DE68918331T2

DE68918331T2 - Menschlicher kristallinischer Granulocyt-Koloniestimulierungsfaktor und dessen Herstellung.

Info

Publication number: DE68918331T2
Application number: DE68918331T
Authority: DE
Inventors: Toshio Akimoto; Sadao Tanaka
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-06-03
Filing date: 1989-06-02
Publication date: 1995-05-18
Anticipated expiration: 2009-06-03
Also published as: EP0344796A2; EP0344796B1; ES2063783T3; DE68918331D1; ATE111921T1; EP0344796A3

Description

Der menschliche Granulocyten-koloniestimulierende Faktor hier als menschlicher G-CSF bezeichnet) wirkt auf menschliche Knochenmarkszellen. Er induziert deren Differenzierung und Proliferation zu Granulocyten. Es wird erwartet, daß menschlicher G-CSF als Arzneimittel in der Chemotherapie oder zur Verhinderung verschiedener Leukämiearten und als Heilmittel bei ernsten Infektionskrankheiten angewendet wird, die nicht ausschließlich mit Antibiotika behandelt werden können.
Es wurde von verschiedenen menschlichen G-CSF-Typen berichtet. Natürlich vorkommender, menschlicher G-CSF wurde aus dem Kulturüberstand G-CSF herstellender Zellen isoliert. Diese stammten von menschlichen Tumorzellen aus Patienten mit Mundkrebs (japanisches Patent, Veröffentlichungsnr. 62-227526). Unter Verwendung von E.coli als Wirtszellen wurde mittels der rekombinanten DNA-Technologie G-CSF ohne Zuckerketten hergestellt (japanisches Patent, Veröffentlichungsnr. Nr. 62-132898 und Nr. 62-132899). G-CSF wurde auch als Glycoprotein mittels tierischer Wirtszellen hergestellt (japanisches Patent Veröffentlichungsnr. 62-236497).
Viele verschiedene Techniken wurden zur Kristallisation von Proteinen oder Polypeptiden entwickelt. Tatsächlich wird insbesondere die Kristallisation von Enzymen als eines der wirksamsten Verfahren zur Steigerung der Reinheit durchgeführt. Es wurde jedoch kein allgemein anwendbares Verfahren zur Kristallisation entwickelt. Die Enzymspezies, sowie die Kristallisationsbedingungen die PH, Ionenstärke, Temperatur und Proteinkonzentration können variieren.
Ferner sind einige bioaktive Proteine oder Polypeptide gegenüber Änderungen des PH, der Ionenstärke, der Temperatur usw. sehr instabil, was zu möglichen Veränderungen der dreidimensionalen Struktur und einer Verminderung oder einem vollständigen Verlust der Aktivität führt. Es ist daher notwendig, geeignete Kristallisationsbedingungen zu wählen, die keinerlei Veränderung der dreidimensionalen Struktur bewirken.
Es ist allgemein bekannt, daß viele nach dem Versuch- und Irrtumsprinzip zu bestimmende Faktoren an der Protein-Kristallisation beteiligt sind. So sind in vielen Fällen der Kristallisation eine Menge Versuche notwendig.
Zur Kristallisation von Proteinen aus einer wäßrigen Lösung ist es notwendig, die stärkere Affinität zwischen den Proteinmolekülen als zwischen Protein und Wasser stufenweise zu erhöhen. Im Hinblick auf Moleküle, wie Proteine, mit einem hohen Molekulargewicht und komplexe, physikalische Eigenschaften aufweisenden Oberflächen ist es offensichtlich, daß das Gesetz gilt, welches die Minimierung der freien Energie bei der Interaktion zwischen Proteinen bestimmt. Die Interaktion zwischen Proteinen ist jedoch wesentlich komplexer als zwischen organischen Verbindungen mit niedrigen Molekulargewichten. Es wird in Betracht gezogen, daß die verschiedenen Faktoren, die Interaktionen zwischen Proteinen bewirken elektrische Ladungen, sterische-, hydrophobe-, hydrophile- und van der Waals-Effekte umfassen. Die Interaktionen zwischen Proteinen sowie zwischen Proteinen und Wasser wirken derart, daß sich ein diese Proteine enthaltendes System in dem stabilsten Zustand befindet. So zeigen Proteinmoleküle in Abhängigkeit von der Konzentration, der Temperatur, dem pH, der Ionenstärke usw. verschiedene Arten von Wechselwirkungen. In einigen Fällen können die Proteine auskristallisieren in anderen nicht, was nur zu einer Aggregation führt. Sogar im Fall, daß ein Protein kristallisiert, kann ein Kristall-Polymorphismus in Abhängigkeit von derartigen Faktoren wie Proteinkonzentration, Temperatur, Ionenstärke usw. erzeugt werden.
Es ist bekannt, daß es sehr schwierig ist, die Kristallisation von Proteinen mit geringer Reinheit zu erreichen.
Wie vorstehend beschrieben, wurden viele Versuche zur Kristallisation von Proteinen und Polypeptiden durchgeführt, und die Kristallisation von einigen Proteinen war tatsächlich erfolgreich. Die meisten erfolgreichen Versuche waren jedoch unter der großen Zahl natürlich vorkommender Proteine auf reine Proteine, sowie auf sehr stabile Proteine beschränkt, wie extrazelluläre und aus Pflanzen isolierte Proteine.
Durch Kristallisation von menschlichem G-CSF, was kürzlich als sehr schwierig betrachtet wurde, werden die folgenden wichtigen Vorteile erzielt:
(1) die Erhöhung der Reinheit und die Verringerung der Antigenität;
(2) die Steigerung der Stabilität, wodurch die Handhabung von G-CSF während der Lagerung und der Arzneimittel- Herstellung erleichtert wird; und
(3) die Steigerung der G-CSF-Aktivität.
Fig. 1 stellt eine mikroskopische Aufnahme (x 100) von mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestelltem kristallinem menschlichem G-CSF dar.
Fig. 2 stellt die die Koloniebildung stimulierende Aktivität von mittels des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens hergestelltem kristallinem menschlichem G-CSF dar.
Fig. 3a und 3b stellen HPLC-Chromatogramme von menschlichem Roh-G-CSF bzw. kristallinem menschlichem G-CSF dar [Nachweis, Absorption bei 200 nm: Elutionspuffer 10 mM Phosphatpuffer (pH 6.8) + 100 mM NaCl; Säule, GPC (TSK G-3000); Durchflußrate, 1 ml/min.].
Fig. 4 stellt eine Präzessionsaufnahme von (OKl) Kristallen I und II (u = 100) des mittels des Verfahrens aus Beispiel hergestellten kristallinen menschlichen G-CSF dar.
Fig. 5 stellt eine mikroskopische Aufnahme (x 84) des mittels des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens hergestellten kristallinen menschlichen G-CSF dar.
Viele der mittels der vorstehenden Verfahren gereinigten menschlichen G-CSF-Typen (japanische Patente, Veröffentlichungsnr. 61-227526 62-132898, 62-132899 und 62-236497) werden in einem neutralen oder schwach sauren Puffer gelöst und kristallisieren in Gegenwart eines Kristallisationsagens aus. Die Kristalle werden dann mittels Zentrifugation gewonnen.
Vorzugsweise wird kristalliner menschlicher G-CSF soweit gereinigt, daß er beim Lösen in Wasser weder Verunreinigungen noch jegliche Polymere wie Dimere oder Trimere enthält.
Bei dem vorliegenden Kristallisationsverfahren als Ausgangsmaterialien verwendete menschliche G-CSFs umfassen einen natürlich vorkommenden menschlichen G-CSF, wobei es sich um ein Glycoprotein handelt, einen unter Verwendung tierischer Wirtszellen mittels rekombinanter DNA-Technik hergestellten menschlichen G-CSF und seine Abkömmlinge und einen mittels rekombinanter DNA-Technik unter Verwendung von E.coli als Wirt hergestellten menschlichen G-CSF ohne Zuckerketten und seine Abkömmlinge. Allgemein ist die Kristallisation von Glycoproteinen und Proteinen mit Zuckerketten schwieriger als von Proteinen ohne Zuckerketten. Das vorliegende Kristallisationsverfahren ermöglicht jedoch die Kristallisation von als Glycoprotein vorliegenden menschlichen G-CSFs.
Die Kristallisation des menschlichen G-CSF mittels der vorliegenden Erfindung dann unter Verwendung von Gas-Dampf- Gleichgewichtsverfahren wie das Verfahren des hängenden Tropfens und das Verfahren, das einen eine Vertiefung aufweisenden Objektträger verwendet; Fällungsmittel verwendenden Verfahren wie das Knopfverfahren (Button method) das Dialysemembran-Verfahren und das Batchverfahren; und Dialyseverfahren wie das Knopfverfahren (Button method) und das Dialysemembran-Verfahren durchgeführt werden.
Jedes dieser Verfahren wird nachstehend erläutert.

Gas-Dampf-Gleichgewichtsverfahren

Typische Beispiele dieses Verfahrens sind das Verfahren des hängenden Tropfens und das einen eine Vertiefung aufweisenden Objektträger verwendende Verfahren. Bei beiden Verfahren wird ein zu kristallisierender menschlicher G-CSF in schwach sauren oder neutralen Puffern wie Acetat-, Phosphat-, Citrat-, Phosphat-Citratpuffer mit einer Konzentration von 5 bis 100 mM gelöst, die vorzugsweise einen pH von 3.0 bis 7.0 aufweisen. Vorzugsweise liegt die Konzentration von menschlichem G-CSF in einem Puffer im Bereich von etwa 1 bis 100 mg/ml.
Zu dem menschlichen G-CSF wie vorstehend beschrieben enthaltenden Puffer werden ein Kristallisationsagens wie neutrale oder schwach saure Salze z. B. (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, Na&sub2;SO&sub4;, NaCl, KCl, NH&sub4;Cl, NaH&sub2;PO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;, NH&sub4;H&sub2;PO&sub4;, LiCl, CsCl, CaCl&sub2;, MgCl&sub2;, MgSO&sub4; usw. und anschließend eine organische Verbindung
z. B. Polyethylenglycol gegeben. Obgleich die Konzentration des Fällungsmittels in Abhängigkeit von der Art des Agens und des Puffers variiert, wird (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; in einer Konzentration von etwa 1 bis 20%, vorzugsweise von etwa 2 bis 15% der Sättigungsmenge verwendet. Weitere Fällungsmittel werden zur Kristallisation in einer Konzentration von etwa 0.1 bis 1.5 M, vorzugsweise etwa 0.2 bis 1.2 M verwendet.
Ferner kann zu der Proteinlösung, falls notwendig ein stabilisierendes Agens (z. B. neutrale Salze wie NaCl, KCl CsCl, MgCl&sub2; und CaCl&sub2; oder organische Verbindungen wie Glycerol, Dioxan und Aceton), ein Antiseoticum (z. B. NaN&sub3;), ein komplexbildendes Agens für Schwermetalle (z. B. EDTA), ein Thiolgruppen schützendes Agens oder Anti-Oxidationsmittel (z. B. Mercaptoethanol, Cystein, Glutathion und Dithiothreitol), ein einer Polymerisation entgegen wirkendes Agens, grenzflächenaktives Mittel (z. B. Octyl-β-glycosid, Hexantriol, Tween® oder Octaethylenglycol-n-dodecylether) usw. zugesetzt werden.
Bei dem Verfahren des hängenden Tropfens werden Tröpfchen der mittels des vorstehenden Verfahrens hergestellten Lösung aus menschlichem G-CSF auf die Rückseite eines Deckglases gegeben. Die Glasplatte wird auf ein Reservoir gelegt, das eine zuvor bestimmte Menge an Fällungsmittel und einen Puffer enthält, üblicher Weise den gleichen, der auch zur Herstellung der Lösung aus menschlichem G-CSF verwendet wurde. Das Reservoir wird vollständig mit Silicon verschlossen.
Bei dem einen eine Vertiefung aufweisenden Objektträger verwendenden Verfahren wird eine zuvor bestimmte Menge eines Puffers und Fällungsmittels in ein Reservoir gegeben. Auf einen eine Vertiefung aufweisenden Glasobjektträger wird eine Lösung aus menschlichem G-CSF gegeben. Das Reservoir wird bis 21 Tage bei 5 bis 30ºC vorzugsweise in einem erschütterungsfreien Inkubator stehengelassen. So wird kristalliner, menschlicher G-CSF hergestellt.

Aussalzungsverfahren mittels Dialyse (Fällungsverfahren)

Eine 1 bis 100 mg/ml menschlichen G-CSF in einem Puffer enthaltende Lösung wird in einen Dialyseschlauch gefüllt und fegen den gleichen das Fällungsmittel zu 10 bis 14% Sättigung enthaltenden Puffer [z. B. 10 bis 14% Sättigung an (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 0.2 bis 1.5 M NaCl, 0.2 bis 1.5 M NaH&sub2;PO&sub4; usw.] oder gegen Polyethylenglykollösung bis zum Wachstum des Kristalls (normalerweise für 1 Woche) dialysiert. Danach können die hergestellten Kristalle durch Zentrifugieren des Inhalts des Dialyseschlauchs isoliert werden.

Knopf- und Dialyseverfahren unter Verwendung einer Dialysemembran

Eine 1 bis 100 mg/ml menschlichen G-CSF enthaltende Pufferlösung wird zur Kristallisation in einen "Knopf" (button) gefüllt, mit einem EDTA-behandelten Dialyseschlauch verschlossen und gegen den gleichen niedrig konzentrierten Puffer i Tag bis 1 Woche dialysiert. Durch Zentrifugation des Inhalts des "Knopfes" (button) können die hergestellten nadelförmigen Kristalle dann isoliert werden.

Batchverfahren

Eine 1 bis 100 mg/ml menschlichen G-CSF enthaltende Pufferlösung wird in geeignete Behälter gefüllt. Zu den Behältern wird eine Lösung des üblicherweise in dem gleichen Puffer gelösten Fällungsmittels gegeben. Die erhaltene Lösung wird falls erforderlich gerührt. Das Gemisch wird etwa 1 bis 2 Wochen zur Herstellung von kristallinem menschlichen G-CSF in Form von farblosen, plättchenförmigen Kristallen stehengelassen.
Die Kristalle können aus der sie enthaltenden Pufferlösung mittels Zentrifugation isoliert werden.

Charakterisierung der Kristalle

Der durch diese Erfindung erhaltene kristalline menschliche G-CSF wurde mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht. Drei Kristallarten mit den folgenden Charakteristika wurden identifiziert.
I Kristallform: orthorhombisch
Raumgruppe: P22&sub1;2&sub1;
Achsenlänge (Å): a = 29, b = 94, c = 111
Lösungsmittelvolumen (%): Vs = 37
II Kristallform: orthorhombisch
Raumgruppe: P2&sub1;2&sub1;2&sub1;
Achsenlänge (Å): a : 28, b : 100, c : 110
Lösungsmittelvolumen (%): Vs = 37
III Kristallform: orthorhombisch
Raumgruppe: P22&sub1;2&sub1;
Achsenlänge (Å): a = 29, b = 107, c = 114
Lösungsmittelvolumen (%): Vs = 46
Eine Präzessionsaufnahme (OKl) der Kristalle I und II (u - 10º) ist in Fig. 4 dargestellt.
In einigen Fällen werden Chimärkristalle der vorstehend beschriebenen kristallinen Stoffe I und II hergestellt.

Messung der Aktivität des kristallinen menschlichen G-CSF

Zur Messung der Aktivität des kristallinen menschlichen G-CSF wurde die koloniestimulierende Aktivität (CSA) mittels des folgenden Verfahrens in vitro untersucht.

(Testverfahren)

Der CSA-Test wurde mittels des einschichtigen Züchtungsverfahrens in Weichagar (Bradley T.R. und Metealf D. et al., Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 44 (1966), 287-300) durchgeführt. Ein Gemisch aus 1 ml Pferdeserum (Hyclone Co., Ltd.), 0.25 ml Probe, 0.25 ml CS7BL Maus-Myeloid-Zellsuspension (1.5 x 10&sup6; Zellen/ml) und 1 ml 0.75% Agar enthaltendem modifizierten McCoy-SA-Medium wurde zur Gewebekultur in eine Plastikschale gegossen. Nach dem Festwerden wurde die Schale 5 Tage bei 37ºC oder 5ºC bei 100% relativer Feuchtigkeit in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2;/95% Luft inkubiert. Die Anzahl der gebildeten Kolonien (eine Kolonie umfaßt mehr als 50 Zellen) wurde gezählt. Eine Einheit CSA wurde als die zur Bildung einer Kolonie benötigte Aktivität definiert.
Eine Probe (Originallösung) wurde wie folgt hergestellt: 10 ul einer Lösung aus kristallinem menschlichem G-CSF (14 mg/ml, mittels HPLC quantitativ bestimmt) in 100 mM Acetatpuffer (pH 4.2) wurde mit 0.5% Maus-Serumalbumin (Cappel Co., Ltd.) enthaltender Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (0.5% mSAPBS) verdünnt. Die Konzentration wurde auf 100 ug/ml das Gesamtvolumen betrug 1.4 ml) eingestellt. Nach der Filtration mittels eines Millipore Filters wurden die entsprechenden rohen dieser Originallösung 10, 100, 500, 2500, 12500 bzw. 62500-fach mit 0.5% mSAPBS verdünnt. 0.5% mSAPBS wurde auch um Vergleich verwendet. 1 ug/ml rG-CSF (nicht-kristalliner, gereinigter, menschlicher mittels rekombinanter DNA-Technik hergestellter G-CSF) wurde zu Vergleichszwecken bereitgestellt.
Die Ergebnisse lauten wie folgt (auch in Fig. 2 dargestellt): Verdünnung Die Anzahl der gebildeten Kolonien Experiment Durchschnitt Kontrolle
Aus den vorstehenden Daten geht deutlich hervor, daß der erfindungsgemäße kristalline menschliche G-CSF die gleiche oder höhere koloniestimulierende Aktivität aufwies wie der nicht-kristalline und der mittels rekombinanter DNA-Technik hergestellte menschliche G-CSF.
Eine detaillierte Erklärung dieser Erfindung wird nachstehend in den Beispielen gegeben. Mittels eines ähnlichen Verfahrens kann ein weiterer menschlicher G-CSF mit einem hohen Maß an Sequenzhomologie kristallisiert werden.

Beispiel 1

Einen eine Vertiefung aufweisenden Objektträger verwendendes Verfahren (Gas-Dampf-Gleichgewichtsverfahren)

Eine Lösung aus von tierischen Wirtszellen mittels rekombianter DNA-Technik in Form eines Glycoproteins hergestelltem in 10 mM Citratpuffer (pH 4.5) gelöstem, menschlichem G-CSF (10 ul, 15.5 mg/ml) wurde auf einem eine Vertiefung aufweisenden Glasobjektträger mit einer zu 16% gesättigten NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung (10 ul) gemischt. Ein ml einer zu 12% gesättigten (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung in 10 mM Citratpuffer (pH 4.6) wurde in ein Reservoir gegeben, dieses mit einer Glasplatte bedeckt und mit Silicon verschlossen. Nachdem das Reservoir 3 Wochen bei Raumtemperatur (20 bis 24ºC) stehengelassen worden war, wurden einzelne Kristalle von menschlichem G-CSF in Form eines farblosen, durchsichtigen Plättchens erhalten (Fig. 1).
Zur Bestimmung der Charakteristika dieser Kristalle wurden die so hergestellten Signal-Kristalle und die Mutterlösung in ein Quarz-Kapillarröhrchen gefüllt, dieses verschlossen und mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht.
Die Ergebnisse der Analyse identifizierten drei Kristallarten mit den folgenden Charakteristika.
I Kristallform : orthorhombisch
Raumgruppe : P22&sub1;2&sub1;
Dimension der Kristallgitter- Einheit (Å) : a = 29, b = 94, c = 111
Anzahl der Moleküle pro Kristallgitter-Einheit : 8
Volumen der Kristallgitter- Einheit (Å³) : 303900
Lösungsmittelvolumen (%) : Vs = 37
II Kristallform : orthorhombisch
Raumgruppe : P2&sub1;2&sub1;2&sub1;
Dimension der Kristallgitter- Einheit (Å) : a = 28, b = 100, c = 110
Anzahl der Moleküle pro Kristallgitter-Einheit : 8
Volumen der Krristailgitter- Einheit (Å³) : 303600
Lösungsmittelvolumen (%) Vs = 37
III Kristallform . orthorhombisch Raumgruppe P22&sub1;2&sub1;
Dimension der Kristallgitter- Einheit (A) a = 29, b = 107, c = 114
Anzahl der Moleküle pro Kristallgitter-Einheit : 8
Volumen der Kristallgitter- Einheit (Å³) : 353742
Lösungsmittelvolumen (%) : Vs = 46
Der hergestellte Kristall wurde zweimal mit zu 25% mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gesättigtem Puffer gewaschen und anschließend mittels HPLC mit einer Retentionszeit von 19.75 Minuten analysiert [Säule, GPC (TSK G-3000); Elutionspuffer, 10 mM Phosphatpuffer (pH 6.8) + 100 mM NaCl; Durchflußrate, 1 ml/min.]. Die Ergebnisse der HPLC-Analyse sind in Fig. 3a (Kontrolle) und 3b zusammengefaßt. Diese zeigen, daß es sich bei diesen Kristallen um G-CSF handelt.

Beispiel 2

Verfahren des hängenden Tropfens-Gas-Dampf-Gleichgewichtsverfahren)

In Beispiel 1 verwendete Lösungen aus menschlichem G-CSF in Form des Glycoproteins (2 ul, 18.3 mg/ml), der in 100 mM ein Fällungsmittel und/oder ein stabilisierendes Agens enthaltendem Acetatpuffer (pH 4.2) gelöst worden war, wurden auf silanisierten Deckgläsern mit verschiedenen Konzentrationen einer NaH&sub2;PO&sub4;-Lösung gemischt (2 ul, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 und 1.2 M). Die jeweils 8 ml der NaH&sub2;PO&sub4;-Lösungen mit verschiedenen Konzentrationen (0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1 und 1.2 M) enthaltenden Reservoirs wurden mit den Deckgläsern abgedeckt, mit Silicon verschlossen und stehengelassen. Frühestens in etwa 24 Stunden schieden sich unter den verschiedenen Kombinationen dieser Proben farblose plättchenförmige Kristalle ab.
Mittels HPLC wurde der sich nach etwa 2 Wochen abscheidende Kristall als G-CSF identifiziert.
Die Kristallisations-Bedingungen von jeder Probe sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Puffer Kristallisationsagens Reservoir stabilisierendes Agens oder andere Acetatpuffer gesättigt keine wie vorstehend Glycerol Citratpuffer Citrat/Phosphatpuffer Polyethylenglycol

Beispiel 3

Dialysemembran-Verfahren

Eine wie in Beispiel 1 verwendete Lösung aus in 100 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöstem menschlichem G-CSF (1050 ul, 16.3 mg/ml) wurde in einem Dialyseschlauch dicht verschlossen (Porengröße: Ausschluß bei MW 7000, mit EDTA vorbehandelt). Dieser Schlauch wurde in 200 ml 10 mM Acetatpuffer (PH 4.2) getaucht, der 1 M KCl enthielt und etwa eine Woche dem Aussalzen unterzogen, wobei das äußere Lösungsmittel vorsichtig gerührt wurde. Der Inhalt wurde dann in ein V-förmiges Fläschchen überführt. Farblose plättchenförmige Kristalle wurden mittels Zentrifugation gewonnen (10 Minuten, 5ºC, 15000 Upm).

Beispiel 4

Batchverfahren

(1) Eine wie in Beispiel 1 verwendete Lösung aus in 100 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöstem menschlichem G-CSF (200 ul, 15.58 mg/ml) wurde in einen Behälter gegeben. Zu dieser Lösung wurde 1.2 M NaH&sub2;PO&sub4; enthaltender 100 mM Acetatpuffer gegeben und das Gemisch 2 Wochen bei Raumtemperatur stehengelassen.
Farblose, plättchenförmige Kristalle wurden abgeschieden und dann mittels Zentrifugation (10 Minuten, 5ºC, 15000 Upm) isoliert.
(2) Wie in (1) beschrieben wurde eine Lösung aus in 100 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöstem menschlichem G-CSF (300 ul, 13.08 mg/ml) mit 300 ul zu 18% mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gesättigtem 100 mM Acetatpuffer gemischt. Das Gemisch wurde 3 Wochen stehengelassen. Farblose, plättchenförmige Kristalle wurden mittels Zentrifugation isoliert.

Beispiel 5

Dialysemembran-Verfahren

Gegen eine zu 15% gesättigte (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung dialysierter, wie in Beispiel 1 verwendeter menschlicher G-CSF wurde in 5 mM Citratpuffer (pH 4.6) gelöst. Die Lösung aus menschlichem G-CSF 200 ul) wurde in einen Dialyseschlauch gefüllt und gegen 50 ml Wasser dialysiert. Wie in Fig. 4 dargestellt wurden sehr lange nadelförmige Kristalle hergestellt.

Beispiel 6

Verfahren des hängenden Tropfens (Gas-Dampf-Gleichgewichtsverfahren

Gegen eine zu 15% gesättigte (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung dialysierter, wie in Beispiel 1 verwendeter menschlicher G-CSF wurde in einem 3 mM Octyl-β-glycosid enthaltenden 5 mM Citratpuffer (pH 4.6) gelöst. Fünf ml dieser Lösung aus menschlichem G-CSF wurde mit 5 ml einer zu 15 bis 22% gesättigten (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;- Lösung oder 5 ml einer 5 mM Natrium-Citratlösung gemischt. Der in der Lösung enthaltene menschliche G-CSF wurde unter Verwendung von 8 ml einer zu 11 bis 13% gesättigten (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Lösung oder einer 5 mM Natrium-Citratlösung als umgebender Lösung auskristallisiert. Innerhalb mehrerer Tage bis 2 Wochen wurden plättchenförmige Kristalle hergestellt.

Beispiel 7

Dialysemembran-Verfahren

Eine wie in Beispiel 1 verwendete Lösung aus in 10 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöstem menschlichem G-CSF (610 ul, 11.45 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch gegeben und anschließend gegen 200 ml einer 1 M KCl enthaltende 10 mM Acetatpuffer-Lösung (pH 4.2) dialysiert. Die KCl-Konzentration der umgebenden Lösung wurde vom nächsten Tag an mit einer Rate von 0.1 M pro Tag erhöht und erreichte schließlich 1.4 M. Der Inhalt des Dialyseschlauchs wurde dann in ein V-förmiges Fläschchen überführt und zum Entfernen der flüssigen Phase zentrifugiert (5 Minuten, 10ºC, 15000 Upm). Es wurden farblose, plättchenförmige Kristalle isoliert. Diese Kristalle wurden in 400 ul 10 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöst und zentrifugiert (5 Minuten, 10ºC, 12000 Upm). Die G-CSF-Konzentration in dem erhaltenen überstand (420 ul) wurde mittels HPLC-Analyse zu 15.05 mg/ml (Ausbeute 90.7%) bestimmt.

Beispiel 8

Dialysemembran-Verfahren

Eine wie in Beispiel 1 verwendete Losung aus in 10 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöstem menschlichem G-CSF (680 ul, 32.09 mg/ml) wurde in einen Dialyseschlauch gefüllt und anschließend gegen zu 5% mit (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gesättigten 10 mM Acetatpuffer (200 ul) dialysiert. Die (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;-Konzentration der umgebenden Lösung wurde vom nächsten Tag an stufenweise mit einer Rate von 1% pro Tag erhöht und erreichte schließlich 13%. Der Inhalt des Schlauchs wurde in ein V-förmiges Fläschchen überführt und dann zum Entfernen der flüssigen Phase zentrifugiert (5 Minuten, 10ºC, 15000 Upm), wobei farblose, plättchenförmige Kristalle erhalten wurden. Die Kristalle wurden in 1200 ul 10 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöst und die Lösung zentrifugiert (5 Minuten, 10ºC 12000 Upm). Die G-CSF- Konzentration in dem erhaltenen überstand (1290 ul) wurde mittels HPLC-Analyse zu 16.32 mg/ml (Ausbeute 96.4%) bestimmt.

Beispiel 9

Batch-Verfahren

Zu einer wie in Beispiel 1 verwendeten Lösung aus in 10 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöstem menschlichem G-CSF (200 ul, 19.84 mg/ml) wurde eine 1.5 M NaH&sub2;PO&sub4;-Lösung gegeben (250 ul). Das Gemisch wurde 1 Woche stehengelassen. Der Inhalt wurde dann in ein V-förmiges Fläschchen überführt und farblose, plättchenförmige Kristalle mittels Zentrifugation (10 Minuten, 10ºC, 15000 Upm) isoliert. Die gesammelten Kristalle wurden in 400 ul 10 mM Acetatpuffer gelöst und die Lösung zentrifugiert (10 Minuten, 10ºC, 12000 Upm). Die G-CSF-Konzentration des erhaltenen Überstands (450 ul) wurde mittels HPLC-Analyse zu 12.51 mg/ml (Ausbeute 78.8%) bestimmt.

Beispiel 10

Batchverfahren

u einer wie in Beispiel 1 verwendeten Lösung aus in 10 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöstem menschlichem G-CSF (1200 ul, 28.91 mg/ml wurde auf Eis eine zu 34% gesättigte (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;- Lösung (500 ul) gegeben. Das Gemisch wurde bei 14ºC stehengelassen und die Temperatur stufenweise mit einer Rate von 1ºC pro Tag auf 24ºC erhöht. Der Inhalt wurde in ein V-förmiges Fläschchen überführt und farblose, plättchenförmige Kristalle mittels Zentrifugation zum Entfernen der flüssigen Phase (5 Minuten. 10ºC, 15000 Upm) isoliert. Die Kristalle wurden in 10 mM Acetatpuffer (pH 4.2) gelöst und die Lösung zentrifugiert (5 Minuten, 10ºC, 12000 Upm). Die G-CSF-Konzentration des erhaltenen Überstands (1380 ul) wurde mittels HPLC zu 24.05 mg/ml (Ausbeute 95.7%) bestimmt.
Der erfindungsgemäß hergestellte kristalline menschliche G-CSF wurde, wie in Beispiel 7 bis 10 dargestellt, erfolgreich in hoher Ausbeute (78.8 bis 96.4%) erhalten. Ferner wies der erfindungsgemäß hergestellte kristalline menschliche G-CSF, wie in Fig. 2 dargestellt, eine koloniestimulierende Aktivität auf, die der des nicht-kristallinen menschlichen G-CSF entsprach oder höher war. Ausgehend von dieser Aktivität ist diese Erfindung für Anwendungen in medizinischen und pharmazeutischen Bereichen sehr nützlich. Der erfindungsgemäße menschliche G-CSF bietet auch große Vorteile, indem er eine einfache Formulierung von Dosierungsformen ermöglicht, da er in kristalliner Form vorliegt und sehr stabil ist.

Beispiel 11

Knopfverfahren (button method)

Durch das Aussalzungsverfahren erhaltener menschlicher G-CSF wurde in 5 mM Citratpuffer (pH 4.6) zu einer Endkonzentration von etwa 10 mg/ml gelöst. Die Lösung wurde zur Kristallisation in einen "Knopf" (button) mit einer Kapazität von 30 ul gefüllt und mit einer mit EDTA behandelten Dialysemembran verschlossen, wobei der Einschluß von Blasen sorgfältig vermieden wurde. Die Membran wurde fest mit einem Gummiring fixiert. Der "Knopf" (button) wurde gegen 2 mM Citratpuffer dialysiert. Man erhält nach 1-3 Tagen nadelförmige Kristalle.
Unter den folgenden Bedingungen wurde kristalliner menschlicher G-CSF mittels des gleichen Verfahrens erhalten. Puffer Konzentration (Lösungsmittel → umgebende Lösung) Detergens Kristallform Hepes-Puffer Mikro wie vorstehend Octyl-β-glycosid Plättchen Citratpuffer Nadel Octa-ethylenglycol-n-dodecylether

Claims

1. Menschlicher Granulocyten-koloniestimulierender Faktor in kristalliner Form.

2. Menschlicher Granulocyten-koloniestimulierender Faktor in kristalliner Form nach Anspruch 1, wobei der menschliche Granulocyten-koloniestimulierende Faktor von tierischen oder anderen eukaryotischen Zellen durch rekombinante DNA-Technik hergestellt wird.

3. Menschlicher Granulocyten-koloniestimulierender Faktor in kristalliner Form nach Anspruch 1, wobei der menschliche Granulocyten-koloniestimulierende Faktor aus dem Kulturüberstand menschlicher Zellen isoliert wird, die die Fähigkeit haben, den Granulocyten-koloniestimulierenden Faktor herzustellen.

4. Menschlicher Granulocyten-koloniestimulierender Faktor in kristalliner Form nach Anspruch l, wobei der menschliche Granulocyten-koloniestimulierende Faktor von einem prokariotischen Mikroorganismus als Wirt durch rekombinante DNA-Technik hergestellt wird.

5. Verfahren zur Herstellung von kristallinem menschlichem Granulocyten-koloniestimulierendem Faktor, wobei man einen menschlichen Granulocyten-koloniestimulierenden Faktor und gegebenenfalls ein Fällungsmittel in einem Puffer enthaltend 5 bis 100 mM eines Puffersalzes und mit einem pH-Wert von 3,0 bis 7,0 löst und sodann den Granulocyten-koloniestimulierenden Faktor mit dem Gas- Dampf-Gleichgewichtsverfahren, Dialyse-Verfahren, Knopfverfahren (Button method) oder Batchverfahren auskristallisiert.

6. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Granulocytenkoloniestimulierendem Faktor in kristalliner Form nach Anspruch 5, wobei der menschliche Granulocyten-koloniestimulierende Faktor in einem Puffer bei einer Konzentration von etwa 1 bis 100 mg/ml gelöst wird.

7. Verfahren zur Herstellung von menschlichem Granulocytenkoloniestimulierendem Faktor in kristalliner Form nach Anspruch 5, wobei das Fällungsmittel, sofern verwendet, ausgewählt wird aus der Gruppe (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, Na&sub2;SO&sub4;, NaCl, KCl, NH&sub4;Cl, NaH&sub2;PO&sub4;, KH&sub2;PO&sub4;, NH&sub4;H&sub2;PO&sub4;, LiCl, CsCl, CaCl&sub2;, MgCl&sub2;, MgSO&sub4;, Polyethylenglycol, Natriumcitrat, Natriumoxalat und Gemischen davon.

8. Verfahren zur Herstellung eines menschlichen Granulocyten-koloniestimulierenden Faktors in kristalliner Form nach Anspruch 7, wobei die Konzentration des Fällungsmittels in der Lösung enthaltend den menschlichen Granulocyten-koloniestimulierenden Faktor in einem Bereich von 0,1 bis 1,5 M liegt.