KR20220016944A - 개선된 안정성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인 및 특히 개선된 안정성을 갖는 이러한 설계된 안키린 반복 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 설계된 안키린 반복 도메인(들)을 포함하는 재조합 결합 단백질, 이러한 설계된 안키린 반복 도메인 또는 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 질환의 치료에서의 이러한 단백질 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 유럽 특허청에 2019년 6월 4일에 출원된 유럽 특허 출원 EP19178282호의 우선권의 이익을 주장한다. 유럽 특허 출원 EP19178282호의 내용은 모든 표, 도면 및 청구항을 포함하여 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다.
기술분야
본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인 및 특히 개선된 안정성을 갖는 이러한 설계된 안키린 반복 도메인에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이러한 설계된 안키린 반복 도메인(들)을 포함하는 재조합 결합 단백질, 이러한 설계된 안키린 반복 도메인 또는 단백질을 암호화하는 핵산, 이러한 단백질을 포함하는 약제학적 조성물 및 질환의 치료에서의 이러한 단백질 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
활성 성분이 통상적으로 단백질 및/또는 폴리펩타이드인 생물학적 약물 제품에 대해, 분자 입체형태의 유지와 그에 따른 생물학적 활성의 유지는 비공유결합력뿐만 아니라 공유결합력에 따라 달라진다. 이 제품은 온도 변화, 산화, 광, 이온 함량 및 전단과 같은 환경 요인에 특히 민감하다. 생물학적 활성의 유지를 보장하기 위해, 이러한 약물 제품의 활성 성분이 제조, 운반 및 저장 동안 노출되는 조건에 견디는 것이 중요하다. 분해 및 분자 변화의 다른 형태가 가능한 많이 회피될 필요가 있다. 이와 같이, 안정한 활성 성분의 개발은 성공적인 상업 제품 개발에 중요하다.
혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이 기재되어 있고, 이들은 연장된 말단 반감기를 갖는 재조합 결합 단백질의 생성에 특히 유용하다(예를 들어, 국제공개 WO 2012/069654호 참조). 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하지 않는 단백질과 비교된 혈장에서의 이러한 증가된 반감기는 치료학적 용도를 위해 고도로 유리하다. 예를 들어, 국제공개 WO 2016/156596호는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 치료학적으로 유용한 안키린 반복 단백질을 기재한다.
혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 이러한 설계된 안키린 반복 도메인의 개발에도 불구하고, 일반적으로 오늘날의 의학 제품 및 특히 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 안정성 특성 및 특히 저장 안정성 특성을 개선하기 위한 필요성 및 과제가 여전히 있다.
본 발명자들은 본 발명의 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이 추가의 개선된 안정성 특성 및 특히 개선된 저장 안정성 특성을 제공한다는 것을 놀랍게도 발견하였다. 이와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인이 이러한 액체 제형 중에서 승온에서, 예를 들어 60℃에서 열 처리 동안 액체 제형에서 개선된 저장 안정성뿐만 아니라 유리한 안정성 특성으로 이어진다는 것을 발견하였다. 후자는 이러한 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 정제를 가능하게 하는 데 특히 유리하다. 더욱이, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인은 승온에서 pH 이동 동안 개선된 안정성을 나타냈고, 이는 이러한 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 정제할 때 그만큼 더 고도로 유리하다. 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인의 안정성의 개선은 예를 들어 승온에서의 항온처리 및 SDS PAGE 분석 후, 분해 생성물로 추정되는 확인된 저 분자량(lower molecular weight) 종의 보다 적은 정도에 의해 특히 명확하다. 결과적으로, 선행 기술 생성물과 비교하여, 증가된 양의 고 분자량(higher molecular weight) 종 및 이에 따라 보다 적은 양의 추정적(assumed) 분해 생성물은, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이 더 낮은 pH에서 저장된 후, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인되었다. 더 낮은 pH에서의 재조합 결합 단백질의 저장은 대개 원치 않는 저 분자량 종의 발생으로 이어질 수 있다. 게다가, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인의 안정성의 개선이 혈청 알부민에 대한 이의 결합 특이성을 저하시키지 않는다는 것이 주목된다.
이와 같이, 일 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 제공하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않는다. 다른 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 관한 것이고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 1개, 통상적으로 바람직하게는 1개 또는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질을 암호화하는 핵산을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인, 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 본 발명의 핵산, 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 양태 및 실시형태는 상세한 설명에서 명확해질 것이다.
도 1. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 서열 정렬. 서열 번호 3 및 서열 번호 4는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성 및 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 개선된 안정성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 나타낸다. 잔기 번호는 서열 위에 표시된다.
도 2. 서열 번호 2의 서열 모티프에 정렬된 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상이한 설계된 안키린 반복 도메인의 77번 내지 79번 잔기에서의 서열 모티프. 각각의 단백질의 서열 번호는 정렬의 왼쪽에 표시된다.
도 3. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 안정성을 비교하는 SDS-PAGE. 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4(각각 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어짐; N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 이후 실시예 3에 기재된 것처럼 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서 1주 동안 60℃(기준품에 대해 -80℃)에서 항온처리되고, 이후 실시예 4에 기재된 것처럼 SDS-PAGE를 사용하여 저장 안정성 평가되었다. 3개의 SDS PAGE 사진은 각각의 겔 위에 표시된 것처럼 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서의 측정을 나타낸다. 단백질은 이의 서열 번호에 의해 표시된다. O: -80℃ 항온처리된 기준 샘플. I: 60℃ 항온처리된 샘플. Mw: 분자량 마커, kDa 값은 왼쪽에 표시됨.
도 4. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 안정성의 LabChip 분석. 단백질 #2, 단백질 #3, 단백질 #4, 단백질 #5 및 단백질 #6(각각 서열 번호 2 내지 서열 번호 6으로 이루어짐; 모두 N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐)은 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 이후 실시예 3에 기재된 것처럼 pH 6, pH 7.4 및 pH 8.5에서 1주 동안 60℃에서 항온처리되고, 이후 실시예 5에 기재된 것처럼 LabChip를 사용하여 저장 안정성 평가되었다. LabChip 데이터는 3개의 상이한 pH 값에 대해 3개의 그룹에서 표시된다. 분자량 마커 수준은 각각의 그룹의 왼쪽 및 오른쪽에 (kDa로) 표시된다.
도 5. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 크기-배제 크로마토그래피. 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4(각각 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어짐; N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 이후 실시예 3에 기재된 것처럼 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서 1주 동안 60℃(기준품에 대해 -80℃)에서 항온처리되고, 이후 실시예 6에 기재된 것처럼 크기-배제 크로마토그래피 분석을 사용하여 저장 안정성 평가되었다. 60℃ 및 -80℃에서의 각각의 단백질에 대해 얻은 크로마토그램의 오버레이는 도 5a에서의 pH 7.4, 도 5b에서의 pH 6 및 도 5c에서의 pH 5에 대해 도시되어 있다. 보이드 부피는 2.18분에, 총 부피는 5.28분에 용리한다. OD: mAu [ ] 단위의 280 nm에서의 광학 밀도(360 nm에서의 광학 밀도에 의해 참조됨); t: [분] 단위의 시간.
도 6. 1 mg/㎏로 정맥내 주어진 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 마우스(a) 및 사이노몰거스 원숭이(b)에서의 약동학적 프로파일. 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4(각각 서열 번호 2 내지 서열 번호 4로 이루어짐; 모두 N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐; 도면에 표시된 기호)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 마우스 약동학적 프로파일은 실시예 9에 기재된 것처럼 결정되고, 사이노몰거스 원숭이 약동학적 프로파일은 실시예 10에 기재된 것처럼 결정되었다. 각각의 표준 편차를 포함하여 3마리의 마우스 또는 2마리의 원숭이로부터의 평균 단백질 농도가 도시된다. C: [nM] 단위의 농도; t: [시간] 단위의 시간.
도 7. 1 mg/㎏로 정맥내 주어진 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 마우스에서의 약동학적 프로파일. 단백질 #7, 단백질 #8, 단백질 #9, 단백질 #10, 단백질 #11 및 단백질 #12(각각 서열 번호 7 내지 서열 번호 12로 이루어짐; 모두 N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐; 도면에 표시된 기호)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 마우스 약동학적 프로파일은 실시예 11에 기재된 것처럼 결정되었다. 3마리의 마우스로부터의 평균 단백질 농도가 표준 편차를 포함하여 도시된다. 비교를 용이하게 하기 위해, 단백질 #7, 단백질 #9 및 단백질 #11(a)뿐만 아니라 단백질 #8, 단백질 #10 및 단백질 #12(b)는 2개의 별개의 그래프에서 표현된다. C: [nM] 단위의 농도; t: [시간] 단위의 시간.
도 2. 서열 번호 2의 서열 모티프에 정렬된 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상이한 설계된 안키린 반복 도메인의 77번 내지 79번 잔기에서의 서열 모티프. 각각의 단백질의 서열 번호는 정렬의 왼쪽에 표시된다.
도 3. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 안정성을 비교하는 SDS-PAGE. 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4(각각 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어짐; N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 이후 실시예 3에 기재된 것처럼 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서 1주 동안 60℃(기준품에 대해 -80℃)에서 항온처리되고, 이후 실시예 4에 기재된 것처럼 SDS-PAGE를 사용하여 저장 안정성 평가되었다. 3개의 SDS PAGE 사진은 각각의 겔 위에 표시된 것처럼 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서의 측정을 나타낸다. 단백질은 이의 서열 번호에 의해 표시된다. O: -80℃ 항온처리된 기준 샘플. I: 60℃ 항온처리된 샘플. Mw: 분자량 마커, kDa 값은 왼쪽에 표시됨.
도 4. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 안정성의 LabChip 분석. 단백질 #2, 단백질 #3, 단백질 #4, 단백질 #5 및 단백질 #6(각각 서열 번호 2 내지 서열 번호 6으로 이루어짐; 모두 N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐)은 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 이후 실시예 3에 기재된 것처럼 pH 6, pH 7.4 및 pH 8.5에서 1주 동안 60℃에서 항온처리되고, 이후 실시예 5에 기재된 것처럼 LabChip를 사용하여 저장 안정성 평가되었다. LabChip 데이터는 3개의 상이한 pH 값에 대해 3개의 그룹에서 표시된다. 분자량 마커 수준은 각각의 그룹의 왼쪽 및 오른쪽에 (kDa로) 표시된다.
도 5. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 크기-배제 크로마토그래피. 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4(각각 서열 번호 2, 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어짐; N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 이후 실시예 3에 기재된 것처럼 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서 1주 동안 60℃(기준품에 대해 -80℃)에서 항온처리되고, 이후 실시예 6에 기재된 것처럼 크기-배제 크로마토그래피 분석을 사용하여 저장 안정성 평가되었다. 60℃ 및 -80℃에서의 각각의 단백질에 대해 얻은 크로마토그램의 오버레이는 도 5a에서의 pH 7.4, 도 5b에서의 pH 6 및 도 5c에서의 pH 5에 대해 도시되어 있다. 보이드 부피는 2.18분에, 총 부피는 5.28분에 용리한다. OD: mAu [ ] 단위의 280 nm에서의 광학 밀도(360 nm에서의 광학 밀도에 의해 참조됨); t: [분] 단위의 시간.
도 6. 1 mg/㎏로 정맥내 주어진 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 마우스(a) 및 사이노몰거스 원숭이(b)에서의 약동학적 프로파일. 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4(각각 서열 번호 2 내지 서열 번호 4로 이루어짐; 모두 N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐; 도면에 표시된 기호)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 마우스 약동학적 프로파일은 실시예 9에 기재된 것처럼 결정되고, 사이노몰거스 원숭이 약동학적 프로파일은 실시예 10에 기재된 것처럼 결정되었다. 각각의 표준 편차를 포함하여 3마리의 마우스 또는 2마리의 원숭이로부터의 평균 단백질 농도가 도시된다. C: [nM] 단위의 농도; t: [시간] 단위의 시간.
도 7. 1 mg/㎏로 정맥내 주어진 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 마우스에서의 약동학적 프로파일. 단백질 #7, 단백질 #8, 단백질 #9, 단백질 #10, 단백질 #11 및 단백질 #12(각각 서열 번호 7 내지 서열 번호 12로 이루어짐; 모두 N 말단에서 서열 번호 1을 추가로 가짐; 도면에 표시된 기호)는 실시예 2에 기재된 것처럼 제조되고, 마우스 약동학적 프로파일은 실시예 11에 기재된 것처럼 결정되었다. 3마리의 마우스로부터의 평균 단백질 농도가 표준 편차를 포함하여 도시된다. 비교를 용이하게 하기 위해, 단백질 #7, 단백질 #9 및 단백질 #11(a)뿐만 아니라 단백질 #8, 단백질 #10 및 단백질 #12(b)는 2개의 별개의 그래프에서 표현된다. C: [nM] 단위의 농도; t: [시간] 단위의 시간.
본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인, 이러한 설계된 안키린 반복 도메인(들)을 포함하는 재조합 결합 단백질 및 추가로 이러한 설계된 안키린 반복 도메인을 암호화하는 핵산 및 재조합 결합 단백질뿐만 아니라 상기 설계된 안키린 반복 도메인, 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 질환의 치료에서 이러한 재조합 결합 단백질 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
이와 같이, 일 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 제공하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않는다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 93%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 95%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 98%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 바람직하게는 적어도 93%, 다시 추가로 바람직하게는 적어도 95%, 및 더 추가로 바람직하게는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 세린(S)을 갖지 않는다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 바람직하게는 적어도 93%, 다시 추가로 바람직하게는 적어도 95% 및 더 추가로 바람직하게는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 세린(S)을 갖지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 바람직하게는 적어도 93%, 다시 추가로 바람직하게는 적어도 95% 및 더 추가로 바람직하게는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 KDFAGKTPLHLAAX1X2G(서열 번호 13)를 포함하고, X1은 A, D 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고; X2는 A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타낸다. 바람직하게는, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 바람직하게는 적어도 93%, 다시 추가로 바람직하게는 적어도 95%, 및 더 추가로 바람직하게는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 X1 및 X2 중 적어도 하나는 아스파르트산(D)이다. 일 실시형태에서, 상기 X1 및 X2 중 적어도 하나는 알라닌(A)이다. 일 실시형태에서, 상기 X1 및 X2 중 적어도 하나는 아스파르트산(D)이고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%, 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 바람직하게는 적어도 93%, 다시 추가로 바람직하게는 적어도 95% 및 더 추가로 바람직하게는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 X1 및 X2 중 적어도 하나는 아스파르트산(D)이고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 최대 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산만큼 상기 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 다르다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 KDFAGKTPLHLAAX1X2G(서열 번호 13)를 포함하고, X1 및 X2는 각각 독립적으로 A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기이고, 바람직하게는 상기 X1 및 X2는 동일하지 않다. 바람직하게는, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 바람직하게는 적어도 93%, 다시 추가로 바람직하게는 적어도 95%, 및 더 추가로 바람직하게는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 KDFAGKTPLHLAAADG(서열 번호 14) 또는 KDFAGKTPLHLAADAG(서열 번호 15)를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 KDFAGKTPLHLAAADG(서열 번호 14)를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 KDFAGKTPLHLAADAG(서열 번호 15)를 포함한다. 바람직하게는, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%, 바람직하게는 적어도 90%, 추가로 바람직하게는 적어도 93%, 다시 추가로 바람직하게는 적어도 95%, 및 더 추가로 바람직하게는 적어도 98%의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어지거나, 바람직하게는 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3 내지 서열 번호 6, 바람직하게는 서열 번호 3 및 서열 번호 4의 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환된다. 이러한 아미노산 치환은 바람직하게는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 기능, 바람직하게는 혈청 알부민에 대한 특이적 결합에 상당히 영향을 미치지 않게 된다. 이러한 아미노산 치환은 예를 들어 국제공개 WO2012/069655호에 기재된 것처럼 반복 도메인을 캡핑하기 위한 것과 같은 설계된 안키린 반복 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있었다. 아미노산을 치환할 때, 임의의 다른 아미노산은 대체 아미노산으로 간주될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 다른 아미노산은 A, D, E, F, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게는, 이러한 다른 아미노산은 C, G 또는 P가 아니다. 일부 실시형태에서, 치환(들)은 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어지거나, 바람직하게는 서열 번호 3 및 서열 번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 설계된 안키린 반복 도메인의 KD 값과 비교하여 1000배 초과, 100배 초과 또는 10배 초과만큼 인간 혈청 알부민에 대한 결합의 KD 값을 변경하지 않는다. 소정의 실시형태에서, 치환은 표 X에 따른 보존적 치환이다. 소정의 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 밖에서, 예를 들어 알파-나선을 연결하는 베타 루프에서 치환이 이루어진다. 소정의 실시형태에서, 안키린 반복 도메인의 구조적 코어 잔기 내에 치환이 이루어진다.
[표 X]
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (1) 서열 번호 3, 및 (2) 서열 번호 3의 1번 내지 76번 및 79번 내지 124번 위치로부터 선택된 임의의 위치에서의 서열 번호 3의 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 교환된 서열 번호 3으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 관한 것이고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (1) 서열 번호 4, 및 (1) 서열 번호 4의 1번 내지 76번 및 79번 내지 124번 위치로부터 선택된 임의의 위치에서의 서열 번호 4의 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 교환된 서열 번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
상기 기재된 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인의 모두에서, 마지막에서 두번째 위치는 "A" 또는 "L"일 수 있고/있거나 마지막 위치는 "A" 또는 "N"일 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, 선택적으로 마지막에서 두번째 위치에서의 A는 L로 치환되고/되거나 마지막 위치에서의 A는 N으로 치환된다. 이와 같이, 하나의 예시적인 실시형태에서, 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, 선택적으로 마지막에서 두번째 위치에서의 A는 L로 치환되고/되거나, 마지막 위치에서의 A는 N으로 치환된다. 다른 예시적인 실시형태에서, 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, 선택적으로 마지막에서 두번째 위치에서의 A는 L로 치환되고/되거나, 마지막 위치에서의 A는 N으로 치환된다.
게다가, 상기 기재된 본 발명의 모든 설계된 안키린 반복 도메인은 선택적으로 이의 N-말단에서 "G", "S" 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, (ii) 이의 N 말단에서 G, S 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 이의 N 말단에서 G, S 또는 GS를 추가로 포함한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 이의 N 말단에서 G, S 또는 GS를 추가로 포함한다. 다른 예시적인 실시형태에서, 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 선택적으로 이의 N 말단에서 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두번째 위치에서의 A는 L로 치환되고/되거나, 마지막 위치에서의 A는 N으로 치환된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열로 이루어진다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 90 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 80 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 70 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 60 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 50 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖는다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타낸다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타내고, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타낸다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타내고, 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타낸다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타내고, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타내고/나타내거나 (ii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타낸다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타내고, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행되고/되거나 (ii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타내고, 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타낸다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타내고, 상기 LabChip 분석은 pH 6.0 또는 7.4에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 항온처리 후 수행된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 바람직하게는 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨);
(ii)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 바람직하게는 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨);
(iii)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타냄(여기서, 바람직하게는 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); 및
(iv)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타냄(여기서, 바람직하게는 상기 LabChip 분석은 pH 6.0 또는 7.4에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 항온처리 후 수행됨).
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(i)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨);
(ii)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨);
(iii)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); 및
(iv)
서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타냄(여기서, 상기 LabChip 분석은 pH 6.0 또는 7.4에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 항온처리 후 수행됨).
일 실시형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 1 nM 미만의 EC50으로 PBST-C에서 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 20 nM 미만의 EC50으로 PBST-C에서 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 30 nM 미만의 EC50으로 PBST-C에서 마우스 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 100 nM 미만의 EC50으로 PBST-C에서 인간 혈청 알부민, 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민 및 마우스 혈청 알부민에 결합한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 마우스에서의 말단 반감기는 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인의 마우스에서 말단 반감기의 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 가장 바람직하게는 97%이다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 마우스에서의 말단 반감기는 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인의 마우스에서의 말단 반감기와 30% 미만, 바람직하게는 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 가장 바람직하게는 3%만큼 다르다. 바람직하게는, 마우스에서의 상기 말단 반감기는 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥으로의 정맥내 주사에 의해 1 mg/㎏의 용량으로 상기 설계된 안키린 반복 도메인을 적용하여 결정된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 사이노몰거스 원숭이에서의 말단 반감기는 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인의 사이노몰거스 원숭이에서의 말단 반감기의 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 가장 바람직하게는 92%이다. 일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 사이노몰거스 원숭이에서의 말단 반감기는 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인의 사이노몰거스 원숭이에서 말단 반감기와 30% 미만, 바람직하게는 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 가장 바람직하게는 8%만큼 다르다. 바람직하게는, 사이노몰거스 원숭이에서의 상기 말단 반감기는 정맥내 주사에 의해 30분까지 1 mg/㎏의 용량으로 상기 설계된 안키린 반복 도메인을 적용하여 결정된다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 통상적으로 및 바람직하게는 1주 동안 60℃에서 설계된 안키린 반복 도메인의 항온처리 시 SDS-PAGE 분석에서 고 분자량 생성물의 더 적은 발생이다. 바람직하게는, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행된다.
SDS-PAGE 분석에서의 "고 분자량 생성물"이라는 용어는 통상적으로 및 바람직하게는 겔에서 예상된 분자량보다 고 분자량에서 이어지는 밴드를 지칭한다. 일 실시형태에서, SDS-PAGE 분석에서의 상기 고 분자량 생성물은 겔에서 21.5 kDa 초과의 분자량에서 이어지는 밴드를 지칭한다. 도 3에서, pH 5, 6 또는 7.4에서 1주 동안 60℃에서 배양된 단백질 #2는 SDS-PAGE에서의 이러한 고 분자량 생성물을 나타내는데, 이것은 대략 14 kDa에서 이어지는 예상된 밴드보다 겉보기 고 분자량에서 이어진다. 일 실시형태에서, SDS-PAGE 분석에서의 상기 적은 고 분자량 생성물은 1주 동안 60℃에서 항온처리 시 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 가장 바람직하게는 50%만큼 상기 고 분자량 생성물의 감소를 지칭한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 통상적으로 및 바람직하게는 1주 동안 60℃에서 설계된 안키린 반복 도메인의 항온처리 시 SDS-PAGE 분석에서 저 분자량 생성물의 더 적은 발생이다. 바람직하게는, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행된다.
SDS-PAGE 분석에서의 "저 분자량 생성물"이라는 용어는 통상적으로 및 바람직하게는 겔에서 예상된 분자량보다 저 분자량에서 이어지는 밴드를 지칭한다. 도 3에서, pH 5, 6 또는 7.4에서 1주 동안 60℃에서 배양된 단백질 #2는 SDS-PAGE에서의 이러한 저 분자량 생성물을 나타내는데, 이것은 대략 14 kDa에서 이어지는 예상된 밴드보다 겉보기 저 분자량에서 이어진다. 일 실시형태에서, SDS-PAGE 분석에서의 상기 적은 저 분자량 생성물은 1주 동안 60℃에서 항온처리 시 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 가장 바람직하게는 50%만큼 상기 저 분자량 생성물의 감소를 지칭한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 통상적으로 및 바람직하게는 1주 동안 60℃에서 설계된 안키린 반복 도메인의 항온처리 시 LabChip 분석에서 고 분자량 생성물의 더 적은 발생이다. 일 실시형태에서, LabChip 분석에서의 상기 고 분자량 생성물은 크로마토그램에서 예상된 분자량보다 고 분자량에서 이어지는 밴드를 지칭한다. 일 실시형태에서, LabChip 분석에서의 상기 고 분자량 생성물은 크로마토그램에서 30 kDa 초과의 분자량에서 이어지는 밴드를 지칭한다. 도 4에서, pH 6 또는 7.4에서 1주 동안 60℃에서 배양된 단백질 #2는 LabChip 분석에서의 이러한 고 분자량 생성물을 나타내는데, 이것은 대략 15 kDa 내지 20 kDa에서 이어지는 예상된 밴드보다 겉보기 고 분자량에서 이어진다. 일 실시형태에서, LabChip 분석에서의 상기 적은 고 분자량 생성물은 1주 동안 60℃에서 항온처리 시 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 가장 바람직하게는 50%만큼 상기 고 분자량 생성물의 감소를 지칭한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 통상적으로 및 바람직하게는 1주 동안 60℃에서 설계된 안키린 반복 도메인의 항온처리 시 LabChip 분석에서 저 분자량 생성물의 더 적은 발생이다. 일 실시형태에서, LabChip 분석에서의 상기 저 분자량 생성물은 크로마토그램에서 예상된 분자량보다 저 분자량에서 이어지는 밴드를 지칭한다. 일 실시형태에서, LabChip 분석에서의 상기 저 분자량 생성물은 크로마토그램에서 대략 7 kDa의 분자량에서 보이는 밴드를 지칭한다. 도 4에서, pH 6에서 1주 동안 60℃에서 배양된 단백질 #2는 LabChip 분석에서의 이러한 저 분자량 생성물을 나타내는데, 이것은 대략 15 kDa 내지 20 kDa에서 이어지는 예상된 밴드보다 겉보기 저 분자량에서 이어진다. 일 실시형태에서, LabChip 분석에서의 상기 적은 저 분자량 생성물은 1주 동안 60℃에서 항온처리 시 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 가장 바람직하게는 25%만큼 상기 저 분자량 생성물의 감소를 지칭한다.
일 실시형태에서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 통상적으로 및 바람직하게는 pH 5에서 1주 동안 60℃에서 항온처리 시 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 생성물의 더 적은 양의 발생이다. 일 실시형태에서, 크기-배제 크로마토그래피에서의 "고 분자량 생성물"이라는 용어는 통상적으로 및 바람직하게는 예상된 분자량 생성물 전에 용리하는 생성물을 지칭한다. 도 5c에서, pH 5에서 1주 동안 60℃에서 항온처리된 단백질 #2는 크기 배제 크로마토그래피에서 4.1분에 용리하는 이러한 고 분자량 생성물을 나타내는 반면, 예상된 분자량 생성물은 대략 4.6분 후 용리한다. 일 실시형태에서, 크기-배제 크로마토그래피에서의 상기 고 분자량 생성물의 더 적은 양은, 곡선 하 총 면적의 백분율이, 1주 동안 60℃에서 항온처리 시, 곡선 하 총 면적의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 가장 바람직하게는 25%만큼 감소함을 지칭한다.
일 실시형태에서, 상기 항온처리는 pH 8.5, 7.4, 6 또는 5에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 항온처리는 pH 8.5에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, "항온처리"라는 용어는 pH 7.4에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 항온처리는 pH 6에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, 상기 항온처리는 pH 5에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, pH 8.5에서의 상기 항온처리는 포스페이트/시트레이트/보레이트 완충액에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, pH 7.4에서의 상기 항온처리는 PBS에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, pH 6에서의 상기 항온처리는 포스페이트/시트레이트 완충액 pH 6에서의 항온처리를 지칭한다. 일 실시형태에서, pH 5에서의 상기 항온처리는 포스페이트/시트레이트 완충액 pH 5에서의 항온처리를 지칭한다.
다른 양태에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 추가로 제공한다. 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인에 대해 상기에 그리고 본원에 기재된 것과 같은 바람직한 실시형태 및 특징은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 하나의 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질을 포함하여 본 발명의 임의의 양태 및 모든 양태에 적용된다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 3개를 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과의 상기 아미노산 서열 동일성은 적어도 93%, 추가로 바람직하게는 적어도 95% 및 다시 추가로 바람직하게는 적어도 98%이다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 90 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 80 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 70 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 60 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 50 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 적어도 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖는다. 서열 번호 9 내지 서열 번호 12는 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의, 바람직하게는 정확히 2개의, 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖는다. 서열 번호 9 내지 서열 번호 12는 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의, 바람직하게는 정확히 2개의, 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 3으로 이루어진다. 서열 번호 9 및 서열 번호 10은 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의, 바람직하게는 정확히 2개의, 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 4로 이루어진다. 서열 번호 11 및 서열 번호 12는 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 90 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 80 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 70 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 60 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 50 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 90 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 80 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 70 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 60 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 50 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 (i) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); (ii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); (iii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); 및 (iv) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타냄(여기서, 상기 LabChip 분석은 pH 6.0 또는 7.4에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 항온처리 후 수행됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 (i) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); (ii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); (iii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); 및 (iv) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타냄(여기서, 상기 LabChip 분석은 pH 6.0 또는 7.4에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 항온처리 후 수행됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 재조합 결합 단백질은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖고, 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교된 상기 개선된 안정성은 (i) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); (ii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); (iii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타냄(여기서, 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행됨); 및 (iv) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타냄(여기서, 상기 LabChip 분석은 pH 6.0 또는 7.4에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 항온처리 후 수행됨)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 90 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 80 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 70 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 60 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 50 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각이 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인으로 치환됨을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 결합 단백질과 비교하여 개선된 안정성을 갖는다. 서열 번호 9 내지 서열 번호 12는 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다.
서열 번호 9 또는 서열 번호 11로 이루어진 재조합 결합 단백질은, 각각 서열 번호 2로 이루어진, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는, 서열 번호 7로 이루어진 재조합 결합 단백질과 비교하여 개선된 안정성을 나타내는, 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다. 서열 번호 10 또는 서열 번호 12로 이루어진 재조합 결합 단백질은, 각각 서열 번호 2로 이루어진, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는, 서열 번호 8로 이루어진 재조합 결합 단백질과 비교하여 개선된 안정성을 나타내는, 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 1개 또는 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 1개 또는 정확히 2개를 포함하고, 상기 1개 또는 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 중 정확히 2개를 포함하고, 상기 2개의 안키린 반복 도메인의 각각은 독립적으로 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 9 내지 서열 번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이것으로 이루어진다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게는 이것으로 이루어진다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질의 마우스에서의 말단 반감기는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각이 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인으로 치환됨을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 결합 단백질의 마우스에서의 말단 반감기의 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 가장 바람직하게는 적어도 90%이다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질의 마우스에서의 말단 반감기는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각이 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인으로 치환됨을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 결합 단백질의 마우스에서의 말단 반감기와 30% 미만, 바람직하게는 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15% 미만, 가장 바람직하게는 10% 미만만큼 다르다. 바람직하게는, 마우스에서의 상기 말단 반감기는 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥으로의 정맥내 주사에 의해 1 mg/㎏의 용량으로 상기 재조합 결합 단백질을 적용하여 결정된다.
일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질의 사이노몰거스 원숭이에서의 말단 반감기는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각이 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인으로 치환됨을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 결합 단백질의 사이노몰거스 원숭이에서의 말단 반감기의 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% 미만, 가장 바람직하게는 92%이다. 일 실시형태에서, 상기 재조합 결합 단백질의 사이노몰거스 원숭이에서의 말단 반감기는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각이 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인으로 치환됨을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 결합 단백질의 사이노몰거스 원숭이에서의 말단 반감기와 30% 미만, 바람직하게는 25%, 20%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9% 미만, 가장 바람직하게는 8% 미만만큼 다르다. 바람직하게는, 사이노몰거스 원숭이에서의 상기 말단 반감기는 정맥내 주사에 의해 30분까지 1 mg/㎏의 용량으로 상기 재조합 결합 단백질을 적용하여 결정된다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 안키린 반복 도메인의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 9 내지 서열 번호 12로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명은 서열 번호 12의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 임의의 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인, 및/또는 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인을 암호화하는 핵산 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 공지되어 있고, 하기에 더 자세히 기재되어 있다. 더욱 추가로, 본원에 언급된 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인 중 하나 이상을 포함하는 진단학적 조성물이 제공된다.
약제학적 조성물은 상기 기재된 것과 같은 결합 단백질 및 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980]에 기재된 것과 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 당업자에게 공지된 적합한 담체, 부형제 또는 안정제는 예를 들어 식염수, 링거액, 덱스트로스 용액, 행크 용액, 고정유, 에틸 올레에이트, 식염수 중 5% 덱스트로스, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 완충액 및 보존제를 포함한다. 다른 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체성 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같은 조성물을 받는 개체에 유해한 항체의 생성을 스스로 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 약제학적 조성물은 또한 추가의 활성제, 예를 들어 항암제 또는 항혈관생성제를 포함하는 병용 제형일 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 무균성 또는 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
약제학적 조성물은 당업자의 지식 내에 임의의 적합한 방법에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 비경구이다. 비경구 투여에서, 본 발명의 약제는 용액, 현탁액 또는 에멀션과 같은 단위 투여 주사용 형태로 상기 정의된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화될 것이다. 투여량 및 투여 방식은 치료되는 개체 및 특정 질환에 따라 달라질 것이다.
추가로, 임의의 상기 언급된 약제학적 조성물은 질환 또는 장애의 치료에 고려된다. 본 발명은 치료 방법을 추가로 제공한다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 약제학적 조성물 또는 재조합 결합 단백질 또는 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
추가로, 상기 언급된 약제학적 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 인간을 포함하는 포유류에서 병리학적 병태를 치료하는 방법이 제공된다.
본 개시내용은 치료학적 유효량의 재조합 결합 단백질 또는 본원에 기재된 것과 같은 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 소정의 실시형태에서, 암은 고형 종양이다. 서열 번호 9 내지 서열 번호 12는 암을 치료하는 이러한 방법에서 유용한 재조합 결합 단백질의 예이다.
일부 실시형태에서, 암은 뇌암, 방광암, 유방암, 투명 세포 신장암, 자궁경부암, 대장 및 직장암, 자궁내막암, 위암, 두부/경부 편평 세포 암종, 구순 및 구강암, 간암, 폐 편평 세포 암종, 흑색종, 중피종, 비소세포 폐암(NSCLC), 비흑색종 피부암, 난소암, 구강암, 췌장암, 전립선암, 신장 세포 암종, 육종, 소세포 폐암(SCLC), 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN), 삼중 음성 유방암 또는 갑상선암이다.
본 발명은 실시예에 기재된 특정 실시형태로 제한되지는 않는다. 다른 공급원이 사용되고, 하기에 기재된 대체적인 개요에 따라 처리될 수 있다.
본 명세서는 "P5754_Sequence_Protocol.txt"로 명명된 본 명세서의 아미노산 서열 목록의 다수의 아미노산 서열을 참고하고, 서열 프로토콜의 아미노산 서열은 본 명세서에 참고로 포함된다.
정의
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 보통의 기술자가 흔히 이해하는 의미를 가져야 한다.
본 발명의 맥락에서, "단백질"이라는 용어는 폴리펩타이드를 포함하는 분자로서, 폴리펩타이드의 적어도 일부가 단일 폴리펩타이드 사슬 내에 그리고/또는 다수의 폴리펩타이드 사슬들 사이에 2차 구조, 3차 구조 및/또는 4차 구조를 형성하여 한정된 3차원 배열을 갖거나 획득할 수 있는 분자를 지칭한다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하면, 개별 폴리펩타이드 사슬은 예를 들어 2개의 폴리펩타이드 사이의 이황화물 결합에 의해 비공유적으로 또는 공유적으로 연결될 수 있다. 2차 구조 및/또는 3차 구조를 형성하여 한정된 3차원 배열을 개별적으로 갖거나 획득할 수 있는 단백질의 부분을 "단백질 도메인"이라 칭한다. 이러한 단백질 도메인은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
재조합 단백질, 재조합 폴리펩타이드 등에 사용된 것과 같이 "재조합"이라는 용어는 상기 단백질 또는 폴리펩타이드가 당업자에게 잘 공지된 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 제조된다는 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리펩타이드를 암호화하는 (예를 들어, 유전자 합성에 의해 생성된) 재조합 DNA 분자는 박테리아 발현 플라스미드(예를 들어, pQE30, QIAgen), 효모 발현 플라스미드, 포유류 발현 플라스미드 또는 식물 발현 플라스미드 또는 시험관내 발현이 가능하게 하는 DNA 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 이러한 재조합 박테리아 발현 플라스미드가 적절한 박테리아(예를 들어, 에스케리치아 콜라이)에 삽입되면, 이 박테리아는 이 재조합 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드(들)를 생성할 수 있다. 상응하게 제조된 폴리펩타이드 또는 단백질은 재조합 폴리펩타이드 또는 재조합 단백질이라 불린다.
본 발명의 맥락에서, "결합 단백질"이라는 용어는 결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 결합 단백질은 또한 2개, 3개, 4개, 5개 또는 이것 초과의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다. 본 발명의 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다.
더욱이, 임의의 이러한 결합 단백질은 당업자에게 잘 공지된 추가의 폴리펩타이드(예를 들어, 폴리펩타이드 태그, 펩타이드 링커, 결합 특이성을 갖는 다른 단백질성 도메인에 대한 융합, 사이토카인, 호르몬 또는 길항제), 또는 화학적 변형(예를 들어, 폴리에틸렌-글리콜, 독소(예를 들어, 면역원으로부터의 DM1), 소분자, 항생제 등에 대한 커플링)을 포함할 수 있다.
"결합 도메인"이라는 용어는 표적에 결합 특이성을 나타내는 단백질 도메인을 의미한다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다.
"표적"이라는 용어는 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 단백질, 탄수화물 또는 임의의 다른 천연 발생 분자와 같은 개별 분자와 이러한 개별 분자의 임의의 부분, 또는 이러한 분자의 2개 이상의 복합체, 또는 전체 세포 또는 조직 샘플, 또는 임의의 비천연 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 표적은 자연 발생 또는 비천연 폴리펩타이드 또는 단백질, 또는 화학 변형, 예를 들어 천연 발생 또는 비천연 인산화, 아세틸화 또는 메틸화를 함유하는 폴리펩타이드 또는 단백질이다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서, 혈청 알부민은 개시된 혈청 알부민 특이적 결합 도메인 및 단백질의 표적이다.
본 발명의 맥락에서, "폴리펩타이드"라는 용어는 펩타이드 결합을 통해 연결된 다수의, 즉 2개 이상의 아미노산의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 펩타이드 결합을 통해 연결된 8개 초과의 아미노산으로 이루어진다. "폴리펩타이드"라는 용어는 또한 시스테인의 S-S 가교에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산 사슬을 포함한다. 폴리펩타이드는 당업자에게 잘 공지되어 있다.
국제공개 WO 2002/020565호 및 문헌[Forrer et al., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K., 
, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)]은 반복 단백질 특징 및 반복 도메인 특징, 기법 및 분야의 일반 설명을 함유한다. "반복 단백질"이라는 용어는 하나 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 반복 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 반복 도메인을 포함한다. 더욱이, 상기 반복 단백질은 추가의 비반복 단백질 도메인, 폴리펩타이드 태그 및/또는 펩타이드 링커를 포함할 수 있다. 반복 도메인은 결합 도메인일 수 있다.
"반복 도메인"이라는 용어는 구조 단위로서 2개 이상의 연속 반복 모듈을 포함하는 단백질 도메인에 관한 것이고, 상기 반복 모듈은 구조 상동성 및 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게는, 반복 도메인은 N 말단 및/또는 C 말단 캡핑 모듈을 추가로 포함한다. 명확성을 위해, 캡핑 모듈은 반복 모듈일 수 있다. 이러한 반복 도메인, 반복 모듈 및 캡핑 모듈, 서열 모티프뿐만 아니라 구조적 상동성 및 서열 상동성은 안키린 반복 도메인(국제공개 WO2002/020565호), 류신-풍부 반복 도메인(국제공개 WO2002/020565호), 테트라트라이코펩타이드 반복 도메인(문헌[Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003]) 및 아르마딜로 반복 도메인(국제공개 WO2009/040338호)의 예로부터 당업자에게 잘 공지되어 있다. 이러한 반복 도메인이 반복 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 상이하고, 모든 반복 아미노산 서열이 개별 도메인(예를 들어, 피브로넥틴의 FN3 도메인)을 형성할 수 있다는 것이 당업자자에게 추가로 잘 공지되어 있다.
설계된 반복 단백질, 설계된 반복 도메인 등에 사용된 것과 같은 "설계된"이라는 용어는 이러한 반복 단백질 및 반복 도메인이 각각 인공이고 자연에서 발생하지 않는 특성을 지칭한다. 본 발명의 결합 단백질은 설계된 반복 단백질이고, 이들은 적어도 하나의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다.
"표적 상호작용 잔기"라는 용어는 표적과의 직접적인 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다.
"프레임워크 잔기"이라는 용어는 폴딩 위상배치에 기여하는, 즉 상기 반복 모듈의 폴드에 기여하는 또는 이웃 모듈과의 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다. 이러한 기여는 반복 모듈에서의 다른 잔기와의 상호작용 또는 α-나선 또는 β-시트에서 발견되는 것과 같은 폴리펩타이드 골격 형태, 또는 선형 폴리펩타이드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치의 참여에 대한 영향일 수 있다.
이러한 프레임워크 및 표적 상호작용 잔기는 물리화학적 방법, 예컨대 X선 결정학, NMR 및/또는 CD 분광법에 의해 얻은 구조 데이터의 분석에 의해, 또는 구조 생물학 및/또는 생물정보에서 참여하는 것으로 잘 알려진 공지된 및 관련된 구조 정보와의 비교에 의해 확인될 수 있다.
"반복 모듈"이라는 용어는 자연 발생 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래된, 설계된 반복 도메인의 반복된 아미노산 서열 및 구조 단위를 지칭한다. 반복 도메인에 포함된 각각의 반복 모듈은 자연 발생 반복 단백질의 패밀리 또는 하위패밀리, 예를 들어 안키린 반복 단백질의 패밀리의 하나 이상의 반복 단위로부터 유래된다. 더욱이, 반복 도메인에 포함된 각각의 반복 모듈은 예를 들어 실시예 1에 기재된 것과 같은, 동일한 표적 특이성을 갖는 표적 상에 선택된 반복 도메인으로부터 얻은 상동성 반복 모듈로부터 추론된 "반복 서열 모티프"를 포함할 수 있다.
따라서, "안키린 반복 모듈"이라는 용어는 자연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래된 반복 모듈을 지칭한다. 안키린 반복 단백질은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
반복 모듈은 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적을 위한 라이브러리에서 무작위화되지 않은 아미노산 잔기를 갖는 위치("비무작위화된 위치") 및 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적을 위한 라이브러리에서 무작위화된 아미노산 잔기를 갖는 위치("무작위화된 위치")를 포함할 수 있다. 비무작위화된 위치는 프레임워크 잔기를 포함한다. 무작위화된 위치는 표적 상호작용 잔기를 포함한다. "무작위화된"은 2개 이상의 아미노산이 반복 모듈의 아미노산 위치에서 허용된다는 것을 의미하고, 예를 들어 임의의 일반 20개의 자연 발생 아미노산이 허용되거나, 시스테인 이외의 아미노산, 또는 글리신, 시스테인 및 프롤린 이외의 아미노산과 같은 대부분의 20개의 자연 발생 아미노산이 허용된다. 이 특허 출원의 목적을 위해, 서열 번호 2 내지 서열 번호 6의 3개, 4개, 6개, 14개 및 15개의 아미노산 잔기는 본 발명의 안키린 반복 모듈의 무작위화된 위치이다.
"반복 서열 모티프"라는 용어는 하나 이상의 반복 모듈로부터 추론된 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 모듈은 동일한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인 유래이다. 이러한 반복 서열 모티프는 프레임워크 잔기 위치 및 표적 상호작용 잔기 위치를 포함한다. 상기 프레임워크 잔기 위치는 반복 모듈의 프레임워크 잔기의 위치에 상응한다. 마찬가지로, 상기 표적 상호작용 잔기 위치는 반복 모듈의 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 반복 서열 모티프는 비무작위화된 위치 및 무작위화된 위치를 포함한다.
"반복 단위"라는 용어는 하나 이상의 자연 발생 단백질의 서열 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하고, 상기 "반복 단위"는 다수의 카피에서 발견되고, 단백질의 폴드를 결정하는 모든 상기 모티프에 흔한 한정된 폴딩 위상배치를 나타낸다. 이러한 반복 단위의 예는 류신 풍부 반복 단위, 안키린 반복 단위, 아르마딜로 반복 단위, 테트라트리코펩타이드 반복 단위, HEAT 반복 단위 및 류신 풍부 변형 반복 단위를 포함한다.
"표적에 대한 결합 특이성을 갖는다", "표적에 특이적으로 결합하는", "높은 특이성으로 표적에 결합하는", "표적에 특이적인" 또는 "표적 특이성" 등과 같은 용어는 결합 단백질 또는 결합 도메인이 PBS에서 이. 콜라이 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 비관련 단백질에 결합하는 것보다 낮은 해리 상수로 표적에 결합한다(즉, 이것은 더 높은 친화성으로 결합한다)는 것을 의미한다. 바람직하게는, 표적에 대한 PBS에서의 해리 상수("Kd")는 MBP에 대해 상응하는 해리 상수보다 적어도 102; 더 바람직하게는 적어도 103; 더 바람직하게는 적어도 104; 또는 더 바람직하게는 적어도 105배 더 낮다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기법 (예를 들어, SPR 평형 분석) 또는 등온 적정 열량계(isothermal titration calorimetry)(ITC)와 같은 단백질-단백질 상호작용의 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 Kd 값은 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에 측정되면 변할 수 있다. 따라서, Kd 값의 측정은 바람직하게는 표준화된 단백질 용액 및 PBS와 같은 표준화된 완충액에 의해 이루어진다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석에 의한 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 해리 상수(Kd)의 통상적이고 바람직한 용어는 실시예 7에 기재되어 있다.
"약"이라는 용어는 언급된 값 +/- 20%를 의미하고; 예를 들어 "약 50"은 40 내지 60을 의미해야 한다.
"PBS"라는 용어는 137 mM NaCl, 10 mM 인산염 및 2.7 mM KCl을 함유하고, pH가 7.4인 인산염 완충 수용액을 의미한다. 이는 실시예 3에 예시되어 있다. "포스페이트/시트레이트 완충액 pH 6"이라는 용어는 375 mM Na2HPO4*2H2O 및 150 mM NaCl을 함유하고, pH가 5.7인 물이 든 완충액을 의미한다. 이는 실시예 3에 예시되어 있다. "포스페이트/시트레이트 완충액 pH 5"라는 용어는 30 mM 시트르산 및 30 mM NaH2P04를 함유하고, pH가 4.75인 물이 든 완충액을 의미한다. 이는 실시예 3에 예시되어 있다. "포스페이트/시트레이트/보레이트 완충액"이라는 용어는 30 mM 시트르산, 30 mM NaH2PO4, 30 mM 붕산을 함유하고, pH가 8.5인 물이 든 완충액을 의미한다. 이는 실시예 3에 예시되어 있다.
"마우스 혈청 알부민"이라는 용어는 UniProt 수탁 번호 P07724를 지칭하고, "사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민"(즉, 마카카 파시쿨라리스)라는 용어는 UniProt 수탁 번호 A2V9Z4를 지칭하고, "인간 혈청 알부민"이라는 용어는 UniProt 수탁 번호 P02768을 지칭한다.
실시예
실시예에 사용된 단백질:
단백질 #2(His-태그(서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 2);
단백질 #3(His-태그(서열 번호 1)이 N 말단에 융합된 서열 번호 3);
단백질 #4(His-태그(서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 4);
단백질 #5(His-태그(서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 5);
단백질 #6(His-태그(서열 번호 1)이 N 말단에 융합된 서열 번호 6);
단백질 #7(His-태그(서열 번호 1)이 N 말단에 융합된 서열 번호 7);
단백질 #8(His-태그(서열 번호 1)이 N 말단에 융합된 서열 번호 8);
단백질 #9(His-태그(서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 9);
단백질 #10(His-태그(서열 번호 1)이 N 말단에 융합된 서열 번호 10);
단백질 #11(His-태그(서열 번호 1)이 N 말단에 융합된 서열 번호 11);
단백질 #12(His-태그(서열 번호 1)가 N 말단에 융합된 서열 번호 12).
달리 기재되지 않는 한, 당업자에게 잘 공지된 방법에 따라 실험을 수행하였다. 일부 실시예에 대한 실험 조건은 국제공개 WO2012/069654호 및 국제공개 WO2016/156596호에 추가로 또한 기재되어 있다.
실시예
1:
혈청
알부민에 대한 결합 특이성
및 개선된 안정성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인의 구축
예상치 못하게, 본 발명자들은 서열 번호 2(원래 국제공개 WO2016156596호에 기재됨)에 상응하는 아미노산 서열로 이루어진 단백질이, 이것이 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 더 일찍 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖는 변이체라는 사실에도 불구하고(국제공개 WO2012/069654호), 승온에서 항온처리 시 안정하지 않는 것으로 보인다는 것(실시예 2 내지 실시예 6 참조)을 발견하였다. 본 발명의 목표는 이와 같이 혈청 알부민 결합 및 약동학적 특성을 보존하면서 승온에서 항온처리 시 개선된 안정성을 나타내는 서열 번호 2의 변이체를 제공하는 것이다. (예를 들어, 당업자에게 잘 공지된 알라닌 스캐닝 공정과 필적하는) 다수의 위치에서 아미노산을 변경하고 시험관내 및 생체내 생성된 단백질 변이체를 규명하는 것의 수회차를 수반하는 고도로 반복적인 과정을 통해, 마지막으로 개선된 안정성 특성을 나타내는 4개의 변이체가 생겼다. 예상을 뒤엎어서, 이 변이체는 모두 폴리펩타이드 사슬 분해의 기원에 있는 것으로 공지된 아미노산인 77번 위치 및/또는 78번 위치에서 아미노산 Asp를 포함한다. 매우 놀랍게도, 많은 이들 변형은 특히 폴리펩타이드 사슬 분해에 민감한 것으로 공지된 Asp-Gly 서열 모티프를 포함한다. 이와 같이 상기 공정은 놀랍게도 예상치 못한 변형으로 이어졌다.
서열 번호 2 내지 서열 번호 6으로 이루어진 각각의 설계된 안키린 반복 도메인을 암호화하는 DNA는 하기 기재된 것과 같이 단순한 단백질 정제가 용이하게 하도록 N 말단 His-태그를 제공하는 pQE(QIAgen, 독일) 기반 발현 벡터로 클로닝되었다. 이들 특히 선택된 서열의 제조 및 규명뿐만 아니라 사용은 하기 실시예에 기재되어 있다.
실시예
2:
단백질의 발현 및 정제
N 말단에 융합된 His-태그 서열 번호 1을 추가로 갖는 서열 번호 2 내지 서열 번호 6으로 이루어진 단백질뿐만 아니라 N 말단에 융합된 His-태그 서열 번호 1을 추가로 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 12로 이루어진 단백질은 이. 콜라이에서 제조되었고, 동종성이 되게 정제되었고, PBS 완충액에 저장되었다. 명확함을 위해, 단백질 #2 내지 단백질 #6은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이고, 단백질 #7 내지 단백질 #12는 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이다. 단백질 #7 및 단백질 #8은 서열 번호 2를 2회 포함한다. 단백질 #9 및 단백질 #10은 서열 번호 3을 2회 포함한다. 단백질 #11 및 단백질 #12는 서열 번호 4를 2회 포함한다. 단백질 #7은 국제공개 WO2016156596호의 서열 번호 134로부터 당업자에게 잘 공지되어 있고, 단백질 #8은 국제공개 WO2018054971호의 서열 번호 21로부터 당업자에게 잘 공지되어 있다. 그러므로, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질인 단백질 #7과 비교하여, 단백질 #9 및 단백질 #11은 (i) 혈청 알부민에 대한 결합 특이성 및 (ii) 개선된 저장 안정성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이다. 마찬가지로, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질인 단백질 #8과 비교하여, 단백질 #10 및 단백질 #12는 (i) 혈청 알부민에 대한 결합 특이성 및 (ii) 개선된 저장 안정성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질이다. 이 문단에 기재된 것처럼 발현되고 정제된 단백질은 실시예 3 내지 실시예 12의 실험에 사용되었다.
대안적으로, N 말단에서 아미노산 GS를 추가로 갖는 서열 번호 2 내지 서열 번호 12로 이루어진 단백질은 이. 콜라이에서 제조되었고, 동종성이 되게 정제되었고, PBS 완충액에 저장되었다. 아미노산 GS가 N 말단에 있는 경우, 발현 벡터에 의해 추가로 암호화된 Met 잔기는 발현된 폴리펩타이드로부터 이. 콜라이의 세포질 중에서 효율적으로 절단되는데, 이는 출발 Met 뒤에 작은 Gly 잔기가 뒤따르기 때문이다. N 말단에서 아미노산 GS를 추가로 갖는 서열 번호 2 내지 서열 번호 12로 이루어진 단백질은 실시예 3 내지 실시예 12에서 N 말단에 융합된 His-태그 서열 번호 1을 추가로 갖는 서열 번호 2 내지 서열 번호 12로 이루어진 단백질과 동등한 결과를 나타낸다.
실시예
3:
저장 안정성 항온처리
실시예 2의 단백질은 다양한 pH에서 1주(7일) 동안 60℃에서 100 마이크로몰 단백질 농도에서 저장 안정성에 대해 시험되었다. 사용된 완충액은 PBS(pH 7.4; 137 mM NaCl, 10 mM 포스페이트 및 2.7 mM KCl) 또는 포스페이트/시트레이트(pH 5.7; 375 mM Na2HPO4*2H2O 및 150 mM NaCl, 1 M 시트르산 1수화물을 사용하여 조정된 pH) 또는 포스페이트/시트레이트(pH 4.75; 30 mM 시트르산 및 30 mM NaH2P04, 수산화나트륨을 사용하여 조정된 pH) 또는 포스페이트/시트레이트/보레이트(pH 8.5, 30 mM 시트르산, 30 mM NaH2PO4, 30 mM 붕산)였다. 단백질을 각각의 완충액과 혼합 시, 생성된 pH 값은 각각 pH 7.4, pH 6, pH 5 또는 pH 8.5였다. 60℃에서의 항온처리와 병행하여, 단백질의 분취액을 대조군으로서 1주(7일) 동안 -80℃에서 항온처리하였다.
상이한 pH에서 60℃에서 항온처리 동안의 안정성은 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질의 제조와 산업적으로 관련되는데, 제조 공정이 폴리펩타이드가 이러한 조건에 노출되는 동안 하나 이상의 공정 단계를 포함하기 때문이다. 또한, 당업자는 승온에서 항온처리의 단계를 포함하는 가속 저장 안정성 측정에 의해 저장 안정성을 결정한다.
실시예
4:
저장 안정성 분석 샘플의
SDS
-
PAGE
일시적 청색 염색(Sigma Aldrich)에 의해 염색된 NuPAGE 4% 내지 12% 비스-트리스 나트륨 도데실 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 겔(Thermo Fisher)에서 실시예 3의 단백질(10 마이크로그램의 단백질 각각의 레인)의 샘플을 분석하였다. 결과는 도 3에 도시되어 있다. 모든 단백질은 약 14.4 kDa의 예상된 크기에서 주요 밴드를 보여준다. 일부 단백질은 추가적인 저 분자량에서의 밴드(저 분자량 생성물) 및/또는 고 분자량에서의 밴드(고 분자량 생성물)를 보여준다. 단백질 #3 및 단백질 #4는 단백질 #2와 비교하여 pH 7.4, pH. 6 및 pH 5에서 더 적은 양의 저 분자량 생성물을 나타낸다. SDS-PAGE로부터 판단하여, 저 분자량 생성물의 감소는 pH 7.4, pH 6, 및/또는 pH 5에서 적어도 10%이다. 유사하게, SDS-PAGE로부터 판단하여, 저 분자량 생성물의 양의 감소는 pH 7.4, pH 6, 및/또는 pH 5에서 적어도 50%이다. 유사하게, 단백질 #2는 pH 7.4, pH 6 및/또는 pH 5에서 적어도 50% 초과의 저 분자량 생성물 또는 저 분자량 생성물 밴드를 보여준다. 놀랍게도, 단백질 #2는 1주 동안 60℃에서 항온처리 시 고 분자량 밴드를 나타낸다. 단백질 #3 및 단백질 #4는 고 분자량 밴드를 나타내지 않는 것으로 보이고, 즉 개선된 안정성을 나타낸다. SDS-PAGE로부터 판단하여, 고 분자량 밴드 생성물 밴드의 감소는 단백질 #2를 단백질 #3 및 단백질 #4와 비교할 때 pH 7.4에서 적어도 50%, pH 6에서 적어도 50% 및 pH 5에서 적어도 50%이다. 유사하게, 단백질 #2는 pH 7.4에서 적어도 10%, pH 6에서 적어도 20% 및 pH 5에서 적어도 50%에 이르는 고 분자량 밴드 및/또는 고 분자량 생성물의 증가를 보여준다.
실시예
5:
저장 안정성 분석 샘플의
LabChip
분석
제조사(Perkin Elmer)에 따라 LabChip GXII 장치를 사용하여 실시예 3의 단백질의 샘플을 분석하였다. 간단히, 샘플을 변성 용액과 혼합하고, 70℃에서 10분 동안 변성한 후, HT Protein Express Chip에서 분석하였다. 장치의 소프트웨어를 사용하여 실행을 분석하였다. 결과는 도 4에 도시되어 있다. 단백질 #3 및 단백질 #4는 단백질 #2와 비교하여 pH 7.4, pH. 6 및 pH 5에서 더 적은 양의 분해 생성물 또는 저 분자량 생성물을 나타낸다. LabChip 데이터로부터 판단하여, 분해 생성물 밴드 또는 저 분자량 생성물 밴드의 감소는 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서 적어도 10%이다. 단백질 #2는 1주 동안 60℃에서 항온처리 시 고 분자량 밴드를 나타내는 반면, 단백질 #3 및 단백질 #4는 고 분자량 밴드를 나타내지 않는다. LabChip 데이터로부터 판단하여, 고 분자량 밴드 생성물 밴드의 감소는 pH 7.4에서 적어도 10% 및 pH 6에서 적어도 50%이다(표 1 참조). 단백질 #2 내지 단백질 #4에 대해 이 실시예에서, 밴드는 이것이 25 kDa보다 큰 경우에 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드인 것으로 간주된다. 단백질 #2 내지 단백질 #4에 대해 이 실시예에서, 밴드는 이것이 10 kDa보다 작은 경우에 LabChip 분석에서 저 분자량 밴드인 것으로 간주된다. 단백질 제제의 높은 순도를 추정하여, 이러한 저 분자량 밴드는 분해 생성물 밴드인 것으로 간주될 수 있다.
[표 1]
실시예
6:
저장 안정성 분석 샘플의 크기-배제 크로마토그래피 분석
실시예 3의 샘플을 0.5 ml/분 유속에서 PBS 중의 Agilent 1200 HPLC 시스템에서 GE Superdex 200 150/5 칼럼에서 분석하였다. 각각의 단백질 중에서, 0.1 ml 내지 100 마이크로몰의 -80℃ 대조군 샘플 및 60℃ 항온처리 샘플의 각각을 분석하였다. 크기 배제 크로마토그램(360 nm에서의 광학 밀도에 의해 공제된 280 nm에서의 광학 밀도)은 도 5a(pH 7.4), 도 5b(pH 6) 및 도 5c(pH 5)에 도시되어 있다. 단백질 #3 및 단백질 #4는 pH 7.4, pH 6 및 pH 5에서 -80℃ 대조군 샘플 및 60℃ 항온처리 샘플의 대략 중첩하는 크로마토그램을 보여준다. 단백질 #2는 pH 7.4 및 pH 6에서 -80℃ 대조군 샘플 및 60℃ 항온처리 샘플의 대략 중첩하는 크로마토그램을 보여준다. 그에 반해서, 단백질 #2는 pH 5에서의 -80℃ 대조군 샘플과 비교하여 60℃ 항온처리 샘플 중에서 명확한 고 분자량 종의 명확한 증가를 보여주었다. 60℃ 항온처리 샘플에서의 pH 5에서의 단백질 #2의 명확한 고 분자량 종은 곡선 하 총 면적의 25%에 상응하는 반면, pH 5에서의 -80℃ 대조군 샘플인 단백질 #2는 명확한 고 분자량 종을 나타내지 않는다. 이 실시예에서의 명확한 고 분자량 종은 약 4.1분에서 피크로 용리하는 종이다. 예상된 명확한 분자량 종은 약 4.6분에서 피크로 용리하는 종이다. 단백질 #3 및 단백질 #4는 pH 5에서 60℃ 항온처리 샘플에서 명확한 고 분자량 종을 나타내지 않는다.
실시예
7:
친화성 측정
당업자에게 공지된 표준 절차에 따라 PBS 중의 ProteOn 시스템(BioRad)을 사용하여 SPR 측정에 의해 인간 혈청 알부민에 대한 실시예 2의 단백질의 친화성을 결정하였다. 결정된 친화성은 표 2에 열거되어 있다. 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 모든 설계된 안키린 반복 도메인은 해리 상수 KD < 100 nM을 나타내고, 해리 상수는 필적하는 범위에 있다.
[표 2]
실시예
8:
혈청 알부민 종 교차반응성
실시예 2의 단백질의 샘플을 국제공개 WO2016156596호에 기재된 것처럼 ELISA 혈청 알부민 교차반응성 분석으로 처리하였다. 웰당 PBS 중의 100 μl의 20 nM 혈청 알부민을 Maxisorp 플레이트(Nunc, 덴마크)에서 4℃에서 밤새 부동화하였다. 300 μl의 PBST(0.1% Tween 20이 보충된 PBS)에 의해 5회 세척 후, 웰을 Titramax 1000 진탕기(Heidolph, 독일)에서 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 2시간 동안 300 μl의 PBST-C(0.25% 카제인이 보충된 PBST)에 의해 차단하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, PBST-C 중의 100 μl/웰 또는 50 μl/웰 단백질 #2, 단백질 #3 또는 단백질 #4(각각의 단백질에 대한 100 nM 내지 0.01 pM의 범위의 농도)를 적용하고, 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 2시간 동안 항온처리하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 PBST-C 중의 100 μl의 토끼 항-설계된 안키린 반복 도메인 단일클론 항체를 사용하여 단백질의 결합을 검출하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 PBST-C 중의 100 μl/웰 염소 항-토끼 IgG-HRP 접합체를 사용하여 결합된 항-설계된 안키린 반복 도메인 항체를 검출하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, 물 중에 1:4 희석된 100 μl의 BM 가용성 청색 POD 기질(Roche, 스위스)을 사용하여 ELISA가 이후 전개되었다. 반응은 100 μl의 1 M H2SO4를 사용하여 5분 후 중단되었다. 이후, OD(OD 450 nm 내지 OD 620 nm)를 기록하였다. EC50 값은 GraphPad Prism을 사용하여 결정되었다(표 3). 분석은 인간, 사이노몰거스 원숭이 및 마우스의 혈청 알부민이 고친화성으로 결합한다는 것을 보여준다. 인간 혈청 알부민 결합에 대한 측정된 EC50 값은 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4에 대해 1 nM 미만이다. 사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민 결합에 대한 측정된 EC50 값은 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4에 대해 20 nM 미만이다. 마우스 혈청 알부민 결합에 대한 측정된 EC50 값은 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4에 대해 30 nM 미만이다.
[표 3]
실시예
9:
혈청
알부민에 대한 결합 특이성을
갖는 설계된
안키린
반복 도메인의 마우스에서의 약동학적 프로파일.
단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4를 사용하여 암컷 Balb/c 마우스에서 약동학적 분석을 수행하였고, 이들은 실시예 2에 기재된 것과 같이 제조되었다. 단백질을 꼬리 정맥으로 정맥내 주사에 의해 1 mg/㎏로 적용하였다. 각각의 단백질에 대해 각각 3마리의 마우스의 2개의 그룹으로 나누어진 6마리의 마우스를 사용하였다. 모든 단백질에 대해, 주사 후 5분, 24시간, 72시간, 168시간 및 360시간에 하나의 그룹의 마우스로부터 그리고 주사 후 4시간, 48시간, 144시간 및 168시간에 다른 그룹의 마우스로부터 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 실온에서 정치되게 하고 원심분리하여 당업자에게 잘 공지된 절차를 사용하여 혈청을 생성한 후, 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 포획 시약으로서 토끼 단일클론 항-DARPin 항체 및 검출 시약으로서 항-RGS-His 항체-HRP 접합체를 사용하여 그리고 표준 곡선을 사용하여 샌드위치 ELISA에 의해 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4의 혈청 농도를 결정하였다. 당업자에게 잘 공지된 종래의 토끼 면역화 및 하이브리도마 생성 기법을 사용하여 단일클론 항-DARPin 항체를 생성하였고, 농도 결정 실험 전에 단백질 #2 내지 단백질 #16에 대한 단일클론 항체의 결합을 검증하였다. 간단히, 웰당 PBS 중의 100 μl의 10 nM 염소-항-토끼 항체(Thermo Scientific)를 4℃에서 밤새 Maxisorp 플레이트(Nunc, 덴마크)에 부동화하였다. 300 μl의 PBST(0.1% Tween 20이 보충된 PBS)에 의해 5회 세척 후, 웰을 Titramax 1000 진탕기(Heidolph, 독일)에서 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 300 μl의 PBST-C(0.25% 카제인이 보충된 PBST)에 의해 차단하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, PBST-C 중의 100 μl/웰 5 nM 토끼-항-DARPin 항체를 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 첨가하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, PBST-C에 희석된 혈청 샘플 또는 표준 기준품의 상이한 희석액을 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 2시간 동안 첨가하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, PBST-C 중의 50 μl의 100 ng/ml 마우스 항-RGS-His 항체-HRP 접합체(QIAgen)를 450 rpm에서 진탕시키면서 실온에서 30분 동안 첨가하였다. 상기 기재된 것처럼 5회 세척 후, 50 μl의 TMB 기질을 사용하여 ELISA가 전개되었다. 반응은 100 μl의 1 M H2SO4를 사용하여 5분 후 중단되었다. 이후, OD(OD 450 nm 내지 OD 620 nm)를 기록하였다. 모두 당업자에게 잘 공지된 Phoenix WinNonLin(미국 프린스턴 소재의 Certara) 또는 GraphPadPrism(미국 라호이아 소재의 GraphPad Software)과 같은 표준 소프트웨어, 및 비구획 분석과 같은 표준 분석을 사용하여 약동학적 매개변수를 결정하였다. 생성된 약동학적 프로파일은 도 6a에 도시되어 있다. 측정으로부터 유래된 약동학적 매개변수인 곡선 하 면적, 청소율, 분포 부피 및 반감기는 표 4에 열거되어 있다.
[표 4]
실시예
10:
혈청
알부민에 대한 결합 특이성을
갖는 설계된
안키린
반복 도메인의
사이노몰거스
원숭이에서의
약동학적 프로파일.
30분 정맥내 주입 투여를 통해 투여된 1 mg/㎏로 각각의 단백질에 대해 2마리의 수컷 마카카 파시쿨라리스에서 약동학적 분석을 수행하였다. 모든 단백질에 대해, 주사 후 5분, 6시간, 24시간, 72시간, 120시간, 168시간, 336시간, 408시간, 504시간 및 672시간에 모든 동물로부터 혈액을 수집하였다. 혈액 샘플을 실온에서 정치되게 하고 원심분리하여 당업자에게 잘 공지된 절차를 사용하여 혈청을 생성한 후, 분석할 때까지 -80℃에 저장하였다. 단백질 #2, 단백질 #3 및 단백질 #4의 혈청 농도는 실시예 9에 기재된 것과 같이 샌드위치 ELISA에 의해 결정되었다. 모두 당업자에게 잘 공지된 Phoenix WinNonLin(미국 프린스턴 소재의 Certara) 또는 GraphPadPrism(미국 라호이아 소재의 GraphPad Software)과 같은 표준 소프트웨어, 및 비구획 분석과 같은 표준 분석을 사용하여 약동학적 매개변수를 결정하였다. 생성된 약동학적 프로파일은 도 6b에 도시되어 있다. 측정으로부터 유래된 약동학적 매개변수인 곡선 하 면적, 청소율, 분포 부피 및 반감기는 표 5에 열거되어 있다.
[표 5]
실시예
11:
혈청
알부민에 대한 결합 특이성
및 개선된 안정성을 갖는 설계된
안키린
반복 도메인을 사용한 재조합 결합 단백질의 생성 및 규명
재조합 DNA 기술에 의해 혈청 알부민에 대한 결합 특이성 및 개선된 저장 안정성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 생성하였다. 서열 번호 7 내지 서열 번호 12는 이러한 재조합 결합 단백질의 예이다. 실시예 3에 기재된 것과 같이 단백질 #7, 단백질 #8, 단백질 #9, 단백질 #10, 단백질 #11 및 단백질 #12(말단에 융합된 His-태그 서열 번호 1을 추가로 갖는 서열 번호 7 내지 서열 번호 12로 이루어짐; 실시예 2 참조)를 제조하였다. 유사하게, N 말단에서 아미노산 MGS를 각각 추가로 보유하는 서열 번호 7 내지 서열 번호 12로 이루어진 단백질(여기서, 출발 Met 뒤에 작은 Gly 잔기가 뒤따르므로, N 말단 메티오닌은 발현된 폴리펩타이드로부터 이. 콜라이의 세포질에서 효율적으로 절단됨)은 이. 콜라이에서 제조될 수 있고, 종래의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
실시예 3 내지 실시예 6에 따라 안정성 개선에 대해 재조합 결합 단백질을 평가하였다. 서열 번호 9 및 서열 번호 11로 이루어진 재조합 결합 단백질은 서열 번호 7로 이루어진 재조합 결합 단백질보다 더 높은 안정성을 나타낸다. 마찬가지로, 서열 번호 10 및 서열 번호 12로 이루어진 재조합 결합 단백질은 서열 번호 8로 이루어진 재조합 결합 단백질보다 더 높은 안정성을 나타낸다.
실시예
12:
혈청
알부민에 대한 결합 특이성을
갖는 설계된
안키린
반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 마우스에서의 약동학적 프로파일.
단백질 #7, 단백질 #9 및 단백질 #11을 사용하여 그리고 단백질 #8, 단백질 #10 및 단백질 #12를 사용하여 마우스에서 약동학적 분석을 수행하였고, 모두 실시예 2에 기재된 것과 같이 제조되었다. 단백질마다 3마리의 마우스를 사용하고 주사 후 5분, 4시간, 48시간 및 96시간에 혈액을 취하여 연구는 본질적으로 실시예 9에 기재된 것처럼 수행되었다. 실시예 9에 기재된 것과 같이 농도 결정 및 약동학적 매개변수의 결정을 수행하였다. 단백질 #7, 단백질 #9 및 단백질 #11의 비교를 위해, 약동학적 트레이스는 도 7a에 도시되어 있고, 모든 단백질에 대한 측정으로부터 유래된 약동학적 매개변수인 곡선 하 면적, 청소율, 분포 부피 및 반감기는 표 6에 열거되어 있다. 단백질 #8, 단백질 #10 및 단백질 #12의 비교를 위해, 약동학적 트레이스는 도 7b에 도시되어 있고, 모든 단백질에 대한 측정으로부터 유래된 약동학적 매개변수인 곡선 하 면적, 청소율, 분포 부피 및 반감기는 표 7에 열거되어 있다.
[표 6]
[표 7]
SEQUENCE LISTING
<110> Molecular Partners AG
<120> Designed ankyrin repeat domain with improved stability
<130> P5754PC00
<150> EP19178282.0
<151> 2019-06-04
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> His-tag
<400> 1
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser
1 5 10
<210> 2
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ankyrin repeat domain
<400> 2
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 3
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ankyrin repeat domain
<400> 3
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ankyrin repeat domain
<400> 4
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 5
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ankyrin repeat domain
<400> 5
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ile Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 6
<211> 124
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ankyrin repeat domain
<400> 6
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
115 120
<210> 7
<211> 601
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein comprising four ankyrin repeat domains
<400> 7
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp
180 185 190
Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala
245 250 255
Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
260 265 270
Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu
275 280 285
Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala
290 295 300
Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
305 310 315 320
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu
325 330 335
Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu
355 360 365
His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu
370 375 380
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro
385 390 395 400
Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
405 410 415
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr
420 425 430
Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val
435 440 445
Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
450 455 460
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly
465 470 475 480
Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg
485 490 495
Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser
500 505 510
His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val
515 520 525
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala
530 535 540
Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile
545 550 555 560
Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile
565 570 575
Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp
580 585 590
Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
595 600
<210> 8
<211> 568
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein comprising four ankyrin repeat domains
<400> 8
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln
180 185 190
Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala
245 250 255
Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
260 265 270
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
275 280 285
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu
290 295 300
Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala
305 310 315 320
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr
325 330 335
Leu Ala Thr Ala His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu
355 360 365
His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu
370 375 380
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro
385 390 395 400
Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu
405 410 415
Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro
420 425 430
Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys
435 440 445
Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu
450 455 460
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His
465 470 475 480
Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu
485 490 495
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly
500 505 510
Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His Leu Glu Ile Val
515 520 525
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe
530 535 540
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile
545 550 555 560
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565
<210> 9
<211> 601
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein comprising four ankyrin repeat domains
<400> 9
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asp Arg Tyr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp
180 185 190
Ile Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Ser Tyr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala
245 250 255
Ala Asn Thr Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly
260 265 270
Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu
275 280 285
Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala
290 295 300
Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr
305 310 315 320
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu
325 330 335
Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu
355 360 365
His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu
370 375 380
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro
385 390 395 400
Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
405 410 415
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr
420 425 430
Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val
435 440 445
Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
450 455 460
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly
465 470 475 480
Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg
485 490 495
Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser
500 505 510
His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val
515 520 525
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala
530 535 540
Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile
545 550 555 560
Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile
565 570 575
Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp
580 585 590
Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
595 600
<210> 10
<211> 568
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein comprising four ankyrin repeat domains
<400> 10
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His
65 70 75 80
Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala
85 90 95
Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly
100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr
130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Val Thr Pro Leu His Ile Ala Ala Gln
180 185 190
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195 200 205
Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala
245 250 255
Ala Asp Trp Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
260 265 270
Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr
275 280 285
Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu
290 295 300
Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala
305 310 315 320
Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Glu Tyr Gly Leu Thr Pro Leu Tyr
325 330 335
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340 345 350
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Ala Ile Gly Phe Thr Pro Leu
355 360 365
His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu
370 375 380
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Phe Gly Lys Thr Pro
385 390 395 400
Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu
405 410 415
Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro
420 425 430
Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys
435 440 445
Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu
450 455 460
Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser His
465 470 475 480
Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu Lys Ile Val Glu
485 490 495
Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala Gly
500 505 510
Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His Leu Glu Ile Val
515 520 525
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile Phe
530 535 540
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile
545 550 555 560
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565
<210> 11
<211> 601
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein comprising four ankyrin repeat domains
<400> 11
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Val Asn Ala Glu Asp Tyr Phe Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
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225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Lys Asp Asp Tyr Gly Asn Thr Pro Leu His Leu Ala
245 250 255
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260 265 270
Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr Pro Ala Asp Leu
275 280 285
Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala
290 295 300
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305 310 315 320
Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Asp Lys Lys Leu Leu
325 330 335
Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys
340 345 350
Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Ser Thr Gly Trp Thr Pro Leu
355 360 365
His Leu Ala Ala Pro Trp Gly His Pro Glu Ile Val Glu Val Leu Leu
370 375 380
Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Gln Gly Trp Thr Pro
385 390 395 400
Leu His Leu Ala Ala Ala Ala Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu
405 410 415
Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Lys Ser Gly Lys Thr
420 425 430
Pro Ala Asp Leu Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val
435 440 445
Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr
450 455 460
Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly
465 470 475 480
Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg
485 490 495
Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Tyr Phe Ser
500 505 510
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515 520 525
Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp Phe Ala
530 535 540
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545 550 555 560
Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Gln Asp Ile
565 570 575
Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp
580 585 590
Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
595 600
<210> 12
<211> 568
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Protein comprising four ankyrin repeat domains
<400> 12
Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp
1 5 10 15
Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp
20 25 30
Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu
35 40 45
Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys
50 55 60
Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr
115 120 125
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130 135 140
Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Ile Lys Leu Leu Phe Ala Ala Ala Lys
145 150 155 160
Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val
165 170 175
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180 185 190
Ser Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Lys Asp Val Thr Gly Asp Thr Pro Leu His Leu Ala Ala
210 215 220
Gln His Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala
225 230 235 240
Asp Val Asn Ala Gln Asp Glu Arg Gly Trp Thr Pro Ala Asp Leu Ala
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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355 360 365
His Leu Ala Ala Phe Ile Gly His Leu Glu Ile Ala Glu Val Leu Leu
370 375 380
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385 390 395 400
Ala Asp Ile Ala Ala Gly Ala Gly Asn Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu
405 410 415
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420 425 430
Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Lys
435 440 445
Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu
450 455 460
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465 470 475 480
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515 520 525
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530 535 540
Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly His Glu Asp Ile
545 550 555 560
Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala
565
<210> 13
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence motif
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> X represents an amino acid residue selected from the group
consisting of A, D, and I; preferably, A and D
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> X represents an amino acid residue selected from the group
consisting of A and D
<400> 13
Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Xaa Xaa Gly
1 5 10 15
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence motif
<400> 14
Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly
1 5 10 15
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence motif
<400> 15
Lys Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly
1 5 10 15
Claims (15)
- 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인으로서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열과 적어도 80%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않고/않거나 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않고, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 선택적으로 이의 N 말단에서 G, S 또는 GS를 추가로 포함하고, 선택적으로 마지막에서 두번째 위치에서의 A는 L로 치환되고/되거나, 마지막 위치에서의 A는 N으로 치환된, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 77번 위치에 상응하는 위치에서 아스파라긴(N)을 갖지 않는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 78번 위치에 상응하는 위치에서 글루탐산(E)을 갖지 않는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 아미노산 서열 KDFAGKTPLHLAAX1X2G(서열 번호 13)를 포함하는, 설계된 안키린 반복 도메인:
상기 식 중,
X1은 A, D 및 I로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타내고;
X2는 A 및 D로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 잔기를 나타냄. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 내지 서열 번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4를 포함하는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 100 nM 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 혈청 알부민에 결합하는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 개선된 안정성을 갖는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 분해 밴드를 더 적게 나타내고, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행되는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 (i) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 SDS-PAGE에서 고 분자량 밴드를 더 적게 나타내고, 상기 SDS-PAGE는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행되고/되거나, (ii) 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 크기-배제 크로마토그래피에서 고 분자량 피크를 더 적게 나타내고, 상기 크기-배제 크로마토그래피는 pH 5.0에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 1주 항온처리 후 수행되는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 설계된 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인과 비교하여 LabChip 분석에서 고 분자량 밴드를 적어도 10% 적게 나타내고, 상기 LabChip 분석은 pH 6.0 또는 7.4에서 60℃에서 100 마이크로몰에서 항온처리 후 수행되는, 설계된 안키린 반복 도메인.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 설계된 안키린 반복 도메인의 1개 또는 2개를 포함하는 재조합 결합 단백질.
- 제12항에 있어서, 상기 재조합 결합 단백질은 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 상기 설계된 안키린 반복 도메인의 각각이 서열 번호 2로 이루어진 설계된 안키린 반복 도메인으로 치환됨을 제외하고는 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 결합 단백질과 비교하여 개선된 안정성을 갖는, 재조합 결합 단백질.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질을 암호화하는 핵산.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질, 또는 제14항의 핵산, 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는, 약제학적 조성물.
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