JP2023546269A - Ｔ細胞を増殖させるための二重特異性コンストラクトおよび関連する方法 - Google Patents

Abstract

本明細書において、ＣＤ３経路およびＣＤ２８経路の両方を刺激する二重特異性ｓｃＦｖコンストラクトが記載される。通常、本コンストラクトは可溶性であり、ヒトＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで活性化、増殖、および分化する。また、関連する組成物および方法、たとえばＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖、活性化、および／または分化するための方法、ならびにがんを処置する方法が記載される。【選択図】図１

Description

本発明は、Ｔ細胞に関する。特に本発明は、Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させるための二重特異性コンストラクト、ならびに関連する組成物および方法に関する。

養子細胞移入（ＡＣＴ）は、患者への細胞の移入である。この細胞は、患者起源であってもよく、または別の個体を起源としてもよい。この細胞は、最も一般的には、免疫の機能性および特徴を改善する目的にて、免疫系に由来する。自家性がん免疫療法では、Ｔ細胞は患者から抽出され、遺伝子改変され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され、同患者に戻される。

自家性腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または遺伝子的にリダイレクトされた末梢血単核球の養子移入は、メラノーマおよび結腸直腸癌を含む進行性固形腫瘍を有する患者、ならびにＣＤ１９発現血液系腫瘍、子宮頸がん、リンパ腫、白血病、胆管がん、および神経芽細胞腫、肺がん、乳がん、肉腫、メラノーマ、混合型白血病（ＭＬＬ）の再編成を保有するＢ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）を含む再発性および難治性ＣＤ１９＋Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者を処置するために、実験的に使用されている。制御性Ｔ細胞の移入は、１型糖尿病および他の自己免疫疾患を処置するために使用されている。

Ｌｏｆｆｌｅｒら（２０００； Ｂｌｏｏｄ； ９５：２０９８－２１０３および米国特許第７５７５９２３号）は、ＣＤ１９抗原およびＣＤ３抗原にそれぞれ特異的な少なくとも２つの結合部位を含む新規の一本鎖多機能性ポリペプチドを記載している。さらに、好ましくは予め決定された機能の、少なくとも１つのさらなるドメインを含むポリペプチドが提供される。さらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび上記ポリヌクレオチドを含むベクターおよびそれを用いて形質転換された宿主細胞および上記ポリペプチドの産生におけるそれらの使用が記載されている。さらに、上述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、またはベクターのいずれかを含む組成物、好ましくは医薬組成物および診断用組成物が提供される。また、好ましくは非ホジキンリンパ腫などのＢ細胞悪性腫瘍に対する、免疫療法のための医薬組成物の調製のための上述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびベクターの使用が記載されている。

Ｇｒｏｓｓｅ－Ｈｏｖｅｓｔら（２００３； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．； ３３：１３３４－１３４０および米国特許第７５３８１９６号）は、軽鎖（Ｖ_Ｌ）上に可変ドメイン、および重鎖（Ｖ_ｈ）上でそれに結合したＴ細胞受容体ＣＤ－２８に関する可変ドメインを伴う少なくとも１つの結合部位を含む第１の二重特異性抗体分子を記載している。この抗体分子は、重鎖（Ｖ_Ｈ）上に可変ドメイン、および軽鎖（Ｖ_Ｌ）上でそれに結合した腫瘍抗原に関する可変ドメインを伴う少なくとも１つの結合部位をさらに含む。両方の特異性に関する重鎖上の可変ドメインは、ペプチドリンカーにより互いに結合している。第２の二重特異性抗体分子は、ＣＤ－２８に対して二価であり、腫瘍抗原に対して少なくとも一価である。

ＣＤ３およびＣＤ２８の両方に係合する二重特異性抗体またはビーズの出現にもかかわらず、Ｔ細胞を増殖させるための別の有効なコンストラクトおよび組成物、ならびに関連する方法の開発が必要とされている。

一態様では、ＣＤ３経路およびＣＤ２８経路の両方を刺激する二重特異性ｓｃＦｖコンストラクトが提供される。

一態様では、本コンストラクトは可溶性である。

一態様では、本コンストラクトは、ヒトＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで活性化、増殖、および分化する。

一態様では、本コンストラクトは、フェムトモル濃度の範囲、たとえば約１０～約５００ｆＭ、たとえば約１７０ｆＭの濃度で活性である。

一態様では、本コンストラクトは、固定化された抗ＣＤ３ ｍＡｂ／可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂまたは可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂ複合体を含む方法と比較して１２日間の過程にわたりヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の優先的な増殖を促進する。

一態様では、本コンストラクトは、ＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の表現型の増殖を優先する。

一態様では、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、上記コンストラクトのＮ末端にあり、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは上記コンストラクトのＣ末端にある。

一態様では、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは上記コンストラクトのＮ末端にあり、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは上記コンストラクトのＣ末端にある。

一態様では、本コンストラクトは、１つ以上の可動性リンカー、たとえば１、２、または３つの可動性リンカーを含む。

一態様では、本コンストラクトは、各ｓｃＦｖの各重鎖および軽鎖ドメインの間に可動性リンカー、ならびに各ｓｃＦｖの間に可動性リンカーを含む。

一態様では、本コンストラクトは、１：１のモル比でＴＣＲの活性化および共刺激のためのシグナルの両方に係合する。

一態様では、本コンストラクトは、精製タグおよび／または検出タグを含む。

一態様では、本コンストラクトは、ヒスチジンタグを含む。

一態様では、本コンストラクトは、配列番号１：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬＭＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＡＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＮＦＳＬＮＩＨＰＶＤＥＤＤＶＡＭＹＦＣＱＱＳＲＫＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＫＬＱＱＳＧＰＧＬＶＴＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＱＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＫＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ
と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそのフラグメントを含むかまたはからなる。

一態様では、本コンストラクトは、配列番号１と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するポリペプチド、またはそのフラグメントを含むかまたはからなる。

一態様では、本コンストラクトは、配列番号１を有するポリペプチドを含むかまたはからなる。

一態様では、本明細書中記載のコンストラクトをコードするポリヌクレオチドが提供される。

一態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号２：
ｇａｃａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃａｃａｇａｇｃｃｃｔｇｃｔｔｃｔｃｔｇｇｃｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｇａｇｃｃａｃｃａｔｃａｇｃｔｇｔａｇａｇｃｃａｇｃｇａｇａｇｃｇｔｇｇａａｔａｔｔａｃｇｔｇａｃｃａｇｃｃｔｇａｔｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｃｃｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｃｃｔａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔｔｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａａｔｇｔｇｇａａａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｇａｔｔｔｔｃｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇａａｃａｔｔｃａｃｃｃｃｇｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇａｃｇｔｇｇｃｃａｔｇｔａｃｔｔｔｔｇｃｃａｇｃａｇａｇｃａｇａａａｇｇｔｇｃｃｃｔａｃａｃｃｔｔｔｇｇｃｇｇａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇｇａａａｔｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａａｇｃｇｇａｇｇｃｇｇｃｇｇａｔｃｔｃａａｇｔｇａａａｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｃａｃａｃｃｔｔｃｔｃａｇａｇｃｃｔｇａｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｃｔｔｔａｇｃｃｔｇａｇｃｇａｔｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｃｃｇａｃａｇｔｃｔｃｃａｇｇａｃａａｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｃｔｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃａａａｃｔａｃａａｃａｇｃｇｃｃｃｔｇａｔｇａｇｃｃｇｇａａｇｔｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃａｇｇｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇａｔｇａａｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｇａｃｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｔｔｇｃｇｃｃａｇａｇａｃａａｇｇｇｃｔａｃａｇｃｔａｃｔａｃｔａｃａｇｃａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａｃｃｇｔｇａｃａｇｔｔａｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔａｃａａａｇｇｇｃｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｃｔｇｇａａｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｔｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａａｇｔｇａｔａｔｔａａｇｃｔｇｃａｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｃｃｇａｇｃｔｇｇｃｔａｇａｃｃｔｇｇｔｇｃｃｔｃｔｇｔｇａａｇａｔｇａｇｃｔｇｃａａｇａｃｃａｇｃｇｇｃｔａｃａｃｃｔｔｃａｃｃａｇａｔａｃａｃｃａｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｃａａｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｇａｃａｇｇｇａｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇｃｔａｃａｔｃａａｃｃｃｃａｇｃｃｇｇｇｇｃｔａｃａｃｃａａｃｔａｃａａｃｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇａｃａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇａｃｃａｃｃｇａｃａａｇａｇｃａｇｃａｇｃａｃａｇｃｃｔａｃａｔｇｃａｇｃｔｇａｇｃａｇｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇａａｇａｔａｇｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｃｃｇｇｔａｃｔａｃｇａｃｇａｃｃａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｇａｔｔａｔｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇａａｃａａｃｃｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｔａｇｔｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｔｇｇａｔｇａｔａｔｃｃａｇｃｔｇａｃｔｃａｇｔｃｃｃｃｔｇｃｃａｔｃａｔｇｔｃｔｇｃｔａｇｃｃｃｔｇｇｃｇａｇａａａｇｔｇａｃｃａｔｇａｃｃｔｇｃａｇａｇｃｃａｇｃａｇｃｔｃｃｇｔｇｔｃｃｔａｃａｔｇａａｃｔｇｇｔａｔｃａａｃａａａａｇａｇｃｇｇｃａｃａａｇｃｃｃｃａａｇｃｇｇｔｇｇａｔｃｔａｃｇａｔａｃａａｇｃａａｇｇｔｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃｔａｔａｇａｔｔｔｔｃｔｇｇａａｇｃｇｇａｔｃｃｇｇｃａｃｃａｇｃｔａｃｔｃｃｃｔｇａｃａａｔｃａｇｃａｇｃａｔｇｇａａｇｃｃｇａｇｇａｔｇｃｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃａａｃａｇｔｇｇｔｃｃａｇｃａａｔｃｃｃｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｇａｇｃｃｇｇａａｃａａａｇｃｔｇｇａａｃｔｇａａｇｃａｃｃａｃｃａｃｃａｔｃａｃｃａｃ
と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそのフラグメントを含むかまたはからなる。

一態様では、本明細書中記載のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。

一態様では、上記ベクターを含む宿主細胞が提供される。

一態様では、本明細書中記載のコンストラクトと担体とを含む組成物が提供される。

一態様では、上記のコンストラクト、ポリヌクレオチド、宿主細胞、または組成物は、養子Ｔ細胞療法のためのものである。

一態様では、上記のコンストラクト、ポリヌクレオチド、宿主細胞、または組成物は、Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させるためのものである。

一態様では、上記のコンストラクト、ポリヌクレオチド、宿主細胞、または組成物は、がんを処置および／または予防するためのものである。

一態様では、Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖、活性化、および／または分化するための方法であって、Ｔ細胞を本明細書中記載のコンストラクトとインキュベートするステップを含む、方法が提供される。

一態様では、本コンストラクトは、約１０～約５００ｆＭ、たとえば約１７０ｆＭの濃度で使用される。

一態様では、インキュベートは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間、たとえば約１２日間の期間である。

一態様では、本明細書中記載の方法により作製されるＴ細胞が提供される。

一態様では、がんを処置するための方法であって、本明細書中記載のＴ細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法が提供される。

本発明の新規の特性は、以下の本発明の詳細な説明の検討により当業者に明らかとなるであろう。しかしながら、提示される本発明の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の特定の態様を表すが、本発明の趣旨および範囲内の様々な変更および修正が本発明の詳細な説明および続く特許請求の範囲から当業者に明らかとなるため、例示的な目的でのみ提供されていることを理解すべきである。

本発明は、以下の図面を参照して以下の説明からさらに理解されるであろう。

Ｔ－ＣＥＰの設計および精製。（Ａ）Ｔ－ＣＥＰ、Ｔ細胞増殖タンパク質の構造を表す略図。Ｔ－ＣＥＰは、短い可動性リンカー（リンカー２）によりＣＤ３結合ｓｃＦｖに結合したＮ末端のＣＤ２８を標的とするｓｃＦｖから構成される二重特異性作用物質である。両ｓｃＦｖは、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）の直鎖状アセンブリとしてさらに定義される。ヒスチジンタグ（６×Ｈｉｓ）が、精製および検出の目的のためＴ－ＣＥＰのＣ末端に挿入された。（Ｂ）組み換え型Ｔ－ＣＥＰが、ＨＥＫ ２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３発現系）で産生され、Ｎｉ－ＮＴＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製された。この純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（左のパネル；クーマシー染色）およびウェスタンブロット（右のパネル；抗Ｈｉｓタグ抗体を使用して検出）により確認された。タンパク質は、約６０ｋＤａのバンドとして移動する。 ヒトＣＤ３およびヒトＣＤ２８の細胞外ドメインへのＴ－ＣＥＰの結合の性質決定。（Ａ）ある範囲のＴ－ＣＥＰ濃度にわたる組み換え型のヒトＦＣタグ付けされたＣＤ３ε／δおよび組み換え型のヒトＦｃタグ付けされたＣＤ２８へのＴ－ＣＥＰの結合を表す表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーグラム。（以下の）表は、ＳＰＲセンサーグラムから計算したＴ－ＣＥＰ結合動態のパラメータをまとめている。結合速度定数（ｋ_ａ）、解離速度定数（ｋ_ｄ）、および解離定数（Ｋ_Ｄ）は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用し１：１の結合モデルを使用して計算した。（Ｂ）プレートに結合した組み換え型ヒトＣＤ３－ＦｃまたはＩｇＧ対照（ｎ＝３）への可溶性Ｔ－ＣＥＰの結合を確認した酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。その後、ＣＤ３に結合したＴ－ＣＥＰは、ビオチン化組み換え型ヒトＣＤ２８－Ｆｃコンストラクト、次に、ストレプトアビジン－ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出した。^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。 Ｔ－ＣＥＰは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して示されるように、標的抗原に結合する。サンドイッチＥＬＩＳＡは、９６ウェル高タンパク質結合プレートのウェルをＴ－ＣＥＰ（４μｇ／ｍＬ）でコーティングすることにより行われ、これは標的抗原とインキュベートされた。組み換え型ヒトＣＤ３εδ－Ｆｃ（４μｇ／ｍＬ）、組み換え型ヒトＣＤ２８－Ｆｃ（４μｇ／ｍＬ）、およびＦｃが一致する対照（４μｇ／ｍＬ）は、抗ｈｉｇＧ－ＨＲＰコンジュゲートを使用して検出した（ｎ＝３）。用語：ｒｈＣＤ３εδ、組み換え型ヒトＣＤ３εδ－Ｆｃ；ｒｈＣＤ２８、組み換え型ヒトＣＤ２８－Ｆｃ；記号：^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。 低濃度のＴ－ＣＥＰは、ヒトＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの活性化および増殖を促進する。（Ａ）サイトカインを添加することなく、Ｔ細胞増殖条件に５日間曝露した後のヒトＴ細胞の増殖状態を表す代表的なＣＦＳＥプロファイル。固定化された抗ＣＤ３（ｉ αＣＤ３）および可溶性抗ＣＤ２８（ｓ αＣＤ２８）アゴニストｍＡｂを、それぞれ５μｇ／ｍＬおよび２μｇ／ｍＬの作業濃度で使用し、ウェル中の可溶性四量体抗体複合体（ＴＡＣ；ＳＴＥＭＣＥＬＬ）の最終的な濃度は、約１．５μｇ／ｍＬであった。Ｔ－ＣＥＰは、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度までウェルに分注した。（Ｂ）細胞増殖条件にｅｘ ｖｉｖｏで曝露したヒトＴ細胞で５日目に観察した代表的なサイトカイン分泌レベル。用語：ＴＡＣ、四量体抗体複合体；ｉαＣＤ３、固定化された抗ＣＤ３；ｓαＣＤ２８、可溶性抗ＣＤ２８。記号：^＊Ｐ＜０．０５；□、Ｔ－ＣＥＰ；○、ＴＡＣ；◇、ｉαＣＤ３＋ｓαＣＤ２８；△、ｉαＣＤ３。 １２日間にわたる活性化したヒトＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖のモニタリング。（Ａ）３名のドナーから精製したヒトＴ細胞の１２日間の増殖。生細胞数は、トリパンブルーでの死細胞の染色により、血球計数器を使用して計測した（ｎ＝２）。（Ｂ）３名のドナーのＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋およびＣＤ８＋のＴ細胞のサブセットの増殖プロファイル。Ｔ細胞増殖からの細胞数は、フローサイトメトリーにより決定したＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋のＴ細胞のパーセンテージに沿って使用した。倍数増殖は、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の開始数に基づき決定した。１２日目の、３名のドナー由来のＴ細胞のサブセットの倍数増殖の平均値は、Ｔ－ＣＥＰが他の刺激条件と比較して最も高いＣＤ８^＋Ｔ細胞の倍数増殖を有することを表し、また一方でＴＡＣは、有意に高いＣＤ４^＋Ｔ細胞の増殖を示した。（Ｃ）１２日間の培養後のフローサイトメトリーにより定義される生きたリンパ球の総数と比較した活性化したヒトＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋のＴ細胞集団のパーセンテージ。３名のドナーに基づき、Ｔ－ＣＥＰ（ｐ＝０．０１２）または固定化したｉαＣＤ３および可溶性ｓαＣＤ２８ ｍＡｂの組み合わせ（ｐ＝０．０１８）でＣＤ３およびＣＤ２８を標的とすることは、可溶性ＴＡＣよりも有意に多くのＣＤ８^＋ヒトＴ細胞の増殖を優先した。用語：ＴＡＣ、四量体抗体複合体；ｉαＣＤ３、固定化された抗ＣＤ３；ｓαＣＤ２８、可溶性抗ＣＤ２８。記号：^＊Ｐ＜０．０５；□、Ｔ－ＣＥＰ；○、ＴＡＣ；◇、ｉαＣＤ３＋ｓαＣＤ２８；△、ｉαＣＤ３。 １２日間のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖期間にわたる刺激後のヒトＴ細胞の活性化。３名のドナー由来のヒトＴ細胞上の表面マーカーの存在が、フローサイトメトリーにより分析された。（Ａ）個々の刺激条件に曝露した活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ３８の表面発現。活性化マーカーでの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）の増加は、刺激前の０日目のＭＦＩを減算することにより計算した。両活性化マーカーのＭＦＩ値は、３名全てのドナーで１２日目までにベースラインの値まで減少した。Ｔ－ＣＥＰは、最も高い活性化マーカーの平均発現を示したが、ＭＦＩ値の間に有意差はなく、１２日目までに活性化マーカーは、処置前のレベルに戻った。（Ｂ）ヒトＴ細胞でのＰＤ－１マーカーおよびＬＡＧ－３マーカーの共発現は、３日目までにピークとなり、１２日目までに処置前のレベルに戻った。ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるピークを測定した時点での疲弊マーカーの共発現の間に有意差はなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞では、これらマーカーの発現は、Ｔ－ＣＥＰで刺激した細胞では３日目に増加したが、他の活性化方法の場合、９日目までにベースラインの値に戻った。用語：ＴＡＣ、四量体抗体複合体；ｉαＣＤ３、固定化された抗ＣＤ３；ｓαＣＤ２８、可溶性抗ＣＤ２８。記号：^＊Ｐ＜０．０５；□、Ｔ－ＣＥＰ；○、ＴＡＣ；◇、ｉαＣＤ３＋ｓαＣＤ２８；△、ｉαＣＤ３。 Ｔ－ＣＥＰは、あまり分化していないヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞表現型へのＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの分化を優先する。（Ａ）指定された処置を使用したそれらの活性化および増殖の後の１２日目でのＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ２７、ならびにＣＤ８^＋ＣＤ２７＋のヒトＴ細胞の発現を強調する代表的なサイトメトリープロット。（Ｂ）３名のドナー由来のＣＤ４^＋集団のパーセンテージとしてのＣＤ４５ＲＡマーカーおよびＣＤ２７マーカーの１２日目での表面の発現。ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋Ｔ細胞のサブセット集団では、Ｔ－ＣＥＰで処置した細胞は、固定化された抗ＣＤ３（ｉ αＣＤ３）で処置した細胞と比較して高いレベルのＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^＋Ｔ細胞を表す（ｐ＝０．００９８）。（Ｃ）３名のドナー由来のＣＤ８^＋集団のパーセンテージとしてのＣＤ４５ＲＡマーカーおよびＣＤ２７マーカーの１２日目での表面発現。Ｔ－ＣＥＰは、ｉ αＣＤ３単独（ｐ＝０．００１６）と比較するか、またはｉ αＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８の組み合わせ（ｓ αＣＤ２８；ｐ＝０．０３１８）と比較して、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^＋集団を有意に増大させる。また、Ｔ－ＣＥＰは、ｉ αＣＤ３（ｐ＝０．００１８）、ｉ αＣＤ３およびｓ αＣＤ２８と比較するか（ｐ＝０．００４２）、または可溶性四量体抗体複合体（ＴＡＣ）で活性化する場合（ｐ＝０．０１８５）と比較して、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^－集団を有意に低減する。（Ｄ）３名のドナーから回収したヒトＴ細胞サンプルで観察された１２日目での生きたＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋リンパ球 生きたＣＤ３^＋リンパ球のパーセンテージ。ＣＤ８およびＣＤ２７を共発現するＴ－ＣＥＰで刺激したＴ細胞は、ｉ αＣＤ３単独（ｐ＝０．００１６）、ｉ αＣＤ３およびｓ αＣＤ２８（ｐ＝０．００１７）、ならびにＴＡＣ（ｐ＝０．０００７）のいずれかで処置した細胞と比較して、生きたリンパ球集団の合計の６０．８０％を構成した。（Ｅ）各処置様式からの１２日目でのＣＤ８^＋Ｔ細胞でのＣＤ２７発現（ΔＭＦＩ）。ΔＭＦＩは、適切なアイソタイプ対照のＭＦＩ値を減算することにより計算した。ＣＤ２７を発現するＣＤ８^＋Ｔ細胞のサブセットは、他の刺激方法［ｉ αＣＤ３（ｐ＝０．０００８）、ｉ αＣＤ３およびｓ αＣＤ２８（ｐ＝０．００１０）、ならびにＴＡＣ（ｐ＝０．００５９）］と比較してＴ－ＣＥＰで刺激したＴ細胞において有意に高い。（Ｆ）１２日間にわたるＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の増殖は、他の刺激条件［ｉ αＣＤ３（ｐ＝０．００２）、ｉ αＣＤ３およびｓ αＣＤ２８（ｐ＝０．００９５）、ならびにＴＡＣ（ｐ＝０．００８５）］でよりもＴ－ＣＥＰで処置した場合に、実質的に高かった。用語、ＴＡＣ、四量体抗体複合体；ｉαＣＤ３、固定化された抗ＣＤ３；ｓαＣＤ２８、可溶性抗ＣＤ２８。記号：^＊Ｐ＜０．０５；^＊＊Ｐ＜０．００５；^＊＊＊Ｐ＜０．０００５。

詳細な説明
定義
他の意味が説明されない限り、本明細書中使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ Ｖ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－１９－８５４２８７－９）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．， １９９４ （ＩＳＢＮ ０－６３２－０２１８２－９）；およびＲｏｂｅｒｔ Ａ． Ｍｅｙｅｒｓ （ｅｄ．）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ．， １９９５（ＩＳＢＮ １－５６０８１－５６９－８）で見出され得る。本明細書中に記載されるものと同様または均等の全ての方法および材料が本発明の試験のための実務において使用され得るが、通例の材料および方法が本明細書に記載されている。本発明を説明および請求する場合、以下の用語法が使用される。

また、本明細書中使用される用語法は、単に特定の態様を説明するためのものであり、限定することを意図してはいないことも理解されたい。多くの特許出願、特許、および公報は、記載される態様の理解を支援するために本明細書にて参照され得る。これら参照文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本出願の範囲を理解する際、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味するように意図されている。さらに、用語「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその派生語は、本明細書中使用される場合、記載される特性、要素、成分、グループ、整数、および／またはステップの存在を明記するが、記載されていない他の特性、要素、成分、グループ、整数、および／またはステップの存在を排除しないオープンエンドの用語であるように意図されている。また上記は、用語「～を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「～を有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの派生語などの同様の意味を有する用語に当てはまる。

特定の成分を「含む」と記載される全ての態様はまた、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」または「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」場合があることが理解される。ここで「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、クローズエンドまたは制限の意味を有し、「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、明記される成分を含むが、不純物として存在する物質と、上記成分を提供するために使用されるプロセスの結果として存在する避けられない物質と、本発明の技術的な効果を達成する以外の目的で追加される成分とを除く他の成分を排除することを意味する。たとえば、「～から本質的になる」との文言を使用して定義される組成物は、全ての既知の許容される添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを包有する。通常、一連の成分から本質的になる組成物は、５重量％未満、典型的には３重量％未満、より典型的には１重量％未満、さらにより典型的には０．１重量％未満の記載されていない成分を含む。

含まれていると本明細書中定義される全ての成分は、但し書きまたは否定的な限定により請求される発明から明確に除外され得ることが理解されるであろう。

さらに、本明細書中提供される全ての範囲は、明記されているかどうかに関わらず、当該範囲の端、およびまた全ての中間の範囲点を含む。

「実質的に」、「約（ａｂｏｕｔおよびａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）などの度合いの用語は、本明細書中使用される場合、最終的な結果が有意に変更されないように修飾される用語の合理的な偏差の量を意味する。これら度合いの用語は、この偏差が、それが修飾する用語の意味を否定しない場合、修飾される用語の少なくとも±５％の偏差を含むと解釈される。

本明細書中記載されるものと同様または均等の方法および材料が本開示の実務または試験で使用され得るが、適切な方法および材料は後述されている。略語「ｅ．ｇ．」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉａに由来し、非限定的な例を表すため本明細書中で使用される。よって、略語「ｅ．ｇ」は、用語「たとえば（ｆｏｒ ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義語である。用語「または」は、文脈が他の意味を明確に表さない限り「および」を含むように意図されている。

「～をコードする」は、明確なヌクレオチド配列（たとえばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｍＲＮＡ）または明確なアミノ酸配列のいずれか、ならびにそれらからもたらされる生物学的な特性を有する生体プロセス中の他のポリマーおよびマクロ分子の合成のためのテンプレートとして機能するための、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を表す。よって、遺伝子は、当該遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞または他の生態系でタンパク質を産生する場合、当該タンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常配列リストで提供されるヌクレオチド配列であるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして使用されるノンコーディング鎖は、両方とも当該遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると表され得る。

用語「発現」は、本明細書中使用される場合、そのプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳として定義される。

「単離された」は、天然の状態から変更または取り出されていることを意味する。たとえば、生きた動物において天然に存在する核酸またはペプチドは「単離」されていないが、その天然の状態の共存する物質から部分的または完全に分離された同核酸またはペプチドは「単離」されている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在し得、または非天然の環境、たとえば宿主細胞において存在し得る。

特段の記載がない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。また、タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列との文言は、当該タンパク質をコードするヌクレオチド配列が一部のバージョンでイントロンを含み得る限り、イントロンを含み得る。

用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）」は、本明細書中使用される場合、処置もしくは化合物の非存在下での対象の応答のレベルと比較、および／または他で同一ではあるが未処置の対象の応答のレベルと比較した、当該対象における応答のレベルの検出可能な増加または減少を媒介することを意味する。この用語は、ネイティブなシグナルまたは応答を乱すおよび／または影響を与えることにより、対象、通常はヒトにおいて有用な治療上の応答を媒介することを包有する。

用語「動作可能に結合した」は、制御配列と異種性核酸配列との間の、後者の発現をもたらす機能的な結合を表す。たとえば、第１の核酸配列は、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合に、第２の核酸配列と動作可能に結合している。たとえば、プロモーターは、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、コード配列に動作可能に結合している。一般的に、動作可能に結合したＤＮＡ配列は、隣接しており、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、同じリーディングフレームにある。

用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中使用される場合、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。よって、核酸およびポリヌクレオチドは、本明細書中使用される場合互換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、単量体の「ヌクレオチド」へと加水分解され得るとの一般的な知識を有している。単量体のヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書中使用される場合、限定するものではないが、ポリヌクレオチドは、限定するものではないが組み換え手段、すなわち、組み換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、通常のクローニング技術およびＰＣＲの使用などを含む当該分野で利用可能ないずれかの手段、および合成手段により得られる全ての核酸配列を含む。

本明細書中使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、互換可能に使用され、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を表す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなければならず、タンパク質またはペプチドの配列を含み得るアミノ酸の最大数に関しては限定されない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含む全てのペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書中使用される場合、この用語は、たとえば当該分野でペプチド、オリゴペプチド、およびオリゴマーとも一般に称される短い鎖、ならびに、多くの種類が存在するタンパク質と当該分野で一般に称されるより長い鎖の両方を表す。「ポリペプチド」として、たとえば特に、生物学的に活性なフラグメント、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドのホモダイマー、ヘテロダイマー、バリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、類縁体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドは、天然のペプチド、組み換え型ペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせを含む。

用語「特異的に結合する」は、抗体に関して本明細書中使用される場合、サンプルにおいて特異的な抗原を認識するが、他の分子を実質的に認識または結合しない抗体を意味する。たとえば、１つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体はまた、１つ以上の種由来の抗原に結合し得る。しかし、このような異種間反応性自体は、特異的という抗体の分類を変更しない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体はまた、抗原の異なる対立形質形態にも結合し得る。しかしながら、このような交差反応性自体は、特異的という抗体の分類を変更しない。場合により、用語「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、抗体、タンパク質、またはペプチドの第２の化学的な種との相互作用に関して、相互作用が化学的な種に関する特定の構造（たとえば抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存していることを意味するように使用され得、たとえば抗体は、一般的にタンパク質よりも特定のタンパク質の構造を認識およびこれに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、エピトープＡ（または遊離し、標識されていないＡ）を含む分子の存在は、標識された「Ａ」および抗体を含む反応において、当該抗体に結合した標識されたＡの量を低減する。

用語「トランスフェクトした」、または「形質転換した」、または「形質導入した」は、本明細書中使用される場合、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを表す。「トランスフェクトした」、または「形質転換した」、または「形質導入した」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入されている細胞である。この細胞は、初代対象細胞およびその後代を含む。

「転写制御下」または「動作可能に結合した」との文言は、本明細書中使用される場合、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始およびポリヌクレオチドの発現を制御するために、当該ポリヌクレオチドに関連した正確な位置および方向にあることを意味する。

「ベクター」は、単離した核酸を含み、細胞の内部に単離した核酸を送達するために使用され得る物質の組成物である。限定するものではないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に結合したポリヌクレオチド、プラスミド、およびウイルスを含む多くのベクターが当該分野で知られている。よって、用語「ベクター」は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。またこの用語は、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物、たとえばポリリジン化合物、リポソームなどを含むと解釈される。ウイルスベクターの例として、限定するものではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。

「バリアント」は、比較配列内の１つ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾、および／または置換のため比較の配列と異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性のコンストラクト、抗体、またはそのフラグメントである。バリアントは、一般に、比較配列と１００％未満の配列同一性を有する。しかしながら、通常、生物学的に活性のバリアントは、比較配列と少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、たとえば少なくとも約７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性でアミノ酸配列を有する。バリアントは、比較配列の生物学的な活性の一部のレベルを保持する少なくとも１０アミノ酸のペプチドフラグメントを含む。またバリアントは、１つ以上のアミノ酸残基が、比較配列のＮもしくはＣ末端、または比較配列の中に付加されたポリペプチドを含む。またバリアントは、多くのアミノ酸残基が欠失し、任意選択で１つ以上のアミノ酸残基で置換されているポリペプチドを含む。またバリアントは、たとえば天然に存在するアミノ酸以外の部分で置換するかまたは天然に存在しないアミノ酸を産生するためにアミノ酸残基を修飾することにより、共有結合で修飾され得る。

「パーセントアミノ酸配列同一性」は、最大パーセント配列同一性を達成するため、配列同一性の一部としていずれの保存的置換をも考慮せずに、配列をアライメントし必要に応じてギャップを導入した後に、本発明のポリペプチドなどの目的の配列の残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして本明細書中定義される。候補配列へのＮ末端、Ｃ末端、または内部の伸張、欠失、または挿入は、配列同一性または相同性に影響すると解釈されない。アライメントに関する方法およびコンピュータプログラム、たとえば「ＢＬＡＳＴ」は、当該分野でよく知られている。

本明細書中記載されるコンストラクトは、修飾を含み得る。このような修飾は、限定するものではないが、エフェクター分子へのコンジュゲートを含む。さらに修飾は、限定するものではないが、検出可能なレポーター分子へのコンジュゲートを含む。半減期を延長する修飾（たとえばペグ化）もまた含まれる。タンパク質および非タンパク質の作用物質が、当該分野で知られている方法によりコンストラクトにコンジュゲートされ得る。コンジュゲートの方法は、直接的な結合、共有結合したリンカーを介した結合、および特異的な結合対のメンバー（たとえばアビジン－ビオチン）を含む。このような方法として、たとえば、本明細書中参照により組み込まれているＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０， ６６００－６６０７ （１９９０）に記載されるもの、ならびにＡｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３０３， ７９－９０ （１９９１）およびＫｉｓｅｌｅｖａ ｅｔ ａｌ， ＭｏＩ． Ｂｉｏｌ． （ＵＳＳＲ）２５， ５０８－５１４（１９９１）により記載されるもの（両文献は本明細書中参照により組み込まれている）が挙げられる。

本明細書の目的に対し「活性な」または「活性」は、本明細書中記載のコンストラクトおよび／またはＴ細胞の生物学的および／または免疫学的な活性を表す（ここで「生物学的な」活性は、コンストラクトおよび／またはＴ細胞により引き起こされる生物学的な機能（阻害性または刺激性）を表す）。

用語「治療上有効量」、「有効量」、または「十分な量」は、望ましい結果を達成するために、哺乳類、たとえばヒトを含む対象に投与する際に十分な量、たとえば防御免疫応答を引き起こすために有効な量を意味する。本明細書中記載の化合物の有効量は、対象の免疫原、年齢、性別、および体重などの要因により変動し得る。用量または処置レジメンは、当業者が理解するように、最適な治療応答を提供するために調節され得る。たとえば、本明細書中記載のコンストラクトの治療上有効量の投与は、複数の態様において、Ｔ細胞を活性化、増殖、および／または分化するために十分である。別の例では、本明細書中記載のＴ細胞の治療上有効量の投与は、複数の態様において、がんまたは自己免疫疾患を処置および／または予防するために十分である。

さらに、治療上有効量を用いた対象の処置レジメンは、単回投与からなり得、またはあるいは一連の適用を含み得る。処置期間の長さは、免疫原、対象の年齢、作用物質の濃度、作用物質に対する患者の応答性、またはそれらの組み合わせなどの様々な要因に応じて変動する。また、処置で使用される作用物質の有効な用量は、特定の処置レジメンの過程にわたり増加または減少し得ることが理解される。用量の変更は、当該分野で知られている標準的な診断アッセイによりもたらされ、明らかとなり得る。本明細書中記載のコンストラクトおよび／またはＴ細胞は、複数の態様において、がんなどの問題となる疾患または障害の従来の療法での処置の前、間、または後に、投与され得る。

用語「対象」は、本明細書中使用される場合、動物界のいずれかのメンバー、通常は哺乳類を表す。用語「哺乳類」は、ヒト、他の高等霊長類、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、および動物園、スポーツ、またはペット用の動物、たとえばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む哺乳類と分類される全ての動物を表す。通常、哺乳類はヒトである。

１つ以上のさらなる治療用作用物質と「組み合わせた」投与は、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ、ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ）投与およびいずれかの順序の連続投与を含む。

用語「薬学的に許容される」は、化合物または化合物の組み合わせが、薬学的な使用のため製剤の残りの成分と適合可能であること、および米国食品医薬品局が交付したものを含む確立された政府の基準によってヒトへの投与が一般に安全であることを意味する。

用語「薬学的に許容される担体」は、限定するものではないが、溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤および／または吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の使用はよく知られている。

Ｔ－ＣＥＰ
本明細書において、二重特異性ｓｃＦｖコンストラクトが記載される。これらコンストラクトは、ＣＤ３経路およびＣＤ２８経路の両方を刺激（ａｇｏｎｉｚｅ）する。通常、本コンストラクトは、互いに直接または間接的に融合した、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖを含む。

通常、本コンストラクトは小さく可溶性であり、フェムトモル濃度の範囲の濃度でヒトＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで活性化、増殖、および／または分化する。たとえば本コンストラクトは、通常、約１０～約５００ｆＭ、たとえば約１０、約１５、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、または約４５０～約１５、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約３５０、約４００、約４５０、または約５００ｆＭの濃度で活性である。たとえば、本コンストラクトは、通常、約１５０～約２００ｆＭ、たとえば約１７０ｆＭの濃度で活性である。

本明細書中記載のコンストラクトは、通常、固定化された抗ＣＤ３ ｍＡｂ／可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂまたは可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂ複合体を含む方法と比較して、約８～約１６日間、たとえば約１２日間の過程にわたりヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の優先的な増殖を促進する。

複数の態様では、本明細書中記載のコンストラクトは、ＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の表現型の増殖を優先する。

抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、本コンストラクトのＮ末端またはＣ末端またはそれらの近くにあり得、抗ＣＤ３は、対応するＣ末端またはＮ末端またはそれらの近くにあることが理解される。しかしながら、通常、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖは、本コンストラクトのＮ末端またはＮ末端の近くにあり、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖは、本コンストラクトのＣ末端またはＣ末端の近くにある。

通常、本コンストラクトは、１つ以上の可動性リンカーを含む。たとえば、可動性リンカーは、抗ＣＤ２８ ｓｃＦＶおよび／または抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの重鎖と軽鎖との間に含まれ得る。さらにまたはあるいは、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖおよび抗ＣＤ３ ｓｃＦｖの間にリンカーが存在し得る。通常、本コンストラクトは、１、２、３つのリンカーを含み、通常は３つのリンカーを含む。本コンストラクトは、通常、ヒスチジンタグなどの検出タグをさらに含み、これは通常本コンストラクトのＣ末端にある。

通常、本コンストラクトは、１：１のモル比でＴＣＲの活性化および共刺激のためのシグナルの両方に係合する。

たとえば、通常、本コンストラクトは、以下の配列を有する：

（ここで、通常のフォントは抗ＣＤ２８の配列を表し、イタリック体のフォントは抗ＣＤ３の配列を表す。下線は、存在する場合はリンカーを表し、太字は、存在する場合は検出タグを表す）。

たとえば、本コンストラクトは、通常、以下の配列を有する：

また、上記の配列と実質的に同一の配列、たとえば、少なくとも約８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一である配列が企図されている。配列のフラグメントまたは実質的に同一なバリアント配列もまた本明細書中企図されている。

実質的に同一な配列は、１つ以上の保存的アミノ酸変異を含み得る。参照配列に対する１つ以上の保存的アミノ酸変異は、参照配列と比較して物理的、化学的、または機能的な特性において実質的な変化がない変異体ペプチドをもたらし得ることが当該分野で知られており、このような場合、参照配列および変異体配列は、「実質的に同一な」ポリペプチドとみなされる。保存的アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、欠失、また置換を含み得；保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基の、同様の化学的特性（たとえば大きさ、電荷、または極性）を有する別のアミノ酸残基との置換として本明細書中定義される。

非限定的な例では、保存的変異は、アミノ酸の置換であり得る。このような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、または酸性のアミノ酸を、同じグループの別のアミノ酸で置換し得る。用語「塩基性アミノ酸」は、通常生理的ｐＨで正に荷電している、７超のｐＫ値の側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸として、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、およびリジン（ＬｙｓまたはＫ）が挙げられる。用語「中性アミノ酸」（また「極性アミノ酸」）は、生理的ｐＨで荷電していない側鎖を有するが、２つの原子により一般に共有される電子対が原子のうちの１つによってより密接に保持されている少なくとも１つの結合を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸として、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、およびグルタミン（ＧｌｎまたはＱ）が挙げられる。用語「疎水性アミノ酸」（また「非極性アミノ酸」）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）の正規化されたコンセンサスな疎水性スケールにより０超の疎水性を呈するアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸として、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、およびグリシン（ＧｌｙまたはＧ）が挙げられる。

「酸性アミノ酸」は、通常生理的ｐＨで負に荷電している、７未満のｐＫ値の側鎖を有する親水性アミノ酸を表す。酸性アミノ酸として、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）およびアスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）が挙げられる。

配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用され；これは、２つの配列が残基の位置間で対応性が最大となるようにアライメントされる場合に同じである残基のパーセントを計算することにより決定される。いずれかの既知の方法が、配列同一性を計算するために使用されてよく、たとえば配列同一性を計算するためにコンピュータソフトウェアが利用可能である。限定されることを望むものではないが、配列同一性は、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにより維持されるＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２サービス（ｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／で見出される）、ＢＬＡＳＴ－Ｐ、Ｂｌａｓｔ－Ｎ、もしくはＦＡＳＴＡ－Ｎ、または当該分野で知られている他のいずれかの適切なソフトウェアなどのソフトウェアにより計算され得る。

本発明の実質的に同一な配列は、少なくとも８５％同一であり得；別の例では、実質的に同一な配列は、本明細書中記載の配列とアミノ酸レベルで少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％（またはそれらの間のいずれかのパーセンテージで）同一であり得る。特定の態様では、実質的に同一な配列は、参照配列の活性および特異性を保持する。非限定的な実施形態では、配列同一性の差異は、保存的アミノ酸の変異によるものであり得る。

また、本明細書中記載のコンストラクトは、それらの発現、検出、または精製を支援するためにさらなる配列を含み得る。当業者に知られているいずれかのこのような配列またはタグが使用され得る。たとえば、限定されることを望むものではないが、本コンストラクトは、標的化またはシグナル配列（たとえば限定するものではないがｏｍｐＡ）、検出タグを含み得、例示的なタグカセットとして、Ｓｔｒｅｐタグまたはそのいずれかのバリアント；たとえば米国特許第７，９８１，６３２号を参照、Ｈｉｓタグ、配列モチーフＤＹＫＤＤＤＤＫを有するＦｌａｇタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、Ａｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、Ｓｏｆタグ１、Ｓｏｆタグ３、Ｖ５タグ、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、チオレドキシンタグ、またはそれらのいずれかの組み合わせ；精製タグ（たとえば限定するものではないがＨｉｓ_５またはＨｉｓ_６）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

別の例では、さらなる配列は、ビオチン認識部位、たとえば、国際特許公開公報第９５／０４０６９号においてＣｒｏｎａｎらまたは国際特許公開公報第／２００４／０７６６７０号においてＶｏｇｅｓらにより記載されるものであり得る。また当業者に知られているように、リンカー配列は、さらなる配列またはタグと組み合わせて使用され得る。

より具体的には、タグカセットは、高い親和性または結合活性で抗体に特異的に結合し得る細胞外成分を含み得る。一本鎖融合タンパク質構造の中で、タグカセットは、（ａ）コネクター領域のアミノ末端に隣接して、（ｂ）リンカーモジュール間に挿入し結合して、（ｃ）結合ドメインのカルボキシ末端に隣接して、（ｄ）結合ドメイン（たとえばｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂ）の間に挿入し結合ドメインをエフェクタードメインに結合して、（ｅ）結合ドメインのサブユニット間に挿入し結合して、または（ｆ）一本鎖融合タンパク質のアミノ末端に位置し得る。特定の実施形態では、１つ以上のジャンクションアミノ酸は、タグカセットと疎水性部分との間に配置しそれらを結合し得、またはタグカセットとコネクター領域との間に配置しそれらを結合し得、またはタグカセットとリンカーモジュールとの間に配置しそれらを結合し得、またはタグカセットと結合ドメインとの間に配置しそれらを結合し得る。

また、本明細書において、様々な方法を使用して表面上に固定化された単離または精製されたポリペプチド、またはそのフラグメントが包有され；たとえば、限定されることを望むものではないが、このポリペプチドは、Ｈｉｓタグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着などを介して表面に結合またはカップリングされ得る。固体の表面は、いずれかの適切な表面、たとえば限定するものではないが、マイクロタイタープレートのウェルの表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のセンサーチップのチャネル、膜、ビーズ（たとえば磁性ベースまたはセファロースベースのビーズ、または他のクロマトグラフィーの樹脂）、ガラス、フィルム、または他のいずれかの有用な表面であり得る。

他の態様では、本コンストラクトは、カーゴ分子に結合し得；本コンストラクトは、カーゴ分子を望ましい部位に送達し得、当該分野で知られているいずれかの方法（組み換え技術、化学的なコンジュゲート、キレート化など）を使用してカーゴ分子に結合し得る。カーゴ分子は、いずれかの種類の分子、たとえば治療用または診断用作用物質であり得る。たとえば、いずれの方法でも限定されることを望むものではないが、治療用作用物質は、放射線免疫療法で使用され得る放射性同位元素；毒素、たとえばイムノトキシン；サイトカイン、たとえばイムノサイトカイン；サイトトキシン；アポトーシス誘導因子；酵素；免疫療法用の抗がん抗体；または当該分野で知られている他のいずれかの適切な治療用分子であり得る。別の例では、診断用作用物質は、決して限定されるものではないが、検出可能なタンパク質ベースの分子に融合した、放射性同位元素、常磁性標識、たとえばガドリニウムまたは酸化鉄、フルオロフォア、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光色素または色素（たとえばＣｙ３、Ｃｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０、またはＤｙｌｉｇｈｔ８００）、アフィニティ標識（たとえばビオチン、アビジンなど）、またはイメージング法により検出され得る他のいずれかの適切な作用物質を含み得る。特定の非限定的な例では、本コンストラクトは、ＦＩＴＣなどの蛍光作用物質に結合し得、または高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）に遺伝子的に融合し得る。

本明細書中記載のコンストラクトは、それらの標的に特異的に結合する。抗体特異性は、本明細書中記載の抗体または抗体フラグメントの抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的な認識を表し、親和性および／または結合活性に基づき決定され得る。抗体と抗原の解離に関する平衡定数（Ｋ_Ｄ）により表される親和性は、抗原決定基（エピトープ）と抗体結合部位との間の結合強度を測定する。結合活性は、抗体のその抗原との間の結合の強度の測定値である。抗体は、通常、１０^－５～１０^－１１ＭのＫ_Ｄで結合する。１０^－４Ｍ超のいずれかのＫ_Ｄは、一般に、非特異的な結合を表すとみなされる。Ｋ_Ｄの値が小さくなると、抗原決定基と抗体結合部位との間の結合強度は強くなる。複数の態様では、本明細書中記載の抗体は、１０^－４Ｍ、１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、または１０^－１２Ｍ未満のＫ_Ｄを有する。

また、本明細書において、本明細書中記載のコンストラクトをコードする核酸分子、および当該核酸分子を含むベクター、および当該ベクターを含む宿主細胞が記載される。

本明細書中記載のコンストラクトをコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの核酸配列と実質的に同じ核酸配列を有するポリヌクレオチドを含む。「実質的に同じ」核酸配列は、２つの配列を最適にアライメントし（適切なヌクレオチドの挿入または欠失を伴う）、比較して、２つの配列間のヌクレオチドの正確な一致を決定する際に、別の核酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性を有する配列として、本明細書中定義される。

抗体のフラグメントをコードするポリヌクレオチドの適切な供給源として、完全長の抗体を発現するいずれかの細胞、たとえばハイブリドーマおよび脾臓細胞が挙げられる。フラグメントは、抗体の均等物としてそれ自体が使用されてもよく、または上述のように均等物へと組み換えられてもよい。このセクションで記載されるＤＮＡの欠失および組み換えは、既知の方法、たとえば「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」と題されるセクションにおいて上記に列挙されている公開済みの特許出願に記載されるものおよび／または以下に記載されるものなどの他の標準的な組み換えＤＮＡ技術により、行われ得る。ＤＮＡの別の供給源は、当該分野で知られている、ファージディスプレイライブラリーから産生された一本鎖抗体である。

たとえば、複数の態様において、本明細書中記載のコンストラクトをコードするポリヌクレオチドは、配列：

、またはそれと少なくとも８０％同一の配列、またはそれらのフラグメントを有する。

さらに、発現配列、プロモーター、およびエンハーサー配列に動作可能に結合した上述のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。細菌などの原核生物ならびに限定するものではないが酵母および哺乳類細胞培養系を含む真核生物の系での抗体ポリペプチドの効率的な合成のため様々な発現ベクターが開発されている。本発明のベクターは、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含み得る。

いずれかの適切な発現ベクターが使用され得る。たとえば、原核生物のクローニングベクターとして、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、たとえばｃｏｌＥｌ、ｐＣＲｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ｐＵＣ、ｐＫＳＭ、およびＲＰ４が挙げられる。また原核生物のベクターは、Ｍｌ３および他の繊維状一本鎖ＤＮＡファージなどのファージＤＮＡの誘導体を含む。酵母に有用なベクターの一例は、２μプラスミドである。哺乳類細胞での発現に適したベクターは、ＳＶ－４０、アデノウイルス、レトロウイルス由来のＤＮＡ配列のよく知られている誘導体、ならびに上述のものなどの機能的な哺乳類ベクターの組み合わせに由来するシャトルベクター、ならびに機能的なプラスミドおよびファージＤＮＡを含む。

さらなる真核生物の発現ベクターが、当該分野でよく知られている（たとえば、Ｐ Ｊ． Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ＆ Ｐ． Ｂｅｒｇ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ， １：３２７－３４１ （１９８２）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ， １： ８５４－８６４ （１９８１）；Ｋａｕｆｉｎａｎｎ ＆ Ｓｈａｒｐ， ”Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ Ｍｏｄｕｌａｒ Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ，” Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ， １５９：６０１－６２１ （１９８２）；Ｋａｕｆｈｉａｎｎ ＆ Ｓｈａｒｐ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ， １５９：６０１－６６４ （１９８２）；Ｓｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｏｆ Ａ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ＤＮＡ Ｇｅｎｅ Ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ Ｃｅｌｌｓ，” Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８０：４６５４－４６５９ （１９８３）；Ｕｒｌａｕｂ ＆ Ｃｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ， ７７：４２１６－４２２０， （１９８０）。これらは全て本明細書において参照により組み込まれている）。

発現ベクターは、通常、発現されるＤＮＡ配列またはフラグメントに動作可能に結合している少なくとも１つの発現制御配列（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。制御配列は、クローニングしたＤＮＡ配列の発現を制御および調節するためにベクターに挿入される。有用な発現制御配列の例は、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージλの主要なオペレーター領域およびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖プロモーター、たとえば３－ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母の酸性ホスファターゼのプロモーター、たとえばＰｈｏ５、酵母のα－接合因子のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、およびサルウイルスに由来するプロモーター、たとえば早期プロモーターおよび後期プロモーターまたはＳＶ４０、ならびに原核細胞または真核細胞およびそれらのウイルスまたはそれらの組み合わせの遺伝子の発現を制御するために知られている他の配列である。

また、本明細書において、以前に記載された発現ベクターを含む組み換え型宿主細胞が記載される。本明細書中記載のコンストラクトは、ハイブリドーマ以外の細胞株で発現され得る。ポリペプチドをコードする配列を含む核酸は、適切な哺乳類の宿主細胞の形質転換に使用され得る。

特に好ましい細胞株は、目的のタンパク質の高いレベルの発現、構成的発現、および宿主タンパク質からの最小限のコンタミネーションに基づき選択される。発現のための宿主として利用可能な哺乳類細胞株は、当該分野でよく知られており、多くの不死化された細胞株、たとえば限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、および他の多くの細胞を含む。さらなる適切な真核生物細胞は、酵母および他の真菌を含む。有用な原核生物の宿主として、たとえばＥ． ｃｏｌｉ、たとえばＥ． ｃｏｌｉ ＳＧ－９３６、Ｅ． ｃｏｌｉ ＨＢ １０１、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｘ１７７６、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｘ２２８２、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨＩ、およびＥ． ｃｏｌｉ ＭＲＣ１、シュードモナス属、バシラス属、たとえば枯草菌、およびストレプトマイセス属が挙げられる。

これらの本発明の組み換え型宿主細胞は、ポリペプチドの発現を許容する条件下で細胞を培養し、宿主細胞または宿主細胞の周辺の培地からポリペプチドを精製することにより、タンパク質を産生するために使用され得る。組み換え型宿主細胞での分泌で発現されるポリペプチドの標的化は、目的の抗体をコードする遺伝子の５’末端にシグナルまたは分泌性リーダーペプチドをコードする配列を挿入することにより容易になり得る（Ｓｈｏｋｒｉ ｅｔ ａｌ， （２００３） Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６０（６）： ６５４－６６４， Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ．， １０：１－６ （１９９７）； ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４：４６８３－４６９０ （１９８６）を参照（これらは全て本明細書において参照により組み込まれている））。これら分泌性リーダーペプチドエレメントは、原核生物または真核生物の配列のいずれかに由来し得る。よって、適宜、分泌性リーダーペプチドは、宿主細胞のサイトゾルからのポリペプチドの移動および培地への分泌を指示するためのポリペプチドのＮ末端に結合したアミノ酸である、分泌性リーダーペプチドが使用される。

本明細書中記載のコンストラクトは、さらなるアミノ酸残基に融合され得る。このようなアミノ酸残基は、たとえば単離を容易にするためのペプチドタグであり得る。特定の臓器または組織への抗体のホーミングのための他のアミノ酸残基も、同様に企図される。

また、本明細書において、Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖、活性化、および／または分化するための方法が記載される。本方法は、一定期間、たとえば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間、たとえば約１２日間、Ｔ細胞を本明細書中記載のコンストラクトとインキュベートするステップを含む。本コンストラクトは、任意の濃度で使用され得るが、通常、約１０～約５００ｆＭ、たとえば約１７０ｆＭの濃度で使用される。

また、本明細書において、上記の方法により作製されたＴ細胞が記載される。これらＴ細胞は、任意の望ましい目的のため使用され得るが、通常は、研究、がんの処置および／もしくは予防、ならびに／または自己免疫疾患の処置および／もしくは予防のために使用される。

本明細書中記載のコンストラクトおよびＴ細胞を投与するために、いずれかの適切な方法または経路が使用され得る。投与経路として、限定するものではないが、たとえば、経口、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内投与が挙げられる。

本明細書中記載のコンストラクトまたはＴ細胞は、防止または処置のため哺乳類で使用される場合、薬学的に許容される担体をさらに含む組成物の形態で投与されることが理解される。適切な薬学的に許容される担体として、たとえば、１種類以上の水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容される担体は、結合したタンパク質の保存可能期間または有効性を高める、微量の補助物質、たとえば湿潤剤または乳化剤、保存剤、またはバッファーをさらに含み得る。注射の組成物は、当該分野でよく知られているように、哺乳類への投与の後に有効成分の迅速な放出、徐放、またはゆっくりとした放出を提供するように製剤化され得る。

ヒト抗体はヒトへの投与で特に有用であるが、これらは同様に他の哺乳類へ投与され得る。用語「哺乳類」は、本明細書中使用される場合、限定するものではないが、ヒト、研究動物、家庭用ペット、および農業用動物を含むように意図されている。

以下の実施例は、従来の方法、たとえばベクターおよびプラスミドの構築、ポリペプチドをコードする遺伝子の当該ベクターおよびプラスミドへの挿入、またはプラスミドの宿主細胞への導入で使用される方法の詳細な説明を含まない。このような方法は、当業者によく知られており、本明細書中参照により組み込まれているＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８９）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを含む多くの刊行物に記載されている。

さらに説明することなく、先行する記載および以下の例示的な実施例を用いて、当業者は、本発明の化合物を作製および利用し、請求される方法を実施すると考えられる。よって、以下の実施例は、本発明の典型の態様を具体的に指摘しており、本開示の残りをいかなる方法であっても限定すると解釈されるべきではない。

実施例
実施例１：Ｔ－ＣＥＰ：多機能のヒトＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖を優先する可溶性Ｔ細胞アクチベーター
概要
養子細胞療法は、抗腫瘍免疫を提供するために、腫瘍反応性Ｔ細胞をがん患者へ注入することを含む。このようなＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの増殖および分化は、それらの治療可能性に影響する鍵となるパラメータである。ヒトＴ細胞は、現在、ビーズに固定化されるか、細胞上に発現されるか、または可溶性抗体複合体の状況下でアセンブリされる抗ＣＤ３モノクローナル抗体および抗ＣＤ２８モノクローナル抗体の使用を介して、培養物で増殖される。ここで、本発明者らは、ＣＤ３経路およびＣＤ２８経路の両方を刺激する小分子の二重特異性ｓｃＦｖコンストラクトの設計を報告する。この可溶性Ｔ細胞増殖タンパク質は、Ｔ－ＣＥＰと称され、フェムトモル濃度の範囲の濃度でヒトＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで活性化、増殖、および分化する。重要なことに、Ｔ－ＣＥＰは、固定化された抗ＣＤ３ ｍＡｂ／可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂ、または可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂ複合体を含む方法と比較して、１２日間にわたりヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の優先的な増殖を促進する。得られたヒトＴ細胞集団の分化プロファイルはまた、著しくＴ－ＣＥＰの影響を受け、好ましいＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の表現型の増殖を優先する。ｅｘ ｖｉｖｏでのヒトＴ細胞でのＴ－ＣＥＰの活性プロファイルは、養子細胞療法により機能的に適しているヒトＴ細胞集団の作製におけるこの使用を示唆している。

イントロダクション
養子細胞療法（ＡＣＴ）は、抗腫瘍活性を有するリンパ球が特定のがん細胞を排除するために患者へ移入されることにより通常例証される細胞ベースの臨床的な手法を再編成する。^１このような手法は、血液系悪性腫瘍、転移性メラノーマ、および転移性乳がんの処置で成功している。^２－４悪性度に応じて、処置は、患者自身の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を使用するか、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を設計するか、または遺伝子修飾したＴ細胞を使用することにより、行われ得る。これらリンパ球、特には著しく機能的なヒトＴ細胞は、患者内への注入の前に、全てがｅｘ ｖｉｖｏで増殖されなければならず^５－７、これは、臨床的に有効な用量を作製するためにこのような細胞の増殖に関連する課題を克服することを必要とする重要なステップである。^７ヒトＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの活性化、増殖、および生存に重要なステップは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在する活性化シグナル、共刺激シグナル、およびサイトカインを介したシグナリングを含む。^８ｉｎ ｖｉｔｒｏでのポリクローナルＴ細胞の活性化は、一般的に、ＴＣＲの活性化および共刺激のシグナルの両方を提供するＣＤ３およびＣＤ２８をそれぞれ標的とするアゴニスティック抗体の使用を介して達成され、ここで適切なサイトカインが補充される。^５

ＡＴＣに関してヒトＴ細胞の使用の成功に関連したいくつかの臨床的に重要な基準が存在する。第１に、移入されたＣＤ４^＋Ｔ細胞もまたＣＤ８^＋Ｔ細胞が介在する腫瘍拒絶を高める可能性を呈するが、ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、それらの細胞溶解性活性によりＡＣＴにおいて優先される。^９、１０第２の鍵となるパラメータは、ｅｘ ｖｉｖｏで増殖して得られるＴ細胞産物の分化状態である。具体的には、Ｔ細胞分化のイベントは、それらの増殖の間に起こり、最終的にｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの最適な持続および機能に必要な重大なＡＣＴの特徴の喪失をもたらし得る。^{１１、１２}あまり分化していないＴ細胞が望ましく、これは、より分化したエフェクターメモリー（Ｔｅｍ）、および最終分化したＴ細胞（Ｔｅｍｒａ）とは対照的に、ナイーブＴ細胞（Ｔｎ）、幹細胞メモリー（Ｔｓｃｍ）、およびセントラルメモリー（Ｔｃｍ）Ｔ細胞の既知のマーカーの表面発現に基づき区別され得る。^{１３、１４}両ＣＤ３経路およびＣＤ２８経路をｉｎ ｖｉｔｒｏで刺激することを介したＴ細胞の活性化、増殖、および分化は、どのように両シグナルがヒトＴ細胞に対しかつ提供されるサイトカイン上に提示されるかに基づく固有の方法にて細胞を増殖し得る。現在、異なる増殖方法および当該方法の改変が、より望ましい表現型を提示するＴ細胞をもたらし得ることが研究で示されている。^{１５－１７}リガンド密度^１８、機械的な力^{１９、２０}、相互作用の強度^２１、およびヒトＴ細胞を活性化するシグナルの持続期間などのパラメータは、ＡＴＣ応答のアウトカムに影響する。^２２よって、異なる形式のシグナル送達を介してＴ細胞の活性化を誘発することは、最終的なＴ細胞の表現型をゆがめることが予想される。

この報告では、本発明者らは、低濃度で可溶性因子として添加される場合にヒトＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖する著しく強力な単量体タンパク質を設計した。このＴ細胞増殖タンパク質（Ｔ－ＣＥＰと称される）の効力は、固定化したアゴニスティック抗ＣＤ３ ｍＡｂを可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂと組み合わせる確立したプロトコルと比較した。またＴ－ＣＥＰを、単一特異性四量体抗体複合体（ＴＡＣ）の組み合わせた溶液の形式でヒトＣＤ３およびＣＤ２８の両方を標的とする市販の可溶性Ｔ細胞アクチベーターと比較した。Ｔ－ＣＥＰは、ヒトＴ細胞上でＣＤ３およびＣＤ２８の両方と係合し、高いレベルの増殖活性をもたらすことが示された。さらに、Ｔ－ＣＥＰは、患者でのＡＴＣアウトカムのより大きな成功に臨床的に関連しているあまり分化していないＴ細胞の表現型を呈するＣＤ８^＋ヒトＴ細胞集団を増殖する改善された特性を示した。

結果
Ｔ－ＣＥＰの設計および産生
６０ｋＤａの可溶性Ｔ細胞増殖タンパク質（Ｔ－ＣＥＰ）は、それぞれヒトＣＤ３およびヒトＣＤ２８に結合し、両シグナリング経路の活性化においてアゴニストとして作用する２つの異なる一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）をまとめて融合することにより設計した（図１Ａ）。これら選択されたｓｃＦｖ配列は、独立して、それぞれＣＤ３^２３およびＣＤ２８^２４を刺激し、よって、ヒトＴ細胞を活性化することが示されている。これらｓｃＦｖは、以前に記載したリンカーと類似した短い可動性スペーサー（ＳＳＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を使用して共に結合した。^２５６－ヒスチジンタグを精製のためおよびコンストラクトの検出のためコンストラクトのＣ末端に添加した（図１Ａ）。当然、２つのＴ－ＣＥＰコンストラクトは、本来、配向（すなわちコンストラクトのＣ末端またはＮ末端にある抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖ）がそれらの機能の特性に影響するかどうかを評価するために構築された。Ｎ末端にＣＤ２８を標的とするｓｃＦｖおよびそのＣ末端に位置したＣＤ３ ｓｃＦｖを含む図１Ａに記載のコンストラクトが、高い産生率およびより強力なＴ細胞増殖活性（結果は不図示）により、リード化合物として最終的に選択された。Ｔ－ＣＥＰは、ＨＥＫ２９３細胞［Ｅｘｐｉ２９３系］において産生された分泌性可溶性タンパク質として発現され、固定化した金属アフィニティクロマトグラフィーを使用して精製した。この純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により確認され、そのアミノ酸配列に基づき予測されるＴ－ＣＥＰの分子量に対応する６０ｋＤａのバンドとして移動した（図１Ｂ）。

その構造に基づき、Ｔ－ＣＥＰは、１：１のモル比でＴＣＲの活性化および共刺激のためのシグナルの両方に係合するように設計された作用物質である。他の現在利用可能な市販の可溶性Ｔ細胞アクチベーター（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、これらシグナルを、可溶性単一特異性四量体抗体複合体（ＴＡＣ）の形式で送達する。ＴＡＣは、ＣＤ３またはＣＤ２８に対する１匹の動物由来のモノクローナル抗体を使用し、それらを、抗原を標的とする抗体のＦｃフラグメントに対する第２の動物由来のモノクローナル抗体と混合することにより調製する。^２６次に、調製したＴＡＣを、予測される１：１の成分比率をもたらす、抗ＣＤ３ ＴＡＣおよび抗ＣＤ２８ ＴＡＣの１：１の比率で１つの溶液において組み合わせられる。

Ｔ－ＣＥＰは、ヒトＣＤ３およびＣＤ２８の細胞外ドメインに結合する。
ＣＤ３およびＣＤ２８の細胞外ドメインへのＴ－ＣＥＰの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により確認した。具体的には、Ｆｃタグ付けされた組み換え型ヒトＣＤ２８タンパク質およびヒトＣＤ３εδタンパク質を、プロテインＧ修飾チップ上に固定化し、増加する濃度のＴ－ＣＥＰを、各固定化した標的の上に流した。結果得られたセンサグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を分析（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ）して、結合動態パラメータを計算した（ラングミュア１：１結合モデルに対し適合、図２Ａ）。Ｔ－ＣＥＰは、それぞれ０．４８ｎＭおよび０．２４ｎＭの平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）でＣＤ３およびＣＤ２８の標的の両方に硬く結合することが示された。ＣＤ３に対するＴ－ＣＥＰ結合の解離速度（ｋ_ｏｆｆ）は、４．３×１０^－２ｓ^－１であり、これはＣＤ２８に対するＴ－ＣＥＰ結合の解離よりも２桁大きい。ＣＤ３εδに対する結合は、ＣＤ３εδに対する抗ＣＤ３ ｍＡｂ結合と比較して低いＫ_Ｄ（高い親和性）、高い結合速度（ｋ_ａ）、および速い解離速度を有していた。^２７相対的に速いｋ_ｏｆｆは、これがＴＣＲ－ＭＨＣ－ペプチドの相互作用のターンオーバーに寄与するため、Ｔ細胞の効率的な活性化において重要な要因を表す。^２８

同時に両標的に対し結合することは、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して分析した。ＳＰＲの結果と一致して、両組み換え型タンパク質は、個々にＦｃタグ化組み換え型ＣＤ３εδおよびＣＤ２８に対する正のシグナルにより証明されるように、Ｔ－ＣＥＰ単独と結合したが、Ｆｃが一致する対照の場合では存在しなかった（図３）。Ｔ－ＣＥＰが同時に両標的に結合し得るかどうかを決定するために、Ｔ－ＣＥＰを、最初に固定化した組み換え型ＣＤ３εδを使用して捕捉し、次に、組み換え型ＣＤ２８を使用して検出した。最初に、ＣＤ３εδ－ＦｃまたはＦｃ対照を、ＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、その後Ｔ－ＣＥＰをウェルに添加し、次に、ビオチン化ヒトＣＤ２８－Ｆｃ細胞外ドメインとインキュベートし、ストレプトアビジン－ＨＲＰで検出した。正のシグナルは、ＣＤ３εδ－ＦｃおよびＴ－ＣＥＰの両方を含むウェルでのみ観察され、Ｔ－ＣＥＰが一度に両標的と結合できることが表された。対照的に、Ｆｃ対照でコーティングされたウェルまたはＴ－ＣＥＰを欠いたウェルは、ビオチン化ＣＤ２８－Ｆｃに結合しなかった（図２Ｂ）。

ヒトＴ細胞上のＴ－ＣＥＰの機能的な性質決定
Ｔ－ＣＥＰは、非常に低濃度でヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方の増殖を誘導する。
Ｔ－ＣＥＰの最適な作業濃度を決定するために、ヒトＰＢＭＣから単離したＴ細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；細胞増殖トレーサー）で染色し、ある範囲のＴ－ＣＥＰ濃度（５０ｐｇ／ｍＬ～最大１０μｇ／ｍＬ）で５日間Ｔ－ＣＥＰで刺激した。ＣＦＳＥシグナルの喪失によるエビデンスとしてのこれらの増殖活性は、フローにより分析した（結果不図示）。Ｔ－ＣＥＰによる比較可能なＴ細胞増殖活性は、５００ｐｇ／ｍＬとの低い濃度で指摘されたが、全てのその後の試験では、１０ｎｇ／ｍＬ（１７０ｆＭ）のＴ－ＣＥＰ濃度が、最大Ｔ細胞増殖を一貫してもたらすため選択された（図４Ａ）。興味深いことに、ヒトＴ細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの完全な増殖をもたらすために必要とされる可溶性Ｔ－ＣＥＰの濃度は、ＴＡＣで必要とされる濃度よりも（ｇ／Ｌにおいて）１５０倍少なかった（製造者の指示により使用される場合、約１．５μｇ／ｍＬ～約２．５ｐＭ）。このＴ－ＣＥＰの濃度はまた、固定化されたαＣＤ３（ｉ αＣＤ３）（１０μｇ／ｍＬ）および可溶性αＣＤ２８（ｓ αＣＤ２８）（１μｇ／ｍＬ）ｍＡｂの最適用量よりもはるかに少なかった。予想されるように、非刺激Ｔ細胞は増殖せず、共刺激しなかった抗ＣＤ３はＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋のヒトＴ細胞の増殖の両方のレベルが遥かに低かった。

活性化ヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞による培地で放出されたサイトカインレベルは、５日目に測定した（図３Ｂ）。Ｔ－ＣＥＰ（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＴＡＣ（約１．５μｇ／ｍＬ）は、固定化されたαＣＤ３／可溶性αＣＤ２８ ｍＡｂでＴ細胞を刺激した場合よりも高いレベルで、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、およびＴＮＦαの産生を誘導した。

Ｔ－ＣＥＰは、１２日間の過程にわたりＴ細胞の活性化および増殖をもたらす。
養子細胞療法で使用されるＴ細胞は、患者への再注入前に１２～１４日間持続する迅速な増殖期を経る必要がある。^１３名の健常なドナーのＰＢＭＣから単離したヒトＣＤ３^＋Ｔ細胞を、単回刺激の後１２日間の過程にわたり増殖させ、ここでＩＬ－２を培地に添加しえ、ｅｘ ｖｉｖｏで細胞の増殖および活性化をさらに支援させた。１２日間の増殖段階の３日目に、細胞をＧ－Ｒｅｘプレートに移した。その後３日ごとに、アリコートを二連のウェルから採取し、存在する生きたＴ細胞数を記録した。３名のドナー由来のＴ細胞は、Ｔ－ＣＥＰ（１０ｎｇ／ｍＬ；１７０ｆＭ）または可溶性ＴＡＣ（２５μＬ／ｍＬ、約１．５μｇ／ｍＬ）、またはｓ αＣＤ２８を伴うかもしくは伴わないｉ αＣＤ３で刺激した（図５Ａ）。３名のドナー全てで、Ｔ細胞をＴ－ＣＥＰおよびＴＡＣを用いてｅｘ ｖｉｖｏで処置した場合に、最も高いレベルの総Ｔ細胞増殖が観察された。予測されるように、非刺激Ｔ細胞は増殖せず、ｉ αＣＤ３単独で処置したＴ細胞は、ＣＤ２８刺激を含む方法よりもＴ細胞増殖が有意に少なかった。

刺激前のＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋Ｔ細胞の開始数に対する、３名のドナーでの１２日間にわたるＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋のＴ細胞のサブセットの増殖をモニタリングするために、Ｔ細胞をフローサイトメトリーによりさらに分析した。可溶性ＴＡＣは、Ｔ－ＣＥＰと比較して多数のＣＤ４^＋Ｔ細胞をもたらすために最も有効であることが判明した。対照的に、Ｔ－ＣＥＰは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を優先し、ＴＡＣと比較して最も多数のＣＤ８＋Ｔ細胞をもたらした。Ｔ－ＣＥＰにより、ヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞が平均で２３７倍増殖し（１２日目）；これはＴＡＣで増殖したＣＤ８^＋Ｔ細胞よりも有意に高いＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖のレベルであった（Ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。

各増殖条件下で１２日後のＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋のＴ細胞のサブセットの増殖度をさらに評価するために、本発明者らは、３名のドナーから回収した生きたリンパ球の集団の合計と比較したＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋のＴ細胞集団のパーセンテージをフローサイトメトリーにより決定した。パーセンテージに基づくと、Ｔ－ＣＥＰは、ｓ αＣＤ２８を伴うｉ αＣＤ３の従来の方法により産生されるＴ細胞の同様の比率で、ＣＤ４^＋Ｔ細胞よりもＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖を優先した。対照的に、ＴＡＣ処置は、有意に低いパーセンテージのＣＤ８^＋Ｔ細胞をもたらした（Ｐ＜０．０５）（図５Ｃ）。

刺激前に、健常なドナーのＰＢＭＣから精製したＴ細胞のＣＤ４：ＣＤ８の比率は、それぞれ２．１、２．３、および２．７であった。

３名のドナー由来のヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞での活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ３８のレベルを、１２日間の増殖期間の間特定の時点でフローサイトメトリーによりモニタリングした。ＣＤ２５発現の蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）の増加は、３日目にピークに達し、ＣＤ３８では６日目にピークに達した。Ｔ－ＣＥＰは、ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ４^＋Ｔ細胞において最も高いレベルの活性化マーカーを誘導した。しかしながら、３名のドナーに基づく差異は有意ではなかった。その後、ＭＦＩ値は、使用される増殖方法またはモニタリング活性化マーカーとは無関係に、１２日目までに刺激前の値に相当するレベルまで低下した（図５Ａ）。

ＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞で共発現した疲弊マーカーＰＤ－１およびＬＡＧ－３の表面発現を、各増殖条件でフローサイトメトリーにより分析した（図６Ｂ）。これらマーカーを共発現するＣＤ４^＋Ｔ細胞およびＣＤ８^＋Ｔ細胞のパーセンテージは、試験した全ての増殖方法で３日目にピークがあり、ここでＣＤ８^＋Ｔ細胞において有意に高いレベルの共発現がＴ－ＣＥＰで刺激された。しかしながら、この発現パターンは、各刺激方法において、９日目および１２日目までに、活性化前のレベルに戻った。

Ｔ－ＣＥＰでの刺激は、明確に異なるヒトＴ細胞の表現型の分化をもたらす。
３名のドナーからのヒトＴ細胞の分化パターンを、１２日間分析した。特に、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ２７の発現レベルは、これらＴ細胞のサブセットの分化状態の推定を提供するために、ＣＤ４^＋細胞およびＣＤ８^＋細胞でモニタリングした（図７Ａ）。具体的には、ＣＤ２７は、Ｔ細胞の活性化および分化においてある役割を果たしており、その発現は、Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの持続に関連しており^２、２９、ＣＤ２７発現の喪失は、一般的に、後期または最終分化を表す。^３０一方、ＣＤ４５ＲＡは、早期のＴｎ細胞およびＴｓｃｍ細胞のサブセットで発現し、その発現は、Ｔｃｍ細胞およびＴｅｍ細胞への分化後に失われる。その後、このマーカーは、後期Ｔｅｍｒａサブセットへの分化後に再発現する。^{３１、３２}よって、最小～最大に分化したＴ細胞サブセットは、以下のようにこれら２つのマーカーの以下の発現パターンを呈することが予測される：ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２７^＋＜ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^＋＜ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^－＜ＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２７^－。ｅｘ ｖｉｖｏでの１２日間の増殖の後、各ドナーにおけるＴ－ＣＥＰで処置したヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞集団は、ｉ αＣＤ３単独で処置したＴ細胞と比較して、ＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^－およびＣＤ４５ＲＡ^＋ＣＤ２７^－細胞の低いパーセンテージおよびＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の増加を呈した（Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。大きな表現型の変化が、Ｔ－ＣＥＰで処置したＣＤ８^＋Ｔ細胞集団で観察され、より分化したＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^－Ｔ細胞集団が、ＴＡＣ（４７．４％、Ｐ＜０．０５）、ｓ αＣＤ２８を伴うｉ αＣＤ３（５１．５％、Ｐ＜０．００５）、またはｉ αＣＤ３単独（５３．６％、Ｐ＜０．００５）と比較して、総ＣＤ８^＋Ｔ細胞の２５．２％の平均値（３名のドナー）まで有意に低下した（図７Ｃ）。対照的に、あまり分化していないＣＤ４５ＲＡ^－ＣＤ２７^＋Ｔ細胞サブセットは、細胞のうちｓ αＣＤ２８を伴うｉ αＣＤ３（３５．９％、Ｐ＜０．０５）またはｉ αＣＤ３単独（２７．６％、Ｐ＜０．００５）で処置した細胞と比較する場合、ＣＤ３^＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞の（平均値、５６．５％）で、Ｔ－ＣＥＰで１２日間処置したＴ細胞において有意に増加した（図７Ｃ）。

移入したＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞数は、以前より、転移性メラノーマのため自家性ＴＩＬＣを使用する養子治療処置に対する患者の応答の改善に関連している。^２Ｔ－ＣＥＰでの刺激は、３名のドナーのそれぞれでの他の刺激方法と比較して、ＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の量を増大させ（図６Ｄ）、ここでＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋細胞の平均発生頻度は、１２日目で生きたリンパ球集団のうちの６０．８％を表す。このパーセンテージは、他の増殖条件下で観察される当該細胞の比率よりも有意に多い（ｉ αＣＤ３、３２．２％、ｐ＝０．００２；ｉ αＣＤ３およびｓ αＣＤ２８、３２．４％、Ｐ＜０．００５；ＴＡＣ、２８．２３％、Ｐ＜０．００５）。この、Ｔ－ＣＥＰでのＴ細胞増殖後のＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の集団の増大は、１０ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲（生きたリンパ球集団の合計のうちの５４～６５％）のＴ－ＣＥＰの濃度には左右されず、ＴＡＣの場合（２３％～３８％にわたる）とは対照的であった（データ不図示）。ＣＤ２７の１２日目の発現は、ｉ αＣＤ３（Ｐ＜０．００１）、ｉ αＣＤ３およびｓ αＣＤ２８（Ｐ＜０．００５）、またはＴＡＣ（２６．７％、Ｐ＜０．０１）のいずれかで処置したＴ細胞グループと比較して高いＣＤ２７のΔＭＦＩ（蛍光強度の中央値の変化）により示されるように、Ｔ－ＣＥＰで処置したグループにおいて有意に高かった（図７Ｅ）。各ドナー（ｎ＝３）の１２日目までのＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の倍数増殖は、各ドナーの最初のＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の計数に対する生細胞および平均総Ｔ細胞の計数に由来するＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋細胞のパーセンテージを使用して計算した。平均して、Ｔ－ＣＥＰは、ｉ αＣＤ３（６７倍、Ｐ＜０．００５）、ｉ αＣＤ３およびｓ αＣＤ２８（１０８倍、Ｐ＜０．０５）、またはＴＡＣ（１１２倍、Ｐ＜０．０５）と比較して、１２日間にわたり２７９倍、ＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の計数を増大させることが見出された（図７Ｆ）。

参照文献
１． Ｍｅｔ， Ｏ．， Ｊｅｎｓｅｎ， Ｋ． Ｍ．， Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ， Ｃ． Ａ．， Ｄｏｎｉａ， Ｍ． ＆ Ｓｖａｎｅ， Ｉ． Ｍ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４１， ４９－５８ （２０１９）．
２． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｄｕｒａｂｌｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｈｅａｖｉｌｙ ｐｒｅｔｒｅａｔｅｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｕｓｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． １７， ４５５０－４５５７ （２０１１）．
３． Ｚａｃｈａｒａｋｉｓ， Ｎ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｄｕｒａｂｌｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２４， ７２４－７３０ （２０１８）．
４． Ｈｏｌｓｔｅｉｎ， Ｓ． Ａ． ＆ Ｌｕｎｎｉｎｇ， Ｍ． Ａ． ＣＡＲ Ｔ－Ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ： Ａ ｖｏｙａｇｅ ｉｎ ｐｒｏｇｒｅｓｓ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ． １０７， １１２－１２２ （２０２０）．
５． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ．， Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ． Ｐ．， Ｙａｎｇ， Ｊ． Ｃ．， Ｍｏｒｇａｎ， Ｒ． Ａ． ＆ Ｄｕｄｌｅｙ， Ｍ． Ｅ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐａｔｈ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ ８， ２９９－３０８ （２００８）．
６． Ｐｈａｎ， Ｇ． Ｑ． ＆ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｏｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ： Ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｎｄ ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ２０， ２８９－２９７ （２０１３）．
７． Ｌｉ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ． Ｔａｒｇｅｔ． Ｔｈｅｒ． ４， １－１７ （２０１９）．
８． Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎ， Ｊ． Ｅ．， Ｋｏｒｅｔｚｋｙ， Ｇ． Ａ． ＆ Ｊｏｒｄａｎ， Ｍ． Ｓ． Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７， ５９１－６１９ （２００９）．
９． Ｊｉａｎｇ， Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ ｃａｎｃｅｒ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ． ４６２， ２３－３２ （２０１９）．
１０． Ｌｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ＣＤ４＋ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ １ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ＣＤ８＋ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｕｒ， ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｍｅｍｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｔｕｍｏｕｒ ｅｐｉｔｏｐｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６， ｅ１６０ （２０１７）．
１１． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｌｌ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｐａｒａｄｏｘｉｃａｌｌｙ ｉｍｐａｉｒｓ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ＣＤ８ ＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１５， １４６７ （２００５）．
１２． Ｃｒｏｍｐｔｏｎ， Ｊ． Ｇ．， Ｍａｄｈｕｓｕｄｈａｎａｎ， Ｓ． ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ． Ｐ． Ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２５７， ２６４－２７６ （２０１４）．
１３． Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｃ． Ａ．， Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ． ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ． Ｐ． Ｓｏｒｔｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｂｓｅｔｓ： Ｗｈｉｃｈ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？ Ｊ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ３５， ６５１－６６０ （２０１２）．
１４． Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ， Ｌ．， Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｃ． Ａ． ＆ Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｎ． Ｐ． Ｐａｔｈｓ ｔｏ ｓｔｅｍｎｅｓｓ： ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｔｈｅ ｕｌｔｉｍａｔｅ ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ Ｔ ｃｅｌｌ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｃａｎｃｅｒ １２， ６７１－８４ （２０１２）．
１５． Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｃ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｅｘ ｖｉｖｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＩ３Ｋｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ａｎｄ ＶＩＰ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ． Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ． ２， ２１０－２２３ （２０１８）．
１６． Ｌｉ， Ｙ． ＆ Ｋｕｒｌａｎｄｅｒ， Ｒ． Ｊ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ａｎｄ ａｎｔｉ－ＣＤ２８－ｃｏａｔｅｄ ｂｅａｄｓ ｗｉｔｈ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ｆｏｒ ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ： Ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ ｔｏ ｒｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ． Ｊ． Ｔｒａｎｓｌ． Ｍｅｄ． ８， １０４ （２０１０）．
１７． Ｋａｇｏｙａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｘｐｎｄｓ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ． ＪＣＩ ｉｎｓｉｇｈｔ ２， ８９５８０ （２０１７）．
１８． Ｇｉａｎｎｏｎｉ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｔ Ｃｅｌｌ ｌｉｇａｎｄｓ ｏｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＡＰＣ ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ Ｔ Ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ θ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７４， ３２０４－３２１１ （２００５）．
１９． Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｉｇｉｄｉｔｙ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｃｅｌｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８９， １３３０－１３３９ （２０１２）．
２０． Ｊｕｄｏｋｕｓｕｍｏ， Ｅ．， Ｔａｂｄａｎｏｖ， Ｅ．， Ｋｕｍａｒｉ， Ｓ．， Ｄｕｓｔｉｎ， Ｍ． Ｌ． ＆ Ｋａｍ， Ｌ． Ｃ． Ｍｅｃｈａｎｏｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． １０２， Ｌ５－Ｌ７ （２０１２）．
２１． Ｂｏｒｔｏｌｅｔｔｏ， Ｎ．， Ｓｃｏｔｅｔ， Ｅ．， Ｙｏｉｃｈｉ， Ｍ．， Ｄ’Ｏｒｏ， Ｕ． ＆ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， Ａ． Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ＣＤ３ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３２， ３１０２－３１０７ （２００２）．
２２． Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ， Ａ． ＆ Ｓａｌｌｕｓｔｏ， Ｆ． Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７， ３２６－３３２ （２００５）．
２３． Ｌｏｆｆｌｅｒ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ， ＣＤ１９ Ｘ ＣＤ３， ｉｎｄｕｃｅｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｌｙｍｐｈｏｍａ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｂｙ ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｂｌｏｏｄ ９５， ２０９８－２１０３ （２０００）．
２４． Ｇｒｏｓｓｅ－Ｈｏｖｅｓｔ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｔａｒｇｅｔｅｄ， ｓｕｐｒａ－ａｇｏｎｉｓｔｉｃ ＣＤ２８－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３３， １３３４－１３４０ （２００３）．
２５． Ｃｈｅｎ， Ｘ．， Ｚａｒｏ， Ｊ． Ｌ． ＆ Ｓｈｅｎ， Ｗ． Ｃ． Ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｎｋｅｒｓ： Ｐｒｏｐｅｒｔｙ， ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ． Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． ６５， １３５７－１３６９ （２０１３）．
２６． Ｉｓａｍｕ， Ａ． ＆ ＫＯＫＡＪＩ． Ｓｏｌｕｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｆｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｏｒ ＮＫ ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ． （２０１５）．
２７． Ｌａｗ， Ｃ．－Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｏｌｕｂｌｅ ｈｕｍａｎ ＣＤ３ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｎａｔｉｖｅ ＴＣＲ－ＣＤ３ ｃｏｍｐｌｅｘ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４， ３８９－４００ （２００２）．
２８． Ｄｕｓｈｅｋ， Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｏｔｅｎｃｙ ａｎｄ ｍａｘｉｍａｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｒｅｖｅａｌ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｓｃｉ． Ｓｉｇｎａｌ． ４， ｒａ３９ （２０１１）．
２９． Ｐｏｗｅｌｌ， Ｄ． Ｊ．， Ｄｕｄｌｅｙ， Ｍ． Ｅ．， Ｒｏｂｂｉｎｓ， Ｐ． Ｆ． ＆ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ． Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｔｅ－ｓｔａｇｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ＣＤ２７＋ ＣＤ２８＋ ｔｕｍｏｒ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｆｔｅｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｌｏｏｄ １０５， ２４１－２５０ （２００５）．
３０． Ｈａｍａｎｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７－ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｄｉｖｉｓｉｏｎ． Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１， １０２７－１０３３ （１９９９）．
３１． Ｌａｒｂｉ， Ａ． ＆ Ｆｕｌｏｐ， Ｔ． Ｆｒｏｍ ’ｔｒｕｌｙ ｎａｉｖｅ’ ｔｏ ’ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ’ Ｔ ｃｅｌｌｓ： Ｗｈｅｎ ｍａｒｋｅｒｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ． Ｃｙｔｏｍ． Ｐａｒｔ Ａ ８５， ２５－３５ （２０１３）．
３２． Ｄｉ Ｍｉｔｒｉ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＡ＋ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８７， ２０９３－２１００ （２０１１）．
３３． Ｒａｂｅｎｓｔｅｉｎ， Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉｇｅｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ ｏｆ ＣＤ４ ＋ ａｎｄ ＣＤ８ ＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９２， ３５０７－３５１７ （２０１４）．
３４． Ｆｏｕｌｄｓ， Ｋ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ： ＣＤ４ ａｎｄ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｆ． １６８， １５２８－１５３２ （２００２）．
３５． Ｋａａｒｔｉｎｅｎ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｗ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆａｖｏｒｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｖｅｒ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ １９， ６８９－７０２ （２０１７）．
３６． Ｐｒｉｅｔｏ， Ｐ． Ａ．， Ｄｕｒｆｌｉｎｇｅｒ， Ｋ． Ｈ．， Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ． ＆ Ｄｕｄｌｅｙ， Ｍ． Ｅ． Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ８＋ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｕｍｏｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ａｄｏｐｔｉｖｅｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３３， ５４７－５５６ （２０１０）．
３７． Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｓｅｌｆ／ｔｕｍｏｒ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｆｅｒ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １０２， ９５７１－９５７６ （２００５）．
３８． Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｆｉｎｅｄ ＣＤ８＋ ａｎｄ ＣＤ４＋ ｓｕｂｓｅｔｓ ｃｏｎｆｅｒ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ３０， ４９２－５００ （２０１６）．
３９． Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｒ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ４ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｆｉｎｅｄ ｂｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＣＲ７ ａｎｄ ＣＤ２７． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７５， ６４８９－６４９７ （２００５）．
４０． Ｍａｈｎｋｅ， Ｙ． Ｄ．， Ｂｒｏｄｉｅ， Ｔ． Ｍ．， Ｓａｌｌｕｓｔｏ， Ｆ．， Ｒｏｅｄｅｒｅｒ， Ｍ． ＆ Ｌｕｇｌｉ， Ｅ． Ｔｈｅ ｗｈｏ’ｓ ｗｈｏ ｏｆ Ｔ－ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ： Ｈｕｍａｎ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３， ２７９７－２８０９ （２０１３）．
４１． Ｈａｍａｎｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６， １４０７－１４１８ （１９９７）．
４２． Ｓｃｈｉｏｔｔ， Å．， Ｌｉｎｄｓｔｅｄｔ， Ｍ．， Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ－Ｌｉｎｄｂｏｍ， Ｂ．， Ｒｏｇｇｅｎ， Ｅ． ＆ Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ， Ｃ． Ａ． Ｋ． ＣＤ２７－ＣＤ４＋ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｆｉｎｅ ａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｍｅｍｏｒｙ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｔ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１３， ３６３－３７０ （２００４）．
４３． Ｃａｌｌｅｎｄｅｒ， Ｌ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ ＣＤ８＋ ＥＭＲＡ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｉｓｐｌａｙ ａ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｐ３８ ＭＡＰＫ． Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ １７， ｅ１２６７５ （２０１８）．
４４． Ｇｒａｅｆ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｔｅｍｎｅｓｓ ｏｆ ＣＤ８＋ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４１， １１６－１２６ （２０１４）．
４５． Ｈｕａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ－２ ｏｆ ＣＤ７０ ａｎｄ ＣＤ２７ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７６， ７７２６－３５ （２００６）．
４６． Ｃｏｈｅｎ， Ａ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １２９， ２２１０－２２２１ （２０１９）．
４７． Ｈｅｎｄｒｉｋｓ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． ＣＤ２７ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １， ４３３－４４０ （２０００）．
４８． Ｈｅｎｄｒｉｋｓ， Ｊ．， Ｘｉａｏ， Ｙ． ＆ Ｂｏｒｓｔ， Ｊ． ＣＤ２７ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ ＣＤ２８ ｉｎ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｐｏｏｌ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９８， １３６９－１３８０ （２００３）．
４９． Ｎｅｅｓｏｎ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘ ｖｉｖｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ－ｌｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １７， １１０５－１１１６ （２０１０）．
５０． Ｃｈａ， Ｅ．， Ｇｒａｈａｍ， Ｌ．， Ｍａｎｊｉｌｉ， Ｍ． Ｈ． ＆ Ｂｅａｒ， Ｈ． Ｄ． ＩＬ－７ ＋ ＩＬ－１５ ａｒｅ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ｔｏ ＩＬ－２ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ４Ｔ１ ｍａｍｍａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｇｒｅａｔｅｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． Ｔｒｅａｔ． １２２， ３５９－３６９ （２０１０）．
５１． Ｐｒｏｄｅｕｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ． ＶＩＳＴＡ．ＣＯＭＰ－ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｇｏｎｉｓｔ ｔｈａｔ ｐｏｔｅｎｔｌｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ． ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ２， ｅ９４３０８ （２０１７）．

上記開示は、全般的に本発明を記述する。特定の用語が本明細書中使用されているが、当該用語は、説明の意味で意図されており、限定するためのものではない。

上述の全ての刊行物、特許および特許出願は、各個々の刊行物、特許、または特許出願がその全体が参照により組み込まれているように具体的かつ個別に記載されている場合と同じ度合いで、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている。

本発明の好ましい実施形態が本明細書に詳細に記載されているが、本発明の趣旨または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、それに対する変動がなされ得ることを、当業者は理解するであろう。

Claims (29)

1. ＣＤ３経路およびＣＤ２８経路の両方を刺激する二重特異性ｓｃＦｖコンストラクト。
2. 可溶性である、請求項１に記載のコンストラクト。
3. ヒトＴ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで活性化、増殖、および分化する、請求項１または２に記載のコンストラクト。
4. フェムトモル濃度の範囲、たとえば約１０～約５００ｆＭ、たとえば約１７０ｆＭの濃度で活性である、請求項３に記載のコンストラクト。
5. 固定化された抗ＣＤ３ ｍＡｂ／可溶性抗ＣＤ２８ ｍＡｂまたは可溶性抗ＣＤ３／ＣＤ２８ ｍＡｂ複合体を含む方法と比較して１２日間の過程にわたりヒトＣＤ８^＋Ｔ細胞の優先的な増殖を促進する、請求項１～３のいずれか１項に記載のコンストラクト。
6. ＣＤ８^＋ＣＤ２７^＋Ｔ細胞の表現型の増殖を優先する、請求項１～５のいずれか１項に記載のコンストラクト。
7. 抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖが前記コンストラクトのＮ末端にあり、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖが前記コンストラクトのＣ末端にある、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト。
8. 抗ＣＤ３ ｓｃＦｖが前記コンストラクトのＮ末端にあり、抗ＣＤ２８ ｓｃＦｖが前記コンストラクトのＣ末端にある、請求項１～６のいずれか１項に記載のコンストラクト。
9. １つ以上の可動性リンカー、たとえば１、２、または３つの可動性リンカーを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載のコンストラクト。
10. 各ｓｃＦｖの各重鎖および軽鎖ドメインの間に可動性リンカー、ならびに各ｓｃＦｖの間に可動性リンカーを含む、請求項９に記載のコンストラクト。
11. １：１のモル比でＴＣＲの活性化および共刺激のためのシグナルの両方に係合する、請求項１～１０のいずれか１項に記載のコンストラクト。
12. 精製タグおよび／または検出タグを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のコンストラクト。
13. ヒスチジンタグを含む、請求項１２に記載のコンストラクト。
14. 配列番号１：
    ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＳＬＡＶＳＬＧＱＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬＭＱＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＦＡＡＳＮＶＥＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＮＦＳＬＮＩＨＰＶＤＥＤＤＶＡＭＹＦＣＱＱＳＲＫＶＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶＫＬＱＱＳＧＰＧＬＶＴＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＤＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＱＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳＲＫＳＩＳＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＡＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＫＧＹＳＹＹＹＳＭＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＶＰＹＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ
    と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはそのフラグメントを含むかまたはからなる、請求項１～１４のいずれか１項に記載のコンストラクト。
15. 配列番号１と少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の同一性を有するポリペプチド、またはそのフラグメントを含むかまたはからなる、請求項１４に記載のコンストラクト。
16. 配列番号１を有するポリペプチドを含むかまたはからなる、請求項１４に記載のコンストラクト。
17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンストラクトをコードするポリヌクレオチド。
18. 配列番号２：
    ｇａｃａｔｃｇｔｇｃｔｇａｃａｃａｇａｇｃｃｃｔｇｃｔｔｃｔｃｔｇｇｃｃｇｔｇｔｃｔｃｔｇｇｇａｃａｇａｇａｇｃｃａｃｃａｔｃａｇｃｔｇｔａｇａｇｃｃａｇｃｇａｇａｇｃｇｔｇｇａａｔａｔｔａｃｇｔｇａｃｃａｇｃｃｔｇａｔｇｃａｇｔｇｇｔａｔｃａｇｃａｇａａｇｃｃｔｇｇｃｃａｇｃｃｔｃｃｔａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｃｔｔｃｇｃｃｇｃｃａｇｃａａｔｇｔｇｇａａａｇｃｇｇａｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｇａｔｔｔｔｃｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃａｇｃｇｇｃａｃｃａａｃｔｔｃａｇｃｃｔｇａａｃａｔｔｃａｃｃｃｃｇｔｇｇａｃｇａｇｇａｃｇａｃｇｔｇｇｃｃａｔｇｔａｃｔｔｔｔｇｃｃａｇｃａｇａｇｃａｇａａａｇｇｔｇｃｃｃｔａｃａｃｃｔｔｔｇｇｃｇｇａｇｇｃａｃｃａａｇｃｔｇｇａａａｔｃａａｇａｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａｇｇａｔｃｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｇｇａａｇｃｇｇａｇｇｃｇｇｃｇｇａｔｃｔｃａａｇｔｇａａａｃｔｇｃａｇｃａｇｔｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｔｃａｃａｃｃｔｔｃｔｃａｇａｇｃｃｔｇａｇｃａｔｃａｃｃｔｇｔａｃｃｇｔｇｔｃｃｇｇｃｔｔｔａｇｃｃｔｇａｇｃｇａｔｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｃｔｇｇｇｔｃｃｇａｃａｇｔｃｔｃｃａｇｇａｃａａｇｇａｃｔｇｇａａｔｇｇｃｔｇｇｇａｇｔｇａｔｔｔｇｇｇｃｔｇｇｃｇｇａｇｇｇａｃａａａｃｔａｃａａｃａｇｃｇｃｃｃｔｇａｔｇａｇｃｃｇｇａａｇｔｃｃａｔｃａｇｃａａｇｇａｃａａｃａｇｃａａｇａｇｃｃａｇｇｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇａｔｇａａｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｇｃｃｇａｃｇａｃａｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｃｔａｔｔｇｃｇｃｃａｇａｇａｃａａｇｇｇｃｔａｃａｇｃｔａｃｔａｃｔａｃａｇｃａｔｇｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇｃａｃｃａｃｃｇｔｇａｃａｇｔｔａｇｃｔｃｔｇｃｃｔｃｔａｃａａａｇｇｇｃｃｃｃａｇｃｇｔｇｔｔｃｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｃｔｇｇａａｇｔｇｇｃｇｇｔｇｇｔｇｇａｔｃａｇｇｃｇｇｔｇｇｃｇｇｔｔｃｔｇｇｃｇｇａｇｇｃｇｇａａｇｔｇａｔａｔｔａａｇｃｔｇｃａｇｃａｇａｇｃｇｇａｇｃｃｇａｇｃｔｇｇｃｔａｇａｃｃｔｇｇｔｇｃｃｔｃｔｇｔｇａａｇａｔｇａｇｃｔｇｃａａｇａｃｃａｇｃｇｇｃｔａｃａｃｃｔｔｃａｃｃａｇａｔａｃａｃｃａｔｇｃａｔｔｇｇｇｔｃａａｇｃａｇｃｇｇｃｃｔｇｇａｃａｇｇｇａｃｔｔｇａｇｔｇｇａｔｃｇｇｃｔａｃａｔｃａａｃｃｃｃａｇｃｃｇｇｇｇｃｔａｃａｃｃａａｃｔａｃａａｃｃａｇａａｇｔｔｃａａｇｇａｃａａｇｇｃｃａｃａｃｔｇａｃｃａｃｃｇａｃａａｇａｇｃａｇｃａｇｃａｃａｇｃｃｔａｃａｔｇｃａｇｃｔｇａｇｃａｇｃｃｔｇａｃｃａｇｃｇａａｇａｔａｇｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｃｃｇｇｔａｃｔａｃｇａｃｇａｃｃａｃｔａｃｔｇｃｃｔｇｇａｔｔａｔｔｇｇｇｇａｃａｇｇｇａａｃａａｃｃｃｔｇａｃｃｇｔｇｔｃｔａｇｔｇｔｇｇａａｇｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃｇｇｔａｇｃｇｇｔｇｇｃｔｃｔｇｇｔｇｇａａｇｃｇｇｃｇｇａｇｔｇｇａｔｇａｔａｔｃｃａｇｃｔｇａｃｔｃａｇｔｃｃｃｃｔｇｃｃａｔｃａｔｇｔｃｔｇｃｔａｇｃｃｃｔｇｇｃｇａｇａａａｇｔｇａｃｃａｔｇａｃｃｔｇｃａｇａｇｃｃａｇｃａｇｃｔｃｃｇｔｇｔｃｃｔａｃａｔｇａａｃｔｇｇｔａｔｃａａｃａａａａｇａｇｃｇｇｃａｃａａｇｃｃｃｃａａｇｃｇｇｔｇｇａｔｃｔａｃｇａｔａｃａａｇｃａａｇｇｔｇｇｃｃａｇｃｇｇｃｇｔｇｃｃｃｔａｔａｇａｔｔｔｔｃｔｇｇａａｇｃｇｇａｔｃｃｇｇｃａｃｃａｇｃｔａｃｔｃｃｃｔｇａｃａａｔｃａｇｃａｇｃａｔｇｇａａｇｃｃｇａｇｇａｔｇｃｃｇｃｃａｃｃｔａｃｔａｃｔｇｃｃａａｃａｇｔｇｇｔｃｃａｇｃａａｔｃｃｃｃｔｇａｃｃｔｔｔｇｇａｇｃｃｇｇａａｃａａａｇｃｔｇｇａａｃｔｇａａｇｃａｃｃａｃｃａｃｃａｔｃａｃｃａｃ
    と少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド、またはそのフラグメントを含むかまたはからなる、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
19. 請求項１７または１８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
20. 請求項１９に記載のベクターを含む宿主細胞。
21. 請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンストラクトと担体とを含む組成物。
22. 養子Ｔ細胞療法のための、請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項１７もしくは１８に記載のポリヌクレオチド、請求項２０に記載の宿主細胞、または請求項２１に記載の組成物。
23. Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖させるための、請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項１７もしくは１８に記載のポリヌクレオチド、請求項２０に記載の宿主細胞、または請求項２１に記載の組成物。
24. がんを処置および／または予防するための、請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンストラクト、請求項１７もしくは１８に記載のポリヌクレオチド、請求項２０に記載の宿主細胞、または請求項２１に記載の組成物。
25. Ｔ細胞をｅｘ ｖｉｖｏで増殖、活性化、および／または分化するための方法であって、Ｔ細胞を、請求項１～１６のいずれか１項に記載のコンストラクトとインキュベートするステップを含む、方法。
26. 前記コンストラクトが、約１０～約５００ｆＭ、たとえば約１７０ｆＭの濃度で使用される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記インキュベートが、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４日間、たとえば約１２日間の期間である、請求項２５または２６に記載の方法。
28. 請求項２５に記載の方法により作製されるＴ細胞。
29. がんを処置するための方法であって、請求項２８に記載のＴ細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
    

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