JP6936497B2 - 多価Fv抗体 - Google Patents
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Description
三重特異性Fv抗原結合分子をコード化するDNA発現構築物のクローニング
CHO細胞における三重特異性構築物の発現のために、全分子のコーディング配列をpcDNA5/FRTベクター由来の適宜修飾した哺乳動物発現系中に単一遺伝子または二重遺伝子構築物としてクローンした。二プロモーターベクターを二遺伝子構築物(ヘテロダイマー三重特異性構築物)の前記クローニングおよび前記発現のために使用した。前記三重特異性一遺伝子構築物のために、前記正常なpcDNA5/FRT発現ベクターを使用した。手短に言うと、異なるリンカー(長いリンカーおよび短いリンカー)によって隔てられたVHおよびVLドメインをコード化する遺伝子配列をLife Technologies GeneArt(Regensburg、Germany)によって合成し、サブクローニングした。前記結果として得られる構築物を異なる制限酵素(BamHI、HindIII、XhoI、EcoRV、PacI)によって消化するか、または異なるVH/VLエフェクターおよび標的結合ドメインを対応するプライマーを用いるPCRによって増幅する。その後、前記異なる重複DNA−フラグメントおよび前記直線化骨格2プロモーターベクターまたはpcDNA5/FRTベクターを一回の等温反応でGibson Assemblyによってあわせまとめる。すべての発現構築物は、それぞれ抗体分泌および精製を促進するために、N末端シグナルペプチドのコーディング配列および前記第一遺伝子カセットのC末端ヘキサヒスチジン(6×His)タグまたは前記第二遺伝子カセットのC末端FLAGタグを含むように設計された。全構築物の配列は、プライマー対遺伝子カセット1について5’−AGAGCTCGTTTAGTGAACCG−3’および5’−TCATGTCTGGATCCGGCCTTG−3’または遺伝子カセット2について5’−GCCTGGAGACGCCATCC−3’および5’−GCAGAATTCCACCACACTGG−3’を使用するGATC(Konstanz、Germany)でのDNA配列決定によって確認した。
Flp−lnCHO細胞(Life Technologies)、CHO−K1チャイニーズハムスター卵巣細胞の誘導体(ATCC、CCL−61)(Kao and Puck、1968)を、L−グルタミン、10%FCSおよび100μg/mLのZeocinを追加したハムのF−12 Nutrient Mix中で培養した。接着細胞を0.25%のトリプシン−EDTAで分離させ、Life Technologiesによって提供された標準的細胞培養プロトコルにしたがって継代培養した。
分泌された単一遺伝子または二重遺伝子三重特異性抗体を安定して発現する組換えFlp−lnCHO細胞株を、懸濁液適合宿主細胞のトランスフェクションによって生成した。このために、ポリエチレンイミン(PEI)を使用する関心対象の前記タンパク質(pcDNA5/FRT)および前記Flpリコンビナーゼ(pOG44、Life Technologies)をコード化する発現プラスミド(2.5μg)との同時導入の一日前にZeocinを含まない標準培地中に細胞を入れた。簡単に言うと、ベクターDNAおよびトランスフェクション試薬を1:3(μg/μg)のDNA:PEI比にて合計100μlのOptiMEM I培地中で混合し、10分間インキュベートした後、1mLのCHO−S−SFMII培地(Life Technologies)中に懸濁させた2・106Flp−lnCHO細胞に添加した。24時間インキュベーション後、培養物をCHO−S−SFMII培地中に0.1・106生存細胞/mLの密度で希釈し、T75培養フラスコ中に播種した後、500μg/mLのHygromycin Bを添加することによって、安定にトランスフェクトされた細胞に関する選択を開始した。Flpリコンビナーゼは、部位特異的DNA組換えによる前記組込みFRT部位での前記Flp−lnCHO細胞のゲノム中への前記発現構築物の挿入を媒介する(O’Gorman et al 1991)。選択の間、生存細胞密度を1週間に2回測定し、細胞を遠心分離し、新鮮な選択培地中に0.1・106生存細胞/mLの最大密度で再懸濁させた。組換えタンパク質産物を安定して発現する細胞プールを選択の2〜3週間後に回収し、この時点で細胞を振盪フラスコ中の標準的培養培地に移した。分泌された組換えタンパク質の発現を、Criterion Stain−Free(Bio−Rad)技術を使用する細胞培養上清のタンパク質ゲル電気泳動によって確認した。安定な細胞プールを、50%ProFreeze(Lonza)および7.5%DMSOを含む培地中で凍結保存した。
組換えタンパク質を、前記細胞培養上清中への分泌によって安定してトランスフェクトされたCHO細胞株の10日の流加培養で産生した。このために、三重特異性抗体を安定して発現する細胞プールを、気体透過性キャップを備えたポリカーボネート製三角フラスコ(Corning)中の標準的培養培地中6・105細胞/mLの出発密度で播種し、そして37℃および5%CO2にて140rpmで撹拌しながらインキュベートした。流加培養中、培地に40mL/LのActiCHO Feed A(GE Healthcare)および4mL/LのActiCHO Feed B(GE Healthcare)を第0日(開始日)に追加し、3、5、および7日に二倍量を追加した。細胞培養上清を典型的には>75%の培養生存率で10日後に回収した。サンプルを供給前に産生培養物から一日おきに集め、細胞密度および生存力を評価した。採取日に、細胞培養上清をさらに使用する前に、遠心分離およびMillipore Express PLUS Membrane Filter(Millipore)を使用する真空ろ過(0.22μm)によって清澄化した。
三重特異性抗体を清澄化したCHO細胞培養上清から、IMACおよび分取SECを含む2ステップ手順で精製した。必要ならば、第三のクロマトグラフィーステップ(FLAGアフィニティークロマトグラフィー)をさらなるポリッシングのために適用した。IMACのために、前記清澄化上清をHisTrap Sepharoseカラムにかけた。Tris/NaCI緩衝液pH7.5で洗浄した後、それぞれ15mM、125mM、および500mMイミダゾールを使用する3段階勾配でタンパク質を溶出させた。フラクションの前記純度を、SE−HPLCおよびSDS−PAGEを用いて分析した。許容される純度を示すフラクションをプールし、Superdex 200 prep gradeカラムを用いる分取ゲルろ過に供した。FLAGアフィニティークロマトグラフィーは、数例ではさらなるポリッシングのためであった。したがって、前記タンパク質を前記FLAGアフィニティーカラムにかけ、PBSで洗浄し、グリシン/HCl緩衝液をpH3.5で使用して溶出させた。精製した三重特異性抗体を含む溶出液フラクションをプールし、10mM酢酸ナトリウムpH5.0に対して透析し、限外ろ過によって約1mg/mLの典型的な濃度まで濃縮した。前記最終サンプルの純度および均一性(約90%)を、還元および/または非還元条件下でのSDS−PAGEと、それに続いてHisタグならびにFLAGタグ特異的抗体を用いたイムノブロッティング、ならびに分析的SE−HPLCによって評価した。精製タンパク質をさらに使用するまでアリコートとして−80℃にて保存した。
前記ダイアボディ単位の異なるドメイン順を有する三重特異性抗体分子の産生
図2による前記形式の四つの異なるFv抗体分子を実施例1で記載したように構築し、これらは前記ダイアボディ単位において前記二対の可変ドメインの異なるドメイン配置を有する(N→C末端)。前記ダイアボディ単位の前記可変ドメインを、下表では太字で示す。
抗CD16A、抗CD19および抗CD30抗体可変ドメインを含む以下の多価抗体分子を産生した。
以下のペプチドリンカーを前記実施例で使用した:
scFv単位中のリンカー(4):VH−VLについて(G2S)6、VL−VHについて(G2S)7
ダイアボディ単位中のリンカー(3、3a):(G2S)3
scFv単位をダイアボディ単位と結合させるリンカー(5):(G2S)3
三重特異性抗体分子が介在する細胞結合および細胞毒性活性の評価
試験手順:
細胞および細胞培養物
CD19+/CD30+MEC−1(DSMZ、cat.:ACC497)、CD19+/CD30−Raji(DSMZ、cat.:ACC319)、およびCD19−/CD30+KARPAS−299(DSMZ、cat.:ACC31)細胞を、細胞株の供給業者によって推奨されるように、本明細書中で完全RPMI培地と称する、10%熱不活性化ウシ胎仔血清(FCS)(cat.:10270−106)、100U/mLペニシリンG、100μg/mLのストレプトマイシン(cat:1540−122)、および2mMのL−グルタミン(cat:25030−024;すべてInvitrogen、Karlsruhe、Germany)を追加したRPMI1640(cat.:21875−034)またはIMDM(cat.:12440−053)培地中で、標準的条件下で培養した。
前記表示した細胞株のアリコートを、2%の熱不活性化FCS(Invitrogen、cat.:10270−106)、0.1%のアジ化ナトリウム(Roth、Karlsruhe、Germany、cat.:A1430.0100)を含むFACS緩衝液(PBS、Invitrogen、cat.:14190−169)中、Hisタグ抗体の連続的希釈物100μlとともに45分間氷上でインキュベートした。NK細胞の染色を、1mg/mLのポリクローナルヒト抗体(Gammanorm、Octapharma、Langenfeld、Germany、cat.:PZN−2451445)を追加したFACS緩衝液中で実施して、抗体のFc受容体に対する結合をブロックした。
前記カルセイン放出細胞毒性アッセイのために、標的細胞を30分間、RPMI1640培地中、37℃にて10μMのカルセインAM(Invitrogen、cat.:C3100MP)で標識し、洗浄し、そして1×104細胞を、96ウェルマイクロプレートの各ウェル中で、エフェクター細胞とともに200μlの合計体積で、5:1のエフェクター対:標的(E:T)比にて、抗体濃度を増加させて蒔いた。37℃にて加湿5%CO2雰囲気中で前記表示された時間インキュベーションした後、上清中に遊離されたカルセインの蛍光(F)を520nmにてプレートリーダー(Victor 3、Perkin Elmer、Turku Finland、cat.:1420−012)によって測定した。特異的細胞溶解を:[F(サンプル)−F(自発)]/[F(最高)−F(自発)]×100%として算出した。F(自発)は、エフェクター細胞および抗体に非存在下で標的細胞から遊離された蛍光を表し、そしてF(最高)は、1%のTriton×100(Roth、Karlsruhe、Germany、cat.:3051.2)の添加によって誘導された全細胞溶解後に遊離された蛍光を表す。回帰曲線を適合させてEC50を算出した(GraphPad Prism version 6.00 for Windows、GraphPad Software、La Jolla California USA)。
異なる配向で配列した同じ抗体可変ドメインを含む図2で示すような三重特異性抗体分子を表す、実施例3で記載する三重特異性抗体分子であるaTriFlex_101、aTriFlex_102、aTriFlex_103およびaTriFlex_104の結合(実施例3a)、3b)、3c)および3d)を参照のこと)を、シングルポジティブなCD19+/CD30−RajiおよびCD19−/CD30+KARPAS−299細胞上で、またダブルポジティブなCD19+/CD30+MEC−1細胞に対してフローサイトメトリーを使用して実証した。CD19の解離定数は6〜64nMの範囲であり、CD30については16〜45nMであった(図12)。ダブルポジティブなMEC−1細胞上で、9〜47nMの範囲内の解離定数が観察され、概して、シングルポジティブなRajiおよびKARPAS−299細胞についてそれぞれ得られた前記データを裏付けた。
Claims (21)
- ポリペプチド中でペプチドリンカー又はペプチド結合によって次々に連結した可変ドメインを含む多価Fv抗原結合分子であって、
二対の並置可変ドメインからなるダイアボディ単位を含み、ここで、一対の可変ドメインがV L−V L として配向され、他方の対の可変ドメインがVH−VH として配向され、
ここで、一対の並置可変ドメインが少なくとも六個の可変ドメインを含む第一ポリペプチド中に組み込まれ、前記第一ポリペプチドのこの一対の並置可変ドメインが、他方の対の並置ドメインからなる第二ポリペプチドと会合する、多価Fv抗原結合分子。 - 前記第一ポリペプチドが六個の可変ドメインからなり、前記第一ポリペプチドと前記第二ポリペプチド中の可変ドメインが、以下から選択される配向でN末端からC末端に配置される、請求項1に記載の多価Fv抗原結合分子。
(a)V H −V L −V H −V H −V L −V H (第一ポリペプチド)およびV L −V L (第二ポリペプチド)
(b)V L ―V H ―V H ―V H ―V H −V L (第一ポリペプチド)およびV L −V L (第二ポリペプチド)
(c)V H −V L −V L −V L ―V H −V L (第一ポリペプチド)およびV H ―V H (第二ポリペプチド)
(d)V L ―V H −V L −V L ―V H −V L (第一ポリペプチド)およびV H −V H (第二ポリペプチド)、および、
(e)V H −V L −V L −V L −V L ―V H (第一ポリペプチド)およびV H −V H (第二ポリペプチド) - 前記Fv抗原結合分子が、三重特異性又は四重特異性である請求項1又は2に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 可変ドメインVL−VLの対および可変ドメインVH−VHの対中の二個の可変ドメインが12以下のアミノ酸残基から構成されるペプチドリンカーによって連結されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記ポリペプチドは、さらにTag配列を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- ポリペプチド中でペプチドリンカー又はペプチド結合によって次々に連結した可変ドメインを含む多価Fv抗原結合分子であって、
二対の並置可変ドメインからなるダイアボディ単位を含み、ここで、一対の可変ドメインがV L −V L として配向され、他方の対の可変ドメインがV H −V H として配向され、
ここで、前記ダイアボディ単位の一対の並置可変ドメインが少なくとも六個の可変ドメインを有するポリペプチド中に組み込まれ、前記ポリペプチドの他方の対の並置可変ドメインと会合する、多価Fv抗原結合分子。 - 少なくとも六個の可変ドメインを有する前記ポリペプチドが、そのN末端でscFv単位と、そのC末端でscFv単位とを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 少なくとも六個の可変ドメインを有する前記ポリペプチドが、そのN末端で一本鎖ダイアボディ単位と、そのC末端で一本鎖ダイアボディ単位とを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子が単一のポリペプチドから構成される、請求項6〜8のいずれか一項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子が、10個の可変ドメインを含む第一ポリペプチドと、二個の可変ドメインを含む第二ポリペプチドとで構成され、前記第一ポリペプチドが、前記N末端で一本鎖ダイアボディ単位と前記C末端で一本鎖ダイアボディ単位とを含み、前記第二ポリペプチドが前記ダイアボディ単位に対する前記第一ポリペプチドと会合している、請求項8に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記ポリペプチドが前記N末端から前記C末端へ次々に連結された六個の可変ドメインを有し、第一可変ドメインおよび第二可変ドメインは前記N末端でscFv単位を形成し、前記N末端の前記scFv単位は第三可変ドメインに対してC末端でペプチドリンカーによって連結され、前記第三可変ドメインは12以下のアミノ酸残基から構成されるペプチドリンカーによって第四可変ドメインに連結され、前記第四可変ドメインは前記C末端でscFv単位に対してC末端でペプチドリンカーによって連結され、前記scFv単位が第五および第六可変ドメインによって形成される、請求項1に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記ポリペプチドが前記N末端から前記C末端へ次々に連結された八個の可変ドメインを有し、第一可変ドメインおよび第二可変ドメインがN末端でscFv単位を形成し、前記N末端での前記scFv単位が第三可変ドメインに対してC末端でペプチドリンカーによって連結され、前記第三可変ドメインは12以下のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーによって第四可変ドメインに連結され、前記第四可変ドメインが第五可変ドメインに対してC末端でペプチドリンカーによって連結され、前記第五可変ドメインが第六可変ドメインに対してC末端で12以下のアミノ酸残基から構成されるリンカーによって連結され、前記第六可変ドメインはC末端でscFv単位に対してC末端でペプチドリンカーによって連結され、前記scFv単位が第七および第八可変ドメインによって形成される、請求項6に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子が免疫エフェクター細胞上に存在する抗原に対して特異性を有する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子が、同じ種類の免疫エフェクター細胞に対する特異性を有する二つの抗原結合部位を含む、請求項13に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子が三重特異性であり、免疫エフェクター細胞に二価的に結合する請求項1〜14のいずれか1項に記載のFv抗原結合分子。
- 前記ダイアボディ単位が前記免疫エフェクター細胞に対して特異的である請求項15に記載のFv抗原結合分子。
- 前記抗原がCD3、CD16およびCD16Aから選択される、請求項13〜16のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子が腫瘍抗原に対する少なくとも一つの特異性を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子が二つの腫瘍抗原に対する特異性を含む、請求項18に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 前記Fv抗原結合分子がウイルス抗原に対する少なくとも一つの特異性を含む、請求項13〜19のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
- 薬剤として使用するための請求項1〜20のいずれか1項に記載の多価Fv抗原結合分子。
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