KR20190050802A

KR20190050802A - 재조합 결합 단백질 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20190050802A
Application number: KR1020197009396A
Authority: KR
Inventors: 클라라 메츠; 울리케 피들러; 이그나시오 도라도; 헤이크 마리아 스트로벨
Original assignee: 몰리큘라 파트너스 아게
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2019-05-13
Also published as: MX2019003298A; ZA201901592B; US20180155402A1; JP6976335B2; NZ751689A; CL2019000729A1; US20210130420A1; RU2019111628A3; CO2019002609A2; EP3515933A1; US10717772B2; RU2019111628A; MY196882A; AU2017331329B2; EP3515933B1; WO2018054971A1; KR102270315B1; CA3036301A1; PH12019500596A1; ES2953516T3

Abstract

HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하고 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 새로운 재조합 결합 단백질뿐만 아니라, 이러한 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 이러한 재조합 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 질병의 치료에 있어서의 이러한 재조합 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도가 개시된다.

Description

재조합 결합 단백질 및 그의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 9월 22일자로 유럽 특허청에 출원된 유럽 특허 출원 EP 16190221호의 우선권 및 그 이익을 주장한다. 유럽 특허 출원 EP 16190221호의 내용은, 모든 표, 도면 및 청구범위를 포함할 뿐만 아니라 본 명세서에 포함되지 않은 상세한 설명, 청구범위 또는 도면의 임의의 요소 또는 부분의 도입을 포함하여, 모든 목적을 위하여 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함되며, 이는 PCT 규칙 4.18에 의거한 PCT 규칙 20.5(a)를 참조한다.

기술분야

새로운 재조합 결합 단백질이 제공된다. 본 단백질은 폴리펩티드 링커에 의해 연결된, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인, 및 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다. 재조합 결합 단백질은 질병의 치료에 유용하다. 특히, 재조합 결합 단백질은, 높은 저장 안정성을 나타내는, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다. 상기 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 상기 재조합 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 질병의 치료에 있어서의 상기 재조합 결합 단백질, 핵산, 또는 약제학적 조성물의 용도가 추가로 제공된다.

설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리 (국제특허 공개 WO2002/020565호; 문헌 [Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P.,

, M.G., and

, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004]; 문헌 [Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008])가 표적 특이적 설계된 안키린 반복 도메인의 선택에 사용될 수 있다. 결과적으로, 이러한 표적 특이적 설계된 안키린 반복 도메인은 질병의 치료를 위한 재조합 결합 단백질의 유용한 성분으로서 사용될 수 있다. 인간 표피 성장 인자 수용체 2 (HER2 또는 ErbB2; UniProt P04626)에 대한 결합 특이성을 갖는 상이한 설계된 안키린 반복 도메인들의 선택이 기재되어 있다 (국제특허 공개 WO2014/083208호). 본 발명에서는, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이 개시된다.

예를 들어, FcRn 재순환에 의해 매개되는 긴 전신 반감기를 나타내는 IgG 항체와 달리, 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 단백질은, 그러한 단백질이, 예를 들어 국제특허 공개 WO2012/069654호에 기재된 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인과 같은, 약동학적 특성을 개선하는 요소를 포함하지 않는 한, 전형적으로 빠른 약동학적 제거율 (clearance) 및 짧은 최종 반감기를 나타낸다. 단백질의 약동학적 특성을 개선하기 위해 혈청 알부민 결합을 사용하는 것은 당업계에 잘 알려진 프로세스이다 (예를 들어, 국제특허 공개 WO1991/001743호; 문헌 [Frejd F.Y., 2012 (in Kontermann, R (Ed.) "Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527-32849-9)]; 및 국제특허 공개 WO2012/069654호 참조). 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 임상적 약물 후보물질에 사용하기 위해, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 공지의 설계된 안키린 반복 도메인의 저장 안정성이 개선되는 것이 바람직하다. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이 본 명세서에 개시되며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 개선된 저장 안정성 특성을 나타낸다. 이전의 보고내용 (문헌 [Hopp, J., Horning, N., Zettlitz, K.A., Schwarz, A., Fuss, N.,

, D., Kontermann, R.E. Protein Eng. Des. Sel. 23, 827-834, 2010])과는 대조적으로, 본 발명자들은 놀랍게도 재조합 결합 단백질 내에 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 1개 대신에 2개를 가짐으로써, 재조합 결합 단백질의 약동학적 특성이 개선될 수 있음을 관찰하였다.

HER2는 소정 유형의 암의 발병기전 및 진행에 있어서 중요한 역할을 한다. HER2는 ErbB 수용체의 더 넓은 패밀리에 속하는 막관통 수용체 티로신 키나제 (RTK)이다 (문헌 [Bublil, E.M. and Yarden, Y. Curr. Opin. Cell Biol. 19(2), 124-34, 2007]). ErbB 수용체 패밀리는 척추동물에 걸쳐 보존되며, 또한 ErbB1 또는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 또는 HER1 (UniProt P00533) 및 수용체 HER3 (ErbB3; UniProt P21860) 및 HER4 (ErbB4; UniProt Q15303)를 포함한다. 모든 ErbB 수용체는 광범위한 서열 및 도메인 상동체를 공유하며, 모든 조합에서 기능성 동종이량체 (예를 들어, ErbB1-ErbB1, HER2-HER2 및 HER4-HER4) 및 이종이량체를 형성한다. 수용체 동종이량체화 및 이종이량체화는 리간드 결합 또는 수용체 과발현 시에 일어나며, 이는 결과적으로 자가인산화에 의해 세포내 수용체 키나제 도메인을 활성화시킨다. 이어서, 이는 하류 세포내 신호전달 및 생물학적 반응을 촉발시킨다. ErbB 신호전달 경로의 잘 알려진 길항제는 단일클론 항체 트라스투주맙 (HER2의 세포외 도메인의 도메인 IV에 결합하고 HER2 동종이량체화를 억제함) 및 퍼투주맙 (HER2의 세포외 도메인의 도메인 II에 결합하고 HER2/HER3 이종이량체화를 억제함)을 포함한다. 중요한 점은, 트라스투주맙은 주로 항증식 효과를 갖고, 진행된 질병 단계에서의 이러한 치료로부터 종양이 도피될 수 있다는 것이다. 단제로서 예기치 않게도 낮은 치료 효능 (therapeutic efficacy)을 갖는 퍼투주맙은 HER2/HER3 이종이량체화를 방해함으로써 트라스투주맙의 활성을 보완할 수 있다. 따라서, 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물은 HER2 양성 암의 치료에 매력적이다 (문헌 [Capelan M., et al., Ann. Oncol., 24, 273-82, 2013]).

트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물은 HER2 내의 2개의 도메인의 이중 표적화가 월등한 항종양 효능에 필요하다는 개념으로 이어져 왔다. HER2의 도메인 II 및 도메인 IV를 표적화하거나, 또는 HER2의 도메인 I 및 다른 도메인 (미국 특허 출원 공개 US 20110033460호; 예를 들어, 또한 도메인 IV), 또는 도메인 I 및 도메인 IV (국제특허 공개 WO2014/060365호; 문헌 [Jost, Ch., et al., Structure 21, 1-13, 2013]; 문헌 [Tamaskovic, R., et al., Nat Commun 7, 11672, 2016]), 또는 도메인 II 및 도메인 IV (국제특허 공개 WO2014/083208호)를 동시 표적화하거나, 또는 HER2의 도메인 IV 상의 트라스투주맙 에피토프 및 HER2의 도메인 II 상의 퍼투주맙 에피토프를 동시 표적화하는 (국제특허 공개 WO2009/068625호) 항체 혼합물이 보고되어 있다. 이들 접근법 중 일부는 이중-파라토프성(bi-paratopic) 결합 단백질을 포함하였다. 흥미롭게도, 국제특허 공개 WO2009/068625호에서 시험된 이중-파라토프성 결합 단백질들 중 일부는 길항적 효과를 가졌고, 다른 것들은 효능적 효과를 가졌다. 국제특허 공개 WO2014/083208호 및 문헌 [Jost, Ch., et al] (인용된 곳에서 참조; 국제특허 공개 WO2014/060365호)의 보고내용은 길항적 이중-파라토프성 결합 단백질의 생성이 간단하지 않음을 나타낸다. 대신에, 개별 도메인들 (에피토프, 결합제 특성)뿐만 아니라 구조적 배열 (배향, 거리, 링커 길이, 링커 조성)의 신중한 선택이 효과적인 길항작용을 위해 최적화되어야 한다. 추가적으로, 약동학적 조작 모이어티(engineering moiety)의 선택 및 이의 구조적 배열이 또한 최적화되어야 한다. 종합하면, 이것은 적어도 250,000개의 상이한 변이체로부터의 선택을 나타낸다.

본 명세서에는, (i) HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 및 (ii) 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인으로 이루어진 ErbB-신호전달을 길항하는 이중-파라토프성 결합 단백질을 포함하고, 개선된 저장 안정성을 갖는 재조합 결합 단백질이 개시된다. 이러한 재조합 결합 단백질, DARPin® 약물 후보는 다양한 질병의 치료를 위한 유용한 약물 후보인 것으로 밝혀져 있다. DARPin®은 스위스 소재의 Molecular Partners AG의 등록상표이다.

본 발명은 4개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이고, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다. 본 발명은 특히 서열 번호 21과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이러한 재조합 결합 단백질에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인이 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 상기 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 특히, 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 14를 포함하는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들은 각각 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 비해, PBS에서 개선된 저장 안정성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질보다 더 높은 저장 안정성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 10^-7M 미만의 억제 상수로 BT474 세포 증식을 억제한다. 일 실시 형태에서, 100 nM 농도의 본 발명의 재조합 결합 단백질은 100 nM 농도의 트라스투주맙보다 BT474 세포에서의 AKT-S473 인산화의 더 강한 하향조절을 나타낸다. 본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질병, 신생물성 질병, 암, 유방암, 난소암, 위암, 위선암, 자궁암, 결직장암, 방광암, HER2-과발현 암, HER2 발현 암, HER2 의존 암, 부분 HER2 의존 암, HER2 증폭 암, 트라스투주맙-저항성 암, 트라스투주맙-감수성 암, 위장암, 또는 뇌암의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 세균에서 상기 재조합 결합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (ii) 크로마토그래피를 사용하여 상기 재조합 결합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다.

도 1. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 재조합 결합 단백질의 예시.
(a) 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 예시. 이러한 안키린 반복 도메인의 예는 서열 번호 12 내지 15로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인, 특히 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인이다. (b) HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 예시. 이러한 안키린 반복 도메인의 예는 서열 번호 16 내지 20으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인, 특히 서열 번호 16 및 17의 아미노산 서열을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인이다. (c) 폴리펩티드 링커의 예시 (예를 들어, 서열 번호 2 내지 9 중 임의의 것에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 특히 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드 링커). (d) N 말단 아미노산 서열의 예시. 이러한 N 말단 아미노산 서열의 예는, 예를 들어 서열 MGS 또는 GS (예를 들어, 서열 번호 21 내지 30 및 32 및 33 중 임의의 것의 N 말단에 존재하는 것과 같은 것), 또는 서열 번호 1에 상응하는 아미노산 서열에 의해 예시되는 바와 같은 폴리펩티드 태그이다. (e) 폴리펩티드 링커들에 의해 연결된, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 및 각각 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하고, N 말단 아미노산 서열을 갖는 본 명세서에서 제공된 바와 같은 재조합 결합 단백질의 예시. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 2개의 다른 설계된 안키린 반복 도메인을 플랭킹한다. 서열 번호 21의 아미노산을 포함하는 재조합 결합 단백질이 이 예시에 상응한다.
도 2. 서열 번호 14를 포함하는 단백질의 개선된 저장 안정성.
4℃ (1), 25℃ (2), 40℃ (3), 및 60℃ (4)에서 1주 동안 PBS에서 10 mg/ml로 저장된 단백질 #13-His (#13) 및 단백질 #14-His (#14; 실시예 1 참조)의 SDS 15% PAGE 분석. 단백질 #14-His는 단백질 #13-His보다 더 높은 저장 안정성을 나타낸다. M: 마커 (하위 밴드: 6.5 kDa, 단백질 #14-His 수준의 밴드: 14.4 kDa, 단백질 #14-His PAGE의 경우 상위 밴드: 21.5 kDa).
도 3. HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 재조합 결합 단백질에 의한 BT474 세포 증식의 억제.
BT474 유방암 세포 증식 억제를 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질은 서열 번호 23을 포함하는 재조합 결합 단백질보다 더 낮은 IC50을 나타내는데, 이는, 재조합 결합 단백질 내에 서열 번호 16 및 17을 갖는 것이 서열 번호 18 및 17을 갖는 것보다 더 유리함을 나타낸다. 채워진 원 및 실선: 단백질 #21-His; 채워진 사각형 및 파선: 단백질 #23-His; 삼각형: 억제제 없음. OD: OD405-OD620; C: nM 단위의 농도.
도 4. 종양 이종이식편 마우스 실험.
a.) BT474 유방암 종양 이종이식편 마우스 모델. 모델을 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 삼각형: PBS; 빈 사각형: 트라스투주맙; 파선을 갖는 다이아몬드: 트라스투주맙 및 퍼투주맙; 채워진 원: HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 재조합 결합 단백질 (단백질 #21-His); V: 종양 부피 [㎣]; t: 시간 [d]. b.) 치료 18일째에 단백질 #21-His (21), 단백질 #23-His (23), 단백질 #24-His (24), 또는 단백질 #25-His (25)를 비교하는 BT474 유방암 종양 이종이식편 마우스 모델. 실험을 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 단백질 #21-His는 단백질 #24-His (p=0.0003), 단백질 #23-His, 또는 단백질 #25보다 종양 성장을 억제하는 데 있어서 유의하게 더 효능이 있다. V: 종양 부피 [㎣]; t: 시간 [d]. c.) 및 d.) GXA3039 위암 환자 유래 종양 이종이식편 마우스 모델. 실험을 실시예 7에 기재된 바와 같이 2회 수행하였다. PBS (삼각형), 퍼투주맙 (빈 역삼각형), 트라스투주맙 (빈 사각형), 트라스투주맙과 퍼투주맙의 혼합물 (파선을 갖는 다이아몬드)뿐만 아니라 단백질 #21을 이들 실험에 사용하였다. c.) 단백질 #21은 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물과 유사한 종양 성장의 강한 억제를 나타내는 반면, 트라스투주맙 단독은 덜 효능이 있다. d.) 단백질 #21은 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물과 유사한 종양 성장의 강한 억제를 나타낸다. 트라스투주맙 단독 및 퍼투주맙 단독은 상당히 덜 효능이 있다. RTV: 치료 시작 시 종양 부피로 언급되는 상대 종양 부피 [%]; t: 시간 [d]. e.) GXF281 위암 환자 유래 종양 이종이식편 마우스 모델. 실험을 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. PBS (삼각형), 라파티닙 (빈 사각형)뿐만 아니라 단백질 #21 (채워진 원). 단백질 #21은 이 모델에서 라파티닙에 비해 종양 성장의 강한 억제를 나타낸다. RTV: 치료 시작 시 종양 부피로 언급되는 상대 종양 부피 [%]; t: 시간 [d].
도 5. 마우스에서 약동학적 분석.
a.) 실시예 8에 따라 단백질 #21-His (채워진 원)를 단백질 #23-His (사각형)와 비교하는, 마우스에서의 약동학적 특성 분석. 이 실험은 재조합 결합 단백질 내에 서열 번호 18이 존재하는 것보다 서열 번호 16이 존재하는 것의 약동학적 이점을 나타낸다. b.) 실시예 8 및 실시예 11에 따라 단백질 #30-His (채워진 원; 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함함)를 단백질 #29-His (채워진 사각형; 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함함)와 비교하는, 마우스에서의 약동학적 특성 분석. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 가짐으로써, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 1개의 설계된 안키린 반복 도메인으로 달성되는 프로파일을 능가하여 약동학적 프로파일을 개선한다. c.) 실시예 8 및 실시예 10에 기재된 바와 같이, GlySer 폴리펩티드 링커를 포함하는 재조합 결합 단백질 (단백질 #26-His; 채워진 사각형) vs. ProThr 폴리펩티드 링커를 포함하는 재조합 결합 단백질 (단백질 #27-His; 채워진 원)의 약동학적 비교. ProThr 폴리펩티드 링커를 갖는 것은 마우스에서 약동학적 특성에 유리한 영향을 미친다. % ID: 1시간 측정 값에 대해 정규화된 퍼센트 주사 용량 [%]; t: 시간 [hr].
도 6. 사이노몰거스 원숭이에서의 약동학적 분석.
a) 실시예 9에 따라 사이노몰거스 원숭이에서 1 mg/㎏의 단백질 #21-His (채워진 원) 및 단백질 #23-His (채워진 사각형)의 약동학적 특성 분석. 더 긴 최종 반감기가 단백질 #21-His에 대해 관찰되는데, 이는 재조합 결합 단백질 내에 서열 번호 16이 존재하는 것이 서열 번호 18이 존재하는 것보다 더 유리함을 나타낸다. b) 실시예 9에 따라 사이노몰거스 원숭이에서의 1 mg/㎏ (채워진 원), 5 mg/㎏ (채워진 사각형), 및 10 mg/㎏ (채워진 삼각형)의 단백질 #21-His의 약동학적 특성 분석. 단백질 #21-His는 1 mg/㎏에서의 47시간부터 5 mg/㎏에서의 100시간까지, 이어서 10 mg/㎏에서의 약 180시간까지의 최종 반감기의 용량-의존적 증가를 나타낸다. 농도 [nM]; t: 시간 [hr].
도 7. BT474 세포에서의 아폽토시스 유도.
실시예 6에 따라, 변동하는 농도의 단백질 #21 (채워진 원), 트라스투주맙 (빈 사각형), 퍼투주맙 (빈 역삼각형), 또는 100 nM 트라스투주맙과 변동하는 농도의 퍼투주맙의 혼합물 (빈 다이아몬드; 파선)에 의해 유도된 BT474 세포의 아폽토시스의 측정. 비선형 회귀 적합 곡선을 포함하여, 결과가 도표로 나타나 있다. PBS (채워진 삼각형) 및 100 nM 트라스투주맙 (채워진 역삼각형)에 대한 측정치는 50 pM에서의 참조로서 나타나 있다. C: 농도 [nM]; RLU: 상대 광 단위.

본 발명은 4개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이고, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다. 서열 번호 21은 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다.

일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 (i) 서열 번호 14, 및/또는 (ii) 서열 번호 14의 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 (i) 서열 번호 14, 및/또는 (ii) 서열 번호 14의 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어지고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각, 본 출원의 서열 번호 12, 13, 또는 15뿐만 아니라, 국제특허 공개 WO2012/069654호의 서열 번호 17 내지 25 및 43 내지 48로 이루어진 군으로부터 선택되는, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 서열과 동일하지 않다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 10 내지 20 중 임의의 것의 끝에서 두 번째의 아미노산은 Ala 또는 Leu, 바람직하게는 Ala이다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 10 내지 20 중 임의의 것의 C-말단 아미노산은 Ala 또는 Asn, 바람직하게는 Ala이거나, 또는 선택적으로 누락되어 있다. 예를 들어, 서열 번호 29는, 예를 들어 서열 번호 15를 포함하는데, 여기서는 끝에서 두 번째의 아미노산은 Leu이고 C-말단 아미노산은 누락되어 있다. 바람직하게는, 본 발명의 재조합 결합 단백질 내에 존재하는 임의의 설계된 안키린 반복 도메인 (즉, 서열 번호 10 내지 20 중 임의의 것)의 끝에서 두 번째의 아미노산 및 C-말단 아미노산은 둘 모두 Ala이다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 10 내지 30 및 32 및 33 중 임의의 것의 N 말단에서의 아미노산 Gly Ser은 선택적으로 누락되어 있다.

일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열이 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인들은 아미노산 서열이 동일하다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인들은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인들은 각각 서열 번호 14로 이루어진다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 하나의 혈청 알부민 분자에 동시에 결합할 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 4개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이고, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14로 이루어진다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 14를 포함하는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 13을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인에 비해, PBS에서 개선된 저장 안정성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 14를 포함하는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 15를 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인에 비해, PBS에서 개선된 저장 안정성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 14로 이루어진 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 13으로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인에 비해, PBS에서 개선된 저장 안정성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 14로 이루어진 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 15로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인에 비해, PBS에서 개선된 저장 안정성을 나타낸다. 서열 번호 12 내지 15로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 예이다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인에 비해, PBS에서 개선된 저장 안정성, 바람직하게는 PBS에서 10 mg/ml로 40℃에서 1개월 동안 저장 후 감소된 분해 산물의 양을 나타낸다.

일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질은 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해, 개선된 저장 안정성, 바람직하게는 PBS에서 10 mg/ml로 40℃에서 1개월 동안 저장 후 감소된 분해 산물의 양을 나타내고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함한다. 서열 번호 21 및 22는, 각각 서열 번호 14 및 13을 포함하는 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다.

일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 개선된 약동학적 특성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해, 사이노몰거스 원숭이에서 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 실시예 11 (도 5b 참조)은 개선된 약동학적 특성을 갖는 재조합 결합 단백질을 개시한다.

일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은, 하나는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인의 N-말단에 그리고 하나는 이의 C-말단에 있다.

일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 16과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 (i) 서열 번호 16, 및/또는 (ii) 서열 번호 16의 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 16을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 16으로 이루어진다.

일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 17과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 (i) 서열 번호 17, 및/또는 (ii) 서열 번호 17의 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 17을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 17로 이루어진다.

일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 16과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖고, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 17과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 (i) 서열 번호 16, 및/또는 (ii) 서열 번호 16의 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 (i) 서열 번호 17, 및/또는 (ii) 서열 번호 17의 최대 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 16을 포함하고, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 17을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 16으로 이루어지고, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나는 서열 번호 17로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 17의 N-말단에 서열 번호 16을 포함한다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 32와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 (i) 서열 번호 32, 및/또는 (ii) 서열 번호 32의 최대 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 4개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 서열 번호 16 및 17로 이루어진 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이고, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인 중 2개는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14로 이루어진다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 32 및 2회의 서열 번호 14를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 32 및 2회의 서열 번호 14를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 서열 번호 32는 N 말단에서의 하나의 서열 번호 14 및 C 말단에서의 하나의 서열 번호 14에 의해 플랭킹된다.

일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질에 존재하는 설계된 안키린 반복 도메인들을 연결하는 폴리펩티드 링커들은, 서열 번호 2 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 3 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 4 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 6 또는 9, 더 바람직하게는 서열 번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열 번호 2 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 3 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 4 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 6 또는 9, 더 바람직하게는 서열 번호 9의 최대 4, 3, 2, 1, 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 7 내지 9 중 임의의 것의 플랭킹 N 말단 Gly Ser 및/또는 서열 번호 2 내지 6 중 임의의 것의 플랭킹 C 말단 Gly Ser이 선택적으로 누락된다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 2 내지 9 중 임의의 것은 선택적으로 C 말단에 Arg Ser을 추가로 포함한다 (예를 들어, 서열 번호 29에 존재하는 바와 같음). 일 실시 형태에서, 상기 폴리펩티드 링커들은 서열 번호 2 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 3 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 4 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 6 또는 9, 더 바람직하게는 서열 번호 9의 임의의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질에 존재하는 설계된 안키린 반복 도메인들을 연결하는 폴리펩티드 링커들은 서열 번호 2 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 3 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 4 내지 9, 더 바람직하게는 서열 번호 6 또는 9, 더 바람직하게는 서열 번호 9의 임의의 아미노산 서열로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질에 존재하는 설계된 안키린 반복 도메인들을 연결하는 폴리펩티드 링커들은 각각 서열 번호 9로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질에 존재하는 상기 폴리펩티드 링커들은 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일하고, 바람직하게는 동일하다. 일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어지고, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열로 각각 이루어진 폴리펩티드 링커들에 의해 연결된다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 N 말단부터 C 말단까지, 폴리펩티드 링커에 의해 연결된 서열 번호 14 - 서열 번호 16 - 서열 번호 17 - 서열 번호 14를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 N 말단부터 C 말단까지, 서열 번호 14 - 서열 번호 9 - 서열 번호 16 - 서열 번호 9 - 서열 번호 17 - 서열 번호 9 - 서열 번호 14를 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질과 적어도 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은, (i) 서열 번호 21 및/또는 (ii) 서열 번호 21의 최대 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 대체된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질과 적어도 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은, (i) 서열 번호 21 및 (ii) 서열 번호 21의 최대 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 대체된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 바람직하게는, 서열 번호 21에서의 상기 아미노산 대체는 서열 번호 21의 위치 127 내지 444에 위치한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질과 적어도 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질과 적어도 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 본 발명은, (i) 서열 번호 21 및/또는 (ii) 서열 번호 21의 최대 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 대체된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은, (i) 서열 번호 21 및/또는 (ii) 서열 번호 21의 최대 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 대체된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이며, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열로 이루어진다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질이 바람직하다. 서열 번호 21이 바람직하다. 아미노산 서열이 서열 번호 21인 재조합 결합 단백질이 바람직하다. 아미노산 서열이 서열 번호 21인 단백질이 바람직하다. 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질이 바람직하다. 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 재조합 결합 단백질이 바람직하다.

다수의 특징은 서열 번호 21에 의해 인코딩된 단백질을 본 발명의 바람직한 재조합 결합 단백질이 되도록 한다. 이것은 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 및 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하며, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14로 이루어진다. HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 2개의 상이한 에피토프에서 HER2와 결합한다. 이것은 혈청 알부민-결합 및 이중-파라토프성 HER2-결합을 조합한 제1 재조합 결합 단백질이다. 서열 번호 14의 설계된 안키린 반복 도메인은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 공지의 설계된 안키린 반복 도메인에 비해 개선된 저장 안정성 특성을 나타낸다 (실시예 2 및 실시예 3; 도 2 참조). 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 놀랍게도 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 갖는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 재조합 결합 단백질의 개선된 약동학적 특성으로 이어졌다 (실시예 11, 도 5). 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인이 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 다른 설계된 안키린 반복 도메인들을 플랭킹하는 경우, 최상의 약동학적 특성이 관찰된다 (실시예 11). HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인들뿐만 아니라 이들의 구조적 배열의 선택은 화합물의 최대 활성으로 이어진다 (실시예 5, 실시예 6, 및 실시예 7). 설계된 안키린 반복 도메인들은 PT-풍부 링커를 사용하여 연결되며, 이는 놀랍게도 개선된 약동학적 특성으로 이어진다 (실시예 10 및 실시예 11). 이러한 분자들은 하나의 분자 내에 적어도 2개의 약물 (예를 들어, 트라스투주맙 및 퍼투주맙)의 기능성을 통합하고, 추가적으로 HER2 발현 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있다 (실시예 6, 도 7).

일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 22로 이루어진 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 개선된 저장 안정성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 22로 이루어진 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해, PBS에서 10 mg/ml로 40℃에서 1개월 동안 저장 후 감소된 분해 산물의 양을 나타낸다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 C-말단 설계된 안키린 반복 도메인이 제거된 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질에 비해 개선된 약동학적 특성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 1 내지 422로 이루어진 재조합 결합 단백질에 비해 개선된 약동학적 특성을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 33으로 이루어진 재조합 결합 단백질에 비해 개선된 약동학적 특성을 나타낸다.

일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 PBS에서 10^-5 M 미만; 바람직하게는 10^-6 M 미만; 또는 더 바람직하게는 10^-7 M 미만의 해리 상수 (kd)로 마우스, 래트, 개, 사이노몰거스 원숭이, 또는 인간 기원의 혈청 알부민, 더 바람직하게는 마우스, 사이노몰거스 원숭이 또는 인간 기원의 혈청 알부민, 더 바람직하게는 사이노몰거스 원숭이 또는 인간 기원의 혈청 알부민, 더 바람직하게는 인간 기원의 혈청 알부민과 결합한다. 일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14로 이루어지고, PBS에서 10^-5 M 미만; 바람직하게는 10^-6 M 미만; 또는 더 바람직하게는 10^-7 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 표면 플라즈몬 공명을 사용한 해리 상수 결정의 예가 실시예 5에 그리고 국제특허 공개 WO2014/083208호에 제공되어 있다.

일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 PBS에서 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만; 더 바람직하게는 10^-8 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-9 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 기원의 HER2와 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 16으로 이루어진 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS에서 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만; 더 바람직하게는 10^-8 M 미만, 더 바람직하게는 10^-9 M 미만, 더 바람직하게는 10^-10 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-11 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 HER2와 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 17로 이루어진 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS에서 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만; 더 바람직하게는 10^-8 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-9 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 HER2와 결합한다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 PBS에서 10^-7 M 미만; 바람직하게는 10^-8 M 미만; 더 바람직하게는 10^-9 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-10 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 기원의 HER2와 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 32를 포함하는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 재조합 결합 단백질은 PBS에서 10^-8 M 미만; 바람직하게는 10^-9 M 미만; 또는 더 바람직하게는 10^-10 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 재조합 결합 단백질은 PBS에서 10^-7 M 미만; 바람직하게는 10^-8 M 미만; 더 바람직하게는 10^-9 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-10 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 기원의 HER2와 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어지는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 재조합 결합 단백질은 PBS에서 10^-7 M 미만; 바람직하게는 10^-8 M 미만; 더 바람직하게는 10^-9 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-10 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 기원의 HER2와 결합한다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 10^-5 M 미만, 바람직하게는 10^-6 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-7 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 재조합 결합 단백질은 PBS에서 10^-5 M 미만; 바람직하게는 10^-6 M 미만; 또는 더 바람직하게는 10^-7 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어지는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 재조합 결합 단백질은 PBS에서 10^-5 M 미만; 바람직하게는 10^-6 M 미만; 또는 더 바람직하게는 10^-7 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합한다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-8 M 미만의 억제 상수 (IC₅₀)로 HER2-발현 세포의 세포 증식을 억제한다. 이러한 세포의 예는 BT474, SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, HCC1419, 또는 MDA-MB175 세포를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-8 M 미만의 억제 상수 (IC₅₀)로 BT474 세포 증식을 억제한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 32를 포함하는 재조합 결합 단백질은 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-8 M 미만의 억제 상수 (IC₅₀)로 BT474 세포 증식을 억제한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질은 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-8 M 미만의 억제 상수 (IC₅₀)로 BT474 세포 증식을 억제한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질은 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-8 M 미만의 억제 상수 (IC₅₀)로 BT474 세포 증식을 억제한다. 세포 억제 검정은 당업계에 잘 알려져 있다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 갖는 재조합 결합 단백질보다 더 강력하게 BT474 세포 증식을 억제한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC; 당업자에게 잘 알려짐)의 도움 없이 BT474 세포 증식을 억제한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 IgG1-Fc 단편의 도움 없이 BT474 세포 증식을 억제한다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 BT474 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 미만의 반수 최대 유효 농도 (half maximal effective concentration) (EC₅₀) 값으로 BT474 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 바람직하게는, 상기 재조합 결합 단백질은 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 nM 미만의 EC50 값으로 BT474 세포에서 아폽토시스를 유도한다. 바람직하게는, 100 nM의 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 트라스투주맙, 100 nM 퍼투주맙, 또는 100 nM 트라스투주맙 및 100 nM 퍼투주맙의 혼합물보다 더 크게 BT474에서 아폽토시스를 유도한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 HER2 발현 세포에서 아폽토시스를 유도한다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질은 PAS 경로를 억제한다. 일 실시 형태에서, BT474 내의 HER2는 트라스투주맙으로 처리될 때보다 서열 번호 21을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질로 처리될 때 덜 인산화된다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 HER2 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 인간 혈청 알부민의 2개의 분자에 동시에 결합할 수 있다. 이러한 동시 결합은 당업자에게 잘 알려진 기법인 표면 플라즈몬 공명 실험 (실시예 5) 또는 정적 광 산란에 결합된 크기-배제 크로마토그래피 (실시예 14)를 사용하여 밝혀질 수 있다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 이중-파라토프성 모드로 HER2와 결합하고 있다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 2개의 상이한 에피토프에서 HER2와 결합한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 제1, 제2, 제3 및 제4의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 상기 제1 및 제2의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 HER2에 대한 결합 특이성을 갖고, 상기 제3 및 제4의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는다. 바람직하게는, 상기 재조합 결합 단백질은 단일 폴리펩티드 사슬로 이루어진다. 더 바람직하게는, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4의 설계된 안키린 반복 도메인은 폴리펩티드 링커들에 의해 연결된다. 서열 번호 21은 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다.

일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제1의 설계된 안키린 반복 도메인은 HER2의 결합 도메인 II이다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2의 설계된 안키린 반복 도메인은 HER2의 결합 도메인 IV이다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제1의 설계된 안키린 반복 도메인은 HER2의 결합 도메인 II이고, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2의 설계된 안키린 반복 도메인은 HER2의 결합 도메인 IV이다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제1의 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 16을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2의 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 17을 포함한다. 일 실시 형태에서, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제1의 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 16을 포함하고, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2의 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 17을 포함한다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 16을 포함하는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제1의 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS에서 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만; 더 바람직하게는 10^-8 M 미만, 더 바람직하게는 10^-9 M 미만, 더 바람직하게는 10^-10 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-11 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 HER2와 결합한다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 17을 포함하는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제2의 설계된 안키린 반복 도메인은 PBS에서 10^-6 M 미만; 바람직하게는 10^-7 M 미만; 더 바람직하게는 10^-8 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-9 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 HER2와 결합한다.

일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제3 및 제4의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 PBS에서 10^-5 M 미만, 바람직하게는 10^-6 M 미만, 또는 더 바람직하게는 10^-7 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합한다. 일 실시 형태에서, 각각 서열 번호 14를 포함하는, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제3 및 제4의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 PBS에서 10^-5 M 미만; 바람직하게는 10^-6 M 미만; 또는 더 바람직하게는 10^-7 M 미만의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합한다.

용어 "제1의 설계된 안키린 반복 도메인", "제2의 설계된 안키린 반복 도메인", "제3의 설계된 안키린 반복 도메인" 및 "제4의 설계된 안키린 반복 도메인"에 사용된 "제1", "제2", "제3" 및 선택적으로 "제4"는 재조합 결합 단백질 내의 상기 설계된 안키린 반복 도메인들의 임의의 위치 배열을 나타내거나 암시하지 않는다. 일 실시 형태에서, 상기 4개의 설계된 안키린 반복 도메인은 N 말단부터 C 말단까지 다음과 같이 위치한다: 제3 - 제1 - 제2 - 제4.

일 실시 형태에서, 재조합 결합 단백질은 마우스에서의 종양 이종이식편 모델에서 BT474 세포 증식을 억제한다. 일 실시 형태에서, 재조합 결합 단백질은 마우스에서의 HER2-발현 환자-유래 이종이식편 암 모델에서 종양 성장을 억제한다. 일 실시 형태에서, 재조합 결합 단백질은 마우스에서의 HER2-발현 환자-유래 이종이식편 위암 모델에서 종양 성장을 억제한다. 용어 "HER2-발현 환자-유래 이종이식편"은 환자-유래 암 조직 이종이식편이라는 의미를 가지며, 상기 조직에서 적어도 하나의 세포는 백그라운드보다 높은 HER2를 발현한다.

주어진 아미노산 서열에 대해 적어도 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질에 관한 본 발명의 임의의 실시 형태에서, 동일하지 않은 아미노산은 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질의 임의의 위치에 위치할 수 있다.

마찬가지로, 최대 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 또는 0개의 아미노산이 임의의 아미노산에 의해 대체된 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질에 관한 본 발명의 임의의 실시 형태에서, 대체된 아미노산은 설계된 안키린 반복 도메인의 임의의 위치에 위치할 수 있다. 본 발명의 재조합 결합 단백질을, 예를 들어 점 돌연변이에 의해 변형시키는 기법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 서열 번호 21로부터 출발하여, 당업자는 기능적 활성의 비변경의 높은 가능성으로 서열 번호 21의 서열 변이체를 생성하기 위하여 (예를 들어, 국제특허 공개 WO2002/020565호의 지식을 사용하여) 아미노산을 대체하는 방법 및 위치를 안다.

일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 제4의 설계된 안키린 반복 도메인이 결여된 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 최종 반감기의 증가, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%의 최종 반감기의 증가를 나타낸다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 최종 반감기의 증가, 바람직하게는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 45%의 최종 반감기의 증가를 나타낸다. 이러한 최종 반감기의 증가의 예는 실시예 11에 제공되어 있다.

일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 사이노몰거스 원숭이에서 1 mg/㎏으로 약 47시간의 최종 반감기를 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 사이노몰거스 원숭이에서 5 mg/㎏으로 약 100시간의 최종 반감기를 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 상기 재조합 결합 단백질은 사이노몰거스 원숭이에서 10 mg/㎏으로 100시간 초과의 최종 반감기를 나타낸다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 재조합 결합 단백질은 사이노몰거스 원숭이에서 100 mg/㎏으로 100시간 초과의 최종 반감기를 나타낸다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질, 바람직하게는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21로 이루어진 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 핵산은 당업자에게 잘 알려져 있다. 실시예에서는, 핵산을 사용하여, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질을 E. 콜라이 (E. coli)에서 생성하였다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인, 및/또는 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인을 인코딩하는 핵산 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질 또는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 알려져 있으며, 하기에서 보다 상세히 설명된다. 또한, 하나 이상의 상기 언급된 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인 및/또는 핵산, 특히 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산을 포함하는 진단 조성물이 고려된다.

약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 결합 단백질, 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인, 및/또는 핵산, 바람직하게는 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산, 및, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16^th edition, Osol, A. Ed., 1980]에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다. 당업자에게 공지된 적합한 담체, 부형제 또는 안정제는 식염수, 링거액 (Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액 (Hank's solution), 고정유, 에틸 올레에이트, 식염수 중 5% 덱스트로스, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 완충액 및 보존제이다. 다른 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같은 조성물을 제공받는 개체에 유해한 항체의 생성을 스스로 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 약제학적 조성물은 또한 추가의 활성제, 예를 들어 항암제 또는 항혈관생성제 또는 추가의 생물활성 화합물을 포함하는 병용 제형일 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태는 약제학적 조성물을 제조하기 위한, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이고, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 증가된 최종 반감기, 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200% 또는 250%의 증가된 최종 반감기를 나타낸다.

일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 결합 단백질 및 비이온성 표면활성제(detergent)와 같은 표면활성제, 인산염과 같은 완충액 및 수크로스와 같은 당을 포함한다. 일 실시 형태에서, 이러한 조성물은 전술한 바와 같이 재조합 결합 단백질 및 PBS를 포함한다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이다. 이러한 목적을 위해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물 또는 재조합 결합 단백질은 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 투여된다. 투여는 국소 투여, 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 전형적인 투여 경로는 비경구 투여이다. 비경구 투여에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 단위 투여 주사용 형태로 상기 정의된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화될 것이다. 투여량 및 투여 방식은 치료하고자 하는 개체 및 특정 질병에 따라 달라질 것이다.

또한, 상기 언급한 임의의 약제학적 조성물 또는 재조합 결합 단백질은 장애의 치료를 위해 고려된다.

일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 상기 재조합 결합 단백질 또는 이러한 다른 약제학적 조성물은 정맥내 적용된다. 비경구 적용을 위해, 재조합 결합 단백질 또는 상기 약제학적 조성물은 볼루스 (bolus) 주사로서 또는 느린 주입에 의해 치료적 유효량으로 주사될 수 있다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 발명의 재조합 결합 단백질의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 실시예 7 (도 4)은 암의 치료를 위한 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질의 용도의 유용성을 예시한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 본 발명의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료에 사용하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자는 질병의 치료에 사용하기 위한 것으로 고려된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자를 포함하는 약제에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 약제학적 조성물에 있어서의 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 상기 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 상기 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 상기 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 약제로서의 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 약제의 제조를 위한 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 약제의 제조 방법에 관한 것이며, 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자는 약제의 활성 성분이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산 분자를 사용한 질병의 치료 방법에 관한 것이다.

용어 "의학적 질환" (또는 장애 또는 질병)은 자가면역 장애, 염증성 장애, 망막병증 (특히, 증식성 망막병증), 신경퇴행성 장애, 감염, 대사성 질병, 및 신생물성 질병을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 결합 단백질은 이러한 장애, 특히 자가면역 장애, 염증성 장애, 망막병증 및 신생물성 질병을 포함하는 군으로부터 선택되는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. "의학적 질환"은 부적절한 세포 증식을 특징으로 하는 것일 수 있다. 의학적 질환은 과증식성 질환일 수 있다. 본 발명은 특히 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 상기 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 신생물성 질병이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "신생물성 질병"은 급속하게 증식하는 세포 성장 또는 신생물을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 비정상적인 상태 또는 질환을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 악성 신생물성 질병이다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암과 관련된다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 HER2 발현 암, HER2 의존 암, 부분 HER2 의존 암, HER2 과발현 암, HER2 증폭 암, 트라스투주맙-저항성 암, 및/또는 트라스투주맙-감수성 암과 관련된다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 유방암 및/또는 위장암 및/또는 뇌암과 관련된다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 유방암, 난소암, 위암, 위선암, 자궁암, 결직장암, 방광암, 및/또는 HER2 과발현 암과 관련된다. 용어 "뇌암"은 HER2 과발현 암의 뇌 전이, HER2 증폭 암의 뇌 전이, HER2 과발현 뇌암, 또는 HER2 증폭 뇌암과 관련될 수 있다. 용어 "위장"암은 위암, 식도암, 결직장암, 담관샘암(biliary gland cancer), 담낭암, 또는 췌장 선암종과 관련될 수 있다. 용어 "치료적 유효량"은 환자에서 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암과 관련되며, 상기 암의 세포는 IHC에 의해 결정될 때 백그라운드보다 높은 HER2 발현 수준을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암과 관련되며, 상기 암의 세포는 IHC에 의해 결정될 때 그들 부근에 있는 건강한 세포보다 높은 HER2 발현 수준을 나타낸다. 백그라운드보다 높은 이러한 HER2 발현 수준은, 예를 들어 HercepTest® (Dako)와 같은 검정으로부터, 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 백그라운드보다 높은 HER2 발현 수준은 1+, 2+, 또는 3+, 더 바람직하게는 2+, 또는 3+의 HercepTest® 점수와 관련된다. Her2-과발현은 당업자에게 잘 알려져 있다 (문헌 [

et al., 2012. Modern Pathology 25, 637-650]; 문헌 [Wolff et al., 2013. J. Clin. Oncol. 31 (31), 3997-4014]).

특히, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하는 의학적 질환의 치료에 관한 것이고, 상기 의학적 질환은 암이다.

암 질병의 치료를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 상기 약제학적 조성물의 사용은 또한 당업계에 공지된 하나 이상의 다른 요법과 병용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "병용 사용"은 주어진 계획 (regimen)에 따라 수행되는 공동투여를 지칭할 것이다. 이것은 상이한 화합물들의 동시 투여뿐만 아니라 상이한 화합물들의 시간차 (time-shifted) 투여를 포함한다 (예를 들어, 화합물 A가 1회 제공되고, 그 후 화합물 B가 수회 제공되거나, 또는 그 반대로 제공되거나, 또는 화합물 둘 모두 동시에 제공되고, 두 화합물 중 하나는 후기 단계에서도 제공됨). 예를 들어 공동투여될 수 있는 화합물의 예에는 탁산, 안트라사이클린, 백금계 화학요법제, 5-FU, PI3K 억제제 (예를 들어, 아피톨리십, 타셀리십, 또는 알펠리십), MEK 억제제 (예를 들어, 트라메티닙 또는 코비메티닙), RAS 억제제 (예를 들어, 살리라십), RAF 억제제, mTOR 억제제 (예를 들어, 아피톨리십 및 에베롤리무스를 포함함), Pan-EGFR 억제제, 미세소관 억제제 (에리불린을 포함함), 표적화된 요법, 예컨대 세포 주기 키나제 억제제 (예를 들어, 팔보시클립), HER2 억제제, 트라스투주맙, 트라스투주맙-DM1, 퍼투주맙, 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙, 베바시주맙, 라니비주맙, MP0250, 이필리무맙, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 우렐루맙, 우톨리무맙, 또는 아테졸리주맙이 포함된다. 바람직하게는, 이들 화합물은 권장된 용량으로 사용된다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질은 PI3K 억제제, mTOR 억제제, 에리불린, 트라스투주맙, 또는 라파티닙의 효과를 증강시킨다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 21을 포함하는 상기 재조합 결합 단백질은 질병의 치료를 위한 PI3K 억제제, mTOR 억제제, 에리불린, 트라스투주맙, 또는 라파티닙의 더 낮은 용량의 사용을 가능하게 한다. 이러한 병용물의 예가 실시예 17에 제공되어 있다.

추가의 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환, 바람직하게는 신생물성 질병, 더 바람직하게는 암의 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 신생물성 질병, 특히 암일 수 있는 의학적 질환의 치료에 사용되는 약제의 제조를 위한 본 발명의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

생체내(in vivo) 투여에 사용되는 제형은 무균성 또는 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 언급된 임의의 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 재조합 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 재조합 결합 단백질, 및/또는 상기 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및/또는 상기 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 재조합 결합 단백질, 및/또는 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및/또는 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 재조합 결합 단백질 및/또는 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하게는 이로 이루어진 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.

일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 21을 포함하는, 바람직하는 이로 이루어진 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 세균에서 상기 재조합 결합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (ii) 크로마토그래피를 사용하여 상기 재조합 결합 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가의 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 결합 단백질을 생성하는 이러한 방법은 실시예 1에 제공되어 있다.

본 발명은 실시예에 기재된 특정 실시 형태로 제한되지 않는다. 다른 공급원이 사용되고, 하기에 기재된 대체적인 개요에 따라 처리될 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 다수의 문헌이 인용되어 있다. 이들 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 명세서는 "P015_Sequence_Listing.txt"로 명명된 본 명세서의 아미노산 서열 목록의 다수의 아미노산 서열을 참고하고, 서열 프로토콜의 아미노산 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다.

정의

본 발명의 맥락에서, 용어 "단백질"은, 폴리펩티드로서, 폴리펩티드의 적어도 일부가 단일 폴리펩티드 사슬 내에 그리고/또는 다수의 폴리펩티드 사슬들 사이에 2차, 3차 또는 4차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 갖거나 획득할 수 있는, 폴리펩티드를 지칭한다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우에, 개별 폴리펩티드 사슬들은, 예를 들어 두 폴리펩티드 사이의 이황화물 결합에 의해 비공유적으로 또는 공유적으로 연결될 수 있다. 2차 또는 3차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 개별적으로 갖거나 획득할 수 있는 단백질의 일부를 "단백질 도메인"이라 칭한다. 이러한 단백질 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있다.

재조합 단백질, 재조합 단백질 도메인, 재조합 결합 단백질 등에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합"은, 상기 폴리펩티드가 관련 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 생성된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 DNA 분자 (예를 들어, 유전자 합성에 의해 생성됨)가 세균 발현 플라스미드 (예를 들어, pQE30, QIAgen), 효모 발현 플라스미드, 포유류 발현 플라스미드 또는 식물 발현 플라스미드 또는 시험관내(in vitro) 발현을 가능하게 하는 DNA 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 이러한 재조합 세균 발현 플라스미드가 적절한 세균 (예를 들어, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli))에 삽입되는 경우에, 이 세균은 이 재조합 DNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 생성할 수 있다. 상응하여 생성된 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질로 불린다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "결합 단백질"은 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 더 바람직하게는 4개 이상의 결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 4개의 반복 도메인을 포함한다. 더 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 4개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질의 상기 결합 도메인들 중 2개는 각각 혈청 알부민에 대한 표적 특이성을 갖는다. 또한 바람직하게는, 상기 결합 단백질의 상기 결합 도메인들 중 2개는 각각 HER2에 대한 표적 특이성을 갖는다.

더욱이, 임의의 이러한 결합 단백질은 당업자에게 잘 알려진 추가의 폴리펩티드 (예를 들어, 폴리펩티드 태그, 폴리펩티드 링커, 다른 결합 단백질성 도메인에 대한 융합, 사이토카인, 호르몬, 또는 길항제), 또는 화학적 변형 (예를 들어, 폴리에틸렌-글리콜, 독소 (예를 들어, 면역원으로부터의 DM1), 소분자, 항생제 등에 대한 커플링)을 포함할 수 있다.

용어 "결합 도메인"은, 하기에 정의된 바와 같이, 단백질 골격과 동일한 "접힘" (즉, 2차, 3차 및/또는 4차 구조)을 나타내고, 미리 결정된 특성을 갖는 단백질 도메인을 의미한다. 이러한 결합 도메인은 당업계에 공지된 합리적인, 또는 가장 통상적으로는, 조합적인 단백질 조작 기법에 의해 얻을 수 있다 (문헌 [Binz, H.K., Amstutz, P.,

, A., 2005. Nat. Biotech. 23, 1257-1268]). 예를 들어, 미리 결정된 특성을 갖는 결합 도메인은 (a) 하기에 추가로 정의된 바와 같은 단백질 골격과 동일한 접힘을 나타내는 단백질 도메인들의 다양한 집합을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 다양한 집합을 스크리닝하고/하거나, 상기 다양한 집합으로부터 선택하여 상기 미리 결정된 특성을 갖는 적어도 하나의 단백질 도메인을 얻는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 단백질 도메인들의 다양한 집합은, 사용되는 스크리닝 및/또는 선택 시스템에 따라 몇몇 방법에 의해 제공될 수 있으며, 파지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이와 같은 당업자에게 익히 공지된 방법의 사용을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다.

용어 "단백질 골격"은, 노출된 표면적을 가지며, 거기서 아미노산 삽입, 치환 또는 결실이 고도로 허용될 수 있는 단백질을 의미한다. 본 발명의 결합 도메인을 생성하는 데 사용될 수 있는 단백질 골격의 예는 항체 또는 그의 단편, 예를 들어 단일 사슬 Fv 또는 Fab 단편, 스타필로콕쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)로부터 유래된 단백질 A, 피에리스 브라스시카이 (Pieris brassicae)로부터 유래된 빌린 (bilin) 결합 단백질, 또는 다른 리포칼린 (lipocalin), 안키린 반복 단백질 또는 다른 반복 단백질 및 인간 피브로넥틴이다. 단백질 골격은 당업자에게 공지되어 있다 (문헌 [Binz et al., 2005, 인용된 곳에서 참조]; 문헌 [Binz et al., 2004, 인용된 곳에서 참조]).

용어 "표적"은 개별 분자, 예를 들어 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 단백질, 탄수화물 또는 임의의 다른 천연 발생 분자와 같은 개별 분자를 지칭하며, 이러한 개별 분자의 임의의 부분 또는 이러한 분자 2개 이상의 복합체를 포함한다. 표적은 전체 세포 또는 조직 샘플일 수 있거나, 그것은 임의의 비천연 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 표적은 천연 발생 또는 비천연 폴리펩티드 또는, 예를 들어 천연 또는 비천연 인산화, 아세틸화 또는 메틸화에 의해 변형된 화학적 변형을 함유하는 폴리펩티드이다. 본 발명의 특정 적용에서, 표적은 혈청 알부민 및 HER2이다.

용어 "미리 결정된 특성"은 표적에 대한 결합, 표적의 차단, 표적 매개 반응의 활성화, 효소 활성 및 관련 추가 특성과 같은 특성을 지칭한다. 원하는 특성의 유형에 따라, 당업자는 원하는 특성을 갖는 결합 도메인의 스크리닝 및/또는 선택을 수행하기 위한 포맷 및 필요한 단계를 확인할 수 있을 것이다. 바람직하게는, 상기 미리 결정된 특성은 표적에 특이적으로 결합하는 것이다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 다수의, 즉 2개 이상의 아미노산의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 8개 초과의 아미노산으로 이루어진다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 시스테인의 S-S 가교에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산 사슬들을 포함한다. 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있다.

용어 "폴리펩티드 태그"는 폴리펩티드/단백질에 부착된 아미노산 서열을 지칭하며, 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드/단백질의 정제, 검출 또는 "표적화" (즉, 표적 부위로의 위치화)에 유용하거나, 상기 아미노산 서열은 폴리펩티드/단백질의 물리화학적 거동을 개선하거나, 상기 아미노산 서열은 이펙터(effector) 기능을 보유한다. 결합 단백질의 개별 폴리펩티드 태그는 결합 단백질의 다른 부분에 직접 연결되거나 또는 폴리펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 이들 폴리펩티드 태그는 모두 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자가 충분히 이용가능하다. 폴리펩티드 태그의 예는 작은 폴리펩티드 서열, 예를 들어 His (예를 들어, 서열 번호 1의 His 태그), myc, FLAG 또는 Strep 태그, 또는 폴리펩티드, 예를 들어 효소 (예를 들어, 알칼리 포스파타제)이며, 이는 상기 폴리펩티드/단백질, 또는 표적화 (예를 들어, 면역글로불린 또는 그의 단편)에 그리고/또는 이펙터 분자로서 사용될 수 있는 폴리펩티드의 검출을 가능하게 한다.

용어 "폴리펩티드 링커"는, 예를 들어 2개의 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그와 단백질 도메인, 단백질 도메인과 비단백성 화합물 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체 또는 두 서열 태그를 연결시킬 수 있는 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 추가의 도메인, 태그, 비단백성 화합물 또는 중합체 및 링커는 관련 기술 분야의 당업자에게 공지되어 있다. 예시 목록은 국제특허 공개 WO2002/020565호의 설명에 제공되어 있다. 이러한 링커의 특정 예는 가변 길이의 글리신-세린-링커 및 프롤린-트레오닌-링커이다. 글리신-세린-링커의 예는 GS 및 서열 번호 2 내지 6에 제공된 아미노산 서열이고, 프롤린-트레오닌-링커의 예는 서열 번호 7 내지 9의 아미노산 서열에 제공되어 있다.

국제특허 공개 WO2002/020565호 및 문헌 [Forrer et al., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K.,

, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)]은 반복 단백질 특징 및 반복 도메인 특징, 기법 및 응용에 대한 전반적인 설명을 수록하고 있다. 용어 "반복 단백질"은 하나 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 반복 단백질은 최대 6개의 반복 도메인을 포함한다. 더 바람직하게는, 반복 단백질은 최대 5개의 반복 도메인을 포함한다. 더 바람직하게는, 반복 단백질은 최대 4개의 반복 도메인을 포함한다. 또한, 상기 반복 단백질은 추가의 비반복 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그 및/또는 폴리펩티드 링커를 포함할 수 있다. 반복 도메인은 전술한 바와 같은 결합 도메인일 수 있다.

용어 "반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속적인 반복 모듈을 포함하는 단백질 도메인을 지칭하며, 상기 구조 단위는 동일한 접힘을 가지며, 조인트 소수성 코어(joint hydrophobic core)를 갖는 초나선(superhelical) 구조를 형성하도록 단단히 포개어져 있다. 구조적 상동성 다음으로, 이러한 반복 모듈은 서열 상동성을 추가로 갖는다. 바람직하게는, 반복 도메인은 N 말단 및/또는 C 말단 캡핑 (capping) 반복을 추가로 포함한다. 명확성을 위해, 캡핑 반복은 반복 모듈일 수 있다. 이러한 반복 도메인, 반복 모듈 및 캡핑 반복, 서열 모티프뿐만 아니라 구조적 상동성 및 서열 상동성은 안키린 반복 도메인 (국제특허 공개 WO2002/020565호), 류신-풍부 반복 도메인 (국제특허 공개 WO2002/020565호), 테트라트라이코펩티드 반복 도메인 (문헌 [Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003]), 및 아르마딜로 반복 도메인 (국제특허 공개 WO2009/040338호)의 예로부터 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 반복 도메인은, 모든 반복된 아미노산 서열이 개별 도메인 (예를 들어, 피브로넥틴의 FN3 도메인)을 형성할 수 있거나, 반복된 아미노산 서열이 구조 단위가 아니며, 즉 상기 반복된 아미노산 서열이 조인트 소수성 코어를 갖는 초나선 구조를 형성하도록 단단히 포개어져 있지 않다는 점에서, 반복된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과는 상이하다는 것이 당업자에게 추가로 잘 알려져 있다. 반복 모듈 또는 반복 서열 모티프를 확인 및 결정하는 방법 또는 이러한 반복 단위 또는 모티프를 포함하는 관련 단백질의 패밀리를 확인하는 방법, 예컨대 상동성 검색 (BLAST^® 등)은 생물정보학 분야에서 잘 확립되어 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다.

용어 "설계된 반복 단백질" 및 "설계된 반복 도메인"은, 예를 들어 국제특허 공개 WO2002/020565호에 설명된 바와 같이, 본 발명의 절차의 결과로서 얻어진 반복 단백질 또는 반복 도메인을 각각 지칭한다. 용어 "설계된"은, 이러한 반복 단백질 및 반복 도메인이 각각 인공적이고 합성적이며, 천연의 것이 아닌 특성을 지칭한다. 국제특허 공개 WO2002/020565호의 설계된 반복 단백질 또는 설계된 반복 도메인은 각각 설계된 안키린 반복 단백질 또는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다. 따라서, 본 발명의 설계된 안키린 반복 단백질은 적어도 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 단백질에 상응한다. 또한, 용어 "천연의 것이 아닌"은, 상기 결합 단백질 또는 상기 결합 도메인의 서열이 서열 데이터베이스, 예를 들어, GenBank, EMBL-Bank 또는 Swiss-Prot에서 비인공적인 서열 엔트리로서 존재하지 않는다는 것을 의미한다. 이들 데이터베이스 및 다른 유사한 서열 데이터베이스는 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 설계된 안키린 반복 도메인은 비천연 발생이다.

용어 "반복 모듈", "반복 단위", "캡핑 반복", "캡핑 모듈" 및 반복 단백질 및 반복 도메인과 관련된 추가의 용어는 국제특허 공개 WO2002/020565호에 정의되어 있으며, 그 정의는 참고로 포함된다.

용어 "표적에 대한 결합 특이성을 갖는다", "표적에 특이적으로 결합하는", "높은 특이성으로 표적에 결합하는", "표적에 대해 특이적인" 또는 "표적 특이성" 등은, 결합 단백질 또는 결합 도메인이 PBS에서 E. 콜라이 말토스 결합 단백질 (MBP)과 같은 비관련 단백질에 결합하는 것보다 낮은 해리 상수 (즉, 그것은 더 높은 친화도로 결합함)로 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 표적에 대한 PBS에서의 해리 상수 ("Kd")는 MBP에 상응하는 해리 상수보다 적어도 10²; 더 바람직하게는 적어도 10³; 더 바람직하게는 적어도 10⁴; 또는 더 바람직하게는 적어도 10⁵배 더 낮다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기반 기법 (예를 들어, SPR 평형 분석) 또는 등온 적정 열량계 (isothermal titration calorimetry) (ITC)와 같은 단백질-단백질 상호작용의 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 Kd 값은, 상이한 조건 (예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정되는 경우에 달라질 수 있다. 따라서, Kd 값의 측정은 표준화된 단백질 용액 및 표준화된 완충액, 예를 들어 PBS에 의해 바람직하게 이루어진다.

용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 인산염 및 2.7 mM KCl을 함유하고, pH가 7.4인 인산염 완충 수용액을 의미한다.

본 발명과 관련하여 용어 "세포 증식을 억제하다" 등은 세포 증식을 억제하는 상기 재조합 결합 단백질의 능력을 지칭한다. 억제 강도는 전형적으로 반수-최대 억제의 농도 (concentration of half-maximal inhibition) (IC₅₀)를 평가하여 측정된다. 용어 억제 및 IC₅₀ 값의 평가는 당업계에 잘 확립되어 있다.

용어 "마우스 혈청 알부민"은 UniProt 수탁 번호 P07724를 지칭하며, 용어 "사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민" (즉, 마카카 파시쿨라리스 (Macaca fascicularis))은 UniProt 수탁 번호 A2V9Z4를 지칭하며, 용어 "인간 혈청 알부민"은 UniProt 수탁 번호 P02768을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, HER2는 Neu, ErbB-2, CD340 (분화 클러스터 340) 또는 p185로도 알려진 인간 표피 성장 인자 수용체 2에 관한 것이다. HER2는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR/ErbB) 패밀리의 구성원이다. 인간에서, HER2는 인간 염색체 17의 긴 아암 (arm) (17q12)에 위치한 알려진 원발암유전자인 ERBB2에 의해 인코딩된다. HER2는 UniProtKB/Swiss-Prot 번호 P04626을 갖는다. 인간 HER2는 21개의 아미노산 신호 서열, 631개의 아미노산 세포외 영역 (예를 들어, 도메인 I 내지 도메인 IV를 포함하는 엑토도메인), 23개의 아미노산 막관통 영역, 및 580개의 아미노산 세포질 도메인을 갖는 1255개의 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 맥락에서, "개선된 저장 안정성"은 PBS에서 10 mg/ml로 1개월 동안 40℃에서 저장 후 발생하는 분해 밴드의 양의 감소, 바람직하게는 분해 산물의 양의 감소가, 쿠마시 염색(Coomassie-stained) SDS-PAGE에 의해 검출될 때, 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 50%임을 의미한다. SDS-PAGE에 의해 저장 안정성을 평가하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 개선된 저장 안정성 특성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인 및 재조합 결합 단백질의 예는 실시예 2 및 실시예 3에 제공되어 있다.

"혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질"이란 표현은, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인들 중 하나를 제외한 전부 및 상응하는 폴리펩티드 링커를 제거함으로써, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 수가 하나로 감소된 본 발명의 재조합 결합 단백질의 조성을 갖는 재조합 결합을 의미한다.

용어 "이중-파라토프성 결합 단백질"은 동일한 표적 단백질 상에 위치한 2개의 상이한 에피토프에 대해 유도된 결합 단백질을 의미한다. 예를 들어, HER2를 표적화하는 이중-파라토프성 결합 단백질은 HER2 상의 제1 에피토프를 표적화하는 제1 결합 도메인 및 HER2 상의 상이한 제2 에피토프를 표적화하는 제2 결합 도메인을 적어도 포함한다. 서열 번호 32로 이루어진 단백질은 HER2 상의 상이한 에피토프를 표적화하는, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 이중-파라토프성 결합 단백질이다. 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질은 서열 번호 32를 포함한다.

본 발명에서 "개선된 약동학적 특성을 나타낸다", "개선된 약동학적 특성" 또는 "약동학적 특성 개선"이라는 표현은, 재조합 결합 단백질의 약동학적 파라미터가 그와 비교되는 단백질의 상응하는 약동학적 파라미터에 비해 개선된다는 의미를 갖는다. 상응하는 예는 실시예 8, 실시예 9, 실시예 10, 및 실시예 11 (도 5 및 도 6 참조)에 나타나 있다. 바람직하게는, 개선된 약동학적 특성은 감소된 제거율 및/또는 증가된 노출률 및/또는 증가된 최종 반감기이다. 더 바람직하게는, 개선된 약동학적 특성은 증가된 최종 반감기이다. 일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 2개, 더 바람직하게는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 또는 250%의 증가된 최종 반감기 및/또는 감소된 제거율 및/또는 증가된 노출률을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 2개, 더 바람직하게는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질은 증가된 최종 반감기, 바람직하게는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 상응하는 재조합 결합 단백질에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 또는 250%의 증가된 최종 반감기를 나타낸다.

바람직하게는, 제거율 및/또는 노출률 및/또는 최종 반감기는 포유류, 더 바람직하게는 마우스 및/또는 사이노몰거스 원숭이, 더 바람직하게는 사이노몰거스 원숭이에서 평가된다. 바람직하게는, 마우스에서 제거율 및/또는 노출률 및/또는 최종 반감기를 측정하는 경우에, 평가는 주사 후 48시간까지의 데이터를 고려하여 수행된다. 더 바람직하게는, 마우스에서 최종 반감기의 평가는 24시간으로부터 48시간까지 계산된다. 바람직하게는, 사이노몰거스 원숭이에서 제거율 및/또는 노출률 및/또는 최종 반감기를 측정하는 경우에, 평가는 주사 후 7일째까지의 데이터를 고려하여 수행된다. 더 바람직하게는, 사이노몰거스 원숭이에서 최종 반감기의 평가는 1일째로부터 5일째까지 계산된다. 당업자는 또한 표적-매개 제거 (target-mediated clearance)와 같은 효과들을 확인하고 최종 반감기를 계산할 때 이들을 고려할 수 있다. 본 발명의 재조합 결합 단백질과 같은 약물의 "최종 반감기"라는 용어는 유사 평형 (pseudo-equilibrium)에 도달된 후에, 포유류에 적용된 약물의 혈장 농도의 절반에 도달하는 데 필요한 시간 (예를 들어, 마우스에서는 24시간으로부터 48시간까지 계산되거나, 사이노몰거스 원숭이에서는 1일째로부터 5일째까지 계산됨)을 지칭한다. 최종 반감기는 포유류에 투여된 약물의 용량의 절반을 제거하는 데 필요한 시간으로서 정의되지 않는다. 용어 최종 반감기는 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 약동학적 비교는 임의의 용량, 더 바람직하게는 등가 용량 (즉, 동일한 mg/㎏ 용량) 또는 등몰 용량 (즉, 동일한 몰/㎏ 용량), 더 바람직하게는 등몰 용량 (즉, 동일한 몰/㎏ 용량)으로 수행된다. 동물에서 등가 및/또는 등몰 투여가 적어도 20%, 더 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 실험 용량 변동에 적용된다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 바람직하게는, 약동학적 측정에 사용되는 용량은 0.001 내지 1000 mg/㎏, 더 바람직하게는 0.01 내지 100 mg/㎏, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/㎏, 더 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/㎏으로부터 선택된다.

실시예

일반적인 재료 및 방법: 본 명세서에 개시된 모든 표준 물질 및 시약은 당업자에게 알려져 있으며, 구매가능하거나, 익히 공지된 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 세포주는 LGC/ATCC (프랑스/미국)로부터 구매하였다. 세포 배양 배지는 Invitrogen/Lubio (스위스 소재)로부터의 것이었다. 달리 언급되지 않는 한, 방법은 당업자에게 잘 알려진, 기재된 확립된 프로토콜에 따라 수행된다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York]). 사용된 일부 방법은 이전에 국제특허 공개 WO2012/069654호 및 국제특허 공개 WO2014/083208호에 기재되어 있다.

설계된 안키린 반복 도메인: 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 생성하는 방법은 국제특허 공개 WO2012/069654호에 기재되어 있다. HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 생성하는 방법, 및 이러한 설계된 안키린 반복 도메인의 예 및 이중-파라토프성 결합 단백질을 생성하는 방법은 국제특허 공개 WO2014/083208호에 기재되어 있다. 설계된 안키린 반복 도메인은 일반적으로 국제특허 공개 WO2002/020565호에 상세히 기재되어 있다.

실시예 1: 재조합 DNA, 단백질 발현 및 단백질 정제

설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 DNA를 당업자에게 잘 알려진 유전적 수단에 의해 생성하였다. 서열 번호 21 내지 33의 아미노산 서열의 군으로부터 선택되며, 선택적으로 N 말단에 서열 번호 1을 추가로 갖는 재조합 결합 단백질, 또는 서열 번호 10 내지 20의 아미노산 서열의 군으로부터 선택되며, 선택적으로 N 말단에 서열 번호 1을 추가로 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을, 예를 들어 Qiagen (독일 소재)으로부터의 pQE 발현 시스템을 사용하여 표준 기법을 사용하여 에스케리키아 콜라이의 세포질에서 발현시켰다. 아미노산 GS가 N 말단에 있는 경우, 발현 벡터에 의해 추가로 인코딩된 Met 잔기는 발현된 폴리펩티드로부터 E. 콜라이의 세포질 중에서 효율적으로 절단되었는데, 이는 출발 Met 뒤에 작은 Gly 잔기 (즉, 예를 들어 서열 번호 21의 위치 1에 있는 아미노산)가 오기 때문이다. 세포를 French 프레스를 사용하여 용해시키고, 당업자에게 잘 알려진 표준 크로마토그래피 기법을 사용하여, 단백질을 조 세포 추출물로부터 거의 균질하게 정제하였다.

하기 목록은 본 발명에 사용되는 바와 같은 단백질을 정의한다:

단백질 #10-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 10

단백질 #11-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 11

단백질 #12-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 12

단백질 #13-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 13

단백질 #14-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 14

단백질 #15-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 15

단백질 #16-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 16

단백질 #17-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 17

단백질 #18-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 18

단백질 #19-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 19

단백질 #20-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 20

단백질 #21: 서열 번호 21

단백질 #21-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 21

단백질 #22: 서열 번호 22

단백질 #22-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 22

단백질 #23: 서열 번호 23

단백질 #23-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 23

단백질 #24: 서열 번호 24

단백질 #24-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 24

단백질 #25: 서열 번호 25

단백질 #25-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 25

단백질 #26: 서열 번호 26

단백질 #26-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 26

단백질 #27: 서열 번호 27

단백질 #27-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 27

단백질 #28: 서열 번호 28

단백질 #28-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 28

단백질 #29: 서열 번호 29

단백질 #29-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 29

단백질 #30: 서열 번호 30

단백질 #30-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 30

단백질 #31-His: 서열 번호 31 (이의 N 말단에 His-태그를 포함함)

단백질 #32: 서열 번호 32

단백질 #32-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 32

단백질 #33: 서열 번호 33

단백질 #33-His: His-태그 (서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 33

실시예 2. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안정성-개선된 설계된 안키린 반복 도메인의 생성 (서열 번호 14).

일반적인 설계된 안키린 반복 지식과는 대조적으로, 단백질 #12-His, 단백질 #13-His, 및 단백질 #15-His (국제특허 공개 WO2012/069654호; 실시예 1 참조)는 40℃에서 10 mg/㎏으로 PBS 중에서 장기간 인큐베이션 시에 분해되고, 이에 따라 약물 후보 중의 성분으로서 사용하기에 이상적이지 않은 것으로 확인되었다. 서열 번호 13의 아미노산 서열의 분석은 많은 수의 잠재적 분해 부위를 보여준다. 분해는, 예를 들어 추가의 잠재적 분해 부위 중에서 서열 번호 13의 5개의 아스파라긴 (아스파라긴-글리신 다이펩티드를 포함함), 13개의 아스파르테이트 또는 10개의 글리신 중 어느 하나 부근에서 일어날 수 있다. 서열 번호 13은 다수의 잠재적 산화 부위를 추가로 포함한다. 따라서, 많은 수의 돌연변이체 및 조합 돌연변이체를 분석하여 개선된 저장 안정성 특성을 나타내는 변이체를 단리해야 한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 서열 번호 13의 위치 80만을 돌연변이시킴으로써 저장 안정성에 대해 주요 효과를 나타내는 기능적 변이체를 발생시킬 수 있었다. 서열 번호 13의 위치 80에 있는 아스파르테이트를 글루타메이트로 돌연변이시켰을 때, 서열 번호 14에 상응하는, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 기능적인 설계된 안키린 반복 도메인이 생성되었으며, 이는 저장 안정성의 현저한 개선을 나타낸다 (실시예 3; 도 2). 단백질 #13-His와 마찬가지로, 단백질 #14-His는 PBS에서 pH 7.4의 인간, 마우스 및 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민에 대해 낮은 나노몰농도의 친화도 (100 nM 미만의 해리 상수 (Kd)) (제조사 (BioRad)에 따른 ProteOn 표면 플라즈몬 공명 측정)를 나타내었다. 놀랍게도, 단백질 #14-His는 잘 알려진 기법을 사용하여 열 풀림 (thermal unfolding)에 의해 결정될 때, 단백질 #13-His에 비해 열 변성의 개선된 중간점을 추가로 나타내었다 (문헌 [Niesen, F.H., Berglund, H., Vedadi, M., Nature Protocols 2, 2212-2221, 2007]; 단백질 #13-His: Tm = 86℃; 단백질 #14-His, Tm = 89.5℃; pH 6.0).

실시예 3. 서열 번호 14를 사용할 때 단백질 저장 안정성의 개선.

단백질 #13-His, 단백질 #14-His 및 단백질 #15-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 샘플을 PBS 중에서 10 mg/ml로 농축시켰다. 이어서, 단백질 #14-His와 단백질 #15-His를 유리 바이알에 -80℃ 또는 40℃에서 1개월 동안 저장 후, SDS 15% PAGE 상에서 분석하였다. 단백질 #14-His와 단백질 #15-His는 -80℃에서의 저장 시 등가의 안정성을 나타내었으나, 40℃에서 1개월 저장 후, 단백질 #14-His는 단백질 #15-His에 비해, SDS 15% PAGE 상에서 50% 초과 감소로 유의하게 감소된 분해 산물의 양을 나타내었다. 유사하게, PBS에서 10 mg/ml로 4℃, 25℃, 40℃ 및 60℃에서 1주 동안 저장한 경우에, 단백질 #14-His는 단백질 #13-His에 비해 유의하게 감소된 분해 산물의 양을 나타내었다. 특히, 각각 40℃ 또는 60℃에서 저장한 경우에 둘 모두에서, 단백질 #14-His는 단백질 #13-His에 비해, SDS 15% PAGE 상에서 분해 산물의 50% 초과의 감소를 나타내었다 (도 2). 이들 조사결과는 단백질 #14-His가 단백질 #13-His 및 단백질 #15-His에 비해 개선된 저장 안정성을 가지고 있음을 예시한다. 유사하게, 40℃에서 1개월 동안 유리 바이알에서 PBS 중에 10 mg/ml로 단백질을 인큐베이션함으로써, 단백질 #12-His, 단백질 #13-His, 단백질 #14-His, 및 단백질 #15-His의 저장 안정성을 비교하는 경우에 (실시예 1 참조), 단백질 #12-His, 단백질 #13-His, 및 단백질 #14-His는 단백질 #15-His에 비해 30% 초과의 분해 산물의 감소를 나타낸다.

단백질 #21 및 단백질 #22 (각각 서열 번호 21 및 22에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 재조합 결합 단백질)의 저장 안정성을 시험할 때, 저장 안정성 개선이 또한 관찰된다. 단백질 #21 및 단백질 #22를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고, 샘플을 PBS 중에서 10 mg/ml로 농축하고, 유리 바이알에서 -80℃ 또는 40℃에서 1개월 동안 저장 후, 표준 크기 배제 크로마토그래피로 분석한다. 단백질 #21과 단백질 #22는 -80℃에서의 저장 시에 등가의 용리 프로파일을 나타내지만, 단백질 #21은 40℃에서의 저장 시에 단백질 #22에 비해 상당히 더 많은 단량체 종을 나타낸다. 이는 재조합 결합 단백질 내에 서열 번호 21이 존재하는 것이 서열 번호 22가 존재하는 것보다 저장 안정성에 대해 더 유리하다는 것을 나타낸다. 유사하게, 유리 바이알에서 PBS 중에 10 mg/ml로 40℃에서 1개월 저장 후, SDS-PAGE에 의해 분석한 경우에, 단백질 #21은 단백질 #22보다 더 낮은 양의 분해 산물을 나타내는데, 이는 서열 번호 22를 포함하는 재조합 결합 단백질에 비해, 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질의 더 높은 저장 안정성을 확인시켜 주었다. 결과적으로, 이는, 재조합 결합 단백질에 존재하는 서열 번호 14로 이루어진 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 갖는 것이, 존재하는 서열 번호 13으로 이루어진 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 갖는 것보다 저장 안정성 능력에 관하여 더 유리함을 나타낸다.

실시예 4: 약물 후보의 생성

HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 예가 이전에 개시되었다 (국제특허 공개 WO2014/083208호; 국제특허 공개 WO2014/060365호; 문헌 [SSteiner, D., Forrer, P. and

, A., J. Mol. Biol. 382, 1211-1227, 2008]; 문헌 [Zahnd, C., Pecorari, F., Straumann, N., Wyler, E. and

, A., J. Biol. Chem. 281(46), 35167-35175, 2006]). 국제특허 공개 WO2014/083208호 및 국제특허 공개 WO2014/060365호에서는, 상이한 도메인들에 결합하는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인들을 조합하여, 종양 세포 성장의 향상된 억제를 나타내는 이중-파라토프성 결합 단백질을 생성하였다.

서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질은, 폴리펩티드 링커들 (각각 서열 번호 9)에 의해 연결된, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 (각각 서열 번호 16 및 17)뿐만 아니라, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 플랭킹하는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 (각각 서열 번호 14)을 포함하는 약물 후보이다 (도 1 참조). 이러한 재조합 결합 단백질은, 특히 단백질 조작 및 최적화 단계를 포함하는 복잡한 절차에 의해 확인되었다. 제1 단계에서는, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인들의 수백 개의 조합을 클로닝, 발현 및 정제에 의해 이중-파라토프성 결합 단백질로서 생성하였다 (실시예 1 참조). 이어서, 이중-파라토프성 결합 단백질을 WO2014/083208호에 기재된 바와 같이 그리고 하기에 기재된 바와 같이 HER2에 대한 친화성뿐만 아니라 세포 효력 (cellular potency) 및 세포 증식 억제에 대해 스크리닝하였다. 이러한 노력으로 얻은 이중-파라토프성 결합 단백질의 대표적인 결과가 실시예 5 및 실시예 6에 제공되어 있다. 중요한 것은, 분자는 이중-파라토프성이어야 할 필요가 있다는 점인데, 그 이유는, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 도메인을 갖는 경우 세포 억제 효력을 갖지 않는 분자를 초래하기 때문이다. 재조합 결합 단백질을 추가로 조작하였다. 이 단계는 (특히) 약동학적 조작을 포함하였는데, 이러한 약동학적 조작은 이중-파라토프성 결합 단백질에 다양한 포맷의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 첨가함으로써 (즉, 분자 내의 상이한 위치에서 상이한 수의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 첨가함으로써), 그리고 다양한 폴리펩티드 링커를 시험함으로써 행해진다. 이들 단백질을 생체내 효능 (대표적인 실시예 7), 마우스에서의 약동학적 특성 (대표적인 실시예 8), 및 사이노몰거스 원숭이에서의 약동학적 특성 (대표적인 실시예 9)뿐만 아니라 세포 효력에 대해 시험하였다. 폴리펩티드 링커의 최적화는 약동학적 프로파일에 대한 링커의 효과를 시험하는 단계를 포함하였다 (대표적인 실시예 10). 약동학적 조작 노력의 최적화를 약동학적 측정 (대표적인 실시예 11) 및 효력 측정 (대표적인 실시예 12)에 의해 평가하였다. 더욱이, 다양한 약물 후보를 E. 콜라이에서 그들의 재조합 발현 수준에 대해 시험하였다 (실시예 13). 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질은 이러한 노력으로부터 생성된 단백질이다. 이는 인간에 사용하기 위한 약물 후보이다.

서열 번호 31로 이루어진 재조합 결합 단백질인 단백질 #31은 단백질 #21 및 N 말단에 있는 서열 번호 1의 아미노산으로 이루어진 단백질에 상응한다.

실시예 5: 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질에 의한 HER2의 고친화성 결합.

단백질 #21-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. HER2에 대한 그의 친화도를 국제특허 공개 WO2014/083208호에 기재된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 당업자에게 잘 알려진 방법인, 상이한 농도에 대해 얻어진 공명 단위 값의 전역적 적합화 (global fitting)에 의해 27 pM의 해리 상수가 결정되었다. 비교하여, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 다른 조합을 포함하는 단백질 #23-His (실시예 1 참조)는 64 pM의 해리 상수를 나타내었다. 마찬가지로, 서열 번호 16 및 도 17에 상응하는 설계된 안키린 반복 도메인들의 조합은 국제특허 공개 WO2014/083208호로부터 알려진 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 기초하여 생성된 대부분의 조합보다 더 우수한 해리 상수를 나타내었다.

표면 플라즈몬 공명 측정은 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질이 HER3 또는 EGFR의 세포외 도메인과 상호작용하지 않음을 추가로 나타내었다.

표면 플라즈몬 공명 측정은, 서열 번호 16 또는 17로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인 (각각은 N 말단에 있는 서열 번호 1을 추가로 포함함)이 HER2 결합에 대해 각각 9 pM 및 152 pM의 해리 상수를 나타낸다는 것을 추가로 보여주었다.

표면 플라즈몬 공명 실험은 단백질 #21이 인간 HER2 및 인간 혈청 알부민에 동시에 결합할 수 있음을 추가로 보여주었다.

표면 플라즈몬 공명 실험은 100 nM의 단백질 #21이 21 nM의 해리 상수 (Kd)로 인간 혈청 알부민과 결합함을 추가로 보여주었다.

실시예 6: 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질의 높은 세포 효력 및 아폽토시스의 유도.

단백질 #21-His 및 단백질 #23-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. BrdU-표지화 (labeling) (BrdU, 세포 증식 ELISA, Roche)를 사용하여 DNA 합성을 측정함으로써, BT474 세포 증식에 대한 재조합 결합 단백질의 효과를 결정하였다. 간략하게 말하면, 100 ul의 완전 배지 중 웰당 10000개의 BT474 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 재조합 결합 단백질 또는 대조군을 추가 72시간 동안 첨가하였다. 세포 표지화를 위한 BrdU를 마지막 24시간 동안 첨가하였다. 표지된 (증식) 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 검출하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여, y-축 상의 OD450-602 nm에 대해 x-축 상의 log [c]를 도표로 나타내었다. 비선형 회귀 적합 (log (길항제) vs. 반응 - 가변 기울기 (4개의 파라미터))을 사용하여 데이터를 적합화하여 IC₅₀ 값을 도출하였다. 결과는 도 3에 나타나 있다. 단백질 #21-His는 1.5 nM의 겉보기 IC₅₀ 값으로 BT474 세포의 증식을 억제한다. 2.4 nM의 60% 더 높은 (즉, 악화된) IC₅₀이 단백질 #23-His에 대해 관찰되는데, 이는 재조합 결합 단백질 내에 서열 번호 16 및 17을 갖는 것이 서열 번호 18 및 17을 갖는 것보다 더 유리함을 나타낸다. 마찬가지로, 서열 번호 16 및 도 17에 상응하는 설계된 안키린 반복 도메인들의 조합은 국제특허 공개 WO2014/083208호로부터 알려진 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 기초하여 생성된 대부분의 조합에 대해 관찰된 것보다 더 낮은 겉보기 IC₅₀ 값으로 BT474 세포를 억제하였다.

서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질 (단백질 #21)은 세포주 SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, HCC1419, 또는 MDA-MB175를 포함하는 다양한 암 세포주에 대해 강한 증식 억제를 추가로 나타내었다.

Caspase 3/7-Glo 시스템 (스위스 소재의 Promega)을 사용하여 카스파제3/7 활성화를 측정함으로써, 단백질 #21에 의한 아폽토시스의 유도를 결정하였다. 간략하게 말하면, 100 ul의 완전 배지 중 웰당 10000개의 BT474 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 #21 및 벤치마크를 추가 24시간 동안 첨가하였다. Caspase Glo 시약을 제조사의 프로토콜에 따라 1시간 동안 첨가하였다. 루시페라제 활성을 측정함으로써 카스파제3/7 활성화를 모니터링하였다. 대안적으로, 세포사 검출 ELISAPLUS 시스템 (스위스 소재의 Roche)을 사용하여 아폽토시스의 유도를 결정하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 검정을 수행하였다. 세포수 및 인큐베이션 시간은 Caspase Glo 판독치와 유사하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여, y-축 상의 OD405/490 nm 또는 상대 광 단위 (RLU; Tecan M-1000 판독기 상에서 측정됨)에 대한 x-축 상의 농도를 도표로 나타내었다. 비선형 회귀 적합 (log (효능제) vs. 반응 - 가변 기울기 (4개의 파라미터))을 사용하여 데이터를 적합화하였다. 결과는 도 7에 나타나 있다. 단백질 #21의 경우, 2.4 nM의 EC50이 관찰되었다. 아폽토시스는 세포주 SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, HCC1419, 또는 MDA-MB175에 대한 아폽토시스를 유도함에 있어서 마찬가지로 높은 효력을 나타낸다. 대조적으로, 항체 트라스투주맙, 퍼투주맙, 또는 트라스투주맙과 퍼투주맙의 혼합물은 BT474 세포에서 아팝토시스를 유도하지 않았다 (도 7).

중요한 것은, 이들 검정은 서열 번호 32가 서열 번호 14에 의해 플랭킹된 단백질 #21이, 서열 번호 32를 단독으로 사용하는 경우와 유사하게, 높은 세포 효력을 나타냄을 보여준다는 것이다.

실시예 7: 마우스 종양 이종이식편 모델에서 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질의 높은 효능

단백질 #21-His, 단백질 #23-His, 단백질 #24-His, 단백질 #25-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 한 연구에서는, 단백질 #21-His를 트라스투주맙 및 PBS와 비교하였다. 결과는 도 4a에 나타나 있다. BT474 유방암 종양 이종이식편 마우스 모델은 당업자에게 잘 알려진 절차를 사용하여 하기와 같이 본질적으로 수행하였다: BT474 인간 유방 암종 세포를 배양하고, 재현탁시키고, 마우스당 50:50 Matrigel (BD Biosciences)을 함유하는 200 μl의 RPMI 1640 배지 중 2*10⁷개의 세포를 암컷 Balb/c 누드 마우스의 우측 옆구리 내로 주사하였다. 약 200 내지 300 ㎣의 종양 부피일 때, 마우스를 8 마리의 동물로 이루어진 군으로 무작위 배정하고, PBS, 트라스투주맙 (10 mg/㎏), 트라스투주맙 (10 mg/㎏) 및 퍼투주맙 (10 mg/㎏), 또는 단백질 #21-His (35 mg/㎏)를 3일 간격으로 7회 용량 (Q3Dx7) 동안 정맥내 (i.v.) 투여함으로써 종양 처리를 시작하였다. 종양 부피를 32일 동안 측정하였다. 단백질 #21-His는 트라스투주맙보다 종양 성장을 억제하는 데 있어서 더 효능이 있다.

BT474 세포를 사용한 유사한 연구 (동일한 설정 및 절차; 모두 35 mg/㎏의 용량)에서, 단백질 #21-His를 단백질 #23-His, 단백질 #24-His, 및 단백질 #25-His와 비교하였다. 처리 후 18일째의 결과가 도 4b에 나타나 있다. 중요한 것은, 단백질 #21-His는 단백질 #23-His, 단백질 #24-His, 또는 단백질 #25-His보다 종양을 억제하는 데 있어서 더 효능이 있다는 점이다.

또한, 단백질 #21을 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. PBS, 단백질 #21 (60 mg/㎏), 트라스투주맙 (10 mg/㎏), 퍼투주맙 (10 mg/㎏)뿐만 아니라 트라스투주맙과 퍼투주맙 (각각 10 mg/㎏)의 병용물을 당업자에게 잘 알려진, 환자 유래 위암 종양 이종이식편 마우스 모델에 사용하였다. 모든 군에 매 3일마다 6회 동안 투여하였다. 간략하게 말하면, 누드 마우스에서 연속 계대 중인 이종이식편으로부터 종양 단편을 획득하였다. 공여체 마우스로부터 적출한 후, 피하 이식을 위해 종양을 단편 (4 내지 5 mm 직경)으로 절단하였다. 종양이 대략 100 내지 120 ㎣의 부피에 도달하였을 때 마우스를 군으로 무작위 배정하였다. 무작위 배정 및 처리 개시 당일을 각각의 실험에서 0일째로서 지정한다. 종양 성장을 무작위 배정 당일에 그리고 이어서 주 2회 캘리퍼를 사용하여 2차원 측정에 의해 모니터링하였다. x일째의 개별 종양 부피 (Tx)를 0일째의 동일한 종양의 개별 부피 (T0)로 나누고 100%를 곱함으로써 x일째에 대한 개별 종양의 상대 부피 (개별 RTV)를 계산하였다. 대조군에 대한 시험군의 중위 RTV 값의 비에 100%를 곱하여, 특정 날짜에 대한 종양 억제 (T/C, 단위 %)를 계산하였다. 도 4c는 위암 PDX 모델 GXA3039에서 트라스투주맙 및 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물과 비교하여 단백질 #21의 효능을 보여준다. 단백질 #21은 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물과 유사한 종양 성장의 강한 억제를 나타내는 반면, 트라스투주맙 단독은 덜 효능이 있다. 도 4d는 단백질 #21을 트라스투주맙, 퍼투주맙, 및 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물과 비교하는 동일한 모델에서의 두 번째 실험을 보여준다. 단백질 #21은 트라스투주맙과 퍼투주맙의 병용물과 유사한 종양 성장의 강한 억제를 나타낸다. 트라스투주맙 단독 및 퍼투주맙 단독은 상당히 덜 효능이 있다. 이는 종양 모델이 시간 경과에 따라 획득된 트라스투주맙 저항성을 가질 수 있었음을 나타낸다. 결과적으로, 이는 단백질 #21이 트라스투주맙-저항성 암에서도 효능이 있음을 시사한다.

유사한 실험에서, 당업자에게 잘 알려진 위암 PDX 마우스 모델 GXA281에서 표준 치료 (standard of care) 라파티닙과 비교하여 단백질 #21을 추가로 시험하였다 (도 4e). 간략하게 말하면, 종양 이식 및 종양 성장 모니터링을 전술된 바와 같이 행하였다. 라파티닙은 21일 동안 매일 100 mg/㎏/day로 정맥내 투여하고, 단백질 #21은 6회 동안 매 3일마다 40 mg/㎏으로 정맥내 투여하였다.

이 실시예의 이들 실험은 질병의 치료에 있어서 약제로서의 사용을 위한 서열 번호 21을 포함하는 단백질의 유용성을 예시한다.

실시예 8: 마우스에서의 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질의 유리한 약동학적 특성.

이 실시예에 나타낸 측정은 실시예 11에 기재된 바와 같은 반감기 조작 노력의 결과이다. 단백질 #21-His 및 단백질 #23-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. His-태그된 단백질의 약동학적 특성을 어딘가 다른 곳에 기재된 바와 같이 마우스에서 평가하였다 (문헌 [Zahnd, C., Kawe, M., Stumpp, M.T., de Pasquale, C., Tamaskovic, R., Nagy-Davidescu, G., Dreier, B., Schibli, R., Binz, H.K., Waibel, R.,

, A., Cancer Res.70, 1595-1605, 2010]). 결과는 도 5에 나타나 있다. 단백질 #21-His는 30.4시간의 최종 반감기를 나타내며, 아울러 19.5% ID가 48시간 후에 남아 있다. 비교하여, 단백질 #23-His는 24.7시간의 최종 반감기를 나타내며, 아울러 6.5% ID가 48시간 후에 남아 있다. 따라서, 재조합 결합 단백질 내에 서열 번호 16이 존재하는 것이 서열 번호 18이 존재하는 것보다 더 유리한 것으로 나타난다.

실시예 9: 사이노몰거스 원숭이에서의 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질의 유리한 약동학적 특성.

이 실시예에 나타낸 측정은 실시예 11에 기재된 바와 같은 반감기 조작 노력의 결과이다. 단백질 #21-His, 단백질 #23-His, 및 단백질 #24-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 단백질의 약동학적 특성을 사이노몰거스 원숭이에서 평가하였다. 사이노몰거스 원숭이에게 1 mg/㎏ 사이의 표적 용량 수준으로 30분 동안 정맥내 주입을 통해 단백질을 투여하였다. 투여 전에, 그리고 다시, 주입 종료 후 (즉, 주사 후) 선택된 시점에서, 예를 들어 5분째, 10분째, 0.5시간째, 1시간째, 2시간째, 4시간째, 8시간째, 12시간째, 24시간째, 48시간째, 72시간째, 96시간째, 120시간째, 144시간째, 168시간째, 192시간째, 216시간째, 및 240 시간째에 혈액 샘플을 수집하였다. 혈액 샘플을 실온에서 방치하고, 원심분리하여 혈청을 생성한 후, 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 약동학적 파라미터는 당업자에게 잘 알려진 절차를 사용하여 결정하였다. 포획 시약으로서 토끼 단일클론 항 설계된 안키린 반복 도메인 항체를 그리고 검출 시약으로서 뮤린 단일클론 항 설계된 안키린 반복 도메인 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해, 그리고 표준 곡선을 사용하여, 단백질의 혈청 농도를 측정하였다. Phoenix WinNonLin (미국 프린스턴 소재의 Certara) 또는 GraphPadPrism (미국 라호이아 소재의 GraphPad Software)과 같은 표준 소프트웨어, 및 비구획 분석과 같은 표준 분석을 사용하여 약동학적 파라미터를 결정하였다. 단백질 #21-His 및 단백질 #23-His에 대한 결과가 도 6에 나타나 있다. 단백질 #21-His는 47시간의 최종 반감기를 나타내는 반면, 단백질 #23-His는 35시간의 최종 반감기를 나타내었고, 단백질 #24-His는 45시간의 최종 반감기를 나타내었다. 농도가 100 nM 미만으로 떨어지면, 단백질은 또한 유의한 표적-매개 제거를 나타낸다. 표적-매개 제거는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 HER2를 표적화하는 항체로부터 알려져 있다.

유사하게, 단백질 #21-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 단백질의 약동학적 특성을 1 mg/㎏, 5 mg/㎏ 및 10 mg/㎏에서 전술된 바와 같이 사이노몰거스 원숭이에서 평가하였다. 약동학적 파라미터를 전술된 바와 같이 평가하였으며, 그 결과가 도 6에 나타나 있다. 1 mg/㎏에서의 47시간부터 5 mg/㎏에서의 100시간까지, 이어서 10 mg/㎏에서의 100시간 초과까지의 최종 반감기의 용량 의존적 증가가 관찰되었다. 일단 농도가 100 nM 미만으로 떨어지면, 표적 매개 제거가 관찰된다.

(실시예 1에 기재된 바와 같이 발현되고 정제된) 단백질 #21을 시험할 때 유사한 결과가 관찰된다. 단백질의 약동학적 특성을 1 mg/㎏, 10 mg/㎏ 및 100 mg/㎏에서 전술된 바와 같이 사이노몰거스 원숭이에서 평가한다. 약동학적 파라미터를 전술된 바와 같이 평가한다. 최종 반감기의 용량 의존적 증가가 관찰된다. 단백질 #21의 경우, 109.5시간 또는 130.6시간의 최종 반감기가 사이노몰거스 원숭이에서 100 mg/㎏의 용량에서 관찰되었다.

실시예 10: 폴리펩티드 링커의 선택에 의한 약물 특성의 개선.

단백질 도메인들을 연결하는 폴리펩티드 링커들은 당업자에게 잘 알려져 있다. Gly-Ser-풍부 링커는 단일 사슬 Fv 항체 단편으로부터 잘 알려져 있고, 이들은 2개의 Fv 폴리펩티드 사슬을 연결시키는 데 가장 적절한 것으로 입증되어 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 Pro-Thr-풍부 링커가, Gly-Ser-풍부 링커에 비하여, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 및 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 약동학적 특성에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 알아낸다. 단백질 #26-His 및 단백질 #27-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 마우스에서의 약동학적 분석을 실시예 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 정맥내 주사 후 48시간째에, 단백질 #27-His는 주사된 용량의 7%가 남아 있었던 반면, 단백질 #26-His는 단지 5.3%의 주사 용량만이 남아 있었다. 유사하게, 단백질 #27-His는 단백질 #26-His보다 더 긴 최종 반감기를 나타내었다.

실시예 11: 약동학적 특성의 조작

특히, 페길화(PEGylation), 폴리펩티드 연장, Fc-융합, 혈청 알부민-융합, 및 혈청 알부민에 대한 결합을 포함하는 약동학적 가공에 대한 많은 선택사항이 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Kontermann, R (Ed.) "Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives", Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527-32849-9]). 예를 들어, 서열 번호 16 및 17을 포함하는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인들의 조합으로부터 시작하여, 수백 개의 잠재적인 약물 후보 변이체 (다른 측면 중에서 특히, 약동학적 변형 조작의 선택, 폴리펩티드 링커 (예를 들어, 많은 다른 것 중에서 특히, 서열 번호 2 내지 9)의 선택)가 존재한다. 본 발명자들은 서열 번호 14로 이루어진 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 (실시예 2 및 실시예 3 참조)을 사용하고, Pro-Thr-풍부 폴리펩티드 링커 (서열 번호 9)를 사용하여 서열 번호 21을 생성함으로써, 유익한 약동학적 특성이 달성되며, 이는 시험된 다른 포맷에 비해 명백한 이점을 갖는다는 것을 알아내었다. 폴리펩티드 링커의 선택의 효과의 결과가, 예를 들어 실시예 10에 나타나 있다. 단백질 #29-His와 단백질 #30-His의 마우스 약동학적 프로파일의 비교는 놀랍게도 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 단지 1개의 설계된 안키린 반복 단백질을 갖는 것과 비교하여 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 갖는 것의 이익을 보여주는데 (도 5 참조), 이는, 알부민 결합 도메인에 대한 문헌이 분자 내에 존재하는 2개의 알부민 결합 도메인을 갖는 것이 존재하는 단지 1개의 알부민 결합 도메인만을 갖는 것과 비교하여 약동학적 특성에 어떠한 이익도 가져오지 않는다고 나타내고 있기 때문이다 (문헌 [Hopp et al.], 인용된 곳에서 참조). 유사하게, 단백질 #21 (서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질)을, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 C-말단 설계된 안키린 반복 도메인이 누락된 단백질 #21 변이체 (서열 번호 21의 아미노산 1 내지 422, 이는 단백질 #33을 생성함)와 비교할 때, 단백질 #21은 현저하게 개선된 약동학적 특성, 특히 더 긴 최종 반감기를 나타낸다. 5 mg/㎏ 용량의 단백질 #21의 사이노몰거스 원숭이 약동학적 프로파일을 페길화된 단백질 #28 (이는 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 동일한 설계된 안키린 반복 도메인 (서열 번호 16 및 17)을 포함하지만, 단백질 #28은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 대신에 40 kDa PEG 모이어티를 포함함)과 비교한 결과, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 단백질이 현저하게 개선된 약동학적 특성을 나타냄을 나타낸다. 실시예 9에 기재된 바와 같이, 단백질 #21-His와 단백질 #24-His의 약동학적 프로파일의 비교는, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인이, 서열 번호 16 및 17을 플랭킹하는 것이 이들 둘 모두가 N-말단에 있는 것보다 더 유리함을 보여준다 (도 6 참조).

이 실시예에서의 연구를 위해, 단백질 #21-His, 단백질 #24-His, 단백질 #28-His, 단백질 #29-His, 및 단백질 #30-His를 실시예 1에 따라 제조하였다. 단백질 #28-His를 40 kDa PEG 모이어티 (NOF Sunbright GL2-400MA)를 사용하여 단백질 #28-His의 자유 C-말단 시스테인 상에의 PEG-모이어티의 말레이미드 커플링에 의해 추가로 페길화한 후, 표준 정제 방법, 당업자에게 잘 알려진 절차를 사용하여 균일하게 정제하였다. 마우스 또는 사이노몰거스 원숭이에서의 약동학적 분석을 실시예 8 및 실시예 9에 기재된 바와 같이 수행하였다.

실시예 12: 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질은 서열 번호 24를 포함하는 재조합 결합 단백질에 비해 더 우수한 생체내 효력을 나타낸다

단백질 #21-His 및 단백질 #24-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 마우스 이종이식편 실험을 실시예 7에 기재된 바와 같이 수행하였다. 결과는 도 4b에 나타나 있다. 32일의 처리 후에, 단백질 #21-His는 단백질 #24-His보다 유의하게 더 우수한 종양 억제를 나타낸다. 이는, (서열 번호 #21에서 확인되는 바와 같은) 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 플랭킹하는 것이, (서열 번호 24에서 확인되는 바와 같은) 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인 둘 모두가, HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 N-말단에 있는 것보다 더 유리함을 나타낸다.

실시예 13: E. 콜라이에서 높은 재조합 발현 수율.

단백질 #21, 단백질 #23, 및 단백질 #25를 인코딩하는 서열을 표준 T7 프로모터 벡터 내에 클로닝하고, 단백질을 E. 콜라이 HMS 174 (DE3)에서 발현시켰다. 단백질 #21의 경우, 4.4 g/l의 역가가 달성된 반면, 단백질 #23은 1.9 g/l의 역가를 나타내었고, 단백질 #25는 2.1 g/l의 역가를 나타내었는데, 이는 단백질 #21의 발현이 최상임을 나타낸다. 따라서, 놀랍게도, 단백질 #21에 사용된 설계된 안키린 반복 도메인들의 배열은, 예를 들어, 동일한 성분 (설계된 안키린 반복 도메인 및 폴리펩티드 링커)이 사용됨에도 불구하고, 단백질 #25에 사용된 다른 배열에 대해 관찰된 것보다 더 높은 재조합 발현으로 이어진다. 흥미롭게도, 서열 번호 16 및 17에 상응하는 설계된 안키린 반복 도메인들의 조합은 국제특허 공개 WO2014/083208호로부터 알려진 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 기초하여 생성된 대부분의 조합보다 더 우수한 재조합 단백질 발현을 나타내었다.

실시예 14: 단백질 #21에 의한 2개의 혈청 알부민 분자의 동시 결합.

단백질 #21을 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 정적 광 산란에 결합된 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200 10/300GL (GE Healthcare), Agilent 1200 (Life Technologies), Wyatt Optilab Trex (RI) 및 MiniDawnTreos (MALS))를 PBS 중의 30 μM 단백질 #21, 60 μM 인간 혈청 알부민 (CSL Behring 20% 용액을 사용하여 Superdex 200 26/60 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 인간 혈청 알부민의 단량체 분획을 정제함), 또는 이들 2개의 1:2 혼합물을 사용하여 수행하였다.

단백질 #21은 단량체 피크로서 용리되고, MALS에 의해 65.2 kDa의 분자량이 결정되었는데, 이는 이의 이론적 분자량 (66437 Da)의 1.2 kDa 이내이다. 혈청 알부민은 55.1 kDa의 단량체 피크로서 용리되었다 (이론적 분자량 58917 Da). 2개의 분자의 1:2 혼합물 (몰비)은 169.8 kDa (범위: 186.2 kDa 내지 136.6 kDa)의 평균 분자량을 갖는 주요 피크로 이어졌는데, 이는 1:2 복합체에 상응하는 분자량 종 (이론적 분자량: 191.8 kDa)뿐만 아니라, 1:1 복합체에 상응하는 분자량 종 (132.8 kDa)을 포함한다. 추가적으로, 실험에 사용된 혈청 알부민의 6.5%에 상응하는 유리 혈청 알부민의 작은 피크가 검출되었다. 유리 단백질 #21에 상응하는 분자 질량을 포함하는 피크는 검출되지 않았다. 이들 결과는 단백질 #21이 2개의 혈청 알부민 분자에 동시에 결합할 수 있음을 나타낸다.

실시예 15: 단백질 #21의 높은 열 안정성.

단백질 #21을 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 질소 분위기 (3 L/min)에서 Jasco J-815 CD 분광계를 사용하여 원편광 이색성을 사용하여 열 안정성을 평가하였다. 용액 중 온도 제어 센서 (in-solution temperature control sensor)를 구비한 117.100F-QS 큐벳(cuvette) (Hellma, d = 1 cm) 내의 PBS 중 0.4 μM의 단백질 #21을 측정하였는데, 20℃부터 95℃까지 가열하고 (45℃ 미만: +3℃/min; 45℃ 초과: +1℃/min), 222 nm에서의 신호를 기록하고, 95℃에서의 1분간 지연시키고, 후속 냉각 단계를 수행하였다 (가열 단계와 비교하여 반전된 프로그램). CD 신호를 정규화하여 deg ㎠ dmol^-1 단위로 잔기 타원율 (MRE)을 평균하였다. 추가적으로, 원(far)-UV CD 스펙트럼을 기록하였다.

단백질 #21은 208 nm 및 222 nm에서 특징적인 최소값을 갖는 알파-나선 단백질에 대해 전형적인 CD 스펙트럼을 나타낸다. 단백질 #21은 안정한 기준선 (기울기의 변화 없음) 후에 높은 열 안정성을 나타내며, 222 nm에서의 신호의 손실이 78℃보다 높은 온도에서 검출된다.

실시예 16: 포스포 -프로테옴에 대한 단백질 #21의 영향.

단백질 #21을 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. BT474 또는 NCI-N87 세포를 단백질 #21 (100 nM), 트라스투주맙 (100 nM), 퍼투주맙 (100 nM), 트라스투주맙 (100 nM)과 퍼투주맙 (100 nM)의 혼합물, 또는 PBS 중 어느 하나로 18시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포에 하기 문헌에 기재된 바와 같은 포스포-프로테옴 MS (질량 분석) 분석을 거쳤다: 문헌 [Britton, D., et al. (Britton, D., Zen, Y., Quaglia, A., Selzer, S., Mitra, Vl.,

, C., Jung, S.,

, G., Schmid, P., Prefot, P., Hoehle, C., Koncarevic, S., Gee, J., Nicholson, R., Ward, M., Castellano, L., Stebbing, J., Zucht, H.D., Sarker, D., Heaton, N., and Pike, I., 2014. PLOS One 9 (3), e90948)]. 이 분석은 단백질 #21에 의한 세포 처리가 트라스투주맙, 퍼투주맙, 및 이들 둘의 병용물에 비해 다수의 인산화된 펩티드를 차별적으로 조절하는 것을 보여준다. 결과는 표 1에 나타나 있다. 중요한 것은, 단백질 #21은 부위 1073/1078/1083, 1139/1151, 1172/1174, 1174, 및 1240에서 HER2의 인산화를 더 강하게 억제한다는 점에서, 트라스투주맙, 퍼투주맙, 및 트라스투주맙과 퍼투주맙의 혼합물과 일부 현저한 차이를 나타낸다. 다른 인산화 부위에서는, 인산화가 증가된다 (772). HER2의 하류에서, mTOR 신호전달 캐스케이드의 특정 구성원들이 단백질 #21에 의한 처리 시에 차별적으로 조절되는 것으로 확인되었는데; 예를 들어, S6키나제에 대한 포스포펩티드 (S441/T444/S447)는 PBS에 대해 0.63배 하향조절되었으며, 이와 비교하여 다른 군에서는 하향조절이 단지 0.88배 범위였다. 더욱이, MAPK1 및 MAPK3에 맵핑되는 인산화된 펩티드는 상당히 하향조절되었다.

AKT-S473에 대한 포스포-부위 특이적 ELISA (BioConcept: PathScan® 포스포-Akt1 (Ser473) 샌드위치 ELISA 키트 #7160)에 의한 동일한 샘플의 분석은 단백질 #21에 의해 PBS에 대해 0.16으로의 하향조절을 나타내었으며, 이와 비교하여 다른 군에서는 하향조절이 단지 0.3 내지 0.7배의 범위였다. ELISA의 결과는 표 2에 나타나 있다.

이들 결과는 단백질 #21이 트라스투주맙, 퍼투주맙 및 이들 둘의 병용물과 비교하여 HER2 하류 신호전달을 차별적으로 조절하고 있다는 것을 나타낸다. 가장 큰 차이는 세포 생존을 위한 중요한 경로인 AKT-mTOR 경로에서 관찰되었는데, 이는 결과적으로, 단백질 #21이 아폽토시스를 유도하고 있는 이유를 설명한다. 포스포이노시타이드 3-키나제 (PI3K/Akt) 경로는 아폽토시스를 차단함으로써 세포 생존을 유지하는 중요한 경로들 중 하나인 것으로 여겨진다. 따라서, 예를 들어 HER2/HER3-이종이량체화에 의한 이의 병리학적 활성화는 악성 증식으로 이어질 수 있다.

이 실험에서는, 단백질 #21에 대한 BT474 및 NCI-N87 세포의 노출이 Foxo3a 단백질의 세포 수준을, 단지 PBS만에 대한 노출과 비교할 때, 각각 1.88배 및 2.8배 증가시킨 것으로 추가로 관찰되었다. 트라스투주맙에 대한 노출에 의한 BT474 및 NCI-N87 세포에서의 Foxo3a 단백질 수준의 상응하는 증가는 각각 1.14배 및 1.32배였으며; 퍼투주맙에 대한 노출의 경우는 각각 1.21배 및 1.25배였으며; 트라스투주맙과 퍼투주맙에 대한 노출의 경우는 각각 1.28배 및 1.19배였다. 따라서, 단백질 #21은 트라스투주맙 또는 퍼투주맙 또는 둘의 병용물에 비해 세포 Foxo3a 단백질 수준의 훨씬 더 높은 증가로 이어진다. Akt1이 Foxo3a를 인산화시켜, 그 결과 Foxo3a의 분해 및 세포 생존의 촉진을 야기한다는 것이 당업자에게 알려져 있다. Akt 인산화의 억제는 Foxo3a의 안정화로 이어지고, 이에 따라 Foxo3a 수준이 증가된다. 증가된 수준에서, Foxo3a는 핵으로 이행되어 아팝토시스를 유도할 수 있다.

[표 1]

[표 2]

실시예 17: 요법 개선을 위한 서열 번호 21을 포함하는 재조합 결합 단백질을 사용한 공동투약 (Co-medication)

단백질 #21 및 단백질 #21-His를 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 표준 BrdU 세포 증식 검정을 수행하였으며, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다. 간략하게 말하면, 단백질 #21-His, 다른 화합물, 또는 다른 화합물과 병용된 단백질 #21-His의 세포 증식에 대한 효과를 BrdU-표지화 (BrdU, 세포 증식 ELISA, Roche)를 사용하여 DNA 합성을 측정함으로써 결정하였다. 간략하게 말하면, 100 μl의 완전 배지 중 웰당 10000개의 세포를 96 웰 플레이트에 시딩하고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 단백질 #21-His 및/또는 화합물을 추가 72시간 동안 첨가하였다. 세포 표지화를 위한 BrdU를 마지막 24시간 동안 첨가하였다. 표지된 (증식) 세포를 제조사의 프로토콜에 따라 검출하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다 (log [c] vs. OD450-602 nm의 도표). 비선형 회귀 적합 (log (길항제) vs. 반응 - 가변 기울기 (4개의 파라미터))을 사용하여 데이터를 적합화하였다.

단백질 #21-His와 미세소관 억제제인 에리불린의 병용물: 단백질 #21-His, 에리불린, 또는 단백질 #21-His와 에리불린의 병용물을 BT474 및 MDA-MB175 세포의 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 단백질 #21-His의 준최적 (suboptimal) 농도 (BT474에서는 2 nM, 그리고 MDA-MB175에서는 4 nM) 바로 가까이에서 1,000 nM로 시작하여 에리불린을 적정하였다. 양쪽 분자의 병용물은 두 세포주 모두에서 단독으로의 에리불린보다 월등하였다. 에리불린은, 단제로서는 BT474 세포에 대해 활성을 나타내지 않았지만, 단백질 #21-His와 병용된 상태에서는 강력한 억제를 나타내었다. 에리불린은 MDAA-MB175 세포에 대해 단독으로는 매우 낮은 효력을 나타내었지만, 이는 단백질 #21-His와 병용된 상태에서는 개선되었다. IC₅₀ 값이 표 3에 제공되어 있다. 이들 데이터는 단백질 #21-His가 에리불린과 병용되어 그의 활성을 증강시킬 수 있음을 보여준다.

단백질 #21-His와 pI3K 억제제인 GDC-0941의 병용물: 단백질 #21-His, GDC-0941, 또는 단백질 #21-His와 GDC-0941의 병용물을 BT474 및 MDA-MB175 세포의 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 단백질 #21-His의 준최적 농도 (BT474에서는 2 nM, 그리고 MDA-MB175에서는 4 nM) 바로 가까이에서 20,000 nM로 시작하여 GDC-0941을 적정하였다. 양쪽 분자의 병용물은 두 세포주 모두에서 단독으로의 GDC-0941보다 월등하였다. GDC-0941은 그 자체로 활성을 나타내었지만, 단백질 #21-His와 병용한 상태에서 효력이 증가되었다. BT474에서 GDC-0941의 효력은 강하게 증가하였는데, 이는 상승적 효과를 시사한다. 유사하게, 단백질 #21-His는 MDA-MB175 세포에서 GDC-0941의 효력을 증가시켰으며, 여기서 효과는 상가적인 것으로 나타났다. IC₅₀ 값이 표 3에 제공되어 있다. 이들 데이터는 단백질 #21-His가 GDC-0941과 병용되어 그의 활성을 증강시킬 수 있음을 보여준다.

단백질 #21-His와 mTOR 억제제인 에베롤리무스의 병용물: 단백질 #21-His, 에베롤리무스, 또는 단백질 #21-His와 에베롤리무스의 병용물을 BT474 및 MDA-MB175 세포의 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 단백질 #21-His의 준최적 농도 (BT474에서는 2 nM, 그리고 MDA-MB175에서는 4 nM) 바로 가까이에서 1 mM로 시작하여 에베롤리무스를 적정하였다. 양쪽 분자의 병용물은 두 세포주 모두에서 단독으로의 에베롤리무스보다 월등하였다. 에베롤리무스는 그 자체로 활성을 나타내었지만, 단백질 #21-His와 병용한 상태에서 효력이 증가되었다. BT474 세포에서 에베롤리무스의 효력은 강하게 증가하였는데, 이는 상승적 효과를 시사한다. 유사하게, 단백질 #21-His는 MDA-MB175 세포에서 에베롤리무스의 효력을 증가시켰으며, 여기서 효과는 상가적인 것으로 나타났다. IC₅₀ 값이 표 3에 제공되어 있다. 이들 데이터는 단백질 #21-His가 에베롤리무스와 병용되어 그의 활성을 증강시킬 수 있음을 보여준다.

단백질 #21-His와 pan-HER 억제제인 라파티닙의 병용물: 단백질 #21-His, 라파티닙, 또는 단백질 #21-His와 라파티닙의 병용물을 BT474 및 MDA-MB175 세포의 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 단백질 #21-His의 준최적 농도 (BT474에서는 2 nM, 그리고 MDA-MB175에서는 4 nM) 바로 가까이에서 10000 nM로 시작하여 라파티닙을 적정하였다. 양쪽 분자의 병용물은 두 세포주 모두에서 단독으로의 라파티닙보다 월등하였다. 라파티닙은 그 자체로 활성을 나타내었지만, 단백질 #21-His와 병용한 상태에서 효력이 증가되었다. BT474 세포에서 라파티닙의 효력은 강하게 증가하였는데, 이는 상승적 효과를 시사한다. 유사하게, 단백질 #21-His는 MDA-MB175 세포에서 라파티닙의 효력을 증가시켰으며, 여기서 효과는 상가적인 것으로 나타났다. IC₅₀ 값이 표 3에 제공되어 있다. 이들 데이터는 단백질 #21-His가 라파티닙과 병용되어 그의 활성을 증강시킬 수 있음을 보여준다.

단백질 #21과 트라스투주맙의 병용물: 단백질 #21, 트라스투주맙, 또는 단백질 #21과 트라스투주맙의 병용물을 BT474 및 MDA-MB175 세포의 증식을 억제하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 단백질 #21의 준최적 농도 (BT474에서는 1 nM, 그리고 MDA-MB175에서는 10 nM) 바로 가까이에서 100 nM로 시작하여 트라스투주맙을 적정하였다. 양쪽 분자의 병용물은 두 세포주 모두에서 단독으로의 트라스투주맙보다 월등하였다. 트라스투주맙은 그 자체로 단지 제한된 활성만을 나타내었고 아폽토시스는 유도하지 않고 단지 세포 증식 정지만을 유도한 반면, 단백질 #21은 아폽토시스를 유도한다. 준최적 농도의 단백질 #21과 트라스투주맙의 병용물은 증식의 억제를 야기하였다. 이는, 양쪽 분자가 병용될 수 있고 단백질 #21은 트라스투주맙의 활성을 증강시킴을 보여준다. 일정 농도의 트라스투주맙 (50 nM) 바로 가까이에서 단백질 #21을 적정함으로써 병용물의 효과를 또한 확인할 수 있었다.

유사하게, 단백질 #21과 아피톨리십, 타셀리십, 알펠리십, 팔보시클립, 트라메티닙, 코비메티닙 또는 살리라십의 병용물은 단독으로의 단백질 #21 또는 단독으로의 아피톨리십, 타셀리십, 알펠리십, 팔보시클립, 트라메티닙, 코비메티닙 또는 살리라십보다 BT474 세포의 증식을 억제하는 데 있어서 더 효율적이었다 (표 3 참조). 아피톨리십, 타셀리십, 알펠리십, 또는 팔보시클립에 대한 실험의 경우에는, 단백질 #21을 2 nM로 사용하고, 아피톨리십, 타셀리십, 알펠리십, 또는 팔보시클립의 농도를 적정하여 IC₅₀ 값을 결정하였다. 트라메티닙 (10^-5 M), 코비메티닙 (10^-5 M) 또는 살리라십 (3*10^-5 M)에 대한 실험의 경우에는, 단백질 #21을 적정하여 IC₅₀ 값을 결정하였다.

요약하면, 단백질 #21 또는 단백질 #21-His는 몇몇 부류의 유방암 표준 치료 약물과 병용되어 HER2-과발현 세포에 대한 그들의 성장 억제 효과를 증강시킬 수 있다. 이는 독성을 감소시키기 위한 표준 치료 용량의 감소 및/또는 향상된 효능의 임상 가능성을 나타낸다.

[표 3]

SEQUENCE LISTING <110> Molecular Partners AG <120> Recombinant Binding Proteins <130> P015 <160> 33 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-tag <400> 1 Met Arg Gly Ser His His His His His His 1 5 10 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GlySer linker <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GlySer linker <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GlySer linker <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GlySer linker <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GlySer linker <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 14 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed ankyrin repeat domain <400> 14 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 15 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed ankyrin repeat domain <400> 15 Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly 35 40 45 His Leu Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 50 55 60 Ala Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Asp 65 70 75 80 Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys His Gly Ala Asp Val 85 90 95 Asn Ala Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp 100 105 110 Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 125 <210> 16 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designed ankyrin repeat domain <400> 16 Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln 1 5 10 15 Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 20 25 30 Lys Asp 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Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Met Ala Asn Gly Ala 450 455 460 Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr Leu Ala 465 470 475 480 Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Asn Gly 485 490 495 Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu His Leu 500 505 510 Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu Lys His 515 520 525 Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Ala Phe Asp 530 535 540 Ile Ser Ile Gly Asn Gly Asn Glu Asp Leu Ala Glu Ile Leu Gln Lys 545 550 555 560 Ala Ala <210> 31 <211> 580 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein comprising four designed ankyrin repeat domains <400> 31 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Asp Leu Gly Lys 1 5 10 15 Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu 20 25 30 Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His 35 40 45 Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu 50 55 60 Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn 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Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu 210 215 220 Ala Ala Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala 225 230 235 240 Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp 245 250 255 Leu Ala Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys 260 265 270 Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro 275 280 285 Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu 290 295 300 Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu 305 310 315 320 Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro 325 330 335 Leu Tyr Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu 340 345 350 Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr 355 360 365 Pro Leu His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val 370 375 380 Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys 385 390 395 400 Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu 405 410 415 Val Leu Gln Lys Ala Ala 420

Claims

서열 번호 21과 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질로서,
상기 재조합 결합 단백질은 HER2에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인 및 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
제1항에 있어서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 2개의 설계된 안키린 반복 도메인은 각각 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 21로 이루어진 재조합 결합 단백질과 적어도 95%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인들은 각각, 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 비해, PBS에서 개선된 저장 안정성을 나타내는, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 결합 단백질은 10^-7 M 미만의 억제 상수로 BT474 세포 증식을 억제하는, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 100 nM 농도의 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 농도의 트라스투주맙보다 BT474 세포에서의 AKT-S473 인산화의 더 강한 하향조절을 나타내는, 재조합 결합 단백질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 결합 단백질을 인코딩하는, 핵산.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 결합 단백질 또는 제9항의 핵산, 및 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 질병의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 암의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제10항에 있어서, 유방암, 난소암, 위암, 위선암, 자궁암, 결직장암, 방광암, 또는 HER2 과발현 암의 치료에 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 결합 단백질 또는 제9항의 핵산 또는 제10항의 약제학적 조성물을 포함하는, 키트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법으로서,
(i) 세균에서 상기 결합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (ii) 크로마토그래피를 사용하여 상기 결합 단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 방법.