CN104918959A - 包含至少两个针对her2的重复序列结构域的结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及重组结合蛋白，其至少包含第一和第二重复序列结构域，其中所述2个重复序列结构域中的每一个均结合HER2的胞外区，并且其中所述重复序列结构域通过共价键连接。
Description
技术领域
本发明涉及包含至少两个对人表皮生长因子受体2(HER2)具有结合特异性的重复序列结构域的结合蛋白质以及编码这种结合蛋白质的核酸，含有这种蛋白质的药物组合物和这种蛋白质在疾病治疗中的用途。
背景技术
人表皮生长因子受体2(HER2；人HER2的UniProtKB/Swiss-Prot编号为P04626)也称为ErbB2，是由人ERBB2基因编码的蛋白质。该基因的扩增或过度表达表现出在某些类型的癌症的发生和发展起重要作用，并且近年来，该基因已经进展成为疾病治疗的重要生物标记和目标。HER2是跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)，其属于较广泛的ErbB受体家族(Bublil,E.M.和Yarden,Y.Curr.Opin.Cell Biol.19(2),124-34,2007)。ErbB受体家族在脊椎动物中是保守的，并且包括家族奠基者ErbB1(也称为表皮生长因子受体(EGFR)或HER1；该人蛋白质在UniProKB/Swiss-Prot中的编号为P00533)以及最近识别的受体HER3(也称为ErbB3；该人蛋白质在UniProKB/Swiss-Prot中的编号为P21860)和HER4(也称为ErbB4；该人蛋白质在UniProKB/Swiss-Prot中的编号为Q15303)。所有的ErbB受体共享广泛的序列和结构域同源性，并且形成功能性同源二聚体(例如，ErbB1-ErbB1,HER2-HER2和HER4-HER4)以及所有组合的异源二聚体。受体同源和异源二聚化在配体结合或受体过度表达时发生并且转而通过自身磷酸化激活受体激酶结构域。这接着触发下游胞内信号传导和生物反应。与其它ErbB受体相反，HER2不具有任何已知的配体，并且能二聚化，在其过度表达之后，二聚化是非常明显的并且在之前没有配体结合的情况下被激活。重要的是，HER3没有活化的胞内激酶结构域并且通过与其它ErbB受体家族成员的异源二聚化激活，导致非常有效的下游信号传导。HER3的这种异源二聚化和激活在配体结合至HER3时或如果合作的受体，比如HER2极大地过度表达而发生。
HER2以及其它ErbB受体家族成员由4个胞外结构域组成，该4个胞外结构域被顺序命名为I、II、III和IV，其中结构域IV离胞外细胞膜最近并且结构域I离胞外细胞膜最远。在配体被剥夺条件下，ErbB受体中的结构域I和III共享分子间的相互作用，该分子间的相互作用封闭结构域II。这防止受体同源/异源二聚化和信号传导，因为二聚化需要两个邻近的ErbB受体的结构域II之间的相互作用(Burguess A.W.,等人,Mol.Cell 12(3),541-552,2003)。结合配体破坏结构域I和III之间的相互作用，然后导致非激活态-激活态受体构象变化并且使结构域II暴露。这造成该受体混杂从而与其它激活态ErbB受体二聚化并且开始信号传导。有趣的是，HER2是唯一的组成处于激活态构象的ErbB受体家族成员，因此，结构域II被持续暴露并可进行同源和异源二聚化。
ErbB受体二聚化和自身磷酸化导致参与正常生理以及疾病的过多的、关键的下游信号传导分子的激活。这种被激活的信号传导分子的性质在一定程度上取决于活化的ErbB受体二聚体的组合物。例如，HER1-HER1和HER2-HER2同源二聚体优选激活下游胞外信号调节激酶(ERK)信号传导和增殖，而HER2-HER3异源二聚体也激活PI3K信号传导通路(包括下游激酶AKT的激活)，并由此使细胞存活。事实上，在肿瘤细胞中AKT被HER2-HER3信号传导激活促进肿瘤细胞存活并且使肿瘤细胞抵抗HER2靶向药物，如单克隆抗体曲妥珠单抗(Berns K.等人,Cancer Cell 12,395-402,2007)。有趣的是，在这些细胞中抑制HER2-HER3介导的PI3K-AKT信号传导变成速率限制，并导致细胞死亡。除了细胞增殖和存活，HER2信号传导还有原因地参与其它过程，比如血管生成和迁移。
HER2在约20％的所有乳腺癌中过度表达。由于其临床相关性，HER2成为第一RTK，针对该第一RTK研发了靶向生物制剂，即曲妥珠单抗(Genentech)。该抗体结合HER2的结构域IV并通过尚未完全了解的几种机制抑制HER2信号传导。这包括在肿瘤细胞中诱导受体内在化，导致降低HER2表达水平和信号传导，并导致致瘤表型减毒。曲妥珠单抗已经改变了数以万计的乳腺癌妇女的生活，扩展了她们的寿命和生活质量。然而，曲妥珠单抗主要具有抗增殖作用并且在疾病晚期阶段肿瘤可能逃避这样的治疗。在研发更有效的治疗的尝试中，产生了新抗体，其识别HER2的结构域II，即帕妥珠单抗(Genentech)。与曲妥珠单抗相比，该抗体不是开发成降低HER2的膜表达水平，而是通过结合至和阻断受体二聚化结构域II干扰HER2同源二聚体和异源二聚体的形成。帕妥珠单抗在体外和体内作为单一试剂具有意想不到的低治疗功效；然而，其与曲妥珠单抗的组合显示协同效应。因此，两种抗体的组合可以成为乳腺癌患者的标准护理治疗(Capelan M.,等人,Ann.Oncol.,24,273-82,2013)。
曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合的临床前和临床成功造成这样的观点：良好的抗肿瘤功效需要双重靶向HER2结构域II和IV。这与最近产生的同时靶向HER2的结构域II和IV的其它分子一致。例如，丹麦公司Symphogen正在研发的针对HER2的结构域II和IV的抗体混合物在临床前小鼠肿瘤模型已经显示出一些更高的功效(即优于单独的曲妥珠单抗)。
同样地，US2011/033460描述了结合HER2的结构域I和结构域IV的抗体的组合在DNA合成和BT474细胞的存活能力上显示协同效应。此外，US2011/033460还描述了结合HER2的两种不同表位的双特异性抗体，其中一个表位位于HER2的结构域I并且另一表位位于HER2的结构域IV。
WO 2009/068625报道双特异性抗体(biparatopic antibody)构建体的研发，该抗体构建体包含第一抗体结构域和第二抗体结构域，第一抗体结构域与曲妥珠单抗竞争结合至HER2，该第二壳体结构域结合HER2的不同表位或一部分。有趣的是，一些构建体具有SKBR3细胞增殖的拮抗作用，而另一些具有激动作用。特别是，WO 2009/068625报道双特异性抗体构建体的研发，该抗体构建体包含第一抗体结构域和第二抗体结构域，其中该第一抗体结构域与曲妥珠单抗竞争结合HER2(即，结合HER2的结构域IV)，该第二抗体结构域与帕妥珠单抗竞争结合HER2(即，结合HER2的结构域II)。构建体，其中结合结构域IV的抗体结构域克隆到结合结构域II的抗体结构域的N端，显示出阻断图谱激酶激活，而在其它取向(即，结合结构域II的抗体结构域在N端)没有观察到这样阻断。总之，WO 2009/068625描述了靶向HER2的多种双特异性抗体构建体，其在SKBR3细胞增殖或细胞信号传导上可变地扩大效果(激动或拮抗)，但没有对细胞毒性和凋亡作用进行描述。
也描述了二价结合蛋白质，如二价双抗体分子或靶向HER2的二价亲和体(Nielsen,U.B.,等人,Cancer Res.,60,6434-6440,2000；Steffen,A-C.,CancerBiother.Radiopharmaceut.20,239-248,2005)。这样的分子结合两倍的相同的结合域，因此与包含2个结合结构域(每个结合结构域结合至相同靶向分子上的不同表位)的双特异性分子不同。
作为抗体衍生的疗法和SMI的替代，新的结合蛋白或结合结构域可用于特异性结合靶分子(例如，Binz,H.K.,Amstutz,P.和Plückthun,A.,Nat.Biotechnol.23,1257-1268,2005)，并因此充当拮抗剂。一种不具有Fc的这类新型结合蛋白或结合结构域基于设计的重复序列蛋白或设计的重复序列结构域(WO 2002/020565；Binz,H.K.,Amstutz,P.,Kohl,A.,Stumpp,M.T.,Briand,C.,Forrer,P.,Grütter,M.G.,和Plückthun,A.,Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp,M.T.,Binz,H.K和Amstutz,P.,Drug Discov.Today 13,695-701,2008)。
WO2002/020565描述了如何构建重复序列蛋白的大文库及其一般应用。这些设计的重复序列结构域利用重复序列蛋白的模块化性质，并且可以具有N端和C端加帽模块，以防止设和Plückthun,A.,FEBS letters 539,2-6,2003)。该新型结合蛋白包括设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)。之前描述了结合至HER2的单特异性DARPin的产生(例如，Steiner,D.,Forrer,P.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.382,1211-1227,2008；Zahnd,C.,Pecorari,F.,Straumann,N.,Wyler,E.和Plückthun,A.,J.Biol.Chem.281(46),35167-35175,2006)。
最近，描述了设计的双特异性锚蛋白重复序列蛋白，其靶向HER2(Jost,Ch.,等人,Structure 21,1-13,2013)。作者表示通过短接头(长接头不能达到同样好的效果)连接使两个锚蛋白重复序列结构域(一个靶向HER2的结构域I并且另一靶向HER2的结构域IV)结合相比单独的靶向HER2的结构域IV的曲妥珠单抗在BT474细胞上导致更强的细胞毒性作用。该特异性重复序列蛋白通过2个HER2分子的分子内交联而起作用，即，其连接两个膜结合型HER2分子，使其扭曲，从而使其不能与任何EGFR家族成员形成能进行信号传导的二聚体，防止任何激酶的二聚化，并因此导致所观察到的细胞毒性作用。
即使现有技术表明HER2的靶向有利于疾病，例如癌症的治疗，还明确需要产生较高效地靶向HER2的结合蛋白。
发明内容
本发明的目的是提供HER2的新拮抗剂。
本发明的另一个目的是提供抑制HER2相关的细胞信号传导的新机制。
本发明的另一目的是提供一种在细胞(例如，肿瘤细胞)、组织、器官或患者中抑制HER2介导的细胞增殖和/或诱导凋亡的新方法。
本发明的另一目的是提供利用双特异性重复序列蛋白处理HER2的两个结构域的单一治疗方法。
本发明的另一目的是提供癌症治疗的新选择。
本发明的另一目的是提供针对肿瘤疾病的治疗，该治疗具有良好的功效和/或副作用小。
本发明的另一目的是提供一种针对肿瘤疾病的可供选择的治疗，该治疗不会(或仅部分地)对现有技术的疗法有反应，或有抗性。
发明概要
这些目的通过独立权利要求的主题实现，从属权利要求以及说明书进一步公开优选的实施例。
虽然附图和前面的描述更详细地展示和描述了本发明，这些展示和描述被认为是解说或示例而非限制，本发明不限于已公开的实施例，在实践本发明时，本领域技术人员可以从附图、公布和权利要求的学习中明白并实现公布的实施例的其它变形。在权利要求中，术语“包含”不排除其它元件或步骤，并且不定冠词“一”或“一个”不排除多个。在仅凭某些措施被记载在相互不同的从属权利要求中并不表示这些措施的组合不能被有利地使用。权利要求的任何附图标记不能解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1. DARPin与HER2结合
如图1A和1B所示，利用纯化的HER2结构域(结构域I、结构域III-IV或结构域I-III)作为竞争者通过竞争ELISA测试单价DARPin与HER2胞外结构域(结构域I-IV)的结合。存在500nM Her2结构域I的情况下，DARPin#51和DARPin#52不可以结合HER2(结构域I-IV)，表明其结合在结构域I上的表位。DARPin#7、DARPin#53和DARPin#54结合结构域II，因为500nM Her2结构域I或500nM Her2结构域III-IV都不能防止其结合至全长Her2(结构域I-IV)。图1C展示了单价DARPin可以结合在预先形成的HER2-帕妥珠单抗复合体上并且，与帕妥珠单抗结合HER2结构域II相比，结合HER2上的不同的表位。参下文DARPin的定义。OD，在450nM的光密度减去620nm的OD；C对照DARPin，其不结合HER2；d1，HER2的结构域I；d1-3，HER2的结构域I-III；d3-4，HER2的结构域III-IV。
图2.单价和双特异性结合蛋白对BT474细胞增殖的抑制作用
测试单价DARPin(即，DARPin#1和DARPin#18)、这些单价DARPin的非共价混合物和包含在不同取向的这些单价DARPin的双特异性结合蛋白(DARPin#41和DARPin#49)对BT474增殖的抑制。图2A展示了不同浓度的双特异性DARPin对增殖的抑制作用并且对不同的单个实验展示了相应的抑制拟合曲线。接着计算DARPin#41的IC50值为约2nM。表2列举了不同的DARPin的IC50值。图2A展示了OD，在450nM的光密度减去620nm的OD针对C、DARPin浓度(nM)绘图。X轴以对数标度显示。图2B展示了双特异性DARPin的浓度为100nM的双特异性DARPin、单价DARPin二者的混合物和单独的相应的单价DARPin对增殖的抑制。OD绘制在Y轴。低OD反映抑制增殖。参见下文对DARPins.#41、DARPin#41；#49、DARPin#49；#18、DARPin#18；#1、DARPin#1的定义；n.c.负对照。
图3.各种双特异性DARPin对BT474细胞增殖的抑制
该图展示了包含不同N端和/或C端锚蛋白重复序列结构域的双特异性DARPin(#23,#24,#33,#37,#43,#44和#41)分组对BT474增殖的抑制。对于各不同的单个试验展示了不同浓度的DAPRin对增殖的抑制作用以及相应的抑制拟合曲线。表2列举了不同DAPRin的IC50值。图3A展示了具有DARPin#15的双特异性DARPin的抑制作用并且图3B展示了DARPin#18在C端的双特异性DARPin的抑制作用。图3C和3D展示了DARPin#51在N端和DARPin#18在C端的双特异性DARPin的抑制作用，并且图3D展示了DARPin#51在N端和DARPin#21在C端的双特异性DARPin的抑制作用。曲线图展示了OD，在450nM的光密度减去620nm的OD，针对C、DARPin浓度(nM)绘图。X轴以对数标度显示。参见下文对DARPins.#23、DARPin#23；#24、DARPin#24；#33、DARPin#33；#37、DARPin#37；#41、DARPin#41；#43、DARPin#43；#44、DARPin#44的定义。
图4.在不同的细胞系中双特异性DARPin#41对细胞增殖的抑制
测试DARPin#41和曲妥珠单抗对NCI-N87(图4A)和ZR75-30(图4B)以及MDA-MB175(图4C)增殖的抑制作用。对于各不同的单个试验展示了不同浓度的DAPRin对增殖的抑制作用以及相应的抑制拟合曲线。表3列举了不同细胞系的IC50值。曲线图展示了OD，在450nM的光密度减去620nm的OD，针对C、DARPin浓度(nM)绘图。X轴以对数标度显示。参见下文对DARPin和相关分子#41、DARPin#41；T、曲妥珠单抗的定义。
图5.在不同细胞系中双特异性DARPin#41对凋亡的诱导
测试在BT474细胞(图5A)和NCI-N87细胞(图5B)以及MDA-MB175(图5C)中DARPin#41和曲妥珠单抗对凋亡的诱导。对于各不同的单个试验展示了不同浓度的DAPRin对凋亡的诱导以及相应的抑制拟合曲线。表3列举了不同细胞系的EC50值。图5A的曲线图展示了OD，在450nM的光密度减去490nm的OD，针对C、曲妥珠单抗或DARPin浓度(nM)绘图。图5B和5C的曲线图展示了RLU，相对光度单位针对C、曲妥珠单抗或DARPin浓度(nM)绘图。X轴以对数标度显示。参见下文对DARPin；T、曲妥珠单抗；#41、DARPin#41的定义。
图6.比较DARPin#41和基准对细胞增殖的抑制作用和对凋亡的诱导的功效
测试DARPin#41和基准曲妥珠单抗和帕妥珠单抗以及100nM曲妥珠单抗和滴定的帕妥珠单抗的组合对BT474细胞的增殖抑制作用和对凋亡的诱导。图6A展示了对于各不同的单个试验各种浓度的DARPin，各基准浓度对增殖的抑制作用，以及相应的抑制拟合曲线。表3列举了不同细胞系的IC50值。该曲线图展示了OD，在450nM的光密度减去620nm的OD，针对C、DARPin/基准浓度(nM)绘图。X轴以对数标度显示。图6B展示了对于各不同的单个试验，不同浓度的DARPin，各基准浓度对凋亡的诱导，以及相应的激活拟合曲线。表3列举了不同细胞系的EC50值。该曲线图展示了相对光度单位(RLU)针对C、DARPin/基准(nM)浓度绘图。X轴以对数标度显示。参见下文对DARPin；T、曲妥珠单抗；P、帕妥珠单抗；#41、DARPin#41的定义。
图7.不同形式的双特异性结合蛋白对BT474细胞增殖的抑制作用
该图展示了由在N端的DARPin#1和在C端的DARPin#18组成的不同形式的双特异性DARPin对BT474增殖的抑制作用。图7A展示了对于不同的单个试验，各种浓度的双特异性DARPin(该双特异性DARPin被改造成具有长血清半衰期)对增殖的抑制以及相应的抑制拟合曲线。双特异性DARPin#63在其C端Cys残基被聚乙二醇化，而双特异性DARPins#64和#65包含结合至血清白蛋白的锚蛋白重复序列结构域。图7B展示了对于不同的单个试验，在结合HER2的重复序列结构域之间含有不同接头的不同浓度的双特异性DARPin对增殖的抑制以及相应的抑制拟合曲线。表2列举了DARPin的IC50值。该曲线图展示了OD，在450nM的光密度减去620nm的OD，针对C、不同浓度的DARPin(nM)绘图。X轴以对数标度显示。参见下文对DARPin；#66、DARPin#66(其在两个重复序列结构域之间包含2个氨基酸长度的短GS-接头)；#67、DARPin#67(其在两个重复序列结构域之间包含5个氨基酸长度的GS-接头)；#41、DARPin#41(其在两个重复序列结构域之间包含10个氨基酸长度的GS-接头)；#68、DARPin#68(其在两个重复序列结构域之间包含24个氨基酸长度的PT-接头)的定义，
具体实施方式
根据本发明的一个实施例，重组结合蛋白包含至少第一和第二重复序列结构域，其中所述两个重复序列结构域中的每个结合HER2的胞外区，并且其中所述重复序列结构域是通过共价键连接的。
已经令人惊讶地证明HER2的胞外部分与包含至少两个共价连接的重复序列结构域(每个共价连接的重复序列结构域对HER2的胞外区具有特异性)的重组结合蛋白的结合比上文概括的现有技术的方法[通过不同和单独的结合物(例如，曲妥珠单体和帕妥珠单体的组合；图6)结合HER2]具有优势和意想不到的效果。
人HER2由1255个氨基酸组成，其中21个氨基酸的信号序列、631个氨基酸的胞外区(例如，包含结构域I至IV的胞外域)、23个氨基酸的跨膜区，以及580个氨基酸的胞浆结构域。
优选地，HER2的胞外区与所述重组结合蛋白的结合和所述重复序列结构域结合至HER2的胞外区是同时发生的或并行发生的。同样优选地，所述重复序列结构域结合至HER2胞外区的2个不同的表位。同样优选地，所述重复序列结构域结合至HER2胞外区的2个不同的非覆盖型表位。
功效增加的一个原因可能是根据本发明的重组结合蛋白诱导迄今未描述的HER2胞外区的非激活态构象，这似乎是本发明的双特异性结合蛋白与HER2胞外区上的2个不同表位的分子内相互作用的结果(实施例8)；即，该结合蛋白的2个重复序列结构域似乎都同时结合至相同的HER2分子上的不同表位，并且从而迫使HER2的胞外区处于这种新的非激活态构象中。现有技术没有描述这种非激活态构象。重要的是，这2个重复序列结构域需要连接在相同的结合蛋白中，即，这两个重复序列结构域的简单混合不表现出疗效(图2B)。此外，这种结合蛋白与HER2胞外区的二价结合可以通过显示增加的亲合力(即，同步结合至靶的不同表位的组合强度)产生协同结合效果。亲合力与亲和力不同，其对应单个的结合相互作用的强度。总之，如实施例所示，该结合蛋白与HER2的特异性相互作用可以解释通过这些分子对增殖非常有效的抑制作用和对凋亡的诱导。
根据这些理论，在相同蛋白中的2个不同的重复序列结构域协同地支持彼此结合其各自的表位，从而导致对靶的总亲和力增加。
第一重复序列结构域结合至HER2上的表位使得第二重复序列结构域进入积极和/或空间有利的位置，这促进该第二重复序列结构域与HER2上其单独的表位结合。
如实施例所示，该第一和第二重复序列结构域的共价连接似乎增强其生物活性。
在根据本发明的重组结合蛋白的优选实施例中，第一重复序列结构域结合HER2的结构域II并且第二重复序列结构域结合HER2的结构域IV。
重点要了解的是，术语“结合结构域II”意味着单独的重复序列结构域主要结合HER2的结构域II。但是，这个定义并不排除所述重复序列结构域的部分可以与其它结构域结合，或相交。这同样适用于术语“结合结构域IV”。
根据本发明的双特异性结合蛋白同时靶向HER2的结构域II和IV比现有技术中的已知技术具有特别意想不到的效果。在这些结合蛋白抑制增殖和诱导细胞凋亡的情况下的细胞应答相比现有技术的抗体获得的效果要更加明显的多。例如，这些应答的程度已经证明优于临床抗体基准[比如，分别靶向HER2的结构域IV和II的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合(图4、5和6)]诱导的程度。有趣的是，与HER2的结构域I和结构域IV结合的一些双特异性结合蛋白没有显示这些意想不到的效果(图3C和3D)。
本领域技术人员周知确定与重复序列结构域结合的HER2胞外区的结构域的方法(例如，Jost等人，同上)。
通过本发明的双特异性结合蛋白同时靶向HER2的结构域II和IV可能更有效替代当前抗体靶向方法，在此意义上，申请人的发现对HER2造成的人癌症有重要意义。
因此，根据本发明的结合蛋白优选双特异性结合蛋白，即，其包括识别在相同蛋白靶(即，HER2)上的2个不同表位，或结构域(即，结构域II和IV)的2个抗原重复序列结构域。但是，和那些既是双特异性或多特异性多肽、也是多价多肽(即具有能够识别一个或更多个其它靶蛋白的抗原重复序列结构域的多肽)的多肽一样，多特异性多肽，即，含有能够识别相同靶蛋白上的3个、4个或更多个表位的抗原重复序列结构域的多肽，也包含在本发明的范围之内。
在此使用的HER2涉及人表皮生长因子受体2，也称为Neu,ErbB-2,CD340(分化群340)或p185。HER2为表皮生长因子受体(EGFR/ErbB)家族成员。在人中，HER2由ERBB2编码，ERBB2是位于人染色体17长臂(17q12)上的已知的原癌基因。HER2的UniProtKB/Swiss-Prot编号为P04626。
根据本发明的优选实施例，该第一和第二重复序列结构域位于相同的多肽上，而靶向HER2的结构域II的重复序列结构域位于靶向HER2的结构域IV的重复序列结构域的N端。
例如，图2A以及相应的描述展示了这些实施例。发明人已经令人惊讶地展示靶向HER2的结构域II的重复序列结构域位于靶向HER2的结构域IV的重复序列结构域C端的结合蛋白比靶向HER2的结构域II的重复序列结构域位于靶向HER2的结构域IV的重复序列结构域N端的结合蛋白的功效明显较小。
优选地，结合HER2的结构域II的所述第一重复序列结构域不与帕妥珠单抗竞争结合至HER2。例如，图1C展示了这些重复序列结构域不与帕妥珠单抗竞争结合至HER2。同样优选地，结合HER2的结构域IV的所述第二重复序列结构域不与曲妥珠单抗竞争结合至HER2。例如，DARPin#18至20的重复序列结构域不与曲妥珠单抗竞争结合至HER2。本领域技术人员周知确定重复序列结构域是否与曲妥珠单抗或帕妥珠单抗竞争结合至HER2的方法，例如，如实施例3所示。
这意味着，在第一优选实施例中，与帕妥珠单抗比较，该第一重复序列结构域结合与HER2结构域II不同的表位。同样地，在第二优选实施例中，与曲妥珠单抗比较，该第二重复序列结构域结合与HER2结构域IV不同的表位。在不受限于理论的情况下，发明人将试验部分中所示的至少一些效果归因于这些事实。
根据本发明的另一优选实施例，所述第一重复序列结构域为锚蛋白重复序列结构域，或设计的锚蛋白重复序列结构域，并且所述第二重复序列结构域为锚蛋白重复序列结构域，或设计的锚蛋白重复序列结构域。
优选地，所述锚蛋白重复序列结构域或设计的锚蛋白重复序列结构域包括70～300个氨基酸，特别是90～200个氨基酸。
同样优选地，本发明的重复序列结构域为锚蛋白重复序列结构域，或如在WO 2002/020565中所示的设计的锚蛋白重复序列结构域。实施例展示了对HER2的不同结构域具有双特异性结合特异性的设计的锚蛋白重复序列结构域的例子。
根据本发明的优选实施例，该第一重复序列结构域在PBS中以小于10-7M的Kd结合HER2的胞外区并且所述第二重复序列结构域在PBS中以小于10-7M的Kd结合HER2的胞外区。
Kd为解离常数，其将进一步在下文中定义。Kd需要小于10-7M才能使重复序列结构域对其靶具有足够的亲和力。优选的是，重复序列结构域在PBS中以比10-8M、10-9M、10-10M小，或者，更优选比10-11M小的Kd结合其靶结构域。
实施例2展示了包含在PBS以低于10-7M的Kd结合HER2结构域II和/或结构域IV的蛋白的重组结合蛋白。
根据优选实施例，所述结合蛋白以小于100nM的半抑制浓度(IC50)值抑制BT474细胞的受激增殖。优选地，所述结合蛋白以小于90、80、70、60、50、40、30、20或10nM的IC50值抑制BT474细胞的受激增殖。同样优选地，所述结合蛋白抑制至少100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％BT474细胞的受激增殖。
可以通过本领域技术人员周知的标准手段将BT474细胞用于测量本发明的结合蛋白抑制增殖的功能，例如，如实施例4所示。优选地，BT474、SKBR-3、NCI-N87、ZR75-30、HCC1419或MDA-MB175细胞可以用于测量本发明的化合物抑制增殖的功能，例如，如实施例5所示。
在实施例4中公开并论述了以小于100nM的IC50值抑制BT474细胞的受激增殖的重组结合蛋白。
根据本发明的另一优选实施例，所述结合蛋白以小于100nM的半数有效浓度(EC50)在BT474细胞中诱导凋亡。优选地，所述结合蛋白以小于90、80、70、60、50、40、30、20或10nM的EC50在BT474细胞中诱导凋亡。
可以通过本领域技术人员周知的标准手段将BT474细胞用于测量本发明的结合蛋白诱导凋亡的功能，例如，如实施例5所示。优选地，BT474、SKBR-3、NCI-N87、ZR75-30、HCC1419或MDA-MB175细胞可以用于测量本发明的化合物诱导凋亡的功能，例如，如实施例5所示。
在实施例5中公开并论述了以小于100nM的EC50值在BT474细胞中诱导凋亡的重组结合蛋白。
根据优选实施例，所述第一和第二重复序列结构域通过多肽接头连接。
例如，这种多肽接头可以通过仅对待融合的各结构域的编码cDNA进行基因融合实现。这类实施例有资格成为具有2个不同重复序列结构域的融合多肽蛋白。
例如，该接头可以由分别含有氨基酸G和S，或P和T的寡肽组成，如SEQID Nos:7至12中阐述。根据另一优选实施例，可以使用下文所述的“多聚化部分”。可替代地，该2个重复序列结构域可以，例如，通过基于非多肽的化学接头，互相连接。
优选地，在PBS、pH7.4中该重组结合蛋白和/或重复序列结构域的热去折叠的中点变性温度(Tm)高于45℃，更优选高于50℃，更优选高于55℃，并且最优选高于60℃时。在生理条件下，本发明的结合蛋白或重复序列结构域具有确定的二级和三级结构。这种多肽的热去折叠导致其丧失二级和三级结构，这接着，例如，可以进行圆二色性测量。该重组结合蛋白和/或重复序列结构域的热去折叠的中点变性温度对应在生理缓冲液中通过将温度从10℃缓慢提高至约100℃使所述蛋白或结构域热变性时协作转变的中点温度。本领域技术人员周知热去折叠的中点变性温度的测定。该结合蛋白或重复序列结构域在热去折叠的中点变性温度表明所述多肽的热稳定性。
还优选的是这样的重组结合蛋白和/或锚蛋白重复序列结构域：当在37℃，PBS中培养超过5天，优选超过10天，更优选超过20天，更优选超过40天，最优选超过100天，该重组结合蛋白和/或锚蛋白重复序列结构域在浓度高达20g/L，优选高达40g/L，更优选高达60g/L，甚至更优选高达80g/L，最优选高达100g/L时，形成小于5％(w/w)的不溶性聚集物。可通过直观沉淀的出现、凝胶过滤或动态光散射(不溶性聚集物形成后其将极大地增加)检测不溶性聚集物的形成。可通过在10’000x g离心10分钟从蛋白样品移除不溶性聚集物。在PBS、37℃上述培养条件下重组结合蛋白和/或锚蛋白重复序列域形成少于2％，更优选少于1％、0.5％、0.2％、0.1％，或最优选少于0.05％(w/w)的不溶性聚集物。可以通过从可溶性蛋白中分离不溶性聚集物，接着用标准量化方法测定可溶性和不溶性部分中的蛋白量而确定不溶性聚集物的百分比。
还优选的是：在含有100mM二硫苏糖醇(DTT)的PBS中37℃培养1或10小时后，不丧失其天然三维结构的重组结合蛋白和/或锚蛋白重复序列结构域。
在一个特别的实施例中，本发明涉及这样的重组结合蛋白：其包含2个锚蛋白重复序列结构域，特异性结合HER2并具有如上定义的指示的或优选的中点变性温度和不聚集性质。
根据本发明的其它优选的实施例，提供：
所述第一重复序列结构域与选自EQ ID NOs:62至68、72和114至121的锚蛋白重复序列结构域竞争结合至HER2；和/或
所述第二重复序列结构域与选自SEQ ID NOs:74至82的锚蛋白重复序列结构域竞争结合至HER2。
发明人已经证实这些重复序列结构域，第一重复序列结构域结合HER2的结构域II，而第二重复序列结构域结合HER2的结构域IV。
优选地，所述第一重复序列结构域与选自SEQ ID NOs:62至67和115至121的锚蛋白重复序列结构域竞争结合至HER2。更优选地，所述第一重复序列结构域与选自SEQ ID NOs:62、115、120和121，特别是SEQ ID NO:115和120的锚蛋白重复序列结构域竞争结合至HER2。同样优选地，所述第一重复序列结构域与选自DARPins#1至6和54至60的结合蛋白，更优选地，与选自DARPins#1、54、59和60的结合蛋白，特别地，与选自DARPins#54和60的结合蛋白竞争结合至HER2。
另外优选地，所述第二重复序列结构域与选自SEQ ID NOs:79至81，特别是SEQ ID NO:80和81的锚蛋白重复序列结构域竞争结合至HER2。同样优选地，所述第二重复序列结构域与选自DARPins#18至20的结合蛋白，特别地，与选自DARPins#19和20的结合蛋白竞争结合至HER2。
根据本发明的其它优选实施例，提供：
第一重复序列结构域包含于选自SEQ ID NOs:62至68,72和114至121的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，
第二重复序列结构域包含于选自SEQ ID NOs:74至82的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，
并且其中进一步地
在所述锚蛋白重复序列结构域位置1的G和/或在位置2的S可选择地缺失；和
在所述锚蛋白重复序列结构域的倒数第二位置的L和/或在最后位置的N可选择地被A替换。
优选地，所述第一重复序列结构域包含与选自SEQ ID NOs:62至67和115至121的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。更优选地，所述第一重复序列结构域包含与选自SEQ ID NOs:62、115、120和121，特别是SEQ ID NO:115和120的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。同样优选地，所述第一重复序列结构域包含与选自DARPins#1至6和54至60的结合蛋白，更优选地，与选自DARPins#1、54、59和60的结合蛋白，特别地，与选自DARPins#54和60的结合蛋白具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
另外优选地，所述第二重复序列结构域包含与选自SEQ ID NOs:79至81，特别是SEQ ID NO:80和81的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。同样优选地，所述第二重复序列结构域包含与选自DARPins#18至20的结合蛋白，特别是与选自DARPins#19和20的结合蛋白具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
优选地，所述第一锚蛋白重复序列结构域包含与选自SEQ ID NOs:62至68、72和114至121的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
优选地，该第二锚蛋白重复序列结构域包含与选自SEQ ID NOs:74至82的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
同样优选地，该第一锚蛋白重复序列结构域包含与一个、两个或三个锚蛋白重复序列模块具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，该一个、两个或三个锚蛋白重复序列模块存在于选自SEQ ID NOs:62至68、72和114至121的锚蛋白重复序列结构域的N端和C端加帽模块之间。
同样优选地，该第二锚蛋白重复序列结构域包含与一个、两个或三个锚蛋白重复序列模块具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，该一个、两个或三个锚蛋白重复序列模块存在于选自SEQ ID NOs:74至82的锚蛋白重复序列结构域的N端和C端加帽模块之间。
根据本发明的其它优选实施例，提供：
所述第一重复序列结构域选自SEQ ID NOs:62至68、72和114至121，
所述第二重复序列结构域选自SEQ ID NOs:74至82，
并且其中进一步地
在所述锚蛋白重复序列结构域位置1的G和/或在位置2的S可选择地缺失；和
在所述锚蛋白重复序列结构域的倒数第二位置的L和/或在最后位置的N可选择地被A替换。
优选地，所述第一锚蛋白重复序列结构域选自SEQ ID NOs:62至67、72和115至121；更优选SEQ ID NO:115、120，和121，特别是，SEQ ID NO:115和120。
优选地，该第二锚蛋白重复序列结构域选自SEQ ID NOs:79至81，特别是SEQ ID NO:80和81。
根据本发明的其它优选实施例，提供：
所述第一重复序列结构域包含锚蛋白重复序列模块，该锚蛋白重复序列模块具有选自SEQ ID NO:15至18、21至23、37、38、125、126、129、130、133和134的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:15至18、21至23、37、38、125、126、129、130、133和134中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸残基取代，和/或
所述第二重复序列结构域包含锚蛋白重复序列模块，该锚蛋白重复序列模块具有选自SEQ ID NO:46、47、51、52、55和56的氨基酸序列，其中在SEQID NO:46、47、51、52、55和56中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸残基取代。
优选地，所述第一锚蛋白重复序列结构域的锚蛋白重复序列模块选自SEQID NO:15至18、125、126、129、130、133和134，更优选SEQ ID NO:15、125、129和133，并且甚至更优选SEQ ID NO:125和133。
优选地，所述第二锚蛋白重复序列结构域的锚蛋白重复序列模块选自SEQID NO:46、47、55和56，并且更优选SEQ ID NO:55和56。
同样优选地，在SEQ ID NO:15至18、21至23、37、38、46、47、51、52、55、56、125、126、129、130、133和134的重复序列模块中多达8个氨基酸被另一氨基酸替换，被替换的氨基酸优选为多达7个氨基酸，更优选为多达6个氨基酸，更优选为多达5个氨基酸，甚至更优选为多达4个氨基酸，更优选为多达3个氨基酸，更优选为多达2个氨基酸，最优选为1个氨基酸。
优选地，当在加帽模块、重复序列模块或重复序列结构域，重复序列结构域，或结合蛋白中替换氨基酸时，这些氨基酸被选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y，更优选A、D、E、H、I、K、L、Q、R、S、T、V，和Y的氨基酸取代。同样优选地，氨基酸被同源氨基酸替换，即，氨基酸被侧链具有相似的生物物理特性的氨基酸替换。例如，带负电荷的氨基酸D可以被带负电荷的氨基酸E取代，或疏水性氨基酸，例如L可被A，I或V取代。本领域技术人员周知在多肽中氨基酸被另一氨基酸替换的技术。
优选地，根据本发明的重复序列结构域具有选自KDFQGITPLHIAATSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:16中多达9个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代，并且其中
在位置3的F被A可选择地替换；
在位置4的Q被E可选择地替换；
在位置5的G被S可选择地替换；
在位置6的I被V可选择地替换；
在位置11的I被L可选择地替换；
在位置14的T被Q可选择地替换；和/或
在位置15的N被选自S和W的氨基酸可选择地替换。
该组中一个非常优选的重复序列模块具有由KDFQGVTPLHIAAQSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:125)、SEQ IDNO:129或SEQ ID NO:133组成的氨基酸序列。
同样优选地，根据本发明的锚蛋白重复序列模块具有选自KDITGETPLHHAADSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:18中多达9个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代，并且其中
在位置3的I被V可选择地替换；
在位置6的E被D可选择地替换；
在位置11的H被L可选择地替换；
在位置14的D被Q可选择地替换；
在位置15的S被H可选择地替换；和/或
在位置19的E被V可选择地替换。
该组中一个非常优选的重复序列模块具有由KDVTGDTPLHLAAQHGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:126)、SEQ IDNO:130或SEQ ID NO:134组成的氨基酸序列。
同样优选地，根据本发明的锚蛋白重复序列结构域具有选自KDWEGTTPLHLAAHTGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:21)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:21中多达9个氨基酸残基被任何氨基酸残基取代，并且其中
在位置3的W被F可选择地替换；
在位置4的W被Q可选择地替换；
在位置6的T被选自I、Y和V的氨基酸可选择地替换，优选T；
在位置11的L被选自I和V的氨基酸可选择地替换，优选I和V；
在位置14的H被选自H、Q、Y和W的氨基酸可选择地替换，优选H；和/或
在位置15的T可选择地缺失或被选自A和D的氨基酸替换。
同样优选地，根据本发明的锚蛋白重复序列结构域具有选自KDTVGTTPLHYAAEDGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:22中多达9个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代，并且其中
在位置3的T被选自S、K、E和I的氨基酸可选择地替换；氨基酸分配相等；
在位置4的V被选自Q、I和Y的氨基酸可选择地替换；优选Y；
在位置6的T被选自Q、F、R和W的氨基酸可选择地替换；
在位置11的Y被选自L、E和S的氨基酸可选择地替换；优选S；
在位置14的E被选自S、Q、Y和V的氨基酸可选择地替换；和/或
在位置15的D被选自S、F和Y的氨基酸可选择地替换；
在位置16的G被D可选择地替换；
同样优选地，根据本发明的锚蛋白重复序列模块选自KDVEGWTPLHYAASSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:38中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸残基取代，并且其中
在位置6的W被Q可选择地替换；
在位置11的Y被L可选择地替换；和/或
在位置15的S被Y可选择地替换。
同样优选地，根据本发明的锚蛋白重复序列模块选自KDWRGFTPLHYAAYLGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:46)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:46中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸残基取代，并且其中
在位置3的W被选自W、T、V和R的氨基酸可选择地替换；优选T和R；
在位置4的R被选自R、T和I的氨基酸可选择地替换；优选I；
在位置6的F被选自F或H可选择地替换；优选F；
在位置11的Y被R可选择地替换；
在位置14的Y被F可选择地替换；
在位置15的L被V可选择地替换；和/或
在位置17的H被Q可选择地替换。
优选地，SEQ ID NOs:16、18、28、31、21、22、38和/或46的9、8、7、6、5、4、3、2，或1个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代。
此外，特别优选地，所述结合蛋白包含多肽，其中所述多肽包含所述第一和第二锚蛋白重复序列结构域，并且其中所述多肽与选自SEQ ID NO:83至98、102、103、122、123和136至141的多肽具有至少70％氨基酸序列一致性。
优选地，所述多肽包含与选自SEQ ID NO:83至98、102、103、122、123和136至141的多肽具有至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，或100％氨基酸序列一致性的氨基酸序列。
同样优选地，所述多肽选自SEQ ID NO:84、85、86、87、90、91、92、98、102、103、122and 123，更优选SEQ ID NO:85、86、87、90、91、92、102、103、122和123，甚至更优选SEQ ID NO:86、87、91和92，并且最优选SEQ IDNO:86和87。
根据其它优选实施例，所述第一和第二锚蛋白重复序列结构域的锚蛋白重复序列模块的一个或更多个氨基酸残基被在锚蛋白重复序列单元的比对上相应位置处的氨基酸残基替换。
本发明的另一实施例提供核酸分子，该核酸分子编码上文所述的至少一个结合蛋白或特别的锚蛋白重复序列结构域。此外，考虑包含所述核酸分子的载体。
并非所有根据本发明的结合组合物都包含多肽或蛋白。后面的实施例仅涉及那些包含多肽或蛋白的结合组合物。对于这些组合物，申请人没有在此公开能够对它们进行编码的所有核酸分子，这是因为，由于遗传密码的简并性，许多核酸分子能够对一个和相同的多肽或蛋白进行编码。
但是，它可以明确地并且毫不含糊地确定给定的核酸是否编码给定的多肽或蛋白。因此，对技术人员来说，本实施例是清楚的，并且其范围是易于确定的。
本发明的另一实施例是提供根据上文所述的结合蛋白抑制以下至少一种的用途：
HER2受体二聚化，
HER2/HER3异源二聚化，
HER2受体自身磷酸化，
HER受体介导的信号传导，
HER3受体配体诱导的磷酸化，和/或
HER3受体介导的信号传导。
HER2受体二聚化(也称为“同源二聚化”)发生在独立于配体之外使HER2过度表达的组织中。所述同源二聚化导致胞内自身磷酸化，这可以最终导致，例如，增加细胞增殖。
因为HER3缺乏内在的激酶活性，HER2/HER3异源二聚体形成之后，在HER2过度表达的乳腺癌中HER3被磷酸化，其可以最终导致，例如，抑制细胞凋亡。
所述用途可以发生在体外或体内。如上所述，所有这些方法可以导致致病结果，即，通过激活各自的信号转导通路。通过HER2二聚化和/或HER2/HER3异源二聚体激活的信号转导通路包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，磷酸肌醇3-激酶(PI3K/Akt)，磷脂酶Cγ，蛋白激酶C(PKC)，信号转导和转录激活因子(STAT)，Ras-Map激酶通路和mTOR通路。
例如，磷酸肌醇3-激酶(PI3K/Akt)通路被认为是通过阻断凋亡使细胞维持存活的关键通路之一。其病理激活，例如，通过HER2/HER3异源二聚体，可能引发恶性增殖(例如，参见实施例)。
HER2的病理结合，例如，通过HER2同源二聚化，可能引发细胞恶性迁移、入侵或增殖(例如，参见实施例、Hynes NE.和Lane HA.,Nat.Rev.Cancer.,5,341-54,2005)。
本发明的另一实施例，提供包含根据上述公布的结合蛋白或组合物的药物制剂，以及可选地提供可接受药物的载体和/或稀释剂。
可接受药物的载体和/或稀释剂对本领域技术人员来说是已知的并且在下文有更详细的说明。甚至进一步地，考虑包含一种或更多种上文所述的重组结合蛋白，特别是包含重复序列结构域的结合蛋白的用于诊断的组合物。
药物制剂包含上述的重组结合蛋白和可接收药物的载体、赋形剂或稳定剂，例如，如在Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.[1980]一文中所述。本领域技术人员已知的合适的载体、赋形剂或稳定剂为生理盐水、林格氏溶液、葡萄糖溶液、汉克(Hank's)溶液、固定油、油酸乙酯、在盐水中的5％葡萄糖、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲剂和防腐剂。其它合适的载体包括本身不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体的产生的任何载体，例如，蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。
用于体内服用的制剂必须是消过毒的或无菌的。这经由无菌滤膜过滤轻易实现。该药物制剂可通过在本领域技术人员知识范围内的任何合适的方法来服用。
此外，在本发明的另一实施例中提供根据上文公布的至少一种结合蛋白、组合物或药物制剂作为药剂的用途。同样地，提供包括使患者服用上述的结合蛋白、组合物或药物制剂的方法。在这两种情况下，优选，待治疗的疾病是肿瘤疾病，优选癌症。
在每种情况下，优选使患者服用有效量的上述的结合蛋白、组合物或药物制剂以治疗疾病。
在此使用的术语“肿瘤性疾病”是指细胞或组织的异常状态或情况，特征在于迅速增殖的细胞生长或肿瘤。在更具体的意义上，该术语涉及癌变过程，例如，瘤和/或白血病。
根据本发明的结合蛋白显示出凋亡和抗增殖作用(参见实施例部分)。由于肿瘤疾病的特征通常为由凋亡受抑制和/或增殖增强，从这些实施例中合理推断出根据本发明的结合蛋白可以用于肿瘤疾病的治疗。
优选地，所述肿瘤疾病为具有选自以下的至少一个特征的疾病：
HER2编码基因的扩增，
HER2编码基因的过度表达，
HER2编码基因的突变形式的表达，和/或
在抗曲妥珠单抗的肿瘤中HER3编码基因的过度表达。
人HER2由ERBB2基因编码。上述选项可以归因于ERBB2基因突变，这可以通过现代分子诊断来检测，如目前市场上的现代分子诊断。
在此使用的术语“HER2表面具有的表达”涉及表达HER2受体蛋白的细胞、组织或器官，例如，通过免疫组织化学法(IHC)检测出。在此使用的术语“HER2编码基因的扩增或过度表达”涉及与在正常细胞、组织或器官中的表达水平比较，指示在细胞、组织或器官中HER2受体蛋白的异常表达水平，例如，通过免疫组织化学法(IHC)检测出。
本领域已知这样的IHC检测试验，包括临床试验测定(CTA)，市售LabCorp4D5测验和市售(DAKO，卡平特里亚，加利福尼亚州)。后面的试验使用0至3+(0是正常表达，3+表示最强阳性表达)细胞染色的特定得分范围，以识别HER2蛋白过度表达的癌症。因此，HER2蛋白的过度表达在1+、2+或3+，优选2+或3+，更优选3+的范围特征的癌症患者将受益于本发明的治疗方法。
可代替地，也可以通过原位杂交法(ISH)、RT-PC和其它方法检测HER2表达和/或过度表达的得数。
根据特别优选的实施例，所述肿瘤疾病为选自以下疾病中的至少一种：
·乳腺癌，
·卵巢癌，
·胃肿瘤(gastric cancer)，
·胃癌(stomach cancer)，和/或
·子宫癌，
·结肠直肠癌。
此外，优选通过服用选自以下的至少一种活性物质以协作方式补充所述用途：
·抗肿瘤试剂
·内分泌药物，
·肿瘤疫苗，
·免疫疗法，和/或
·细胞疗法。
在此使用的术语“以协作方式补充”应该指的是共同服用，其在给定方案的情况下进行。这包括同步服用不同化合物，以及时移服用不同化合物(例如，化合物A给药一次并且在此之后化合物B给药几次，或反之亦然，或这两种化合物同步给药并且在稍后阶段两者之一也给药)。
在此使用的术语“抗肿瘤试剂”涉及具有抗肿瘤或抗癌作用的药物，或药物的组合。这首先适用于化疗剂，其通过消弱有丝分裂，有效地靶向快速分裂的细胞或者通过使细胞进行凋亡而起作用。大多数化疗药物可分为烷化剂、抗代谢物、蒽环类药物、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂，和其它抗肿瘤试剂。
优选的抗肿瘤试剂是5-氟尿嘧啶、放线菌素、阿霉素、安吖啶、蒽环类药物、硫唑嘌呤、苯达莫司汀、博莱霉素、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、柔红霉素、多西紫杉醇、阿霉素、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、氮芥、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、奥沙利铂、紫杉醇、普卡霉素、鬼臼毒素、替尼泊苷、托泊替康、戊柔比星、长春碱、长春新碱、长春新碱、长春地辛，和/或长春瑞滨。
免疫治疗涉及从癌细胞分离蛋白质并且随后使癌症患者对这些蛋白质免疫，以期刺激免疫反应，杀死癌细胞。另一种治疗性抗癌疫苗接种方法是在患者体内的原位产生免疫应答。这增强对肿瘤抗原的抗肿瘤免疫应答，随后释放裂解性病毒复制体，结果在原位产生患者特异性抗肿瘤疫苗。另一种方法是使患者对在癌症发生中起生理作用的化合物免疫，从而使人体消除所述化合物。
靶向药物是通过干扰致癌和肿瘤生长所需的特异靶向分子，而不是简单干扰快速分裂的细胞(例如，传统的化疗)，阻断癌细胞的生长的一类药剂。靶向治疗的主要种类是小分子和单克隆抗体。
落入此定义的小分子包括，但不限于，拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、伊马替尼、吉非替尼、埃罗替尼、硼替佐米、Bcl-2抑制剂(例如，奥巴克拉、ABT-263、和棉酚)、PARP抑制剂(例如，Iniparib、奥拉帕尼)、Janus激酶抑制剂、PI3K抑制剂、阿帕替尼、mTOR抑制剂(依维莫司)、AN-152、AKT抑制剂、HDAC抑制剂、蛋白酶体抑制剂、连接至[D-Lys(6)]-LHRH的多柔比星、哌加他尼、舒尼替尼、索拉非尼、Tivozanib和帕唑帕尼。落入此定义的单克隆抗体包括，但不限于，利妥昔单抗、曲妥珠单抗、曲妥珠单抗-TDM1、帕妥珠单抗、西妥昔单抗和贝伐珠单抗。
在此使用的内分泌药物是对激素或激素受体有拮抗作用并因此干扰生长需要激素的癌症类型的药物。这样的内分泌药物的一个例子是它莫西芬，其为乳房组织中的雌激素受体的拮抗剂。
在此使用的术语“细胞治疗”，应涉及基于细胞的疗法，如修饰，或未经修饰的，细胞毒性淋巴细胞或树突状细胞的过继转移。
在此使用的术语“肿瘤疫苗”是指如下的疫苗a)防止感染致癌病毒(作用模式类似于其它抗病毒感染的疫苗)，b)治疗现有癌症(治疗性癌症疫苗)，或c)防止癌症发展，或减轻其影响(预防癌症疫苗)。
另外或可代替地，优选通过以下的至少一种其它治疗以协作方式补充所述用途：
·放射治疗
·手术，和/或
·激光消融。
此外，提供了治疗人或动物受试者的方法，该方法包括根据上述公开的用途。优选地，所述治疗方法涉及上文所述的指示。该方法包括使有需要的人或动物服用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白。
可通过比如噬菌体(WO 1990/002809,WO 2007/006665)、或细菌细胞(WO1993/010214)表面展示、核糖体展示(WO 1998/048008)，质粒展示(WO1993/008278)几种方法，或通过利用共价RNA重复序列蛋白杂交构建体(WO2000/032823)，或胞内表达和选择/筛选比如蛋白互补试验(WO 1998/341120)获得和/或进一步形成根据本发明的重组结合蛋白或锚蛋白重复序列结构域。本领域技术人员知晓这些方法。
可以根据本领域技术人员已知的方案获得用于根据本发明的重组结合蛋白或锚蛋白重复序列结构域的选择/筛选的锚蛋白重复序列蛋白的文库(WO2002/020565,Binz,H.K.,等人,J.Mol.Biol.,332,489-503,2003和Binz等人,2004,同上)。实施例1举例说明了这些文库在选择对HER2胞外区具有特异性的锚蛋白重复序列结构域上的用途。此外，可以利用标准的重组DNA技术(例如，WO2002/020565，Binz等人，2003，同上和Binz等人，2004，同上)由根据本发明的锚蛋白重复序列模块和合适的加帽模块或加帽重复序列模块化地组装((Forrer,P.等人，FEBS letters 539,2-6,2003)本发明的锚蛋白重复序列结构域。
本发明并不限于在实施例中描述的特定实施例。也可以使用其它资源，并用下面概括的方法进行处理。
定义
术语“蛋白”是指多肽，其中至少部分所述多肽具有或能够通过在其多肽链内和/或之间形成二级、三级或四级结获得确定的三维排列。如果蛋白包含两条或更多条多肽，该单独的多肽链可以非共价地或共价地连接，例如，通过两条多肽之间的二硫键连接。通过形成二级或三级结构单独具有，或能够获得确定的三维排列的蛋白部分被称为“蛋白结构域”。本领域技术从事者周知这样的蛋白质结构域。
在重组蛋白、重组蛋白结构域、重组结合蛋白等等中使用的术语“重组”是指通过利用相关领域从事者周知的重组DNA技术产生所述多肽。例如，可以将编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pQE30，Qiagen)、酵母表达质粒或哺乳动物表达质粒中。例如，当将这样构建的重组细菌表达质粒插入到合适的细菌(例如，大肠杆菌)时，该细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。相应产生的多肽被称为重组多肽
在本文，术语“多肽”涉及由例如，通过肽键连接的多个，即，2个或更多个氨基酸的一条或多条链组成的分子。优选地，多肽由通过肽键连接的八个以上的氨基酸组成。
术语“多肽标签”指的是连接至多肽/蛋白质的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列用于所述多肽/蛋白质的纯化、检测或靶向，或其中所述氨基酸序列能够改善所述多肽/蛋白质的物理化学行为，或其中所述氨基酸序列具有效应子功能。单独的多肽标签，结合蛋白的部分和/或结构域可直接或通过多肽接头彼此连接。这些多肽标签在本领域中都是周知的，并且对本领域技术人员来说完全是可以获得的。多肽标签的例子为小多肽序列，例如，组氨酸(His)(例如，SEQ ID NO：6的组氨酸标签)、myc、FLAG、Strep标签或部分，例如，酶(例如，碱性磷酸酶)，其能对所述多肽/蛋白质，或可用于靶向(如免疫球蛋白或其片段)和/或作为效应分子的部分或进行检测。
术语“多肽接头”是指氨基酸序列，其能够连接，例如两个蛋白结构域，多肽标签和蛋白结构域，蛋白结构域和非多肽部分，例如，聚乙二醇或两个序列标签。相关领域技术人员已知这些结构域、标签、非多肽部分和接头。在申请号为WO2002/020565的专利申请的描述中提供了上述例子的列表。此类接头的具体例子为长度可变的甘氨酸-丝氨酸连接子及脯氨酸-苏氨酸接头，优选地，所述接头的长度在2和24个氨基酸之间；更优选地，所述接头的长度在2和16个氨基酸之间。SEQ ID NO:7至10提供甘氨酸-丝氨酸接头的例子标签SEQ IDNO：11和12提供脯氨酸-苏氨酸接头的例子。优选地，SEQ ID NO：11的脯氨酸-苏氨酸接头之前有GS和/或之后有GS。
术语“聚合物部分”指的是蛋白质的聚合物部分或非蛋白质的聚合物部分。“蛋白质的聚合物部分”优选为不形成稳定的三级结构的多肽。蛋白质的聚合物部分的例子是(Amunix的注册商标；WO 2007/103515)多肽，或如WO2008/155134所述包含脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸残基的多肽。通过利用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随后通过标准的表达和纯化，蛋白质的聚合物部分可以共价连接至，例如，本发明的重复序列结构域。“非蛋白质的聚合物部分”是并非由多肽构成的聚合物部分。非蛋白质的聚合物部分的例子是羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇，或聚氧化烯。术语“聚乙二醇化”是指PEG部分共价连接至，例如，本发明的多肽。本发明的聚合物部分的分子量可以广泛变化。优选地，所述聚合物部分由多肽接头连接至重复序列结构域。
在特定的实施例中，PEG部分或任何其它非蛋白质的聚合物可以，例如，通过马来酰亚胺接头连接到半胱氨酸巯基，并且半胱氨酸通过肽接头连接至在此所述的重复序列结构域的N或C端。
术语“结合蛋白”是指包含一个或多个结合结构域，一种或多种生物活性化合物和如下面进一步解释的一种或多种聚合物部分的蛋白质。优选地，所述结合蛋白包含高达四个结合结构域。此外，任何此类结合蛋白可以包含并非为结合结构域的另外的蛋白结构域、多聚化部分、多肽标签、多肽接头和/或单个Cys残基。
“多聚化部分”的例子是免疫球蛋白重链恒定区，其成对提供功能性免疫球蛋白Fc结构域，和亮氨酸拉链或包含游离巯基(在2条这样的多肽之间形成分子间二硫键)的多肽。单个Cys残基可用于，例如，通过利用本领域技术人员周知的马来酰亚胺化学作用使其它部分结合至多肽。优选地，所述结合蛋白为重组结合蛋白。还优选地，结合蛋白的结合结构域具有不同的靶特异性。
术语“竞争结合”表示本发明的两个不同的结合结构域都能单独地结合相同的靶，而不能同时结合至相同的靶。因此，这样的两个结合结构域竞争结合至所述靶。优选地，所述两个竞争的结合结构域结合至在所述靶上的重叠或相同的结合表位。本领域技术人员周知确定两个结合结构域是否竞争结合至靶的方法，如竞争酶联免疫吸附法(ELISA)或竞争SPR测定(例如，通过使用来自BioRad公司的Proteon仪)。
术语“多特异性结合蛋白”是指针对位于相同靶蛋白上的两个或多个不同表位的结合蛋白。例如，靶向HER2的多特异性结合蛋白包含至少一个靶向HER2上的第一表位的第一结合结构域、靶向HER2上的不同的第二表位的第二结合结构域，以及任选地包含靶向HER2上的另外的表位的另外的结合结构域。
术语“双特异性结合蛋白”是指针对位于相同靶蛋白上的两个不同表位的结合蛋白。例如，靶向HER2的双特异性结合蛋白包含至少一个靶向HER2第一表位的第一结合结构域和靶向HER2上的不同的第二表位的第二结合结构域。相应地，“双特异性结合蛋白”包含针对第一表位的第一结合结构域和针对相同靶分子上的不同的第二表位的第二结合结构域。
术语“生物活性化合物”指的是当适用于具有所述疾病的哺乳动物时，减轻疾病的化合物。生物活性化合物可以具有拮抗或激动性质，并且可以是蛋白质的生物活性化合物或非蛋白质的生物活性化合物。这种蛋白质的生物活性化合物通过使用标准DNA克隆技术产生基因融合多肽，随后通过标准的表达和纯化可以共价连接至，例如，本发明的结合结构域。这种非蛋白质的生物活性化合物通过化学方法可以共价连接至，例如，本发明的结合结构域，例如，通过由马来酰亚胺接头连接至半胱氨酸硫基并且半胱氨酸由肽接头连接至在此所述的结合结构域的N或C端。蛋白质的生物活性化合物的例子是具有不同靶特异性(例如，通过与生长因子结合使其无效)的结合结构域、细胞因子(如白介素)、生长因子(例如，人生长激素)、抗体及其片段、激素(例如，GLP-1)和任何可能的蛋白质药物。非蛋白质的生物活性化合物的例子是毒素(例如，ImmunoGen的DM1)、靶向GPCR的小分子、抗生素和任何可能的非蛋白质药物。
术语“结合结构域”是指蛋白质支架表现出相同的“折叠”(三维排列)并且具有下文定义的预定形状的蛋白质结构域。这样的结合结构域可以通过合理的，或最常见的是，组合蛋白质工程技术获得，这是本领域已知的技术(Binz等人，2005，同上)。例如，可以通过包括如下步骤的方法获得具有预定性质的结合结构域：(a)提供蛋白质支架展示系统折叠的蛋白质结构域的各种集合；和(b)筛选所述各种集合和/或从所述各种集合中选择，以获得至少一种具有所述预定性质的蛋白质结构域。根据使用的筛选和/或选择系统，可以通过几种方法提供蛋白质结构域的各种集合，并且可以包括利用本领域技术人员已知的方法，比如，噬菌体展示或核糖体展示。优选地，所述结合域是重组结合结构域。还优选地，所述结合结构域是重复序列蛋白或设计的重复序列蛋白。
因此，在此使用的术语“结合”涉及识别并结合给定的靶，但基本上不识别或结合其它靶的结合结构域。优选地，具有本发明意义的结合结构域资格的候选者要求解离常数在PBS中小于10-7M。
术语“Kd”涉及解离常数，其为测量较大的对象可逆地分离(离解)为较小成分的性质(如当复合物分开成其组成分子时)的特定类型的平衡常数。本领域技术人员周知确定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数的方法，比如，基于表面等离子体共振(SPR)的技术(例如，SPR平衡分析)或等温滴定量热法(ITC)。如果在不同的条件(例如，盐浓度，pH值)下测量，那么特定的蛋白质-蛋白质相互作用的测得的Kd值可以不同。因此，优选用标准化的蛋白溶液和标准化的缓冲液，例如PBS进行Kd值的测量。
术语“PBS”意为含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
术语“蛋白质支架”是指具有可以高度容忍氨基酸插入、取代或缺失的暴露表面区域的蛋白质。可以用来产生本发明的结合结构域的蛋白质支架的例子是抗体或其片段，比如单链Fv或Fab片段、来自金黄色葡萄球菌的蛋白A、来自大菜粉蝶(Pieris brassicae)的胆汁三烯结合蛋白或其它脂质运载蛋白、锚蛋白重复序列蛋白或其它重复序列蛋白，和人纤连蛋白。本领域技术人员已知所述蛋白支架(Binz等人，2005，同上；Binz等人，2004，同上)。
术语“靶”指的是单独的分子，例如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物，或任何其它天然存在的分子，包括这些单独分子的任何一部分，或两个或多个这些分子的复合物。靶可以是整个细胞或组织样品，或其可以为任何非天然分子或部分。优选地，所述靶是天然存在的或非天然多肽或含有化学修饰，例如，通过天然或非天然的磷酸化、乙酰化、或甲基化修饰的多肽。在本发明的具体应用中，所述靶为HER2的胞外区域。
术语“预定性质”是指性质，比如，结合至靶、靶的阻断、靶介导的反应的激活、酶活性，以及相关另外的性质。取决于预期性质的类型，普通技术人员能够识别进行筛选和/或选择具有预期性质的结合结构域的形式和必要的步骤。优选地，所述预定性质为结合至靶。
下文对重复序列蛋白的定义是基于申请号为WO 2002/020565的专利申请中的定义。申请号为WO 2002/020565的专利申请进一步涵盖了重复序列蛋白特征、技术和应用的概述。
术语“重复序列蛋白”是指包含一种或多种重复序列结构域的蛋白质。优选地，每个所述重复序列蛋白包含高达四个重复序列结构域。更优选地，每个所述重复序列蛋白包含高达两个重复序列结构域。最优选地，每个重复序列蛋白包括仅一个重复序列结构域。此外，所述重复序列蛋白可以包含另外的非重复序列的蛋白结构域、多肽标签和/或多肽接头。
术语“重复序列结构域”是指包含作为结构单元的两个或更多个连续的重复序列单元(模块)的蛋白结构域，其中，所述结构单元具有相同的折叠部分并紧密堆叠从而产生具有共同的疏水核心的超螺旋结构。优选地，重复序列结构域还包含N端和/或C端加帽单元(或模块)。甚至更优选地，所述N端和/或C端加帽单元(或模块)为加帽的重复序列。
术语“设计的重复序列蛋白”和“设计的重复序列结构域”分别指的是WO2002/020565的专利申请中说明的发明方法的结果获得的重复序列蛋白或重复序列结构域。设计的重复序列蛋白和设计的重复序列结构域是合成的，而不是来自大天然的。其分别为人造蛋白或结构域，通过表达相应的设计的核酸而获得。优选地，该表达在真核或原核细胞中，如细菌细胞，或利用体外无细胞表达系统进行。因此，设计的锚蛋白重复序列蛋白(即，DARPin)对应包含至少一个锚蛋白重复序列结构域的本发明的重组结合蛋白。
术语“结构单元”是指多肽的局部有序的部分，其由二级结构沿着多肽链彼此邻近的两个或更多个片段之间的三维相互作用形成。这样的结构单元呈现结构基序。术语“结构基序”指的是存在于至少一个结构单元的二级结构元件的三维排列。结构基序是本领域技术人员周知的。单独的结构单元不能获得确定的三维排列，然而，其连续结构，例如，在重复序列结构域的重复序列模块，导致相邻单元的相互稳定化，从而产生超螺旋结构。
术语“重复序列单元”是指包含一个或多个天然存在的重复序列蛋白的重复序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复序列单元”有多个拷贝，并且对于确定蛋白质折叠的所有所述基序，所述“重复序列单元”表现出共同的、确定的折叠拓扑结构。这样的重复序列单元对应重复序列蛋白的“重复序列结构单元(重复序列)”(如Forrer等人，2003，同上，一文所述)或重复序列蛋白的“连续的同源结构单元(重复序列)”(如Binz等人，2004，同上，一文所述)。这样的重复序列单元包含框架残基和相互作用的残基。这种重复序列单元的例子为犰狳重复序列单元、富含亮氨酸的重复序列单元，锚蛋白重复序列单位，三角形四肽(tetratricopeptide)重复序列单元，HEAT重复序列单元，和富含亮氨酸的变体的重复序列单元。含有两个或更多个这种重复序列单元的天然存在的蛋白质被称为“天然存在的重复序列蛋白”。当相互比较时，重复序列蛋白的单独的重复序列单元的氨基酸序列可具有显著数目的突变、取代、添加和/或缺失，同时仍基本上保持重复序列单元的一般模式，或基序。
因此，术语“锚蛋白重复序列单位”指的是重复序列单元，其为如Forrer等人，2003，在上述引文中所述的锚蛋白重复序列。锚蛋白重复序列是本领域技术人员周知的。术语“锚蛋白重复序列结构域”指的是包含两个或更多个连续的作为结构单元的锚蛋白重复序列单位(模块)的重复序列结构域，并且，优选地，包含N端和/或C端加帽单元(或模块)的重复序列结构域。
术语“框架残基”涉及重复序列单元的氨基酸残基，或者重复序列模块的相应的氨基酸残基，其对折叠的拓扑结构有贡献，即其对所述重复序列单元(或模块)的折叠部分有贡献或其对相邻单元(或模块)的相互作用有贡献。这样的贡献可能为与在重复序列单元(或模块)的其它残基的相互作用，或如在α螺旋或β折叠，或氨基酸段形成线性多肽或环中发现的对多肽骨架的构象的影响。
术语“靶向相互作用残基”指的是重复序列单元的氨基酸残基或重复序列模块的相应的氨基酸残基，其对与靶物质的相互作用有贡献。这种贡献可能是与靶物质的直接的相互作用，或在其它直接相互作用的残基上的影响，例如，通过稳定重复序列单元(或模块)的多肽的构象以使直接相互作用的残基与所述靶能够或增强相互作用。这样的框架和靶相互作用残基可以通过分析用物理化学方法，比如X射线晶体学、NMR和/或CD光谱获得的结构数据，或者通过与结构生物学和/或生物信息学的从事者周知的已知的和相关的结构信息的比较来识别。
优选地，用于推断重复序列基序的重复序列单元是同源的重复序列单元，其中该重复序列单元包含相同的结构基序，并且其中重复序列单元70％以上的框架残基是彼此同源的。优选地，重复序列单元80％以上的框架残基是彼此同源的。最优选地，重复序列单元90％以上的框架残基是彼此同源的。本领域技术人员知晓确定多肽之间的同源百分比的计算机程序，比如FASTA、BLAST或间Gap。进一步优选地，用于推断重复序列基序的重复序列单元是从确定的靶上选择的重复序列结构域获得的同源重复序列单元。
术语“重复序列基序”是指由一个或多个重复序列单元或重复序列模块推导出的氨基酸序列。优选地，所述重复序列单元或重复序列模块来自对相同靶具有结合特异性的重复序列结构域。这样的重复序列基序包括框架残基位置和靶相互作用残基位置。所述框架残基位置对应重复序列单元(或模块)的框架残基的位置。同样地，所述靶相互作用残基位置对应重复序列单元(或模块)的靶相互作用残基的位置。重复序列基序包含固定位置和随机位置。术语“固定位置”指的是氨基酸在重复序列基序的位置，其中所述位置被设定为特定的氨基酸。多数情况下，这样的固定位置与对特定靶有特异性的框架残基的位置和/或靶相互作用残基的位置是对应的。术语“随机位置”指的是氨基酸在重复序列基序的位置，其中，在所述氨基酸位置可以允许两个或多个氨基酸，例如，其中允许二十种天然存在的常见氨基酸中的任何一种，或者其中允许二十种天然存在的氨基酸中大多数，比如，除半胱氨酸以外的氨基酸，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。多数情况下，这样的随机位置对应靶相互作用残基的位置。然而，框架残基的一些位置也可以是随机化的。
术语“折叠拓扑结构”是指所述重复序列单元或重复序列模块的三级结构。折叠拓扑结构由形成至少部分α螺旋或β折叠的一段氨基酸，或形成线性多肽或环，或α螺旋、β折叠和/或线性多肽/环的任意组合的氨基酸段确定。例如，锚蛋白重复序列单元/模块由β转角，接着两个反平行的α螺旋和到达下一个重复序列单元/模块的转角的环组成。
术语“连续的”指的是排列，其中重复序列单元或重复序列模块串联排列。在设计的重复序列蛋白中，有至少2个，通常约2至6个，特别是至少约6，经常20个或更多个重复序列单元(或模块)。在多数情况下，重复序列结构域的重复序列单元(或模块)将呈现高度的序列一致性(在对应位置的氨基酸残基相同)，或序列相似性(氨基酸残基不同，但具有相似的物理化学性质)，并且一些氨基酸残基可能是高度保守的关键残基。然而，只要保持重复序列单元(或模块)的共同的折叠拓扑结构，通过在不同的重复序列单元(或模块)之间插入和/或缺失和/或取代氨基酸，高度的序列变异性也是可能的。
本领域技术人员周知通过物理化学方法如X射线晶体学，核磁共振或CD光谱直接确定重复序列蛋白的折叠拓扑结构的方法。识别并确定重复序列单元或重复序列基序或用于识别包含这样的重复序列单元或基序的相关蛋白质的家族的方法，例如，同源性检索(BLAST等)，已生物信息学领域建立完善，并且被本领域技术人员周知。改进最初的重复序列基序的步骤可包括迭代过程。
术语“重复序列模块”指的是设计的重复序列结构域的重复序列的氨基酸序列，其最初来源于天然存在的重复序列蛋白的重复序列单元。包含在重复序列结构域的每个重复序列模块来源于天然存在的重复序列蛋白的家族或亚家族(例如，犰狳重复序列蛋白或锚蛋白重复序列蛋白的家族)的一个或多个重复序列单元。进一步优选地，包含在重复序列结构域的每个重复序列模块包括重复序列基序，该重复序列基序由从在靶上选择的重复序列结构域获得的同源重复序列单元(例如，如实施例1所述)推导出并具有相同靶特异性的。
因此，术语“锚蛋白重复序列模块”指的重复序列模块，其最初来源于天然存在的锚蛋白重复序列蛋白的重复序列单元。本领域技术人员周知锚蛋白重复序列蛋白。
“重复序列模块”可以包括氨基酸残基存在于相应的重复序列模块的所有拷贝中的位置(“固定位置”)和不同的或“随机”的氨基酸残基的位置(“随机位置”)。
术语“加帽模块”指的是融合至重复序列结构域的N端或C端重复序列模块的多肽，其中所述加帽模块形成紧密的三级相互作用(即，三级结构的相互作用)，并且因此所述重复序列模块在不与连续的重复序列模块接触的一侧提供使所述重复序列模块的疏水核心与溶剂隔离的帽。所述N端和/或C端加帽模块可以为，或可以来源于，在天然存在的重复序列蛋白中发现的邻近重复序列单元的加帽单元或其它结构单元。术语“加帽单元”指的是天然存在的折叠的多肽，其中所述多肽限定特定的结构单元，该特定的结构单元的N或C融合至重复序列单元，其中所述多肽形成紧密的三级结构相互作用，并且因此所述重复序列单元提供使在一侧的所述重复序列单元的疏水核心与溶剂隔离的帽。优选地，加帽模块或加帽单元为加帽重复序列。术语“加帽重复序列”中的是与所述相邻重复序列单元(模块)具有相似或相同的折叠和/或与相邻重复序列单元(或模块)具有序列相似性的重复序列单元(或模块)。WO 2002/020565和Interlandi等人,2008(同上)描述了加帽模块和加帽重复序列。
N端锚蛋白加帽模块(即，N端加帽重复序列)的例子为SEQ ID NO:1、2、3、13、14、20、26、27、36、40、44、45、50、54、124、128和132，并且C端加帽重复序列模块(即，C端加帽重复序列)的例子为SEQ ID NO:4、5、19、24、25、33、34、35、39、43、48、49、53、57、127、131和135。
例如，SEQ ID NO：13的N端锚蛋白加帽模块由位置1至32的氨基酸编码并且SEQ ID NO：19的C端加帽模块由位置99至126的氨基酸编码。
根据本发明的重组结合蛋白包含至少一个锚蛋白重复序列结构域，其中所述锚蛋白重复序列结构域对哺乳动物的HER2胞外区具有结合特异性。
术语“对靶具有结合特异性”、“特异性结合至靶”或“靶特异性”等等意为结合蛋白或结合结构域在PBS以比结合至不相关蛋白，比如大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)低的解离常数结合至靶。优选地，对于靶，PBS中的解离常数比对于MBP相应的解离常数低至少10倍，更优选至少102倍，甚至更优选至少103倍，或最优选至少104倍。
术语“共有序列”是指氨基酸序列，其中通过多个重复序列单元的结构和/或序列比对获得所述共有序列。使用两个或多个结构和/或序列比对的重复序列单元，并在比对中允许间隙，有可能确定各位置上最频繁的氨基酸残基。共有序列是包含最频繁表现在各位置的氨基酸的序列。两个或更多个氨基酸在单个位置以高于平均值表现的情况下，共有序列可包括的那些氨基酸的分组。所述两个或更多个重复序列单元可以取自包括在单一的重复序列蛋白的重复序列单位，或取自两个或更多个不同的重复序列蛋白。
本领域技术人员周知共有序列和确定共有序列的方法。
“共有氨基酸残基”为在共有序列中的某位置发现的氨基酸。如果在所述两个或更多个重复序列单元中以相似概率发现2个或更多个，例如，3个、4个或5个氨基酸残基，那么共有氨基酸残基可以为最频繁发现的氨基酸之一，或所述2个或更多个氨基酸残基的结合。
另外优选非天然存在的加帽模块、重复序列模块、结合蛋白或结合结构域。
术语“非天然存在”是指合成的或不是来自自然界的，更具体地，该术语是指人造的。术语“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合结构域”是指所述结合蛋白或所述结合结构域是合成的(即由氨基酸通过化学合成产生的)或重组的，而不是来自自然界。“非天然存在的结合蛋白”或“非天然存在的结合结构域”分别为人造蛋白质或结构域，通过表达相应设计的核酸而获得。优选地，该表达在真核或细菌细胞中，或者利用体外无细胞表达系统进行。此外，该术语意为所述结合蛋白或所述结合结构域的序列在序列数据库(比如，GenBank，EMBL-Bank或SWISS-PROT)中不是作为非人工序列而存在。这些数据库和其它类似的序列数据库是本领域技术人员周知的。
根据本发明的锚蛋白重复序列结构域的一般修饰和衍生物，特别地根据本发明的锚蛋白重复序列模块和加帽模块：
进一步优选分别包含N端或C端锚蛋白加帽重复序列的N端或C端锚蛋白加帽模块，其中在所述加帽重复序列的一个或多个氨基酸残基由相应的锚蛋白加帽单元或锚蛋白重复序列单元的比对上的相应位置发现的氨基酸残基取代。
氨基酸可以被20种天然存在的最常见氨基酸中的任何一种取代，优选被选自A、D、E、F、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W和Y，更优选被选自A、D、E、H、I、K、L、Q、R、S、T、V，和Y的氨基酸取代。而且优选地，氨基酸被同源氨基酸取代，即氨基酸被侧链具有相似生物物理学性质的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸D可以被带负电的氨基酸E取代，或疏水氨基酸比如，L可以被A、I或V取代。氨基酸被同源氨基酸取代是本领域技术人员周知的。
而且优选C端锚蛋白加帽模块，其包含基于SEQ ID NO:4、5、19、24、25、33、34、35、39、43、48、49、53、57、127、131或135的上述C端加帽模块中的任何一个的位置27和28的氨基酸A。
而且优选C端锚蛋白加帽模块，其包含基于SEQ ID NO:4、5、19、24、25、33、34、35、39、43、48、49、53、57、127、131或135的上述C端加帽模块中的任何一个的位置1至26或位置1至27和28的氨基酸。
在不对性质有明显的影响的情况下可以从N端锚蛋白加帽模块移除在SEQID NO:1,2,3,13,14,20,26,27,36,40,44,45,50,54,124,128或132的位置1的G或位置2的S。这2个氨基酸作为接头连接锚蛋白重复序列结构域至另外的氨基酸和蛋白质。本发明也包含这样的锚蛋白重复序列结构域：其包含N端锚蛋白加帽模块，其中移除了在位置1的G和在位置2的S。应该理解，在此定义的锚蛋白重复序列结构域中的氨基酸位置(例如，“位置33”)被相应地调整，导致数字偏移，例如，如果缺失一个氨基酸，“位置33”会变成“位置32”，或者，如果缺失两个氨基酸，“位置33”会变成“位置31”。
本发明的锚蛋白重复序列结构域的锚蛋白加帽模块可以通过本领域技术人员已知的组合技术，比如氨基酸序列比对、诱变和基因合成被锚蛋白加帽模块替换。例如，通过如下步骤，SEQ ID NO:79的C端加帽重复序列被SEQ ID NO:5的C端加帽重复序列取代：(i)通过与SEQ ID NO:5进行序列比对确定SEQ IDNO:79的C端加帽重复序列(即，序列位置99至126)，(ii)用SEQ ID NO:5的序列取代确定的SEQ ID NO:79的C端加帽重复序列的序列，(iii)产生编码重复序列结构域的基因，所述重复序列结构域编码替换后的C端加帽模块，(iv)在大肠杆菌的细胞质中表达修饰的重复序列结构域并且(v)通过标准手段纯化修饰的重复序列结构域。作为另外的实施例，SEQ ID NO:79的N端加帽重复序列可以通过如下步骤被SEQ ID NO:3的N端加帽重复序列取代：通过与SEQ ID NO:3进行序列比对确定SEQ ID NO:79的N端加帽重复序列(即，序列位置1至32)(ii)用SEQ ID NO:3取代确定的SEQ ID NO:79的N加帽重复序列的序列，(iii)产生编码重复序列结构域的基因，所述重复序列结构域编码替换后的N端加帽模块，(iv)在大肠杆菌的细胞质中表达修饰的重复序列结构域并且(v)通过标准手段纯化修饰的重复序列结构域。
此外，可以通过基因技术合成，组装N端锚蛋白加帽模块(例如，SEQ ID NO:3的N端加帽重复序列)，接着一个或更多个重复序列模块(例如，2个包含来自SEQ ID NO:79的位置33至99的氨基酸残基的锚蛋白重复序列模块)和C端加帽模块(例如，SEQ ID NO:5的C端加帽重复序列)，从基因方面构建本发明的锚蛋白重复序列结构域。接着可以在大肠杆菌中表达通过基因技术组装成的重复序列结构域基因。
此外优选氨基酸序列缺失氨基酸C、M或N的重组结合蛋白、重复序列结构域、重复序列模块、N端加帽模块或C端加帽模块。
此外优选氨基酸序列缺失氨基酸N(紧接G)的重组结合蛋白、重复序列结构域、重复序列模块、N端加帽模块或C端加帽模块。
此外优选包含任何这样的N端或C端加帽模块的重组结合蛋白或重复序列结构域。
在包含根据本发明的锚蛋白重复序列结构域的重组结合蛋白的另外的优选实施例中，所述重复序列结构域的N端加帽模块的一个或更多个氨基酸残基被在N端加帽单元的比对上的相应位置处发现的氨基酸残基替换。优选地，高达30％的氨基酸残基被替换，更优选地，高达20％，并且甚至更优选地，高达10％的氨基酸残基被替换。最优选地，这样的N端加帽单元为天然存在的N端加帽单元。
在包含根据本发明的锚蛋白重复序列结构域的重组结合蛋白的另外的优选实施例中，所述重复序列结构域的C端加帽模块的一个或更多个氨基酸残基被在C端加帽单元的比对上的相应位置处发现的氨基酸残基替换。优选地，高达30％的氨基酸残基被替换，更优选地，高达20％，并且甚至更优选地，高达10％的氨基酸残基被替换。最优选地，这样的C端加帽单元为天然存在的C端加帽单元。
在又一特定实施例中，高达30％的氨基酸残基，更优选地，高达20％，并且甚至更优选地，高达10％的氨基酸残基被在重复序列单元、N端加帽单元或C端加帽单元的相应位置中没有发现的氨基酸替换。
在包含根据本发明的锚蛋白重复序列结构域的重组结合蛋白的另外的优选实施例中，所述锚蛋白重复序列结构域的重复序列模块的一个或更多个氨基酸残基被在重复序列单元的比对上的相应位置处发现的氨基酸残基替换。优选地，高达30％的氨基酸残基被替换，更优选地，高达20％，并且甚至更优选地，高达10％的氨基酸残基被替换。最优选地，这样的重复序列单元为天然存在的重复序列单元。
在又一特定实施例中，高达30％的氨基酸残基，更优选地，高达20％，并且甚至更优选地，高达10％的氨基酸残基被在重复序列单元的相应位置中没有发现的氨基酸替换。
在另外的实施例中，在此所述的任何结合HER2的重组蛋白或结构域可以共价绑定至一个或多个另外的部分，包括，例如，结合至不同靶以产生双特异性结合试剂的部分、生物活性化合物、标记部分(例如，荧光标记，如荧光素，或放射性示踪剂)、便于蛋白纯化的部分(例如，小肽标记，比如His或Strep标签)，为提高治疗效果提供效应子功能的部分(例如，抗体的Fc部分提供抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用、有毒的蛋白部分比如铜绿假单胞菌外毒素A(ETA)或小分子毒剂比如美登木素生物碱或DNA烷化剂)或提供改善的药物动力学的部分。可以根据感知的治疗需要评估改善的药物动力学。通常，理想的是(有可能通过增加服药后蛋白质保持在血清中的时间)增加生物利用度和/或增加剂量之间的时间。在某些情况下，理想的是改善蛋白质的血清浓度随时间的持续性(例如，降低蛋白质血清在服用后不久的浓度和在下一次服用前不久的浓度之间的浓度差异)。倾向于使从血液中清除蛋白质变慢的部分包括羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、糖(例如，唾液酸)，耐受性良好的蛋白质部分(例如，Fc片段或血清白蛋白)，和对丰富的血清蛋白具有特异性和亲和力的结合结构域或肽，例如，抗体的Fc片段或血清白蛋白。WO 2012/069654中提供了这些对血清白蛋白具有亲和力的结合结构域或重复序列结构域的例子。本发明的重组结合蛋白可以连接至使哺乳动物(例如，大鼠、小鼠，或人)中多肽的清除率相对未修饰的多肽降低大于3倍的部分。
在一个特定的实施例中，本发明涉及包含结合至HER2的第一重复序列结构域、结合至HER2的第二重复序列结构域，并且进一步包含特异性结合至人血清白蛋白的一个或更多个锚蛋白重复序列结构域的重组结合蛋白。在此给出了对HER2具有特异性的重复序列结构域的例子并且WO 2012/069654中描述了对人血清白蛋白具有特异性的锚蛋白重复序列结构域的例子。这些结构域可以通过本领域技术人员已知的方法、通过遗传手段由多肽接头连接。
另一优选的实施例时重组结合蛋白，其中第一重复序列结构域和第二重复序列结构域为锚蛋白重复序列结构域，该锚蛋白重复序列结构域对HER2具有结合特异性，包含1个、2个、3个或更多个参与结合至HER2的内部重复序列模块。优选地，这些锚蛋白重复序列结构域包含N端加帽模块，一至四个内部重复序列模块，和C端加帽模块。优选地，所述加帽模块为加帽重复序列。而且优选地，所述加帽模块将参与结合至HER2。
此外，为了治疗病症考虑上述的任何药物组合物。
本发明进一步提供治疗方法。该方法包括使有需要的患者服用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白。
此外，考虑治疗包括人的哺乳动物的病理状态的方法，包括使有需要的患者服用有效量的上述药物组合物。
实施例
下文公开的所有的起始原料和试剂是本领域技术人员已知并且是市售的或者可以利用公知的技术来制备的。
材料
化学制品购自Fluka(瑞士)。寡核苷酸来自Microsynth(瑞士)。除非另有说明，DNA聚合酶，限制性内切酶和缓冲液来自New England Biolabs(USA)或Fermentas(立陶宛)。克隆和蛋白质生产菌株是E.coli XL1-blue(Stratagene,USA)或BL21(Novagen,USA)。重组人HER2胞外域(通过标准手段在CHO细胞中产生的ErbB2S22-N530-Flag和ErbB2S22-E645-Flag)购自CSIRO Enquiries(澳大利亚)。生物素化的HER2胞外域使用标准生物素化试剂和方法通过将生物素部分连接至蛋白质的伯胺以化学方法获得(Pierce,USA)。细胞系购自LGC/ATCC(法国/USA；商品目录号：BT474-HTB-20、SKBR-3–HTB-30、NCI-N87–CRL5822、ZR75-30–CRL1504、HCC1419-CRL2326、MDA-MB175VII–HTB-25)。细胞培养基来自Invitrogen/Lubio(瑞士)。胎牛血清来自PAA。检测细胞增殖、细胞增殖ELISA的分析试剂，BrdU(色度)(商品目录号：G8091)来自Roche，瑞士并且检测凋亡的分析试剂，Caspase Glo 3/7(商品目录号：1164722900)来自Promega和瑞士并且Cell Death Detection ELISAPLUS系统(11774425001)来自Roche，瑞士。细胞转染试剂，Lipofectamin2000(11668027)是来自Invitrogen瑞士。使用来自Becton-Dickinson(瑞士)的FACS Canto II系统进行FACS分析。利用anti-Penta-His Alexa Fluor 647轭合物(商品目录号：A21445；Lubio，瑞士)检测DARPins与Her2的结合。Accutase(商品目录号：L-11-007)来自PAA。曲妥珠单抗购自Kantonal Apotheke苏黎世，并且帕妥珠单抗由Evitra(瑞士)合成。GFP-标记的Her2的表达载体(商品目录号：RG212583)来自OrigeneUSA。
分子生物学
除非另有说明，方法是按照(Sambrook J.,Fritsch E.F.和Maniatis T.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory 1989,New York)所述方案进行的。
Proliferation analysis
增殖分析
利用BrdU标记(BrdU，细胞增殖ELISA,Roche)通过测量DNA合成确定DARPin对细胞增殖的影响。简要地说，在96孔板的每孔中将10000BT474细胞接种在100ul完全培养基中并培养24小时。加入DARPin和基准，再培养72小时。加入用于细胞标记的BrdU，最后培养24小时。根据制造方案检测标记的(增殖的)细胞。用GraphPad Prism软件分析数据，以x轴上的log[c]对y轴上的OD450-602nm进行绘图。使用非线性回归拟合(log(拮抗剂)vs.反应—可变斜率(4个参数))对数据进行拟合。
凋亡分析
使用Caspase 3/7-Glo系统(Promega，瑞士)测量Caspase3/7的激活确定DARPin对凋亡的诱导。简要地说，在96孔板的每孔中将10000BT474细胞接种在100ul完全培养基中并培养24小时。加入DARPin和基准，保持另外的24小时。根据制造方案加入Caspase Glo试剂，保持1h。通过测量荧光素酶活性监测Caspase 3/7活性。
可代替地，使用Cell Death Detection ELISAPLUS系统(Roche，瑞士)确定对凋亡的诱导。根据制造方案进行该试验。细胞数目和培养时间与Caspase Glo读数相似。
使用GraphPad prism软件分析数据，以x轴上的浓度对y轴上的OD405/490nm或RLU进行绘图。使用非线性回归拟合(log(激动剂)vs.反应—可变斜率(4个参数))对数据进行拟合。
设计的锚蛋白重复序列蛋白文库
(WO 2002/020565；Binz等人.2003,同上；Binz等人.2004,同上)描述了产生设计的锚蛋白重复序列蛋白文库的方法。通过这种方法，可以构建具有随机锚蛋白重复序列模块和/或随机加帽模块的锚蛋白重复序列蛋白文库。例如，可以基于固定的N端加帽模块(例如，SEQ ID NO:2的N端加帽模块)或根据SEQID NO:60的序列基序的随机的N端加帽模块，根据SEQ ID NO:58或59的序列基序的一个或更多个随机的重复序列模块，和固定的C端加帽模块(例如，SEQ ID NO:5的C端加帽模块)或根据SEQ ID NO:61的序列基序的随机的C端加帽模块组装这些文库。优选地，这些文库组装成在重复序列或加帽模块的随机位置不具有氨基酸C、G、M、N(在G残基前面)或P。此外，根据SEQ IDNO:58或59的序列基序的随机重复序列模块在位置10和/或位置17可进一步随机化；根据SEQ ID NO:60的序列基序的随机的N端加帽模块在位置7和/或位置9可进一步随机化；并且根据SEQ ID NO:61的序列基序的随机的C端加帽模块在位置10、11和/或17可进一步随机化。
此外，在这些文库中的这些随机模块可以包含在随机的氨基酸位置的另外的多肽环插入物。这些多肽环插入物为抗体的互补决定区(CDR)环文库或再次产生的肽文库。例如，可以利用人核糖核酸酶L的N端锚蛋白重复序列结构域的结构(Tanaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)作为引导设计这种环插入物。类似10个氨基酸插入到存在于2个锚蛋白重复序列的边界附近的β转角的锚蛋白重复序列结构域，锚蛋白重复序列蛋白文库可以含有插入锚蛋白重复序列结构域的一个或更多个β转角的、长度可变(例如，1至20个氨基酸)的随机环(具有固定的和随机的位置)。
任何这样的锚蛋白重复序列蛋白文库的N端加帽模块优选具有RELLKA或RILKAA基序而非RILLAA基序(例如，存在于SEQ ID NO:65的位置21至26)并且任何这样的锚蛋白重复序列蛋白文库的C端加帽模块优选具有KAA或KLA基序而非KLN基序(例如，SEQ ID NO:65的最后3个氨基酸)。
这种锚蛋白重复序列蛋白文库的设计可以通过与靶相互作用的锚蛋白重复序列结构域的已知结构来引导。这些结构(通过其Protein Data Bank(PDB)唯一登录号或识别代码(PDB-IDs)识别)的例子为1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70和2ZGD。
(WO 2002/020565；Binz等人.2003,同上；Binz等人.2004,同上)描述了设计的锚蛋白重复序列蛋白文库的例子，比如N2C和N3C设计的锚蛋白重复序列蛋白文库。N2C和N3C中的数字描述在N端和C端加帽模块之间存在的随机重复序列模块的数目。
用于定义重复序列单元和模块内的位置的命名法基于Binz等人.2004,同上，修饰锚蛋白重复序列模块的边界，并且锚蛋白重复序列单元通过一个氨基酸位置移位。例如，Binz等人2004(同上)的锚蛋白重复序列模块的位置1对应本发明的锚蛋白重复序列模块的位置2，并且因此Binz等人.2004，同上，的锚蛋白重复序列模块的位置33对应本发明的锚蛋白重复序列模块的位置1。
通过测序确定所有的DNA序列，并且通过质谱法确定所有所述蛋白的计算的分子量
实施例1：筛选包含对HER2具有结合特异性的锚蛋白重复序列结构域的结合蛋白
如Binz等人2004(同上)所述，利用核糖体展示技术(Hanes,J.和Plückthun,A.,PNAS 94,4937-42,1997)从DARPin文库筛选许多对HER2胞外域具有结合特异性的设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)。通过指示筛选成百上千的HER2特异性结合蛋白的粗提物ELISA(参见下文)评价结合特异性。通过测试双特异性DARPin抑制BT474细胞增殖的能力测量选定的克隆对增殖的HER2特异性抑制和对凋亡的诱导。
例如，SEQ ID NO:62至82、112至121的锚蛋白重复序列结构域构成包含对HER2具有结合特异性的锚蛋白重复序列结构域的选定的结合蛋白的氨基酸序列。SEQ ID NO:15至18、21至23、28至32、37、38、41、42、46、47、51、52、55、56、125、126、129、130、133和134提供来自这些对HER2具有结合特异性的锚蛋白重复序列结构域的单独的锚蛋白重复序列模块。SEQ ID NO:13、14、19、20、24至27、33至36、39、40、43至45、48至50、53、54、57、124、127、128、131、132和135提供对HER2具有结合特异性的这些锚蛋白重复序列结构域的单独的加帽模块。
通过核糖体展示技术筛选HER2特异性锚蛋白重复序列蛋白
利用人HER2作为靶蛋白，上述的设计的锚蛋白重复序列蛋白文库和已定方案(Zahnd,C.,Amstutz,P.和Plückthun,A.,Nat.Methods 4,69-79,2007)通过核糖体展示技术(Hanes,J.和Plückthun,同上)进行HER2特异性锚蛋白重复序列蛋白的筛选。每轮筛选之后，逆转录(RT)-PCR循环数从45不断下降至30，因结合物的富集调整产量。前四轮筛选采用标准的核糖体展示筛选，利用下降的靶浓度和增加的洗涤严格度以从第一轮至第四轮增加筛选压力。为了富集高亲和力的抗HER2 DARPin，将来自标准核糖体展示筛选(上文)的第四轮的产物进行解离速率筛选回合并且增加筛选严格度(Zahnd,2007,同上)。进行最后的标准筛选回合以扩增并恢复解离速率筛选的结合蛋白。
如粗提物ELISA所示筛选特异性结合至HER2的克隆
根据标准方案利用DARPin表达细胞的大肠杆菌粗提物通过酶联免疫吸附测定(ELISA)识别特异性结合HER2胞外域的单独筛选出的DARPin。将由核糖体展示技术筛选出的DARPin克隆到pQE30(Qiagen)表达载体中，转化到E.coliXL1-Blue(Stratagene)，接着在含有1ml生长培养基(含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2YT)的96深孔板中(每个克隆单个孔)37℃过夜生长。将100μl过夜培养物与含有50μg/ml氨苄青霉素的1ml新鲜2YT接种到新的96深孔板中培养。在37℃中培养2h之后，用IPTG(终浓度1mM)诱导表达并且持续3h。收集细胞，重新悬浮在100μl B-PERII(Pierce)中并且在室温下培养并摇晃15min。接着，加入900μl PBS-TC(补充0.25％酪蛋白水解物,0.1％TweenpH 7.4的PBS)并且通过离心移除细胞碎片。将100μl每个裂解克隆应用于含有HER2或通过其生物素部分固定的不相关MBP的Neutravidin coated MaxiSorp板的孔中并在RT下培养1h。用PBS-T(补充0.1％TweenpH 7.4的PBS)充分洗涤之后，利用辣根标记的抗RGS(His)4单克隆抗体(34650,Qiagen)以标准ELISA程序展开该板，接着用POD底物(Roche)检测结合。在405nm测量显色。通过这种细胞粗提物ELISA筛选几百个克隆揭示超过百种不同的DARPins对HER2具有特异性。选择这些结合蛋白用于进一步分析。SEQ ID NO:62至82和112至121提供了特异性结合至HER2胞外域的选定的锚蛋白重复序列结构域的氨基酸序列的例子。
将这些对HER2具有结合特异性的锚蛋白重复序列结构域和对HER2没有结合特异性的负对照锚蛋白重复序列结构域(即，SEQ ID NO:111)克隆到基于pQE(QIAgen,Germany)的表达载体(如下所述，提供N端His标签以便于简化蛋白质纯化)中。从而构建编码下面的DARPin的表达载体。
DARPin#1(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:62)；
DARPin#2(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:63)；
DARPin#3(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:64)；
DARPin#5(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:66)；
DARPin#6(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:67)；
DARPin#7(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:68)；
DARPin#8(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:69)；
DARPin#9(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:70)；
DARPin#10(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:71)；
DARPin#11(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:72)；
DARPin#12(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:73)；
DARPin#13(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:74)；
DARPin#14(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:75)；
DARPin#15(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:76)；
DARPin#16(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:77)；
DARPin#17(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:78)；
DARPin#18(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:79)；
DARPin#19(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:80)；
DARPin#20(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:81)；
DARPin#21(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:82)；
DARPin#50(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:111).
DARPin#51(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:112)；
DARPin#52(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:113)；
DARPin#53(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:114)；
DARPin#54(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:115)；
DARPin#55(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:116)；
DARPin#56(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:117)；
DARPin#57(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:118)；
DARPin#58(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:119)；
DARPin#59(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:120)；
DARPin#60(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:121)。
SEQ ID NO:83至110、122、123和136至141提供筛选出的双特异性锚蛋白重复序列蛋白的氨基酸序列的例子。将这些双特异性DARPin克隆到基于pQE(QIAgen,Germany)的表达载体(如下所述，提供N端His标签以便于简化蛋白质纯化)中。从而构建编码下面的DARPin的表达载体。
DARPin#22(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:83)；
DARPin#23(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:84)；
DARPin#24(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:85)；
DARPin#25(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:86)；
DARPin#26(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:87)；
DARPin#27(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:88)；
DARPin#28(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:89)；
DARPin#29(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:90)；
DARPin#30(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:91)；
DARPin#31(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:92)；
DARPin#32(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:93)；
DARPin#33(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:94)；
DARPin#34(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:95)；
DARPin#35(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:96)；
DARPin#36(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:97)；
DARPin#37(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:98)；
DARPin#38(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:99)；
DARPin#39(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:100)；
DARPin#40(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:101)；
DARPin#41(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:102)；
DARPin#42(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:103)；
DARPin#43(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:104)；
DARPin#44(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:105)；
DARPin#45(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:106)；
DARPin#46(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:107)；
DARPin#47(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:108)；
DARPin#48(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:109)；
DARPin#49(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:110)
DARPin#61(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:122)；
DARPin#62(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:123)；
DARPin#63(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:136)；
DARPin#64(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:137)；
DARPin#65(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:138)；
DARPin#66(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:139)；
DARPin#67(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:140)；
DARPin#68(His-标签(SEQ ID NO:6)融合至其N端的SEQ ID NO:141).
单价DARPin的高水平和可溶表达
为了进一步分析，在E.coli BL21或XL1-Blue细胞中表达DARPins#1至50并利用标准方案通过其His标签纯化。将25ml静止过夜培养物(LB，1％葡萄糖，100mg/l氨苄青霉素的；37℃)用于接种到1l培养物(相同的培养基)中。在600nm,吸光度为0.7，用0.5mM IPTG诱导培养物并在37℃培养4-5h。将培养物离心并且将得到的团块重新悬浮在40ml TBS500(50mM Tris–HCl,500mM NaCl,pH 8)中并进行超声处理。将裂解产物离心并且将甘油(终浓度10％(v/v))和咪唑(终浓度20mM)加入所得的上清液中。根据制造商的指示(QIAgen,德国)在镍-氨次氮基三乙酸柱(2.5ml柱容积)上纯化蛋白。可代替地，根据本领域技术人员已知的标准树脂和方案，通过阴离子交换色谱，接着通过体积排阻色谱纯化缺乏6xHis标签的DARPin或选定的重复序列结构域。从SDS-15％PAGE估计，1升大肠杆菌培养物可以纯化出高达200mg对HER2具有结合特异性的高度可溶的DARPin，并且纯度>95％。这样纯化的DARPin用于进一步表征。
实施例2：通过表面等离子体共振分析表征对HER2具有结合特异性的DARPin
通过表面等离子体共振(SPR)分析和ProteOn阵列系统(BioRad)检验纯化的、结合HER2的感兴趣的DARPin的蛋白结合动力学，其中ProteOn阵列系统这样设置：通过中和亲和素(neutravidin)固定生物素化的人HER2并且加入游离的单价DARPin测量相互作用。根据标准程序确定Kd值。
通过结合至涂布的链霉亲和素将生物素化的人HER2分子的胞外域固定在流动池中，并且分析与各种选定的DARPin的相互作用。
表面等离子体共振(SPR)分析
利用ProteOn仪(BioRad)测量SPR并且根据本领域技术人员已知的标准程序进行测量。运行缓冲液为PBS,pH 7.4，其含有0.005％Tween中和亲和素通过共价键固定在GLC芯片(BioRad)上，达到约8000个共振单位(RU)的水平。接着，将HER2固定在涂布中和亲和素的芯片上。然后，通过如下方式测量DARPin HER2的相互作用：注入100μl含连续稀释的DARPin(浓度为50、25、12.5、6.25和3.125nM)的运行缓冲液(含有0.005％的PBS)(基于速率测量)，接着，使运行缓冲液以100μl/min的恒定流速流动10分钟至最多3小时(解离速率测量)。从注入HER2之后获得的RU踪迹(双参考)中去除未涂布的参考细胞和参考注入物(即，仅注入运行缓冲液)的信号(即，共振单元(RU)值)。从结合速率测量和解离速率测量获得的SRP踪迹可以确定相应的DARPin HER2相互作用的结合速率和解离速率。
表1总结了结果。利用本领域技术人员已知的标准程序由预计的结合速率和解离速率计算解离常数(Kd)。
表1:通过SPR确定的选定用于人HER2的DARPin的解离常数
n.d.:未确定。
实施例3：绘制结合至特定的胞外HER2表位的重复序列结构域的图谱
通过本领域技术人员已知的标准方法，分析重复序列结构域与胞外HER2结构域的相互作用，比如，通过X射线结晶技术或NMR光谱法分析复合物四级结构，或利用潜在的相互作用的残基的丙氨酸突变或利用质谱法和共价标记进行表位绘图。此外，进行本领域从事者已知的各种竞争试验，比如竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)以识别选定的重复序列蛋白结合的胞外结构域或者其是否具有与其它结合蛋白(例如，抗体，比如曲妥珠单抗或帕妥珠单抗)重叠的在HER2的胞外结构域上的表位。
HER2的胞外结构域通过购买得到或如(Jost等人,同上)所述制备得到。
通过表面等离子体共振(SPR)分析和ProteOn阵列系统(BioRad)进行结合HER2的、感兴趣的纯化的DARPin的竞争，ProteOn阵列系统使用如下设置：生物素化人ErbB2S22-N530和ErbB2S22-E645通过中和亲和素固定，并且通过加入饱和状态(1uM)的第一单价DARPin，接着加入第一和第二DARPin(各100uM)的1:1混合物，测量竞争。如果尽管存在第一DARPin，第二DARPin仍结合，则该第二DARPin被认为结合不同的表位。
例如，竞争ELISA(图1A和1B)数据表明DARPin#54结合HER2的结构域II并且DARPin#51结合HER2的结构域I。先前已表明DARPin#18结合至HER2的结构域IV(Jost等人,同上)。所述DARPins(20nM)与HER2域I，结构域I-III或域III-IV(在每种情况下结构域浓度为500nm)在PBS中室温预培养45分钟。将混合物加入涂布在F96MaxiSorb Nunc(商品目录号442404)板的20nM全长HER2中。使用小鼠抗RGS-His单克隆抗体(Qiagen，商品目录号34650)作为第一抗体并且用辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体(Pierce，商品目录号31438)作为第二抗体特异性检测结合的DARPins。在图1B描述的ELISA中，第一抗体(小鼠抗RGS-His单克隆抗体)被小鼠抗DARPin单克隆抗体代替。
在450nm下进行读数。除了涂板(利用PBS，pH 7.4在4℃过夜进行)之外，所有的培养步骤在含有0.1％Tween和0.25％酪蛋白，pH7.4的PBS中、450rpm Heidolph Titramax 1000摇床上室温下进行2h。
这些研究结果得到了确认：通过流式细胞术(FACS)确定，这些DARPin已竞争结合至具有HER2重组结构域I、结构域I-II-III和结构域III-IV的HER2过表达细胞(BT474)。DARPins(100nM)与单独的Her2构建体(1uM)在25℃预培养30分钟。将混合物施加在细胞(100ul中100.000个细胞)中，在冰上保持20分钟。利用Alexa 647标记的抗5-His抗体(Qiagen商品目录号：35370)监测DARPin与细胞的结合。该试验确定DARPin#51结合至HER2的结构域I，并且DARPin#1结合至HER2的II，DARPin#18结合至HER2的IV。
还利用流式细胞仪测试DARPin#1与帕妥珠单抗和DARPin#18与曲妥珠单抗的竞争。为此，在与各DARPin(1uM)一起培养之前，将BT474细胞分别与帕妥珠单抗、曲妥珠单抗(两者都为1uM)一起培养。利用Alexa 647标记的抗5-His抗体(Qiagen商品目录号：35370)监测DARPin与细胞的结合，并且利用Alexa 546标记的抗人-lgG抗体(Invitrogen商品目录号：A-21089)监测帕妥珠单抗或曲妥珠单抗与细胞的结合。该实验展示了DARPin都不与帕妥珠单抗或曲妥珠单抗竞争结合至BT474细胞表达的HER2。
也通过ELISA(图1C)观察该研究结果，其中在与各DARPin(20nM)一起培养之前，将帕妥珠单抗(以20nM涂布在F96 MaxiSorb Nunc(商品目录号442404)上)与20nM Her2(结构域I-IIII)一起预培养。利用小鼠抗RGS-His单克隆抗体(Qiagen,商品目录号34650)和辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体(Pierce,商品目录号31438)(在室温下预混合45min)检测DARPin在HER2-帕妥珠单抗复合物上的特异性结合。除了涂板(在4℃过夜进行)之外，所有的培养步骤在450rpm Heidolph Titramax 1000摇床上室温下进行2h。PBS，0.1％TweenpH7.4、0.25％酪蛋白用作阻断剂。在帕妥珠单抗存在的情况下，该试验中测试的所有N端DARPin(DARPin#7、DARPin#52、DARPin#53，和DARPin#54)结合HER2，表明N端DARPin都结合与该抗体不同的表位。
总的来说，这些实验表明SEQ ID NO:62至68、72，和114至121编码的单价重复序列结构域结合至HER2的结构域II，SEQ ID NO:69-71、73、112和113编码的单价重复序列结构域结合至HER2的结构域I，并且SEQ ID NO:74至82编码的单价重复序列结构域结合至HER2的结构域IV。结合至HER2的结构域II的单价重复序列结构域(SEQ ID NO:62至68、72，和114至121)都不与帕妥珠单抗竞争结合至HER2。在结合至HER2的结构域IV的单价重复序列结构域中，SEQ ID NO:77、78和82编码的重复序列结构域与曲妥珠单抗竞争结合至HER2，而SEC ID NO:74至76和79至81编码的重复序列结构域不与曲妥珠单抗竞争。
实施例4：结合HER2的双特异性DARPin阻断过度表达HER2的肿瘤细胞的生长
测试单价DARPin、DARPin的混合物和结合HER2的双特异性DARPin对BT474细胞增殖的抑制。图2展示了单价DARPin和单价DARPin的混合物不能阻断BT474细胞增殖。相反，双特异性DARPin分组诱导对增殖的抑制(图2，表2)。有趣的是，DARPin HER2的重复序列结构域IV必须位于分子的C端(图2)。双特异性形式的单价DARPin的多个组合导致对增殖有抑制作用的DARPin。但是并非所有的组合都能将阻断90-100％的BT474增殖(图3)，这使某些DARPin组合得以归类。这些研究结果表明双特异性形式是有效实现靶向不同分组的某些HER2表位的关键。通过曲妥珠单抗诱导HER2受体内在化和降解(据报道)不足以诱导对肿瘤细胞增殖的有效抑制(图3和5)。与曲妥珠单抗类似，DARPin#41和DARPin#43都能诱导HER2的降解，但仅有DARPin，比如DARPin#41抑制肿瘤细胞增殖。
如方法部分所述进行实验。表2总结了实验结果。利用本领域技术人员已知的标准程序由如上所述获得的滴定曲线计算IC50值。图2和3中给出了DARPin#41的滴定曲线例子。
表2:各种DARPin对BTB474细胞增殖的抑制效力
n.i.:未观察到抑制
实施例5：靶向HER2的双特异性DARPin抑制各种HER2过度表达的细胞系的增殖并诱导凋亡
测试双特异性DARPin#41的效力。在过度表达HER2的细胞系而非表达野生型HER2水平的细胞中，该DARPin对增殖的抑制范围为Her2IHC 3+至1+(图4；表3)。此外，在所列举的细胞系中，该DARPin在24h的培养中强劲地诱导凋亡(图5；表3)。
如方法部分所述进行实验。表3总结了实施例结果。利用本领域技术人员已知的标准程序由如上所述获得的滴定曲线计算IC50和EC50值。图4和5中给出了DARPin#41在三个不同细胞系上的滴定曲线例子。取决于测试的DARPin和细胞系，IC50和EC50值的范围在0.2–10nM之间。例如，实验表明DARPin#41、#45和#46在BT474、MDA-MB175和NCI-N87细胞中诱导凋亡(表3)。利用本发明的其它双特异性结合蛋白也获得相似的结果。
表3：:DARPin#41在各种不同的细胞系上的效力
n.a.:未分析
n.i.:无抑制
实施例6：与当前标准护理治疗对比，靶向HER2的双特异性DARPin抑制BT474细胞的增殖并诱导凋亡
比较双特异性DARPin#41的效力与批准用于治疗HER2阳性乳腺癌的药物、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的效力。与曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合相比，该DARPin有效抑制增殖并且诱导凋亡。
如方法部分所述进行实验。图6展示了实施例结果。利用本领域技术人员已知的标准程序由如上所述获得的滴定曲线计算IC50和EC50值(表3)。利用本发明的其它双特异性结合蛋白也获得相似的结果。
实施例7：各种DARPin形式的产生
作为例子，比较不同形式的双特异性DARPin#41和DARPin#41抑制BT474细胞增殖的效力(图7，表2)。N端或C端的聚乙二醇化或融合至结合人血清白蛋白的DARPin(DARPin#41、#63、#64、#65)的行为不影响效力(图7A)。此外，DARPin部分之间的接头的变化不影响效力(图7B)。IC50值范围在1.5–5.5nM之间。利用相应形式的双特异性DARPin#41、#66、#67、#68获得相应的结果。总的来说，这清楚地表明可以(通过本领域技术人员已知的方法，比如聚乙二醇化或融合至结合血清白蛋白的结构域)修饰该双特异性DARPin以增加其体内半衰期而不损失效力。此外，这些实验表明，在双特异性构建体中结合至HER2的两个重复序列结构域之间的接头可以在至少2至24个氨基酸之间变化而不明显影响该双特异性构建体的功效。
实施例8：绘制DARPin/Her2相互作用图谱
通过溶液(即，PBS，pH 7.4)中这两种分子形成的复合物的化学交联，接着用蛋白酶消化该复合物，并且通过质谱法分析得到的多肽，进一步分析本发明的双特异性DARPin与HER2胞外域的相互作用。在这样的实验中，DARPin区域与HER2区域可以通过共价键交联，只要其接近后者。通过质谱法分析对来自与HER2的相应多肽通过共价键交联的DARPin的多肽的检测表明在HER2/DRAPin复合物中这些多肽很接近。本领域技术人员周知这些邻近分析方法(例如，Birch,C.,等人,Anal.Chem.,82,172–179,2010)并且是各种公司提供的服务(例如，CovalX AG,Zürich,瑞士)。
例如，在这些实验中发现，双特异性DARPin#41(其结合HER2的结构域II和结构域IV)可以与HER2形成1：1复合物。令人惊讶地，观察到C端重复序列结构域(结合至HER2的结构域IV)和HER2的结构域I之间的共价交联，表明即使其结合至结构域IV，但该重复序列结构域与在该复合物中的HER2结构域I接近。如果HER2的构象如现有技术(例如，Bublil和Yarden,同上)所述，则预期不能看见这些交联。重要的是，分析HER2胞外域与单独结合至结构域IV的C端重复序列结构域的复合，不能观察到这种与HER2的结构域I的交联，表面在HER2和结合至结构域IV的单体重复序列结构域形成复合物的情况下，该重复序列结构域不接近结构域I。因此，相比单独的重复序列结构域结合HER2的结构域IV形成的复合物，与本发明的双特异性结合蛋白形成的复合物中，HER2的三维结构域排列必然不同
有趣的是，考虑到在2个重复序列结构域之间的短接头的范围为2至24个氨基酸，HER2的胞外域的已知结构使本发明的双特异性结合蛋白的两个重复序列结构域不能同时结合至相同的HER2分子。这表明HER2可能处于未知的构象中，从而能同时结合两个重复序列结构域。
总的来说，这些实验表明本发明的双特异性结合蛋白可以与HER2的胞外域在分子内相互作用，并且因此本发明的双特异性结合蛋白使HER2胞外域处于现有技术未知的新构象，即，使结构域I和结构域IV处于这样的空间排列：能够观察到重复序列结构域(结合至HER2的结构域IV)和结构域I之间的交联。因此，这种HER2新构象看起来是由本发明的双特异性结合蛋白以分子内的方式通过同时结合HER2的结构域II和结构域IV来稳定。
Claims (22)
1.一种重组结合蛋白，其包含至少第一和第二重复序列结构域，其中该第一和第二重复序列结构域中的每一个均结合至HER2的胞外区域，并且其中所述重复序列结构域通过共价键连接。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一重复序列结构域结合HER2的结构域II并且所述第二重复序列结构域结合HER2的结构域IV。
3.根据权利要求1-2中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一和第二重复序列结构域位于相同的多肽上，并且其中靶向HER2的结构域II的重复序列结构域位于靶向HER2的结构域IV的重复序列结构域的N端。
4.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，结合HER2的结构域II的所述第一重复序列结构域不与帕妥珠单抗竞争结合至HER2。
5.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，结合HER2的结构域IV的所述第二重复序列结构域不与曲妥珠单抗竞争结合至HER2。
6.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一重复序列结构域为锚蛋白重复序列结构域，并且所述第二重复序列结构域为锚蛋白重复序列结构域。
7.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一重复序列结构域以低于10-7M的Kd结合HER2的胞外区域，并且所述第二重复序列结构域以低于10-7M的Kd结合HER2的胞外区域。
8.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白以小于100nM的IC50值抑制BT474的受激增殖。
9.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白能以低于100nM的EC50值诱导BT474细胞凋亡。
10.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于，所述第一和第二重复序列结构域通过多肽接头连接。
11.根据前述任何一项权利要求所述的结合蛋白，其特征在于：
所述第一重复序列结构域与选自SEQ ID NOs:62-68、72和114-121的锚蛋白重复序列结构域竞争结合至HER2；和/或
所述第二重复序列结构域与选自SEQ ID NOs:74-82的锚蛋白重复序列结构域竞争结合至HER2。
12.根据权利要求10所述的结合蛋白，其特征在于：
所述第一重复序列结构域包含与选自SEQ ID NOs:62-68、72和114-121的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列；和/或
所述第二重复序列结构域包含与选自SEQ ID NOs:74-82的一个锚蛋白重复序列结构域具有至少70％氨基酸序列一致性的氨基酸序列，并且其中进一步地，
在所述锚蛋白重复序列结构域的位置1的G和/或位置2的S可选地缺失；以及
在所述锚蛋白重复序列结构域的倒数第二位置的L和/或最后位置的N可选地被A替换。
13.根据权利要求10至12中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于：
所述第一重复序列结构域选自SEQ ID NOs:62-68、72和114-121的锚蛋白重复序列结构域，和/或
所述第二重复序列结构域选自SEQ ID NOs:74-82的锚蛋白重复序列结构域，
并且其中进一步地，
在所述锚蛋白重复序列结构域的位置1的G和/或位置2的S可选地缺失；以及
在所述锚蛋白重复序列结构域的倒数第二位置的L和/或最后位置的N可选地被A替换。
14.根据权利要求10至13中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，其中：
所述第一重复序列结构域包含锚蛋白重复序列模块，该锚蛋白重复序列模块具有选自SEQ ID NO:15-18、21-23、37、38、125、126、129、130、133、134的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:15-18、21-23、37、38、125、126、129、130、133、134中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸残基取代，和/或
所述第二重复序列结构域包含锚蛋白重复序列模块，该锚蛋白重复序列模块具有选自SEQ ID NO:46、47、51、52、55和56的氨基酸序列，其中在SEQID NO:46、47、51、52、55和56中多达9个氨基酸被任何其它氨基酸残基取代。
15.根据权利要求10至14中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述锚蛋白重复序列模块具有选自KDFQGITPLHIAATSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:16中多达9个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代，并且其中
在位置3的F可选地被A替换；
在位置4的Q可选地被E替换；
在位置5的G可选地被S替换；
在位置6的I可选地被V替换；
在位置11的I可选地被L替换；
在位置14的T可选地被Q替换；和/或
在位置15的N可选地被选自S和W的氨基酸，最优选被S，替换。
16.根据权利要求10至14中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述锚蛋白重复序列模块具有选自KDITGETPLHHAADSGHLEIVEVLLKAGADVNA(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO:18中多达9个氨基酸残基被任何其它氨基酸残基取代，并且其中
在位置3的I可选地被V替换；
在位置6的E可选地被D替换；
在位置11的H可选地被L替换；
在位置14的D可选地被Q替换；
在位置15的S可选地被H替换；和/或
在位置19的E可选地被V替换。
17.根据权利要求10至15中任意一项所述的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白包含多肽，所述多肽与选自SEQ ID NO:83-98、102、103、122、123和136-141的多肽具有至少70％，优选90％，的氨基酸序列一致性。
18.一种药物制剂，其包含根据前述权利要求所述的结合蛋白或组合物。
19.根据前述权利要求所述的至少一种结合蛋白、组合物或药物制剂用于治疗癌症的用途。
20.一种方法，包括向患者进行根据前述权利要求所述的结合蛋白、组合物或药物制剂的给药，以治疗癌症。
21.根据权利要求19或20所述的用途或方法，其中在所述用途或方法中，疾病具有选自下组的至少一种特征：
HER2编码基因的扩增，
HER2编码基因的过度表达，
HER2编码基因的突变形式的表达，和/或
在抗曲妥珠单抗的肿瘤中HER3编码基因的过度表达。
22.根据权利要求19-21中所述的用途或方法，其中在所述用途或方法中，疾病为选自下组的至少一种疾病：
乳腺癌，
卵巢癌，
胃肿瘤，
胃癌，
子宫癌，和/或
结肠直肠癌。
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