CN114206943A - 多特异性蛋白质 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及可用于治疗癌症的多特异性重组蛋白质。

Description

多特异性蛋白质
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2019年6月4日提交的美国临时申请62/857,037的优先权权益，该申请的公开内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及可用于治疗癌症的多特异性蛋白质。
以引用方式并入序列表
与此同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表全文以引用方式并入，并标识如下：ASCII(文本)文件，名称为53893A_Seqlisting.txt；大小：107,894字节，创建于2020年5月21日。
背景技术
肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族的几个成员在初始T细胞活化后发挥作用，以维持T细胞应答，因此在免疫系统的组织和功能中具有关键作用。CD27、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)、HVEM、CD30和GITR可对T细胞具有共刺激效应，这意味着它们在初始T细胞活化后维持T细胞应答(Watts T.H.，2005年，Annu.Rev.Immunol.，第23卷，第23-68页)。根据病征，经由共刺激TNF家族成员进行刺激可加剧或改善疾病。
4-1BB(CD137)是TNF受体超家族的成员，已被首先标识为其表达由T细胞活化诱导的分子(Kwon Y.H.和Weissman S.M.1989年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷，第1963-1967页)。后续研究表明4-1BB在T淋巴细胞和B淋巴细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞以及非造血起源的细胞(诸如内皮和平滑肌细胞)中的表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达主要是诱导型的，并且由各种刺激信号驱动，诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发，以及通过共刺激分子或促炎细胞因子的受体诱导的信号传导。
已知4-1BB信号传导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖，以及促进树突状细胞(DC)活化，如由它们增加的存活率和分泌细胞因子和上调共刺激分子的能力所指示的。然而，4-1BB最好表征为在T细胞CD4+和CD8+亚群中调节TCR诱导的活化的共刺激分子。结合TCR触发，激动性4-1BB特异性抗体增强T细胞增殖，刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(Snell L.M.等人，2011年，Immunol.Rev.，第244卷，第197-217页)。根据4-1BB抗体在体外对T细胞的这些共刺激效应，将它们施用于携带肿瘤的小鼠在许多实验肿瘤模型中导致强效抗肿瘤效应(Melero I.等人，1997年，Nat.Med.，第3卷，第682-685页；Narazaki H.等人，2010，Blood，第115卷，第1941-1948页)。体内衰竭实验表明CD8+T细胞在4-1BB特异性抗体的抗肿瘤效应中起到最关键的作用。然而，根据肿瘤模型或组合疗法(包括4-1BB特异性抗体)，已报道了其他类型的细胞(诸如DC、NK细胞或CD4+T细胞)的作用(MuriUo O.等人，2009年，Eur.J.Immunol.，第39卷，第2424-2436页；Stagg J.等人，2011年，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第108卷，第7142-7147页)。
除了对不同淋巴细胞亚群的直接影响之外，4-1BB激动剂还可通过4-1BB介导的肿瘤血管内皮上的细胞间粘附分子1(ICAM1)和血管细胞粘附分子1(VCAM1)的上调来诱导肿瘤中活化的T细胞的浸润和滞留。4-1BB触发还可逆转由暴露于可溶抗原而诱导的T细胞无反应状态，这可有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫耐受。
据报道，全身施用4-1BB特异性激动性抗体诱导与肝脏毒性相关联的CD8+T细胞的扩增(Dubrot J.等人，2010年，Cancer Immunol.Immunother.，第59卷，第1223-1233页)。在人临床试验(ClinicalTrials.gov，NCT00309023)中，每三周施用一次4-1BB激动性抗体(BMS-663513)，持续12周，诱导患有黑素瘤、卵巢癌或肾细胞癌的患者的疾病稳定。然而，另一个试验(NCT00612664)中给出的相同抗体引起4级肝炎，从而导致试验终止(Simeone E.和Ascierto P.A.，2012年，J.Immunotoxicology，第9卷，第241-247页)。
因此，需要有效地接合4-1BB同时避免不期望的副作用的新一代激动剂。
发明内容
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将认识到或仅能够使用常规实验来确定本文所述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施方案(E)涵盖。
E1.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含特异性结合成纤维细胞活化蛋白(FAP)的第一锚蛋白重复结构域和特异性结合4-1BB的第二锚蛋白重复结构域。
E2.根据E1所述的重组蛋白质，该重组蛋白质还包含特异性结合4-1BB的第三锚蛋白重复结构域。
E3.根据E2所述的重组蛋白质，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)。
E4根据E1至E3中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质还包含半衰期延长部分。
E5.根据E4所述的重组蛋白质，其中所述半衰期延长部分包含特异性结合血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域。
E6.根据E5所述的重组蛋白质，该重组蛋白质还包含特异性结合血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域。
E7.根据E6所述的重组蛋白质，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域(本文也称为血清白蛋白结合结构域1))-(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(血清白蛋白结合结构域(本文也称为血清白蛋白结合结构域2))。
E8.根据E1至E7中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质还包含介于任何所述FAP结合结构域、所述4-1BB结合结构域和所述半衰期延长部分之间的连接基。
E9.根据E1至E8中任一项所述的重组蛋白质，该重组蛋白质从N末端到C末端包含下式：(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)。
E10.根据E1至E8中任一项所述的重组蛋白质，从N末端到C末端包含下式：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)。
E11.根据E4或E8至E9中任一项所述的重组蛋白质，其中所述半衰期延长部分包含免疫球蛋白重链恒定结构域。
E12.根据E11所述的重组蛋白质，其中所述免疫球蛋白结构域是IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgM、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4免疫球蛋白的Fc结构域。
E13.根据E12所述的重组蛋白质，其中所述Fc结构域是人IgG1免疫球蛋白的Fc结构域。
E14.根据E13所述的重组蛋白质，其中所述Fc结构域包含降低效应子功能的修饰。
E15.根据E1至E14中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP是人FAP。
E16.根据E1至E15中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB是人4-1BB。
E17.根据E5至E10中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)。
E18.根据E11至E14中任一项所述的重组蛋白质，其中所述免疫球蛋白重链恒定结构域是人免疫球蛋白重链恒定结构域。
E19.根据E1至E18中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质与FAP的结合不会使FAP的蛋白酶活性降低超过25％、超过20％、超过15％、超过10％或超过5％。
E20.根据E1至E19中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，SEQ ID NO:2的倒数第二位置处的A被L取代并且/或者SEQ ID NO:2的最后位置处的A被N取代。
E21.根据E1至E20中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
E22.根据E1至E19中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:18至23和39至43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
E23.根据E1至E20和E22中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含SEQ ID NO:18至23和39至43中的任一者的氨基酸序列。
E24.根据E1至E20和E22中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至22和43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。
E25.根据E1至E20和E22中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:23和39至42中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的L被A取代，并且/或者最后位置处的N被A取代。
E26.根据E1至E20和E22中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:39具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的L被A取代，并且/或者最后位置处的N被A取代。
E27.根据E1至E20和E22中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:43具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。
E28.根据E1至E27中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含(i)与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其N末端处还包含G、S或GS。
E29.根据E1至E27中任一项所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端还包含G、S或GS。
E30.根据E1至E29中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，SEQ ID NO:3的倒数第二位置处的A被L取代并且/或者SEQ ID NO:3的最后位置处的A被N取代。
E31.根据E1至E30中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
E32.根据E1至E29中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:24至29和51至55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
E33.根据E1至E30和E32中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者包含SEQ ID NO:24至29和51至55中的任一者的氨基酸序列。
E34.根据E1至E30和E32中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3、24至28和54中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。
E35.根据E1至E30和E32中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:54具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。
E36.根据E1至E30和E32中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:29、51至53和55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的L被A取代，并且/或者最后位置处的N被A取代。
E37.根据E1至E36中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含(i)与SEQ ID NO:3、18至29和51至55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其N末端处还包含G、S或GS。
E38.根据E1至E37中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3、18至29和51至55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端还包含G、S或GS。
E39.根据E1至E38中任一项所述的重组蛋白质，其中：
(a)所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且
(b)所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。
E40.根据E1至E35中任一项所述的重组蛋白质，其中：
(a)所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且
(b)所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。
E41.根据E1至E34中任一项所述的重组蛋白质，其中：
(a)所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且
(b)所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。
E42.根据E1至E34中任一项所述的重组蛋白质，其中：
(a)所述FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2、18-23和39-43中的任一者的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且
(b)所述4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含SEQ IDNO:3、24至29和51至55中的任一者的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。
E43.根据E5至E10、E15至E17和E19至E42中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域或所述血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。
E44.根据E5至E10、E15至E17和E19至E43中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域或所述血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
E45.根据E5至E10、E15至E17和E19至E42中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域或所述血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:30至31中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，SEQ ID NO:30至31中的任一者的倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者SEQ ID NO:30至31中的任一者的最后位置处的A被N取代。
E46.根据E5至E10、E15至E17和E19至E42和E45中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域或所述血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含SEQ IDNO:30至31中的任一者的氨基酸序列。
E47.根据E5至E10、E15至E17和E19至E46中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域或所述血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含(i)与SEQ IDNO:1和30至31中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且(ii)在其N末端处还包含G、S或GS。
E48.根据E5至E10、E15至E17和E19至E47中任一项所述的重组蛋白质，其中所述血清白蛋白结合结构域或所述血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1和30至31中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端还包含G、S或GS。
E49.根据E7至E10、E15至E17和E19至E48中任一项所述的重组蛋白质，其中所述N末端血清白蛋白结构域(或血清白蛋白结构域1)包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。
E50.根据E8至E49中任一项所述的重组蛋白质，其中所述连接基包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
E51.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中所述蛋白质特异性结合FAP和4-1BB。
E52.根据E51所述的重组蛋白质，其中所述FAP是人FAP。
E53.根据E51和E52所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB是人4-1BB。
E54.根据E1至E53中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以小于或等于：约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约40pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约1pM的KD值结合FAP。
E55.根据E1至E54中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以小于或等于约10nM的KD值结合人FAP。
E56.根据E1至E54中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以小于或等于约1nM的KD值结合人FAP。
E57.根据E1至E56中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以小于或等于约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约40pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约1pM的KD值结合4-1BB。
E58.根据E1至E57中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以小于或等于10nM的KD值结合人4-1BB。
E59.根据E1至E57中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以小于或等于1nM的KD值结合人4-1BB。
E60.根据E1至E57中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质以小于或等于50pM的KD值结合人4-1BB。
E61.根据E54至E60中任一项所述的重组蛋白质，其中所述KD在PBS中通过表面等离振子共振(SPR)测量。
E62.根据E61所述的重组蛋白质，其中所述KD使用Biacore T200仪器测量。
E63.根据E54至E60中任一项所述的重组蛋白质，其中所述KD通过生物层干涉测量法(BLI)测量。
E64.根据E63所述的重组蛋白质，其中所述KD使用ForteBio Octet仪器测量。
E65.根据E1至E64中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有如通过体外IFNγ释放测定所评估的不超过约100nM、不超过约75nM、不超过约65nM、不超过约55nM，不超过约45nM、不超过约35nM、不超过约25nM、不超过约15nM、不超过约10nM、不超过约5nM、不超过约4nM、不超过约3nM、不超过约2nM，约0.01nM至约50nM、约0.01nM至约25nM、约0.01nM至约10nM、约0.01nM至约5nM、约0.05nM至约50nM、约0.05nM至约25nM、约0.05nM至约10nM，约0.05nM至约5nM、约0.1nM至约50nM、约0.1nM至约25nM、约0.1nM至约10nM、约0.1nM至约5nM、约0.4nM至约2nM的半最大有效浓度(EC50)。
E66.根据E1至E65中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有不超过约10nM的EC50。
E67.根据E1至E66中任一项所述的重组蛋白质，其中所述重组蛋白质具有约0.1nM至约10nM的EC50。
E68.根据E65至E67中任一项所述的重组蛋白质，其中所述IFNγ释放测定是人T细胞γ释放测定。
E69.根据E68所述的重组蛋白质，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
E70.根据E65至E69中任一项所述的重组蛋白质，其中所述IFNγ释放测定使用人IFN-γDuoSet ELISA(R和D系统)测量。
E71.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
E72.一种分离的核酸分子，该分离的核酸分子编码根据E1至E71中任一项所述的重组蛋白质。
E73.根据E72所述的分离的核酸分子，该分离的核酸分子包含SEQ ID NO:17的核酸序列。
E74.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含由SEQ ID NO:17的序列编码的氨基酸序列。
E75.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含由与SEQ ID NO:17的序列具有至少85％、90％、95％或99％同一性的核酸序列编码的氨基酸序列。
E76.一种重组蛋白质，该重组蛋白质包含由能够在高严格条件下与SEQ ID NO:17的序列杂交的核酸序列编码的氨基酸序列。
E77.一种载体，该载体包含核酸分子，该核酸分子包含根据E72至E76中任一项所述的核酸序列。
E78.一种宿主细胞，该宿主细胞包含核酸分子，该核酸分子包含根据E72至E76中任一项所述的核酸序列。
E79.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据E77所述的载体。
E80.根据E78或E79所述的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞。
E81.根据E78或E79所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
E82.根据E78或E79所述的宿主细胞，其中所述细胞是真核细胞。
E83.一种制备根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质的方法，该方法包括在其中表达所述重组蛋白质的条件下培养根据E78至E82中任一项所述的宿主细胞。
E84.根据E83所述的方法，该方法还包括分离所述重组蛋白质。
E85.一种药物组合物，该药物组合物包含根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
E86.一种治疗癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质或根据E85所述的药物组合物。
E87.根据E86所述的方法，其中所述受试者是人。
E88.根据E86或E87所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
E89.根据E86至E88中任一项所述的方法，其中所述癌症包括表达FAP的细胞。
E90.根据E86至E89中任一项所述的方法，其中该癌症是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈鳞状细胞癌、唇癌、口腔癌、肝癌、肺鳞状细胞癌、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、小细胞肺癌(SCLC)、头颈鳞状上皮细胞癌(SCCHN)、三阴性乳腺癌或甲状腺癌。
E91.根据E86至E89中任一项所述的方法，其中该癌症是肾上腺皮质肿瘤、肺泡状软组织肉瘤、恶性肿瘤、软骨肉瘤、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮细胞瘤、尤文肉瘤、生殖细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、成神经细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或Wilms瘤。
E92.根据E86或E87所述的方法，其中该癌症是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或慢性髓性白血病(CML)。
E93.根据E86或E87所述的方法，其中该癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
E94.根据E86至E93中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白质或药物组合物经静脉内施用。
E95.根据E86至E93中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白质或药物组合物经皮下施用。
E96.根据E86至E95中任一项所述的方法，其中约每周两次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、每月两次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次或每四个月一次施用所述重组蛋白质或药物组合物。
E96a.根据E86至E95中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白质或药物组合物以约0.5mg/kg至约5mg/kg或约0.015mg/kg至约12mg/kg的剂量范围施用。
E96b.根据E86至E95中任一项所述的方法，其中所述重组蛋白质或药物组合物以约2mg/kg的剂量施用。
E96c.根据E86至E95中任一项所述的方法，其中每三周施用所述重组蛋白质或药物组合物。
E97.根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质或根据E85所述的药物组合物用作药物。
E98.根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质或根据E85所述的药物组合物用于治疗受试者的癌症。
E99.根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质或根据E85所述的药物组合物在制造用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
E100.根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质或根据E85所述的药物组合物用于治疗受试者的癌症的用途。
E101.一种试剂盒，该试剂盒包括容器、该容器内的包含根据E1至E71和E74至E76中任一项所述的重组蛋白质或根据E85所述的药物组合物的组合物、以及包含施用治疗有效量的重组蛋白质或药物组合物以治疗对其有需要的患者的说明书的包装说明书。
本文章节标题的使用仅仅是为了便于阅读，而并非旨在进行限制。整个文档旨在被视为统一的公开内容，并且应当理解，本文所述的特征的所有组合都是预期的。
附图说明
图1是本公开的重组多特异性蛋白质的图示。经由一系列连接基，血清白蛋白结合锚蛋白重复结构域连接到FAP结合锚蛋白重复结构域，该FAP结合锚蛋白重复结构域连接到4-1BB结合锚蛋白重复结构域，该4-1BB结合锚蛋白重复结构域连接到另一个4-1BB锚蛋白重复结构域，该另一个4-1BB锚蛋白重复结构域连接到血清白蛋白结合锚蛋白重复结构域。
图2是本公开的多特异性重组蛋白质的氨基酸序列，具有下式：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)。(SEQ ID NO:6)。血清白蛋白结合结构域的序列用下划线标出，FAP结合结构域的序列用斜体标出，4-1BB结合结构域的序列用粗体标出，并且连接基用阴影标出。
图3是示出FAP/4-1BB双特异性蛋白质介导的4-1BB在肿瘤细胞附近的T细胞上聚集，从而触发免疫应答的示意图。在不存在肿瘤抗原FAP(正常非恶性细胞；参见右侧的“周边”)的情况下，由于缺乏FAP结合，将发生4-1BB的最小聚集，并且免疫活化将受到限制。相比之下，在癌症相关的成纤维细胞(左侧的“肿瘤”)中，FAP是高度表达的(以实心三角形示出)；因此，通过FAP结合，双特异性分子促进4-1BB聚集和T细胞共刺激。
图4是示出本文引用的各种序列的图表。
图5A至图5G描述了六种4-1BB/FAP双特异性蛋白质的设计和所选功能数据(图5A)设计：特异性结合人FAP的锚蛋白重复结构域与各种数目的4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的遗传融合。(图5B至图5G)体外4-1BB报告基因细胞测定。在表达FAP的细胞的存在下，通过NF-κB-荧光素酶报告基因测定来测量人4-1BB转染的HT1080细胞中4-1BB信号传导途径的活化。发光信号用作4-1BB途径活化的相对量度。
图6是示出同时结合MpA与h4-1BB、hFAP和HSA的SPR迹线的图。线(a)MpA或PBST与固定的h4-1BB的结合。线(B)hFAP分别与h4-1BB/MpA复合物或PBST对照的关联。线(c)HSA分别与h41BB-MpA-hFAP复合物或PBST对照的结合，然后是1000s解离阶段。
图7是证明MpA在体外增强原代人T细胞的IFNγ产生的图。通过ELISA测量用板结合的抗CD3抗体加上渐增浓度的MpA刺激的纯化CD8 T细胞和结合到板涂覆的人FAP的对照的IFNγ产生的剂量依赖性增强。MpA和抗FAP-4-1BBL导致CD8 T细胞的活化，从而导致在经由涂覆的FAP结合到板时IFNγ分泌以剂量依赖性方式增加。非FAP靶向对照MpC不会提高T细胞的IFNγ产生。
图8是示出单次静脉内弹丸式施用1mg/kg后BALB/c小鼠(平均+/-最大/min，每组N＝3)中MpA的组平均血清浓度-时间曲线的图。
图9是示出单次静脉内弹丸式施用1mg/kg后BALB/c小鼠(平均+/-最大/min，168小时时间点时N＝6，所有其他时间点时N＝3)中MpA的平均血清浓度-时间曲线的图。
图10是示出在单次静脉注射0.1mg/kg后食蟹猴中MpA的血清浓度-时间曲线(实心符号)和ADA滴度-时间曲线(空心符号)的图。将第一浓度值BLQ设定为0.2nmol/L(是LLOQ的1/5)以指示迹线的过程。AMA阴性样本以100(＝MRD)的滴度进行印迹以指示跟踪过程。在t＝0h时印迹在给药前样本中确定的AMA滴度值。
图11是示出在单次静脉注射1mg/kg后食蟹猴中MpA的血清浓度-时间曲线(实心符号)和ADA滴度-时间曲线(空心符号)的图。将第一浓度值BLQ设定为0.2nmol/L(是LLOQ的1/5)以指示迹线的过程。ADA阴性样本以100(＝MRD)的滴度进行印迹以指示跟踪过程。在t＝0h时印迹在给药前样本中确定的ADA滴度值。
图12是示出在单次静脉注射10mg/kg后食蟹猴中MpA的血清浓度-时间曲线(实心符号)和AMA滴度-时间曲线(空心符号)的图。将第一浓度值BLQ设定为0.2nmol/L(是LLOQ的1/5)以指示迹线的过程。AMA阴性样本以100(＝MRD)的滴度进行印迹以指示跟踪过程。在t＝0h时印迹在给药前样本中确定的AMA滴度值。
图13是示出在单次静脉内输注0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg后食蟹猴中MpA的血清浓度-时间曲线的图。将第一值BLQ设定为0.2nmol/L(是LLOQ的1/5)以指示迹线的过程。
图14是示出在单次静脉内输注0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg后食蟹猴中MpA的剂量归一化血清浓度-时间曲线的图。排除被认为受ADA影响的值。
图15是示出在单次静脉内输注0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg后食蟹猴中MpA的剂量归一化血清浓度-时间曲线的图。排除被认为受ADA影响的值。
图16A和图16B.移植人PBMC的携带HT-29异种移植肿瘤的NOG小鼠中的肿瘤生长。用抗h4-1BB mAb 20H4.9、抗FAP-4-1BBL融合蛋白或MpB(MpA的小鼠替代物)治疗小鼠。图16A是示出接受MpB、抗h4-1BB mAb20H4.9、抗FAP-4-1BBL融合蛋白或溶媒对照的小鼠的平均肿瘤体积的图。图16B包括示出来自各个小鼠的肿瘤体积随时间(天)变化的图。
图17.在NOG小鼠中，施用抗h4-1BB mAb 20H4.9而不是MpB会诱导人PBMC的肝脏T细胞浸润增加。
图18示出了在各种重组分子的存在下的平均FAP活性(示于表19中)。重组人FAP(rhFAP)将底物Z-GLY-PRO-AMC转化为荧光产物，该产物在45分钟后在460nm下进行测量(归一化为100％活性-第1个样本)。与背景活性(第2个和第3个样本)相比，分子编号1和3(MpA和“F”(其是MpA的FAP结合结构域)对FAP肽酶活性没有抑制作用，类似于不结合至FAP的阴性对照(阴性对照MpC和“N”)。对于
Figure BDA0003494854670000181
(另选的FAP结合锚蛋白重复结构域，用作对照)或对于蛋白酶抑制剂混合物(PI)(使用1倍、3倍、5倍浓缩的PI混合物)观察到对FAP活性的部分抑制，其示出剂量依赖性抑制。未观察到FAP结合抗体的抑制。由信号归一化后的一式四份测量示出平均FAP活性(以％为单位)作为平均值和标准偏差。缩写：H＝白蛋白结合结构域；F＝hFAP结合结构域；
Figure BDA0003494854670000182
Figure BDA0003494854670000183
B＝h4-1BB结合结构域；N＝非靶向结合结构域(阴性对照)。
图19A和图19B汇总了具有不同结合结构域构型的各种多特异性蛋白质的功能和药代动力学比较。图19A示出了体外4-1BB报告基因细胞测定的结果。在表达FAP的细胞的存在下，通过NF-κB-荧光素酶报告基因测定来测量人4-1BB转染的HT1080细胞中4-1BB信号传导途径的活化。发光信号用作4-1BB途径活化的相对量度。示出了结合结构域在各种多特异性蛋白质中从N末端到C末端的排列。图19B汇总了小鼠中药代动力学研究的结果。该图示出了单次静脉内弹丸式施用1mg/kg后BALB/c小鼠(平均值+/-最大/min，每组N＝3)的平均血清浓度-时间曲线。示出了结合结构域在各种多特异性蛋白质中从N末端到C末端的排列。H＝HSA结合结构域，F＝FAP结合结构域；B＝4-1BB结合结构域。
图20预测了各种PD标记物相对于人剂量的关系。来源于建立的最小PBPK模型(基于Zhao,J.、Y.Cao和W.J.Jusko的Across-Species Scaling of Monoclonal AntibodyPharmacokinetics Using a Minimal PBPK Model.，Pharm Res，2015年，第32卷第10期，第3269-3281页)的暴露值(Cav)用于转化来自小鼠肿瘤研究的PD效应(全部作为最大效应的％)并预测人中的剂量-效应关系。预测间隔(阴影区域)基于在对人类清除率进行标度期间设定的下限和上限。注意：预测的全身性CD8 T细胞活化和扩增基于人源化PBMC小鼠模型。在健康NHP中未观察到全身性T细胞活化。
具体实施方式
1.概述
本文公开了包含对FAP和4-1BB具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组蛋白质。本发明还公开了编码结合蛋白质的核酸、包含该结合蛋白质或核酸的药物组合物，以及使用该结合蛋白质、核酸或药物组合物的方法。在一个方面，本公开的材料和方法利用FAP在肿瘤相关基质中的表达，从而允许例如肿瘤中淋巴细胞的特异性靶向和那些淋巴细胞中4-1BB的选择性活化。
4-1BB激动剂抗体在单一疗法和组合疗法肿瘤模型两者中在预防性和治疗性环境中已证明了功效，并且已建立持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答。然而，4-1BB激动性抗体的临床开发受到剂量限制性肝毒性的阻碍。例如，来自乌瑞芦单抗(BMS-663513)(美国专利申请公布2017/0247455A1)的I期和II期数据揭示了肝脏毒性似乎是靶标和剂量依赖的，从而阻止了乌瑞芦单抗的临床发展。
本文所述的多特异性重组蛋白质促进了癌症靶标介导的4-1BB聚集，从而解决了与先前疗法相关联的挑战(参见例如图3)。4-1BB在与其配体(4-1BBL)结合时经历三聚反应；并且4-1BB多聚化和聚集是活化其信号传导途径的先决条件。本文所公开的多特异性重组蛋白质利用该聚集效应；并且4-1BB的活化与肿瘤抗原成纤维细胞活化蛋白质(FAP)的表达相关。
成纤维细胞活化蛋白质α(FAP，也称为Seprase)是一种II型膜结合糖蛋白，在许多实体瘤的基质中由癌症相关联成纤维细胞大量表达。FAP选择性地表达于90％以上的上皮恶性肿瘤(原发性和转移性)的反应性基质成纤维细胞中，包括肺癌、结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌，以及骨和软组织肉瘤的恶性间充质细胞中，而它通常不存在于正常成人组织中(Brennen等人，Mol Cancer Ther.，第11卷，第257-266页，2012年；Garin-Chesa等人，Proc Natl Acad Sci USA，第87卷，第7235-7239页，1990年；Rettig等人，Cancer Res.，第53卷，第3327-3335页，1993年；Rettig等人，Proc Natl Acad Sci USA，第85卷，第3110-3114页，1988年)。FAP也在某些恶性肿瘤细胞上表达。
虽然不希望受特定理论的束缚，但图3示出了多特异性分子的优点的示例。在不存在肿瘤抗原FAP(正常非恶性细胞)的情况下，将发生4-1BB的最小聚集，并且免疫活化将受到限制。相比之下，在癌症相关的成纤维细胞中，FAP是高度表达的；因此，通过FAP结合，多特异性分子促进4-1BB聚集和T细胞共刺激。该策略的优点有两方面：全身性毒性应受到限制，因为活化将很大程度上局限于表达FAP的组织，并且肿瘤介导的4-1BB聚集应驱动强效激动作用。
2.定义
除非本文另外定义，否则结合本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数，并且复数术语应包括单数。一般来讲，结合本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交使用的命名法以及技术是本领域熟知的和常用的那些。
除非另外说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应被理解为开放式术语。如果本发明的各方面被描述为“包括”特征，则还设想到“由该特征组成”或“基本上由该特征组成”的实施方案。除非另外提出权利要求，否则本文所提供的任何和全部实例或示例性语言(例如“诸如”)仅仅旨在更好地举例说明本公开，并且并不用来限制本公开的范围。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何不受权利要求书保护的要素是实施本公开所必需的。除了在操作示例中，或在另外指明的情况下，本文所用的表示成分或反应条件的量的所有数字在所有情况下均应理解为由相关领域的技术人员将理解的术语“约”修饰。
除非本文另外说明，否则本文对值的范围的表述仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值和每个端点的简略方法，并且每个单独值和端点并入本说明书中，如同其在本文中被单独地表述一样。
“锚蛋白重复结构域”是指包含至少一个锚蛋白重复基序的结构域，该结构域最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白质的重复单元。一般来讲，锚蛋白重复基序包含约33个残基，这些残基形成由环隔开的两个α螺旋。锚蛋白重复蛋白质是本领域已知的。参见例如国际专利公布WO 2002/020565、WO 2010/060748、WO 2011/135067、WO 2012/069654、WO2012/069655、WO 2014/001442、WO 2014/191574、WO 2014/083208、WO 2016/156596和WO2018/054971，所有这些专利全文以引用方式并入。锚蛋白重复结构域还任选地包含适当的封盖模块。
可使用标准重组DNA技术(参见例如Forrer,P.等人，FEBS letters，第539卷，第2-6页，2003年，WO2012/069655、WO 2002/020565)，将锚蛋白重复结构域模块化地组装成根据本公开的较大锚蛋白重复蛋白质，任选地具有半衰期延长结构域。
如果锚蛋白重复结构域与特定靶标(例如，细胞或物质)的反应或缔合比与另选靶标(例如，细胞或物质)的反应或缔合的更频繁、更迅速、持续时间更长和/或亲和力更高，则锚蛋白重复结构域“特异性结合”或“优先结合”(在本文中可互换使用)该靶标。例如，特异性结合FAP的锚蛋白重复结构域是以比结合其他非FAP蛋白质亲和力更高、亲合力更高、更容易和/或持续时间更长结合FAP的锚蛋白重复结构域。通过阅读该定义还应当理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的锚蛋白重复结构域可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可包括)排他性结合。一般来讲，在指定的测定条件下，锚蛋白重复结构域优先结合特定靶标分子，并且不以显著量结合试验样本中存在的其他组分。
多种测定形式可用于选择或表征特异性结合所关注的分子的锚蛋白重复结构域。例如，固相ELISA免疫测定法、免疫沉淀法、BIAcoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ)、荧光活化细胞分选法(FACS)、OctetTM(ForteBio,Inc.，Menlo Park，CA)和蛋白质印迹分析是可用于标识与靶标特异性反应的锚蛋白重复结构域的许多测定法之一。通常，特定或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且更典型地是背景的10倍以上。甚至更具体地讲，当平衡解离常数(KD)值<1μΜ，诸如<100nM、<10nM、<100pM、<10pM或<1pM时，锚蛋白重复结构域被认为“特异性地结合”靶标。
KD值通常称为结合亲和力。结合亲和力测量一个结合配偶体(例如，本文所公开的FAP或4-1BB结合结构域)的接触残基和其结合配偶体(例如，FAP或4-1BB)的接触残基之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明，否则如本文所用，结合亲和力是指反映结合对或结合配偶体的成员之间1:1相互作用的结合亲和力。在结合蛋白包含一个结合配偶体的两个结合结构域的情况下，结合亲和力可以指反映结合蛋白质和结合配偶体之间1:2相互作用的结合亲和力。
测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，其中任一种均可用于本发明的目的。例如，如本文举例说明，结合亲和力可表示为KD值，其是指特定锚蛋白重复结构域及其结合靶标的解离速率。KD是解离速率(也称为“解离率(Koff)”)与缔合速率或“结合率(Kon)”的比率。因此，KD等于off/Kon并且表示为摩尔浓度(M)，并且KD越小，结合的亲和力越强。
KD值可使用任何合适的方法测定。用于测量KD的一个示例性方法是表面等离振子共振(SPR)(参见例如Nguyen等人，Sensors(Basel)，2015年5月5日，第15卷第5期，第10481-10510页)。KD值可通过SPR使用生物传感器系统诸如
Figure BDA0003494854670000221
系统来测量。BIAcore动力学分析包括分析抗原与其表面具有固定的分子(例如包含表位结合结构域的分子)的芯片的结合和解离。测定蛋白质KD的另一种方法是通过使用生物层干涉测量法(参见例如Shah等人，J Vis Exp.，2014年，第84卷，第51383页)。KD值可使用
Figure BDA0003494854670000222
技术(Octet QKe系统，ForteBio)测量。另选地或另外地，也可使用
Figure BDA0003494854670000223
(动力学排除测定)测定，购自Sapidyne Instruments(Boise,Id.)。本文涵盖适用于评估两个结合配偶体之间的结合亲和力的任何方法。
术语“处理”以及与其相关的词语不一定暗示100％或完全固化。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在的有益效果或治疗效果不同程度的治疗。在这方面，本公开的治疗癌症的方法可提供任何量或任何水平的治疗。此外，由本公开的方法提供的治疗可包括治疗(即，缓解)一种或多种病症或症状。而且，由本公开的方法提供的治疗可涵盖减慢癌症的进展。例如，这些方法可通过增强针对癌症的T细胞活性或免疫应答、减少新病变的肿瘤或癌症生长或外观、减少肿瘤细胞的转移、增加肿瘤或癌细胞的细胞死亡、抑制肿瘤或癌细胞存活等来治疗癌症。在示例性方面，这些方法通过将癌症的发作或复发延迟1天、2天、4天、6天、8天、10天、15天、30天、两个月、4个月、6个月、1年、2年、4年或更长时间来治疗。在示例性方面，这些方法通过增加受试者的存活率来治疗。术语“治疗”还包括预防性治疗。
任何给定疾病或病症中的治疗应答可通过特定于该疾病或病症的标准化应答标准来确定。肿瘤应答可使用筛选技术评估，诸如磁共振成像(MRI)扫描、X射线照相成像、计算机断层摄影(CT)扫描、正电子发射断层摄影(PET)扫描、骨扫描、超声、肿瘤活检取样、循环中肿瘤细胞的计数和/或肿瘤抗原(例如前列腺特异性抗原(PSA)和/或甲胎蛋白(AFP))的测量。除了这些治疗应答之外，接受疗法的受试者可体验到与疾病相关的症状改善的有益效果。
3.靶向FAP和4-1BB的多特异性分子
本文公开了靶向FAP和4-1BB的多特异性分子。这些分子可用于例如治疗癌症。这些分子可包含重组蛋白质。
3.1.锚蛋白重复结构域和锚蛋白重复蛋白质
本文所述的锚蛋白重复结构域通常包含至少一个锚蛋白重复基序。锚蛋白重复基序由两个反平行α螺旋组成，后面是β凸起和含β发夹的环，连接到下一个重复序列上，每个重复序列具有约33个残基。
在天然锚蛋白重复蛋白质中，重复序列从几个到24个重复序列串联出现(参见例如Sedgwick和Smerdon，TIBS，1999年，第24卷第311-316页)。包含延伸的β发夹的环或“指状物”在表面上形成凹槽。SMART结构域数据库中列出了超过3500个包含锚蛋白基序的序列(Shultz等人，PNAS，1998年，第95卷，第5857-5864页)。
包含经设计的锚蛋白重复基序的重组蛋白质或其结合结构域在本文中也称为
Figure BDA0003494854670000231
蛋白质。参见Stumpp等人，Curr Opin Drug Discov Devel，第10卷第2期，第153-159页，2007；以及Binz等人，Nature Biotech.，第22卷第5期，第575-582页，2004年。
Figure BDA0003494854670000232
蛋白质可被认为是对靶蛋白质具有高特异性和高结合亲和力的抗体模拟物。一般来讲，
Figure BDA0003494854670000233
蛋白质包含至少一个锚蛋白重复基序，例如至少2个、3个或更多个锚蛋白重复基序。
本文所述的锚蛋白重复结构域通常包含提供结构的核心支架，以及结合到靶标的靶标结合残基。结构核心包括保守的氨基酸残基，并且靶标结合表面包括根据靶标而不同的氨基酸残基。例如，锚蛋白重复基序可包含以下序列：DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx(SEQ ID NO:11)，其中“x”表示任何氨基酸。
国际专利公布WO 2002/020565描述了锚蛋白重复蛋白质文库，该文库可用于选择/筛选特异性结合靶标的蛋白质。还提供了制备此类文库的方法。
多个锚蛋白重复结构域可连接(通过共价键或非共价缔合)以形成双特异性或多特异性分子。一个此类分子在图1中示出，其中一个FAP结合结构域和两个4-1BB结合结构域连接以形成多特异性分子。该分子还包括两个半衰期延长部分，一个在N末端并且一个在C末端。
3.2.FAP结合结构域
一种有吸引力的基质细胞靶标是成纤维细胞活化蛋白质(FAP)，它是在几乎所有上皮癌症的癌症相关基质细胞中高度表达的跨膜丝氨酸蛋白酶。FAP还在胚胎发育期间、愈合伤口的组织中以及在慢性炎性和纤维化病症(诸如肝硬化和特发性肺纤维化)中表达。然而，FAP尚未通过免疫组织化学在良性肿瘤中或在大多数正常静态成人基质细胞中检测到。
本文所述的重组蛋白质包含特异性结合FAP的锚蛋白重复结构域，在本文中也称为“FAP结合结构域”。
在一些实施方案中，本文所述的FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:18至23和39至43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:18至23和39至43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:2的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:2的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:2的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:2的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:2的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:2的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:2的序列的蛋白质的KD值相比，取代使KD值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外进行取代，例如在连接α-螺旋的β环中。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域可包含共有序列：DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx(SEQ ID NO:11)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)；或DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx(SEQ ID NO:12)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)，并且“z”选自天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。
另外，倒数第二位置可以是“A”(参见例如SEQ ID NO:2、18至22和43)或“L”(参见例如SEQ ID NO:23和39至42)，并且/或者最后位置可以是“A”(参见例如SEQ ID NO:2、18至22和43)或“N”(参见例如SEQ ID NO:23和39至42)。因此，在一些实施方案中，FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至22和43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。在一个示例性实施方案中，FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至22和43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。在一些实施方案中，FAP结合结构域包含与SEQID NO:23和39至42中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的L被A取代，并且/或者最后位置处的N被A取代。在一个示例性实施方案中，FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:23和39至42中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的L被A取代，并且/或者最后位置处的N被A取代。这些序列可任选地在其N末端处包含G、S或GS(参见下文)。
另外，FAP结合结构域还可任选地在其N末端包含“G”、“S”或“GS”序列(比较例如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:34)。因此，在一些实施方案中，FAP结合结构域(i)包含与SEQ IDNO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及(ii)在其N末端处还包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端还包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，FAP结合结构域包含与SEQ IDNO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端还包含G、S或GS。
在某些实施方案中，重组蛋白质和其靶标(FAP)之间的亲和力以KD描述。在示例性实施方案中，KD为约10-1M或更小、约10-2M或更小、约10-3M或更小、约10-4M或更小、约10-5M或更小、约10-6M或更小、约10-7M或更小、约10-8M或更小、约10-9M或更小、约10-10M或更小、约10-11M或更小、约10-12M或更小、约10-13M或更小、约10-14M或更小、约10-5M至约10-15M、约10-6M至约10-15M、约10-7M至约10-15M、约10-8M至约10-15M、约10-9M至约10-15M、约10-10M至约10-15M、约10-5M至约10-14M、约10-6M至约10-14M、约10-7M至约10-14M、约10-8M至约10-14M、约10-9M至约10-14M、约10-10M至约10-14M、约10-5M至约10-13M、约10-6M至约10-13M、约10-7M至约10-13M、约10-8M至约10-13M、约10-9M至约10-13M、约10-10M至约10-13M。
在示例性实施方案中，重组蛋白质以为以下或小于以下的KD值结合FAP：约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约40pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约1pM。在一个示例性实施方案中，重组蛋白质以小于或等于约10nM的KD值结合FAP。在另一个示例性实施方案中，重组蛋白质以小于或等于约1nM的KD值结合FAP。
在某些实施方案中，FAP是人FAP(SEQ ID NO:14)。
表1氨基酸取代
初始残基 保守取代 示例性取代
Ala(A) Val Val；Leu；Ile
Arg(R) Lys Lys；Gln；Asn
Asn(N) Gln Gln；His；Asp、Lys；Arg
Asp(D) Glu Glu；Asn
Cys(C) Ser Ser；Ala
Gln(Q) Asn Asn；Glu
Glu(E) Asp Asp；Gln
Gly(G) Ala Ala
His(H) Arg Asn；Gln；Lys；Arg
Ile(I) Leu Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸
Leu(L) Ile 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys(K) Arg Arg；Gln；Asn
Met(M) Leu Leu；Phe；Ile
Phe(F) Tyr Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr Tyr；Phe
Tyr(Y) Phe Trp；Phe；Thr；Ser
Val(V) Leu Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸
3.3.4-1BB结合结构域
本文所公开的重组蛋白质还利用4-1BB诱导的T细胞刺激活性。先前的研究表明，一些4-1BB激动剂单克隆抗体(mAb)增加共刺激分子表达并显著增强溶细胞T淋巴细胞应答，从而在各种模型中产生抗肿瘤功效。4-1BB单一疗法和组合疗法肿瘤模型已建立持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答(Lynch，2008年，Immunol Rev.，第22卷，第277-286页)。
本文所述的重组蛋白质包含特异性结合4-1BB的锚蛋白重复结构域，在本文中也称为“4-1BB结合结构域”。与4-1BB激动剂抗体类似，4-1BB结合结构域活化4-1BB信号传导途径。本文所述的重组蛋白质还可包含不止一个4-1BB结合结构域，例如两个或三个或更多个4-1BB结合结构域。因此，本文所述的重组蛋白质可包含第一和第二4-1BB结合结构域，或第一、第二和第三4-1BB结合结构域。下文提供的实施方案描述了此类第一4-1BB结合结构域、第二4-1BB结合结构域和/或第三4-1BB结合结构域。
在一些实施方案中，4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:24至29和51至55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，4-1BB结合结构域或所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:24至29和51至55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。
本文所述的重组蛋白质可包含4-1BB结合结构域，该结合结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或其中的一个或多个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:3的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:3的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:3的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:3的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:3的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:3的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:3的序列的蛋白质的KD值相比，取代使KD值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外进行取代，例如在连接α-螺旋的β环中。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域可包含共有序列：DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx(SEQID NO:11)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)；或DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx(SEQ ID NO:12)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)，并且“z”选自天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。
另外，倒数第二位置可以是“A”(参见例如SEQ ID NO:3、24至28和54)或“L”(参见例如SEQ ID NO:29、51至53和55)，并且/或者最后位置可以是“A”(参见例如SEQ ID NO:3、24至28和54)或“N”(参见例如SEQ ID NO:29、51至53和55)。因此，在一些实施方案中，4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至28和54中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。在一个示例性实施方案中，4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至28和54中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。在一些实施方案中，4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:29、51至53和55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的L被A取代，并且/或者最后位置处的N被A取代。在一个示例性实施方案中，4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:29、51至53和55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的L被A取代，并且/或者最后位置处的N被A取代。这些序列可任选地在其N末端处包含G、S或GS(参见下文)。
另外，4-1BB结合结构域还可任选地在其N末端包含“G”、“S”或“GS”序列(比较例如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:35)。因此，在一些实施方案中，4-1BB结合结构域包含与SEQ IDNO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端处还包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端还包含G、S或GS。
在某些实施方案中，重组蛋白质和其靶标(4-1BB)之间的亲和力以KD描述。在示例性实施方案中，KD为约10-1M或更小、约10-2M或更小、约10-3M或更小、约10-4M或更小、约10-5M或更小、约10-6M或更小、约10-7M或更小、约10-8M或更小、约10-9M或更小、约10-10M或更小、约10-11M或更小、约10-12M或更小、约10-13M或更小、约10-14M或更小、约10-5M至约10-15M、约10-6M至约10-15M、约10-7M至约10-15M、约10-8M至约10-15M、约10-9M至约10-15M、约10-10M至约10-15M、约10-5M至约10-14M、约10-6M至约10-14M、约10-7M至约10-14M、约10-8M至约10-14M、约10-9M至约10-14M、约10-10M至约10-14M、约10-5M至约10-13M、约10-6M至约10-13M、约10-7M至约10-13M、约10- 8M至约10-13M、约10-9M至约10-13M、约10-10M至约10-13M。
在示例性实施方案中，重组蛋白质以等于或小于约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约250pM、约200pM、约150pM、约100pM、约50pM、约40pM、约30pM、约25pM、约20pM、约15pM、约10pM、约5pM或约1pM的KD值结合4-1BB。在一些示例性实施方案中，重组蛋白质以小于或等于10nM的KD值结合4-1BB。在一些示例性实施方案中，重组蛋白质以小于或等于1nM的KD值结合4-1BB。在一些示例性实施方案中，重组蛋白质以小于或等于50pM的KD值结合4-1BB。
在一些实施方案中，优选两个或更多个4-1BB结合结构域，以进一步促进4-1BB聚集和T细胞共刺激。据报道，4-1BB配体与T细胞上的4-1BB结合导致4-1BB单体的三聚反应。然而，单独的三聚反应不足以活化4-1BB受体。需要更高阶的聚集。如本文所述，通过FAP结合，多特异性分子已促进肿瘤环境中的4-1BB聚集。为了进一步促进4-1BB聚集，可使用两个或更多个4-1BB结合结构域，以在细胞表面上产生“交联”效应。例如，如图5A至图5B所示，单价4-1BB粘结剂(F-B)足以活化4-1BB途径。更高的效力可通过使用两个4-1BB结合结构域(F-B-B)或三个4-1BB结合结构域(F-B-B-B)来实现。图5A至图5B还示出了两个4-1BB结合结构域足以高效活化4-1BB途径，并且不必具有三个4-1BB结合结构域来进行有效的4-1BB聚集。
在某些实施方案中，4-1BB是人4-1BB(SEQ ID NO:13)。
3.4.半衰期延长部分
与不具有半衰期延长部分的相同蛋白质相比，“半衰期延长部分”延长了本文所述的重组蛋白质的体内血清半衰期。半衰期延长部分的示例包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G、免疫球蛋白结构域、麦芽糖结合蛋白质(MBP)、人血清白蛋白(HSA)结合结构域或聚乙二醇(PEG)。
在一些实施方案中，本文所述的重组多特异性蛋白质包含特异性结合血清白蛋白的锚蛋白重复结构域，在本文也称为“血清白蛋白结合结构域”。本文所述的重组蛋白质还可包含不止一个血清白蛋白结合结构域，例如两个或三个或更多个血清白蛋白结合结构域。因此，本文所述的重组蛋白质可包含第一和第二血清白蛋白结合结构域，或第一、第二和第三血清白蛋白结合结构域。下文提供的实施方案描述了此类第一血清白蛋白结合结构域、第二血清白蛋白结合结构域和/或第三血清白蛋白结合结构域。
在一些实施方案中，本文所述的半衰期延长部分包含血清白蛋白结合结构域，该血清白蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的半衰期延长部分包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的半衰期延长部分与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的半衰期延长部分包含与SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少90％同一性的氨基酸序列。
本文所述的重组蛋白质可包含半衰期延长部分，该半衰期延长部分包含SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或者其中的一个或多个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:5的序列的蛋白质的KD值相比，取代使KD值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基之外进行取代，例如在连接α-螺旋的β环中。在某些实施方案中，在锚蛋白重复结构域的结构核心残基内进行取代。例如，锚蛋白结构域可包含共有序列：DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx(SEQ ID NO:11)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)；或DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx(SEQ ID NO:12)，其中“x”表示任何氨基酸(优选地不是半胱氨酸、甘氨酸或脯氨酸)，并且“z”选自天冬酰胺、组氨酸或酪氨酸。在一个实施方案中，对命名为“x”的残基进行取代。在另一个实施方案中，在命名为“x”的残基之外进行取代。
另外，倒数第二位置可以是“A”或“L”，并且/或者最后位置可以是“A”(参见例如SEQ ID NO:1、5、30和31)或“N”(参见例如SEQ ID NO:36)。因此，在一些实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:1、5和30至31中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代和/或最后位置处的A被N取代。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与SEQ IDNO:1、5、30和31中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代，并且/或者最后位置处的A被N取代。这些序列可任选地在其N末端处包含G、S、或GS(参见下文)。
另外，血清白蛋白结合结构域还可任选地在其N末端包含“G”、“S”或“GS”序列(比较例如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5)。因此，在一些实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:1、30和31中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，以及在其N末端处还包含G、S或GS。在一个示例性实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:1、30和31中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端还包含G、S或GS。此外，在一些实施方案中，血清白蛋白结合结构域包含与SEQ IDNO:36具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且在其N末端处还包含G、S或GS。
在某些实施方案中，重组蛋白质和其靶标(血清白蛋白)之间的亲和力以KD描述。在示例性实施方案中，KD为约10-1M或更小、约10-2M或更小、约10-3M或更小、约10-4M或更小、约10-5M或更小、约10-6M或更小、约10-7M或更小、约10-8M或更小、约10-9M或更小、约10-10M或更小、约10-11M或更小、约10-12M或更小、约10-13M或更小、约10-14M或更小、约10-5M至约10-15M、约10-6M至约10-15M、约10-7M至约10-15M、约10-8M至约10-15M、约10-9M至约10-15M、约10-10M至约10-15M、约10-5M至约10-14M、约10-6M至约10-14M、约10-7M至约10-14M、约10-8M至约10-14M、约10- 9M至约10-14M、约10-10M至约10-14M、约10-5M至约10-13M、约10-6M至约10-13M、约10-7M至约10- 13M、约10-8M至约10-13M、约10-9M至约10-13M、约10-10M至约10-13M。
在示例性实施方案中，重组蛋白质以为以下或小于以下的KD值结合血清白蛋白：约900nM、约800nM、约700nM、约600nM、约500nM、约400nM、约300nM、约250nM、约200nM、约150nM、约100nM、约50nM、约40nM、约30nM、约20nM、约10nM、约5nM、约2nM、约1nM、约900pM、约800pM、约700pM、约600pM、约500pM、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约10pM或约1pM。在一个示例性实施方案中，重组蛋白质以100nM或等于100nM的KD值结合血清白蛋白。在另一个示例性实施方案中，重组蛋白质以10nM或等于10nM的KD值结合血清白蛋白。
在某些实施方案中，血清白蛋白是人血清白蛋白(HSA)(SEQ ID NO:15)。
在一些实施方案中，优选两个或更多个血清白蛋白结合结构域。在示例性实施方案中，一个血清白蛋白结合结构域位于N末端，并且一个血清白蛋白结合结构域位于C末端。在示例性实施方案中，重组蛋白质从N末端到C末端包含：(i)特异性结合血清白蛋白的锚蛋白重复结构域；(ii)特异性结合FAP的锚蛋白重复结构域，(iii)特异性结合4-1BB的锚蛋白重复结构域，(iv)特异性结合4-1BB的锚蛋白重复结构域；以及(v)特异性结合血清白蛋白的锚蛋白重复结构域。在某些实施方案中，N末端血清白蛋白结合结构域(在本文中也称为血清白蛋白结合结构域1)包含与SEQ ID NO:5具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，C末端血清白蛋白结合结构域(在本文中也称为血清白蛋白结合结构域2)包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，半衰期延长部分包含免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白结构域包含Fc结构域。在一些实施方案中，Fc结构域来源于以下已知重链同种型中的任一者：IgG(γ)、IgM(μ)、IgD(δ)、IgE(ε)或IgA(α)。在一些实施方案中，Fc结构域来源于以下已知的重链同种型或亚型中的任一者：IgG1(γ1)、IgG2(γ2)、IgG3(γ3)、IgG4(γ4)、IgA1(α1)、IgA2(α2)。在一些实施方案中，Fc结构域是人IgG1的Fc结构域。
在一些实施方案中，Fc结构域包含Fc结构域的不间断天然序列(即野生型序列)。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域包含导致改变的生物活性的变体Fc结构域。例如，可将至少一个点突变或缺失引入Fc结构域中以便降低或消除效应子活性(例如国际专利公布WO 2005/063815)，以及/或者增加重组蛋白质产生期间的同质性。在一些实施方案中，Fc结构域是人IgG1的Fc结构域并且包含以下效应子空取代中的一者或多者：L234A、L235A和G237A(Eu编号)。在一些实施方案中，Fc结构域不包含位于人IgG1的C末端位置处的赖氨酸(即，由Eu编号的K447)。不存在赖氨酸可增加重组蛋白质产生期间的同质性。在一些实施方案中，Fc结构域包含位于C末端位置处的赖氨酸(K447，Eu编号)。
3.5.连接基
本文所述的重组蛋白质可包含连接基。“连接基”是使两个单独的实体(例如，FAP结合结构域和4-1BB结合结构域)彼此结合并且可在两个实体之间提供间距和灵活性使得它们能够实现其中它们例如特异性结合它们的相应靶标(例如，FAP和4-1BB)的构象的分子或分子组。蛋白质连接基是特别优选的，并且可使用本领域熟知的标准重组DNA技术将它们表达为重组蛋白质的组分。对于本文所述的包含两个或更多个连接基的重组蛋白质(例如包含两个或更多个“(连接基)”组分的式)，连接基可全部相同，或者连接基中的一些或全部可彼此不同。
锚蛋白重复结构域可例如通过二硫键、多肽键或交联剂共价连接；或非共价地产生异源二聚体蛋白质。重组蛋白质可包含FAP结合结构域、4-1BB结合结构域和任选的半衰期延长部分之间的连接基。
在一些实施方案中，连接基是肽基连接基。在一些实施方案中，肽基连接基包含约1个至30个氨基酸残基。示例性连接基包括例如富含甘氨酸的肽；包含甘氨酸和丝氨酸的肽；具有序列[Gly-Gly-Ser]n的肽，其中n是1、2、3、4、5或6；或具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n(SEQ ID NO:16)的肽，其中n是1、2、3、4、5或6。富含甘氨酸的肽连接基包含肽连接基，其中至少25％的残基是甘氨酸。富含甘氨酸的肽连接基是本领域熟知的(例如Chichili等人，Protein Sci.，2013年2月，第22卷第2期，第153-167页)。
在一些实施方案中，肽基连接基是富含脯氨酸-苏氨酸的肽连接基。在一个示例性实施方案中，连接基是SEQ ID NO:4的富含脯氨酸-苏氨酸的肽连接基。
在一些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
3.6.N末端和C末端封盖序列
本文所公开的重组蛋白质的锚蛋白重复结构域可包含N末端或C末端封盖序列。封盖序列是指融合到锚蛋白重复序列基序的N末端或C末端的附加多肽序列，其中所述封盖序列与锚蛋白重复序列基序形成紧密的三级相互作用(即三级结构相互作用)，从而提供保护一侧的锚蛋白重复结构域的疏水核免于暴露于溶剂的盖。
N末端和/或C末端封盖序列可来源于存在于邻近重复单元的天然存在的重复蛋白质中的封盖单元或其他结构单元。封盖序列的示例在国际专利公布WO 2002/020565和WO2012/069655、美国专利公布US20130296221中有所描述并且通过Interlandi等人，J MolBiol.，2008年1月18日，第375卷第3期，第837-854页进行描述。N末端锚蛋白封盖模块(即N末端封盖重复序列)的示例是SEQ ID NO:7、9、10，并且锚蛋白C末端封盖模块(即C末端封盖重复序列)的示例包括SEQ ID NO:8。
在一个示例性实施方案中，N末端封盖序列包含GSDLGKKLLE AARAGQDDEVRILLKAGADV NA(SEQ ID NO:9)或GSDLGKKLLE AARAGQDDEV RELLKAGADV NA(SEQ ID NO:10)，其中SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的位置24处的氨基酸残基L任选地被V、I或A取代；在SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的除位置24之外的其他位置处的至多9个、至多8个、至多7个、至多6个、至多5个、至多4个、至多3个、至多2个或至多1个氨基酸任选地被任何氨基酸交换；并且其中SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
3.7.FAP/4-1BB双靶向双特异性或多特异性分子
在一些实施方案中，本文所述的重组蛋白质从N末端到C末端包含：(i)特异性结合FAP的第一锚蛋白重复结构域，(ii)特异性结合4-1BB的第二锚蛋白重复结构域，以及(iii)特异性结合4-1BB的第三锚蛋白重复结构域。第二锚蛋白重复结构域和第三锚蛋白重复结构域可具有相同的序列，或者可具有不同的序列。
在示例性实施方案中，重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)。在示例性实施方案中，重组蛋白质从N末端到C末端包含：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)。
在一些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
本文所述的重组蛋白质可包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或其中的一个或多个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:6的序列进行不超过10个、不超过9个、不超过8个、不超过7个、不超过6个、不超过5个、不超过4个、不超过3个、不超过2个或不超过1个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:6的序列进行不超过10个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:6的序列进行不超过5个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:6的序列进行不超过4个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:6的序列进行不超过3个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:6的序列进行不超过2个取代。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO:6的序列进行不超过1个取代。在一些实施方案中，与包含SEQ IDNO:6的序列的蛋白质的KD值相比，取代使对FAP结合或4-1BB结合的KD值改变不超过1000倍、不超过100倍或不超过10倍。在某些实施方案中，取代是根据表1的保守取代。
在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含与SEQ ID NO:6具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含与SEQ ID NO:6具有至少93％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含与SEQ ID NO:6具有至少95％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含与SEQID NO:6具有至少98％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白，并且其中所述重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期，其中通常且优选地，食蟹猴的所述终末半衰期如实施例6所述进行测量。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含SEQ IDNO:6的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白，并且其中在所述重组蛋白质的存在下，与对照相比，FAP蛋白酶活性降低不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％或不超过2％，其中通常且优选地，所述对照是在不存在所述重组蛋白质的FAP蛋白酶活性，并且其中进一步通常且优选地，所述FAP蛋白酶活性如实施例10中所述进行测量。在一个实施方案中，所述重组蛋白质包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白，并且其中所述重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期，其中通常且优选地，食蟹猴的所述终末半衰期如实施例6中所述进行测量，并且其中在所述重组蛋白质的存在下，与对照相比，FAP蛋白酶活性降低不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过9％、不超过8％、不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％或不超过2％，其中通常且优选地，所述对照是在不存在所述重组蛋白质的FAP蛋白酶活性，并且其中进一步通常且优选地，所述FAP蛋白酶活性如实施例10中所述进行测量。
在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质在与FAP和4-1BB结合时诱导细胞毒性。在某些实施方案中，细胞毒性是T-细胞介导的细胞毒性。在某些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在某些实施方案中，通过测量细胞因子释放的体外测定来评估多特异性重组蛋白质的生物活性。据报道，血清和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性中细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)的产生指示4-1BB活化。
在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质具有不超过约100nM、不超过约75nM、不超过约65nM、不超过约55nM、不超过约45nM、不超过约35nM、不超过约25nM、不超过约15nM、不超过约10nM、不超过约5nM、不超过约4nM、不超过约3nM、不超过约2nM、不超过约1nM、约0.01nM至约50nM、约0.01nM至约25nM、约0.01nM至约10nM、约0.01nM至约5nM、约0.05nM至约50nM、约0.05nM至约25nM、约0.05nM至约10nM、约0.05nM至约5nM、约0.1nM至约50nM、约0.1nM至约25nM、约0.1nM至约10nM、约0.1nM至约5nM、约0.4nM至约2nM的半最大有效浓度(EC50)，如通过体外IFNγ释放测定所评估的。
在一个示例性实施方案中，多特异性重组蛋白质具有不超过约10nM的EC50。在另一个示例性实施方案中，多特异性重组蛋白质具有不超过约3nM的EC50。在另一个示例性实施方案中，多特异性重组蛋白质具有约0.1nM至约10nM的EC50。
在某些实施方案中，IFNγ释放测定是人T细胞IFNγ释放测定。在某些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一个示例性实施方案中，根据生产商的说明书，IFNγ释放测定使用人IFN-γDuoSet ELISA(R和D系统，目录号DY285B)测量。在一个示例性实施方案中，通过使用Graphpad Prism软件将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。在一个示例性实施方案中，使用实施例4中所述的方法确定EC50值。
在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质在小鼠模型中具有至少10小时、至少20小时、至少30小时、至少40小时或约44小时的终末半衰期。
在一个示例性实施方案中，使用如实施例5中举例说明的方法测量小鼠的终末半衰期。在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期。在一个示例性实施方案中，使用如实施例6中举例说明的方法测量食蟹猴的终末半衰期。
在某些实施方案中，多特异性重组蛋白质不抑制FAP蛋白酶活性。在某些实施方案中，在多特异性重组蛋白质的存在下，与对照相比(对照可以是不存在多特异性重组蛋白质的FAP蛋白酶活性)，FAP蛋白酶活性降低不超过25％、不超过20％、不超过15％、不超过10％、不超过9％、不超过8％，不超过7％、不超过6％、不超过5％、不超过4％、不超过3％或不超过2％。在一个示例性实施方案中，使用如实施例10中举例说明的方法测量FAP活性。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其N末端还任选地包含G、S或GS；并且倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。在一个示例性实施方案中，重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其N末端还任选地包含G、S或GS；并且倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。在一个示例性实施方案中，重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且/或者最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S、或GS，并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且/或者最后位置可以是N或A。在一个示例性实施方案中，FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23、和39至43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个示例性实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2、18至23和39至43中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3、24至29和51至55中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。在示例性实施方案中，重组蛋白质还可具有以下特性中的任一者或任何组合：(i)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；(ii)4-1BB结合结构域包含与SEQ IDNO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；(iii)FAP结合结构域位于4-1BB结合结构域的N末端；(iv)重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB；(v)重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)结合人FAP；(vi)在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小；(vii)所述FAP结合结构域和所述4-1BB结合结构域通过肽基连接基，优选的富含脯氨酸-苏氨酸(PT)的连接基(诸如包含SEQ ID NO:4的连接基)或GS连接基连接；(viii)重组蛋白质包含一个、两个或三个4-1BB结合结构域；(ix)重组蛋白质在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域；(x)重组结合蛋白质能够同时结合FAP、4-1BB和血清白蛋白，(xi)重组蛋白质不抑制FAP蛋白酶活性，或在重组蛋白质的存在下，FAP蛋白酶活性的降低不超过25％、不超过20％、不超过15％或不超过10％；(xii)重组蛋白质在小鼠模型中具有至少10小时、至少20小时、至少30小时、至少40小时或约44小时的终末半衰期，并且(xiii)重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)FAP结合结构域位于4-1BB结合结构域的N末端。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)FAP结合结构域位于4-1BB结合结构域的N末端。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)FAP结合结构域位于4-1BB结合结构域的N末端。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)FAP结合结构域位于4-1BB结合结构域的N末端。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)FAP结合结构域位于4-1BB结合结构域的N末端。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB，并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述4-1BB结合结构域包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)所述FAP结合结构域和所述4-1BB结合结构域通过肽基连接基，优选的富含脯氨酸-苏氨酸(PT)的连接基(诸如包含SEQ ID NO:4的连接基)或GS连接基连接。重组蛋白质可包含1个、2个或3个此类4-1BB结合结构域。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和两个4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A。在示例性实施方案中，重组蛋白质还可具有以下特性中的任一者或任何组合：(i)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；(ii)4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；(iii)重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)；(iv)重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB；(v)重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)结合人FAP；(vi)在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小；(vii)所述FAP结合结构域和所述4-1BB结合结构域通过肽基连接基，优选的富含脯氨酸-苏氨酸(PT)的连接基(诸如包含SEQ ID NO:4的连接基)或GS连接基连接；(viii)重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)；(ix)重组蛋白质在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域；(x)重组结合蛋白质能够同时结合FAP和4-1BB；(xi)重组蛋白质不抑制FAP蛋白酶活性，或在重组蛋白质的存在下，FAP蛋白酶活性的降低不超过25％、不超过20％、不超过15％或不超过10％；(xii)重组蛋白质在小鼠模型中具有至少10小时、至少20小时、至少30小时、至少40小时或约44小时的终末半衰期，并且(xiii)重组蛋白质在食蟹猴模型中具有至少1天、至少2天、至少3天、至少4天或约2.8天或约4.5天的终末半衰期。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和两个4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB；并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10- 9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和两个4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB；并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10- 9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和两个4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB；并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10- 9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含FAP结合结构域和两个4-1BB结合结构域，其中：(a)FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(b)所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS；并且其中倒数第二位置可以是L或A，并且最后位置可以是N或A；并且(c)重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，重组蛋白质从N末端到C末端包含：(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)。在某些实施方案中，连接基包含SEQID NO:4。在某些实施方案中，重组蛋白质在PBS中以低于10-7M、低于10-8M、低于5×10-9M或低于3×10-9M的解离常数(KD)值结合人4-1BB；并且/或者重组蛋白质在PBS中以低于10-8M、低于5×10-9M、低于3×10-9M或低于1×10-9M的解离常数(KD)值结合人FAP。重组蛋白质还可在N末端、C末端或两者处包含血清白蛋白结合结构域。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)值特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S、或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，所述重组蛋白质同时结合人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白；其中优选地，所述同时结合通过表面等离振子共振(SPR)来测量，进一步优选地如实施例3所述。在某些实施方案中，所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ IDNO:3具有至少93％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S、或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，所述重组蛋白质同时结合人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白；其中优选地，所述同时结合通过表面等离振子共振(SPR)来测量，进一步优选地如实施例3所述。在某些实施方案中，所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少93％同一性的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ IDNO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S、或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，所述重组蛋白质同时结合人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白；其中优选地，所述同时结合通过表面等离振子共振(SPR)来测量，进一步优选地如实施例3所述。在某些实施方案中，所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)值特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQID NO:3具有至少98％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S、或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，所述重组蛋白质同时结合人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白；其中优选地，所述同时结合通过表面等离振子共振(SPR)来测量，进一步优选地如实施例3所述。在某些实施方案中，所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)值特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S、或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，所述重组蛋白质同时结合人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白；其中优选地，所述同时结合通过表面等离振子共振(SPR)来测量，进一步优选地如实施例3所述。在某些实施方案中，所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ IDNO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述重组蛋白质能够同时结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。与人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白的同时结合优选通过表面等离振子共振(SPR)在PBS中测量，进一步优选如实施例3所述。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)值特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQID NO:3具有至少95％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述重组蛋白质能够同时结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。与人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白的同时结合优选通过表面等离振子共振(SPR)在PBS中测量，进一步优选如实施例3所述。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M或低于10-10M的解离常数(KD)值特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-7M或低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述重组蛋白质能够同时结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。与人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白的同时结合优选通过表面等离振子共振(SPR)在PBS中测量，进一步优选如实施例3所述。
在某些实施方案中，本文所述的重组蛋白质包含特异性结合人FAP的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合人4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合人血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域和特异性结合人血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人FAP，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)值特异性结合人4-1BB，并且其中所述重组蛋白质在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)值特异性结合人血清白蛋白，并且其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列；其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述两个血清白蛋白结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，其中其N末端还任选地包含G、S或GS，并且其中任选地，倒数第二位置处的A被L取代并且/或者最后位置处的A被N取代，并且其中所述重组蛋白质能够同时结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。在某些实施方案中，连接基包含SEQ ID NO:4。在某些实施方案中，连接基由SEQ ID NO:4组成。在某些实施方案中，在表达FAP的CHO细胞的存在下，重组蛋白质活化表达4-1BB的HT1080细胞中的人4-1BB，其中EC50值为约10-8M或更小、或约10-9M或更小。与人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白的同时结合优选通过表面等离振子共振(SPR)在PBS中测量，进一步优选如实施例3所述。
3.8.核酸和生产多特异性蛋白质的方法
本公开还提供了编码本文所述的重组蛋白质的多核苷酸。本发明还提供了制备本文所述的多核苷酸中的任一者的方法。多核苷酸可通过本领域已知的方法制备和表达。
在一个方面，本公开提供了多核苷酸或包含编码重组多特异性蛋白质的多核苷酸的组合物，其中sad蛋白值包含特异性结合成纤维细胞活化蛋白质(FAP)的第一锚蛋白重复结构域和特异性结合4-1BB的第二锚蛋白重复结构域，以及任选地半衰期延长部分。
在一个方面，本公开提供了多核苷酸或包含多核苷酸的组合物，这些多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:1、2、3、4或5的重组蛋白质的核酸序列。在一个方面，本公开提供了多核苷酸或包含多核苷酸的组合物，这些多核苷酸包含编码包含SEQ ID NO:6的重组蛋白质的核酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了包含SEQ ID NO:17的核酸序列的核酸。
在另一个方面，本公开提供了编码重组蛋白质的多核苷酸及其变体，其中此类变体多核苷酸与本文所公开的任何核酸(诸如包含SEQ ID NO:17的核酸序列的核酸)共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性。在一些实施方案中，此类变体多核苷酸与本文所公开的任何核酸(诸如包含SEQ ID NO:17的核酸序列的核酸)共享至少95％序列同一性。在一些实施方案中，此类变体多核苷酸与本文所公开的任何核酸(诸如包含SEQ ID NO:17的核酸的核酸序列)共享至少96％序列同一性。在一些实施方案中，此类变体多核苷酸与本文所公开的任何核酸(诸如包含SEQ IDNO:17的核酸序列的核酸)共享至少97％序列同一性。在一些实施方案中，此类变体多核苷酸与本文所公开的任何核酸(诸如包含SEQ ID NO:17的核酸序列的核酸)共享至少98％序列同一性。在一些实施方案中，此类变体多核苷酸与本文所公开的任何核酸(诸如包含SEQID NO:17的核酸序列的核酸)共享至少99％序列同一性。
在另一个方面，本公开提供了编码重组蛋白质的多核苷酸及其变体，其中此类变体多核苷酸能够在高严格条件下与SEQ ID NO:17的序列杂交。“高严格条件”包括以下那些条件：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如在50℃下0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)在杂交期间使用变性剂，诸如在42℃下的甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5，750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠；或者(3)在42℃下采用50％甲酰胺、5×SSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt's溶液、超声处理的鲑精DNA(50pg/mL)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，在42℃下在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺中在55℃下洗涤，然后在55℃下进行由含有EDTA的0.1×SSC组成的高严格度洗涤。
本公开还涵盖与任何此类序列互补的多核苷酸。多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(重组的、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括hnRNA分子和mRNA分子，该hnRNA分子包含内含子并且以一对一的方式对应于DNA分子，该mRNA分子不包含内含子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必连接至其他分子和/或载体材料。
本领域普通技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码包含如本文所述的氨基酸序列的重组蛋白质(或其单独结构域)的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与任何天然基因的核苷酸序列具有最小同源性。本公开特别设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。
本公开还包括经密码子优化的多核苷酸，其中核酸序列已被优化以使在特定细胞中的表达最大化。一般来讲，密码子优化是指通过用在该宿主细胞的基因中更频繁或最频繁使用的密码子替换原始序列的至少一个密码子(例如，约或超过约1、2、3、4、5、10、15、20、25、50或更多个密码子)同时保持原有的氨基酸序列来修饰核酸序列以增强在所关注的宿主细胞中的表达的过程。各种物种对特定氨基酸的某些密码子表现出特定偏倚性。密码子偏倚性(生物体之间密码子使用的差异)通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，这继而据信取决于所翻译密码子的特性以及特定转运RNA(tRNA)分子的可用性等。所选的tRNA在细胞中的优势通常是在肽合成中最频繁使用的密码子的反映。因此，可基于密码子优化对基因进行定制以在给定生物体中进行最佳基因表达。密码子使用表是易得的，并且这些表可以多种方式进行调整(例如Nakamura,Y.等人，“Codon usage tabulated from theinternational DNA sequence databases:status for the year 2000”，Nucl.AcidsRes.，第28卷，第292页，2000年)。用于密码子优化特定序列以在特定宿主细胞中表达的计算机算法也是可用的，诸如Gene Forge(Aptagen，Jacobus,Pa.)也是可用的。在一些实施方案中，编码重组蛋白质的序列中的一个或多个密码子(例如1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、50个或更多个密码子，或所有密码子)对应于特定氨基酸的最常用密码子。
合适的克隆载体可根据标准技术构建，或者可选自本领域可用的大量克隆载体。虽然所选的克隆载体可根据旨在使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体将通常具有自我复制的能力，可具有特定限制性内切核酸酶的单个靶标，并且/或者可携带可用于选择含有该载体的克隆的标记物的基因。合适的示例包括质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mp18、mp19、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体诸如pSA3和pAT28。这些和许多其他克隆载体可购自商业供应商诸如BioRad、Strategene和Invitrogen。
还提供了表达载体。表达载体通常是含有根据本公开的多核苷酸的可复制多核苷酸构建体。这暗示了表达载体必须作为附加体或作为染色体DNA的整体部分在宿主细胞中可复制。合适的表达载体包括但不限于质粒、病毒载体(包括腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、粘粒)和PCT公开WO 87/04462中公开的表达载体。载体组分通常可包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列；复制起点；一个或多个标记基因；合适的转录控制元件(诸如启动子、增强子和终止子)。对于表达(即翻译)，通常还需要一个或多个翻译控制元件，诸如核糖体结合位点、翻译起始位点和终止密码子。
可通过多种适当的手段中的任一者将含有所关注的多核苷酸和/或多核苷酸本身的载体引入宿主细胞中，这些手段包括电穿孔，采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂转染；以及感染(例如，其中载体是感染原，诸如牛痘病毒)。引入载体或多核苷酸的选择通常将取决于宿主细胞的特征。
示例性宿主细胞包括大肠杆菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。在本领域熟知的许多细胞中，优选的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、CHO细胞、人胚肾(HEK)293细胞或Sp2.0细胞。
4.治疗方法
本文所述的重组蛋白质可用于例如治疗患有癌症的受试者。
本公开提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本文所述的重组蛋白质或药物组合物。在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，癌症包括实体瘤。在某些实施方案中，癌细胞表达FAP。在某些实施方案中，肿瘤基质细胞表达FAP。
在一些实施方案中，癌症是脑癌、膀胱癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、宫颈癌、结肠癌和直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈鳞状细胞癌、唇癌和口腔癌、肝癌、肺鳞状细胞癌、黑素瘤、间皮瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、口腔癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤、小细胞肺癌(SCLC)、头颈鳞状上皮细胞癌(SCCHN)、三阴性乳腺癌或甲状腺癌。
在一些实施方案中，癌症是肾上腺皮质肿瘤、肺泡状软组织肉瘤、恶性肿瘤、软骨肉瘤、结肠直肠癌、硬纤维瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、内分泌肿瘤、内胚窦瘤、上皮样血管内皮细胞瘤、尤文肉瘤、生殖细胞瘤、肝母细胞瘤、肝细胞癌、黑素瘤、肾瘤、成神经细胞瘤、非横纹肌肉瘤软组织肉瘤(NRSTS)、骨肉瘤、椎旁肉瘤、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤或Wilms瘤。
在一些实施方案中，癌症是急性淋巴母细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或慢性髓性白血病(CML)。
在一些实施方案中，癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)。
实际上，可治疗的癌症包括但不限于肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、肛门肛管或肛肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈部胆囊或胸膜癌、鼻部鼻腔或中耳癌、口腔癌、外阴癌、食管癌、胃肠类癌肿瘤、喉咽癌、喉癌、鼻咽癌、腹膜网膜和肠系膜癌、咽癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、输尿管癌和膀胱癌。
在特定方面，癌症选自头颈癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌和食管癌、胰腺癌、胃肠道癌、胃癌、乳腺癌、子宫内膜癌和结肠直肠癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、肺癌和细支气管肺泡癌。
在某些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈癌、肾癌、三阴性乳腺癌或胃癌。在某些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈癌、肾癌、乳腺癌、黑素瘤、卵巢癌、肝癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、淋巴瘤或白血病。在某些实施方案中，癌症是脑癌。
本文所述的重组蛋白质可在外科手术之前或之后用于去除肿瘤，并且可在放射疗法之前、期间或之后使用。重组蛋白质可用于治疗足够大以通过触诊或通过本领域熟知的成像技术(诸如MRI、超声或CAT扫描)发现的肿瘤。在一些实施方案中，重组蛋白质用于治疗晚期肿瘤，该晚期肿瘤具有至少约200mm3、300mm3、400mm3、500mm3、750mm3或至多1000mm3的尺寸。
据报道，血清和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性中细胞因子(IFN-γ、TNF-α和IL-2)的产生指示4-1BB活化(参见例如Li等人，Cell Mol Immunol.，2008年10月，第5卷第5期，第379-84页，doi：10.1038/cmi.2008.47)。因此，细胞因子相关(诸如IFN-γ相关)表达谱可预测对4-1BB活化的临床应答。
例如，研究还表明，IFN-γ可增强CD8+T细胞的抗肿瘤和抗病毒作用。CD8+T细胞能够产生IFNγ，这增强了其迁移至抗原呈递细胞的位点的能力。相反地，剥夺自分泌或旁分泌IFNγ或阻断IFNγ向CTL的信号传导显著降低了它们的细胞毒性功能、它们的运动学和效应细胞存活率。对局部IFNγ实现细胞毒性CD8+T细胞功能的需求对于癌症治疗是重要的。
因此，本文提供了增加受试者的T细胞活性，特别是CD8+T细胞介导的细胞毒性的方法。T细胞活性的此类增加包括例如增加T细胞存活率和效应子功能，限制末端分化和复制潜能的损失，促进T细胞寿命，以及增强对靶(例如癌症)细胞的细胞毒性。在某些实施方案中，T细胞活性或免疫应答针对癌细胞或癌症组织或肿瘤细胞或肿瘤。在某些实施方案中，免疫应答是体液免疫应答。在某些实施方案中，免疫应答是先天免疫应答。在某些实施方案中，增强的免疫应答是T-细胞介导的免疫应答。
5.药物组合物和施用
在另一方面，本公开还提供了包含本文所述的重组多特异性蛋白质的药物组合物。
药物组合物可包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。标准药物载体包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水或水/油乳液以及各种类型的润湿剂。
药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶抛射剂、空气置换剂、碱化剂、抗结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、防腐剂、碱、粘合剂、缓冲剂、螯合剂、涂层剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、填料、成膜剂、风味增强剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、粒化剂、湿润剂、润滑剂、黏膜粘附剂、膏剂基料、膏剂、含油溶媒、有机基料、锭剂基料、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基料、界面活性剂、表面活性剂、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张度剂、毒性剂、增粘剂、吸水剂、水混溶性共溶剂、水软化剂或润湿剂。参见例如A.H.Kibbe的Handbook of Pharmaceutical Excipients第三版(Pharmaceutical Press，London，UK，2000年)，其全文以引用方式并入。Remington’s Pharmaceutical Sciences，第十六版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980年)，该文献全文以引用方式并入。
可配制药物组合物以实现生理上相容的pH。在一些实施方案中，药物组合物的pH可例如介于约4或约5和约8.0之间，或介于约4.5和约7.5之间，或介于约5.0和约7.5之间。在示例性实施方案中，药物组合物的pH介于5.5和7.5之间。
本文所述的重组多特异性蛋白质可经由任何合适的施用途径施用给受试者，这些施用途径诸如肠胃外、鼻腔、口服、肺部、局部、阴道或直肠施用。适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、以及使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液。另外的细节参见Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，PA，Banker和Chalmers编辑，第238-250页，1982年，以及ASHP Handbook on Injectable Drugs，Toissel，第4版，第622-630页，1986年。
在治疗方案的过程中施用的本公开的活性剂的剂量应足以在从施用时起的临床可接受的时间段(例如，1周至4周或更长(诸如5周至20周或更长))内治疗癌症。在某些实施方案中，该时间段可甚至更长。剂量将由特定活性剂的功效和动物(例如，人)的病症以及有时待治疗的动物(例如，人)的体重来确定。在施用一定剂量时治疗癌症的程度可由例如活性剂的细胞毒性或用活性剂实现的肿瘤消退程度来表示。测量重组多特异性蛋白质的细胞毒性的方法和测定肿瘤消退的方法是本领域已知的。以举例的方式并且不旨在限制本公开，本公开的活性剂的剂量可以是约0.0001g/kg受试者体重/天至约1g/kg受试者体重/天、约0.0001g/kg体重/天至约0.001g/kg体重/天、或约0.01mg至约1g/kg体重/天。剂量单位也可以rag/m2表示，其是指以毫克/平方米身体表面积表示的量。
基于PK/PD模型和临床前动物模型，据信治疗剂量可在约0.015mg/kg至约12mg/kg的范围内，诸如约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约7.5mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg、约1.0mg/kg、约1.5mg/kg、约2.0mg/kg、约2.5mg/kg、约3.0mg/kg、约3.5mg/kg、约4.0mg/kg、约4.5mg/kg或约5mg/kg。在某些实施方案中，多特异性蛋白质以约0.5mg/kg至约5mg/kg施用。在某些实施方案中，多特异性蛋白质以约2mg/kg施用。
本文所述的重组多特异性蛋白质可与另一种治疗剂(诸如另一种抗癌剂)组合使用。每种治疗剂可同时施用(例如，在相同药物中或同时施用)、并行施用(即，在单独的药物中以任何顺序一个接一个地施用)或以任何顺序依次施用。当组合疗法中的治疗剂为不同剂型(例如，一种药剂是片剂或胶囊剂，并且另一种药剂是无菌液体)和/或以不同给药方案施用时，顺序施用可能是有用的，例如，至少每天施用的化学治疗剂和较不频繁施用的生物治疗剂，诸如每周一次、每两周一次或每三周一次。
在某些实施方案中，本文所述的重组多特异性蛋白质约每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次施用。例如，重组多特异性蛋白质可以每三周约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg或约5mg/kg施用。
实施例
实施例1-多特异性结合蛋白质的设计
产生各种形式的多特异性结合蛋白质(参见图5A和图5B)，并且评估它们增强h4-1BB-HT1080报告基因细胞的NF-κB活化的能力。
在表达人FAP的CHO细胞的存在下，使用人4-1BB转染的NF-κB报告基因细胞(h4-1BB-HT1080)评估包含SEQ ID NO:2所示FAP结合结构域和SEQ ID NO:3所示一个至三个4-1BB结合结构域的各种多特异性结合蛋白质的功能活性。
在表达人FAP的CHO细胞的存在下，体外NF-κB活化测定法：用编码全长人4-1BB的cDNA和pNIFTY-Lucia NF-κB报告基因稳定转染HT1080人纤维肉瘤细胞，如下所述。以相同的方式，CHO细胞用编码人FAP的cDNA稳定转染。使用96孔板，铺板40,000个h4-1BB-HT1080报告基因细胞和40,000个CHO-hFAP细胞，并且将不同浓度的MpA或对照锚蛋白重复蛋白质添加到细胞中并在37℃、5％CO2下温育。20小时后，收集上清液并在新的96孔板中离心。将QUANTI-Luc试剂与上清液混合，并在Tecan M1000发光板读取器上读取发光值。通过使用Graphpad Prism软件(第7.02版)将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。
表达人FAP的CHO细胞的产生：稳定转染CHO细胞以在细胞表面表达人FAP。含有人成纤维细胞活化蛋白质(FAP)的ORF的GFP融合体的质粒获自OriGene Technologies(#RG204692)。使用标准分子生物学技术亚克隆编码人FAP(无GFP)的cDNA。然后使用脂质体将该质粒转染到CHO细胞中以产生过表达人FAP的稳定转染子。使用不同量的遗传霉素G-418(Promega，V8091)施加选择压力。使用抗FAP抗体ESC11(国际专利公布WO2011/040972)通过流式细胞术分析hFAP的表达。选择来自条件1.9mg/mL G-418的CHO-hFAP转染子群体用于效能测定的FAP的较低表达水平，以便能够区分高效
Figure BDA0003494854670000661
分子。
结论：如图5A至图5G所示，本发明的重组蛋白质对4-1BB的活化依赖于表达FAP的细胞(CHO-FAP)的存在。在不表达FAP(CHO-wt)的细胞的存在下，未观察到4-1BB的活化。虽然4-1BB在与其天然三聚配体(4-1BBL)结合时发生三聚反应，但在这种情况下，4-1BB活化不需要具有三个4-1BB结合结构域。单价4-1BB粘结剂(F-B)足以活化4-1BB。更高的效力通过使用两个4-1BB结合结构域(F-B-B)或三个4-1BB结合结构域(F-B-B-B)来实现。据信，通过具有三个4-1BB结合模块，分子将进一步促进4-1BB聚集(“交联”效应)，从而进一步增强T-细胞介导的细胞毒性。令人惊讶的是，与F-B-B(两个4-1BB结合模块)相比，F-B-B-B形式(三个4-1BB结合模块)未显著改善活性。因此，选择F-B-B形式用于进一步表征。该形式用于以下实施例中所述的多特异性结合蛋白质A(MpA)(SEQ ID NO:6)。
实施例2-多特异性分子的结合亲和力
以下实施例描述了进行以测定包含SEQ ID NO:6的多特异性结合蛋白质A(MpA)中不同结构域的物种交叉反应性的实验。针对三种物种(人、食蟹猴和小鼠)分析MpA与血清白蛋白、4-1BB和FAP的相互作用。
材料和方法
用于MpA与不同物种的4-1BB结合的ProteOn设置：使用ProteOn XPR36仪器(BioRad)进行SPR测量。运行缓冲液是含有
Figure BDA0003494854670000676
的PBS pH7.4(PBST)。将bio.h4-1BB、bio.c4-1BB和bio.m4-1BB固定在NLC芯片(BioRad)上至320RU的水平。通过以30nM、10nM、3.3nM、1.1nM和0.3nM的系列稀释度注射MpA，其中180s的缔合和1800s的解离，使用100μl/min的恒定流速来测量MpA与4-1BB的结合(参见表3)。将测量重复三次，并且使用10mM甘氨酸pH 2和124mM H3P04在各个测量之间使靶标再生。信号针对运行缓冲液(PBST)处理的L1和A6对照泳道进行双重参考。h4-1BB、c-4-1BB和m4-1BB分别是指4-1BB的人、食蟹猴和小鼠直系同源物。
用于MpA与不同物种的血清白蛋白结合的ProteOn设置：使用ProteOn XPR36仪器(BioRad)进行SPR测量。运行缓冲液是含有0.005％吐温
Figure BDA0003494854670000675
的PBS pH7.4(PBST)。首先，将bio.h4-1BB涂覆在NLC芯片(BioRad)上至320RU的水平，然后以30μl/min的恒定流速将100mM MpA固定180秒至200RU的水平。通过应用HSA(人血清白蛋白)、CSA(食蟹猴血清白蛋白)和MSA(小鼠血清白蛋白)作为滴定，其中180s的缔合和1800s的解离，使用100μl/min的恒定流量来检测血清白蛋白与MpA的结合。连续测量HSA、CSA和MSA结合，并且每次用10mM甘氨酸(pH 2)和124mM H3P04再生bio.h4-1BB/MpA复合物。因此，必须在每个再生步骤后对MpA进行重新涂覆。信号针对运行缓冲液(PBST)处理的L1和A6对照泳道进行双重参考。1:1朗缪尔模型用于拟合。
用于MpA与不同物种的FAP结合的ProteOn设置：使用ProteOn XPR36仪器(BioRad)进行SPR测量。运行缓冲液是含有0.005％吐温
Figure BDA0003494854670000674
的PBS pH 7.4(PBST)。将hFAP(人FAP)、cFAP(食蟹猴FAP)和mFAP(小鼠FAP)分别在pH 5.3下固定在GLC芯片(BioRad)上至2000RU、1700RU和5000RU的水平。通过应用MpA分子作为滴定来测量FAP和MpA的相互作用(参见表2)。缔合和解离设置汇总于表2中。
表2
配体 分析物 浓度分析物[nM] 流速[μl/min] 关联[s] 解离[s]
Bio.h4-1BB<sup>*</sup> MpA 30、10、3.3、1.1、0.3 100 120 1800
Bio.c4-1BB<sup>*</sup> MpA 30、10、3.3、1.1、0.3 100 120 1800
Bio.m4-1BB<sup>*</sup> MpA 30、10、3.3、1.1、0.3 100 120 1800
MpA HSA 50、16.7、5.6、1.9、0.6 100 180 1800
MpA CSA 100、33、11、3.7、1.2 100 180 1800
MpA MSA 100、33、11、3.7、1.2 100 180 1800
hFAP<sup>**</sup> MpA 25、8.3、2.8、0.9、0.3 100 120 1800
hFAP<sup>**</sup> MpA 50、25、12.5、6.25、3.125 100 180 1500
cFAP MpA 25、8.3、2.8、0.9、0.3 100 120 1800
mFAP MpA 50、25、12.5、6.25、3.125 100 180 1500
*使用相同设置的一式三份测量
**使用不同设置的一式两份测量
进行两次独立的测量以检测MpA与hFAP的结合。使用10mM甘氨酸(pH 2)和124mMH3P04再生靶标。信号针对PBST处理的L1和A6对照泳道进行双重参考。1:1朗缪尔模型用于拟合。
结果
与4-1BB的结合：结果示出MpA以KD＝13±5pM与人4-1BB结合，并且以KD＝14±8pM与食蟹猴4-1BB结合(如表3所示)。
表3.MpA与不同物种(人、小鼠或食蟹猴)的4-1BB、血清白蛋白和FAP结合的动力学 参数。
Figure BDA0003494854670000681
Figure BDA0003494854670000691
*这些值表示一式三份测量的平均值。
**这些值表示一式两份测量的平均值。
Figure BDA0003494854670000692
Chi2/Rmax>10％被定义为不准确的拟合
因此，这些结果表明MpA以类似的表观亲和力与人和cyno4-1BB结合。然而，未检测到与m4-1BB结合，这表明MpA不与小鼠4-1BB交叉反应。这些发现与人和食蟹猴的95％以及人和小鼠的56％的序列同一性一致。
与血清白蛋白的结合：确定MpA与人、食蟹猴和小鼠血清白蛋白交叉反应，其中亲和力分别是KD＝8nM、67nM和38nM。因此，MpA对人血清白蛋白的亲和力是对食蟹猴或小鼠血清白蛋白的亲和力的4倍至8倍。由于人与食蟹猴或小鼠的序列同一性分别是93％和72％，因此对小鼠和食蟹猴的亲和力不同可能是由于表位区域中的各个突变。虽然对于最高施加浓度的MSA和CSA(33-100nM)观察到一定程度的与芯片表面的非特异性结合，但结合血清白蛋白的测定动力学参数落入预计范围内。
与FAP的结合：确定MpA与人和食蟹猴FAP交叉反应，但不与mFAP交叉反应。MpA以KD＝0.4±0.2nM的亲和力与hFAP结合，并且以KD＝0.8nM与cFAP结合。MpA与人和食蟹猴FAP的结合通过1.3E-04s-1的缓慢解离速率来表征。人FAP和食蟹猴FAP之间的类似亲和力与97％的序列同一性一致。
结论：
表面等离振子测量已显示MpA分别以13±5pM和14±8pM的表观亲和力紧密结合人和食蟹猴4-1BB。MpA不与m4-1BB交叉反应，这可能是由于细胞外结构域的序列相似性低至仅56％。MpA示出分别以8nM、67nM和38nM的亲和力结合人血清白蛋白、食蟹猴血清白蛋白和小鼠血清白蛋白。此外，据显示，MpA在亚纳摩尔范围内与人和食蟹猴FAP结合，而尽管序列相似性相对较高为90％，但小鼠FAP不能检测到交叉反应性。
实施例3-通过表面等离振子共振分析MpA与4-1BB、FAP和人血清白蛋白的同时结 合
以下实验描述了进行表面等离振子共振实验，该实验分析包含SEQ ID NO:6的多特异性结合蛋白质A(MpA)分别与人4-1BB、人FAP和人血清白蛋白的同时结合。
使用以下设置进行分析：在开始结合测量之前，将生物素酰化的人4-1BB固定在涂覆中和亲和素的NLC芯片表面上。在第一步骤中，添加MpA，其具有4-1BB的缓慢解离速率。第二，将hFAP应用为第二靶标，然后添加HSA作为第三靶标和最终靶标。
使用ProteOn XPR36仪器(BioRad)进行SPR测量。含有0.005％吐温20的PBS pH7.4用作运行缓冲液。将360RU的10nM生物素酰化的人4-1BB(bio.h4-1BB-Fc)固定在涂覆中性抗生物素蛋白的NLC传感器芯片上。向bio.4-1BB固定的芯片连续施加100nM MpA缔合180s解离60s、100nM hFAP缔合180s解离60s和100nM人血清白蛋白缔合180s解离1000s作为独立的分析物步骤。只有当MpA已结合到4-1BB时，该设置才允许结合hFAP和HSA。该设置的要求是MpA以高亲和力结合4-1BB和FAP，以防止在应用第三靶标(HSA)之前信号快速丢失。使用不同的分析物通道来包括所有对照。信号以PBST处理的L1和A6对照泳道进行双重参考。另外，对固定配体的量(RU)的分析允许通过使用下式确定复合物的结合化学计量：化合价配体＝(Rmax×MW配体)/(R配体*MW分析物)。
最初，在开始结合测量之前，将约360个应答单元(RU)的人4-1BB固定在SPR芯片上。在第一步骤中，将200RU的MpA结合到固定的h4-1BB(在图6中示为注射(a))。第二，注射hFAP并可显示与MpA的结合(由220RU的增加指示)(在图6中显示为注射(b)。第三，注射HSA(在图6中示出为注射(c))。在后续的缔合阶段中人血清白蛋白的结合表明MpA与所有三个靶标的同时结合是可能的。另外，对每个注射步骤后最大应答单位量的分析允许定量结合化合价(汇总于表4中)。
表4.在同时结合SPR测量期间每个结合事件的响应单位(RU)和结合化学计量。
Figure BDA0003494854670000701
*复合物1：bio.4-1BB-Fc/MpA
**复合物2：bio.4-1BB-Fc/MpA/hFAP
因此，在结合HSA时RU为约280意味着两个HSA分子可同时结合MpA。类似地，MpA与4-1BB和FAP的结合比率测定为1:1。连同由于MpA针对h4-1BB的二价(低解离率)而观察到的高表观结合亲和力，确定MpA能够结合两个固定的h4-1BB分子。
实施例4-经由4-1BB共刺激人T细胞活化
本研究的目的是确定包含SEQ ID NO:6的多特异性结合蛋白质A(MpA)在体外共刺激原代人CD8 T细胞的活化并增强原代人CD8 T细胞的抗CD3介导的IFNγ产生的效力。将MpA增强原代人CD8 T细胞的抗CD3介导的IFNγ产生的功能活性与若干其他4-1BB激动分子进行比较。在板涂覆的FAP的存在下，MpA能够以剂量依赖性方式增强CD8 T细胞的IFNγ分泌，其中EC50为1nM至2nM。因此，已确定MpA在结合到FAP时能够为原代人CD8 T细胞提供强效共刺激。MpA的效力与抗FAP-4-1BBL(EC50为1nM至2nM)(4-1BB的天然三聚配体与抗FAP抗体的融合)相当。
材料和方法：
使用FAP聚集的体内人T细胞IFNγ释放测定：从苏黎世供血中心获得血沉棕黄层并用PBS稀释。然后使用Leucosep管通过密度离心分离PBMC。在若干洗涤步骤后，使用阴性选择人CD8 T细胞分离试剂盒，根据制造商的建议从PBMC中纯化CD8 T细胞。将CD8 T细胞(1×105/孔)接种到预先用0.5μg/ml抗CD3克隆OKT-3和中和亲和素涂覆的96孔板上，然后在不同浓度的测试项目的存在下接种生物素酰化的hFAP。将培养物在37℃、5％CO2下温育96小时，之后将上清液移至新的96孔板中并保存于-20℃下直至分析。使用人IFN-γDuoSetELISA根据生产商的说明书检测上清液的IFNγ浓度。通过使用Graphpad Prism软件将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。
使用抗Fc聚集的体内人T细胞IFNγ释放测定：从苏黎世供血中心获得血沉棕黄层并用PBS稀释。使用Leucosep管通过密度离心分离PBMC。在若干洗涤步骤后，使用阴性选择人CD8 T细胞分离试剂盒，根据制造商的建议从PBMC中纯化CD8 T细胞。将CD8 T细胞(1×105/孔)接种到预先用1μg/ml抗CD3(克隆OKT-3)和不同浓度的抗-4-1BB抗体涂覆的96孔板上，该板也经由抗人IgG涂覆到孔中。将培养物在37℃、5％CO2下温育96h，之后将上清液移至新的96孔板中并保存于-20℃下直至分析。使用人IFN-γDuoSet ELISA根据生产商的说明书检测上清液的IFNγ浓度。
EC50测定：使用GraphPad Prism第7.02版，通过以log模式转换x值(浓度)并在非线性模式log(激动剂)与应答中拟合，用可变斜率(四个参数)公式测定EC50值来确定EC50值。
阴性对照：将包含SEQ ID NO:38的多结构域蛋白质C(MpC)用作阴性对照，以展示MpA的药理活性对与FAP结合的依赖性。类似于MpA，MpC包含五个锚蛋白重复结构域：HSA-非FAP-4-1BB-4-1BB-HSA。HSA和4-1BB结合结构域与MpA中相同，但“非FAP”结构域是不具有结合靶标的对照锚蛋白重复结构域。添加六组氨酸标签以有利于检测。
小鼠替代物：包含SEQ ID NO:37的多特异性结合蛋白质B(MpB)是包含五个锚蛋白重复结构域的小鼠替代物：HSA-FAP*-4-1BB-4-1BB-HSA。HSA和4-1BB结合结构域与MpA中的相同。FAP*是特异性结合小鼠FAP和人FAP的锚蛋白重复结构域。MpB用于展示人源化小鼠模型中的药理活性。添加六组氨酸标签以有利于检测。
抗FAP-4-1BBL：抗FAP-4-1BBL是包含融合到抗FAP抗体的天然人4-1BB配体(4-1BBL)的融合蛋白质(WO2016/075278)。
结果和讨论：
MpA增强离体人CD8 T细胞的IFNγ分泌：当经由与结合到板的FAP的交联呈现给细胞时，评估MpA活化人CD8 T细胞上4-1BB的能力。MpA以浓度依赖性方式诱导CD8细胞的IFNγ分泌，其中EC50为1nM至2nM(图7)。相反地，包含与MpA相同的4-1BB结合结构域但不含FAP结合结构域的阴性对照MpC不导致CD8细胞的刺激，这表明经由FAP的MpA聚集对于CD8 T细胞的活化是必需的。含有融合到抗FAP抗体的天然人4-1BB配体的抗FAP-4-1BBL分子在该测定中显示出类似的效力，其中EC50为1nM至2nM(图7)。MpB(MpA的小鼠替代物，包含结合小鼠和人FAP的FAP结合结构域以及与MpA相同的4-1BB结合结构域)也能够用1nM至2nM的相当EC50活化原代人CD8 T细胞。MpA-His具有1nM至3nM的类似EC50。来自代表性实验的EC50值汇总于表5中。
表5：FAP靶向激动剂在人CD8 T细胞活化测定中的效力。
蛋白质/抑制剂 EC<sub>50</sub>[nM] 95％CI
MpA 1.17 0.67至3.44
MpC 无活化 -
抗FAP-4-1BBL 1.26 0.70至2.89
His-MpA(带His标签的型式的MpA) 2.37 1.63至3.45
MpB 1.54 0.77至3.19
抗4-1BB抗体的共刺激活性取决于Fc交联：抗4-1BB mAb增强了分离的人原代CD8T细胞的抗CD3介导的活化(Fisher等人，Cancer Immunol Immunother，第61卷，第1721-1733页，2012年)。已证实抗4-1BB mAb的激动活性取决于结合的抗体经由其Fc受体或通过涂覆在板表面上而聚集。比较了可溶形式的抗4-1BB mAb 20H4.9(IgG4；美国专利7,288,638)和MOR-7480(WO 2012/032433)增强分离的人原代CD8 T细胞或结合到板涂覆的抗Fc抗体的抗CD3介导的IFNγ产生的效力。在该测定法中，抗4-1BB mAb 20H4.9能够在不进行Fc交联的情况下增强IFNγ产生，其中EC50为0.97nM。经由涂覆的抗Fc的交联使效力增加约25倍至0.04nM的EC50。另一方面，在任何测试浓度下，可溶形式的抗4-1BB mAb MOR-7480不显示任何激动剂活性。Fc介导的抗4-1BB mAb MOR-7480的交联导致IFNγ产生增加，其中EC50为0.42nM。经由抗Fc抗体交联的抗4-1BB mAb 20H4.9和MOR-7480的效力比较示出，在该测定中抗4-1BB mAb 20H4.9的效力大概高10倍。当经由板涂覆的抗Fc交联时，抗FAP-4-1BBL与EC50显示0.11nM的效力。EC50值汇总于表6中。
表6：抗4-1BB抗体在人CD8 T细胞活化测定中的效力。
蛋白质/抑制剂 EC<sub>50</sub>[nM] 95％CI
经由抗Fc交联的抗4-1BB mAb 20H4.9 0.02 0.007至0.04
抗4-1BB mAb 20H4.9可溶 0.93 0.71至1.22
经由抗Fc交联的抗4-1BB mAb MOR-7480 0.21 0.13至0.34
抗4-1BB mAb MOR-7480可溶 无活化 -
抗FAP-4-1BBL 0.04 0.009至0.15
结论：
本研究的目的是确定MpA在体外共刺激CD8 T细胞的活化并增强原代人CD8 T细胞的抗CD3介导的IFNγ产生的效力，并将其与抗4-1BB单克隆抗体20H4.9和MOR-7480的效力进行比较。将MpA增强原代人CD8 T细胞的抗CD3介导的IFNγ产生的功能活性与若干其他4-1BB激动分子进行比较。在板涂覆的FAP的存在下，MpA能够以剂量依赖性方式增强CD8 T细胞的IFNγ分泌，其中EC50为1nM至2nM。MpC(非FAP靶向对照)未显示IFNγ产生增强。因此，已确定MpA在结合到FAP时能够为原代人CD8 T细胞提供强效共刺激。MpA的效力与抗FAP-4-1BBL(EC50为1nM至2nM)(4-1BB的天然三聚配体与抗FAP抗体的融合)相当。
使用涂覆有抗Fc抗体而非FAP的板，在测定形式的变型中评估抗4-1BB mAb20H4.9和MOR-7480增强CD8T细胞的抗CD3介导的IFNγ产生的功能活性。两种抗体均需要经由抗Fc抗体交联以实现完全活性，但注意到抗体效力的若干差异。在所测试的整个浓度范围内，抗4-1BB mAb 20H4.9在无交联的情况下表现出一些活性(EC50 0.97nM)，而抗4-1BBmAb MOR-7480在无交联的情况下无活性。在涂覆的抗Fc的存在下，抗4-1BB mAb MOR-7480能够增强CD8 T细胞活化(EC50 0.42nM)，但抗4-1BB mAb 20H4.9显示出高大约10倍的效力(EC50 0.04nM)。抗4-1BBL在该Fc交联测定形式中也是活性的，其中EC50为0.11nM，而在FAP依赖性测定设置中EC50为1nM至2nM。因此，测定形式影响分子的总体效力，因此不应直接比较用FAP依赖性或抗Fc依赖性测定形式评估的不同分子的EC50值。因此，在利用Fc特异性抗IgG的测定中测试的抗体的较低EC50值不一定意味着与FAP靶向的4-1BB特异性试剂相比，它们具有更好的激动效力。
实施例5-小鼠中多特异性结合蛋白质A(MpA)的药代动力学
药代动力学(PK)研究的目的是评估以1mg/kg的目标剂量水平单次静脉内施用后小鼠中包含SEQ ID NO:6的多特异性结合蛋白质A(MpA)的PK特征。
在单次静脉内弹丸式注射后，浓度-时间曲线表明血清浓度的快速初始下降，其在化合物施用后持续长达约6h，然后缓慢下降，这类似于6h和168h(分析的最后时间点)之间的单指数衰减。测量得表观平均终末半衰期是44.8h。在相同时间点测量的血清浓度的受试者间变化性较低(<因子2)。
使用非房室分析，暴露(AUCinf)、总身体清除率(Cl)和分布体积计算为：AUCinf＝15600h*(nmol/L)，Cl＝0.826mL/(h*kg)，并且Vss＝51.5mL/kg。针对分布体积确定的值表明MpA主要限于动物的体循环。
材料/方法：
体内实验：健康雌性BALB/c小鼠(给药前体重20.6g至23.3g)由Janvier，SaintBerthevin Cedex，France供应。在试验前期间以及试验期间，将动物成组圈养在适于物种的笼中。动物自由获取已知配方的标准实验室饮食(3437号，Provimi Kliba，Kaiseraugust，Switzerland)，并且可随意获得家庭市级水。在试验开始之前单独标记动物。
将MpA以单次静脉内弹丸式注射施用到6只小鼠中的每一只的尾静脉中。目标剂量水平是1mg/kg，其中施用体积为5mL/kg。将MpA配制在磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(GibcoLife Technologies，Grand Island，New York，USA，参考：10010-015)中。
将小鼠分为两组，其中动物数目相等。从每只小鼠收集四个血清样本。在化合物施用到Multivette 600管中后5min、6h、24h、48h、72h、96h和168h时从隐静脉收集用于药代动力学研究的血样(大约50μl/样本)。各个动物对相应取样时间点的分配在血清浓度-时间数据表中给出(下表XXX)。将血液在室温下保持大约30分钟以允许凝结，然后进行离心(5min/12000g/4℃)。将血清冷冻并保存在-20℃下以待分析。
生物分析(ELISA)：将每孔一百μl的1.9nmol/L兔单克隆抗
Figure BDA0003494854670000751
抗体1-1-1的PBS溶液涂覆到NUNC Maxisorb ELISA板上在4℃下过夜。在每孔用300μl PBST(补充有0.1％吐温20的PBS)洗涤五次后，在室温(RT)下将孔用补充有0.25％酪蛋白(PBST-C)的200μl PBST在Heidolph Titramax1000摇动器(450rpm)上封闭1小时。板如上所述进行洗涤。将一百μl稀释的血清样本(1:20-1:312500，按1:5稀释步骤)或MpA标准曲线样本(0nmol/L和50nmol/L-0.0008nmol/L，按1:3稀释步骤)在室温下以450rpm振荡施加2h。板如上所述进行洗涤。然后将孔与100μl人抗-
Figure BDA0003494854670000752
单克隆抗体1.4.8(500ng/mL)的PBST-C溶液在室温下在450rpm下温育1h。板如上所述进行洗涤。然后将孔与100μl山羊抗人IgG/HRP缀合物(Ab15，500ng/mL的PBST-C溶液)一起温育，并在室温下在450rpm下温育1h。板如上所述进行洗涤。使用50μl/孔TMB底物溶液显色ELISA 5min，并通过添加50μl 1mol/LH2SO4终止ELISA。计算450nm处吸光度和620nm处吸光度之间的差值。在两个不同的板上一式两份测量样本。将稀释的血清样本的吸光度值与标准曲线进行比较，以计算样本的血清浓度。测定的LLOQ是1nmol/L。
药代动力学分析：计算以下药代动力学参数：AUCinf、AUClast、AUC_％extrapol、Cmax、Tmax、Cl_pred、Vss_pred、t1/2。
最大血清浓度(Cmax)及其发生时间(Tmax)直接从血清浓度-时间曲线获得。血清浓度-时间曲线下面积(AUCinf)通过线性梯形公式直到最后取样点(Tlast)并外推至无穷大(假设终末期单指数下降)来确定。使用Clast/λz进行直至无穷大的外推，其中λz表示通过对数线性回归估计的终点速率常数，并且Clast表示借助于终点对数-线性回归在Tlast处估计的浓度。用于该外推的血清浓度-时间点在血清浓度-时间数据表中标记为(*)(下表7)。总血清清除率(Cl_pred)和表观终末半衰期如下计算：Cl_pred＝i.v.剂量/AUCinf，并且t1/2＝ln2/λz。分布Vss的稳态体积由下式确定：Vss＝i.v.剂量πAUMCinf/(AUCinf)2。AUMCinf表示使用与AUCinf计算中所述相同的外推程序外推至无穷大的药物浓度-时间曲线一阶矩下的总面积。
为了计算基于以nmol/L给出的浓度的PK参数，使用77713g/mol的MpA分子量将以mg/kg给出的剂量值转化为nmol/kg。从而将1mg/kg的剂量水平转化为12.87nmol/kg。
结果和讨论：
体内动物实验：将MpA作为单次静脉内弹丸式注射施用于雌性BALB/c小鼠到尾静脉中。研究中的目标剂量水平是1mg/kg。
对于每项研究，将6只小鼠分成2组，其中动物数目相等。对于药代动力学研究，在不同时间点从隐静脉收集来自每只小鼠的4个血清样本。各个动物对相应取样时间点的分配在血清浓度-时间数据表中给出(下表7)。将血清冷冻在20℃下以待分析。
对于体内实验，没有报导主要问题和与药物相关的不良反应。
生物分析(ELISA)：使用板结合的兔单克隆抗
Figure BDA0003494854670000761
IgG 1-1-1通过夹心ELISA测定MpA的血清浓度，以在稀释的血清样本中捕获MpA。使用人抗
Figure BDA0003494854670000762
抗体1.4.8，然后使用山羊抗人IgG和辣根过氧化物酶(HRP)的缀合物用于检测。使用标准曲线测定每个血清样本中的MpA浓度。
各个和平均血清浓度-时间数据汇总于下表7中。在相同时间点测量的血清浓度的受试者间变化性较低(<因子2)。
药代动力学分析：单次静脉内施用1mg/kg后BALB/c小鼠中MpA的各个血清浓度-时间数据示于表7中。示出血清浓度的组平均值(+/-max/min)或总体平均值(+/-max/min)的相应曲线分别在图8和图9中给出。
使用平均浓度-时间数据进行非房室分析(NCA)。用于测定半衰期的所选数据点示于表7中(由星号表示)。
表7：单次静脉内施用1mg/kg后BALB/c小鼠中MpA的各个和平均血清浓度
Figure BDA0003494854670000771
*用于计算终末半衰期的值
在单次静脉内弹丸式注射1mg/kg MpA后，浓度-时间曲线表明血清浓度的快速初始下降，其在化合物施用后持续长达约6h，然后缓慢下降，这类似于6h和168h(分析的最后时间点)之间的单指数衰减。测量得表观平均终末半衰期是44.8h。
使用非房室分析，暴露(AUCinf)、总身体清除率(Cl)和分布体积计算为：AUCinf＝15600h*(nmol/L)，Cl＝0.826mL/(h*kg)，并且Vss＝51.5mL/kg。针对分布体积确定的值表明MpA主要限于动物的体循环。
结论：药代动力学分析表明，通过静脉内弹丸式注射施用1mg/kg受试化合物后，MpA在小鼠中具有44.8h的表观终末半衰期。使用非房室分析，暴露(AUCinf)、总身体清除率(Cl)和分布体积计算为：15600h*(nmol/L)、0.826mL/(h*kg)和51.5mL/kg。针对分布体积确定的值表明MpA主要限于体循环。
实施例6-食蟹猴中MpA的药代动力学分析
目的是评估包含另外的N末端六组氨酸标签(His-MpA)的MpA以单次剂量0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg静脉内输注30分钟后在蛋白质初始食蟹猴中的PK特性。对于该研究，每个剂量水平使用一只猴(食蟹猴)。在13天的时间段内获取血清样本。通过夹心ELISA测量His-MpA的血清浓度。通过ELISA测量抗His-MpA抗体(AMA)。
材料/方法：
体内动物实验：以0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg的目标剂量水平和5.0mL/kg的施用体积经由静脉内输注给雌性动物施用PBS+0.05％吐温20制剂中的His-MpA 30分钟。在给药前收集用于药代动力学评价的样本，并且在输注结束后10分钟和3小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、192小时、240小时、288小时和312小时的标称时间点再次采集用于药代动力学评估的样本。未测量给药前样本的His-MpA浓度。在施用前(第-4天)收集用于AMA测定的样本，并且在输注结束后96小时、120小时、144小时、192小时、240小时、288小时和312小时的标称时间点再次收集用于AMA测定的样本。在120h和288h时获取的样本未针对抗药物抗体(ADA)进行测量。样本的标称取样时间点实际达到最多48h并且此后略微变化(72+/-0.25h、96-288+/-0.75h，312+/-1h)。标称时间点用于评价浓度-时间和AMA时间数据评价。
用于测量血清样本中的His-MpA的ELISA：将PBS中的一百μl 10nM多克隆山羊抗兔IgG抗体(Ab18)涂覆到NUNC Maxisorb ELISA板上在4℃下过夜。在每孔用300μl PBST(补充有0.1％吐温20的PBS)洗涤五次后，在室温(RT)下将孔用补充有0.25％酪蛋白(PBST-C)的200μl PBST在Heidolph Titramax 1000摇动器(450rpm)上封闭1小时。板如上所述进行洗涤。加入PBST-C中的100μl 5nM兔抗
Figure BDA0003494854670000781
1-1-1抗体，并将板在室温(22℃)下伴随环轨振荡(450rpm)温育1小时。如上所述洗涤板。
将100μl稀释的血清样本(1:20-1:62500，按1:5稀释步骤)或His-MpA标准曲线样本(0nmol/L和50nmol/L-0.0008nmol/L，按1:3稀释步骤)在室温下以450rpm振荡施加2h。板如上所述进行洗涤。
然后将孔与100μl鼠抗-RGS-His-HRP IgG(Ab06，1:2000的PBST-C溶液)一起温育，并在室温下在450rpm下温育1h。板如上所述进行洗涤。使用50μl/孔TMB底物溶液显色ELISA5分钟，并通过添加50μl 1M H2SO4终止ELISA。计算450nm处吸光度和620nm处吸光度之间的差值。在两个不同的板上一式两份测量样本。测定的LLOQ是1nmol/L。
用于测量血清样本中的抗His-MpA抗体的ELISA：将PBS中的一百μl1μg/mL His-MpA涂覆到NUNC Maxisorb ELISA板上在4℃下过夜。在每孔用300μl PBST(补充有0.1％吐温20的PBS)洗涤五次后，在室温(RT)下将孔用补充有0.25％酪蛋白(PBST-C)的300μl PBST在Heidolph Titramax 1000摇动器(450rpm)上封闭1小时。板如上所述进行洗涤。施加100μl稀释的血清样本(起始稀释度1:100(＝最小所需稀释度，MRD)-1:4882812500(按1:5稀释步骤))或抗
Figure BDA0003494854670000791
抗体阳性对照(以与样本相同的方式稀释)。对于切割点测定，以1:100的MRD将12份经过预先测试以产生低信号的初始食蟹猴血清(100μl)施加到同一平板上。将板在室温下温育2h，以450rpm振荡。板如上所述进行洗涤。然后将孔与100μl山羊抗hIgG-HRP(Ab15，0.5μg/mL的PBST-C溶液)一起温育，并在室温下在450rpm下温育45min。Ab15与猴IgG交叉反应并识别食蟹猴的IgG。板如上所述进行洗涤。使用50μl/孔TMB底物溶液显色ELISA 5分钟，并通过添加50μl 1M H2SO4终止ELISA。计算450nm处吸光度和620nm处吸光度之间的差值。在两个不同的板上一式两份测量样本。
通过将这十二个切割点血清的标准偏差乘以正态分布因子2.576(99％的所有值均在正态分布内)加上这十二个切割点血清的平均值，根据这十二个切割点血清的光密度计算每个板的切割点值。
使用4参数拟合算法，根据血清滴定曲线和切割点值的交点计算血清样本的AMA滴度。导致光密度低于MRD的分割点值的血清样本被认为是AMA阴性。
药代动力学分析：使用WinNonlin程序第7.0版作为Phoenix64(Pharsight，NorthCarolina)的一部分进行药代动力学数据分析。用非房室分析(NCA200-202型，IV输注，线性梯形线性插值，输注时间设定为0.5h，从时间点减去0.5h持续到时间点0h)基于经由静脉内输注给药的动物的浓度-时间数据进行药代动力学参数的计算。计算以下药代动力学参数：
AUCinf、AUClast、AUC_％extrapol、Cmax、Tmax、Cl_pred、Vss_pred、t1/2
血清浓度-时间曲线下面积(AUCinf)通过线性梯形公式直到最后取样点(Tlast)并外推至无穷大(假设终末期单指数下降)来确定。使用Clast/λz进行直至无穷大的外推，其中λz表示通过对数线性回归估计的终点速率常数，并且Clast表示借助于终点对数-线性回归在Tlast处估计的浓度。用于该外推的血清浓度-时间点在血清浓度-时间数据表中用(*)标记，并在图13至图17中提供。总血清清除率(Cl_pred)和表观终末半衰期如下计算：Cl_pred＝i.v.剂量/AUCinf，并且t1/2＝ln2/λz。分布Vss的稳态体积由下式确定：Vss＝i.v.剂量·AUMCinf/(AUCinf)2。AUMCinf表示使用与AUCinf计算中所述相同的外推程序外推至无穷大的药物浓度-时间曲线一阶矩下的总面积。
为了计算基于以nmol/L给出的浓度的PK参数，使用78968g/mol的His-MpA分子量将以mg/kg给出的剂量值转化为nmol/kg。通过使用以mg/kg给出的剂量进行曝光数据的剂量归一化。
讨论：
在单次静脉内给药0.1mg/kg测试化合物30min输注后食蟹猴中His-MpA(n＝1)的血清浓度-时间曲线在图10中示出。图10中还示出了相同动物中血清浓度-时间谱与ADA滴度-时间轨迹的组合。输注1mg/kg或10mg/kg的动物的类似数据集分别在图11和图12中示出。接受不同剂量水平的动物的组合血清浓度-时间曲线在图13中示出。接受不同剂量水平的动物的组合血清浓度-时间曲线在图14中示出，对于不同剂量水平，假定受ADA影响的数据点被排除。接受不同剂量水平的动物的组合剂量归一化浓度-时间曲线在图15中示出。在动物的给药前样本中未检测到AMA(或信号非常低)。在向动物静脉内输注0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg剂量水平的His-MpAs后，在施用后直到144h才观察到AMA滴度增加。在所有剂量组中，在144h和192h之间观察到动物中AMA产生的起始。将AMA滴度的升高与动物中His-MpA暴露的快速损失结合。假定不受AMA影响的动物的浓度-时间数据用于通过非房室分析计算PK参数。在单次静脉内输注0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg后针对动物计算的参数在表9中给出。
表9：食蟹猴中His-MpA在单次静脉内输注0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg后的药代动 力学特征
Figure BDA0003494854670000811
用于计算半衰期的浓度-时间数据点在表10中用星号标出，剂量水平分别为0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg。
表10：食蟹猴中His-MpA在单次静脉内输注0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg后的血清 浓度-时间数据
Figure BDA0003494854670000812
*用于计算半衰期(t1/2)的值；
**假定受ADA影响的值，排除在分析之外
BLQ：低于定量限
以0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg的剂量水平向动物单次静脉内施用His-MpA导致在30分钟输注结束后10min至3h观察到Cmax值，该Cmax值随着剂量增加成比例地增加(分别为43nmol/L、337nmol/L和3300nmol/L)。随后，浓度-时间轨迹的进程对于不同的剂量水平是类似的，并且其特征在于血清浓度的快速初始下降，其在化合物施用后持续长达约24h，然后大致呈单指数下降长达144h(0.1mg/kg和1mg/kg)或192h(10mg/kg)。对于给药0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg的动物，单指数期半衰期值分别计算为66h(2.8天)、68h(2.8天)和109h(4.5天)。尽管Cmax值以大致剂量成比例的方式随剂量增加，但暴露(AUCinf)在0.1mg/kg和1mg/kg(分别为2859h*nmol/L和25825h*nmol/L)之间剂量成比例地增加，但略高于在1mg/kg和10mg/kg(分别为25825h*nmol/L和405680h*nmol/L)之间剂量成比例地增加。与接受较低剂量水平(0.00044L/h/kg和0.00049L/h/kg)的动物相比，这导致10mg/kg动物(0.00031L/h/kg)的清除率值较低。在His-MpA的浓度-时间曲线中，1mg/kg和10mg/kg之间的非剂量-线性药代动力学行为是明显的，其中对于0.1mg/kg和1mg/kg剂量观察到较短半衰期，但对于较高剂量观察到较长半衰期。针对分布体积确定的值(0.041L/kg、0.046L/kg和0.048L/kg)表明His-MpA主要限于动物的体循环。
结论：
食蟹猴中His-MpA的药代动力学分析显示，在以0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg的剂量水平单次30min输注His-MpA后，Cmax值以大致剂量成比例的方式随剂量增加。暴露(AUCinf)在0.1mg/kg和1mg/kg之间剂量成比例地增加，但稍高于在1mg/kg和10mg/kg之间剂量成比例地增加。在His-MpA的浓度-时间曲线中，1mg/kg和10mg/kg之间的非剂量-线性药代动力学行为是明显的，其中对于0.1mg/kg和1mg/kg剂量(2.8天)观察到较短半衰期，但对于较高剂量(4.5天)观察到较长半衰期。针对分布体积确定的值表明His-MpA主要限于动物的体循环。
来源于所述研究的His-MpA的药代动力学参数是基于剂量组中的每一者的单只猴(n＝1)的数据。其中在化合物输注后144h和192h之间开始，动物产生AMA。AMA滴度的升高与动物中His-MpA暴露的损失相关联。
实施例7-监测多特异性蛋白质A(MpA)的体内T细胞活化
4-1BB(CD137)是一种共刺激受体，属于TNF受体超家族，并且在造血谱系的多个细胞上表达。最相关的是，4-1BB在活化后在CD8 T细胞上瞬时上调，但也可在NK细胞和活化的CD4+辅助T细胞以及许多其他类型的淋巴细胞和活化的内皮上表达。
评估用MpA治疗对记忆T细胞活化和增殖的影响，并将其与单次静脉内施用于食蟹猴时的抗-4-1BB mAb MOR-7480进行比较。在本研究的整个寿命期收集全血样本，并且通过流式细胞术分析监测T细胞隔室中的变化。
方法：
样本处理和染色：将来自食蟹猴的2×100μl全血样本等分并分别用面板1或面板2染色。面板1和面板2由染色抗体混合物构成。首先，将所有样本与纯化的NA/LE人BD Fc阻断剂(1:200)在室温下一起温育10分钟，然后添加50μl的BD Horizon亮染色缓冲液/样本。接下来，将样本与分别来自面板1或面板2的抗体混合物在黑暗中温育30分钟。然后通过添加2mL的1×FACS裂解溶液裂解样本，并在室温下在黑暗中温育15分钟。在染色缓冲液中洗涤2次后，添加250μl Cytofix/Cytoperm溶液以固定和透化细胞膜，并且在4℃下在黑暗中温育20分钟。温育后，添加3mL 1×Perm/洗涤缓冲液，并在4℃下以500×g离心5分钟。用1mL的1×Perm/洗涤缓冲液进行另外的洗涤。最后，将样本重悬于300μl染色缓冲液中。
样本获取：在BD Biosciences的FACSLyric仪器(序列号R659180000061)中测量样本。
数据分析：使用FlowJo软件第10.0.2版评估具有补偿矩阵的原始fcs。使用GraphPad Prism软件第7版生成汇总图。
结果和讨论
研究概要：给每组一只雌性食蟹猴输注His-MpA或抗4-1BB mAb MOR-7480，如表11所示。
表11：动物研究的生命阶段的研究设计
Figure BDA0003494854670000831
在三个定义的时间点(1.给药前、2.第6天和3.第13天)，从猴中的每一只收集1ml全血放入K3EDTA涂覆管中以防止凝血。在取样后3小时内，在室温下将全血样本转移到BioAgilytix/IPM中用于进一步分析。
收集的全血样本的评估结果：为了评估记忆T细胞之间的增殖，在单次静脉内给药His-MpA或抗4-1BB mAb MOR-7480后的若干时间点，从食蟹猴中分离血样。使用流式细胞术，使用CD95和CD28作为猕猴的中央记忆(CD95+CD28+)和效应记忆(CD95+CD28-)亚群以及初始T细胞(CD95-CD28-)的标记物来标识CD4 T细胞和CD8 T细胞的记忆亚群。分析Ki-67作为增殖标记物；如先前所述CD25、CD69和4-1BB作为T细胞活化标记物进行分析(Fisher等人，Cancer Immunology and Immunotherapy，第61卷，第1721-1733页，2012年)。
门控策略：使用谱系标记物CD4、CD8、CD16、CD28和CD95来定义靶细胞群，如下所述：
1.中央记忆T细胞(Tcm)：CD8(或CD4)+CD28+CD95+
2.效应记忆T细胞(Tem)：CD8(或CD4)+CD28-CD95+
3.初始T细胞(Tn)：CD8(或CD4)+CD28-CD95-
在靶细胞群中的每一者上，监测以下特定标记物的表达以便评估细胞增殖((Ki-67抗原)或活化(4-1BB、CD25、CD69)。
抗4-1BB mAb MOR-7480(但不是His-MpA)增加了血液中T细胞记忆隔室的增殖：在三个定义的时间点处分析新鲜血样显示，来自抗4-1BB mAb MOR-7480治疗组的动物在第13天CD8+Tcm和Tem的显著扩增(数据未示出)。该组中的CD4+Tcm和Tem细胞也显示出一些扩增，但程度低于CD8+细胞。在His-MpA治疗组中的任一者中均未观察到这种扩增。
在用任一化合物治疗后，未检测到CD25和CD69活化标记物的表达增加：在治疗组中的任一者中，CD8+和CD4+记忆T细胞隔室上CD25表达的分析与基线(给药前时间点)相比未显示出任何显著变化。可以预计，CD25在CD8+细胞上的表达是阴性或低的，而CD4+细胞在所有组中均显示出中等但恒定的CD25表达。CD69在整个研究中未在CD4或CD8亚组中的任一者上表达(未示出)。
结论
健康食蟹猴被给予His-MpA或4-1BB激动性mAb MOR-7480，并且通过流式细胞术监测T细胞增殖和活化标记物的表达。相比于抗4-1BB mAb MOR-7480，His-MpA不诱导CD8+或CD4+Tcm和Tem细胞的增殖。
实施例8-MpB证实体内抗肿瘤活性
以下实施例评价了在用人PBMC(MiXeno)重构的HT-29结肠癌异种移植模型中，与抗4-1BB激动性抗体20H4.9和抗FAP-4-1BBL融合蛋白质相比，重复剂量的多特异性结合蛋白质B(MpB)(包含结合小鼠FAP的FAP结合结构域和结合人4-1BB的4-1BB结合结构域的MpA的小鼠替代物)的剂量依赖性功效。该人源化小鼠模型已被描述为提供用于测试免疫检查点和共刺激药物诸如激动性抗4-1BB抗体的免疫刺激功效的合适概念证明。在该模型中用抗4-1BB mAb 20H4.9治疗足以显著减缓肿瘤生长。然而，与未治疗的小鼠相比，它还诱导强全身性效应，诸如加速移植物抗宿主病(GVHD)和肝脏T细胞浸润，从而导致过早死亡。该模型用于评估MpB是否能够增加肿瘤内T细胞浸润并减缓肿瘤生长，同时避免由抗4-1BB mAb20H4.9(非靶向4-1BB激动性单克隆抗体)产生的一些非肿瘤效应。本研究中包括FAP靶向的天然4-1BB配体以用于比较。
材料和方法：
肿瘤实验：给免疫缺陷NOG小鼠在右侧翼区皮下接种HT-29肿瘤细胞(3.5×106)。然后通过注射来自两个健康人供体(3.5×106个细胞/小鼠)的外周血单核细胞(PBMC)来使小鼠人源化。根据如表12所示的预先确定的方案将测试制品施用于携带肿瘤的小鼠。
表12：研究设计-实验组。
Figure BDA0003494854670000851
Figure BDA0003494854670000861
将肿瘤细胞和PBMC接种的日期表示为第0天。每隔3天至4天监测肿瘤生长。在实验的第18天，处死小鼠，移除肿瘤，并通过流式细胞术和定量免疫荧光(QIF)进行研究。肿瘤生长分析限于18天，因为小鼠在这段时间后开始显示GVHD迹象。
流式细胞术：用FlowJo软件(TreeStar)分析来自原始FCS文件的数据。对表达人表面标记物CD45、CD4和CD8的活淋巴细胞进行细胞门控。具有掺入活-死标记染料7-AAD将死细胞从分析中排除。测定人CD8 T细胞的百分比，作为在血液中检测到的总人CD45阳性细胞的百分比。
免疫组织化学：在尸检时从小鼠回收组织，并将组织包埋在最佳切割温度化合物(Sakura)中，并且在不预先固定的情况下冷冻。将OCT包埋的冷冻保存标本切成7μm切片并放在载玻片上。用冷丙酮固定玻片。用以下抗体进行多重免疫荧光染色：抗CD4(山羊Pab，R&D System#AF-379-NA)、抗CD8(兔PAb，Abcam#ab40555)和抗CD45(克隆HI30，Biolegend#304002)。通过抗羊Alexa
Figure BDA0003494854670000862
647(Thermofisher#A21448)、抗兔Rhodamine RedTM-X(Jackson ImmunoResearch#711-296-152)和抗小鼠IgG1-Alexa
Figure BDA0003494854670000863
488(JacksonImmunoResearch#115-545-205)分别检测这些抗体。在Zeiss Axio Scan.Z1玻片扫描仪上获取图像。图像用Zen蓝软件传输并使用ImageJ 1.51n软件进行分析，用FIJI软件包量化人CD45、CD8和CD4 T细胞的数量。
统计分析：用Prism 7.0.2软件(GraphPad软件)进行统计分析。通过使用重复测量双因素方差分析和Tukey多重比较检验(GraphPad Prism，第7.02版)，分析肿瘤生长和体重数据的统计意义上的显著差异。通过Kaplan-Meier方法分析存活率曲线，并通过对数秩检验进行比较。使用单因素方差分析(GraphPad Prism，第7.02版)分析研究结束时的流式细胞术数据。双尾P<0.05被认为是统计意义上显著的。
结果
肿瘤生长：肿瘤生长随时间推移单独追踪(图16和图17)。不同治疗组的平均肿瘤生长曲线在图16中示出。各个小鼠的肿瘤生长曲线在图17中示出。
除了使用依赖性样本T测试对肿瘤接种后第18天获得的数据进行统计分析之外，还通过使用重复测量双因素方差分析然后进行Tukey多重比较检验来分析肿瘤生长数据的统计意义上的显著差异。肿瘤生长抑制汇总于表13中。
表13：治疗的抗肿瘤活性的汇总
Figure BDA0003494854670000871
a.平均值±SEM；b.肿瘤生长曲线的所有时间点的RM双因素方差分析，随后是Tukey多重比较检验与溶媒对照(*p<0.05，**p<0.001)。
与在研究结束时仅分析最终肿瘤体积相比，对整个肿瘤生长曲线的分析给出了更高的分析功效。除了抗4-1BB mAb 20H4.9和MpB 0.32mg/kg组之外，两种分析相关性良好，不同的是双因素方差分析揭示了MPB 1.6mg/kg组的统计意义上的显著性。在抗4-1BB mAb20H4.9(p<0.001)和MpB1.6mg/kg(P<0.05)以及0.32mg/kg治疗组(p<0.001)中肿瘤生长延迟，但在8mg/kg MPB或抗FAP-4-1BBL融合组中肿瘤生长不延迟。抗FAP-4-1BBL融合也示出抑制肿瘤生长的趋势，但效果在统计意义上不显著。施用的溶媒对肿瘤生长没有显著影响。总之，测试物质即抗4-1BB mAb 20H4.9和MpB在皮下HT-29人结肠癌MiXeno模型中展示出显著的抗肿瘤活性。
血液和肿瘤的免疫表型分型：为了确认通过流式细胞术获得的结果，在第18天通过切除的肿瘤中的组织学分析人CD4和CD8 T淋巴细胞密度。使用每组5只小鼠的组织进行组织学检查(数据未示出)。与溶媒组相比，用MpB治疗导致人CD8 T淋巴细胞的浸润更致密。虽然所有测试的MpB剂量以及抗FAP-4-1BBL显示出这种趋势，但差异仅在MpB 0.32mg/kg组中达到显著性(p<0.01；图18A)。另一方面，CD4肿瘤浸润淋巴细胞的数量在所有组中没有显著差异。
移植物抗宿主病：GVHD被认为是测试免疫调节策略的重要模型，其中移植的人T淋巴细胞可通过治疗剂进行调节。在3周至4周后，移植的T淋巴细胞开始浸润脾、肝脏和肺，并在4周至5周后出现严重组织损伤的迹象。用抗4-1BB激动性抗体治疗加速并加剧了由过继转移人T淋巴细胞引起的GVHD。
因此，在过继转移后2周时(数据未示出)，注射3.5×107人PBMC的小鼠在抗4-1BBmAb 20H4.9治疗组中开始减轻体重，并且在大多数情况下，在第18天，需要根据预定义的动物健康终止标准处死，这是由于体重减轻以及呼吸困难、驼背和/或皮毛脱落的迹象。溶媒组中的小鼠在18天的研究期间维持其体重，并且与溶媒组相比，所有其他治疗组均未显示出体重的显著降低。与溶媒对照(数据未示出)相比，抗4-1BB mAb 20H4.9治疗组从第15天开始显示出体重的显著降低(第15天的P<0.01，第17天和第18天的p<0.001)。对小鼠进行了致死GVHD追踪，与对照组相比，在抗4-1BB mAb 20H4.9组中观察到总体存活率显著降低。对照组中没有小鼠死亡，并且未观察到显著的体重减轻。抗4-1BB mAb 20H4.9治疗组中的十只小鼠中的六只(60％)表现出GVHD的强烈迹象，并且死亡或达到≥20％体重减轻的终止判据，并被处死。30只小鼠中的一只(3％)在MpB组中死亡，但没有一只动物表现出大于20％的体重减轻(p<0.001，对数秩检验)。除了在研究早期(治疗1周后)发现死亡的组4中的一只小鼠(MpB，8mg/kg)之外，其他组中的所有小鼠均存活，直到研究在第18天结束(数据未示出)。
尽管事实是PBMC表型分析结果指示外周血中一定程度的CD8 T细胞扩增，但用MpB治疗不导致GVHD加重。另一方面，与MpB和溶媒对照相比，用抗4-1BB mAb 20H4.9治疗导致加速的GVHD，其具有显著增加的体重减轻和死亡率。
总之，由于在研究接近结束(肿瘤细胞/PBMC接种后15天)时GVHD加速发作，因此用抗4-1BB mAb 20H4.9治疗不利地影响体重和总体存活率。与溶媒组相比，用抗FAP-4-1BBL融合或MpB治疗未导致体重减轻和存活率降低，尽管与用抗-4-1BB mAb 20H4.9治疗相比显示出类似的抗肿瘤活性。
肝脏T细胞浸润的组织学分析：使用来自每组5只小鼠的组织对第18天切除的肝脏进行组织学检查。类似于公布的结果，施用抗4-1BB mAb 20H4.9诱导NOG小鼠中人PBMC的肝脏T细胞浸润增加。对按表面积分类为小、中和大的浸润物的定量证实，与溶媒组相比，抗4-1BB mAb 20H4.9诱导显著更大面积的浸润物，并且用FAP靶向4-1BB激动剂MpB和抗FAP-4-1BBL融合蛋白质处理不会诱导肝脏T细胞浸润的增加(图18)。
结论
测试物质即抗4-1BB mAb 20H4.9和MpB在皮下HT-29人结肠癌MiXeno模型中展示出抗肿瘤活性。与溶媒治疗的小鼠相比，用MpB治疗还导致肿瘤中人CD8 T细胞的密度增加。在0.32mg/kg至8mg/kg的测试范围内不存在MpB的明显剂量应答，因为所有剂量均产生类似的人CD8 T细胞百分比的增加，然而对于较低的两个剂量而言抗肿瘤效果是显著的，但对于8mg/kg剂量而言不是显著的。由于在研究接近结束时移植物抗宿主病(GVHD)加速发作，因此用抗4-1BB mAb 20H4.9治疗不利地影响体重和总体存活率。用抗4-1BB mAb 20H4.9治疗还导致浸润到肝脏中的人T细胞增加。相比之下，与溶媒组相比，用MpB和抗FAP-4-1BBL融合蛋白质治疗耐受性良好，并且不导致体重减轻或存活率降低，并且不产生肝脏T细胞浸润增加。
总之，在HT-29人源化异种移植模型中，MpB治疗产生与用抗-4-1BB mAb 20H4.9治疗类似的抗肿瘤活性。与用抗4-1BB mAb 20H4.9治疗相比，MpB增加了人CD8+肿瘤内淋巴细胞的百分比，未加重GVHD，未诱导显著的体重减轻，并且未增加T细胞向肝脏中的浸润。
实施例9：FAP/4-1BB双特异性锚蛋白重复蛋白质结合细胞并经由FAP介导的聚集 活化4-1BB信号传导
据认为4-1BB在细胞表面上的激动剂介导的聚集对于4-1BB信号传导的有效活化是需要的或至少高度有益的。为了测试4-1BB的此类聚集和活化是否也可由FAP/4-1BB双特异性分子介导，测试了各种FAP/4-1BB特异性构建体。
FAP/4-1BB双特异性构建体是通过用BamHI和HidIII消化编码单价4-1BB结合结构域的序列和提供编码FAP结合结构域的序列的载体(pMPCME298)和肽接头(SEQ ID NO:4)以及N末端His标签(SEQ ID NO:56)来克隆的，以便于用BsaI和HidIII进行简单的蛋白质纯化。然后将载体和编码单价4-1BB结合结构域的插入物连接并转化到诱导型大肠杆菌中。通过Microsynth对每个构建体的三个克隆进行测序。然后表达正确的克隆，并使用台式纯化和两个triton洗涤步骤进行纯化。
生成以下FAP-4-1BB双特异性构建体以用于进一步功能测试：
双特异性构建体#44(SEQ ID NO:44，其具有融合至其N末端的His标签(SEQ IDNO:43)，包含SEQ ID NO:3作为4-1BB结合结构域)；
双特异性构建体#45(SEQ ID NO:45，其具有融合至其N末端的His标签(SEQ IDNO:43)，包含SEQ ID NO:51作为4-1BB结合结构域)；
双特异性构建体#46(SEQ ID NO:46，其具有融合至其N末端的His标签(SEQ IDNO:43)，包含SEQ ID NO:52作为4-1BB结合结构域)；
双特异性构建体#47(SEQ ID NO:47，其具有融合至其N末端的His标签(SEQ IDNO:43)，包含SEQ ID NO:53作为4-1BB结合结构域)；
双特异性构建体#48(SEQ ID NO:48，其具有融合至其N末端的His标签(SEQ IDNO:43)，包含SEQ ID NO:54作为4-1BB结合结构域)；以及
双特异性构建体#49(SEQ ID NO:49，其具有融合至其N末端的His标签(SEQ IDNO:43)，包含SEQ ID NO:55作为4-1BB结合结构域)。
作为阴性对照，将对人4-1BB不具有结合特异性的锚蛋白重复结构域(SEQ ID NO:57)克隆到载体中，得到双特异性构建体#50：双特异性构建体#50(SEQ ID NO:50，其具有融合至其N末端的His标签(SEQ ID NO:56)，包含SEQ ID NO:57而不是4-1BB结合结构域)。
FAP-41BB双特异性构建体以高亲和力结合4-1BB和FAP
用SPR研究FAP-41BB双特异性构建体以获得对人4-1BB、cyno 4-1BB和人FAP靶标的准确亲和力数据。
测定设置：简而言之，使用ProteOn XPR36仪器(BioRad)如上所述进行SPR测量。经由中性抗生物素蛋白(约6000RU预涂覆)将生物素酰化的人和食蟹猴4-1BB以及人FAP直接或间接固定在GLC芯片上，分别达到600RU、700RU和2000RU。通过以50nM、16.7nM、5.6nM、1.9nM和0.6nM的系列稀释度注射双特异性构建体，其中120s的缔合和1800s的解离，使用30μl/min的恒定流速来测量FAP-4-1BB双特异性构建体与带涂层的靶标的相互作用。使用10mM甘氨酸pH 2和124mM H3P04在各个测量之间使靶标再生。信号针对运行缓冲液(PBST)处理的对照泳道进行双重参考。
筛选：FAP-4-1BB双特异性构建体的SPR测量结果汇总于表15中。FAP-4-1BB双特异性构建体显示出与人4-1BB的结合亲和力为0.4nM至1.5nM，与食蟹猴4-1BB的结合亲和力为1.1nM至2.9nM，并且与人FAP的结合亲和力为0.1nM至0.4nM。FAP-4-1BB双特异性构建体与hFAP的结合亲和力高于与h4-1BB的结合亲和力。对于所有测试的FAP-4-1BB双特异性构建体，证实了与食蟹猴4-1BB的交叉反应性结合，其中与人4-1BB相比，结合亲和力具有至多约4倍的差异。
表15：FAP-41BB双特异性分子与h4-1BB、c4-1BB和hFAP相互作用的KD值
Figure BDA0003494854670000911
FAP-41BB双特异性构建体活化由FAP诱导的聚类介导的表达4-1BB的细胞中的4- 1BB信号传导
然后进一步测试FAP-41BB双特异性构建体活化经由FAP结合聚集介导的表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导的能力。
测定设置：收获表达人4-1BB和NF-κB-荧光素酶报告基因(参见实施例1)的HT1080细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％PenStrep、1mg/mL G418、100μg/mL Normocin和100μg/mL Zeocin的MEMα培养基+Glutamax中。使用96孔板，将10,000个h4-1BB-HT1080荧光素酶细胞与人FAP涂覆的珠和渐增浓度双特异性构建体在FAP生物素涂覆的链霉抗生物素蛋白珠的存在下一起铺板。将板在37℃、5％CO2下温育20小时。然后收集上清液并在新的96孔板中离心。将QUANTI-Luc试剂(Invivogen，产品目录号rep-qlc1)与上清液混合，并在TecanM1000发光板读取器上读取发光值。通过使用Graphpad Prism软件(第7.02版)将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。
结果：该h4-1BB-HT1080荧光素酶报告基因测定表明，本公开的双特异性构建体在FAP涂覆的珠的存在下显示4-1BB激动作用。4-1BB激动作用依赖于FAP介导的聚集，因为在双特异性构建体中不存在FAP涂覆的珠或不存在FAP结合结构域的情况下，未观察到激动作用。表16提供了双特异性构建体的EC50值：
表16.在FAP珠存在下HT1080细胞中的4-1BB活化：FAP-4-1BB双特异性构建体的 EC50值
Figure BDA0003494854670000921
使用测量在表达FAP的细胞的存在下共培养的表达4-1BB的HT1080细胞中的NF-κB-报告基因活化的测定，进一步测试FAP-4-1BB双特异性构建体在经由FAP结合聚集介导的表达4-1BB的细胞中活化4-1BB信号传导的能力。
表达人FAP的CHO细胞的生成
简而言之，使用编码人FAP的cDNA，通过标准分子生物学技术生成表达载体(pMPMPA13)。使用脂质体用表达载体转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(
Figure BDA0003494854670000922
CCL-121TM)。使用不同浓度的遗传霉素G-418(Promega，V8091)施加选择压力。使用抗FAP抗体通过流式细胞术分析hFAP的表达。选择CHO-FAP转染子的两种不同群体(群体1和群体2)用于进一步实验。FACS分析证实CHO-FAP细胞而非野生型CHO细胞(CHO-wt)在细胞表面上表达hFAP(数据未示出)。
测定设置：收获h4-1BB-HT1080荧光素酶细胞以及CHO-FAP细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％PenStrep、1mg/mL G418、100μg/mL NormocinTM和100μg/mL ZeocinTM的MEMα培养基+Glutamax中。使用96孔板，将40,000个h4-1BB-HT1080个荧光素酶细胞和40,000个CHO-FAP细胞铺板，并且将渐增浓度的FAP-4-1BB双特异性构建体添加到细胞并在37℃、5％CO2下温育。20小时后，收集上清液并在新的96孔板中离心。将QUANTI-Luc试剂(Invivogen，产品目录号rep-qlc1)与上清液混合，并在Tecan M1000发光板读取器上读取发光值。通过使用Graphpad Prism软件(第7.02版)将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。
结果：结果显示，在表达FAP的细胞(群体1)的存在下，所有FAP-4-1BB双特异性构建体在经由FAP结合的聚集介导的表达4-1BB的细胞中诱导4-1BB信号传导至相当的程度。不与4-1BB结合的双特异性构建体#50对4-1BB信号传导没有影响。表17提供了FAP-4-1BB双特异性构建体的EC50值：
表17：在表达FAP的CHO细胞存在下HT1080细胞中的4-1BB活化(群体1)：FAP/4-1BB 双特异性构建体的EC50值
Figure BDA0003494854670000931
用表达FAP的细胞的第二群体(群体2)获得类似的结果。表18提供了双特异性构建体的EC50值：
表18：在表达FAP的CHO细胞存在下HT1080细胞中的4-1BB活化(群体2)：FAP/4-1BB 双特异性构建体的EC50值
Figure BDA0003494854670000932
总之，所有测试的FAP/4-1BB双特异性构建体都能够活化经由FAP结合聚集介导的表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。
实施例10：在存在或不存在多特异性蛋白质下FAP的蛋白酶活性
该实施例描述了FAP活性测定，该测定在各种FAP/4-1BB结合分子的存在下进行，以确定固有FAP酶活性是否在多特异性重组蛋白质结合时受到抑制。
FAP是一种II型单跨膜丝氨酸蛋白酶，其表达在组织重塑位点如肿瘤(例如，在>90％的上皮癌的基质成纤维细胞的表面表达，)、伤口愈合、胚胎组织和炎症位点(例如，动脉粥样硬化/关节炎)上高度上调，而FAP表达在非患病的成人器官中难以检测到。该非典型丝氨酸蛋白酶具有二肽基肽酶(外肽酶)和肽链内切酶活性两者，在脯氨酸后键处切割底物。在结构上，FAP由短细胞质N末端序列(4个氨基酸)、单跨膜螺旋(21个氨基酸)和形成八叶片β-螺旋桨和α/β-水解酶结构域的胞外结构域(735个氨基酸)组成。FAP作为同源二聚体具有活性。FAP蛋白酶活性必需的催化三联体由残基Ser624、Asp702和His734组成。活性位点可通过β-螺旋桨的中心孔或通过β-螺旋桨与水解酶结构域的界面处的腔体进入。
FAP的蛋白酶活性产生多种底物的裂解，包括神经肽Y、I型胶原和α2-抗纤溶酶，而且还产生底物Z-GLY-PRO-AMC，其可被外肽酶或内肽酶活性裂解成可用荧光读取器测量的产物。
在FAP活性测定中测试的分子汇总于表19中。
表19：测定中使用的重组蛋白质
Figure BDA0003494854670000941
H白蛋白结合结构域
F人FAP结合结构域
Figure BDA0003494854670000942
另选的hFAP结合结构域
B人4-1BB结合
N阴性对照(不结合靶标的锚蛋白重复结构域)
FAP活性测定：将rhFAP靶标在测定缓冲液(50mM Tris、1M NaCl、1mg/ml BSA，pH7.5)中稀释至0.22μg/ml，并添加45μl/孔到96孔板(最终浓度，0.03μg/ml(0.3nM))中。如表19所示，通过将5μl 2.7μM分子添加到靶样本中以450倍摩尔过量施加分子1至5(最终浓度135nM)。基准抗FAP抗体(分子编号6)以与分子编号1至5相同的浓度(最终浓度135nM)施加。以不同的稀释度使用蛋白酶抑制剂(PI)混合物(eComplete，不含EDTA，得自Merck)以显示对FAP活性的抑制。将rhFAP/蛋白质或rhFAP/PI混合物以300rpm温育90分钟，然后添加50μl100μM Z-GLY-PRO-AMC底物(最终浓度为50μM)。在测量前，将板在4000rpm下离心2min以移除任何测定干扰气泡。使用手动增益设置为105％的荧光读取器，在380nm激发和460nm发射下，在95分钟期间内每5分钟测量一次荧光。45分钟后的时间点用于分析，其中信噪比大于70。将FAP活性(以％给出)归一化为100％活性(FAP和底物，无分子编号1至6)和0％活性(FAP，在MpA的存在下无底物)的测定对照。进行一式四份测量并以平均值和标准偏差示出。
结果：在第一步骤中，在50μM的固定底物浓度下使用0.01nM至1.2nM的FAP浓度来测量剂量应答曲线。在95分钟的时间段内在0.3nM的rhFAP目标浓度下观察到线性时间依赖性信号增加(每5分钟用0.999的R2测量一次)。为了测定蛋白质结合对FAP的酶活性的影响，该测定在FAP饱和条件下通过以超过FAP 450倍摩尔过量(0.3nM)并超过MpA对人FAP的结合亲和力的300倍(KD＝0.4nM)添加FAP结合分子(例如135nM的MpA)来进行。
如图18所汇总，MpA、MpC和“F”(分子编号1至3)不抑制固有二肽基FAP活性。结果与基准mAb(分子编号6)相当，基准mAb是在结合时也不显示干扰FAP的蛋白酶活性的抗FAP抗体。通过另选的FAP结合分子(
Figure BDA0003494854670000951
分子编号4，用作测定对照)或通过使用蛋白酶抑制剂(PI)混合物观察到部分FAP活性抑制。
结论：MpA(HFBBH)或其FAP结合结构域(F)与FAP的结合不影响FAP的蛋白酶活性，如通过其切割荧光底物Z-GLY-PRO-AMC的能力所测量。
实施例11：多特异性蛋白质的另选设计的比较
该实施例描述了多特异性蛋白质的另选设计的比较分析，特别是FAP结合结构域、4-1BB结合结构域和HSA结合结构域的顺序。
通过评估在表达FAP的CHO细胞的存在下共培养的表达人4-1BB的HT1080细胞中的NF-κ-活化，以与实施例1中所述类似的方式进行HT1080报告基因测定。
测定设置：收获NF-κB-荧光素酶人-4-1BB HT1080细胞以及CHO-hFAP细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％PenStrep、1mg/mL G418、100μg/mL NormocinTM、100μg/mLZeocinTM的MEMα培养基+Glutamax中。使用96孔板，将40,000个h4-1BB-HT1080个荧光素酶细胞和40,000个CHO-hFAP细胞铺板，并且将渐增浓度的多特异性蛋白质分子添加到细胞并在37℃、5％CO2下温育。20小时后，收集上清液并在新的96孔板中离心。将QUANTI-Luc试剂(Invivogen，产品目录号rep-qlc1)与上清液混合，并在Tecan M1000发光板读取器上读取发光值。通过使用Graphpad Prism软件(第7.02版)将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。
表达人FAP的CHO细胞的产生：用含有人成纤维细胞活化蛋白质(FAP)(Uniprot登录号Q12884或NCBI参考序列NM_004460.4)序列的质粒pMPMPA13转导中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(
Figure BDA0003494854670000961
CCL-121TM)。更详细的描述可见于实施例1中。
表达人4-1BB和NF-κ-荧光素酶的HT1080细胞的产生：用含有从OriGeneTechnologies(#RC200664)获得的人4-1BB(带Myc-DDK标签)的cDNA的质粒转导纤维肉瘤细胞系HT1080(
Figure BDA0003494854670000962
CCL-121TM)，该质粒含有受CMV启动子和新霉素抗性基因控制的人4-1BB的序列(UniProt登录号Q07011或NCBI参考序列NM_001561)。在补充有10％(v/v)FBS和G418
Figure BDA0003494854670000963
的最低必需培养基(MEM)α培养基+Glutamax中培养细胞。使用小鼠抗人4-1BB抗体克隆4B4-1(BD PharmingenTM，产品目录号：550890)通过流式细胞术评估4-1BB转导的HT1080细胞的人4-1BB表达。使用相同抗体通过流式细胞术对转染的细胞进行分选，以便富集表达HT1080细胞的h4-1BB群。使用脂质体用NF-κB-荧光素酶报告基因质粒pNiFty3-N-Lucia(Invivogen，产品代码pnf3-lc2)进一步转染h4-1BB HT1080细胞，该质粒含有在NF-κB调控的小鼠干扰素β最小启动子和ZeocinTM抗性基因控制下的分泌型荧光素酶报告基因。在补充有10％(v/v)FBS、G418
Figure BDA0003494854670000964
ZeocinTM(Invivogen，产品目录号ant-zn-1)和NormocinTM(Invivogen，产品目录号ant-nr-1)的最低必需培养基(MEM)α培养基+Glutamax中培养转染的细胞。将一群h4-1BB-HT1080-Lucia细胞用于该测定。
图19A显示，在表达FAP的细胞的存在下，所有测试的多特异性蛋白质的类型设计在相当程度上诱导4-1BB信号传导，这通过经由定位子的聚集介导的。表20提供了这些另选多特异性蛋白质设计的EC50值。图19B汇总了小鼠中药代动力学研究的结果。表21汇总了图19B中所示的数据。
数据显示，在若干类型设计中，与所有测试形式的变体相比，形式HFBBH(MpA)显示出改善的血清半衰期，同时具有相当的功能活性。
表20
多特异性蛋白质构建体 EC50[nM]
HHFBB 0.45
HFBBH 0.41
HFBHB 0.30
BHFBH 0.51
HFHBB 0.22
HBFBH 0.46
表21
Figure BDA0003494854670000971
实施例12：人剂量选择的PK/PD模型外推
在该实施例中，药代动力学研究预测，在宽剂量范围内，MpA的人半衰期为5.9天至14天。根据组合PK/PD模型的预测提供：(i)具有最小预计全身性PD效应的人起始剂量(基于0.015mg/kg下的20％受体占用)，(ii)预期治疗最佳剂量范围(0.5mg/kg至5mg/kg)，以及(iii)可超过最大治疗效应的剂量水平(12mg/kg)，以用于最佳剂量范围确认。参见图20，其示出了在阴影区域中具有预测区间的人中各种生物标记物对剂量的影响％的预测。
开发了翻译数学模型，其使得能够基于非临床物种数据预测MpA在人中的临床药代动力学、药效学和抗肿瘤效应，并且提供对1期起始剂量和方案的支持证明。
该分析的主要目的是使用非临床物种数据来预测人血清/血液和肿瘤中的MpA药代动力学(PK)和药效动力学(PD)。食蟹猴和小鼠中的非临床PK信息用于建立最小PBPK(mPBPK)模型，假设根据它们的内皮血管系统将一些生理隔室聚集在一起，这些生理割室可翻译为人的。对小鼠中PK和多种PD生物标记物终点之间的关系，诸如4-1BB受体在血液中的占用，以及血清中可溶4-1BB浓度(sCD137)的时间进程和血液/肿瘤中CD8/CD4 T细胞比率的变化进行建模，并在并入人PK预测后，将其用于预测预计的人PD效应。
这些分析旨在将非临床PK和PD数据整合以引导两部分中的人预测剂量：(i)通过异速生长标度和mPBPK模型根据小鼠和猴数据预测血清和肿瘤中人PK暴露；以及(ii)使用小鼠来源的PKPD关系并考虑任何人结合体外参数来预测人PD效应。
使用组织体积和淋巴流动的基于生理学的参数，可使用相同的方法描述MpA在小鼠、猴和人中的药代动力学。药代动力学向人的翻译基于异速生长标度的清除率(基于体重)，并且构成了用于预测MpA在人中的药效动力学效应的基础。此外，将关于FAP结合分子和非FAP结合分子两者的数据整合到模型中还使得能够表征作为该药代动力学模型的一部分的MpA与FAP结合的动力学。
药效动力学标记物各自通过不同的药代动力学-药效动力学模型描述：用于4-1BB受体占用的Emax模型，以及描述血液和肿瘤中CD8/CD4 T细胞比率的钟形剂量应答的结合刺激和抑制Emax模型。这些模型中的每一者均可充分描述小鼠模型中观察到的药效动力学。随后，在小鼠和人药效动力学类似的假设下，并基于人MpA浓度-时间曲线的异速生长预测，对标记物中的每一者进行人剂量应答的预测。预测表明，就CD8/CD4比率而言，用2mg/kgMpA Q3W的剂量方案实现了最佳应答。在提出的0.015mg/kg的起始剂量下，预计具有极小的生物效应(CD8/CD4比率增加约20％或更小)。即使由于靶标结合(主要是FAP)的饱和而预期在MpA的药代动力学中存在一些非线性，但预测这些非线性仅在较高剂量(>5mg/kg)下发生，其中预计药代动力学效应变得次优。因此，提出了在队列之间MpA剂量增加标准3倍的递增方案用于临床研究。
总之，该分析提供了对MpA的人群人mPBPK和PKPD群体的见解。PD模拟的结果表明，在2mg/kg的剂量下实现了最佳的生物标记物应答。然后成功地采用群体PK模拟来帮助建议每3周给药将足以递送足够的平均暴露量以引起最大生物标记物应答，并且考虑到不存在关于安全问题的暴露范围，不模拟另外的人类给药计划表。结论是0.015mg/kg的MpA给药方案将是用于评价患有实体瘤的患者的首次人体(FIH)研究的适当起始剂量。
按照本说明书内引用的参考文献的教导内容最彻底地理解本说明书。本说明书内的实施方案提供了对本发明实施方案的说明，并且不应理解为限制本发明的范围。技术人员容易认识到，本发明涵盖许多其他实施方案。本公开中引用的所有出版物、专利和GenBank序列均全文以引用方式并入。在以引用方式并入的材料与本说明书矛盾或不一致的程度上，本说明书将取代任何此类材料。对本文任何参考文献的引用不是承认此类参考文献是本发明的现有技术。
本领域的技术人员将认识到或能够仅使用常规实验来确定本文描述的本发明的特定实施方案的许多等同物。此类等同物旨在由以下实施方案涵盖。
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Claims (21)

1.一种重组蛋白质，所述重组蛋白质包含：
特异性结合成纤维细胞活化蛋白质(FAP)的第一锚蛋白重复结构域、特异性结合4-1BB的第二锚蛋白重复结构域、特异性结合4-1BB的第三锚蛋白重复结构域、特异性结合血清白蛋白的第四锚蛋白重复结构域以及特异性结合血清白蛋白的第五锚蛋白重复结构域，
其中所述锚蛋白重复结构域根据下式从N末端到C末端排列：(血清白蛋白结合结构域)-(FAP结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(4-1BB结合结构域)-(血清白蛋白结合结构域)。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的重组蛋白质，其中所述FAP结合结构域包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人4-1BB。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组蛋白质，其中所述4-1BB结合结构域中的每一者包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组蛋白质，其中所述N末端血清白蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人血清白蛋白。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组蛋白质，其中所述N末端血清白蛋白结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组蛋白质，其中所述C末端血清白蛋白结合结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人血清白蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组蛋白质，其中所述C末端血清白蛋白结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组蛋白质，所述重组蛋白质从N末端到C末端包含下式：(血清白蛋白结合结构域)-(连接基)-(FAP结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(4-1BB结合结构域)-(连接基)-(血清白蛋白结合结构域)，其中所述连接基包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
11.一种重组蛋白质，所述重组蛋白质包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。
12.一种重组蛋白质，所述重组蛋白质包含与SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且以10nM或低于10nM的KD值结合人FAP、人4-1BB和人血清白蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的重组蛋白质，其中所述蛋白质具有如通过体外IFNγ释放测定所评估的约0.1nM至约5nM的半最大有效浓度(EC50)。
14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至13中任一项所述的重组蛋白质，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
15.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1至13中任一项所述的重组蛋白质。
16.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求15所述的核酸分子。
17.一种制备根据权利要求1至13中任一项所述的重组蛋白质的方法，所述方法包括在其中表达所述重组蛋白质的条件下培养根据权利要求16所述的宿主细胞。
18.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向对其有需要的受试者施用有效量的根据权利要求1至13中任一项所述的重组蛋白质或根据权利要求14所述的药物组合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述受试者是人。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的方法，其中所述癌症是实体瘤。
21.根据权利要求1至13中任一项所述的重组蛋白质或根据权利要求14所述的药物组合物用于治疗癌症。
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