, com quatro domínios de ligação. Um domínio V_H e um domínio V_L em uma parte terminal de cada cadeia de polipeptídeo estão ligados por um ligante curto e associado intermolecularmente com os correspondentes domínios V_H e V_L de outra cadeia polipeptídica, enquanto que os outros domínios V_H e V_L de cada cadeia polipeptídica ligam-se intramolecularmente para uma outra, dentro da mesma cadeia, resultando em uma unidade de scFv de ligação ao antígeno. Tais construções são homodímeros, isto é, elas consistem de polipeptídeos de cadeia simples idênticos que se associam uns com os outros de um modo par a par.

[005] Além disso, anticorpos triespecíficos são desejados para direcionar dois antígenos tumorais que permitem uma maior seletividade para as células cancerosas, poupando o tecido saudável e resultando em uma faixa de dosagem mais ampla e aplicabilidade terapêutica dentro da qual o medicamento pode ser eficaz na erradicação de células cancerosas. Por exemplo, um anticorpo triespecífico pode ser usado para o direcionamento dois antígenos tumorais diferentes e com uma terceira especificidade de envolver as células T ou células NK para exercer um efeito citotóxico.

[006] O documento WO 2009/007124 divulga uma fusão triespecífica de Fv de cadeia simples (scFv) que são

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3/90 designados como triplocorpo e que consiste em três fragmentos scFv em tandem-arranjo tendo três especificidade diferentes (CD123 e CD33 para marcadores tumorais e um para CD16 em células NK) . A molécula é adicionalmente estabilizada por pontes dissulfeto na localização central scFv. Tais moléculas de permitem um duplo-direcionamento de células tumorais positivas duplas e ligação monovalente para CD16 em células NK.

[007] A presente invenção refere-se a um anticorpo Fv multivalente compreendendo uma unidade-diacorpo que consiste em dois pares de domínios variáveis que se associam para dois locais de ligação ao antígeno. Um local de ligação ao antígeno significa um local de ligação ao antígeno de Fv de um par de domínios VH / VL, ou seja, um local de ligação ao antígeno VH / VL, ou de um único domínio de local de ligação de antígeno. Cada par de domínios variáveis está ligada uma após a outra em um polipeptídeo. O unidade de diacorpo é constituída por um polipeptídeo (cadeia unidade de diacorpo única) ou dois polipeptídeos (unidade de diacorpo). Pelo menos um par de domínios variáveis está ligada no polipeptídeo a outro domínio variável localizado no terminal-N para este par de domínios variáveis e para outro domínio no terminal C variável. Assim, tal polipeptídeo compreende, pelo menos, quatro domínios variáveis ligados um após o outro, em que dois domínios variáveis justapostos ligados um após o outro são um par de domínios variáveis do unidade de diacorpo e um ainda um domínio variável encontrase no terminal-N para o par de variável domínios do unidade de diacorpo e ainda outros domínios variáveis situa-se CPetição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 10/97

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terminaImente	em relação	ao	par de	domínios	variáveis	do
unidade de	diacorpo.	0	domínio	variável	ligada	N-
terminaImente	em relação	ao	par de	domínios	variáveis	da
unidade de diacorpo pode	ser	um domí	nio de cadeia variável

leve (V_L) ou um domínio de cadeia variável pesada (V_H), bem como o domínio ligado C-terminalmente em relação ao par de domínios variáveis da unidade de diacorpo pode ser um domínio variável de cadeia leve (V_L) ou um domínio de cadeia pesada variável (V_H) . Tal polipeptídeo é um polipeptídeo Fv compreendendo, pelo menos, quatro domínios variáveis ligados um após o outro, isto é, o domínio variável N-terminal ligada ligado com o par de domínios variáveis do unidade de diacorpo que está ligada a outro domínio no terminal C variável. Em concretizações particulares de seis, oito ou dez domínios variáveis são ligados um após o outro em tal polipeptídeo Fv.

[008] O anticorpo multivalente Fv é pelo menos tetravalente e compreende, pelo menos, quatro locais de ligação de antígeno. Assim, o polipeptídeo Fv do anticorpo Fv compreendendo, pelo menos, quatro domínios variáveis, em que dois dos, pelo menos quatro domínios variáveis é um par de dois justapostos domínios variáveis do unidade de diacorpo associam com o outro par de domínios variáveis do diacorpounidade para dois locais de ligação de antígeno (primeiro e segundo) tem, pelo menos, um outro (terceiro) do domínio variável na extremidade N-terminal do polipeptídeo Fv que se associa com um domínio variável que corresponde a um novo local de ligação (terceiro) antígeno e pelo menos um adicionalmente (quarto) do domínio variável na extremidade

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C-terminal do polipeptideo Fv que se associa com um domínio variável que corresponde a um novo local (quarto) de ligação ao antígeno. Em certas concretizações são formadas, pelo menos, quatro locais de ligação de antígeno do anticorpo Fv multivalente entre dois polipeptídeos Fv e em outras concretizações, pelo menos, quatro locais de ligação ao antígeno são formados por dobragem intramolecular de um único polipeptideo Fv.

[009] Assim, em certas concretizações cada um dos outros domínios variáveis ligadas no terminal-N e Cterminalmente em relação ao par de domínios variáveis do unidade de diacorpo no mesmo polipeptideo faz parte de um outro local de ligação ao antígeno. Assim, um par de domínios variáveis do unidade de diacorpo (primeiro par) associados com o outro par de domínios variáveis do unidade de diacorpo (segundo par) para dois locais de ligação ao antígeno (primeiro e do sítio de ligação segundo antígeno) e o outro N -terminalmente localizado associados domínio variável com um domínio variável que corresponde a um terceiro local de ligação de antígeno e os C-terminalmente localizados adicionais associados domínio variável com um domínio variável que corresponde a um local de ligação ao antígeno quarto. Portanto, tal anticorpo Fv multivalente é pelo menos tetravalente. Em certas concretizações deste local de ligação ao antígeno compreendendo ainda um domínio variável ligada no terminal-N e/ou C-terminalmente em relação ao par de domínios variáveis do unidade de diacorpo é um scFvunidade ou um unidade de diacorpo de cadeia simples (SCDB). Em outras concretizações as mais domínios variáveis ligadas

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6/90 no terminal-N e C-terminalmente em relação ao par de domínios variáveis do unidade de diacorpo no mesmo polipeptideo (primeiro polipeptideo) está associado com domínios correspondentes V_H ou V_L de outro polipeptideo (segundo polipeptideo ) compreendendo o segundo outro par de domínios variáveis do unidade de diacorpo, formando, assim, um outro dois sítios de antígenos V_H / V_L (terceira e quarta) entre os domínios variáveis das duas ligações (primeira e segunda) polipepitídeos.

[0010] Em certas concretizações os dois pares de domínios variáveis do unidade de diacorpo são um par de domínios variáveis de cadeia leve (V _L -V _L ) ligados um após o outro em um polipeptideo e um par de cadeias pesadas variáveis (V_H-V_H ) ligados um após o outro em um polipeptideo, em que o V_L-V_L par e o V_H-V _H par associado a dois \ fJ \ f _H(primeiro e segundo), locais de ligação de antígeno.

[0011] Em certos enquadramentos, a molécula de anticorpo multivalente compreende um unidade de diacorpo, ou seja, um par de domínios variáveis do unidade de diacorpo, integrado numa cadeia polipeptídica tendo pelo menos seis domínios variáveis, por exemplo, seis, oito ou dez, ligados um após o outro.

[0012] O unidade de diacorpo é constituída por um par de dois domínios variáveis ligados um após o outro de tal modo que estes domínios não podem dobrar intramolecularmente em uma unidade Fv funcional, ou seja, uma unidade V _H / V _L de ligação ao antígeno, e, em vez associar com um outro par de dois domínios variáveis ligados um após o outro para formar um bivalente, ou seja, diacorpo,

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7/90 para proporcionar dois locais de ligação ao antígeno. Ligando um par de domínios de cadeia leve variável (V_L -V_L) um após o outro e um par de domínios variáveis de cadeia pesada (V_HV_H) um após o outro, o emparelhamento intramolecular dos domínios dentro de cada par é impedido devido ao mesmo tipo de domínios, ou seja, V_H-V_H ou V_L-V_L. A estrutura rígida e compacta da unidade de diacorpo facilita a fabricação, o enrolamento correto do anticorpo multivalente e aumenta a estabilidade do anticorpo. Tal unidade de diacorpo gera dois locais antigênicos V_H / V_L dentro da molécula de ligação do anticorpo por dois domínios ligados não covalentemente V_H e V_L, o que é vantajoso para a estabilidade da molécula de anticorpo, uma vez que leva a uma molécula mais compacta. Em certas concretizações, a par de dois domínios variáveis está ligada por um ligante curto.

[0013] Em certas concretizações, dois Fv (scFv) de cadeia simples são distalmente ligado a unidade de diacorpo de fornecimento de mais dois locais de ligação de antígeno V_H / V_L (Figs. 1 e 2) . Assim, tal molécula de anticorpo multivalente é, pelo menos, tetravalente, porque ela proporciona, pelo menos, quatro locais de ligação ao antígeno; dois pela unidade de diacorpo e dois pelas duas unidades scFv. Cada um dos fragmentos scFv distalmente localizados podem ser dispostos na ordem V_H-V_L ou V_L-V_H no polipeptídeo.

[0014] Tais moléculas de anticorpos tetravalentes é vantajoso para a geração de anticorpos tetravalentes, pentavalentes ou triespecíficos hexavalente. Estes anticorpos triespecíficos novos podem ser utilizados, por

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8/90 exemplo, para recrutar células efetoras imunes para matar células alvo, por exemplo, células tumorais ou células infectadas por vírus. Uma vez que tais anticorpos triespecíficos, de acordo com a invenção são, pelo menos, tetravalente, que proporcionam uma atividade funcional aumentada em relação à trivalente e fraqmentos de cadeia simples triespecíficos . Anticorpos triespecíficos e anticorpos tetravalentes, de acordo com a invenção liqam-se de forma bivalente por dois dos quatro sítios de liqação para ambos, a célula alvo, bem como a célula efetora imune. Por exemplo, a liqação para a célula alvo bivalente não só aumenta a avidez, mas também aumenta a especificidade de direcionamento quando duas das três especificidade de antíqeno são de dois antíqenos diferentes, por exemplo, dois antíqenos tumorais diferentes, na superfície celular da célula alvo. Por outro lado, a eficiência citotóxica da célula efetora imune recrutados pode ser modulada, em particular um aumento, quando o anticorpo se liqa de forma bivalente para a célula efetora imune. Em outros casos, tal anticorpo triespecífico pode ter duas especificidade para diferentes antíqenos nas células efetoras e uma terceira especificidade para um antíqeno de uma célula tumoral, Neuron, ou células viralmente infectadas ou que se liqam e, eventualmente, neutralizar uma proteína solúvel de crescimento semelhante a fator-, citocinas ou outros liqandos não-célula liqada.

[0015] Em certas concretizações, os domínios variáveis do diacorpo na unidade, que são liqados por um liqante curto que impede o emparelhamento intramolecular são

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9/90 ambos tanto domínios variáveis de cadeia leve (V_L-V_L) ou os domínios variáveis de cadeia pesada (V_H-V_H) (Figs. 1 e 2) . Verificou-se que este arranjo de domínio particular facilita o dobramento correta de moléculas de anticorpos multiespecíficos e multivalentes, de acordo com a invenção. Em particular para moléculas de anticorpo tetravalente, triespecífico ou tetraespecíficoa Fv desta, medidas podem ser tomadas para permitir uma associação correta da molécula de anticorpo Fv tendo domínios variáveis para três ou mais especificidade diferentes e para prevenir a associação incorrecta dentro de um único polipeptídeo (monómero) ou homodimerização entre dois polipeptídeos idênticos Fv em vez de heterodimerização correta do primeiro com o segundo polipeptídeo (Exemplo 2). Os inventores obtiveram uma associação correta entre os domínios variáveis de três especificidade e dois polipeptídeos diferentes que fornecem os domínios variáveis, integrando na molécula de anticorpo triespecífico, tal unidade de diacorpo formada por um primeiro par de dois domínios pesados variáveis ligados por um ligante curto associado com um segundo par de dois domínios variáveis leves correspondentes ligados por um ligante curto. Assim, tal arranjo de domínio variável no unidade de diacorpo, ou seja, V _L -V _L em que o primeiro polipeptídeo de domínios variáveis e V _H -V _H em que o segundo polipeptídeo de domínios variáveis, permite a associação correcta e dobragem de uma tetravalente e triespecífica ou anticorpo Fv tetraespecífico. Os inventores verificaram que tais V _L -VL / V _H -V _H arranjo na unidade de diacorpo ou unidade de cadeia diacorpo única força o enrolamento correto

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10/90 de um polipeptideo de comprimento compreendendo mais do que seis domínios variáveis ligados um depois o outro para uma molécula de anticorpo Fv (por exemplo, Fig. 1) ou o enrolamento correto e heterodimerização de dois polipeptídeos com diferentes comprimentos de uma molécula de anticorpo Fv dimérica funcional (por exemplo, as Figs. 2, 5, 6a, 6b) .

[0016] De acordo com outras concretizações pelo menos um de cadeia simples unidade de diacorpo (SCDB) é distalmente ligadas a unidade de diacorpo de fornecimento local de ligação, pelo menos, um antígeno adicional. Por isso, pelo menos um polipeptideo da unidade de diacorpo compreende um par dos domínios variáveis da unidade de diacorpo ligada a pelo menos uma SCDB no polipeptideo. Por exemplo, duas unidades SCDB são distalmente ligadas a unidade de diacorpo de fornecer mais duas ligações antígeno sítios por cada cadeia simples unidade de diacorpo (Figs. 4 e 5). Assim, tal molécula de anticorpo multivalente é, pelo menos, tetravalente, porque ele proporciona, pelo menos, quatro locais de ligação de antígeno. Tal anticorpo multivalente é, pelo menos em concretizações hexavalente, onde pelo menos duas unidades SCDB estão ligados a unidade de diacorpo, por causa das duas unidades SCDB orientada distalmente proporcionando quatro locais de ligação ao antígeno e dois locais de ligação ao antígeno fornecidos pelo unidade de diacorpo. Em cada um dos distalmente SCDB-unidades dos domínios variáveis podem ser dispostos na ordem V_H-V_L-V_H-V_L, V_L-V_H-V_L-V_H, V_L-V_L-V_H-V_H ou V_H-V_H-V_L-V_L no polipeptideo.

[0017] Em certas concretizações a unidade de

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11/90 diacorpo é constituída por dois pares de domínios variáveis dispostos em dois polipeptídeos associados um com o outro, formando assim dois locais de ligação ao antígeno e cada um dos dois polipeptídeos compreende pelo menos um outro fragmento de cadeia simples e/ou única fragmento diacorpo cadeia localizado distalmente para cada um dos dois pares de domínios variáveis da unidade de diacorpo. (Figs. 6A, 6B, 7, 8a e 8b). Assim, tal molécula de anticorpo multivalente é, pelo menos, heptavalente, porque ele proporciona, pelo menos, cinco locais de ligação ao antígeno; dois sítios de ligação pelo unidade de diacorpo, pelo menos, dois sítios de ligação por os dois scFv-unidades ou SCDB-unidades Nterminal e C-terminalmente em relação ao primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo e pelo menos um local de ligação N-terminalmente ou C-terminalmente em relação ao outro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo de outro polipeptídeo da unidade de diacorpo.

[0018] Em certas concretizações, a presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo multivalente compreendendo um polipeptídeo que compreende, pelo menos, seis domínios variáveis ligados um após o outro, em que um unidade de diacorpo que compreende dois primeiros domínios variáveis das ditas, pelo menos, seis domínios variáveis está integrado no referido polipeptídeo e os referidos primeiros dois domínios variáveis do unidade de diacorpo estão associados com mais dois domínios variáveis do unidade de diacorpo, ou seja, segundo dois domínios variáveis, de modo a formar dois locais de ligação ao antígeno. O segundo dois domínios variáveis pode ser localizado no mesmo

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12/90 polipeptideo com os dois primeiros domínios variáveis ou num polipeptídeo separado segundo associado com o primeiro polipeptideo. Os dois locais de ligação ao antígeno fornecidos pela unidade de diacorpo são formadas entre o primeiro e segundo domínios variáveis, em que cada domínio variei do primeiro par de domínios variáveis formam um sítio de ligação ao antígeno com outro domínio variável do segundo par de domínios variáveis. Assim, a unidade de diacorpo é formada por dois referidos primeiro e segundo domínios variáveis, em que os dois domínios variáveis são ligados através de um curto ligante peptídico, no primeiro, bem como os segundos dois domínios variáveis para prevenir o emparelhamento intramolecular.

[0019] Assim, em certas concretizações da presente invenção refere-se a uma molécula de anticorpo multivalente compreendendo um polipeptídeo possuindo, isto é, que compreende, pelo menos, seis domínios variáveis ligados um após o outro, em que dois domínios variáveis do polipeptídeo estão ligados por um ligante peptídico impedindo o emparelhamento intramolecular e disse dois domínios variáveis são associados com outros dois domínios variáveis correspondentes ligados por um ligante peptídico impedindo o emparelhamento intramolecular, os ditos quatro domínios variáveis formando dois locais de ligação de antígeno entre as referidas quatro domínios variáveis. Por exemplo, tal anticorpo é um anticorpo Fv, em particular, um anticorpo triespecífico tetravalente e Fv.

[0020] A molécula de anticorpo é multivalente, ou seja, possuem local de ligação mais do que um antígeno. É

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13/90 tetravalente, quando se tem quatro locais de ligação ao antigeno; pentavalente, quando se tem cinco antigeno e locais de ligação hexavalente, quando se tem seis locais de ligação de antigeno. Tetravalente refere-se a uma molécula de anticorpo que compreende, em especial, que consiste em, quatro locais de ligação ao antigeno de Fv, em que cada um dos locais de ligação ao antigeno de Fv compreende um par V_H/ V _L possuindo um domínio variável de cadeia pesada (V_H) e um domínio variável de cadeia leve (V_L) da mesma especificidade de antigeno epítopo associado com um outro. Assim, tal molécula de anticorpo tetravalente compreende, pelo menos, oito domínios de anticorpo variável, nomeadamente quatro domínios variáveis da cadeia pesada (V _H) e quatro domínios variáveis de cadeia leve (V_L) . Uma vez que a molécula tetravalente de ligação do antigeno compreende, pelo menos, oito domínios variáveis de anticorpo, seu peso molecular é superior a 100 kDa, o que resulta em uma meia-vida mais longa de uma tal molécula em comparação com moléculas trivalente e moléculas de Fv de cadeia simples triespecíficos.

[0021] Em certas concretizações, a molécula de anticorpo multiespecífico é, ou seja, possuem especificidade para diferentes epítopos de antígenos. Em certas concretizações, a molécula de anticorpo é triespecífica.

[0022] Uma molécula de anticorpo triespecífica e tetravalente compreende um local possuindo especificidade de ligação ao antigeno de encontro a um primeiro epítopo de antigeno, um local que possui especificidade de ligação ao antigeno de encontro a um segundo epítopo de antigeno e dois

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14/90 locais de ligação ao antigeno possuindo especificidade contra um terceiro epitopo de antigeno. Assim, tais moléculas de anticorpos triespecificos e tetravalente tem, ou seja, compreendem, especificidade diferentes para três epitopos de antigenos diferentes. Por exemplo, tal molécula de ligação ao antigeno compreende um primeiro local de ligação ao antigeno possuindo especificidade contra um primeiro epitopo de antigeno, um segundo local de ligação ao antigeno possuindo especificidade contra um segundo epitopo de antigeno, um terceiro e um quarto locais de ligação ao antigeno possuindo especificidade contra um terceiro epitopo de antigeno. Um pentavalente e moléculas de anticorpo trispecfic compreende dois locais de ligação de antigeno possuindo especificidade contra um primeiro epitopo de antigeno, dois locais de ligação ao antigeno possuindo especificidade contra um segundo epitopo de antigeno e um local que possui especificidade de ligação ao antigeno contra um terceiro epitopo de antigeno. Alternativamente, uma molécula de anticorpo pentavalente e triespecifica pode compreender três locais de ligação ao antigeno de encontro a um primeiro epitopo de antigeno e um local de ligação a antigeno contra cada um dos segundo e terceiro epitopo de antigeno. Uma molécula de anticorpo triespecifico hexavalente e compreende em certas concretizações dois locais de ligação ao antigeno para cada um dos três epitopos de antigeno ou, em alternativa, um a três locais de antigeno para cada um dos três epitopo de antigeno de ligação.

[0023] Em certas concretizações, a molécula de anticorpo é uma molécula de anticorpo Fv. Anticorpo Fv

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15/90 refere-se a um Fv derivado de um imunglobulina que compreende única variável (V), os domínios de anticorpo, mas é desprovido das regiões constantes de anticorpos ou seus fragmentos. Cada domínio variável de cadeia leve (V_L) associados com um correspondente domínio variável de cadeia pesada (V_H) que forma um local de ligação ao antígeno de Fv (local de ligação ao antígeno VH / VL) . Os domínios de anticorpo variáveis estão ligados uma com a outra por um ligante peptídico ou uma ligação peptídica a um polipeptídeo de fusão. O anticorpo Fv, ou seja, molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção pode ser um monómero de um ico polipeptídeo ou um polipeptídeo multimérico. Uma molécula de ligação ao antígeno multimérico, ou seja, anticorpo Fv, em particular, de anticorpo Fv multivalente, pode ser, por exemplo, um dímero que tem dois polipeptídeos, um trímero com três polipeptídeos ou um tetrâmero tendo quatro polipeptídeos. O dímero é heterodimérica, se for constituída por dois polipeptídeos que possuem composições de aminoácidos diferentes, ou é homodimérica, se for constituída por dois polipeptídeos idênticos.

[0024] O termo polipeptídeo refere-se a um polímero de resíduos de aminoácidos ligados através de ligações amida. O polipeptídeo é, de preferência, uma única proteína de fusão que não é cadeia ramificada. Dentro do polipeptídeo os domínios variáveis de anticorpo (Fv) estão ligados um após o outro. Um polipeptídeo Fv significa um polipeptídeo de fusão, em que os domínios variáveis de anticorpo (Fv) estão ligados um após o outro. O polipeptídeo pode ter resíduos de aminoácidos contíguos, além de N

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16/90 terminal e/ou C-terminal. Por exemplo, o polipeptídeo pode conter uma sequência de marcador, de um modo preferido, no terminal C, que pode ser útil para a purificação, bem como a detecção do polipeptídeo. Exemplo de uma sequência de marcador é um His-Tag, por exemplo um His-Tag consistindo de seis-His resíduos, um FLAG-tag, por exemplo, um octapeptídeo DYKDDDDK (SEQ ID NO: 38) ou STREP ® 1 1-Tag, por exemplo um WSHPQFEK octapeptídeo (SEQ ID NO: 39)), ou um C-Tag, por exemplo um tetrapeptídeo EPEA (SEQ ID NO: . 40) . Para uma molécula de ligação ao antígeno multimérico, sequências marcadoras diferentes podem ser usadas para diferentes polipeptídeos, por exemplo, um His-Tag para o primeiro polipeptídeo e um FLAG-tag para o segundo polipeptídeo de uma molécula dimérica. Em certas concretizações, o polipeptídeo pode compreender domínios variáveis proporcionando os locais de ligação ao antígeno e mais domínios constantes de anticorpos, por exemplo, domínios C_L, C_H e/ou Fc. Por exemplo, tais concretizações podem compreender um polipeptídeo Fv ou anticorpo Fv fundido com, pelo menos um domínio constante de anticorpo, por exemplo, um domínio Fc. Em ainda mais concretizações, o polipeptídeo que compreende os domínios variáveis podem ser acoplados a outro agente, por exemplo, uma toxina, um agente imunomodulação ou um agente gerador de sinal.

[0025] Ligantes refere-se a um peptídeo de ligação entre dois domínios variáveis justapostos no polipeptídeo entre o terminal-C de um domínio e o terminal N do outro domínio justaposto ou vice-versa. Em relação à composição de aminoácidos de um peptídeo é selecionado que não interferem

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17/90 com a formação de Fv, isto é, VH / VL, locais de ligação ao antigeno assim como não interferir com a multimerização, por exemplo, a dimerização de multiespecifica, por exemplo, triespecifico, moléculas. Por exemplo, um ligante compreendendo glicina e resíduos de serina em geral, proporciona resistência a proteases. Em algumas concretizações ligantes peptídicos (G₂S)_X são utilizados, em que, por exemplo, x = 1-20, por exemplo, ligantes peptídicos (G₂S), (G₂S)₂, (G₂S)₃, (G₂S)₄, (G₂S)₅, (G₂S)₆, (G₂S)₇or(G₂S)₈ , or (G₃S)_X são utilizados, em que, por exemplo, x = 1-15 ou ligantes peptídicos (G₄S)_X são utilizados, em que, por exemplo, x = 1-10, de preferência, 1-6. A sequência de aminoácidos do ligante pode ser otimizada, por exemplo, por métodos de apresentação em fagos para melhorar a ligação ao antígeno e um rendimento de produto do polipeptídeo.

[0026] O comprimento dos ligantes influencia a flexibilidade do dímero de polipeptídeo de ligação a antígeno. A flexibilidade desejada do dímero de polipeptídeo de ligação ao antígeno depende da densidade de antígeno alvo e a acessibilidade do antígeno alvo, isto é, epítopos no antígeno alvo. Os ligantes mais longos proporcionam polipeptídeos de ligação ao antígeno mais flexíveis com os locais de ligação ao antígeno mais ágil. O efeito de comprimentos de ligantes na formação de polipeptídeos de ligação ao antígeno diméricos é descrito, por exemplo, em Todorovska et ai, 2001, Journal of Immunological Methods 248:. 47-66; Perisic et al, 1994 Estrutura 2:. 1217-1226; Le Gall et ai, 2004, Protein Engineering 17: 357-366 e WO 94/13804.

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18/90 [0027] Uma unidade de diacorpo está integrado no polipeptideo da molécula de anticorpo. Unidade de diacorpo indica um Fv bivalente-módulo que consiste de dois pares de domínios variáveis, de um primeiro par e um segundo par, o qual associado a dois locais de ligação ao antígeno de VL / VH. Cada par de domínios variáveis está ligada uma após a outra em um polipeptideo. Em certos enquadramentos, a bivalente Fv de módulo é constituído por um primeiro e um segundo par de dois domínios variáveis justapostos, em que em cada par os dois domínios variáveis são fundidos por um curto ligante peptídico que se opõe a uma associação intramolecular entre os domínios variáveis ligadas pelo ligante curto. O primeiro par de domínios variáveis é forçado a associar-se com o segundo par de domínios variáveis para a formação de dois locais de ligação ao antígeno de Fv com os dois pares de domínios variáveis. Assim, cada um dos dois locais de ligação de antígeno Fv é formado por um domínio variável do primeiro par de domínios variáveis e um domínio variável do segundo par de domínios variáveis. Portanto, tais unidade de diacorpo compreende um local de ligação, pelo menos, um antígeno de dois domínios variáveis, que não estão diretamente ligados por um curto ligante peptídico 3, 3a (Figs. 1 e 2) . Os dois pares de domínios variáveis justapostos estão localizados em dois polipeptídeos separados que formam uma unidade dimérica diacorpo (Figs. 2, 3, 5-8), ou os dois pares de domínios variáveis são justapostas localizadas sobre o mesmo polipeptideo que forma uma unidade de diacorpo de cadeia simples (Figs. 1, 4). Em cada par de domínios variáveis do ligante curto 3, 3a liga

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19/90 o C-terminal de um domínio variável com o terminal N do outro domínio variável ou vice-versa. Em cada par dos domínios variáveis pode ser orientada a partir do N- para o C-terminal como V_L-V_H, V_H-V_L, V_H-V_H ou V_L-V_L, em que os dois domínios variáveis do par têm diferentes especificidade de epítopo ou antíqeno a mesma especificidade de epítopo antiqênico. Em certas concretizações, os dois domínios variáveis são diretamente liqados por uma liqação peptídica entre o terminal N de um domínio variável e o terminal C do outro domínio variável do par. O comprimento do liqante peptídico curto que liqa os dois domínios variáveis, em cada um dos primeiro e sequndo par de domínios variáveis do unidade de diacorpo é, tal que uma associação intramolecular entre os domínios variáveis liqadas pelo liqante é impedida. Tal liqante é curta, ou seja, é constituído por 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou cerca de 12 resíduos de aminoácidos No caso de 0 resíduos de aminoácidos do liqante uma liqação peptídica. Tal liqante curto favorece a dimerização correta entre os dois pares de domínios variáveis e formação de dois locais de liqação ao antíqeno de Εν. O encurtamento do liqante para resíduos de cerca de 12 ou menos aminoácidos, qeralmente impede domínios adjacentes da mesma cadeia de polipeptídeo de interaqir umas com as outras. Em uma forma de realização da invenção, estes liqantes consistem de cerca de 3 a cerca de 12, por exemplo 5 a 10, em particular, os resíduos de aminoácidos de 7 a 9 contíguos. O comprimento do liqante pode ser ajustado para a orientação de domínio específico dentro da unidade de diacorpo. Por exemplo, um liqante (L₂S)₂ pode ser usado para um par V_H-V_L ou um par

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V_L-V_H e urn ligante (G₂S)₃ pode ser usado para urn par V_H-V_H ou urn par V_L-V_L ou urn ligante (G₂S)₂ pode ser usado por um par V_H-V_H e um ligante (G₂S)₃ pode ser usado para um par V_L-V_L de uma unidade de diacorpo (ou vice-versa) . Além disso, é, em princípio, possível que dois polipeptídeos possuindo um ligante com mais de 12 resíduos de aminoácidos entre os domínios de anticorpo variáveis do par dimerizam corretamente umas com as outras (ver, por exemplo, Le Gall et ai, 2004, Protein Engineering 17:. 357 -366).

[0028] Em certas concretizações, a unidade de diacorpo é uma unidade de diacorpo de cadeia simples (Fig. 1) . Uma unidade de diacorpo de cadeia simples é constituída por um primeiro par de domínios variáveis ligados a um segundo par de domínios variáveis por um longo ligante permitindo associação intramolecular dos primeiro e segundo pares de domínios variáveis como definido como um ligante longo usado em unidades de scFv e descrito no parágrafo seguinte. Por exemplo, tal ligante longo pode consistir em mais do que 12, em particular, cerca de 15 a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 35, em particular, desde cerca de 15 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos contíguos.

[0029] Em certas concretizações os domínios da diacorpo de cadeia simples ligados um após o outro em um polipeptídeo podem ser dispostos na ordem V_L-V_H-V_L-V_H, V_L-V_L ^vh^-vh/ ^vh^-vh^-vl^-vl ou V_H-V_L-V_H-V_L a partir do N-terminal para o C-terminal da unidade de diacorpo de cadeia simples.

[0030] Em certas concretizações, a molécula de anticorpo da presente invenção consiste de um único polipeptídeo que compreende uma única unidade de cadeia

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21/90 diacorpo-(Figs. 1, 4) . Em concretizações particulares, a molécula de anticorpo compreende pelo menos três unidade de diacorpos de cadeia simples ligadas uma após a outra em um polipeptídeo (Fig. 4). Em outras concretizações a molécula de anticorpo do presente invento compreende, pelo menos, uma unidade de diacorpo de cadeia simples ligada distalmente para uma unidade de diacorpo (Fig. 5).

[0031] Uma unidade Fv de cadeia simples (scFv) indica um local de ligação ao antígeno Fv formado por um fragmento de um único polipeptídeo que consiste de um domínio variável de cadeia leve (V_L) e um domínio de cadeia pesada variável (V_H) . Os domínios variáveis podem ser orientados como V_L-V_H e V_H-V_L a partir do N-terminal para o C-terminal da unidade de scFv. Os domínios variáveis são ligados entre a extremidade C-terminal de um domínio variável e o terminal N do outro domínio variável ou vice-versa por um ligante peptídico. O ligante peptídico é longo e flexível (em geral, que consiste de cerca de 12 ou mais resíduos de aminoácidos) para dobrar intramolecularmente e formando um local de ligação ao antígeno do Fv. Resíduos de aminoácidos adicionais fornecem flexibilidade extra. Por exemplo, tal ligante longo pode consistir em mais do que 12, em particular cerca de 15, a cerca de 50, de preferência cerca de 15 a cerca de 35, em particular desde cerca de 15 a cerca de 25 resíduos de aminoácidos contíguos. O comprimento do ligante pode ser ajustado para a orientação de domínio específico do terminal N para o terminal C no interior da unidade de scFv. Por exemplo, um ligante (L₂S)₆ pode ser usada para uma unidade scF V_H-V_L e um ligante (G₂S)₇ pode ser usada para uma unidade

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22/90 scF V_L-V_H.

[0032] A unidade de scFv é ligada a unidade de diacorpo por um ligante peptídico entre um domínio variável da unidade de scFv e um domínio variável da unidade de diacorpo. O comprimento do ligante peptídico é escolhido para evitar o impedimento estérico entre os domínios variáveis justapostos e para manter a estabilidade da molécula e pode ser, por exemplo, de 5 a 50, em particular

de 5 a 35,	de preferência,	tem, pelo menos,	6, 7, 8, 9,	10,
11, 12, 13	, 14 ou 15 resíduos de aminoácidos	contíguos.
[0033	] Em certas	concretizações,	a unidade	de
diacorpo	está localizado	centralmente no interior	da

molécula de anticorpo para facilitar a dobragem e a melhoria da estabilidade da molécula de anticorpo. Em tais casos, a unidade de diacorpo é a N-terminal e C-terminal conectado com outros domínios variáveis distais. Em certas concretizações a unidade de diacorpo está ligada com duas (Figs. 1, 2, 8a, 8b), três (Figs. 6A, 6B) ou quatro (Fig. 7) scFv-unidades. Em certas concretizações, a molécula de anticorpo, em particular triespecífica de molécula de anticorpo Fv, compreende um polipeptídeo possuindo, pelo menos, seis domínios variáveis, em que o referido polipeptídeo compreende uma unidade de scFv no terminal N, uma unidade de scFv no terminal C e um primeiro par de dois domínios variáveis de uma unidade de diacorpo localizada entre as duas unidades de scFv (Figs. 1 e 2). Este primeiro par de dois domínios variáveis da unidade de diacorpo não se associa a um local de ligação ao antígeno Fv. Por exemplo, se a unidade de diacorpo é uma unidade dimérica diacorpo

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23/90 cada um dos dois domínios variáveis do primeiro par de domínios variáveis justapostos é ligado a um domínio variável adicional. Em particular, cada um dos dois domínios variáveis do primeiro par de domínios variáveis justapostas está ligada com um outro domínio variável de uma unidade de scFv (Fig. 2). Noutros casos, adicionalmente, um ou ambos os domínios variáveis do segundo par de domínios variáveis justapostas pode ser ligada com um outro domínio variável (figs. 6a, 6b, 7) . Se a unidade de diacorpo é uma unidade de diacorpo de cadeia simples do primeiro par de domínios variáveis justapostos é N-terminalmente ligado a outro domínio variável e o segundo par de domínios variáveis justapostos é C-terminal ligado a um domínio variável adicional. Em particular, o primeiro par de domínios variáveis justapostos é N-terminalmente ligado a outro domínio variável de uma unidade de scFv e o segundo par de domínios variáveis justapostos é C-terminal ligado a um outro domínio variável de uma outra unidade de scFv (Fig. 1) . Em outras concretizações, o primeiro par de domínios variáveis de uma primeira unidades de diacorpo de cadeia simples é Nterminalmente ligado a outro domínio variável de uma segunda unidade de diacorpo de cadeia simples e o segundo par de domínios variáveis da primeira unidade de diacorpo de cadeia simples é C-terminalmente ligado a um outro domínio variável de uma terceira unidade de cadeia única diacorpo resultando num polipeptideo que compreende três unidades de diacorpo cadeia simples ligados um após o outro (Fig. 4). Em outros exemplos, pelo menos, um outro domínio variável pode ser localizado entre o primeiro e o segundo par de domínios

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24/90 variáveis justapostas.

[0034] Em certas concretizações onde a unidade de diacorpo é uma única unidade de cadeia diacorpo, o anticorpo multivalente consiste de um ico polipeptídeo que compreende dois domínios variáveis justapostos, isto é, o primeiro par de domínios variáveis justapostas, associado com dois outros domínios variáveis justapostas deste polipeptídeo, ou seja o segundo par de domínios variáveis (Fig. 1). Tal estrutura do anticorpo é favorável para proporcionar multi-específica, em particular, bi-, tri-, ou anticorpos tetraespecífico. Em certas concretizações, tais multivalente, em particular triespecífica Fv, anticorpo tem pelo menos oito domínios variáveis ligados um após o outro a partir do terminal N para o terminal C, um primeiro e um segundo domínio variável formar um scFv-unidade no N-terminal , dito scFv-unidade no N-terminal está ligada pelo terminal C a um terceiro domínio variável de um primeiro par de domínios variáveis de um unidade de diacorpo que compreende o terceiro domínio variável e um domínio diante variável, o referido quarto domínio variável é ligada C -terminally a um quinto domínio variável de um segundo par de domínios variáveis do unidade de diacorpo que compreende o quinto e um sexto domínios variáveis, o referido sexto domínio variável está ligada pelo terminal C a um sétimo domínio variável de um scFvunidade na posição C -terminal e a referida scFv-unidade é formado pelo sétimo e um oito domínios variáveis (Fig. 1). Os domínios variáveis podem ser dispostos a partir do terminal N para o terminal C do polipeptídeo, por exemplo, em um das seguintes orientações: V_h-V_l-V_l-Vh-V_l-V_h-V_l-Vh, V_h

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V_L-V_H-V_H-V_L-V_L-V_L-V_H, V_L-V_H-V_L-V_H-V_L-V_H-V_H-V_L or V_H-V_L-V_L-V_L-V_HV_H-V_L-V_H. Em uma forma de realização particular, um par de domínios variáveis da unidade de diacorpo tem a orientação V h _H e o outro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo tem a orientação V_L-V_L (Fig. 1).

[0035] Concretizações tetravalentes de uma molécula de anticorpo constituído por um único polipeptídeo possuindo oito domínios variáveis conforme descrito no acima mencionado são favoráveis para anticorpos triespecíficos. Por exemplo, tais anticorpos triespecíficos pode fornecer uma primeira e uma segunda especificidade de antígeno para uma célula alvo, por exemplo de células de tumor, e uma terceira especificidade para uma célula efetora imune, por exemplo, de tipo T ou de células NK. Em outros casos, tal anticorpo triespecífico pode ter duas especificidades para diferentes antígenos nas células efetoras e uma terceira especificidade para um antígeno de uma célula tumoral. Em algumas concretizações as duas unidades de scFv distais pode ter a primeira e a segunda especificidade para a célula alvo e a unidade de diacorpo entre as duas unidades de scFv podem ter especificidade para uma célula efetora imune; ou seja, a partir do N-terminal para o C-terminal do primeiro e segundo domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo; os terceiro e quinto domínios variáveis tem a terceira especificidade para a célula efetora imune, os quarto e sexto domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune e a sétima e oito domínios variáveis têm a segunda especificidade para a célula alvo (Fig. 1). Em outras concretizações as duas unidades de

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26/90 scFv distais podem ter especificidade para a célula efetora imune e os dois locais de antigeno formados pela unidade de diacorpo pode ter duas especificidade diferentes para ligação à célula alvo; ou seja, a partir do N-terminal para o C-terminal do primeiro e o segundo, assim como o sétimo e as oito domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune, o terceiro e o quinto domínios variáveis tem a primeira especificidade para o alvo célula e o quarto e sexto domínios variáveis têm a segunda especificidade para a célula alvo. De acordo com outras concretizações alternativas do polipeptídeo único pode ter mais do que oito domínios variáveis, por exemplo, 10, 12 ou mais, e compreender mais do que duas unidades de scFv e / ou mais do que uma unidade de diacorpo.

[0036] Em outras concretizações, a molécula de anticorpo multivalente que consiste de um polipeptídeo compreende três unidades individuais diacorpo cadeia ligados um após o outro (Fig. 4). Tal molécula de anticorpo tem pelo menos 12 domínios variáveis ligados um após o outro a partir do N-terminal para o C-terminal. Em uma forma de realização particular, um par de domínios variáveis da segunda unidade de diacorpo-cadeia simples tem a orientação V_H-V_H e o outro par de domínios variáveis da segunda unidade de cadeia simples diacorpo tem a orientação V_L-V_L (Fig. 4) . Tal molécula de anticorpo é hexavalente e podem compreender locais de ligação ao antigeno de um a seis diferentes especificidades de antigeno, em particular dois ou três especificidade de antigenos diferentes.

[0037] Em certas concretizações, o anticorpo, em

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27/90 particular, molécula de anticorpo Fv compreende uma unidade de diacorpo no formato de unidade de diacorpo dimérica. Em tais casos, a molécula de anticorpo é um dímero de dois polipeptídeos, em que o primeiro par de dois justapostas domínios variáveis da unidade de diacorpo está integrada um primeiro polipeptídeo tendo pelo menos seis domínios variáveis ligados um após o outro e o referido primeiro par de domínios variáveis justapostas está associado a um outro segundo par justapostos dos dois domínios variáveis, em um segundo polipeptídeo. De preferência, os primeiro e segundo polipeptídeos são associados (Figs. 2, 3, 5, 6a, 6b, 7, 8a e 8b8b) de forma não covalente. No entanto, em alguns casos, o primeiro e o segundo polipeptídeo pode ser ligado de forma covalente, por exemplo, por uma ligação dissulfeto, ou agente de ligação químico.

[0038] Em algumas concretizações o primeiro polipeptídeo compreende, pelo menos, seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo compreende, pelo menos, dois domínios variáveis (Fig. 2) . Em tais concretizações o segundo polipeptídeo é parte da unidade de diacorpo e é, de preferência, de forma não covalente, associado com o outro par de dois domínios variáveis justapostas integradas no primeiro polipeptídeo. Em concretizações em que a primeira cadeia de polipeptídeo consiste de seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo é composto por dois domínios variáveis dos domínios variáveis podem ser dispostos a partir do terminal N para o terminal C dos polipeptídeos, por exemplo, nas seguintes orientações: VH -V _L -VH-V _H -V _L -VH (primeiro polipeptídeo) e V _L -V _L (segundo polipeptídeo); V

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28/90 _L -VH-VH-VH-V _H -V _L (primeiro polipeptídeo) e V _L -V _L(segundo polipeptídeo); VH-V _L ^_V L -V L -V H ^_V L (primeiro polipeptídeo) e V _H -V _H (segundo polipeptídeo); V _L -VH-V _L-V _L -V _H -V _L (primeiro polipeptídeo) e V _H -V _H (segundo polipeptídeo) ou V _H ^_V _L -V _L -V _L -V _L -V _H (primeiro polipeptídeo) e V _H -V _H (segundo polipeptídeo). Diâmetro unidades corpo tendo um par dos dois domínios variáveis na orientação V _H -V _H θ o outro par dos dois domínios variáveis na orientação V _L -V _L favor o enrolamento correto, em particular de multiespecífica, por exemplo, triespecífico, anticorpo moléculas.

[0039] concretizações tetravalentes de uma molécula de anticorpo compreendendo um primeiro polipeptídeo tendo pelo menos seis domínios variáveis e um segundo polipeptídeo possuindo pelo menos dois domínios variáveis, tal como descrito no precedente são favoráveis para anticorpos triespecíficos. Devido aos diferentes tamanhos dos primeiro e segundo polipeptídeos, os polipeptídeos podem ser facilmente separados a partir do sobrenadante. Por exemplo, tais anticorpos triespecíficos pode fornecer uma primeira e uma segunda especificidade para uma célula alvo, por exemplo de células de tumor, e uma terceira especificidade para uma célula efetora imune, por exemplo, de tipo T ou de células NK. Em outras concretizações as moléculas de anticorpos triespecíficos fornecem uma primeira e uma segunda especificidade para um primeiro e um antígeno viral ou epítopo antigênico viral e um terceiro na especificidade para uma segunda célula efetora, por exemplo, uma célula NKou T. Em outras concretizações, a molécula de anticorpo

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29/90 triespecifica fornece uma primeira especificidade para um antigeno viral, uma segunda especificidade para um antigeno de uma célula alvo e uma terceira especificidade para uma célula efetora, por exemplo, uma célula NK ou T. Em outros casos, tal anticorpo triespecífico pode ter uma primeira e uma segunda especificidade para células efetoras, por exemplo, células NK ou células-T, e uma terceira especificidade para uma célula alvo, por exemplo, antigeno de tumor numa célula de tumor ou antigeno viral. A primeira e segunda especificidade para uma célula efetora podem ser diferentes antígenos ou epítopos do mesmo antigeno no mesmo tipo de células efetoras.

[0040] Em algumas concretizações, as duas unidades de scFv distais formadas no primeiro polipeptídeo pode ter a primeira e a segunda especificidade para a célula alvo e o unidade de diacorpo entre as duas unidades de scFv e formada com o primeiro e segundo polipeptídeo pode ter especificidade para uma célula imune efetora; ou seja, a partir do N-terminal para o C-terminal, em que o primeiro polipeptídeo do primeiro e segundo domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo; o terceiro e quarto domínios variáveis têm a terceira especificidade para a célula efetora imune, os quinto e sexto domínios variáveis têm a segunda especificidade para a célula alvo e em que o segundo polipeptídeo do primeiro e segundo domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune (Figura 2). Em outras concretizações as duas unidades de scFv distais no primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis podem ter especificidade para a célula

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30/90 efetora imune e as duas antígeno locais formadas pela unidade de diacorpo do primeiro polipeptídeo, bem como os dois domínios variáveis do segundo polipeptídeo de ligação pode ter duas especificidade diferentes para a célula alvo; ou seja, a partir do N-terminal para o C-terminal em que o primeiro polipeptídeo do primeiro e o segundo, assim como o quinto e o sexto domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune, o terceiro domínio variável tem a primeira especificidade para o célula alvo, o quarto domínio variável tem a segunda especificidade para a célula alvo e em que o segundo polipeptídeo do primeiro domínio variável tem especificidade para a segunda especificidade da célula alvo e o segundo domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo.

[0041] De acordo com outras concretizações o primeiro polipeptídeo compreende, pelo menos, seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo compreende quatro (Figuras 6a, 6b) ou seis (Fig. 7) domínios variáveis. Em tais concretizações o primeiro polipeptídeo compreende o primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo e o segundo polipeptídeo compreende o segundo par de domínios variáveis do diacorpo na unidade, que são, de preferência, não-covalente, associada com uma outra, formando assim dois antígeno locais entre o primeiro e segundo polipeptídeo de ligação. Em concretizações em que a primeira cadeia de polipeptídeo consiste de seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo é composto por quatro domínios variáveis do par de domínios variáveis justapostos da unidade de diacorpo em que o segundo polipeptídeo é ligado a uma unidade de scFv

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31/90 proporcionando um adicional ao local de ligação ao antígeno, quer no terminal-N ou C-terminal do segundo polipeptídeo (figs. 6a, 6b). Tais concretizações são pentavalente e podem compreender locais de ligação ao antígeno de um a cinco diferentes especificidades de antígeno, em particular dois ou três especificidade de antígenos diferentes. Unidade de diacorpos tendo um par dos dois domínios variáveis na orientação V _H -V _H em que o primeiro polipeptídeo e o outro par dos dois domínios variáveis na orientação V _L -V _L no segundo polipeptídeo favorecem a dobragem correta, em nomeadamente, de, por exemplo, moléculas de anticorpos triespecíficos multiespecíficos.

[0042] Em mais concretizações em que a primeira cadeia de polipeptídeo consiste de seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo é composto por quatro domínios variáveis do par de domínios variáveis justapostas da unidade de diacorpo em que o segundo polipeptídeo é ligada no terminal-N e C-terminal para as unidades de scFv proporcionando dois mais locais de ligação ao antígeno (Fig. 7) . Tais concretizações são hexavalente e podem compreender locais de ligação ao antígeno de um a seis diferentes especificidades de antígeno, em particular dois ou três especificidades de antígenos diferentes. Em concretizações particulares da unidade de diacorpo tem um par de domínios variáveis na orientação V_H-V_H em que o primeiro polipeptídeo e o outro par de domínios variáveis na orientação V_L-V_L no segundo polipeptídeo. Em outra alternativa, concretizações a multivalente, por exemplo, molécula de anticorpo Fv triespecífica pode compreender mais do que uma unidade de

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32/90 diacorpo dimérica. Em tais concretizações alternativas o primeiro polipeptídeo pode compreender, pelo menos, seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo pode compreender quatro (Fig. 3) ou seis (Figs. 8a, 8b) domínios variáveis. Em concretizações em que o primeiro polipeptídeo compreende, pelo menos, seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo compreende quatro domínios variáveis, a quatro justapostos domínios variáveis do segundo polipeptídeo estão associados com os quatro correspondentes justapostas domínios variáveis integrados no primeiro polipeptídeo, formando assim um conjunto de dois unidade de diacorpos justapostas. Os restantes, pelo menos, dois outros domínios variáveis do primeiro polipeptídeo está localizada distalmente em relação as unidades de diacorpo em tandem e formar uma unidade de scFv (Fig. 8a. 9b) . Em outras concretizações em que o primeiro polipeptídeo compreende seis domínios variáveis e o segundo polipeptídeo compreende seis domínios variáveis, as seis domínios variáveis do primeiro polipeptídeo está associada com os correspondentes seis domínios variáveis do segundo polipeptídeo formando assim uma tripla de unidade de diacorpos justapostas (Fig. 3). A última forma de realização constituído por um primeiro e segundo polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende seis domínios variáveis tem a vantagem de que ele pode fornecer um anticorpo triespecífico com o formato de um homodímero, ou seja, dois polipeptídeos idênticos estão associados um com o outro e proporcionar ligação bivalente para cada dos três especificidade de antígeno.

[0043] Em certas concretizações um anticorpo

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33/90 triespecifico Fv tetravalente, é fornecido por um diacorpo em tandem. Tal molécula anticorpo Fv triespecifica consiste de um primeiro e um segundo polipeptideo, em que cada polipeptideo compreende quatro domínios variáveis ligados um após o outro. Em tal molécula de anticorpo Fv do comprimento do ligante é tal que se opõe emparelhamento intramolecular dos domínios variáveis de modo a que a molécula não pode dobrar-se sobre si mesma, mas é forçado a emparelhar, isto é, associado, com os domínios complementares de outro polipeptideo. Os domínios estão dispostos de tal modo que o correspondente V _H e V _L domínios associado com a outra durante esta dimerização. Apesar da ausência de ligações covalentes intermoleculares o dímero é altamente estável, uma vez formada, permanece intacto e não reverter para a forma monomérica. Em algumas concretizações, a molécula triespecifico de anticorpo Fv compreende uma unidade de diacorpo dimica, em que um par de dois domínios variáveis justapostas tem a orientação V_H-V_H e o outro par de dois domínios variáveis justapostos tem a orientação V_L-V_L. Tal orientação dos domínios variáveis na unidade de diacorpo facilita a associação correta dos dois polipeptídeos triespecificos. Em particular, tal orientação permite triespecificos moléculas de anticorpo Fv no formato de um diacorpo em tandem, uma vez que é um heterodímero de dois polipeptídeos diferentes. Assim, tal orientação permite favoravelmente a heterodimerização correta do diacorpo em tandem triespecifica. Assim, em algumas concretizações, a molécula triespecifica de anticorpo Fv é um diacorpo em tandem (Fig. 3) . Em tais diacorpos em tandem triespecificos

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34/90 os domínios variáveis do primeiro e segundo polipeptideo pode ser providenciado a partir do N-terminal para o Cterminal dos polipeptídeos, por exemplo, nas seguintes orientaes: V _L -V _H -V _H -V _L (primeiro polipeptideo) e V _H-V _L -V _L -V h (segundo polipeptideo) ou vice-versa (fig. 3). Tais anticorpos triespecíficos no formato de um diacorpo em tandem pode fornecer uma primeira e uma segunda especificidade para uma célula alvo, por exemplo de células de tumor, e uma terceira especificidade para uma célula efetora imune, por exemplo, de tipo T ou de células NK. Em outros casos, tal anticorpo triespecífico pode ter duas especificidades para diferentes antígenos nas células efetoras e uma terceira especificidade para um antígeno de uma célula tumoral. Em algumas concretizações os domínios variáveis localizados externamente nos polipeptídeos pode ter a primeira e segunda especificidade para a célula alvo e os dois domínios variáveis centralmente localizados no polipeptideo entre os domínios variáveis localizados externamente tem a terceira especificidade para uma célula efetora imune; ou seja, a partir do N-terminal para o Cterminal, em que o primeiro polipeptideo do primeiro domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo; o segundo e o terceiro domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune, o quarto domínio variável tem a segunda especificidade para a célula alvo, e em que o segundo polipeptideo do primeiro domínio variável tem a segunda especificidade para a célula alvo, o segundo e os terceiros domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune e o quarto domínio

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35/90 variável tem a primeira especificidade para a célula alvo (Fig. 3). Em outras concretizações os domínios variáveis localizados externamente nos polipeptídeos pode ter a terceira especificidade para uma célula efetora imune e os dois domínios variáveis centralmente localizados no polipeptideo entre os domínios variáveis localizados externamente pode ter a primeira e segunda especificidade para a célula alvo; ou seja, a partir do N-terminal para o C-terminal em que o primeiro polipeptideo do primeiro domínio variável tem a terceira especificidade de epítopo para a célula efetora imune; o segundo domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo, o terceiro domínio variável tem a segunda especificidade para a célula alvo, o quarto domínio variável tem o terceiro especificidade para a célula efetora imune, e em que o segundo polipeptideo do primeiro domínio variável possui a terceira especificidade para a célula efetora imune, o segundo domínio variável tem a segunda especificidade para a célula alvo, o terceiro domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo e o quarto domínio variável tem o terceiro especificidade para a célula efetora imune. Em outras concretizações os domínios variáveis possuindo a terceira especificidade para a célula efetora imune está situado lateralmente na molécula de anticorpo; ou seja, a partir do N-terminal para o C-terminal em que o primeiro polipeptideo do primeiro e segundo domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune; o terceiro domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo, o quarto domínio variável tem a segunda especificidade

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36/90 para a célula alvo, e em que o segundo polipeptídeo do primeiro domínio variável tem a segunda especificidade para a célula alvo, o segundo domínio variável tem a primeira especificidade para a célula alvo e os terceiro e quarto domínios variáveis têm o terceiro especificidade para a célula efetora imune.

[0044] Em outras concretizações, o diacorpo em tandem é conjugado com pelo menos um domínio de ligação ao antígeno mais, em particular, pelo menos, um scFv-unidade Nterminal ou C-terminal do polipeptídeo. Em concretizações preferidas, o diacorpo é conjugado em tandem por um ligante peptídico para a, pelo menos, um scFv-unidade. Em particular, tal molécula de anticorpo é constituída por um primeiro e um segundo polipeptídeo, em que ambos os polipeptídeos consistem em seis domínios variáveis e cada um do primeiro polipeptídeo e o segundo polipeptídeo compreende um scFvunidade, quer no terminal N de cada polipeptídeo (Fig. 8b) ou C-terminal de cada polipeptídeo (Fig. 8a). Tais moléculas de anticorpo são hexavalente e podem compreender locais de ligação ao antígeno de um a seis diferentes especificidade de antígeno, em particular, dois ou três especificidade de antígenos diferentes. Em concretizações particulares unidade de diacorpo, localizado centralmente dentro da molécula de anticorpo, tem um par de domínios variáveis na orientação V_H-V_H em que o primeiro polipeptídeo e o outro par de domínios variáveis na orientação V_L-V_L no segundo polipeptídeo. Em certas concretizações, a molécula de anticorpo multivalente, em particular, molécula de anticorpo Fv aqui descrita, é uma, pelo menos, triespecífico e pelo menos molécula de

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37/90 anticorpo tetravalente. Tal molécula de anticorpo compreende pelo menos dois locais de ligação ao antígeno possuindo especificidade para o mesmo epítopo antigênico. Deste modo, a avidez é aumentada, isto é, a força da interação entre o antígeno e a molécula epítopo de ligação ao antígeno. A avidez das moléculas de anticorpos triespecíficos pode ser ainda aumentada pelas pentavalentes e hexavalentes concretizações da invenção. Moléculas pentavalentes pode oferecer, pelo menos, dois sítios de ligação para duas das três especificidades de epítopo do anticorpo e hexavalentes concretizações triespecíficos pode oferecer dois locais de ligação ao antígeno para cada um dos três especificidade de epítopo. Alternativamente, a multi-especificidade, isto é, número de especificoitisespecíficoities, pode ser aumentada por tetravalentes, pentavalentes e hexavalentes concretizações. Por exemplo, as moléculas de anticorpo podem ser tetraespecífico. Vantagens da maior avidez são estabilidade aumentada de interação e retenção sobre o alvo. Por exemplo, se o alvo é uma célula imune efetora citotóxica, tal como uma célula T ou uma célula NK, a maior avidez pode resultar em um aumento do potencial citotóxico da molécula de anticorpo. Em outro exemplo, se o alvo é uma célula tumoral, a maior avidez aumenta o tempo de retenção no alvo e reduz os off-rates a partir do alvo. Em uma determinada forma de realização da invenção, a molécula triespecífica e anticorpo Fv tetravalente compreende primeiro e segundo locais de ligação ao antígeno específicos para dois epítopos de antígenos diferentes do mesmo tipo de células de tumor e ligação ao antígeno sítios terceira e quarta específicas

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38/90 para um epitopo de antígeno numa célula efetora imune, tal como uma célula T ou uma célula NK. Uma tal molécula de anticorpo conduz a um aumento da especificidade bem como a avidez para um tipo particular de célula de tumor e a um aumento da avidez para a ativação ou inibição de um receptor na célula efetora imune que resulta numa vantajosamente aumentada potencial citotóxico específico do de ligação ao antígeno molécula. A ligação a dois epítopos de antígenos tumorais distintas conduz a um aumento na especificidade de direcionamento e uma extensão da janela terapêutica, reduzindo as toxicidades fora do alvo. Assim, a presente invenção proporciona moléculas de anticorpos multiespecíficos, que favoravelmente aumento da avidez e / ou a atividade biológica devido a proporcionar pelo menos dois locais de ligação ao antígeno de, pelo menos, uma das especificidade de epítopo, por exemplo, dois sítios de ligação para um, dois ou três epítopo especificidade, ou seja alvos.

[0045] Importante, apesar da complexidade estrutural, tal multiespecífica, por exemplo, triespecífico e multivalente, por exemplo, tetravalente, molécula de anticorpo de acordo com a invenção é estável.

[0046] Em outros casos, tais multiespecífica, por exemplo, triespecíficos, o anticorpo pode ter duas especificidade para diferentes antígenos na célula efetora, por exemplo, de células NK ou de células T, e uma terceira especificidade para um antígeno de uma célula tumoral.

[0047] Por isso, a molécula de anticorpo de acordo com a invenção pode ser utilizada de maneiras diferentes

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39/90 para redirecionar o potencial citotóxico de células efetoras imunológicas para destruir células tumorais ou agentes infecciosos, tais como, por exemplo, células infectadas com virus. Em algumas concretizações, molécula multiespecífica, por exemplo, molécula de anticorpo triespecífica pode ligarse a dois epítopos diferentes no antígeno alvo. Por exemplo, os dois epítopos diferentes podem estar no mesmo antígeno para prevenir ou mutantes de escape para melhorar a eficácia ou os dois epítopos podem estar em dois antígenos diferentes do alvo. Em outras concretizações a molécula de anticorpo triespecífico pode ligar-se a dois epítopos diferentes no antígeno de células imunitárias efetoras. Por exemplo, um primeiro local de ligação ao antígeno tem a especificidade para um receptor de ativação, por exemplo, CD16, CD16A ou CD3, e um segundo local de ligação ao antígeno tem a especificidade para um receptor co-estimulador, por exemplo, CD137, OX-40 ou CD28. Em outro exemplo, um primeiro local de ligação ao antígeno tem a especificidade para CD16 ou CD16A e um segundo local de ligação ao antígeno para um outro receptor de ativação de células NK, por exemplo, NKG2D, DNAM, NCs) .

[0048] Em outra concretização, fragmentos triespecíficos, em particular, os fragmentos Fv, molécula de anticorpo tem um primeiro local que possui especificidade de ligação ao antígeno para um epítopo antogênico numa célula do tumor, uma segunda de ligação ao antígeno local possuindo especificidade para um epítopo de antígeno numa célula efetora imune e uma terceira antígeno de ligação ao local possuindo especificidade para um epítopo antigênico em uma

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40/90 proteína solúvel em água selecionado a partir do grupo de fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, por mitógenos, e albuminas. Exemplos de uma proteína solúvel tal são a IL-6,FABF, APRIL, o TGF-beta, IL-10, o VEGF-A, TGFalfa, EGF, HB-EGF, Heregulinas, angiopoetina-2 e albumina de soro humano (HSA).

[0049] Numa concretização alternativa, a molécula de anticorpo tem um local que possui especificidade de ligação ao antigeno para um epitopo ao antigeno de um antigeno presente em um tipo de célula e três 5 locais de ligação de antigeno possuindo especificidade de epitopos de antigeno em um ou mais outros tipos de células.

[0050] Células efetoras são células do sistema imunitário que podem estimular ou provocar a citotoxicidade, a fagocitose, a apresentação de antigeno ou de libertação de citoquinas. Tais células efetoras são, por exemplo, mas não se limitando a, células T, células assassinas naturais (NK) -cells, gama delta (gd) células-T, células assassinas naturais T (NKT) -cells, granulócitos, monócitos, macrófagos, células dendríticas , células linfóides inatas (ILC) e antigénico) cuias apresentadoras. Exemplos de especificidade adequadas para células efetoras incluem, mas não estão limitados a subunidades CD2, CD3 e CD3 como CD3e, CD5, CD28 e outros componentes do receptor de células T (TCR) ou CD134 (0X40) para células T; CD16A, CD25, CD38, CD44, CD56, CD69, CD94, CD335 (NKp46), CD336 (NKp44), CD337 (NKp30), NKp80, N KG2A, NKG2C e N KG2D, DNAM, NCRs para cuias NK; CD18, CD64 e CD89 para granulócitos; CD18, CD32, CD47, CD64, CD89 e receptor de manose de macrófagos monócitos e

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15; CD64 e receptor de manose de células dendriticas; bem como CD35. Em certas concretizações da invenção estas especificidade, moléculas de superfie celular ou seja, de células efetoras são adequados para mediar a morte celular ap ligação de um multiespecífica, por exemplo, triespecífico, molécula de anticorpo de tal molécula da superfície celular e, desse modo, induzir citise ou apoptose.

[0051] O antígeno CD3 é um componente do complexo receptor de células T em células-T. No caso em que 20 especificidade para uma célula efetora é CD3, a ligação da molécula de ligação ao antígeno de acordo com a invenção para CD3 desencadeia a atividade citotóxica das células-T. Através da ligação da molécula de anticorpo para CD3 e a uma célula-alvo, por exemplo de células de tumor, a lise celular da célula alvo pode ser induzida.

[0052] O antígeno CD16A (FcyRI IIA) é um receptor expresso na superfície de células NK. Células NK possuem uma actividade cytoloytic inerente e por ligação da molécula de anticorpo de acordo com a 25 invenção para CD16 ou CD16A a actividade citotóxica das células NK para o alvo pode ser disparado.

[0053] Alvo é o local em que o epítopo de antígeno está localizado e para que a molécula de anticorpo deve ligar-se a. Exemplos de alvos são agentes solúveis em água, os antígenos sobre células, agentes infecciosos, tais como antígenos virais ou bacterianas, por exemplo derivado a partir de vírus da dengue, herpes simplex, vírus da gripe, VIH, VHC, CMV ou antígenos em células que facilitam a entrada de vírus e bactérias ou células, por 30 exemplo, neurônios,

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42/90 antigenos que exibem, ou células portadoras de alvos autoimunes, tais como IL-2 / IL2R, um marcador auto-imune ou auto-imune as células do antígeno ou do tumor. Em concretizações, em que pelo menos um dos locais de ligação ao antígeno tem a especificidade para uma célula efetora, o alvo pode ser uma célula de tumor para o qual a célula efetora deve ser redireccionado para induzir ou provocar a respectiva biológica, por exemplo imune, resposta.

[0054] A especificidade adequada para células de tumor podem ser antigenos tumorais e antigenos de superfície celular na respectiva célula de tumor, por exemplo, marcadores tumorais específicas. O termo antígeno tumoral tal como aqui utilizado compreende o antígeno associado a tumor (TAA) e antígeno específico de tumores (TSA) . Um antígeno associado a tumor (TAA), tal como aqui utilizado refere-se a uma proteína que está presente em células tumorais, e em células normais durante a vida fetal (antigenos onco-fetais), e após o nascimento, em órgãos seleccionados, mas a concentração muito mais baixa do que em células tumorais. Um TAA pode também estar presentes no estroma na vizinhança da célula do tumor, mas expresso em menores quantidades no estroma em outras partes do corpo. Em contraste, o termo antígeno eespecífico do tumor (TSA) refere-se a uma proteína expressa por células tumorais. O termo antígeno de superfície celular refere-se a uma molécula de qualquer antígeno ou um seu fragmento capaz de ser reconhecida por um anticorpo na superfície de uma célula.

[0055] Exemplos de especificidade para células tumorais incluem, mas não estão limitados a CD19, CD20, CD26,

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CD29, CD30, CD33, CD52, CD200, CD267, EGFR, EGFR2, EGFR3, EGFRvlll, HER2, HER3, IGFR, IGF-1R, EP- CAM, FLAP, ThomsenFriedenreich (TF) antígeno, TNFRSF17, gpA33, MUC-1 (mucina), IGFR, CD5, IL4-R alfa, a IL13-R, FceRI, MHC de classe 1 / complexos de peptideos e IgE.

[0056] As moléculas de anticorpo de acordo com a invenção, em que a especificidade do tumor é no sentido do antígeno CD19 pode ser utilizado para imunoterapia de malignidades de células-B, porque o antígeno CD19 é expresso em virtualmente todas as malignidades B-linhagem de leucemia linfoblástica (ALL), a não-Hodgkin ' linfoma s (NHL).

[0057] As moléculas de anticorpo de acordo com a invenção em que a especificidade para o tumor é no sentido de CD30 podem ser particularmente úteis no tratamento de doenças e de células T de linfomas de Hodgkin.

[0058] As moléculas de anticorpo, de acordo com a invenção em que a especificidade para o tumor é no sentido de receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) ou mutante EGFRvlll pode ser usado no tratamento de tumores de glioma, mama, ovário, próstata, pulmão, cabeça e pescoço; doenças hepáticas, tais como, por exemplo, câncer hepatocelular, cirrose hepática ou hepatite crônica, [0059] Para aumentar a meia-vida serica da molécula de anticorpo de acordo com a invenção no corpo, a molécula de anticorpo, se desejado, pode ser fundido com albumina, por exemplo albumina do soro humano (HSA), ou peguilado, sialilada, pasylated ou glicosilada (ver,por exemplo, Stork et ai, 2008, J. Biol Chem, 2 83:7804-7812) . Em algumas concretizações, a molécula de anticorpo é pelo menos

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44/90 triespecifica e compreende pelo menos um, por exemplo, um ou dois, locais de ligação ao antígeno possuindo especificidade para albumina, por exemplo de HSA. Tal molécula de anticorpo pelo menos triespecifica pode ser, por exemplo, uma molécula tetravalente, pentavalente ou anticorpo hexavalente.

[0060] Os domínios variáveis que possuem especificidade para os epítopos sobre as células alvo ou células efetoras pode ser obtido por selecção dos fragmentos variáveis (Fvs) que são específicos para os antígenos de interesse. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por rastreio de cadeia simples Fv (scFv) de apresentação em fagos de bibliotecas ou através de tecnologia de hibridoma. Por exemplo, bibliotecas de apresentação de fagos de scFv humanos IgM sequências baseadas-podem ser submetidos a vários ciclos de seleção in vitro para o enriquecimento em aglutinantes específicos para o antígeno desejado. As afinidades dos scFvs selecionados pode ser ainda mais aumentada pela maturação de afinidade.

[0061] Em algumas concretizações da invenção, pelo menos um, de preferência todas, os domínios variáveis de anticorpo são totalmente humanos, humanizados ou domínios quiméricos. Os anticorpos humanizados podem ser produzidos por métodos bem estabelecidos, tais como, por exemplo, CD grafting (ver, por exemplo, Antibody Engineering: métodos e protocolos / editado por Benny KC Lo; Benny Série KC II: Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ) . Assim, um técnico versado no assunto está facilmente capaz de fazer uma versão humanizada ou totalmente humana de molécula de ligação ao antígeno e domínios variáveis não-humano, por exemplo, de

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45/90 murino ou não primata, fontes com as técnicas de biologia molecular convencionais conhecidas no estado da técnica para reduzir a imunogenicidade e melhorar a eficiência da molécula de ligação ao antigeno num sistema imune humano numa concretização preferida da invenção, todos os domínios variáveis de anticorpo são humanizado ou inteiramente humano;. mais preferido, a molécula de anticorpo de acordo com a invenção é humanizado ou inteiramente humano. O termo completamente humanos, tal como aqui utilizado, significa que as sequências de aminoácidos dos domínios variáveis e os peptídeos que ligam os domínios variáveis no polipeptídeo originam ou pode ser encontrada em seres humanos. Em certas concretizações da invenção, os domínios variáveis pode ser humano ou humanizado, mas não os peptídeos que ligam os domínios variáveis de anticorpos.

[0062] Um técnico versado no assunto será prontamente capaz, sem encargo indevido para construir e obter a molécula de anticorpo aqui descritas, utilizando técnicas estabelecidas e os métodos padrão conhecidos na técnica, ver por exemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) NY ; A proteína Protocols Handbook, editado por John M. Walker, Humana Press Inc. (2002); ou Antibody Engineering: métodos e protocolos / editado por Benny KC Lo; Benny KC II Série: Methods in Molecular Biology (Totowa, NJ); Engenharia anticorpo / editado por Roland E. Kontermann e Stefan Dubel, Springer Verlag Berlin Heidelberg (2010)).

[0063] A molécula de anticorpo, de acordo com qualquer uma das concretizações descritas aqui podem ser

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46/90 produzidas expressando os polinucleotideos que codificam as cadeias polipeptidicas individuais que formam a molécula de anticorpo. Por conseguinte, outras concretizações da invenção são polinucleotideos, por exemplo, DNA ou RNA, que codificam os polipeptídeos da molécula de anticorpo, como aqui descrito acima.

[0064] Os polinucleotideos podem ser construídos por métodos conhecidos do técnico versado no assunto, por exemplo, combinando os genes que codificam o anticorpo domínios variáveis, quer separadas por ligantes peptídicos ou diretamente ligados por uma ligação peptídica dos polipeptídeos, em uma construção genética operacionalmente ligada a um promotor adequado, e, opcionalmente, um terminador de transcrição adequado e expressando-a em bactérias ou outro sistema de expressão apropriado tal como, por exemplo, células CHO. Dependendo do sistema de vector e hospedeiro utilizado, qualquer número de elementos de transcrição e tradução adequados, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, pode ser utilizado. O promotor é selecionado de tal modo que dirige a expressão dos polinucleotideos na respectiva célula hospedeira.

[0065] Os polinucleotideos podem ser inseridos em vectores, preferencialmente vetores de expressão, que representam uma concretização adicional da invenção. Estes vetores recombinantes podem ser construídos, de acordo com métodos bem conhecidos do técnico versado no assunto.

[0066] Uma variedade de sistemas de vetor de expressão / hospedeiro podem ser utilizados para conter e expressar os polinucleotideos que codificam as cadeias de

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47/90 polipeptideos da presente invenção. Exemplos de vectores de expressão para a expressão em E. coll é pSKK (LeGall et al, J Immunol Methods (2004) 285 (1) :Lll-27) ou pcDNA5 (Invitrogen) para a expressão em células de mamíferos.

[0067] Assim, a molécula de anticorpo como aqui descritos podem ser produzidos através da introdução de um vector que codifica os polipeptideos como descritos acima para uma célula hospedeira e a cultura da referida célula hospedeira em condições em que os polipeptideos são expressos, pode ser isolado e, opcionalmente, ainda purificado.

[0068] Numa outra concretização, ds composições da invenção, por exemplo, composições farmacêuticas, compreendendo uma molécula de anticorpo como aqui descrita acima e pelo menos um outro componente são fornecidos.

[0069] De acordo com outras concretizações são as moléculas de anticorpo para utilização como um medicamento ou de diagnóstico. Em particular, as moléculas de anticorpo são para utilização em imunoterapia. Por exemplo, as moléculas de anticorpo são para utilização no tratamento de um tumor, doença viral ou neurodegenerativa. Portanto, a invenção compreende ainda um método de tratamento de um indivíduo por uma imunoterapia, em particular, o indivíduo sofre de uma doença selecionados a partir de um tumor, doenças virais ou neurodegenerativas, compreendendo o passo de administrar a molécula de anticorpo de acordo com a invenção.

[0070] A invenção proporciona ainda um método, em que a molécula de anticorpo, em particular, uma composição

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48/90 compreendendo uma molécula de anticorpo como aqui descrito acima e ainda pelo menos um componente é administrado em uma dose eficaz para um sujeito, por exemplo, do paciente, para o tratamento de câncer (por exemplo, linfoma de não-Hodgkin, leucemia linfocítica crônica). A molécula de ligação ao antígeno, de acordo com a invenção pode ser para utilização como um medicamento.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS:

[0071] A Figura 1 mostra um molécula Fv tetravalente, triespecífica consistindo de um único polipeptídeo possuindo oito domínios variáveis de ligação ao antígeno ligados um após o outro na orientação V_H-V_L-V_H-V_H-V_L-V_L-V_L-V_H a partir de o N-terminal 7 com a extremidade C-terminal 8 do polipeptídeo. Tal orientação do domínio é apenas um exemplo e são possíveis outras disposições, como descrito acima. Dois Fv de unidade de cadeia simples (scFv) 2 são distalmente ligado a uma unidade de diacorpo cadeia simples 1 por os ligantes peptídicos 5, em que umu domínio variável de cadeia variável leve (V_L) de uma unidade de scFv 2 está ligada no terminal C por um ligante peptídico 5 para o terminal N de um dpmínio variável de cadeia pesada (V_H) do primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo 1. a V_L do scFv unidade 2 é N-terminalmente ligado com o V_H da unidade de scFv por um ligante longo peptídeo 4. a V_H do primeiro par de domínios variáveis está ligada por um ligante de peptídeo curto 3 para outro V_H domínio do primeiro par de domínios variáveis. O primeiro par de domínios variáveis é Cterminalmente ligados por um ligante peptídeo longo 4 com o terminal N do segundo par de domínios variáveis do diacorpo,

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49/90 que são ambos os domínios V_L. Os dois domínios V_L do sequndo par de domínios variáveis são liqadas através de um curto liqante peptídico 3. O sequndo par de domínios variáveis do diacorpo é C-terminalmente liqado com o terminal N de V _L de domínio de uma outra unidade de scFv dois localizada na extremidade C-terminal do polipeptídeo. A unidade 2 de scFv no terminal C do polipeptídeo consiste na V _L domínio liqado por um liqante lonqo 4 com um V _H domínio. As duas unidades 2 scFvs têm locais de liqação de antíqeno com especificidade diferentes e a unidade de diacorpo um antíqeno tem dois sítios para a mesma especificidade de liqação.

[0072] A Fiqura 2 mostra uma molécula Fv tetravalente, triespecífica que consiste de um primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis liqados um após o outro na orientação Vh-V_l-V_h-V_h-V_l-Vh a partir do Nterminal 7 para o C-terminal 8 do primeiro polipeptídeo e um sequndo polipeptídeo possuindo dois domínios variáveis liqados um após o outro na orientação V_L-V_L a partir do Nterminal 7a para o 8a C-terminal do sequndo polipeptídeo. Tal orientação domínio é apenas um exemplo e são possíveis outras disposições, como descrito acima. A molécula de liqação ao antíqeno Fv compreende uma unidade de diacorpo dimérica uma formada por um primeiro par de dois domínios variáveis inteqrados no primeiro polipeptídeo associado a um sequndo par de dois domínios variáveis, em que o sequndo polipeptídeo. Cada um dos dois domínios variáveis do primeiro par de dois domínios variáveis inteqrados, em que o primeiro polipeptídeo é liqado a uma unidade de scFv 2. Em cada uma das unidades de scFv 2, os domínios variáveis são liqados

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50/90 por um ligante peptidico longo 4. A N-terminal scFv unidade 2 é ligada por um ligante peptidico 5 para o N-terminal do primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo terminal-C 1. o primeiro par de domínios variáveis consiste de duas V _H domínios ligados por um ligante de peptídeo curto 3. O primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo 1 é C-terminalmente ligados por um ligante peptídeo 5 para o N-terminal de uma unidade de scFv 2 localizado no terminal C do primeiro polipeptideo. As duas unidades 2 scFvs têm locais de ligação de antígeno com especificidade diferentes e a unidade de diacorpo um antígeno tem dois sítios para a mesma especificidade de ligação.

[0073] A Figura 3 mostra uma molécula Fv de ligação a antígeno triespecifica tetravalente no formato de um conjunto diacorpo triespecifico constituído por um primeiro e um segundo polipeptideo formando um heterodímero associado de forma não covalente. O diacorpo conjunto compreende uma unidade de diacorpo dimérica um formado por um par de V localizado centralmente _H -V _H domínios em que o primeiro polipeptideo com um par de localizadas centralmente os domínios V _L -V _L em que o segundo polipeptideo. Os domínios variáveis do primeiro e segundo polipeptideo estão ligados um após o outro por ligantes peptídicos curtos 3, 3a a partir do N-terminal 7 para o terminal C 8 na orientação V_L-V_H-V_H-V_L, em que o primeiro polipeptideo e a partir do N-terminal 7a para o 8a C-terminal na orientação V_H-V_L-V_L-V_H, em que o segundo polipeptideo. Os domínios variáveis de N-terminal e C-terminalmente localizados têm locais de ligação de antígeno com especificidade diferentes no N-terminal e o C

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51/90 terminal e a unidade central diacorpo um antígeno tem dois sítios para a mesma especificidade de ligação.

[0074] A Figura 4 mostra uma molécula de ligação ao antígeno Fv hexavalente que consiste num único polipeptídeo possuindo doze domínios variáveis ligados um depois do Nterminal 7 com a extremidade C-terminal 8 do polipeptídeo. A orientação domínio é apenas um exemplo e outras modalidades indicadas para cada par de justapostos domínios variáveis são possíveis. Duas unidades de cadeia diacorpo individuais Ia, 1b são distalmente ligado a uma única unidade de LC cadeia diacorpo por os ligantes peptídicos 5, em que um domínio variável de uma única unidade de cadeia diacorpo la está ligado no terminal C por um ligante peptídico 5 para o N-terminal de um domínio variável do primeiro par de domínios variáveis de LC unidade de diacorpo e um domínio variável da unidade 1b diacorpo de cadeia simples é N-terminalmente ligado por um ligante de 5 para o C-terminal do segundo par de regiões variáveis da única diacorpo cadeia unidade 1c. Os primeiro e segundo pares de domínios variáveis de cada uma das três unidades de cadeia diacorpo individuais la, 1b, 1c são ligados uns com os outros através de um ligante longo peptídeo 4. Em cada uma das unidades de cadeia simples diacorpo la, 1b, 1c, um dos domínios variáveis do primeiro par de domínios variáveis está ligado por um ligante de peptídeo curto 3 para o outro domínio variável do primeiro par de domínios variáveis e os dois domínios variáveis do segundo par de domínios variáveis são ligadas através de um curto ligante peptídico 3.

[0075] A Figura 5 mostra uma molécula Fv de ligação

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52/90 ao antígeno hexavalente que consiste em um primeiro polipeptídeo tendo 10 domínios variáveis de ligação ligados um após o outro a partir do N-terminal 7 com a extremidade C-terminal 8 do primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo possuindo dois domínios variáveis ligados um após o outro a partir do N-terminal 7a para o 8a C-terminal do segundo polipeptídeo. A orientação domínio particular na Figura é apenas um exemplo e as outras modalidades indicadas para cada um dos pares de domínios variáveis justapostos são possíveis. A molécula de ligação ao antígeno Fv compreende uma unidade de diacorpo dimérico 10 formada por um primeiro par de dois domínios variáveis do primeiro polipeptídeo associado a um segundo par de dois domínios variáveis, em que o segundo polipeptídeo. Cada um dos dois domínios variáveis do primeiro par de dois domínios variáveis do primeiro polipeptídeo é ligado a uma única unidade de cadeia diacorpo ia, 1b. Em cada uma das unidades de cadeia única diacorpo ia, 1b. Os dois pares de domínios variáveis justapostos estão ligados por um ligante peptídico longo 4. a unidade de cadeia simples diacorpo N-terminal de ia é Cterminalmente ligados por um ligante peptídeo 5 para o Nterminal do primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo 10. Este primeiro par de domínios variáveis consiste em duas V _H domínios ligados por um curto ligante peptídico 3. o primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo 10 está no terminal C ligado por um ligante peptídico 5 para dar o N-terminal de uma única unidade de cadeia diacorpo 1b localizada no terminal C do primeiro polipeptídeo.

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53/90 [0076] A Figura 6 mostra uma molécula Fv de ligação ao antígeno pentavalente que consiste de um primeiro polipeptideo possuindo seis domínios variáveis ligados um após o outro a partir do N-terminal 7 com a extremidade Cterminal 8 do primeiro polipeptideo e um segundo polipeptideo possuindo quatro domínios variáveis ligados um depois outro a partir do N-terminal 7a para o C-terminal 8a do segundo polipeptideo. A orientação de domínio é apenas um exemplo e outros arranjos para cada par justapostos de domais variáveis são possíveis como indicado na Figura. A molécula de ligação ao antígeno Fv compreende uma unidade de diacorpo dimérica 10 formada por um primeiro par de dois domínios variáveis do primeiro polipeptideo associado a um segundo par de dois domínios variáveis, em que o segundo polipeptideo. Cada um dos dois domínios variáveis do primeiro par de dois domínios variáveis do primeiro polipeptideo é ligada a uma unidade de scFv 2. Em cada uma das unidades de scFv 2, os domínios variáveis são ligadas por um ligante peptídico longo 4. O scFv do terminal N unidade 2 é ligada por um ligante peptídico 5 para o N-terminal do primeiro par de domínios variáveis da unidade de diacorpo terminal-C 10. Este primeiro par de domínios variáveis consiste em dois domínios variáveis ligadas por um ligante de ptido curto 3. O primeiro par de domínios variáveis da unidade 10 diacorpo é C-terminalmente ligados por um ligante peptídeo 5 para o N-terminal de uma unidade de scFv 2 localizado no terminal C do primeiro polipeptideo. A) o segundo polipeptideo compreendendo quatro domínios variáveis consiste no segundo par de domínios variáveis da unidade de diacorpo 10 ligado com uma unidade

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54/90 de scFv 2 C-terminal e B) o segundo polipeptídeo compreendendo quatro domínios variáveis consiste no segundo par de domínios variáveis de a unidade de diacorpo 10 ligado com uma unidade de scFv dois no terminal-N.

[0077] A Figura 7 mostra uma molécula Fv de ligação ao antígeno hexavalente que consiste de um primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis de Fv de ligação do antígeno ligados um após o outro a partir do Nterminal 7 com a extremidade C-terminal 8 do primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis ligados um depois outro a partir do Nterminal 7a para o 8a C-terminal do segundo polipeptídeo. A orientação domínio é apenas um exemplo e outros arranjos para cada par justapostos de domais variáveis são possíveis como indicado na Figura. A molécula de ligação ao antígeno Fv compreende uma unidade de diacorpo dimérico 10 formada por um primeiro par de dois domínios variáveis do primeiro polipeptídeo associado a um segundo par de dois domínios variáveis, em que o segundo polipeptídeo. Cada um dos domínios variáveis da unidade de diacorpo 10 está ligada a uma unidade 2 de scFv no primeiro e segundo polipeptídeo. Em cada uma das unidades de scFv 2 os domínios variáveis são ligadas por um peptídeo ligante longo 4. Cada uma das quatro unidades de scFv 2 está ligada por um ligante peptídico 5 para um domínio variável da unidade de diacorpo 10. Este primeiro par de domínios variáveis consiste de dois domínios variáveis ligados por um ligante curto ptido 3 e o segundo par de domínios variáveis da unidade de diacorpo consiste em dois domínios variáveis ligados por um ligante curto 3a.

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55/90 [0078] A Figura 8 mostra um hexavalente molécula Fv de ligação do antígeno que compreende uma unidade em tandem diacorpo que consiste em um primeiro e um segundo polipeptídeo formando um dímero não covalentemente associadas. 0 conjunto diacorpo compreende uma unidade de diacorpo dimérico 10a formado por um par de domínios variáveis localizado centralmente, em que o primeiro polipeptídeo com um par de domínios variáveis localizado centralmente no segundo polipeptídeo. Os domínios variáveis do primeiro e segundo polipeptídeo estão ligados um após o outro por ligantes peptídicos curtos 3, 3a a partir do Nterminal 7 para o terminal-C 8 em cada polipeptídeo. A orientação domínio é apenas um exemplo e outros arranjos para cada par justapostos de domais variáveis são possíveis como indicado na Figura. Cada um dos primeiro e segundo polipeptídeo compreende uma unidade de scFv 21inked por um ligante de 5 para a unidade em tandem diacorpo. A) Unidades scFv 2 ligadas no terminal C do primeiro e do segundo polipeptídeo. B) unidades de scFv 2 ligadas no terminal-N do primeiro e do segundo polipeptídeo.

[0079] A Figura 9 mostra a análise de SDS-PAGE de aTriFlex-produtos. polipeptídeos longos e curtos são bem expressos (setas), a) aTriFlex_140 e aTriFlex_142, b) e c aTriFlex_138) aTriFlex_139.

[0080] A Figura 10 mostra a purificação IMAC de aTriFlex-produtos: a) aTriFlex_140, b) e c aTriFlex_138) e aTriFlex_142 e d) aTriFlex_139.

[0081] A Figura 11 mostra a análise de SDS-PAGE de aTriFlex-produtos. Os polipeptídeos longos e curtos são bem

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56/90 expressos. A) aTriFlex_101, B) aTriFlex_l02, C) e D aTriFlex_l03) aTriFlex_l04.

[0082] A Figura 12 mostra a ligação de moléculas de anticorpos triespecíficos a única ou linhagens de células duas vezes positivas. CD19 single-positivo + / CD30 Raji e CD19- / CD30 + KA PAS-299 células, bem como de duplo positiva CD19 + / CD30 + MEC-1 foram coradas com diluições em série dos anticorpos de moléculas de anticorpo triespecífico e célula superfície ligados foram detectados por mAb anti His, seguido por IgG de cabra conjugado com FITC antiratinho. Significam intensidades de fluorescência determinadas por citometria de fluxo foram utilizados para calcular K _D valores por meio de regressão não-linear. K _Dvalores para moléculas de anticorpos triespecíficos foram determinados em duas experiências independentes.

[0083] A Figura 13 mostra a atividade citotóxica de moléculas de anticorpos triespecíficos sobre linhas de células de alvo simples ou duplo-positivos. 4 h ensaios de citotoxicidade calcea de libertação foram realizados em CD19 único positivo + / CD30 Raji e CD19 / CD30 + células KARPAS299, bem como CD19 duplamente positivas + / CD30 + MEC-1 cuias alvo com cuias NK enriquecidas como células efetoras em a presença de diluições em série das moléculas de anticorpos triespecíficos indicados. A calceína fluorescente libertado a partir de células alvo lisadas foi usada para calcular a lise de células alvo mediada por anticorpo e modelação de curvas de dose-resposta sigmoidais para a determinação da CE ₅₀ valores por meio de regressão nãolinear. CE so valores para construções aTriFlex foram

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57/90 determinadas em dois experimentos independentes e plotados.

[0084] Os exemplos a seguir ilustram ainda a invenção sem limitar o escopo da invenção. EXEMPLO 1

Clonagem de construções de expressão de DNA que codifica para moléculas Fv de ligação ao antígeno tri-especifica [0085] Para a expressão de construções tri específicas em células CHO, que codificam sequências de todas as moléculas foram clonadas como uma construção de gene único ou gene duplo em um sistema de expressão de mamífero conforme modificado, derivado a partir do vetor pcDNA5 / FRT. Um vetor de dois promotores foi usado para a clonagem e a expressão de duas construções de genes (construções tri-específicaheterodimérica) . Para a uma construção de um gene triespecífica, o vetor de expressão pcDNA5 / FRT normal foi utilizado. Em resumo, as sequências de genes codificando os domínios V_H e V_L separados por ligantes diferentes (ligantes longos e curtos) foram sintetizados pela Life Technologies GeneArt (Regensburg, Alemanha) e subclonados. As construções resultantes são digeridas por meio de enzimas de restrição diferentes (BamHI, HindIII, Xhol, EcoRV, do rato) ou o diferente V _H / V _L efetoras e alvo domínios de ligação são amplificados por meio de PCR com os iniciadores correspondentes. Em seguida, as diferentes que se sobrepõem os fragmentos de ADN e a espinha dorsal linearizada do vetor promotor 2 ou pcDNA5 / FRT vector são unidas entre si por meio de montagem de Gibson em uma reação isotérmica. Todas as construções de expressão foram concebidas para conter sequências de codificação para um peptídeo de sinal N

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58/90 terminal e um C-terminal de hexa-histidina (6xHis) -tag para a primeira cassete de gene ou um identificador FLAG no Cterminal para a segunda cassete de genes para facilitar a secreção de anticorpos e purificação, respectivamente. Sequências de todas as construções foram confirmadas por sequenciação de ADN em GATC (Konstanz, Alemanha), utilizando o par de iniciadores 5 ' -AGAGCTCGTTTAGTGAACCG-3 ' e 5 ' -TC ATGTCTG L ATCCG L CCTTG -3 ' para a cassete do gene 1 ou 5 ' -GCCTGGAGACGCCATCC- 3 ' e 5 ' -GCAGAATTCCACCACACTGG-3 ' para a cassete do gene 2.

Cultura de célula hospedeira [0086] Cpelulas Flp-ln CHO (Life Technologies), um derivado de células de ovário de CHO-K1 de hamster chinês (ATCC, CCL-61) (Kao e Puck, 1968), foram cultivadas em 12 FMistura Nutriente de Ham suplementado com L-Glutamina, 10% de FCS e 100 / mL de zeocina. As células aderentes foram desprendidas com 0,25% de Tripsina-EDTA e subcultivada de acordo com os protocolos de cultura de células padrão fornecidos pela Life Technologies.

[0087] Para adaptação ao crescimento em suspensão, as células foram destacadas dos frascos de cultura de tecido e colocados em HyClone meio isento de soro CDM4 CHO por incubação subsequente em frascos de agitação a 37 ° C, 5% de C0 2 θ 120 rpm. O meio padrão para a cultura de suspensão adaptado-Flp-ln As células hospedeiras CHO foi HyClone CDM4 CHO suplementado com L-glutamina, suplemento HT, penicilina / estreptomicina e 100? G / mL de zeocina. Células adaptadas a suspensão foram criopreservadas em meio com DMSO a 10% e deram negativo para Mycoplasma utilizando o kit de detecção

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MycoAlert Mycoplasma (Lonza).

Geração de bancos de células transfectadas estavelmente [0088] Linhas celulares recombinantes Flp-ln CHO que expressam de forma estável de um único gene segregado ou anticorpos específicos de tri dupla de genes foram geradas por transfecção de células hospedeiras adaptadas de suspensão. Para isso, as células foram colocadas em meio padrão sem zeocina um dia antes da co-transfecção com plasmídeos de expressão (2,5 g) que codificam a proteína de interesse (pcDNA5 / FRT) e a recombinase Flp (pOG44, Life Technologies) utilizando Polietilenimina (PEI). Em breve, o ADN vector e o reagente de transfeco foram misturados a um DNA: relação de PEI de 1: 3 (μξ / μξ) num total de 100 μΐ meio OptiMEM I e incubou-se durante 10 minutos antes da adição a 2-10⁶ Flp-ln CHO as células em suspensão em 1 mL de meio CHO-S-SFMII (Life Technologies). Seguindo 24 h de incubação, a selecção de células transfectadas de forma estável foi iniciada por adição de 500 ug / ml de higromicina B para subsequente diluição culturas a uma densidade de 0,ΙΙΟ ⁶ cuias vieis / mL em meio CHO-S-SFMII e sementeira em frascos de cultura T75. Flp recombinase medeia a inserção da construções de expressão no genoma da célula CHO Flp-ln no local DRF integrada através do local específico de recombinação de ADN (O' Gorman et ai 1991) . Durante a selecção densidades de células viáveis foram medidos duas vezes por semana, e as células foram centrifugadas e ressuspensas em meio de seleção fresco a uma densidade máxima de 0,1-10 ⁶ cuias vieis / mL. Grupos celulares que expressam de forma estável os produtos de proteína recombinantes foram

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60/90 recuperados após 2-3 semanas de seleção em que as células pontuais foram transferidas para meio de cultura padrão em frascos de agitação. A expressão de proteínas recombinantes secretadas foi confirmada por eletroforese em gel de proteínas de sobrenadantes de cultura de células que utilizam a tecnologia Critério Stain-Free (Bio-Rad). Misturas estáveis de células foram criopreservadas em meio contendo 50% ProFreeze (Lonza) e 7,5% de DMSO.

Produção de proteína recombinante em fed-batch CHO culturas em suspensão de células [0089] As proteínas recombinantes foram produzidas em 10 dias de culturas de batelada alimentada transfectadas estavelmente linhas de células CHO por secreção para o sobrenadante da cultura de células. Para isso, agrupamentos de células que expressam de forma estável anticorpos específicos de tri foram semeadas a densidades a partir de 6-10 ⁵ células / mL em meio de cultura padrão em frascos Erlenmeyer de policarbonato com tampas permeáveis a gás (Corning) e incubou-se a 37 ° C e 5% de C0₂ com agitação a 140 rpm. Durante a cultura alimentada em lotes, os meios foram suplementados com 40 ml / L ActiCHO Carga A (GE Healthcare) e 4 mL / L ActiCHO Alimentação B (GE Healthcare) no dia 0 (dia de partida), e com montantes duplos no dia 3, 5 , e 7. Os sobrenadantes de cultura celular foram coletadas após 10 dias em cultura de viabilidades tipicamente 75%. As amostras foram colhidas a partir das culturas de produção a cada dois dias antes da alimentação e a densidade celular e a viabilidade foi avaliada. No dia da colheita, os sobrenadantes de cultura de células foram clarificados por

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61/90 centrifugação e filtração sob vácuo (0,22 μιτι) utilizando Millipore expresso PLUS Filtros de membrana (Millipore) antes de posterior utilização.

Purificação de anticorpos Fv-tri-especificos [0090] Os anticorpos tri-específicos foram purificados a partir de sobrenadantes de cultura de células CHO clarificado num procedimento de dois passos compreendendo IMAC e SEC preparativa. Se necessário, um terceiro passo de cromatografia (cromatografia de afinidade FLAG-) foi aplicada para polimento adicional. Para IMAC o sobrenadante clarificado foi carregado sobre uma coluna HisTrap Sepharose. Após lavagem com Tris / NaCl, pH 7,5 a proteína foi eluída com um gradiente de três etapas com 15 mM, 125 mM e imidazole 500 mM, respectivamente. A pureza das f races foi analisada por meio de SE-HPLC e SDS-PAGE. As fracções que exibem pureza aceitáveis foram reunidas e sujeitas a filtração em gel preparativa utilizando uma coluna de grau prep Superdex 200. A cromatografia de afinidade FLAG estava em alguns casos, para além de polimento. Portanto, a proteína foi carregada na coluna de afinidade FLAG, lavadas com PBS e eluiu-se usando tampão de glicina / HCI a pH 3,5. As fracções de eluato contendo anticorpos específicos para o tri purificadas foram reunidas, dializadas contra acetato de sódio 10 mM, pH 5,0, e concentrou-se por ultrafiltração até uma concentração típica de aprox. 1 mg / mL. A pureza e a homogeneidade (aprox. 90%) das amostras finais foram avaliadas por SDS-PAGE sob condições redutoras e/ou condições não redutoras, seguido por imunotransferência com His-tag bem como anticorpos específicos FLAG- Tag, assim

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62/90 como por análise SE-HPLC. As proteínas purificadas foram armazenados como alíquotas a - 80 ° C até à sua utilização.

[0091] Exemplos de dados biofísicos para moléculas de anticorpo Fv triespecíficos descritos no Exemplo 3; aTriFlex_101 (Exemplo 3a) ) , aTriFlex_102 (Exemplo 3b) ) , aTriFlex_103 (Exemplo 3c) ) e aTriFlex_104 (Exemplo 3d) é mostrada na Tabela 1. A SDS-PAGESs das fracções é mostrada na Figura 11: Todos os triespecífica, tetravalente Fv moléculas de anticorpo foram expressos com tulos aceitáveis, independentemente da ordem de domínio, por exemplo, VH-V _L-V η -V η -V l -VH (aTriFlex_101) ou V _L -VH-V _H -VH-V _H -V _L(aTriFlex_l02). Térmica, bem como estabilidade de armazenamento do triespecífica, moléculas de anticorpo Fv tetravalentes é muito boa e comparável.

Nome	Approx. Expressão de Título [mg/L]	Purificação (IMAC/ FLAG/SEC)	Pureza (SE- HPLC)	T_M(DSF) [°C]	Pureza T=7d; 5°C (SE- HPLC)	Pureza T=7d; 25°C (SE- HPLC)	Pureza 3 x FT (SE- HPLC)
aTr	iFlex 101	135	IMAC / SEC	92.2	46.7	91.2	94.9	69.7
aTr	iFlex 102	103	IMAC / SEC /FLAG	94.7	52.7	94.8	95.5	92.5
aTr	iFlex 103	130	IMAC / SEC	94.8	47.5	94.7	95.5	86.4
aTr	iFlex 104	125	IMAC / SEC	87.8	48.7	92.3	93.8	77.8

Tabela 1: dados biofísicos de moléculas de anticorpo Fv triespecíficos

EXEMPLO 2

Fabricação da molécula do anticorpo triespecífico com diferentes ordens de domínio da unidade de diacorpo [0092] Quatro moléculas diferentes de anticorpo Fv em formato de acordo com a Figura 2 foram construídos como

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63/90 descrito no Exemplo 1 que têm diferentes arranjos de domínio dos dois pares de domínios variáveis na unidade de diacorpo (N -> C-terminal). Os domínios variáveis da unidade de diacorpos são mostrados em negrito nas tabelas abaixo:

[0093] ATriFlex_138 : unidade de diacorpo V_H-V_L/V_H-V_L:

Polipeptídeo	SEQ ID NO	Especificidade de domínios (N -> C)	Ordem de domínio (N -> C)
1	32	CD30 - CD30 - CD16 - EGFRvIII - CD30 - CD30 - His	VH-VL-VH- VL-VH-VL
2	33	EGFRvIII - CD16A FLAG	VH-VL

[0094] aTriFlex_139: unidade de diacorpo V_L-V_H / V_L-V_H:

Polipeptídeo	SEQ ID NO	Especificidade de domínios (N -> C)	Ordem de domínio (N -> C)
1	30	CD30 - CD30 - CD16 EGFRvIII - CD30 CD30 - His	VH-VL-VL-VHVH-VL
2	31	EGFRvIII - CD16A FLAG	VL-VH

[0095] aTriFlex_140: unidade de diacorpo V_L-V_L / V_H-V_H:

Polipeptídeo	SEQ ID NO	Especificidade de domínios (N -> C)	Ordem de domínio (N -> C)
1	36	CD30 - CD30 - CD16 EGFRvIII - CD30 CD30 - His	VH-VL-VL-VLVH-VL
2	37	EGFRvIII - CD16A FLAG	VH-VH

[0096] aTriFlex_142: unidade de diacorpo V_H-V_H / V_L-V_L:

Polipeptídeo	SEQ ID NO	Especificidade de domínios (N -> C)	Ordem de domínio (N -> C)
1	34	CD30 - CD30 - CD16 EGFRvIII - CD30 CD30 - His	VH-VL-VH-VHVH-VL
2	35	EGFRvIII - CD16A FLAG	VL-VL

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64/90 [0097] As moléculas de anticorpo Fv têm sido expressas em células CHO e análise de SDS-PAGE de sobrenadantes de cultura de células de produção indicam que as longas polipeptídeos 1 e os polipeptídeos curtos 2 são bem expressos e executado como bandas separadas em condições desnaturantes (Figs. 9a, 9b, 9c).

[0098] Depois da purificação por IMAC um único passo, tal como descrito no Exemplo 1 com uma pureza de 7 6% foi atingida para aTriFlex_140 (Fig. 10a) e uma pureza de 78% foi atingida para aTriFlex_142 (Fig. 10c). Assim, moléculas de anticorpos multiespecíficos Fv com uma unidade de diacorpo V_L-V_L / V_H-V_H (aTriFlex_140) ou uma unidade de diacorpo V_H-V_H/ V_L-V_L (aTriFlex_142) mostram uma elevada proporção significativa de correctamente dobrado moléculas de anticorpo de Fv. No entanto, várias espécies moleculares que se sobrepõem foram obtidos e não há moléculas de anticorpos heterodiméricos eram separáveis aTriFlex_138 e aTriFlex_139 tendo alternando ordens de domínio V_H-V_L / V_H-V_L e V_L-V_H / V_LV_H; respectivamente, nas suas unidades de diacorpo (Figs. 10b, lOd). Assim, a orientação dos domínios variáveis V_L-V_L/ V_H-V_H na unidade de diacorpo força os dois polipeptídeos diferentes 1 e 2 para associar um com o outro e heterodimerizam para um tetravalente, molécula de anticorpo triespecífico. EXEMPLO 3 [0099] As seguintes moléculas de anticorpo multivalentes compreendendo anti-CD16A, anti-CD30 domínios variáveis de anticorpos anti-CD19 e foram produzidos:

[00100] Ligantes:

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65/90 [00101] Os seguintes ligantes peptídicos foram utilizados nos exemplos:

[00102] Ligante (4) na unidade scFv: (G₂S)₆para V_H-V_Le (G₂S) ₇ para V_L-V_H [00103] Ligante (3, 3a) na unidade diacorpo: (G₂S)₃ [00104] Ligante (5) conectado a unidade scFv com a unidade diacorpo: (G₂S)₃ [00105] A) Uma molécula de anticorpo Fv tetravalente, triespecífica (aTriFlex_101 como mostrado na Fig 2) tendo especificidade para CD30, CD19 e CD16A constituídos por um primeiro polipeptídeo tendo seis domínios variáveis e um Cterminal marcado com His.; e um segundo polipeptídeo possuindo dois domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade dimérica diacorpo localizado centralmente é formado pelo par de V _H -V _H domínios em que o primeiro polipeptídeo e o par de V _L -V _L domínios em que o segundo polipeptídeo que garante o correta heterodimerização de polipeptídeo um polipeptídeo e 2.

Polipeptídeo	Especificidade do domínio (N -> C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD30 - CD16A - CD16A - CD19 - CD19 - His	Vh-V_l-V_h-V_H-V_l_ V_h
2	CD16A - CD16A - FLAG	v_L-v_L

[00106] As sequências de aminoácidos:

[00107] Polipeptídeo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF

QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 72/97

66/90

LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVR QAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA RGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGY TFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSL RSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQ TARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS RVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQL VQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWMGMIWPGDSDTMYSPS FQGQVTISADE SINTAYLQWS S LKAS DTAMYYCARRE T T TVGRYYYAMDYWGQGTLVTV SSAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO :1) [00108] Polipeptídeo 2: SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSSYV LTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:2) [00109] b) Um anticorpo triespecifico Fv tetravalente, (aTriFlex_l02) possuindo especificidade para CD30, CD19 e CD16A, e que consiste de um primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis e um marcador de His C-terminal; e um segundo polipeptídeo possuindo dois domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade dimérica diacorpo localizado centralmente é formado pelo par de V _H -V _H domínios em que o primeiro polipeptídeo e o par de V _L -V _L domínios em que o segundo polipeptídeo.

Polipeptídeo	Especificidade do (N -> C)	domínio	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD19 - CD19 - CD16A CD30 - CD30 -	- CD16A His	V_l-Vh-V_h-Vh-Vh-V_l
2	CD16A - CD16A -	FLAG	v_L-v_L

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 73/97

67/90 [00110] As sequências de aminoácidos:

[00111] Polipeptídeo 1:

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLGGSGGSGGS GGSGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEW MGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTTVGR YYYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSY YMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDT AVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVS CKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVY MELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQVQLQQSGAE LARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTT LTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSGGSGG SGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKV LIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLE INAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:3)

Polipeptídeo 2:

SYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSSYV LTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFS GSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:4) [00112] c) Uma tetravalente, triespecífica de anticorpo Fv (aTriFlex_l03) possuindo especificidade para CD30, CD19 e CD16A consistindo de um primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal; e um sequndo polipeptídeo possuindo dois domínios variáveis e um marcador de His C-terminal. A unidade

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68/90 dimérica diacorpo localizado centralmente é formado pelo par de V _H -V _H domínios em que o primeiro polipeptídeo e o par de V _L -V _L domínios em que o segundo polipeptídeo.

Polipeptídeo	Especificidade do (N -> C)	domínio	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD19 - CD19 - CD16A CD30 - CD30 -	- CD16A FLAG	V_L-V_H-V_L-V_L_V_H-V_L
2	CD16A - CD16A	- His	V_H-V_H

[00113] As sequências de aminoácidos:

[00114] Polipeptídeo 1:

SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIP

ERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLGGSGGSG

GSGGSGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKG

LEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETT

TVGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNI

GSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADY

YCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIG

SKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYY

CQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTF

TTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLT

SEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVM TQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRF TGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEINAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:5)

Polipeptídeo 2:

QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGST

SYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLV

TVSSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGL EWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYY

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 75/97

69/90

YDFADYWGQGTLVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:6) [00115] d) Um anticorpo Fv tetravalente, triespecifico (aTriFlex_l04) possuindo especificidade para CD30, CD19 e CD16A e que consiste de um primeiro polipeptideo possuindo seis domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal; e um segundo polipeptideo possuindo dois domínios variáveis e um marcador de His C-terminal. A localização central diacorpo unidade dimérica é formado pelo par de domínios V_H-V_H em que o primeiro polipeptideo e o par de domínios V_L-V_L em que o segundo polipeptideo.

Polipeptideo	Especificidade do (N -> C)	domínio	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD30 - CD16A CD19 - CD19 -	- CD16A FLAG	V_H-V_L-V_L-V_L_V_L_V_H
2	CD16A - CD16A	- His	Vh-V_h

[00116] As sequências de aminoácidos:

[00117] Polipeptideo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF

QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP

LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQR

PGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLF

GGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQ

SPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGG

TKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPV

LWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGG

TKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSN

WIGWVRQMPGKGLEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDT

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AMYYCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO: 7)

Polypeptide 2: QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTS YAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTV SSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWM GIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFA DYWGQGTLVTVSSAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO :8) [00118] Apesar dos diferentes tamanhos de um polipeptideo (seis domínios variáveis) e polipeptideo de 2 (dois domínios variáveis), as moléculas de anticorpo a), b), c) e d) podem ser expressas de forma satisfatória. A estabilidade Térmica, bem como a estabilidade de armazenamento de moléculas de anticorpos purificados a) -d) é muito boa. Todas as construções a) - d) se ligam a células NK primárias, Raji, Karpas- 299 e linhagens de células CEM1 em citometria de fluxo.

[00119] e) Um anticorpo Fv tetravalente, triespecífica (TeTrisAb_l) como mostrado na figura 3 possuindo especificidade para CD30, CD19 e CD16A e que consiste de um primeiro polipeptídeo possuindo quatro domínios variáveis e um marcador de His C-terminal; e um segundo polipeptídeo possuindo quatro domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade dimérica diacorpo localizado centralmente é formado pelo par de domínios V_H-V_H em que o primeiro polipeptídeo e o par de domínios V_L-V_L , em que o segundo polipeptídeo que assegura a orientação correta de heterodimerização do primeiro e do segundo polipeptídeo.

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Polipeptideo	Especificidade do domínio (N -> C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD16A - CD16A CD19 - His	V_L-V_H-V_H-V_L
2	GDI 9 - CD16A - CD16A CD30 - FLAG	V_H-V_L-V_L-V_H

[00120] Sequências de aminoácidos [00121] Polipeptideo 1:

DIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVP DRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEINGGSGGSGGSQV QLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYA QKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSS GGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGI INPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADY WGQGTLVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKP

GQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQ

VFGGGTKLTVLAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:9)

Polipeptideo 2:

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWMGMIWPGDSDTM YSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGT LVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPV LVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKL TVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVI YQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVL GGSGGSGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGY INPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTW

FAYWGQGTTVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:10) [00122] f) Um anticorpo Fv tetravalente, triespecifico (scTriFlex_2) como mostrado na Fig. 1, tendo especificidade para CD30, CD19 e CD16A e que consiste de um

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 78/97

72/90 único polipeptídeo possuindo oito domínios variáveis e Cterminalmente uma His-tag. A unidade dimérica diacorpo localizado centralmente é formada por um primeiro par de V η -V _H domínios associados com um segundo par justapostos de V l ^_V L domínios no mesmo polipeptídeo. Ο V H ^_ V h par está ligado com ο V L -V _L par pelo ligante (L ₂ S) 6.

Especificidades de domínio (N -> C)	Ordem de domínio (N -> C)
CD30 - CD30 - CD16A - CD16A - CD16A - CD16A - CD19 - CD19 - His	v_H-v_L-v_H-v_H_v_L_ V_L-V_L-V_H

[00123] Sequência de aminoácidos:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVR QAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA RGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGY TFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSL RSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYVLTQP SSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNS GNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSV SVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNT

ATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVA

PGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATL

TISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSE

VQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWMGMIWPGDSDTMY

S PS FQGQVTISADE SINTAYLQWS S LKAS DTAMYYCARRE T T TVGRYYYAMDYWGQGTL VTVSSAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:11) [00124] g) Uma molécula de anticorpo Fv triespecífica

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 79/97

73/90 tetravalente, (como mostrado na Fig. 2) tendo especificidade para CD30, CD19 e CD16A consistindo de um primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis e uma etiqueta de His C-terminal; e um segundo polipeptídeo possuindo dois domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade dimérica diacorpo localizado centralmente é formado pelo par de V _L -V _L domínios em que o primeiro polipeptídeo e o par de V _H ^_V _H domínios em que o segundo polipeptídeo que garante o correcto heterodimerização de polipeptídeo um polipeptídeo e 2.

Polipeptídeo	Especificidade do domínio (N -> C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD30 - CD16A - CD16A - CD19 - CD19 His	VH-VL-VL-VL-VH- VL
2	CD16A - CD16A - FLAG	VH-VH

[00125] Polipeptídeo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF

QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP

LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQR

PGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLF

GGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQ

SPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGG

TKLTVLGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKG

LEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTT

VGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARI

TCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEA

GDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:12)

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74/90

Polypeptide 2 : QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTS YAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTV SSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWM GIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFA DYWGQGTLVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:13) [00126] h) Uma molécula de anticorpo Fv pentavalentes, tetraespecífica (como mostrado na Figura 6a) que tem especificidade para CD30, CD19, EG FRvl 11 e CD16A consistindo de um primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis e um C-terminal marcado com His; e um segundo polipeptídeo possuindo quatro domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade de diacorpo dimérica possuindo dois locais de antígeno para CD16A de ligação é formado pelo par de V _L -V _L domínios em que o primeiro polipeptídeo e o par de V _H -V _H domínios em que o segundo polipeptídeo que garante o correcto heterodimerização de polipeptídeo e um 2 polipeptídeo.

Polipeptídeo	Especificidade (N ->	do domínio C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD30 CD16A - CD19 -	- CD16A - CD19 - His	VH-VL-VL-VL-VH-VL
2	CD16A - CD16A - EGFRvIII	EGFRvIII - - FLAG	VH-VH-VL-VH

[00127] Polipeptídeo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF

QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP

LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQR

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 81/97

75/90

PGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLF GGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQ SPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGG TKLTVLGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKG LEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTT VGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARI TCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEA GDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:14)

Polipeptídeo 2: QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTS YAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTV SSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWM GIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFA DYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQ KPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGTP LIVFGTGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGS GYS FTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYS PS FQGQVTISADKSIS TAYLQWS SLKASDTAMYYCARLGSSWTNDAFDIWGQGTMVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:15) [00128] Uma molécula de anticorpo Fv hexavalente, triespecíficotetraespecífico (como mostrado na figura 5) que tem especificidade para CD30, CD19 e CD16A constituídos por um primeiro polipeptídeo tendo dez domínios variáveis e um C-terminal marcado com His.; e um segundo polipeptídeo possuindo dois domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade dimérica diacorpo localizado centralmente que tem dois locais de antígeno para CD16A de ligação é formado pelo par de domínios V_L-V_L em que o primeiro polipeptídeo e o par de domínios V_H-V_H em que o segundo

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 82/97

76/90 polipeptídeo que garante o correta heterodimerização de polipeptídeo 1 e polipeptídeo 2

Polipeptídeo	Especificidade do domínio (N -> C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD30 - CD30 - CD30 - CD16A - CD16A - GDI 9 - CD19 - CD19 - CD19 - His	VH-VL-VH-VL-VL-VL- VH-VL-VH-VL
2	CD16A - CD16A - FLAG	VH-VH

[00129] Polipeptídeo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPK

VLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKL

EINGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIH

WVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVY

YCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTV

TCKASQNVGTNVAWFQQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQS

EDLAEYFCQQYHTYPLTFGGGTKLEINGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCG

GHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDE

ADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHN

IGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADY

YCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSF

TSNWIGWVRQMPGKGLEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKA

SDTAMYYCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAP

GQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLT

ISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEV

QLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWMGMIWPGDSDTMYS

P S FQGQVTISADE SINTAYLQWS S LKAS DTAMYYCARRET T TVGRYYYAMDYWGQGT LV

TVSSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLV

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 83/97

77/90

VYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTK LTVLAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:16) Polipeptideo 2: QVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTS YAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTV SSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWM GIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFA DYWGQGTLVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:17) [00130] J) Uma molécula de anticorpo Fv hexavalentes, tetraespecífico (como mostrado na Figura 7) possuindo especificidade para CD30, CD19, CD16A EGFRvl 11 e que consiste de um primeiro polipeptideo possuindo seis domínios variáveis e um C-terminal marcado com His; e um segundo polipeptideo possuindo seis domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal.

Polipeptideo	Especificidade do (N -> C)	dominio	Ordem do dominio (N -> C)
1	CD30 - CD30 - CD16A	- CD16A -	VH-VL-VL-VL-VH-
	CD19 - CD19 -	His	VL
2	CD30 - CD30 - CD16A	- CD16A -	VH-VL-VH-VH-VL-
	EGFRvlII - EGFRvlI	I - FLAG	VH

[00131] Polipeptideo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF

QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP

LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQR

PGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLF

GGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQ

SPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGG

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 84/97

78/90

TKLTVLGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKG LEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTT VGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARI TCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEA GDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:18) Polipeptídeo 2: QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVR QAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA RGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGY TFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSL RSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSSYELTQPPSVSVSPGQ TARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTIS GVQAEDEADYYCQSADSSGTPLIVFGTGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQL VQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPS FQGQVTISADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARLGS SWTNDAFDIWGQGTMVTVSSA AAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:19) [00132] Uma molécula de anticorpo Fv triespecífica pentavalente, (como mostrado na Figura 6b) possuindo especificidade para CD30, CD19 e CD16A consistindo de um primeiro polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis e uma etiqueta de His C-terminal.; e um segundo polipeptídeo possuindo quatro domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade de diacorpo dimérica possuindo dois locais de antigeno para CD16A de ligação é formado pelo par de domínios V_L-V_L, em que o primeiro polipeptídeo e o par de

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 85/97

79/90 domínios V _H -V _H em que o segundo polipeptídeo que garante o correta heterodimerização de polipeptídeo e um 2 polipeptídeo

Polipeptídeo	Especificidade do domínio (N -> C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD30 - CD16A - CD16A CD19 - CD19 - His	VH-VL-VL-VL-VHVL
2	CD30 - CD30 - CD16A - CD16A - FLAG	VH-VL-VH-VH

[00133] Polipeptídeo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF

QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP

LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQR

PGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLF

GGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQ

SPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGG

TKLTVLGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKG

LEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTT

VGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYVLTQPPSVSVAPGQTARI

TCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEA

GDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:20)

Polipeptídeo 2:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWF

QQKPGQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYP

LTFGGGTKLEINGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVR

QAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCA

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 86/97

80/90

RGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGY TFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSL RSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO :21) [00134] I) Um anticorpo Fv triespecifico tetravalente, como mostrado na figura 3 possuindo especificidade para CD30, CD19 e CD16A e que consiste de um primeiro polipeptídeo possuindo quatro domínios variáveis e um marcador de His C-terminal; e um segundo polipeptídeo possuindo quatro domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. A unidade dimérica diacorpo localizada centralmente é formado pelo par de V _L -V _L domínios em que o primeiro polipeptídeo e o par de V _H -V _H domínios em que o segundo polipeptídeo que assegura a orientação correta heterodimerização do primeiro e do segundo polipeptídeo.

Polipeptídeo	Especificidade (N ->	do domínio C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD16A CD19 -	- CD16A His	VH-VL-VL-VH
2	CD19 - CD16A CD30 -	- CD16A FLAG	VL-VH-VH-VL

[00135] Polipeptídeo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

VTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVL

VIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLT

VLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIY

QDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLG

GSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWMGMI

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 87/97

81/90

WPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTTVGRYYYA MDYWGQGTLVTVSSAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO :22)

Polipeptideo 2: SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLGGSGGSQVQ LVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQ KFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSG GSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGII NPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYW GQGTLVTVSSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKP GQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFG GGTKLEINAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:23) [00136] m) Um anticorpo Fv hexavalente, tetraespecífico como mostrado na Fig 8a possuindo especificidade para CD30, CD19, EGFRvlll e CD16A e constituído por um primeiro polipeptideo tendo seis domínios variáveis e um marcador de His C-terminal.; e um segundo polipeptideo possuindo seis domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. Cada um dos primeiro e segundo polipeptideo compreende uma unidade C-terminal de scFv.

Polipeptideo	Especificidade do domínio (N -> C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	CD30 - CD16A - CD16A - CD19 EGFRvlll - EGFRvlll - His	VH-VL-VL-VH-VLVH
2	CD19 - CD16A - CD16A - CD30 EGFRvlll - EGFRvlll - FLAG	VL-VH-VH-VL-VLVH

[00137] Polipeptideo 1:

QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVRQRPGHDLEWIGYINPSSGYSD

YNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCARRADYGNYEYTWFAYWGQGTT

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 88/97

82/90

VTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVL VIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLT VLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIY QDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLG GSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSNWIGWVRQMPGKGLEWMGMI WPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRETTTVGRYYYA MDYWGQGTLVTVSSGGSGGSGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQ QKPGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGT PLIVFGTGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKG SGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQW SSLKASDTAMYYCARLGSSWTNDAFDIWGQGTMVTVSSAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:24)

Polipeptídeo 2: SYVLTQPPSVSVAPGQTARITCGGNNIGSKTVHWYQQKPGQAPVLWYDDSDRPSGIPE RFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVGTDWSDHLQVFGGGTKLTVLGGSGGSQVQ LVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQ KFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYWGQGTLVTVSSG GSGGSGGSQVQLVQSGAEVKKPGESLKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGII NPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSAYYYDFADYW GQGTLVTVSSGGSGGSGGSDIVMTQSPKFMSTSVGDRVTVTCKASQNVGTNVAWFQQKP GQSPKVLIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYHTYPLTFG GGTKLEINGGSGGSGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQA PVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGTPLIVFG TGTKLTVLGGSGGSGGSGGSGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTRYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKAS DTAMYYCARLGSSWTNDAFDIWGQGTMVTVSSAAAGSDYKDDDDK (SEQ ID NO:25) [00138] n) Um anticorpo Fv hexavalente, tetraespecifico como mostrado na Fig 8b possuindo

Petição 870180063931, de 24/07/2018, pág. 89/97

83/90 especificidade para CD30, CD19, EGFRvIII e CD16A constituído por um primeiro polipeptídeo tendo seis domínios variáveis e um marcador de His C-terminal; e um segundo polipeptídeo possuindo seis domínios variáveis e um identificador FLAG no C-terminal. Cada um dos primeiro e segundo polipeptídeo compreende uma unidade de scFv no terminal-N.

Polipeptídeo	Especificidade do domínio (N -> C)	Ordem do domínio (N -> C)
1	EGFRvIII CD16A -	- EGFRvIII - CD30 CD16A - CD19 - His	VH-VL-VH-VL-VL-VH
2	EGFRvIII CD16A -	- EGFRvIII - GDI9 CD16A - CD30 - FLAG	VH-VL-VL-VH-VH-VL

[00139] Polipeptídeo 1:

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YS PS FQGQVTISADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARLGS SWTNDAFDIWGQGTMVT VSSGGSGGSGGSGGSGGSGGSSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQK PGQAPVLVIYKDSERPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGTPL IVFGTGTKLTVLGGSGGSGGSQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTTYTIHWVR QRPGHDLEWIGYINPSSGYSDYNQNFKGKTTLTADKSSNTAYMQLNSLTSEDSAVYYCA RRADYGNYEYTWFAYWGQGTTVTVSSGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGG HNIGSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEA DYYCQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSSYVLTQPSSVSVAPGQTATISCGGHNI GSKNVHWYQQRPGQSPVLVIYQDNKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYY CQVWDNYSVLFGGGTKLTVLGGSGGSGGSEVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFT SNWIGWVRQMPGKGLEWMGMIWPGDSDTMYSPSFQGQVTISADESINTAYLQWSSLKAS DTAMYYCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTLVTVSSAAAGSHHHHHH (SEQ ID NO:2 6)

Polipeptídeo 2: EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWIGWVRQMPGKGLEWMGIIYPGDSDTR YS PS FQGQVTISADKSIS TAYLQWS S LKAS DTAMYYCARLGS SWTNDAFDIWGQGTMVT

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo Fv multivalente caracterizado pelo fato de que compreende uma unidade diacorpo que consiste em dois pares de domínios variáveis, em que um par é um par de domínios variáveis de cadeia leve (V_L - V_L) ligados um após o outro em um polipeptídeo e o outro par é um par de domínios variáveis de cadeias pesadas (V_H - V_H) ligados um após o outro em um polipeptídeo, em que o par V_L - V_L e o par V_H - V_H associado a dois locais de ligação a antígeno e, pelo menos, um par de domínios variáveis está ligada em um polipeptídeo compreendendo, pelo menos, quatro domínios variáveis a, pelo menos, a dois domínios variáveis adicionais, em que um dos referidos domínios variáveis adicionais está localizado N-terminalmente para o referido par de domínios variáveis e o outro domínio variável adicional está localizado C-terminalmente ao referido par de domínios variáveis no polipeptídeo.
2. Anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um par de domínios variáveis da unidade diabody está em um primeiro polipeptídeo, o outro par de domínios variáveis da unidade diabody está em um segundo polipeptídeo e o primeiro e o segundo polipeptídeos se associam um ao outro.
3. Anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o par V_L - V_L e o par V_H - V_H da unidade diacorpo associado a dois locais de ligação ao antígeno e o domínio variável Nterminalmente localizado associa-se com um domínio variável correspondente domínio variável a um terceiro local de

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2/6 ligação ao antígeno e o domínio variável localizado Cterminalmente associa-secom um domínio variável correspondente corresponde a um quarto local de ligação ao antígeno.
4. Anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo possuindo, pelo menos, seis domínios variáveis ligados um após o outro, em que um par de domínios variáveis da unidade diacorpo (1, 1c, 10, 10a) está integrado no referido polipeptídeo.
5. Anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os dois domínios variáveis no par de domínios variáveis V_L - V_L e o par de domínios variáveis V_H - V_H estão ligados por um ligante peptídico (3, 3a) que consiste em 12 ou menos resíduos de aminoácidos.
6. Anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreendendo pelo menos quatro domínios variáveis compreende ainda uma sequência de marcação.
7. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o referido par de dois domínios variáveis da unidade diacorpo está em um polipeptídeo possuindo, pelo menos, seis domínios variáveis está associado a outro par de dois domínios variáveis do referido polipeptídeo.
8. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o referido par de domínios variáveis da

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3/6 unidade diacorpo no polipeptideo compreendendo pelo menos quatro domínios variáveis é não-covalentemente associado com um outro par de domínios variáveis de um outro polipeptídeo.
9. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o referido outro polipeptídeo compreende, pelo menos, dois domínios variáveis.
10. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo tem pelo menos seis domínios variáveis compreende uma unidade scFv na sua extremidade N-terminal e uma unidade scFv na sua extremidade C-terminal.
11. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizada pelo fato de que o referido polipeptídeo que tem, pelo menos, seis domínios variáveis compreende uma única cadeia de unidade diacorpo na sua extremidade N-terminal e uma única cadeia de unidade diacorpo na sua extremidade Cterminal.
12. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 7, 10 ou 11, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo Fv consiste de um único polipeptídeo.
13. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que a referida molécula de anticorpo Fv consiste de um primeiro polipeptídeo compreendendo dez domínios variáveis e um

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4/6 segundo polipeptideo compreendendo dois domínios variáveis, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma única unidade de cadeia diacorpo na extremidade N-terminal e uma única unidade de cadeia diacorpo na extremidade C-terminal e o segundo polipeptídeo está associada com o primeiro polipeptídeo de uma unidade diacorpo.
14. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem seis domínios variáveis ligados um após o outro a partir do N-terminal para o C-terminal, um primeiro e um segundo domínio variável formam uma unidade scFv no N-terminal, a referida unidade scFv no Nterminal está ligada pelo C-terminal a um terceiro domínio variável, o referido terceiro domínio variável está ligado por um peptídeo ligante que consiste de 12 ou menos resíduos de aminoácidos para um quarto domínio variável, o referido quarto domínio variável está ligado pelo Cterminal a uma unidade scFv ao C-terminal e a referida unidade scFv é formada por um quinto e sexto domínio variável.
15. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo tem oito domínios variáveis ligados um após o outro a partir do terminal N para o terminal C, um primeiro e um segundo domínio variável formam uma unidade scFv no N-terminal, a dita unidade scFv no Nterminal está ligada pelo terminal C a um terceiro domínio variável, o referido terceiro domínio variável está ligado por um peptídeo ligante que consiste de 12 ou menos

Petição 870190102896, de 14/10/2019, pág. 11/13

5/6 resíduos de aminoácidos para um quarto domínio variável, o referido quarto domínio variável está ligado pelo terminal C a um quinto domínio variável, o referido quinto domínio variável está ligado pelo terminal-C a um sexto domínio variável por um ligante que consiste de 12 ou menos resíduos de aminoácidos, o referido sexto domínio variável está ligado pelo terminal-C a uma unidade scFv na extremidade C-terminal e a referida unidade scFv é formada por um sétimo e um oitavo domínio variável.
16. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o par de domínios variáveis de cadeia leve (V_L - V_L) é ligado em um primeiro polipeptídeo compreendendo pelo menos quatro domínios variáveis para outro domínio variável N-terminal e o outro domínio variável C-terminal e o par de cadeias pesadas variáveis (V_H - V_H) é ligado em um segundo polipeptídeo compreendendo, pelo menos, quatro domínios variáveis para outro domínio variável N-terminal e para outro domínio variável C-terminal.
17. Anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo polipeptídeos compreendem seis domínios variáveis e cada um dos polipeptídeos compreende uma unidade scFv no terminal-C ou no terminal-N.
18. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que cada um do primeiro e do segundo polipeptídeo consiste em quatro domínios variáveis e os domínios variáveis do primeiro polipeptídeo estão dispostos na orientação VL-VH-VH-VL e os

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6/6 domínios variáveis do segundo polipeptídeo estão dispostos na orientação VH-VL -VL-VH.
19. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a molécula de anticorpo Fv tem uma especificidade para um antígeno presente numa célula efetora imune.
20. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o anticorpo FV compreende dois locais de ligação ao antígeno possuindo especificidade para o mesmo tipo de célula efetora imune.
21. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo Fv compreende pelo menos uma especificidade para um antígeno tumoral.
22. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo Fv compreende especificidades para dois antígenos tumorais.
23. Molécula de anticorpo Fv multivalente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo Fv compreende pelo menos uma especificidade para um antígeno viral.
24. Uso do anticorpo Fv multivalente conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um um medicamento.