RS60593B1

RS60593B1 - Antitela koja vezuju domen 2 beta-kloto i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number: RS60593B1
Application number: RS20200912A
Authority: RS
Inventors: Kalyani Mondal; Betty Chan Li; Yu Chen; Taruna Arora; Hugo Matern; Wenyan Shen
Original assignee: Ngm Biopharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2020-08-31
Also published as: JP2020169173A; RU2701434C2; US9738716B2; ES2808340T9; RU2016130128A3; JP2022153375A; IL246921B; MX2016009555A; US10093735B2; NZ722377A; CA2937898A1; EP3097122A4; US11596676B2; AU2015209131B2; CA2937898C; SG10201806108TA; AU2015209131A1; US20230256070A1; WO2015112886A2; PH12016501644A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetno otkriće odnosi se uopšteno na vezujuće proteine, kao što su antitela, koji se vezuju za beta-kloto, uključujući humani beta-kloto, i postupke za njihovu upotrebu.

OSNOV PRONALASKA

[0002] Beta-kloto, koji pripada familiji proteina kloto, je membranski protein tipa I koji jednom prolazi kroz membranu. Beta-kloto ima vanćelijski domen koji se sastoji od dva unutrašnja ponovka koji dele homologiju sa članovima familije glikozidaza 1, ali nemaju glukozidaznu katalitičku aktivnost. Ekspresija beta-kloto se prvenstveno detektuje u jetri, pankreasu i adipoznom tkivu. Ito i kolege su objavili da miševi deficitarni u beta-kloto (KLB-/-) imaju povišene nivoe iRNK za CYP7A1 i CY8B1 i ispoljavaju povećanu sintezu i ekskreciju žučne kiseline (Ito et al., 2005, J Clin Invest 115: 2202-2208). Beta-kloto formira kompleks sa receptorima za faktor rasta fibroblasta (FGF) i funkcioniše kao ko-receptor za FGFs, uključujući FGF19 i FGF21.

[0003] Identifikovana su dvadeset dva člana familije humanih FGF i identifikovana su četiri receptora tirozin kinaze koja se vezuju za FGF (FGFR1-FGFR4). Interakcija između FGF i njegovih receptora rezultuje dimerizacijom FGFR, koja omogućava citoplazmatskim domenima receptora da se transfosforilišu i postanu aktivirani, što zauzvrat vodi fosforilaciji i aktivaciji nishodnih signalnih molekula.

[0004] Receptor visokog afiniteta za FGF19 je FGFR4 i vezivanje FGF19 za FGFR4 je olakšano pomoću beta-kloto. Objavljeno je da FGF19 transgeni miševi imaju sniženu adipoznost, povećanu brzinu metabolizma, redukovane trigliceride u jetri, povećanu oksidaciju masnih kiselina, redukovane nivoe glukoze i povećanu osetljivost na insulin (Tomlinson et al., 2002, Endocrinology 143: 1741-1747). Pored toga, objavljeno je da ovi transgeni miševi ne postaju gojazni ili dijabetični na dijeti sa visokim sadržajem masti (Tomlinson et al., 2002, Endocrinology 143: 1741-1747). Takođe je objavljeno da lečenje pomoću FGF19 sprečava ili ukida nastali dijabetes kod miševa koji su učinjeni gojaznim genetskom ablacijom mrkog masnog tkiva ili genetskim odsustvom leptina (Fu et al., 2004, Endocrinology 145: 2594-2603).

[0005] FGF21 deluje putem interakcije FGFRs i beta-kloto. FGFR1 je obilno zastupljen receptor u belom masnom tkivu i najverovatnije je glavni funkcionalni receptor za FGF21 u belom masnom tkivu. Ekspresija FGF21 se detektuje u jetri, timusu, adipoznom tkivu, i ostrvcima betaćelija u pankreasu. Objavljeno je da interakcija FGF21 sa kompleksom beta-kloto-FGFR stimuliše preuzimanje glukoze, snižava sekreciju glukagona, poboljšava osetljivost na insulin i klirens glukoze, podstiče odgovor belog masnog tkiva na gladovanje, povećava ketogenezu u jetri kao odgovor na gladovanje, snižava nivoe triglicerida u plazmi, i povećava potrošnju energije (Iglesias et al., 2012, European Journal of Endocrinology 167: 301-309).

[0006] Budući da FGF19 i FGF21 zahtevaju FGFRs, kao i beta-kloto za ćelijski prenos signala, agensi koji oponašaju FGF19 i/ili FGF21 mogu da budu poželjni zbog svog delovanja na metabolizam glukoze ili lipidni metabolizam. Međutim, nije sasvim jasno koja svojstva su potrebna da bi agensu obezbedila aktivnost prenosa signala u ćeliji sličnu prenosu signala putem FGF19 ili putem FGF21.

[0007] US 2011/135657 i US 2012/328616 opisuju antitela koja se vezuju za beta-kloto i/ili kompleks koji sadrži beta-kloto i jedan od FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c i FGFR4 da bi indukovala prenos signala sličan FGF21. www.rndsystems.com/pdf/MAB3738.pdf (preuzet sa Interneta 21.02. 2011; "Monoclonal Anti-human/mouse Klotho beta Antibody", 6. februar 2007.) opisuje antitelo koje se vezuje za humani/mišji beta-kloto.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0008] Predmetno otkriće obezbeđuje proteine koji se vezuju za beta-kloto, uključujući vezujuće proteine kao što su antitela koja se vezuju za beta-kloto. Takvi vezujući proteini uključujući antitela, mogu da se vežu za polipeptid beta-kloto, fragment beta-kloto i/ili epitop beta-kloto. Takvi vezujući proteini, uključujući antitela, mogu da budu agonisti (npr., da indukuju prenos signala uz učešće FGF receptora sličan prenosu signala putem FGF19 ili putem FGF21 ili da aktiviraju kompleks beta-kloto/FGF receptor).

[0009] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje vezujuće proteine, uključujući antitela ili njihove fragmente, koji (i) vezuju humani beta-kloto, (ii) indukuju prenos signala sličan prenosu signala putem FGF19 i/ili putem FGF21, i (iii) ne kompetiraju sa FGF19 i/ili FGF21 za interakciju sa beta-kloto.

[0010] Predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje se vezuje u okviru domena 2 beta-kloto (KLB2) koji sadrži aminokiselinske rezidue 657 do 703 humanog beta-kloto (SEQ ID NO:297), pri čemu antitelo sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12, ili SEQ ID NO:13;

CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:14; i

CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:15;

i

(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:16;

CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i

CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:17.

[0011] U nekim primerima izvođenja antitelo sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:1, CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:2, i CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:3; i

(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:4, CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:5, i CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:6.

[0012] U nekim primerima izvođenja antitelo sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:12, CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:2, i CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:3; i

[0013] U nekim primerima izvođenja antitelo sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:13, CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:14, i CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:15; i

(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:16, CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:11, i CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:17.

[0014] U nekim primerima izvođenja antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:25 i varijabilni region lakog lanca koji ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:26.

[0015] U nekim primerima izvođenja antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:25 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:26.

[0016] U nekim primerima izvođenja antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO:271 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO:276.

[0017] U nekim primerima izvođenja antitelo vezuje epitop koji sadrži najmanje jednu od aminokiselinskih rezidua 657, 701 i/ili 703 humanog beta-kloto (SEQ ID NO: 297).

[0018] U nekim primerima izvođenja antitelo je monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, humano antitelo, ili himerno antitelo.

[0019] U nekim primerima izvođenja antitelo je Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, jednolančani molekul antitela, antitelo sa dualnim varijabilnim regionom, antitelo sa pojedinačnim varijabilnim regionom, linearno antitelo, V region, ili multispecifično antitelo formirano od fragmenata antitela.

[0020] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje izolovani polinukleotid koji kodira antitelo prema pronalasku.

[0021] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo prema pronalasku.

[0022] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju-domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira antitelo prema pronalasku ili vektor koji sadrži polinukleotid koji kodira antitelo prema pronalasku.

[0023] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo predmetnog pronalaska, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0024] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u postupku za poboljšanje metabolizma glukoze kod subjekta.

[0025] U nekim primerima izvođenja upotrebe antitela pronalaska u postupku za poboljšanje metabolizma glukoze kod subjekta, postupak za poboljšanje metabolizma glukoze rezultuje u:

(a) redukovanim nivoima glukoze;

(b) redukovanim nivoima insulina;

(c) povećanoj osetljivosti na insulin;

(d) redukovanoj insulinskoj rezistenciji;

(e) poboljšanoj toleranciji na glukozu; i/ili

(f) poboljšanoj funkciji pankreasa.

[0026] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u postupku za lečenje dijabetesa tipa 1, dijabetesa tipa 2, dislipidemije, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), kardiovaskularne bolesti, metaboličkog sindroma, gojaznosti, ili nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD).

[0027] U nekim primerima izvođenja inventivne upotrebe antitela, postupak dalje sadrži primenu jednog ili više terapijskih agenasa u kombinaciji sa antitelom.

[0028] U nekim primerima izvođenja inventivne upotrebe antitela, jedan ili više terapijskih agenasa izabran je iz grupe koja se sastoji od biguanida, sulfonilurea, tiazolidindiona, analoga GLP-1, agonista PPAR gama, inhibitora dipeptidil peptidaze-4 (DPP-4), bromokriptina, sekvestranata žučnih kiselina, insulina, inhibitora alfa glukozidaze, metformina, inhibitora SGLT-2, agenasa za suzbijanje apetita, i lekova za gubljenje težine.

[0029] U nekim primerima izvođenja, anti-beta-kloto antitela su humanizovana antitela koja se vezuju za polipeptid beta-kloto, fragment beta-kloto, ili epitop beta-kloto. Anti-beta-kloto antitelo sadrži VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 monoklonskog antitela označenog kao 5H23, kao što je ovde opisano, ili njegove humanizovane varijante. U određenim primerima izvođenja, anti-beta-kloto antitelo može dalje da sadrži VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3, i/ili VL FR4 aminokiselinske sekvence humanog imunoglobulina ili njene varijante.

[0030] U ovom dokumentu opisan je vezujući protein (npr., anti-beta-kloto antitelo) koji sadrži šest CDRs ili manje od šest CDRs. Vezujući protein koji je ovde opisan (npr., anti-beta-kloto antitelo) sadrži jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest CDRs odabranih od VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3. Anti-beta-kloto antitelo pronalaska sadrži šest CDRs odabranih od VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 monoklonskog antitela označenog kao 5H23, kao što je ovde opisano, ili njegove humanizovane varijante. U nekim primerima izvođenja, anti-beta-kloto antitelo dodatno sadrži region skafolda ili okvirni region, uključujući VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3, i/ili VL FR4 aminokiselinske sekvence humanog imunoglobulina ili njene varijante.

[0031] U nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano antitelo, monoklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, antigen-vezujući fragment ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano monoklonsko antitelo, ili njegov antigen vezujući fragment, koji se vezuje za polipeptid beta-kloto (npr., beta-kloto koji je eksprimiran na ćelijskoj površini ili rastvorljiv), fragment beta-kloto, ili epitop beta-kloto.

[0032] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje vezujuće proteine kao što su anti-beta-kloto antitela (i) koja kompetitivno sprečavaju (npr., na dozno-zavisan način) ovde obezbeđeno anti-beta-kloto antitelo da se veže za polipeptid beta-kloto (npr., beta-kloto koji je eksprimiran na ćelijskoj površini ili rastvorljiv), fragment beta-kloto, ili epitop beta-kloto i/ili (ii) koja se vezuju za epitop beta-kloto koji je vezan ovde obezbeđenim anti-beta-kloto antitelom. Vezujući proteini kao što je anti-beta-kloto antitelo kompetitivno sprečavaju (npr., na dozno-zavisan način) ovde opisano monoklonsko antitelo 5H23 ili 1G19 ili njegove humanizovane varijante da se vežu za polipeptid beta-kloto (npr., beta-kloto koji je eksprimiran na ćelijskoj površini ili rastvorljiv), fragment beta-kloto, ili epitop beta-kloto. Vezujući proteini kao što je anti-beta-kloto antitelo vezuju se za epitop beta-kloto koji je vezan (npr., prepoznat) ovde opisanim monoklonskim antitelom 5H23, ili 1G19 ili njegovom humanizovanom varijantom.

[0033] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje vezujuće proteine, uključujući antitela ili njihove fragmente, koji (i) vezuju epitop humanog beta-kloto i beta-kloto cinomolgus majmuna prepoznat antitelom koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25 i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26; ili (ii) kompetira za vezivanje za humani beta-kloto sa antitelom koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:25 i varijabilni region lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:26. Ovde su opisani vezujući proteini, uključujući antitela ili njihove fragmente, koji se vezuju za region, uključujući epitop, humanog beta-kloto ili beta-kloto cinomolgus majmuna. Antitela predmetnog pronalaska vezuju se za region humanog beta-kloto koji sadrži aminokiselinske rezidue 657 do 703 u SEQ ID NO:297 ili region beta-kloto cinomolgus majmuna koji sadrži aminokiselinske rezidue 657 do 703 u SEQ ID NO:299.

[0034] Antitela predmetnog pronalaska vezuju se za specifični epitop humanog beta-kloto, uključujući: (i) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje jednu od aminokiselinskih rezidua 657, 701 i/ili 703 humanog beta-kloto (SEQ ID NO: 297); (ii) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje aminokiselinsku reziduu 657 iz SEQ ID NO: 297; (iii) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje aminokiselinsku reziduu 701 iz SEQ ID NO: 297; (iv) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje aminokiselinsku reziduu 703 iz SEQ ID NO: 297; (v) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 657 i 701 iz SEQ ID NO: 297; (vi) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 657 i 703 iz SEQ ID NO: 297; (vii) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 701 i 703 iz SEQ ID NO: 297; ili (viii) epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 657, 701 i 703 iz SEQ ID NO: 297. Takva antitela koja su gore obezbeđena mogu da indukuju prenos signala sličan prenosu signala putem FGF19 i/ili putem FGF21 ili da aktiviraju kompleks beta-kloto/FGF receptor u ćeliji koja eksprimira humani betakloto i FGF receptor. Dodatno, u nekim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo, na primer, humanizovano ili himerno antitelo.

[0035] Anti-beta-kloto antitela obezbeđena u ovom dokumentu mogu da budu konjugovana ili rekombinantno vezana za dijagnostički agens, detektabilni agens ili terapijski agens. U nekim aspektima, terapijski agens je lek, uključujući jedan ili više lekova kao što su biguanidi i sulfoniluree (npr., metformin tolbutamid, hlorpropamid, acetoheksamid, tolazamid, glibenklamid, gliburid, i glipizid), tiazolidindioni (npr., rosiglitazon, pioglitazon), analozi GLP-1, agonisti PPAR gama (npr., pioglitazon i rosiglitazon), inhibitori dipeptidil peptidaze-4 (DPP-4), (npr., JANUVIN<®>, ONGLYZA<®>) formulacije bromokriptina i sekvestranti žučnih kiselina (npr., kolesevelam), i insulin (npr., bolus i bazalni analozi), inhibitori alfa glukozidaze (npr., akarboza, rogliboza), metformin (npr., metformin hidrohlorid) sa ili bez tiazolidindiona (TZD), inhibitori SGLT-2, lekovi za suzbijanje apetita ili gubljenje težine (npr., Meridia<®>/ sibutramin, Xenical<®>/ ortistat). U nekim aspektima, detektabilni agens je radioizotop, enzim, fluorescentno jedinjenje, bioluminescentno jedinjenje ili hemiluminescentno jedinjenje.

[0036] U određenim primerima izvođenja, obezbeđene su kompozicije koje sadrže anti-betakloto antitelo pronalaska. U ovom dokumentu obezbeđene su i farmaceutske kompozicije koje sadrže beta-kloto antitelo pronalaska.

[0037] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline koja kodira teški lanac imunoglobulina, laki lanac imunoglobulina, VH region, VL region, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 vezujućih proteina (npr., anti-betakloto antitela) koji se vezuju za polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili epitop beta-kloto. U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline kodira VH region, VL region, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 monoklonskog antitela označenog kao 5H23 kao što je ovde opisano, ili njegove humanizovane varijante. U nekim primerima izvođenja, molekul nukleinske kiseline dodatno kodira region skafolda ili okvirni region, uključujući VH FR1, VH FR2, VH FR3, VH FR4, VL FR1, VL FR2, VL FR3, i/ili VL FR4 aminokiselinske sekvence humanog imunoglobulina ili njene varijante. U ovom dokumentu obezbeđeni su i vektori i ćelije-domaćini koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira vezujući protein kao što je anti-beta-kloto antitelo, kao i postupci za proizvodnju vezujućeg proteina kao što je anti-beta-kloto antitelo kultivisanjem ćelija-domaćina koje su ovde date pod uslovima koji podstiču proizvodnju vezujućeg proteina kao što je anti-beta-kloto antitelo.

[0038] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u postupcima za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja (npr., jednog ili više simptoma) koji obuhvataju davanje terapijski efikasne količine antibeta-kloto antitela subjektu, uključujući subjekt kome je to potrebno, čime se leči, sprečava ili ublažava bolest, poremećaj ili stanje. U nekim primerima izvođenja, bolest, poremećaj ili stanje uzrokovani su, ili drugačije povezani sa beta-kloto, kao što su ona povezana sa prenosom signala sličnim prenosu signala putem FGF19 i/ili putem FGF21 kod subjekta. U određenim primerima izvođenja, bolest može da se leči snižavanjem glukoze u krvi, nivoa insulina ili serumskih lipida (npr., dijabetes tipa 2, gojaznost, dislipidemija, NASH, kardiovaskularna bolest, metabolički sindrom).

[0039] U nekim primerima izvođenja, bolest, poremećaj ili stanje je povezano sa metabolizmom glukoze ili lipidnim metabolizmom. U nekim primerima izvođenja, bolest, poremećaj ili stanje izabrano je iz grupe hiperglikemičnih stanja, (npr., dijabetes, kao što su dijabetes tipa 1, dijabetes tipa 2, gestacioni dijabetes, insulinska rezistencija, hiperinsulinemija, netolerancija na glukozu, metabolički sindrom, ili gojaznost).

[0040] Upotreba u postupcima za lečenje, sprečavanje ili ublažavanje uključuje postupke za poboljšanje metabolizma glukoze i/ili postupke za poboljšanje metabolizma lipida. Upotreba u postupcima za lečenje, sprečavanje ili ublažavanje rezultuje u redukovanim nivoima glukoze (npr., redukovanom glukozom u krvi), povećanoj osetljivosti na insulin, redukovanoj insulinskoj rezistenciji, redukovanom glikogenu, poboljšanoj toleranciji na glukozu, poboljšanoj toleranciji na glukozu, poboljšanom metabolizmu glukoze, poboljšanoj homeostazi, poboljšanoj funkciji pankreasa, redukovanim trigliceridima, redukovanom holesterolu, redukovanom IDL, redukovanom LDL, redukovanom VLDL, sniženom krvnom pritisku, sniženom unutrašnjem zadebljavanju krvnih sudova i/ili sniženoj telesnoj masi ili sniženom dobijanju na težini.

[0041] Predmetno otkriće obezbeđuje postupke za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja povezanog sa humanim FGF19 i/ili humanim FGF21, koja uključuju bilo koju bolest, poremećaj ili stanje čija je pojava kod subjekta (npr., pacijenta) izazvana, najmanje delom, indukcijom prenosa signala sličnog prenosu signala putem FGF19 i/ili putem FGF21, koji se in vivo inicira formiranjem kompleksa koji sadrži FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ili FGFR4 i beta-kloto i FGF19 ili FGF21. Ozbiljnost bolesti ili stanja može takođe da bude snižena indukcijom prenosa signala sličnog prenosu signala putem FGF19 i/ili putem FGF21. Primeri bolesti i stanja koja mogu da se leče pomoću vezujućih proteina kao što su anti-beta-kloto antitela uključuju dijabetes tipa 2, gojaznost, dislipidemiju, NASH, kardiovaskularnu bolest i metabolički sindrom.

[0042] Kao takvi, vezujući proteini kao što su ovde opisana anti-beta-kloto antitela mogu da se koriste za lečenje dijabetesa tipa 2, gojaznosti, dislipidemije (npr., hipertrigliceridemije), NASH, kardiovaskularne bolesti, i/ili metaboličkog sindroma, kao i bilo koje bolesti, poremećaja, ili stanja u kojima je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju, ili mogu da se koriste kao profilaktički tretman primenjen, na primer, dnevno, nedeljno, jednom u dve nedelje, mesečno, jednom u dva meseca, jednom u dve godine, itd. za sprečavanje ili smanjenje učestalosti i/ili ozbiljnosti simptoma (npr., povišeni nivoi glukoze u plazmi, povišeni trigliceridi i nivoi holesterola), uključujući, na primer, da bi se tako obezbedio poboljšani glikemijski i/ili kardiovaskularni profil faktora rizika. Predmetno otkriće obezbeđuje postupke za poboljšanje metaboličkih parametara davanjem vezujućeg proteina subjektu, uključujući antitelo ili njegov fragment kao što je ovde opisano ili ovde opisane farmaceutske kompozicije, uključujući, na primer, slučaj kada poboljšanje uključuje opadanje telesne težine, indeksa telesne mase, obima abdomena, debljine nabora kože, glukoze, insulina i/ili triglicerida.

[0043] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za indukciju prenosa signala sličnog prenosu signala putem FGF19 ili FGF21 u ćelijama koje ispoljavaju ekspresiju beta-kloto i jednog ili više FGF receptora na površini ćelije, kao što su FGFR1, FGFR2, FGFR3, ili FGFR4 koji obuhvataju dovođenje u kontakt ćelija sa efikasnom količinom vezujućeg proteina (npr., antitelo) koji se vezuje za beta-kloto kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, ćelija je adipocit ili hepatocit. U drugim primerima izvođenja, ćelija je ćelija transficirana genom koji kodira beta-kloto i opciono genom koji kodira FGF receptor. Dodatni postupci koji su obezbeđeni uključuju upotrebu anti-beta-kloto antitela kao što je ovde opisano, sa aktivnošću posredovanja u prenosu signala sličnom prenosu signala putem FGF19 i/ili putem FGF21.

[0044] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje antitelo kao što je definisano u patentnim zahtevima za upotrebu u postupcima modulacije prenosa signala sličnog prenosu signala putem FGF19 ili FGF21 kod subjekta koji obuhvataju primenu efikasne količine vezujućeg proteina kao što je anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano kod subjekta, uključujući subjekta kome je to potrebno. U nekim primerima izvođenja, modulacija obuhvata aktivaciju sličnu aktivaciji putem FGF19. U nekim primerima izvođenja, modulacija obuhvata aktivaciju sličnu aktivaciji putem FGF21. U nekim primerima izvođenja, modulacija obuhvata povećanje metabolizma glukoze (npr., redukovanje nivoa glukoze kao što su nivoi glukoze u krvi).

[0045] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupke za detekciju beta-kloto u uzorku koji obuhvataju dovođenje u kontakt uzorka sa anti-beta-kloto antitelom pronalaska, koje sadrži detektabilni agens. U određenim primerima izvođenja, uzorak sadrži ćeliju koja eksprimira betakloto na svojoj površini.

[0046] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje komplete koji sadrže vezujući protein kao što je anti-beta-kloto antitelo koje se vezuje za polipeptid beta-kloto, fragment beta-kloto ili epitop beta-kloto kao što je ovde opisano.

KRATAK OPIS SLIKA

[0047]

Slika 1A-1B prikazuje poravnanje sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca i varijabilnih regiona lakog lanca anti-beta-kloto antitela označenih kao 5H23, 1C17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4P5, 5C23, 5F7 i 1G19. Granice CDR regiona su označene numeracijom Kabat, AbM, Chothia, Contact i IMGT.

Slike 2A-1 i 2A-2 prikazuju poravnanja sekvenci varijabilnih regiona teškog lanca antibeta-kloto antitela dajući konsenzusne CDR sekvence. Grupa na vrhu slike sastoji se od antitela označenih kao 5H23, 1D19, 2L12, 3L3, 4P5, 5C23 i 5F7. Niža grupa se sastoji od

1

antitela označenih kao 1C17 i 1G19. Grupa na dnu slike sastoji se samo od antitela označenog kao 3N20. Varijabilne rezidue su predstavljene kao "X." Granice CDR regiona su označene numeracijom Kabat, AbM, Chothia, Contact i IMGT.

Slike 2B-1 i 2B-2 prikazuju poravnanja sekvenci varijabilnih regiona lakog lanca antibeta-kloto antitela dajući konsenzusne CDR sekvence. Grupa na vrhu slike sastoji se od antitela označenih kao 5H23, 1D19, 2L12, 3L3, 4P5, 5C23 i 5F7. Niža grupa se sastoji od antitela označenih kao 1C17 i 1G19. Grupa na dnu slike sastoji se samo od antitela označenog kao 3N20. Varijabilne rezidue su predstavljene kao "X." Granice CDR regiona su označene numeracijom Kabat, AbM, Chothia, Contact i IMGT.

Slike 3A-1 i 3A-2 prikazuju poravnanje sekvence varijabilnog regiona teškog lanca antibeta-kloto antitelo označen kao 5H23 sa humanizovanim sekvencama (vH1-vH9). Rezidue koje su podebljane označavaju primer rezidua koje su modifikovane iz originalnog antitela. Rezidue koje su podebljane i podvučene označavaju rezidue koje su povratno izmenjene na reziduu miša.

Slika 3B prikazuje poravnanje sekvence varijabilnog regiona lakog lanca anti-beta-kloto antitela označenog kao 5H23 sa humanizovanim sekvencama (vL1-vL5). Rezidue koje su podebljane označavaju primer rezidua koje su modifikovane. Rezidue koje su podebljane i podvučene označavaju rezidue koje su povratno izmenjene na reziduu miša.

Slike 3C-1 i 3C-2 prikazuju poravnanje sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antibeta-kloto antitela označenog kao 5H23 sa humanizovanim sekvencama (v1-39a- v1-39p). Rezidue koje su podebljane označavaju primer rezidua koje su modifikovane.

Slike 3D-1 i 3D-2 prikazuju poravnanje sekvence varijabilnog regiona lakog lanca antibeta-kloto antitela označenog kao 5H23 sa različitim humanizovanim sekvencama (v3-20a- v3-20j). Rezidue koje su podebljane označavaju primer rezidua koje su modifikovane.

Slika 4A-4C prikazuje poravnanje sekvenci humanih, mišjih i himernih polipeptida betakloto. Himerni polipeptid chMoHu označava mišji KLB(M1-F506)-humani KLB(S509-S1044). Himerni polipeptid chHuMo označava humani KLB (M1-F508)-mišji KLB (P507-S1043). Rezidue koje odgovaraju mišjim reziduama su podebljane i iskošene.

Slika 5A-5F prikazuje poravnanje sekvenci polipeptida beta-kloto različitih vrsta koji su ovde opisani.

Slika 6 prikazuje trodimenzionalni model tri identifikovane vezujuće rezidue (tamne lopte) na ekvivalentnim pozicijama citosolne beta-glukozidaze čoveka. Struktura prikazuje ekvivalent rezidua 521-963 beta-kloto.

DETALJAN OPIS

[0048] U ovom dokumentu opisani su vezujući proteini, kao što su antitela koja vezuju betakloto, uključujući beta-kloto čoveka i/ili cinomolgus majmuna. Jedinstveno svojstvo takvih vezujućih proteina, uključujući ovde opisana antitela, je njihova agonistička priroda, uključujući sposobnost da oponašaju in vivo dejstvo FGF19 i/ili FGF21 i da indukuju prenos signala sličan onom putem FGF19 i/ili prenos signala sličan onom putem FGF21. Još značajnije i specifičnije, neki od vezujućih proteina kao što su ovde opisana antitela na beta-kloto (i) vezuju se za betakloto čoveka i cinomolgus majmuna, (ii) ne kompetiraju za vezivanje sa FGF19 i/ili FGF21, i (iii) indukuju prenos signala sličan onom putem FGF19 i/ili prenos signala sličan onom putem FGF21, uključujući, na primer, u nekoliko in vitro testova na bazi ćelija. Takvi testovi mogu da uključuju (1) test na bazi ELK-luciferaznog reporterskog gena (videti, npr., primer 4); (2) ćelijski test fosforilacije ERK posredovan rekombinantnim receptorom FGF19 (videti, npr., primer 4); i (3) test fosforilacije ERK na humanim adipocitima (videti, npr., primer 5). Prema tome, očekuje se da vezujući proteini kao što su ovde opisana anti-beta-kloto antitela, ispoljavaju aktivnosti in vivo koje su u skladu sa prirodnom biološkom funkcijom FGF19 i/ili FGF21. Ovo svojstvo čini opisane vezujuće proteine, uključujući anti-beta-kloto antitela, održivim terapijama za lečenje metaboličkih bolesti (npr., dijabetes tipa 2, gojaznost, dislipidemija, NASH, kardiovaskularna bolest, metabolički sindrom) i uopšteno bilo koje bolesti, poremećaja, ili stanja u kojima je poželjno oponašanje ili povećanje in vivo dejstava FGF19 i/ili FGF21.

[0049] Vezujući proteini, kao što su antitela koja vezuju beta-kloto, obezbeđeni u ovom dokumentu dele zajedničko svojstvo međusobne kompeticije za vezivanje beta-kloto (videti, npr., primer 3 koji opisuje antitela koja pripadaju epitopskoj grupi 5H23). Ova kompetitivna inhibicija ukazuje na to da se svako antitelo vezuje za isti region beta-kloto (npr., isti epitop), potvrđujući tako slična dejstva. Ovde opisana anti-beta-kloto antitela uključuju humanizovana anti-beta-kloto antitela, uključujući humanizovana anti-beta-kloto antitela poreklom od, ili zasnovana na 5H23, 1C17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4P5, 5C23, 5F7 i/ili 1G19, koja imaju CDR sekvencu kao što je opisano u tabelama 1-10 ili na slikama 1-3, takva anti-beta-kloto antitela, uključujući humanizovana anti-beta-kloto antitela, vezuju se za specifični domen humanog beta-kloto (npr., KL2 (rezidue S509-S1044); videti primer 9). Osim toga, takvo vezivanje može u velikoj meri da se pripiše određenim aminokiselinskim reziduama unutar KL2 regiona (npr., H657, Y701 i R703), koje čine epitop koji prepoznaju ovde opisana anti-beta-kloto antitela. Ukupno uzevši, ovde opisani rezultati pokazuju da dejstva zapažena kod anti-beta-kloto antitela poreklom od, ili zasnovanog na 5H23 ili antitela koje pripada epitopskoj grupi 5H23, uključujući antitelo koje ima jedan ili više CDR regiona opisanih u tabelama 1-10 ili na slikama 1-3, mogu da se ekstrapoliraju na druga ovde opisana anti-beta-kloto antitela koja imaju istu ili sličnu eptitopsku specifičnost (npr., iste ili slične CDR regione). Na primer, in vitro aktivnosti antitela kao što je prikazano u primerima 4-7 i 9, kao i in vivo dejstva prikazana u primeru 8 za ilustrativno humanizovano anti-beta-kloto antitelo, su reprezentativne za aktivnosti i dejstva ovde opisanih anti-beta-kloto antitela.

[0050] U nekim aspektima predmetnog otkrića, vezujući proteini kao što su anti-beta-kloto antitela mogu da sadrže varijabilne regione imunoglobulina koji sadrže jedan ili više regiona za određivanje komplementarnosti (CDRs) kao što je opisano u tabelama 1-10. U takvim vezujućim proteinima (npr., anti-beta-kloto antitela), CDR regioni mogu da budu spojeni sa jednim ili više regiona skafolda ili okvirnih regiona, koji usmeravaju CDR region/regione tako da se ostvare odgovarajuća antigen-vezujuća svojstva CDR regiona. Takvi vezujući proteini, uključujući antibeta-kloto antitela kao što je ovde opisano, mogu da olakšaju ili pojačaju interakciju između FGFR1c i beta-kloto, i mogu da indukuju prenos signala sličan onom putem FGF19 i/ili FGF21.

Opšte tehnike

[0051] Tehnike i procedure koje su opisane u ovom dokumentu ili na koje se ovde poziva uključuju one koje su za stručnjake u ovoj oblasti opšte poznate i/ili uobičajeno korišćene uz upotrebu uobičajene metodologije, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane kod Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Z. An, ed, Wiley, Hoboken N.J. (2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols, M. Albitar, ed., Humana Press, Totawa, N.J. (2010); i Antibody Engineering, 2nd Ed., Vols 1 and 2, Kontermann and Dubel, eds., Springer-Verlag, Heidelberg, 2010.

TERMINOLOGIJA

[0052] Osim ako nije drugačije opisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni u ovom dokumentu imaju koje uobičajeno podrazumeva stručnjak u ovoj oblasti. U cilju tumačenja ove specifikacije, primenjivaće se sledeći opis pojmova i kad god je prikladno, pojmovi upotrebljeni u jednini uključivaće i množinu i obrnuto.

[0053] Pojam "beta-kloto" ili "polipeptid beta-kloto" i slični pojmovi odnose se na polipeptid ("polipeptid" i "protein" se ovde koriste kao sinonimi) ili bilo koji nativni beta-kloto poreklom od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare kao što su primati (npr., ljudi, cinomolgus majmun (cyno)), psi i glodari (npr., miševi i pacovi), osim ako nije drugačije navedeno, i, u određenim

1

primerima izvođenja, uključuju srodne polipeptide beta-kloto, uključujući njihove SNP varijante. Beta-kloto sadrži dva domena, beta-kloto 1 (KLB1) i beta-kloto 2 (KLB2). Svaki beta-kloto domen sadrži region glikozil hidrolaze 1. Na primer, KLB1 domen humanog beta-kloto sadrži aminokiselinske rezidue 1-508 sa regionom glikozil hidrolaze 1 koji sadrži aminokiselinske rezidue 77-508, a KLB2 domen humanog beta-kloto sadrži aminokiselinske rezidue 509-1044 sa regionom glikozil hidrolaze 1 koji sadrži aminokiselinske rezidue 517-967. Aminokiselinska sekvenca beta-kloto čoveka data je ispod:

1

�

[0055] Aminokiselinska sekvenca beta-kloto cinomolgus majmuna (cyno), naučnog naziva Macaca fascicularis, data je ispod:

1

[0056] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira beta-kloto cinomolgus majmuna data je ispod:

1

[0057] Aminokiselinska sekvenca beta-kloto homologa miša, naučnog naziva Mus musculus, data je ispod:

1

[0058] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira beta-kloto miša data je ispod:

2

[0059] Aminokiselinska sekvenca beta-kloto pacova, naučnog naziva Rattus norvegicus, data je ispod:

[0060] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira beta-kloto pacova data je ispod:

�

[0061] Aminokiselinska sekvenca beta-kloto hrčka, naučnog naziva Cricetulus griseus, data je ispod:

[0062] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira beta-kloto hrčka data je ispod:

2

[0063] Aminokiselinska sekvenca beta-kloto kunića, naučnog naziva Oryctolagus cuniculus, data je ispod:

2

[0064] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira beta-kloto kunića data je ispod:

2

�

[0065] Aminokiselinska sekvenca beta-kloto psa, naučnog naziva Canis lupus familiaris, data je ispod:

2

[0066] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira beta-kloto psa data je ispod:

[0067] Aminokiselinska sekvenca himernog proteina humani/mišji beta-kloto (humani KLB (M1-F508)-mišji KLB (P507-S1043)) data je ispod:

1

[0068] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni protein humani/mišji beta-kloto data je ispod:

2

[0069] Aminokiselinska sekvenca himernog proteina humani/mišji beta-kloto (mišji KLB (M1-F506) - humani KLB(S509-S1044)) data je ispod:

[0070] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira himerni protein humani/mišji beta-kloto data je ispod:

4

[0071] Srodni polipeptidi beta-kloto uključuju alelne varijante (npr., SNP-varijante); varijante nastale splajsovanjem; fragmente; derivate; varijante nastale supstitucijom, delecijom i insercijom; fuzione polipeptide; i homologe među vrstama, poželjno, koje zadržavaju aktivnost beta-kloto i/ili su dovoljne da stvore anti-beta-kloto imunološki odgovor. Kao što stručnjaci u ovoj oblasti znaju, ovde obezbeđeno anti-beta-kloto antitelo može da se veže za polipeptid betakloto, fragment polipeptida beta-kloto, beta-kloto antigen, i/ili epitop beta-kloto. Epitop može da bude deo većeg beta-kloto antigena, koji može da bude deo većeg fragmenta polipeptida betakloto, koji, za uzvrat, može da bude deo većeg polipeptida beta-kloto. Beta-kloto može da postoji u nativnom ili denaturisanom obliku. Polipeptidi beta-kloto opisani u ovom dokumentu mogu da budu izolovani iz raznih izvora, kao što su razne vrste humanog tkiva ili iz drugih izvora, ili pripremljeni rekombinantnim ili sintetskim metodama. Polipeptid beta-kloto može da sadrži polipeptid koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao odgovarajući polipeptid beta-kloto koji potiče iz prirode. Polipeptidi beta-kloto obuhvataju skraćene ili izlučene oblike polipeptida betakloto (npr., sekvencu vanćelijskog domena), varijantne oblike (npr., oblike nastale različitim splajsovanjem) i alelne varijante polipeptida. Ortolozi polipeptida beta-kloto su takođe dobro poznati u stanju tehnike.

[0072] Pojam "beta-kloto" obuhvata neobrađeni beta-kloto "cele dužine", kao i bilo koji oblik beta-kloto koji nastaje obradom u ćeliji. Pojam takođe obuhvata prirodne varijante ili mutacije beta-kloto (npr., varijante splajsovanja, alelne varijante, SNP-varijante i izoforme). Ovde opisani polipeptidi beta-kloto mogu da budu izolovani iz različitih izvora, kao što su različite vrste humanih tkiva ili iz drugih izvora, ili pripremljeni rekombinantnim ili sintetskim metodama.

[0073] Pojmovi "prenos signala sličan onom putem FGF19" i "indukuje prenos signala sličan onom putem FGF19", kada se odnose na vezujući protein kao što je antitelo koji se vezuje za beta-kloto predmetnog otkrića, znače da vezujući protein (npr., antitelo) oponaša, ili modulira, in vivo biološko dejstvo koje indukuje vezivanje (i) beta-kloto; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4; ili (iii) kompleksa koji sadrži beta-kloto i jedan od FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4 i indukuje biološki odgovor koji bi inače nastao vezivanjem FGF19 za (i) beta-kloto; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ili FGFR4; ili (iii) kompleks koji sadrži beta-kloto i jedan od FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4 in vivo. Pri oceni vezivanja i specifičnosti anti-beta-kloto antitela, na primer, antitela ili njegovog fragmenta, koji se vezuje za beta-kloto (npr., beta-kloto čoveka), smatra se da antitelo ili njegov fragment indukuje biološki odgovor tada kada je odgovor jednak ili veći od 5%, i poželjno jednak ili veći od 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%, od aktivnosti divljeg tipa standarda FGF19 koji sadrži zreli oblik SEQ ID NO:304 (npr., zreli oblik humanog FGF19) i ima sledeća svojstva: ispoljava nivo efikasnosti jednak ili veći od 5% standarda FGF19, sa EC50 jednakom ili manjom od 100 nM, npr., 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM ili 10 nM u (1) testu na bazi ELK-luciferaznog reporterskog gena (videti, npr., primer 4); (2) ćelijskom testu fosforilacije ERK posredovan rekombinantnim receptorom FGF19 (videti, npr., primer 4); ili (3) testu fosforilacije ERK na humanim adipocitima (videti, npr., primer 5).

[0074] Pojam "FGF19R" može dase odnosi na multimerni receptorski kompleks za koji se zna ili pretpostavlja da ga FGF19 obrazuje in vivo. U različitim primerima izvođenja, FGF19R sadrži (i) FGFR, npr., FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ili FGFR4, i (ii) beta-kloto.

[0075] Pojmovi "prenos signala sličan onom putem FGF21" i "indukuje prenos signala sličan onom putem FGF21", kada se odnose na vezujući protein kao što je antitelo koji se vezuje za beta-kloto predmetnog otkrića, znače da vezivanje proteina (npr., antitela) oponaša, ili modulira, in vivo biološko dejstvo koje indukuje vezivanje (i) beta-kloto; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4; ili (iii) kompleksa koji sadrži beta-kloto i jedan od FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4 i indukuje biološki odgovor koji bi inače nastao vezivanjem FGF21 za (i) beta-kloto; (ii) FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ili FGFR4; ili (iii) kompleks koji sadrži beta-kloto i jedan od FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4 in vivo. Pri oceni vezivanja i specifičnosti antibeta-kloto antitela, na primer, antitela ili njegovog fragmenta, koji se vezuje za beta-kloto (npr., beta-kloto čoveka), smatra se da antitelo ili njegov fragment indukuje biološki odgovor tada kada je odgovor jednak ili veći od 5%, i poželjno jednak ili veći od 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili 95%, od aktivnosti divljeg tipa standarda FGF21 koji sadrži zreli oblik SEQ ID NO:306 ili 429 (npr., zreli oblik sekvence humanog FGF21) i ima sledeća svojstva: ispoljava nivo efikasnosti jednak ili veći od 5% od standarda FGF21, sa EC50 jednakom ili manjom od 100 nM, npr., 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM ili 10 nM u (1) testu na bazi ELK-luciferaznog reporterskog gena (videti, npr., primer 4); (2) ćelijskom testu fosforilacije ERK posredovan rekombinantnim receptorom FGF19 (videti, npr., primer 4); ili (3) testu fosforilacije ERK na humanim adipocitima (videti, npr., primer 5).

[0076] Pojam "FGF21R" može da se odnosi na multimerni receptorski kompleks za koji se zna ili pretpostavlja da ga FGF21 obrazuje in vivo. U različitim primerima izvođenja, FGF21R sadrži (i) FGFR, npr., FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c ili FGFR4, i (ii) beta-kloto.

[0077] Pojam "vezujući protein" odnosi se na protein koji sadrži deo (npr., jedan ili više vezujućih regiona kao što su CDRs) koji se vezuje za beta-kloto, uključujući beta-kloto čoveka ili cinomolgus majmuna i, opciono, deo koji predstavlja skafold ili okvirni region (npr., jedan ili više skafolda ili okvirnih regiona) koji omogućava vezujućem delu da zauzme konformaciju koja podstiče vezivanje vezujućeg proteina za polipeptid beta-kloto, fragment ili epitop. Primeri takvih vezujućih proteina uključuju antitela, kao što je humano antitelo, humanizovano antitelo; himerno antitelo; rekombinantno antitelo; jednolančano antitelo; diatelo; tri-antitelo; tetraantitelo; Fab fragment; F(ab') 2 fragment; IgD antitelo; IgE antitelo; IgM antitelo; IgG1 antitelo; IgG2 antitelo; IgG3 antitelo; ili IgG4 antitelo, i njihove fragmente. Vezujući protein može da sadrži, na primer, alternativni proteinski skafold ili veštački skafold sa graftovanim CDRs ili derivatima CDR regiona. Takvi skafoldi uključuju, ali nisu ograničeni na skafolde poreklom od antitela koji sadrže mutacije uvedene da, na primer, stabilizuju trodimenzionalnu strukturu vezujućeg proteina, kao i potpuno sintetske skafolde koji sadrže, na primer, biokompatibilni polimer. Videti, npr., Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 53(1):121-129 (2003); Roque et al., Biotechnol. Prog. 20:639-654 (2004). Pored toga, mogu da se upotrebe peptidni mimetici antitela ("PAMs"), kao i skafoldi na bazi mimetika antitela upotrebom fibronektinskih komponenti kao skafolda. U kontekstu predmetnog otkrića, kaže se da se vezujući protein specifično vezuje ili selektivno vezuje za beta-kloto, na primer, kada je konstanta disocijacije (KD) ≤10<-8>M. Vezujući protein (npr., antitelo) može da specifično veže beta-kloto sa visokim afinitetom kada je KD≤10<-9>M ili je KD≤10<-10>M. Vezujući proteini (npr., antitela) mogu da se vežu za beta-kloto ili kompleks koji sadrži FGFR1c i beta-kloto, tako da je vrednost KDizmeđu oko 10<-7>M i oko 10<-12>M, a u drugim aspektima, vezujući proteini (npr., antitela) mogu da se vežu tako da vrednost KDiznosi 1-2 x 10<-9>M.

[0078] Pojmovi "antitelo" i "imunoglobulin" ili "Ig" se ovde koriste kao sinonimi, i koriste se u najširem smislu i specifično obuhvataju, na primer, pojedinačna anti-beta-kloto monoklonska antitela (uključujući agonistička, antagonistička, neutralizujuća antitela, antitela cele dužine ili intaktna monoklonska antitela), kompozicije anti-beta-kloto antitela sa poliepitopskom ili monoepitopskom specifičnošću, poliklonska ili monovalentna antitela, multivalentna antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela sve dok ispoljavaju željenu biološku ativnost), formirana od najmanje dva intaktna antitela, jednolančana anti-beta-kloto antitela, i fragmente anti-beta-kloto antitela, kao što je ispod opisano. Antitelo može da bude humano, humanizovano, himerno i/ili sazrelog afiniteta, kao i antitelo drugih vrsta, na primer miša, kunića, itd. Pojam "antitelo" namenjen je da obuhvata polipeptidni proizvod B ćelija u imunoglobulinskoj klasi polipeptida koji može da se veže za specifični molekulski antigen i sačinjen je od dva identična polipeptidna lanca, pri čemu svaki par ima jedan teški lanac (oko 50-70 kDa) i jedan laki lanac (oko 25 kDa) i svaki amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do oko 130 ili više aminokiselina i svaki karboksi-terminalni deo svakog lanca uključuje konstantni region (Videti, Borrebaeck (ed.) (1995) Antibody Engineering, Second Ed., Oxford University Press.; Kuby (1997) Immunology, Third Ed., W.H. Freeman and Company, New York). Specifični molekulski antigen koji može da bude vezan ovde obezbeđenim antitelom uključuje polipeptid beta-kloto, fragment beta-kloto ili epitop beta-kloto. Antitela takođe uključuju, ali nisu ograničena na, sintetska antitela, monoklonska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, multispecifična antitela (uključujući bispecifična antitela), humana antitela, humanizovana antitela, kamelizovana antitela, himerna antitela, intra-tela, anti-idiotipska (anti-Id) antitela, i funkcionalne fragmente (npr., antigen-vezujući fragmenti kao što su beta-klotovezujući fragmenti) bilo čega od gore navedenog, što se odnosi na deo polipeptida teškog ili lakog lanca antitela koji zadržava neke, ili sve vezujuće aktivnosti antitela od koga fragment potiče. Neograničavajući primeri funkcionalnih fragmenata (npr., antigen-vezujući fragmenti kao što su beta-kloto vezujući fragmenti) uključuju jednolančane Fvs (scFv) (npr., uključujući monospecifične, bispecifične, itd.), Fab fragmente, F(ab') fragmente, F(ab)2 fragmente, F(ab')2 fragmente, disulfid-vezane Fvs (sdFv), Fd fragmente, Fv fragmente, diatelo, tria-telo, tetra-telo i mini-telo. Konkretno, ovde obezbeđena antitela uključuju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, na primer, antigen-vezujuće domene ili molekule koji sadrže antigen-vezujuće mesto koje se vezuje za beta-kloto antigen (npr., jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) anti-beta-kloto antitela). Takvi fragmenti antitela opisani su u, na primer, Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Myers (ed.), Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, New York: VCH Publisher, Inc.; Huston et al., Cell Biophysics, 22:189-224 (1993); Plückthun i Skerra, Meth. Enzymol., 178:497-515 (1989) i u Day, E.D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, NY (1990). Ovde obezbeđena antitela mogu da budu bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), ili bilo koje potklase (npr., IgG2a i IgG2b) molekula imunoglobulina. Anti-beta-kloto antitela mogu da budu agonistička antitela ili antagonistička antitela. Ovde su obezbeđena agonistička antitela protiv beta-kloto, uključujući antitela koja indukuju prenos signala sličan onom putem FGF19 i/ili prenos signala sličan onom putem FGF21. Poželjna agonistička antitela protiv beta-kloto ne kompetiraju za vezivanje FGF19 i/ili FGF21 sa FGF receptorom uključujući, na primer, FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, ili FGFR4c.

[0079] Pojam "faktori rasta fibroblasta" odnosi se na familiju faktora rasta, uključujući dvadeset dva člana FGF familije kod čoveka. Potfamilija FGF19 faktora rasta fibroblasta sastoji se od humanog FGF21, FGF23 i FGF19 i mišjeg FGF15. Dejstva članova familije FGF su rezultat njihovog heparin-zavisnog vezivanja za jedan ili više članova familije FGF receptorskih tirozin kinaza (FGFR), koja uključuje četiri člana od kojih svaki ima tirozin kinazni domen, FGFR1, FGFR2, FGFR3 i FGFR4, kao i dve varijante nastale splajsovanjem svakog od FGFR1, FGFR2 i FGFR3. Ove varijante nastale splajsovanjem, koje se javljaju u egzonu 3 FGFR1, FGFR2 i FGFR3, označene su kao "b" i "c" varijante (npr., FGFR1b, FGFR2b, FGFR3c, FGFR1c, FGFR2c i FGFR3c, koje su takođe poznate kao FGFR1(III)b, FGFR2(III)b, FGFR3(III)c, FGFR1(III)c, FGFR2(III)c i FGFR3(III)c, redom). Na primer, FGF19 je usmeren i deluje i na adipocite i na hepatocite. Miševi tretirani rekombinantnim humanim FGF19 (rhFGF19), uprkos dijeti sa visokim sadržajem masti, pokazuju povećanu brzinu metabolizma, povećanu oksidaciju lipida, niži respiratorni koeficijent i gubitak težine. Osim toga, takvi miševi su pokazali niže serumske nivoe leptina, insulina, holesterola i triglicerida, i normalne nivoe glukoze u krvi uprkos dijeti sa visokim sadržajem masti i bez smanjenja apetita. Osim toga, gojazni miševi kojima je nedostajao leptin, ali su imali FGF19 transgen pokazali su gubitak težine, snižen holesterol i trigliceride, i nisu razvili dijabetes. Pored toga, gojazni, dijabetični miševi kojima nedostaje leptin, kada im je injektovan rhFGF19, ispoljili su povratak svojih metaboličkih

4

karakteristika u obliku gubitka težine i snižene glukoze u krvi. Na primer, FGF21 se eksprimira primarno u jetri i ima metabolička dejstva slična onima kod FGF19, kao što su povećani metabolizam preko njegovih dejstava na adipozno tkivo, gubitak težine, snižene nivoe glukoze u krvi, i otpornost na gojaznost i dijabetes. FGF21-transgeni miševi su takođe otporni na dijetom indukovanu gojaznost, i, u glodarskim modelima dijabetesa, primena FGF21 snizila je nivoe glukoze i triglicerida u krvi. Metabolička dejstva FGF19 i FGF21 odvijaju se preko njihovog vezivanja za FGF receptore, uključujući FGFR1c, FGFR2c i FGFR3c receptore, i oni zahtevaju beta-kloto za vezivanje. Vezivanje FGF19 i FGF21 za FGFR1c i FGFR2c je značajno. Takođe je pokazano da FGF19 ima metabolička dejstva različita od FGF21, koja uključuju regulaciju proizvodnje žuči u jetri preko njegovih dejstava specifičnih za jetru, negativnu regulaciju proizvodnje žuči kao odgovor na postprandijalnu proizvodnju žuči, i mitogena dejstva na jetru koja nisu zapažena kod FGF21. Na primer, FGF19-transgeni miševi razvijaju hepatični adenokarcinom zbog povećane proliferacije i displazije hepatocita, i rhFGF19-tretirani miševi ispoljavaju proliferaciju hepatocita. Ove dodatne aktivnosti FGF19 su izgleda posredovane njegovim vezivanjem za FGFR4. FGF19 može da veže FGFR4 i na beta-kloto-zavisan i betakloto-nezavisan način. Iako je pokazano da se i FGF21 vezuje za FGFR4 na beta-kloto-zavisan način, prethodno nije zapažen efikasan prenos signala kao posledica vezivanja FGF21 za FGFR4.

[0080] Vezujući proteini, kao što su anti-beta-kloto antitela, kao što su ovde opisana, mogu da indukuju prenos signala sličan onom putem FGF19, kao što je ovde opisano. In vivo, zreli oblik FGF19 je aktivan oblik molekula. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira FGF19 cele dužine data je ispod; nukleotidi koji kodiraju signalnu sekvencu su podvučeni.

[0081] Data je aminokiselinska sekvenca FGF19 cele dužine; aminokiseline koje čine signalnu sekvencu su podvučene:

[0082] Vezujući proteini, kao što su anti-beta-kloto antitela, kao što je ovde opisano mogu da indukuju prenos signala sličan onom putem FGF21, kao što je ovde opisano. In vivo, zreli oblik FGF21 je aktivni oblik molekula. Data je sekvenca nukleinske kiseline koja kodira FGF21 cele dužine; nukleotidi koji kodiraju signalnu sekvencu su podvučeni:

[0083] Ispod je data aminokiselinska sekvenca FGF21 cele dužine; aminokiseline koje čine signalnu sekvencu su podvučene:

[0084] Data je sekvenca nukleinske kiseline koja takođe koja kodira FGF21 cele dužine; nukleotidi koji kodiraju signalnu sekvencu su podvučeni:

[0085] Data je aminokiselina sekvenca koja takođe kodira FGF21 cele dužine; aminokiseline koje kodiraju signalnu sekvencu su podvučene:

[0086] Vezujući proteini, kao što su anti-beta-kloto antitela, kao što je ovde opisano, vezuju se za beta-kloto sam, ili u kompleksu sa FGF receptorom, kao što je FGFR1c. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani FGFR1c (GenBank pristupni broj NM 023110; takođe označen kao FGFRαIIIc) data je ispod:

4

[0087] Aminokiselinska sekvenca humanog FGFR1c (GenBank pristupni broj NP 075598) (takođe označen kao FGFRαIIIC) data je ispod:

4

[0088] Vezujući proteini, kao što su ovde opisana anti-beta-kloto antitela, mogu da se vežu za beta-kloto u kompleksu sa vanćelijskim delom FGF receptora kao što je FGFR1c. Primer vanćelijskog regiona FGFR1c je:

[0089] Primer vanćelijskog regiona FGFR1c (αIIIc) je:

[0090] Primer vanćelijskog regiona FGFR1c (βIIIc) je:

4

[0091] Kao što je ovde opisano, FGFR1c proteini mogu takođe da uključuju fragmente. Kako se ovde koristi, pojmovi se koriste kao sinonimi da označe receptor, konkretno, i ako nije drugačije navedeno, humani receptor, koji nakon udruživanja sa beta-kloto i FGF21 indukuje aktivnost prenosa signala sličnu onoj kod FGF21.

[0092] Pojam FGFR1c takođe uključuje post-translacione modifikacije aminokiselinske sekvence FGFR1c, na primer, moguća N-vezana glikozilaciona mesta. Prema tome, antigenvezujući proteini mogu da se vežu za ili da budu generisani od proteina koji su glikozilisani na jednoj ili više pozicija.

[0093] Vezujući proteini, kao što su anti-beta-kloto antitela, kao što su ovde opisana, vezuju se za beta-kloto sam, ili u kompleksu sa FGF receptorom, kao što je FGFR2c. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani FGFR2c data je ispod:

4

[0094] Ispod je data aminokiselinska sekvenca humanog FGFR2c; aminokiseline koje čine signalnu sekvencu su podvučene:

4

[0095] Vezujući proteini, kao što su anti-beta-kloto antitela, kao što su ovde opisana, vezuju se za beta-kloto sam, ili u kompleksu sa FGF receptorom, kao što je FGFR3c. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani FGFR3c (GenBank pristupni broj NP 000133) data je ispod:

4

[0096] Ispod je data aminokiselinska sekvenca humanog FGFR3c; aminokiseline koje čine signalnu sekvencu su podvučene:

[0097] Vezujući proteini, kao što su anti-beta-kloto antitela, kao što je ovde opisano, vezuju se za beta-kloto sam, ili u kompleksu sa FGF receptorom, kao što je FGFR4. Sekvenca kodirajuće nukleinske kiseline humanog FGFR4 data je ispod:

1

[0098] Aminokiselinska sekvenca humanog FGFR4 (GenBank pristupni broj NP.002002.3) data je ispod; aminokiseline koje čine signalnu sekvencu su podvučene:

[0099] "Antigen" je unapred određeni antigen za koji antitelo može selektivno da se veže. Ciljni antigen može da bude polipeptid, ugljeni hidrat, nukleinska kiselina, lipid, hapten ili drugo prirodno ili sintetsko jedinjenje. Poželjno, ciljni antigen je polipeptid.

[0100] Pojam "antigen-vezujući fragment", "antigen-vezujući domen", "antigen-vezujući region" i slični pojmovi odnose se na onaj deo antitela koji sadrži aminokiselinske rezidue koje

2

interaguju sa antigenom i daju vezujućem agensu njegovu specifičnost i afinitet za antigen (npr., regioni koji određuju komplementarnost (CDRs)).

[0101] Pojmovi "vezuje" ili "vezivanje" odnose se na interakciju između molekula uključujući, na primer, obrazovanje kompleksa. Interakcije mogu da budu, na primer, nekovalentne interakcije uključujući vodonične veze, jonske veze, hidrofobne interakcije, i/ili van der Waals interakcije. Kompleksi mogu takođe da uključuju vezivanje dva ili više molekula povezana kovalentnim ili nekovalentnim vezama, interakcijama ili silama. Jačina ukupnih nekovalentnih interakcija između jednog antigen-vezujućeg mesta na antitelu i jednog epitopa ciljnog molekula, kao što je beta-kloto, je afinitet antitela ili funkcionalni fragment za taj epitop. Odnos asocijacije (k1) prema disocijaciji (k-1) antitela prema monovalentnom antigenu (k1/ k-1) je konstanta asocijacije K, koja je mera afiniteta. Vrednost K varira za različite komplekse antitela i antigena i zavisi i od k1 i od k-1. Konstanta asocijacije K za antitelo koje je ovde obezbeđeno može da se odredi upotrebom bilo kog ovde datog postupka ili bilo kog drugog postupka koji je dobro poznat stručnjacima u ovoj oblasti. Afinitet na jednom vezujućem mestu ne odražava uvek pravu jačinu interakcije između antitela i antigena. Kada kompleksni antigeni koji sadrže višestruke, ponavljajuće antigene determinante, kao što su polivalentni beta-kloto, dođu u kontakt sa antitelima koja sadrže višestruka vezujuća mesta, interakcija antitela sa antigenom na jednom mestu povećaće verovatnoću reakcije na drugom mestu. Jačina takvih višestrukih interakcija između multivalentnog antitela i antigena naziva se aviditet. Aviditet antitela može da bude bolja mera njegovog vezujućeg kapaciteta nego što je to afinitet njegovih pojedinačnih vezujućih mesta. Na primer, visok aviditet može da kompenzuje nizak afinitet kakav je ponekad slučaj sa pentamernim IgM antitelima, koja mogu da imaju niži afinitet nego IgG, ali visok aviditet IgM, koji rezultuje iz njegove multivalentnosti, omogućava ovom antitelu da efikasno veže antigen.

[0102] Pojmovi "antitela koja se specifično vezuju za beta-kloto", "antitela koja se specifično vezuju za epitop beta-kloto" i analogni pojmovi se takođe ovde koriste kao sinonimi i odnose se na antitela koja se specifično vezuju za polipeptid beta-kloto, kao što su antigen, ili fragment, ili epitop beta-kloto (npr., beta-kloto čoveka kao što su humani polipeptid, antigen ili epitop betakloto). Antitelo koje se specifično vezuje za beta-kloto, (npr., beta-kloto čoveka) može da se veže za vanćelijski domen ili peptid poreklom od vanćelijskog domena beta-kloto u beta-kloto. Antitelo koje se specifično vezuje za beta-kloto antigen (npr., beta-kloto čoveka) može da bude unakrsno reaktivno sa srodnim antigenima (npr., beta-kloto cinomolgus majmuna). U određenim primerima izvođenja, antitelo koje se specifično vezuje za beta-kloto antigen ne reaguje unakrsno sa drugim antigenima. Antitelo koje se specifično vezuje za beta-kloto antigen može da se identifikuje, na primer, imunoesejima, Biacore testom, ili drugim tehnikama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Antitelo se specifično vezuje ta beta-kloto antigen kada se vezuje za beta-kloto antigen sa višim afinitetom nego za bilo koji unakrsno reaktivni antigen određeno upotrebom eksperimentalnih tehnika, kao što su radioimunoeseji (RIA) i enzimski vezani imunosorbentni testovi (ELISAs). Tipično, specifična ili selektivna reakcija će imati signal najmanje dvaput veći od pozadinskog signala ili šuma i može da ima 10 puta jači signal od pozadinskog. Videti, npr., Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York na stranama 332-336 za diskusiju u pogledu specifičnosti antitela. Antitelo "koje vezuje" antigen od interesa (npr., ciljni antigen kao što je beta-kloto) je ono koje vezuje antigen sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao terapijski agens u ciljnom delovanju na ćeliju ili tkivo koje eksprimira antigen, i ne ispoljava značajnu unakrsnu reakciju sa drugim proteinima. U takvim primerima izvođenja, stepen vezivanja antitela za protein koji "nije ciljni" biće manji od oko 10% vezivanja antitela za njegov konkretni ciljni protein, na primer, određeno analizom fluorescentno aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS) ili radioimunoprecipitacijom (RIA). Primenjen na vezivanje antitela za ciljni molekul, pojam "specifično vezivanje" ili "specifično se vezuje za" ili je "specifičan za" određeni polipeptid ili epitop na konkretnom ciljnom polipeptidu označava vezivanje koje je merljivo drugačije od nespecifične interakcije. Specifično vezivanje može da se meri, na primer, određivanjem vezivanja molekula u poređenju sa vezivanjem kontrolnog molekula, koji je uopšteno molekul slične strukture koji ne ispoljava aktivnost vezivanja. Na primer, specifično vezivanje može da se odredi kompeticijom sa kontrolnim molekulom koji je sličan ciljnom molekulu, na primer, sa viškom neobeleženog ciljnog molekula. U tom slučaju, u pitanju je specifično vezivanje ako je vezivanje obeleženog ciljnog molekula za probu potpuno inhibirano viškom neobeleženog ciljnog molekula. Pojam "specifično vezivanje" ili "specifično se vezuje za" ili je "specifičan za" određeni polipeptid ili epitop na konkretnom ciljnom polipeptidu, kako se ovde koristi, može da se ispolji, na primer, time što molekul ima Kd za ciljni molekul od najmanje oko 10<-4>M, alternativno najmanje oko 10<-5>M, alternativno najmanje oko 10<-6>M, alternativno najmanje oko 10<-7>M, alternativno najmanje oko 10<-8>M, alternativno najmanje oko 10<-9>M, alternativno najmanje oko 10<-10>M, alternativno najmanje oko 10<-11>M, alternativno najmanje oko 10<-12>M, ili više. Pojam "specifično vezivanje" odnosi se na vezivanje kod koga se molekul vezuje za određeni polipeptid ili epitop na konkretnom polipeptidu bez suštinskog vezivanja za bilo koji drugi polipeptid ili polipeptidni epitop. U određenim primerima izvođenja, antitelo koji se vezuje za beta-kloto ima konstantu disocijacije (Kd) manju od, ili jednaku 10 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, ili 0.1 nM. Što je KDniža, to je veći afinitet anti-beta-kloto antitela. U određenim primerima izvođenja, anti-beta-

4

kloto antitelo vezuje epitop beta-kloto koji se pojavljuje kao konzervativan kod beta-kloto različitih vrsta (npr., između beta-kloto čoveka i cinomolgus majmuna).

[0103] Pojam "kompetira", kada se koristi u kontekstu anti-beta-kloto antitela (npr., agonistička antitela i vezujući proteini koji se vezuju za (i) beta-kloto; ili (ii) kompleks koji sadrži beta-kloto i jedan od FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4) koja kompetiraju za isti epitop ili vezujuće mesto na ciljnom molekulu označava kompeticiju među njima određenu testom u kome antitelo (ili njegov vezujući fragment) koje se ispituje sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog molekula (npr., referentni ligand, ili referentni antigen-vezujući protein, kao što je referentno antitelo) za zajednički antigen (npr., beta-kloto ili njegov fragment). Brojni različiti testovi za kompetitivno vezivanje mogu da se koriste za određivanje da li ispitivano antitelo kompetira sa referentnim antitelom za vezivanje za beta-kloto (npr., beta-kloto čoveka). Primeri testova koji mogu da se koriste uključuju direktni ili indirektni radioimunoesej (RIA) na čvrstoj fazi, direktni ili indirektni enzimski imunoesej (EIA) na čvrstoj fazi, „sendvič“ kompetitivni test (videti, npr., Stahli et al., (1983) Methods in Enzymology 9:242-253); direktni biotin-avidin EIA na čvrstoj fazi (videti, npr., Kirkland et al., (1986) J. Immunol. 137:3614-3619) direktno obeleženi test na čvrstoj fazi, direktno obeleženi „sendvič“ test na čvrstoj fazi (videti, npr., Harlow i Lane, (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); direktno obeleženi RIA na čvrstoj fazi upotrebom oznake 1-125 (videti, npr., Morel et al., (1988) Molec. Immunol. 25:7-15); direktni biotin-avidin EIA na čvrstoj fazi (videti, npr., Cheung, et al., (1990) Virology 176:546-552); i direktno obeleženi RIA (Moldenhauer et al., (1990) Scand. J. Immunol.32:77-82). Tipično, takav test uključuje upotrebu prečišćenog antigena (npr., beta-kloto kao što je beta-kloto čoveka) koji je vezan za čvrstu površinu ili ćelija koje nose ili neobeleženi ispitivani antigen-vezujući protein (npr., ispitivano anti-beta-kloto antitelo) ili obeleženi referentni antigen-vezujući protein (npr., referentno antibeta-kloto antitelo). Kompetitivna inhibicija može da se meri određivanjem količine oznake vezane za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu ispitivanog antigen-vezujućeg proteina. Obično je ispitivani antigen-vezujući protein prisutan u višku. Antitela identifikovana pomoću testa kompeticije (kompetitivna antitela) uključuju antitela koja se vezuju za isti epitop kao referentno antitelo i/ili antitela koja se vezuju za susedni epitop koji je dovoljno blizak epitopu za koji se vezuje referentno antitelo da dolazi do pojave sternog ometanja antitela. Dodatni detalji u vezi sa postupcima određivanja kompetitivnog vezivanja opisani su u ovom dokumentu. Obično, kada je protein kompetitivnih antitela prisutan u višku, on će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela za zajednički antigen za najmanje 23%, na primer 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ili 97%, 98%, 99% ili više.

[0104] Pojam "anti-beta-kloto antitelo" ili "antitelo koje se vezuje za beta-kloto" uključuje antitelo koje može da veže beta-kloto sa dovoljnim afinitetom da antitelo može da se upotrebi kao dijagnostički i/ili terapijski agens za ciljno delovanje na beta-kloto. Poželjno, stepen vezivanja anti-beta-kloto antitela za nesrodni, ne-beta-kloto protein manji je od oko 10% od vezivanja antitela za beta-kloto mereno, na primer, pomoću analize fluorescentno aktiviranog ćelijskog sortiranja (FACS) ili imunoeseja kao što je radioimunoesej (RIA). Antitelo koje "specifično vezuje" ili je "specifično za" beta-kloto ilustrovano je iznad u tekstu. Antitelo koje se vezuje za beta-kloto, kao što je definisano u patentnim zahtevima ima konstantu disocijacije (Kd) manju od, ili jednaku 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 0.9 nM, 0.8 nM, 0.7 nM, 0.6 nM, 0.5 nM, 0.4 nM, 0.3 nM, 0.2 nM, ili 0.1 nM, i/ili veću od, ili jednaku 0.1 nM. U određenim primerima izvođenja, anti-beta-kloto antitelo vezuje epitop beta-kloto koji se pojavljuje kao konzervativan kod beta-kloto različitih vrsta (npr., između beta-kloto čoveka i cinomolgus majmuna).

[0105] "Izolovano" antitelo je suštinski bez ćelijskog materijala ili drugih kontaminirajućih proteina poreklom od ćelija ili tkiva i/ili drugih kontaminirajućih komponenti od kojih antitelo potiče, ili suštinski bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je sintetisano hemijskim putem. Izraz "suštinski bez ćelijskog materijala" uključuje pripremu antitela kod koje se antitelo odvaja od ćelijskih komponenti ćelija iz kojih je izolovano ili rekombinanto proizvedeno. Prema tome, antitelo koje je suštinski bez ćelijskog materijala uključuje pripremu antitela koje ima manje od oko 30%, 25%, 20%, 15%,10%, 5%, ili 1% (suve težine) heterologog proteina (takođe ovde označenog kao "kontaminirajući protein"). U određenim primerima izvođenja, kada je antitelo rekombinantno proizvedeno, ono je suštinski bez medijuma za kulturu, npr., medijum za kulturu predstavlja manje od oko 20%, 15%, 10%, 5%, ili 1% od zapremine proteinskog preparata. U određenim primerima izvođenja, kada se antitelo proizvedi hemijskom sintezom, ono je suštinski bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija, na primer, odvojeno je od hemijskih prekursora ili drugih hemikalija koje su uključene u sintezu proteina. Prema tome, takvi preparati antitela imaju manje od oko 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, ili 1% (suve težine) hemijskih prekursora ili jedinjenja koja nisu antitelo od interesa. Kontaminirajuće komponente mogu takođe da uključuju, ali nisu ograničene na materijale koji bi interferirali sa terapijskim upotrebama antitela, i mogu da uključuju enzime, hormone, i druge proteinske ili neproteinske rastvorene supstance. U određenim primerima izvođenja, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 95% po težini antitela određeno Lorijevom metodom (Lowry et al. J. Bio. Chem. 193: 265275, 1951), kao što je 96%, 97%, 98%, ili 99%, po težini, (2) do stepena kada je moguće odrediti najmanje 15 rezidua N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence upotrebom "spinning cup" sekvenatora, ili (3) do homogenosti na SDS-PAGE pod redukujućim ili neredukujućim uslovima upotrebom Coomassie plavog ili, poželjno, srebrnog bojenja. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ u rekombinantnim ćelijama budući da najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će biti pripremljeno pomoću najmanje jednog koraka prečišćavanja. U specifičnim primerima izvođenja, ovde obezbeđena antitela su izolovana.

[0106] Četvorolančano jedinično antitelo je heterotetramerni glikprotein sačinjen od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. U slučaju IgGs, četvorolančana jedinica je uglavnom oko 150 000 daltona. Svaki L lanac je vezan za H lanac jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca povezana jedan sa drugim preko jedne ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. Svaki H i L lanac takođe ima pravilno razmaknute unutarlančane disulfidne mostove. Svaki H lanac ima na N-terminalnom kraju, varijabilni domen (VH) praćen sa tri konstantna domena (CH) kod svakog od α i γ lanaca i četiri CH domena kod µ i ε izotipova. Svaki L lanac ima na N-terminalnom kraju, varijabilni domen (VL) praćen konstantnim domenom (CL) na svom drugom kraju. VL je poravnat sa VH i CL je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca (CH1). Smatra se da određene aminokiselinske rezidue formiraju dodirnu površinu između varijabilnih domena lakog lanca i teškog lanca. Sparivanjem VH i VL obrazuje se jedno antigen-vezujuće mesto. Za strukturu i svojstva različitih klasa antitela, videti, npr., Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr i Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, str 71 i poglavlje 6.

[0107] Pojam "varijabilni region" ili "varijabilni domen" odnosi se na deo lakog ili teškog lanca antitela koji je uglavnom smešten na amino-terminalnom kraju lakog ili teškog lanca i ima dužinu od oko 120 do 130 aminokiselina u teškom lancu i oko 100 do 110 aminokiselina u lakom lancu, i ima ulogu u vezivanju i specifičnosti svakog konkretnog antitela za njegov određeni antigen. Varijabilni region teškog lanca može da bude označen kao "VH." Varijabilni region lakog lanca može da bude označen kao "VL." Pojam "varijabilni" odnosi se na činjenicu da se određeni segmenti varijabilnih regiona intenzivno razlikuju po sekvenci između različitih antitela. V region posreduje u vezivanju antigena i definiše specifičnost konkretnog antitela za određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena duž kičme od 110 aminokiselina varijabilnih regiona. Umesto toga, V regioni se sastoje od manje varijabilnih (npr., relativno invarijantnih) nizova nazvanih okvirni regioni (FRs) od oko 15-30 aminokiselina razdvojenih kraćim regionima veće varijabilnosti (npr., izuzetno varijabilnih) nazvanih "hipervarijabilni regioni" od kojih je svaki dug oko 9-12 aminokiselina. Svaki od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca sadrže četiri FR, koji uglavnom zauzimaju konfiguraciju β-naborane ploče, povezana sa tri hipervarijabilna regiona, koji obrazuju petlje koje spajaju, i u nekim slučajevima čine deo, strukture β-naborane ploče. Hipervarijabilni regioni svakog lancu lanca se drže zajedno veoma blisko pomoću FR regiona i, sa hipervarijabilnim regionima drugog lanca, doprinose formiranju antigen-vezujućeg mesta antitela (videti, npr., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)). Konstantni regioni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za antigen, ali ispoljavaju različite efektorske funkcije, kao što su učestvovanje antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). Varijabilni regioni se intenzivno razlikuju po sekvenci između različitih antitela. Varijabilnost u sekvenci je koncentrisana u CDR regionima, dok su manje varijabilni delovi u varijabilnom regionu označeni kao okvirni regioni (FR). CDR regioni lakog i teškog lanca su prvenstveno odgovorni za interakciju antitela sa antigenom. U specifičnim primerima izvođenja, varijabilni region je humani varijabilni region.

[0108] Pojam "numerisanje rezidua varijabilnog regiona prema Kabatu" ili "numerisanje položaja aminokiselina prema Kabatu", i njegove varijante, odnosi se na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne regione teškog lanca ili varijabilne regione lakog lanca grupe antitela u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Upotrebom ovog sistema numeracije, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može da sadrži izostale ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju, ili inserciji u FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može da uključuje jedan aminokiselinski insert (rezidua 52a prema Kabatu) posle rezidue 52 u H2 i insertovane rezidue (npr., rezidue 82a, 82b, i 82c, itd, prema Kabatu) posle rezidue 82 u FR teškog lanca. Numerisanje prema Kabatu rezidua može da se odredi za dato antitelo poravnanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" sekvencom numerisanom prema Kabatu. Sistem numerisanja prema Kabatu se uglavnom koristi u vezi sa reziduama u varijabilnom domenu (približno rezidue 1-107 lakog lanca i rezidue 1-113 teškog lanca) (npr., Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). "Sistem numerisanja EU " ili "EU indeks" se uglavnom koristi kada se odnosi na reziduu u konstantnom regionu teškog lanca imunoglobulina (npr., EU indeks prikazan u Kabat et al., iznad). "EU indeks prema Kabatu" odnosi se na numerisanje rezidua humanog IgG 1 EU antitela. Opisani su i drugi sistemi numerisanja, uključujući, na primer, AbM, Chothia, Contact, IMGT i AHon. Različiti sistemi numeracije ilustrovani su na slikama 1-3.

[0109] "Intaktno" antitelo je ono koje sadrži antigen-vezujuće mesto kao i CL i najmanje CH1, CH2 i CH3 konstantne regione teškog lanca. Konstantni regioni mogu da uključuju humane konstantne regione ili varijante njihove aminokiselinske sekvence. Poželjno, intaktno antitelo ima jednu ili više efektorskih funkcija.

[0110] "Fragmenti antitela" sadrže deo intaktnog antitela, poželjno antigen-vezujući ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju, bez ograničenja, Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente; diatela i di-diatela (videti, npr., Holliger, P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.90:6444-8; Lu, D. et al., (2005) J. Biol. Chem.280:19665-72; Hudson et al., Nat. Med.

9:129-134 (2003); WO 93/11161; i SAD patente br. 5,837,242 i 6,492,123); molekul jednolančanog antitela (videti, npr., SAD patente br. 4,946,778; 5,260,203; 5,482,858 i 5,476,786); antitela sa dvostrukim varijabilnim domenom (videti, npr., SAD patent br.

7,612,181); antitela sa jednim varijabilnim domenom (SdAbs) (videti, npr., Woolven et al., Immunogenetics 50: 98-101, 1999; Streltsov et al., Proc Natl Acad Sci USA.101:12444-12449, 2004); i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela.

[0111] "Funkcionalni fragment" ili "vezujući fragment" ili "antigen-vezujući fragment" terapijskog antitela ispoljiće najmanje jednu, ako ne neke ili sve biološke funkcije koje se pripisuju intaktnom antitelu, funkcije koja obuhvata najmanje vezivanje za ciljni antigen, (npr., beta-kloto-vezujući fragment ili fragment koji se vezuje za beta-kloto).

[0112] Pojam "fuzioni protein", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu antitela i aminokiselinsku sekvencu heterologog polipeptida ili proteina (npr., polipeptida ili proteina koji nije normalno deo antitela (npr., antitelo koje ne vezuje beta-kloto antigen)). Pojam "fuzioni", kada se koristi u vezi sa beta-kloto ili sa anti-betakloto antitelom, odnosi se na spajanje peptida ili polipeptida, ili fragmenta, njihove varijante i/ili derivata, sa heterologim peptidom ili polipeptidom. U određenim primerima izvođenja, fuzioni protein zadržava biološku aktivnost beta-kloto ili anti-beta-kloto antitela. Fuzioni protein sadrži VH region, VL region, VH CDR (tri VH CDRs), i/ili VL CDR (tri VL CDRs) beta-kloto antitela, kao što je definisano u patentnim zahtevima, pri čemu se fuzioni protein vezuje za epitop betakloto, fragment beta-kloto i/ili polipeptid beta-kloto.

[0113] Pojam "teški lanac", kada se koristi u vezi sa antitelom, odnosi se na polipeptidni lanac od oko 50-70 kDa, u kome amino-terminalni deo uključuje varijabilni region od oko 120 do 130 ili više aminokiselina i karboksi-terminalni deo koji uključuje konstantni region. Konstantni region može da bude jedan od pet različitih tipova, (npr., izotipa) označenih kao alfa (α), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) i mi (µ), na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnog regiona teškog lanca. Različiti teški lanci razlikuju se po veličini: α, δ i γ sadrže približno 450 aminokiselina, dok µ i ε sadrže približno 550 aminokiselina. Kada se kombinuju sa lakim lancem, ovi različiti tipovi teških lanaca daju pet dobro poznatih klasa (npr., izotipa) antitela, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, redom, uključujući četiri potklase IgG, odnosno IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Teški lanac može da bude humani teški lanac.

[0114] Pojam "laki lanac", kada se koristi u vezi sa antitelom, odnosi se na polipeptidni lanac od oko 25 kDa, u kome amino-terminalni deo uključuje varijabilni region od oko 100 do oko 110 ili više aminokiselina i karboksi-terminalni deo uključuje konstantni region. Približna dužina lakog lanca je 211 do 217 aminokiselina. Postoje dva različita tipa, označena kao kapa (κ) ili lambda (λ) na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnih domena. Aminokiselinske sekvence lakog lanca su dobro poznate u stanju tehnike. Laki lanac može da bude humani laki lanac.

[0115] Pojam "domaćin", kako se ovde koristi, odnosi se na životinju, kao što je sisar (npr., čovek).

[0116] Pojam "ćelija-domaćin", kako se ovde koristi, odnosi se na određenu predmetnu ćeliju koja može da se transfekuje molekulom nukleinske kiseline i na potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćelije. Potomstvo takve ćelije ne mora da bude identično parentalnoj ćeliji koja je transfekovana molekulom nukleinske kiseline zbog mutacija ili uticaja sredine koji se javljaju u narednim generacijama ili integracije molekula nukleinske kiseline u genom ćelije-domaćina.

[0117] Pojam "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, npr., pojedinačna antitela koja sadrži populacija su identična osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu da budu prisutne u malim količinama, i svako monoklonsko antitelo će tipično prepoznati jedan epitop na antigenu. U specifičnim primerima izvođenja, "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, je antitelo proizvedeno u jednome hibridomu ili drugoj ćeliji, pri čemu se antitelo vezuje samo za epitop beta-kloto određeno, na primer, ELISA testom ili drugim testom za vezivanje antigena ili kompetitivno vezivanje poznatim u stanju tehnike. Pojam "monoklonsko" nije ograničen na bilo koji konkretan metod za pravljenje antitela. Na primer, monoklonska antitela korisna za predmetno otkriće mogu da se pripreme metodologijom hibridoma koja je prvo opisana kod Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili mogu da se naprave upotrebom metoda rekombinantne DNK u bakterijskim, eukariotskim životinjskim ili biljnim ćelijama (videti, npr., SAD patent br. 4,816,567). "Monoklonska antitela" mogu takođe da budu izolovana iz biblioteka antitela na fagu upotrebom tehnika opisanih u Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), na primer. Druge metode za pripremu klonalnih ćelijskih linija i monoklonskih antitela eksprimiranih u njima su dobro poznate u stanju tehnike (videti, na primer, poglavlje 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley and Sons, New York). Primeri metoda za proizvodnju monoklonskih antitela obezbeđeni su u Primerima u ovom dokumentu.

[0118] Pojam "nativni", kada se koristi u vezi sa biološkim materijalima kao što su molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi, ćelije-domaćini, i slično, odnosi se na one koji se nalaze u prirodi i čovek ih nije podvrgavao manipulacijama, modifikacijama, i/ili izmenama (npr., nisu izolovani, prečišćeni, selektovani).

[0119] Ovde obezbeđena antitela mogu da uključuju "himerna" antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima poreklom od određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili potklasi antitela, dok je ostatak lanaca/lanaca identičan sa ili homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima poreklom od drugih vrsta ili koja pripadaju drugoj klasi ili potklasi antitela, kao i fragmenti takvih antitela, sve dok ispoljavaju željenu biološku aktivnost (videti SAD patent br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

[0120] "Humanizovani" oblici nehumanog (npr., mišjeg) antitela su himerna antitela koja uključuju humane imunoglobuline (npr., recipijentno antitelo) u kojima su nativne CDR rezidue zamenjene reziduama iz odgovarajućih CDR nehumanih vrsta (npr., donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, kunić ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim slučajevima, jedna ili više rezidua FR regiona humanog imunoglobulina zamenjene su odgovarajućim nenhumanim reziduama. Osim toga, humanizovana antitela mogu da sadrže rezidue koje se nalaze u recipijentnom antitelu ili u donorskom antitelu. Ove modifikacije se uvode da bi se dodatno poboljšale karakteristike antitela. Teški ili laki lanac humanizovanog antitela može da sadrži suštinski sve od najmanje jednog ili više varijabilnih regiona, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima u imunoglobulinu koji nije humanog porekla, i svi ili suštinski svi FR regioni sadrže sekvence humanog imunoglobulina. U određenim primerima izvođenja, humanizovano antitelo će sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično humanog imunoglobulina. Za dodatne detalje, videti, Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992); Carter et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA 89:4285-4289 (1992); i SAD patente br: 6,800,738 (objavljen 5. oktobra 2004), 6,719,971 (objavljen 27. septembra 2005), 6,639,055 (objavljen 28. oktobra 2003), 6,407,213 (objavljen 18. juna 2002), i 6,054,297 (objavljen 25. aprila 2000).

1

[0121] "Humano antitelo" je ono koje poseduje aminokiselinu sekvencu koja odgovara sekvenci antitela nastalog u čoveku i/ili je napravljeno upotrebom bilo koje od tehnika za pravljenje humanih antitela koje su ovde opisane. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži nehumane antigen-vezujuće rezidue. Humana antitela mogu da budu proizvedena upotrebom različitih tehnika poznatih u ovoj oblasti, uključujući biblioteke prikaza na fagu (Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) i biblioteke prikaza na kvascu (Chao et al., Nature Protocols 1: 755-768 (2006)). Takođe su za pripremu humanog monoklonskog antitela dostupne metode opisane u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Videti takođe van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Humana antitela mogu da se pripreme primenom antigena na transgene životinje koje su modifikovane tako da proizvode takva antitela kao odgovor na izlaganje antigenu, ali čiji su endogeni lokusi onesposobljeni, npr., miševi (videti, npr., Jakobovits, A., Curr. Opin. Biotechnol. 1995, 6(5):561-6; Brüggemann and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):455-8; i SAD pat. br. 6,075,181 i 6,150,584 u pogledu tehnologije XENOMOUSE™). Videti takođe, na primer, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) u vezi sa humanim antitelima generisanim putem tehnologije humanih B-ćelijskih hibridoma.

[0122] "CDR" se odnosi na jedan od tri hipervarijabilna regiona (H1, H2 ili H3) u ne-okvirnom regionu β ravni okvirnog regiona VH imunoglobulina (Ig ili antitela), ili jedan od tri hipervarijabilna regiona (L1, L2 ili L3) u ne-okvirnom regionu β ravni okvirnog regiona VL antitela. Prema tome, CDR su sekvence varijabilnog regiona isprepletane sa sekvencama okvirnog regiona. CDR regioni su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i definisani su kod, na primer, Kabata kao regioni sa najviše hipervarijabilnosti u varijabilnim (V) domenima antitela (Kabat et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); Kabat, Adv. Prot. Chem. 32:1-75 (1978)). Sekvence CDR regiona takođe su strukturno definisane kod Chothia kao one rezidue koje nisu deo konzervativne β ravni okvirnog regiona, i stoga mogu da zauzmu različite konformacije (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Obe terminologije su dobro poznate u stanju tehnike Sekvence CDR regiona takođe su definisane sa AbM, Contact i IMGT. Sekvence CDR regiona su ilustrovane na slikama 1-3. Pozicije CDR regiona u kanonskom varijabilnom regionu antitela određene su poređenjem brojnih struktura (Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol.

273:927-948 (1997); Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Budući da broj rezidua u hypervarijabilnom regionu varira u različitim antitelima, dodatne rezidue u odnosu na kanonske pozicije su konvencionalno označene sa a, b, c i tako dalje do broja rezidue u šemi numerisanja

2

kanonskog varijabilnog regiona (Al-Lazikani et al., gore (1997)). Takva nomenklatura na sličan način je poznata stručnjacima u ovoj oblasti.

[0123] Pojam "hipervarijabilni region", "HVR", ili "HV", kako se ovde koristi, odnosi se na oblasti varijabilnih regiona antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci i/ili obrazuju strukturno definisane petlje. Uopšteno, antitela sadrže šest hipervarijabilnih regiona; tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). Nekoliko definicija hipervarijabilnog regiona je u upotrebi i uključeno u ovaj dokument. Regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) prema Kabatu zasnivaju se na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (videti, npr., Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Nasuprot tome, numerisanje prema sistemu Chothia odnosi se na položaj strukturnih petlji (videti, npr., Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Kraj petlje CDR-H1 prema sistemu numerisanja Chothia, kada se izvrši numerisanje upotrebom Kabatove konvencije o numerisanju varira između H32 i H34 u zavisnosti od dužine petlje (ovo je zbog toga što šema numerisanja prema Kabatu postavlja insercije na H35A i H35B; ako ni 35A ni 35B nije prisutna, petlja se završava na 32; ako je samo 35A prisutna, petlja se završava na 33; ako su prisutne i 35A i 35B, petlja se završava na 34). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između CDRs prema Kabatu i strukturnih petlji prema Chothia, i koristi ih softver za modelovanje antitela Oxford Molecular's AbM (videti, npr., Martin, u Antibody Engineering, Vol. 2, Chapter 3, Springer Verlag). "Kontaktni" hipervarijabilni regioni se zasnivaju na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Rezidue svakog od ovih hipervarijabilnih regiona ili CDRs navedene su u nastavku teksta.

[0124] Nedavno je razvijen i široko prihvaćen univerzalni sistem numerisanja, ImMunoGeneTics (IMGT) Information System<®>(Lafranc et al., Dev. Comp. Immunol.27(1):55-77 (2003)). IMGT je integrisani informacioni sistem specijalizovan za imunoglobuline (IG), T-ćelijske receptore (TR) i glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) čoveka i drugih kičmenjaka. Ovde, CDRs se pominju u smislu aminokiselinske sekvence, kao i lokacije u lakom ili teškom lancu. Budući da je "lokacija" CDRs unutar strukture varijabilnog domena imunoglobulina konzervativna među vrstama i nalazi se u strukturama koje se nazivaju petlje, upotrebom sistema numeracije koji poravnavaju sekvence varijabilnog domena prema strukturnim svojstvima, rezidue koje pripadaju CDR i okvirnim regionima se lako identifikuju. Ova informacija može da se koristi pri graftovanju i zameni CDR rezidua iz imunoglobulina jedne vrste u akceptorski okvirni region, obično, humanog antitela. Dodatni sistem numerisanja (AHon) razvili su Honegger i Plückthun, J. Mol. Biol. 309: 657-670 (2001). Odnos između sistema numerisanja, uključujući, na primer, Kabatov sistem numerisanja i jedinstveni sistem numerisanja IMGT, dobro je poznat stručnjaku u ovoj oblasti (videti, npr., Kabat, iznad; Chothia and Lesk, iznad; Martin, iznad; Lefranc et al., iznad) i takođe je ilustrovan na slikama 1-3. Ilustrativni primer sistema, koji je ovde prikazan, kombinuje sisteme Kabat i Chothia.

[0125] Hipervarijabilni regioni mogu da sadrže sledeće "produžene hipervarijabilne regione": 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL i 26-35 ili 26-35A (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102, ili 95-102 (H3) u VH. Kako se ovde koriste, pojmovi "HVR" i "CDR" predstavljaju sinonime.

[0126] Pojam "konstantni region" ili "konstantni domen" odnosi se na karboksi-terminalni deo lakog i teškog lanca koji nije direktno uključen u vezivanje antitela za antigen, ali ispoljava različite efektorske funkcije, kao što je interakcija sa Fc receptorom. Pojmovi se odnose na deo imunoglobulinskog molekula koji ima konzervativniju aminokiselinsku sekvencu u odnosu na drugi deo imunoglobulina, varijabilni region, koji sadrži antigen-vezujuće mesto. Konstantni region može da sadrži CH1, CH2 i CH3 regione teškog lanca i CL region lakog lanca.

[0127] Rezidue "okvirnog regiona" ili "FR" su one rezidue varijabilnog regiona koje oivičavaju CDRs. FR rezidue su prisutne, na primer, u himernim, humanizovanim, humanim, domenskim antitelima, diatelima, linearnim antitelima, i bispecifičnim antitelima. FR rezidue su one rezidue varijabilnog domena različite od rezidua hipervarijabilnog regiona ili CDR rezidua.

[0128] Antitelo "sazrelog afiniteta" je ono sa jednom ili više izmena (npr., varijacija aminokiselinske sekvence, uključujući promene, adicije i/ili delecije) u jednom ili više njihovih HVRs koje rezultuju poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa parentalnim antitelom koje nema ovu/ove izmene. Poželjna antitela sazrelog imuniteta imaće nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljni antigen. Antitela sazrelog imuniteta proizvode se pomoću postupaka poznatih u stanju tehnike. Za pregled, videti Hudson and Souriau, Nature Medicine

4

9 :129-134 (2003); Hoogenboom, Nature Biotechnol. 23 : 1105-1116 (2005); Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4 : 39-51 (2010).

[0129] "Blokirajuće" antitelo ili "antagonističko" antitelo je ono koje inhibira ili redukuje biološku aktivnost antigena za koji se vezuje. Na primer, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela mogu suštinski ili potpuno da inhibiraju biološku aktivnost antigena.

[0130] "Agonističko antitelo" je antitelo koje pokreće odgovor, npr., ono koje oponaša najmanje jednu od funkcionalnih aktivnosti polipeptida od interesa (npr., FGF19 ili FGF21). Agonističko antitelo uključuje antitelo koje je mimetik liganda, na primer, pri čemu se ligand vezuje za receptor ćelijske površine i vezivanje indukuje ćelijski prenos signala ili aktivnosti preko međućelijskog signalnog puta i gde antitelo indukuje sličnu ćelijsku signalizaciju ili aktivaciju.

[0131] "Agonist" beta-kloto odnosi se na molekul koji može da aktivira ili drugačije poveća jednu ili više bioloških aktivnosti beta-kloto, na primer u ćeliji koja eksprimira beta-kloto i FGF receptor. Antitelo pronalaska može, na primer, da deluje aktiviranjem ili drugačijim povećanjem aktivacije i/ili puteva ćelijske signalizacije ćelije koja eksprimira beta-kloto protein i FGF receptor, povećavajući tako biološku aktivnost ćelije posredovanu beta-kloto proteinom u odnosu na biološku aktivnost posredovanu beta-kloto proteinom u odsustvu agonista. Antitela pronalaska su agonistička anti-beta-kloto antitela, koja uključuju antitela koja indukuju prenos signala sličan onom putem FGF19 i/ili prenos signala sličan onom putem FGF21.

[0132] "Afinitet vezivanja" uopšteno se odnosi se na jačinu zbira svih nekovalentnih interakcija između jednog vezujućeg mesta u molekulu (npr., vezujućem proteinu kao što je antitelo) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Osim ako nije drugačije navedeno, kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" odnosi se na intrinzički afinitet vezivanja koji odslikava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr., antitelo i antigen). Afinitet vezujućeg molekula X prema njegovom vezujućem partneru Y može uopšteno da se predstavi konstantom disocijacije (KD). Afinitet može da se meri uobičajenim postupcima poznatim u stanju tehnike, uključujući one koji su opisani u ovom dokumentu. Antitela niskog afiniteta uopšteno vezuju antigen polako i imaju sklonost ka lakoj disocijaciji, dok antitela visokog afiniteta uopšteno vezuju antigen brže i imaju sklonost da duže ostanu vezana. Različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja su poznati u stanju tehnike, od kojih bilo koji može da se koristi u svrhu predmetnog otkrića. Specifični ilustrativni primeri izvođenja uključuju sledeće. U jednom primeru izvođenja, "KD" ili "KDvrednost" može da se meri testovima poznatim u stanju tehnike, na primer testom vezivanja. KDmože da se meri u testu vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA), na primer, izvedenom sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena (Chen, et al., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). KDili KDvrednost može takođe da se meri upotrebom testa rezonancije površinskog plazmona Biacore, upotrebom, na primer, BIAcoreTM-2000 ili BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), ili pomoću interferometrije bioplasta upotrebom, na primer, sistema OctetQK384 (ForteBio, Menlo Park, CA). "Brzina direktne reakcije" ili "brzina vezivanja" ili "brzina asocijacije" ili "kon" može takođe da se odredi istim tehnikama rezonancije površinskog plazmona ili interferometrije bioplasta opisanim gore, upotrebom, na primer, sistema BIAcoreTM-2000 ili BIAcoreTM-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ), ili OctetQK384 (ForteBio, Menlo Park, CA).

[0133] Izraz "suštinski sličan" ili "suštinski isti" označava dovoljno visok stepen sličnosti između dve numeričke vrednosti (npr., jedne povezane sa antitelom predmetnog otkrića i druge povezane sa referentnim antitelom), takav, da bi stručnjak u oblasti smatrao da je razlika između dve vrednosti od male ili nikakve biološke i/ili statističke značajnosti u kontekstu biološke karakteristike merene tim vrednostima (npr., KDvrednosti). Na primer, razlika između dve vrednosti može da bude manja od oko 50%, manja od oko 40%, manja od oko 30%, manja od oko 20%, manja od oko 10%, manja od oko 5%, vrednosti koju ima referentno antitelo.

[0134] Izraz "suštinski redukovan", ili "suštinski različit", kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen razlike između dve numeričke vrednosti (npr., jedne povezane sa antitelom predmetnog otkrića i druge povezane sa referentnim antitelom), takav, da bi stručnjak u oblasti smatrao da je razlika između dve vrednosti statistički značajna u kontekstu biološke karakteristike merene tim vrednostima. Na primer, razlika između navedene dve vrednosti može da bude poželjno veća od oko 10%, veća od oko 20%, veća od oko 30%, veća od oko 40%, veća od oko 50% vrednosti koju ima referentno antitelo.

[0135] "Efektorske funkcije" antitela odnose se na one biološke aktivnosti koje mogu da se povežu sa Fc regionom (npr., Fc regionom nativne sekvence ili Fc region sa izmenjenom aminokiselinskom sekvencom) antitela, i variraju sa izotipom antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i citotoksičnost zavisna od komplementa; vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC); fagocitoza; nishodna regulacija receptora ćelijske površine (npr., B-ćelijski receptor); i B-ćelijska aktivacija.

[0136] Pojam "Fc region" se ovde koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina, uključujući, na primer, Fc regione nativne sekvence, rekombinantne Fc regione, i varijante Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da variraju, Fc region teškog lanca humanog IgG često je definisan tako da se pruža od aminokiselinske rezidue na poziciji Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksi-terminalnog kraja. C-terminalni lizin (rezidua 447 prema sistemu numerisanja EU) Fc regiona može da bude uklonjena, na primer, tokom proizvodnje ili prečišćavanja antitela, ili rekombinantnim konstruisanjem nukleinske kiseline koja kodira teški lanac antitela. Prema tome, kompozicija intaktnog antitela može da sadrži populacije antitela sa uklonjenim svim K447 reziduama, populacije antitela bez uklonjenih K447 rezidua, i populacije antitela koje predstavljaju smešu antitela sa i bez K447 rezidua.

[0137] "Funkcionalni Fc region" ima "efektorsku funkciju" nativne sekvence Fc regiona. Primeri "efektorskih funkcija" uključuju vezivanje C1q; citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju receptora ćelijske površine (npr., B-ćelijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije uopšteno zahtevaju da Fc region bude kombinovan sa vezujućim regionom ili vezujućim domenom (npr., varijabilni region ili domen antitela) i mogu da se procene upotrebom različitih testova kao što je opisano.

[0138] "Fc region nativne sekvence" sadrži aminokiselinsku sekvencu identičnu sa aminokiselinskom sekvencom Fc regiona nađenog u prirodi, i kojom čovek nije manipulisao, modifikovao je, i/ili menjao (npr., izolovao, prečišćavao, selektovao, uključivao ili kombinovao sa drugim sekvencama, kao što su sekvence varijabilnog regiona). Humani Fc regioni nativne sekvence uključuju Fc region nativne sekvence humanog IgG1 (ne-A i A alotipova); Fc region humanog IgG2 nativne sekvence; Fc region humanog IgG3 nativne sekvence; i Fc region humanog IgG4 nativne sekvence, kao i njihove prirodne varijante.

[0139] "Varijanta Fc regiona" sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od nativne sekvence Fc regiona po najmanje jednoj aminokiselinskoj modifikaciji, (npr., supstituciji, adiciji, ili deleciji) poželjno po jednoj ili više aminokiselinskih supstitucija. Poželjno, varijanta Fc regiona ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa nativnom sekvencom Fc regiona ili sa Fc regionom parentalnog polipeptida, na primer, od oko jedne do oko deset aminokiselinskih supstitucija, i poželjno od oko jedne do oko pet aminokiselinskih supstitucija u nativnoj sekvenci Fc regiona ili u Fc regionu parentalnog polipeptida. Varijanta Fc regiona u ovom dokumentu će poželjno imati najmanje oko 80% homologije sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom parentalnog polipeptida, i poželjnije najmanje oko 90% homologije sa njima, na primer, najmanje oko 95% homologije sa njima. Na primer, varijanta sa dve aminokiselinske izmene u alanin na dve pozicije u Fc sekvenci humanog IgG1 prikazane su podebljane u aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u nastavku:

Takva varijanta sekvence može da se koristi u konstruktima humanizovanog teškog lanca kao što je prikazano ispod za humanizovani 5H23-vH3 (videti, npr., primer 7) označen kao 5H23(vH3)-hIgG1 (E233A)(L235A) kao što je dato ispod; aminokiseline koje čine signalnu sekvencu su podvučene, a sekvenca varijabilnog regiona je podebljana:

[0140] "Konstantni region lakog lanca" uključuje kapa i lambda konstantne regione. Primer kapa konstantnog regiona dat je ispod:

Takva sekvenca kapa konstantnog regiona može da se koristi u konstruktima humanizovanog lakog lanca kao što je prikazano ispod za humanizovani 5H23-vL2 (videti, npr., primer 7) kao što je dato ispod; aminokiseline koje čine signalnu sekvencu su podvučene, a sekvenca varijabilnog regiona je podebljana:

[0141] Pojam "varijanta", kada se koristi u vezi sa beta-kloto ili sa anti-beta-kloto antitelom može da se odnosi na peptid ili polipeptid koji sadrži jedan ili više (kao što je, na primer, oko 1 do oko 25, oko 1 do oko 20, oko 1 do oko 15, oko 1 do oko 10, ili oko 1 do oko 5) supstitucije, delecije, i/ili adicije aminokiselinske sekvence u poređenju sa nativnom ili nemodifikovanom sekvencom beta-kloto. Na primer, varijanta beta-kloto može da rezultuje iz jedne ili više (kao što je, na primer, oko 1 do oko 25, oko 1 do oko 20, oko 1 do oko 15, oko 1 do oko 10, ili oko 1 do oko 5) promena u aminokiselinskoj sekvenci nativnog beta-kloto. Takođe, kao primer, varijanta anti-beta-kloto antitela može da rezultuje iz jedne ili više (kao što je, na primer, oko 1 do oko 25, oko 1 do oko 20, oko 1 do oko 15, oko 1 do oko 10, ili oko 1 do oko 5) promena u aminokiselinskoj sekvenci nativnog ili prethodno nemodifikovanog anti-beta-kloto antitela. Varijante mogu da budu prirodne, kao što su alelne ili varijante nastale splajsovanjem, ili mogu da budu veštački konstruisane. Polipeptidne varijante mogu da se pripreme iz odgovarajućih molekula nukleinske kiseline koja kodira varijante. Kao što je ovde opisano, varijanta beta-kloto ili varijanta anti-beta-kloto antitela zadržava najmanje funkcionalnu aktivnost beta-kloto ili antibeta-kloto antitela, redom. Kao što je ovde opisano, varijanta anti-beta-kloto antitela vezuje betakloto i/ili ima antagonističko delovanje na aktivnost beta-kloto. Kao što je ovde opisano, varijanta anti-beta-kloto antitela vezuje beta-kloto i/ili ima agonističko delovanje na aktivnost beta-kloto. Kao što je ovde opisano, varijanta je kodirana varijantom polimorfizma jednog nukleotida (SNP) molekula nukleinske kiseline koja kodira beta-kloto ili regione ili podregione VH ili VL anti-beta-kloto antitela, kao što su jedan ili više CDRs.

[0142] Pojam "vektor" odnosi se na supstancu koja se korist da nosi ili uključuje sekvence nukleinske kiseline, uključujući na primer, u cilju uvođenja sekvence nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina. Vektori primenljivi za upotrebu uključuju, na primer, ekspresione vektore, plazmide, fagne vektore, virusne vektore, epizome i veštačke hromozome, koji mogu da uključuju odabrane sekvence ili funkcionalne markere za stabilnu integraciju u hromozom ćelijedomaćina. Dodatno, vektori mogu da uključuju jedan ili više gena za selektabilne markere i odgovarajuće sekvence za kontrolu ekspresije. Geni za selektabilne markere koji mogu da budu uključeni, na primer, obezbeđuju otpornost na antibiotike ili toksine, nadoknađuju nedostatke auksotrofnog tipa, ili obezbeđuju esencijalne hranljive materije kojih nema u medijumu za kulturu. Sekvence za kontrolu ekspresije mogu da uključuju konstitutivne i inducibilne promotore, pojačivače transkripcije, transkripcione terminatore, i slično, dobro poznate u stanju tehnike. Kada dva ili više molekula nukleinske kiseline treba da se ko-eksprimiraju (npr. i teški i laki lanac antitela ili VH i VL antitela) oba molekula nukleinske kiseline mogu da budu insertovana, na primer, u jedan ekspresioni vektor ili u odvojene ekspresione vektore. Za ekspresiju u jednom vektoru, kodirajuće nukleinske kiseline mogu opciono da budu vezane za jednu zajedničku sekvencu za kontrolu ekspresije ili za različite sekvence za kontrolu ekspresije, kao što su jedan inducibilni promotor i jedan konstitutivni promotor. Uvođenje molekula nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina može da se potvrdi upotrebom postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike. Takvi postupci uključuju, na primer, analizu nukleinske kiseline kao što je Northern blot ili umnožavanje iRNK lančanom reakcijom polimeraze (PCR), ili imunobloting za ekspresiju genskih proizvoda, ili druge pogodne analitičke metode za ispitivanje ekspresije introdukovane sekvence nukleinske kiseline ili odgovarajućeg genskog proizvoda. Stručnjaci u ovoj oblasti znaju da se molekuli nukleinske kiseline eksprimiraju u dovoljnoj količini da proizvedu željeni proizvod (npr. anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano), i dalje je jasno da nivoi ekspresije mogu da budu optimizovani tako da se dobije dovoljna ekspresija upotrebom postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike.

[0143] "Ćelijski-posredovana citotoksičnost zavisna od antitela" ili "ADCC" odnosi se na oblik citotoksičnosti kod koga se izlučeno Ig vezuje za Fc receptore (FcRs) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr., ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) omogućavajući ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i zatim ubiju ciljnu ćeliju citotoksinima. Antitela "naoružavaju" citotoksične ćelije i apsolutno su neophodna za takvo ubijanje. Primarne ćelije koje posreduju ADCC, NK ćelije, ekspimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. Poznata je ekspresija FcR na hematopoeznim ćelijama (videti, npr., tabelu 3, strana 464, Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)). Da bi se procenila ADCC aktivnost molekula od interesa, može da se sprovede in vitro ADCC test, (videti, npr., SAD patent br. 5,500,362 ili 5,821,337). Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može da se proceni in vivo, na primer, u životinjskom modelu (videti, npr., Clynes et al. (USA) 95:652-656 (1998)). Za upotrebu mogu da se odaberu antitela sa malo ili nimalo ADCC aktivnosti.

[0144] "Fc receptor" ili "FcR" opisuje receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je nativna sekvenca humanog FcR. Osim toga, poželjni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (npr., gama receptor) i uključuje receptore potklasa FcγRI, FcγRII i FcγRIII, uključujući alelne varijante i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA ("aktivirajući receptor") i FcγRIIB ("inhibirajući receptor"), koji imaju slične aminokiselinske sekvence koje se primarno razlikuju po svojim citoplazmatskim domenima (videti, npr., pregled Daëron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs su poznati (videti, npr., Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); i de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)). Drugi FcRs, uključujući one koji će se identifikovati u budućnosti, obuhvaćeni su pojmom "FcR" u ovom dokumentu. Pojam takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prelazak majčinih IgGs u fetus (videti, npr., Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcRs su opisane (videti, npr., u WO 2000/42072; SAD patenti br. 7,183,387, 7,332,581 i 7.335,742; Shields et al. J. Biol. Chem.9(2):6591-6604 (2001)).

[0145] "Citotoksičnost zavisna od komplementa" ili "CDC" odnosi se na lizu ciljne ćelije u prisustvu komplementa. Aktivacija klasičnog puta komplementa pokreće se vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za antitela (odgovarajuće potklase) koja su vezana za svoj srodni antigen. Za procenu aktivacije komplementa može da se izvede CDC test, (videti, npr., Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)). Polipeptidne varijante sa izmenjenom aminokiselinskom sekvencom Fc regiona (polipeptidi sa varijantom Fc regiona) i povećanom ili sniženom sposobnošću vezivanja C1q su opisane, (videti, npr., SAD patent br. 6,194,551, WO 1999/51642, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)). Za upotrebu mogu da se selektuju antitela sa malo ili nimalo CDC aktivnosti.

[0146] "Vanćelijski domen" ili "ECD" beta-kloto polipeptida odnosi se na oblik polipeptida betakloto koji je suštinski bez transmembranskih i citoplazmatskih domena. Na primer, ECD polipeptida beta-kloto može da ima manje od 1% takvog transmembranskog i/ili citoplazmatskog domena i poželjno, može da ima manje od 0.5% takvih domena. Pojam "identičnost" se odnosi na odnos između sekvenci dva ili više polipeptidnih molekula ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, određeno poravnanjem i poređenjem sekvenci. "Procenat identičnosti" označava procenat identičnih rezidua između aminokiselina ili nukleotida u upoređenim molekulima i izračunava se na osnovu veličine najmanjeg od molekula koji se porede. Za ova izračunavanja, praznine u poravnanjima (ako ih ima) moraju da se obrade određenim matematičkim modelom ili kompjuterskim programom (npr., "algoritmom"). Metode koje mogu da se koriste za izračunavanje identičnosti poravnatih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one koje su opisane u Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), (1988)

1

New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. i Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; i Carillo et al., (1988) SIAM J. Applied Math.48:1073.

[0147] Pri izračunavanju procenta identičnosti, sekvence koje se porede mogu da budu poravnate na način koji daje najveće poklapanje između sekvenci. Kompjuterski program koji može da se koristi za određivanje procenta identičnosti je programski paket GCG, koji uključuje GAP (Devereux et al., (1984) Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.). Kompjuterski algoritam GAP se koristi za poravnanje dva polipeptida ili polinukleotida za koja treba da se odredi procenat identičnosti sekvence. Sekvence mogu da se poravnaju za optimalno poklapanje njihovih aminokiselina ili nukleotida ("podudarni raspon", prema rezultatima određenim pomoću algoritma). U kombinaciji sa algoritmom koristi se penal za prazninu (koji se izračunava kao 3 puta prosečna dijagonala, pri čemu je "prosečna dijagonala" prosek dijagonale matrice za poređenje koja se koristi; "dijagonala" je skor ili broj pripisan svakom tačnom poklapanju aminokiselina prema konkretnoj matrici za poređenje) i penal za dužinu praznine (koji je obično 1/10 penala za prazninu), kao i matrice za poređenje kao što su PAM 250 ili BLOSUM 62. U određenim primerima izvođenja, algoritam koristi i standardnu matricu za poređenje (videti, Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 za matricu za poređenje PAM 250; Henikoff et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:10915-10919 za matricu za poređenje BLOSUM 62).

[0148] Ilustrativni parametri za određivanje procenta identičnosti za polipeptidne ili nukleotidne sekvence upotrebom GAP programa su sledeći: (i) Algoritam: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; (ii) Matrica za poređenje: BLOSUM 62 autora Henikoff et al., 1992, iznad; (iii) Penal za prazninu: 12 (ali bez penala za krajnje praznine) (iv) Penal za dužinu praznine: 4; i (v) Prag sličnosti: 0.

[0149] Određene šeme poravnanja za poravnanje aminokiselinskih sekvenci mogu da rezultuju poklapanjem samo kratkog regiona dve sekvence, i ovaj mali poravnati region može da ima veoma visoku identičnost sekvence čak i ako nema značajne povezanosti između dve sekvence cele dužine. Prema tome, odabrani metod poravnanja (npr., GAP program) može po želji da se prilagodi da bi se postiglo poravnanje koje obuhvata brojne aminokiseline, na primer, najmanje 50 susednih aminokiselina ciljnog polipeptida.

2

[0150] "Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence" u odnosu na referentnu polipeptidnu sekvencu definisan je kao procenat aminokiselinskih rezidua u sekvenci kandidatu koje su identične sa aminokiselinskim reziduama u sekvenci referentnog polipeptida, posle poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je neophodno, za postizanje maksimalnog procenta identičnosti sekvence, i ne smatrajući bilo kakve konzervativne supstitucije delom identičnosti sekvence. Poravnanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može da se ostvari na različite načine u okviru stanja tehnike, na primer, upotrebom javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnanje sekvenci, uključujući bilo koje algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnanja celom dužinom sekvenci koje se porede.

[0151] "Modifikacija" aminokiselinske rezidue/pozicije odnosi se na promenu primarne aminokiselinske sekvence u poređenju sa polaznom aminokiselinom sekvencom, pri čemu promena rezultuje iz izmene sekvence koja uključuje navedene aminokiselinske rezidue/pozicija. Na primer, tipične modifikacije uključuju supstituciju rezidue drugom aminokiselinom (npr., konzervativna ili nekonzervativna supstitucija), inserciju jedne ili više (npr., uopšteno manje od 5, 4 ili 3) aminokiselina do navedene rezidue/pozicije, i/ili deleciju navedene rezidue/pozicije.

[0152] "Epitop" je mesto na površini molekula antigena za koji se vezuje pojedinačni molekul antitela, odnosno lokalizovani region na površini antigena, kao što je polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto ili epitop beta-kloto, koji može da se veže za jedan ili više antigen vezujućih regiona antitela, i koji ima antigenu ili imunogenu aktivnost kod životinje, kao što je sisar (npr., čovek), koji može da izazove imuni odgovor. Epitop koji ima imunogenu aktivnost je deo polipeptida koji izaziva odgovor antitela kod životinje. Epitop koji ima antigenu aktivnost je deo polipeptida za koji se antitelo vezuje određeno bilo kojom metodom poznatom u stanju tehnike, uključujući, na primer, imunoesej. Antigeni epitopi ne moraju da budu imunogeni. Epitopi se često sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Pojam, "epitop" specifično uključuje linearne epitope i konformacione epitope. Region polipeptida koji doprinosi epitopu mogu da čine kontinuirane aminokiseline polipeptida ili epitop može da se sastavi od dva ili više nekontinuiranih regiona polipeptida. Epitop može, ili ne mora da bude trodimenzionalna površinska struktura antigena. Epitop beta-kloto može da bude trodimenzionalna površinska struktura polipeptida beta-kloto. Alternativno, epitop beta-kloto može da bude linearna struktura polipeptida beta-kloto. Uopšteno, antigen ima nekoliko ili više različitih epitopa i može da reaguje sa mnogim različitim antitelima.

[0153] Antitelo vezuje "epitop" ili "suštinski isti epitop" ili "isti epitop" kao referentno antitelo, kada dva antitela prepoznaju identične, preklapajuće ili susedne epitope u trodimenzionalnom prostoru. Najčešće korišćene i brze metode za određivanje da li se dva antitela vezuju za identične, preklapajuće ili susedne epitope u trodimenzionalnom prostoru su testovi kompeticije, koji mogu da budu konfigurisani u brojnim različitim formatima, na primer, upotrebom ili obeleženog antigena ili obeleženog antitela. U nekim testovima, antigen je imobilizovan na ploči sa 96 bunarčića, ili eksprimiran na površini ćelije, i sposobnost neobeleženog antitela da blokira vezivanje obeleženog antitela meri se upotrebom radioaktivnih, fluorescentnih ili enzimskih oznaka.

[0154] "Mapiranje epitopa" je postupak identifikovanja mesta za koja se antitela vezuju, ili epitopa, na njihovim ciljnim antigenima. Epitopi koje prepoznaju antitela mogu da budu linearni epitopi ili konformacioni epitopi. Linearne epitope formira kontinuirana sekvenca aminokiselina u proteinu. Konformacioni epitopi su formirani od aminokiselina koje nisu kontinuirane u proteinskoj sekvenci, ali koje dolaze u međusobnu blizinu nakon što se protein savije u svoju trodimenzionalnu strukturu. Indukovani epitopi se formiraju kada je trodimenzionalna struktura proteina u izmenjenoj konformaciji, na primer posle aktivacije ili vezivanja drugog proteina ili liganda (npr., vezivanje beta-kloto za FCF receptor kao što su FGRFR1c, FGFR2c, FGFR3c, ili FGFR4c.

[0155] "Epitop-specifično sortiranje" je postupak grupisanja antitela na osnovu epitopa koje prepoznaju. Konkretnije, epitop-specifično sortiranje obuhvata postupke i sisteme za razlikovanje svojstava prepoznavanja epitopa različitih antitela, upotrebom testova kompeticije u kombinaciji sa kompjuterskim postupcima za razvrstavane antitela u klastere na osnovu njihovih svojstava prepoznavanja epitopa i identifikovanja antitela koja imaju različite specifičnosti vezivanja.

[0156] "Beta-kloto-posredovana bolest" i "beta-kloto-posredovani poremećaj" i "beta-klotoposredovano stanje" koriste se kao sinonimi i odnose na bilo koju bolest, poremećaj ili stanje koje je potpuno ili delimično izazvano, ili je rezultat beta-kloto ili interakcije beta-kloto sa FGF receptorima kao što su FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, ili FGFR4 i/ili alternativno bilo koju bolest, poremećaj, ili stanje u kome je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju.

[0157] Pojam "terapijski efikasna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu agensa (npr., ovde opisano antitelo ili bilo koji drugi ovde opisani agens) koja je dovoljna da smanji i/ili

4

ublaži ozbiljnost i/ili trajanje date bolesti, poremećaja ili stanja, i/ili simptoma povezanog sa njima. Terapijski efikasna količina agensa, uključujući terapijski agens, može da bude količina neophodna za (i) smanjenje ili ublažavanje napredovanja ili progresije date bolesti, poremećaja, ili stanja, (ii) smanjenje ili ublažavanje recidiva, razvoja ili početka date bolesti, poremećaja, ili stanja, i/ili (iii) poboljšanje ili pojačanje profilaktičkog ili terapijskog efekta druge terapije (npr., terapije drugačije od davanja ovde opisanog antitela). "Terapijski efikasna količina" supstance/molekula/agensa predmetnog otkriće (npr., anti-beta-kloto antitelo) može da varira sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol, i težina osobe, i sposobnost supstance/molekula/agensa, da izazovu željeni odgovor kod osobe. Terapijski efikasna količina obuhvata količinu kod koje terapijski korisna dejstva prevazilaze bilo kakva toksična ili štetna dejstva supstance/molekul/agensa. Pojam "terapijski efikasna količina" odnosi se na količinu antitela ili drugih agenasa (npr., ili leka) koja je efikasna za "lečenje" bolesti, poremećaja, ili stanja, kod subjekta ili sisara.

[0158] "Efikasna količina" je uopšteno količina dovoljna da smanji ozbiljnost i/ili učestalost simptoma, eliminiše simptome i/ili skriveni uzrok, spreči pojavu simptoma i/ili njihovog skrivenog uzroka, i/ili poboljša ili sanira oštećenje koje rezultuje iz, ili je povezano sa bolešću, poremećajem, ili stanje, uključujući, na primer, dijabetes, gojaznost, dislipidemiju, kardiovaskularnu bolest, metabolički sindrom ili uopšteno bilo koju bolest, poremećaj, ili stanje kod koga je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju. U nekim primerima izvođenja, efikasna količina je terapijski efikasna količina ili profilaktički efikasna količina. "Terapijski efikasna količina" je količina dovoljna za lečenje bolesti, poremećaja, ili stanja (npr., dijabetesa tipa 2, gojaznosti, dislipidemije, NASH, kardiovaskularne bolesti, metaboličkog sindroma ili uopšteno bilo koje bolesti, poremećaja, ili stanja kod koga je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju) ili simptoma, posebno bolesti, poremećaja, ili stanja, ili simptoma povezanih sa takvom bolešću, poremećajem, ili stanjem, ili drugačije sprečavanje, ometanje, usporavanje ili preokretanje progresije bolesti, poremećaja, ili stanja, ili bilo kog drugog nepoželjnog simptoma povezanog sa takvom bolešću, poremećajem, ili stanjem, na bilo koji način. "Profilaktički efikasna količina" je količina farmaceutske kompozicije koja će, kada se primeni kod subjekta, imati predviđeno profilaktičko dejstvo, npr., sprečavanje ili odlaganje početka (ili ponovnog javljanja) dijabetesa, gojaznosti ili dislipidemije, ili smanjenje verovatnoće početka (ili ponovnog javljanja) bolesti, poremećaja, ili stanja ili povezanog/povezanih simptoma, uključujući, na primer, dijabetes, gojaznost, dislipidemiju, kardiovaskularnu bolest, metabolički sindrom ili uopšteno bilo koju bolest, poremećaj, ili stanje kod koga je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju) ili povezane simptome. Potpuno terapijsko ili profilaktičko dejstvo ne javlja se neophodno pri primeni jedne doze, i može da se javi tek posle primene serije doza. Prema tome, terapijski ili profilaktički efikasna količina može da se primeni u jednoj ili više primena.

[0159] "Profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu efikasnu, u dozama i tokom neophodnih perioda vremena, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, ali ne neophodno, budući da se profilaktička doza koristi kod subjekata pre ili u ranom stadijumu bolesti, poremećaja, ili stanja, profilaktički efikasna količina može da bude manja od terapijski efikasne količine.

[0160] "Hronična" primena odnosi se na primenu agensa/agenasa na kontinuirani način (npr., tokom vremenskog perioda kao što su dani, nedelje, meseci ili godine) nasuprot akutnom načinu, tako da se održi inicijalno terapijsko dejstvo (aktivnost) tokom produženog vremenskog perioda. "Naizmenična" primena je lečenje koje se ne primenjuje uzastopno bez prekida, već je ciklične prirode.

[0161] Primena "u kombinaciji sa" jednim ili više dodatnih terapijskih agenasa uključuje istovremenu (npr., paralelnu) i uzastopnu primenu bilo kojim redom. Pojam "u kombinaciji" u kontekstu primene drugih terapija (npr., drugih agenasa) uključuje upotrebu više od jedne terapije (npr., jednog agensa). Upotreba pojma "u kombinaciji" ne ograničava redosled kojim se terapije daju subjektu. Prva terapija (npr., agens) može da se primeni pre (npr., 1 minut, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 5 časova, 6 časova, 7 časova, 8 časova, 12 časova, 24 časa, 48 časova, 72 časa, 96 časova, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 8 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, ili 12 nedelja), istovremeno, ili posle (npr., 1 minut, 15 minuta, 30 minuta, 45 minuta, 1 čas, 2 časa, 3 časa, 4 časa, 5 časova, 6 časova, 7 časova, 8 časova, 12 časova, 24 časa, 48 časova, 72 časa, 96 časova, 1 nedelju, 2 nedelje, 3 nedelje, 4 nedelje, 5 nedelja, 6 nedelja, 7 nedelja, 8 nedelja, 9 nedelja, 10 nedelja, 11 nedelja, ili 12 nedelja) primene druge terapije (npr., agensa) kod subjekta koji je imao, ima, ili je podložan beta-kloto-posredovanoj bolesti.

[0162] Bilo koja dodatna terapija (npr., agens) može da se primeni bilo kojim redosledom sa drugim dodatnim terapijama (npr., agensima). U određenim primerima izvođenja, antitela mogu da se primene u kombinaciji sa jednom ili više terapija kao što su agensi (npr., terapije, uključujući agense, koje nisu antitela koja se trenutno primenjuju) za sprečavanje, lečenje, kontrolu, i/ili ublažavanje beta-kloto-posredovane bolesti. Neograničavajući primeri terapija (npr., agenasa) koji mogu da se primene u kombinaciji sa antitelom uključuju, na primer, analgetike, anestetike, antibiotike, ili imunomodulatorne agense ili bilo koji drugi agens naveden u SAD farmakopeji i/ili Lekarskom priručniku (PDR). Primeri agenasa koji su korisni u kombinovanoj terapiji uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: nesteroidne antiinflamatorne lekove (NSAID) kao što su aspirin, ibuprofen, i drugi derivati propionske kiseline (alminoprofen, benoksaprofen, bukloksična kiselina, karprofen, fenbufen, fenoprofen, fluprofen, flurbiprofen, indoprofen, ketoprofen, miroprofen, naproksen, oksaprozin, pirprofen, pranoprofen, suprofen, tiaprofenska kiselina i tioksaprofen), derivate sirćetne kiseline (indometacin, acemetacin, alklofenak, klidanak, diklofenak, fenklofenak, fenklozinska kiselina, fentiazak, fuirofenak, ibufenak, izoksepak, okspinak, sulindak, tiopinak, tolmetin, zidometacin, i zomepirak), derivate fenaminske kiseline (flufenaminska kiselina, meklofenaminjks kiselina, mefenaminska kiselina, nifluminska kiselina i tolfenaminska kiselina), derivate bifenilkarboksilne kiseline (diflunisal i flufenisal), oksikame (izoksikam, piroksikam, sudokdikam i tenoksikan), salicilate (acetil salicilnu kiselinu, sulfasalazin) i pirazolone (apazon, bezpiperilon, feprazon, mofebutazon, oksifenbutazon, fenilbutazon). Druge kombinacije uključuju inhibitore ciklooksigenaze-2 (COX-2). Drugi agensi za kombinaciju uključuju steroide kao što su prednizolon, prednizon, metilprednizolon, betametazon, deksametazon, ili hidrokortizon. Takva kombinacija može da bude posebno pogodna, budući da jedno ili više sporednih dejstava steroida može da bude redukovano ili čak eliminisano postepenim smanjivanjem potrebne doze steroida kada se pacijenti leče u kombinaciji sa predmetnim antitelima. Dodatni primeri agenasa za kombinacije uključuju antiinflamatorni lek/lekove koji suprimiraju citokine (CSAIDs); antitela protiv, ili antagoniste drugih humanih citokina ili faktora rasta, na primer, TNF, LT, IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF, ili PDGF. Kombinacije agenasa mogu da uključuju TNF antagoniste kao što su himerna, humanizovana ili humana TNF antitela, REMICADE, fragmente anti-TNF antitela (npr., CDP870), i rastvorljive receptore TNF, p55 ili p75, njihove derivate, p75TNFRIgG (ENBREL<®>) ili p55TNFR1gG (LENERCEPT<®>), rastvorljivi receptor IL-13 (sIL-13), i takođe inhibitore TNFα-konvertujućeg enzima (TACE); slično, inhibitori IL-1 (npr., inhibitori interleukin-1-konvertujućeg enzima) mogu da budu efikasni. Druge kombinacije uključuju interleukin 11, anti-P7s i glikoproteinski ligand pselektina (PSGL). Drugi primeri agenasa koji su korisni u kombinovanoj terapiji uključuju interferon-β1a (AVONEX); interferon-β1b (BETASERON<®>); kopakson; hiperbarični kiseonik; intravenski imunoglobulin; klabribin; i antitela protiv, ili antagoniste drugih humanih citokina ili faktora rasta (npr., antitela protiv liganda CD40 i CD80).

[0163] "Nosači", kako se ovde koriste, uključuju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense, ili stabilizatore koji su netoksični za ćeliju ili sisara koji su im izloženi u upotrebljenim dozama i koncentracijama. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni rastvor koji je pH puferisan. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat, i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu; niskomolekulske ((npr., manje od oko 10 aminokiselinskih rezidua) polipeptide; proteine, kao što su serumski albumin, želatin, ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što su polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujući glukozu, manozu, ili dekstrine; helirajuće agense kao što su EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; protiv-jone koji formiraju soli kao što je natrijum; i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN™, polietilen glikol (PEG), i PLURONICS™. Pojam "nosač" može takođe da se odnosi na razblaživač, adjuvans (npr., Freund-ov adjuvans (kompletni ili nekompletni)), ekscipijens, ili vehikulum sa kojim se terapeutik primenjuje. Takvi nosači, uključujući farmaceutske nosače, mogu da budu sterilne tečnosti, kao što su voda i ulja, uključujući ona naftnog, životinjskog, biljnog ili sintetskog porekla, kao što su ulje kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Voda je primer nosača kada se kompozicija (npr., farmaceutska kompozicija) primenjuje intravenski. Slani rastvori i vodena dekstroza i rastvori glicerola mogu takođe da se koriste kao tečni nosači, naročito za injektabilne rastvore. Pogodni ekscipijensi (npr., farmaceutski ekscipijensi) uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatin, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, obrano mleko u prahu, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol i slično. Kompozicija, po želji, može takođe da sadrži manje količine agenasa za kvašenje ili emulgovanje, ili pH-puferišuće agense. Kompozicije mogu da imaju oblik rastvora, suspenzija, emulzija, tableta, pilula, kapsula, prahova, formulacija sa produženim oslobađanjem i slično. Oralne kompozicije, uključujući formulacije, mogu da uključuju standardne nosače kao što su manitol, laktoza, skrob, magnezijum stearat, natrijum saharin, celulozu, magnezijum karbonat farmaceutske čistoće, itd. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača opisani su u Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA. Kompozicije, uključujući farmaceutska jedinjenja, mogu da sadrže profilaktički ili terapijski efikasnu količinu anti-betakloto antitela, na primer, u izolovanom ili prečišćenom obliku, zajedno sa pogodnom količinom nosača kako bi se obezbedio oblik koji je odgovarajući za primenu kod subjekta (npr., pacijenta). Formulacija bi trebalo da odgovara načinu primene.

[0164] Pojam "farmaceutski prihvatljiv", kako se ovde koristi, znači odobren od strane regulatorne agencije savezne ili državne vlade, ili naveden u SAD farmakopeji, evropskoj farmakopeji ili drugim opšte priznatim farmakopejama za primenu kod životinja, i konkretnije ljudi.

[0165] Pojam "farmaceutska formulacija" odnosi se na preparat koji je u takvom obliku da omogućava da biološka aktivnost aktivnog sastojka (npr., anti-beta-kloto antitelo) bude efikasna, i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekat kome bi formulacija bila data. Takva formulacija može da bude sterilna.

[0166] "Sterilna" formulacija je aseptična ili bez bilo kakvih živih mikroorganizama i njihovih spora.

[0167] "Poliklonska antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na populaciju antitela generisanu u imunogenom odgovoru na protein koji ima više epitopa i prema tome uključuje mnoštvo različitih antitela usmerenih na isti i na različite epitope unutar proteina. Postupci za proizvodnju poliklonskih antitela su poznati u stanju tehnike (Videti, npr., poglavlje 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel et al., eds., John Wiley i Sons, New York).

[0168] "Izolovana nukleinska kiselina" je nukleinska kiselina, na primer, RNK, DNK, ili mešani polimer, koji je suštinski razdvojen od drugih genomskih DNK sekvenci kao i od proteina ili kompleksa kao što su ribozomi i polimeraze, koje prirodno prate nativnu sekvencu. "Izolovani" molekul nukleinske kiseline je onaj koji je razdvojen od drugih molekula nukleinske kiseline koji su prisutni u prirodnom izvoru molekula nukleinske kiseline. Osim toga, "izolovani" molekul nukleinske kiseline, kao što je cDNK molekul, može da bude suštinski bez ćelijskog materijala, ili medijuma za kulturu kada je proizveden rekombinantnim tehnikama, ili suštinski bez hemijskih prekursora ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisan. U specifičnom primeru izvođenja, jedan ili više molekula nukleinske kiseline koja kodira antitelo kao što je ovde opisano su izolovani ili prečišćeni. Pojam obuhvata sekvence nukleinske kiseline koje su uklonjene iz njihovog prirodnog okruženja, i uključuje rekombinantne ili klonirane DNK izolate i hemijski sintetisane analoge ili biološki sintetisane analoge u heterologim sistemima. Suštinski čist molekul može da uključuje izolovane oblike molekula.

[0169] "Polinukleotid" ili "nukleinska kiselina", koji se ovde koriste kao sinonimi, odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i uključuju DNK i RNK. Nukleotidi mogu da budu deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze, i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji može da bude ugrađen u polimer pomoću DNK ili RNK polimeraze ili sintetskom reakcijom. Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. "Oligonukleotid", kako se ovde koristi, uopšteno se odnosi na kratke, uglavnom jednolančane, uglavnom sintetske polinukleotide koji su uglavnom, ali ne neophodno, kraći od oko 200 nukleotida. Pojmovi "oligonukleotid" i "polinukleotid" nisu međusobno isključivi. Gornji opis polinukleotida je jednako i potpuno primenjiv na oligonukleotide. Ćelija koja proizvodi anti-beta-kloto antitelo predmetnog otkrića može da uključuje parentalnu ćeliju hibridoma, kao i bakterijske i eukariotske ćelije-domaćine u koje je nukleinska kiselina koja kodira antitela introdukovana. Pogodne ćelije-domaćini su opisane u nastavku teksta.

[0170] Osim ako nije drugačije navedeno, levi kraj bilo koje ovde opisane jednolančane polinukleotidne sekvence je 5' kraj; smer ulevo dvolančane polinukleotidne sekvence označen je kao 5' smer. Smer dodavanja nascentnih RNK transkripata od 5' ka 3' označen je kao smer transkripcije; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koji su 5' u odnosu na 5' kraj RNK transkripta, označeni su kao "ushodne sekvence"; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK transkript koji su 3' u odnosu na 3' kraj RNK transkripta označeni su kao "nishodne sekvence".

[0171] Pojam "uložak u pakovanju" koristi se da označi uputstvo koje je obično uključeno u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, koje sadrži informaciju o indikacijama, upotrebi, dozi, primeni, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvih terapijskih proizvoda.

[0172] Pojmovi "sprečiti", "sprečavanje" i "prevencija", odnose se na ukupnu ili delimičnu inhibiciju razvoja, recidiva, pojave ili širenja beta-kloto-posredovane bolesti i/ili simptoma povezanog sa njom, koja rezultuje iz primene terapije ili kombinovane terapije kao što je ovde dato (npr., kombinacija profilaktičkih ili terapijskih agenasa, kao što je ovde obezbeđeno antitelo).

[0173] Pojam "profilaktički agens" odnosi se na bilo koji agens koji može potpuno ili delimično da inhibira razvoj, recidiv, pojavu ili širenje beta-kloto-posredovane bolesti i/ili simptoma povezanog sa njom. U određenim primerima izvođenja, pojam "profilaktički agens" odnosi se na anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano. U određenim drugim primerima izvođenja, pojam "profilaktički agens" odnosi se na agens drugačiji od anti-beta-kloto antitela kao što je ovde opisano. U određenim primerima izvođenja, profilaktički agens je agens za koji je poznato da je koristan ili je korišćen ili se trenutno koristi za sprečavanje beta-kloto-posredovane bolesti, poremećaja, ili stanja, i/ili simptoma povezanog sa njima ili sprečavanje pojave, razvoja, progresije i/ili ozbiljnosti beta-kloto-posredovane bolesti, poremećaja, ili stanja, i/ili simptoma povezanog sa njima. U specifičnim primerima izvođenja, profilaktički agens je humanizovano anti-beta-kloto antitelo, kao što je humanizovano anti-beta-kloto monoklonsko antitelo.

[0174] U određenim primerima izvođenja, "profilaktički efikasan serumski titar", je serumski titar kod subjekta, poželjno čoveka, koji potpuno ili delimično inhibira razvoj, recidiv, pojavu ili širenje beta-kloto-posredovane bolesti, poremećaja, ili stanja, i/ili simptoma povezanog sa njima kod subjekta.

[0175] U određenim primerima izvođenja, "terapijski efikasan serumski titar" je serumski titar kod subjekta, poželjno čoveka, koji smanjuje ozbiljnost, trajanje i/ili simptome udružene sa betakloto-posredovanom bolešću, poremećajem, ili stanjem, kod subjekta.

[0176] Pojam "rekombinantno antitelo" odnosi se na antitelo koje je pripremljeno, eksprimirano, stvoreno ili izolovano na rekombinantan način. Rekombinantna antitela mogu da budu antitela eksprimirana upotrebom rekombinantnog ekspresionog vektora transfekovanog u ćelijudomaćina, antitela izolovana iz rekombinanta, kombinatorijalne biblioteke antitela, antitela izolovana iz životinje (npr., miša ili krave) koja je transgena i/ili transhromozomalna za humane imunoglobulinske gene (videti, npr., Taylor, L. D. et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna antitela mogu da imaju varijabilne i konstantne regione, uključujući koji potiču iz imunoglobulinskih sekvenci humane klicine linije (videti Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Kao što je ovde opisano, međutim, takva rekombinantna antitela mogu da budu podvrgnuta in vitro mutagenezi (ili, kada se koristi životinja koja je transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatska mutageneza) i prema tome, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako poreklom od i povezane sa VH i VL sekvencama humane klicine linije, ne moraju prirodno da postoje u repertoaru antitela humane klicine linije in vivo.

[0177] Pojam "serumski titar" odnosi se prosečan serumski titar kod subjekta iz više izvora (npr., prisutan u jednom trenutku ili u više vremenskih tačaka) ili u populaciji od najmanje 10, kao što je najmanje 20, ili najmanje 40 subjekata, do oko 100, 1000 ili više.

[0178] Pojam "sporedna dejstva" obuhvata neželjena i/ili štetna dejstva terapije (npr., profilaktičkog ili terapijskog agensa). Neželjena dejstva nisu nužno štetna. Štetno dejstvo terapije (npr., profilaktičkog ili terapijskog agensa) može da bude štetno ili neprijatno ili rizično. Primeri sporednih dejstava uključuju, dijareju, kašalj, gastroenteritis, teško disanje, mučninu, povraćanje, anoreksiju, stomačne grčeve, groznicu, bol, gubitak telesne težine, dehidrataciju, alopeciju, dispenju, nesanicu, vrtoglavicu, mukozitis, dejstva na nerve i mišiće, zamor, suvoću usta, i gubitak apetita, osip ili otok na mestu primene, simptome slične gripu kao što je groznica, drhtanje i zamor, problemi sa digestivnim traktom i alergijske reakcije. Dodatna neželjena dejstva koja su pacijenti doživeli su brojna i poznata u stanju tehnike. Mnoga od njih opisana su u Lekarskom priručniku (68. izd., 2014.).

1

[0179] Pojmovi "subjekat" i "pacijent" mogu da se koriste kao sinonimi. Kako se ovde koristi, u određenim primerima izvođenja, subjekat je sisar, kao što su ne-primati (npr., krave, svinje, konji, mačke, psi, pacovi, itd.) ili primati (npr., majmun i čovek). U specifičnim primerima izvođenja, subjekat je čovek. U jednom primeru izvođenja, subjekat je sisar (npr., čovek) koji ima beta-kloto-posredovanu bolest, poremećaj ili stanje. U još jednom primeru izvođenja, subjekat je sisar (npr., čovek) u riziku od razvoja beta-kloto-posredovane bolesti, poremećaja, ili stanja.

[0180] "Suštinski sav" odnosi se na odnosi se na najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, ili oko 100%.

[0181] Pojam "terapijski agens" odnosi se na bilo koji agens koji može da se koristi za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja, uključujući za lečenje, prevenciju ili ublažavanje jednog ili više simptoma beta-kloto-posredovane bolesti, poremećaja, ili stanja i/ili simptoma povezanog sa njima. Terapijski agens odnosi se na anti-beta-kloto antitelo pronalaska. Terapijski agens može takođe da se odnosi na agens drugačiji od ovde obezbeđenog antitela. Terapijski agens može da bude agens za koji je poznato da je koristan za, ili je bio korišćen ili se trenutno koristi za lečenje, prevenciju ili ublažavanje jednog ili više simptoma beta-klotoposredovane bolesti, poremećaja, ili stanja, ili simptoma povezanog sa njima.

[0182] Kombinovane terapije (npr., upotreba agenasa, uključujući terapijske agense) mogu da budu efikasnije nego zbir dejstva bilo koje dve ili više pojedinačnih terapija (npr., sinergističko dejstvo). Sinergističko dejstvo je neočekivano i ne može da se predvidi. Na primer, sinergističko dejstvo kombinacije terapijskih agenasa omogućava upotrebu nižih doza jednog ili više agenasa i/ili manje učestalu primenu agenasa kod subjekta sa beta-kloto-posredovanom bolešću. Mogućnost da se koriste niže doze terapija i/ili da se terapije ređe primenjuju smanjuje toksičnost povezanu sa primenom terapija kod subjekta bez smanjenja efikasnosti terapija u prevenciji, lečenju ili ublažavanju jednog ili više simptoma beta-kloto-posredovane bolesti. Pored toga, sinergističko dejstvo može da dovede do poboljšane efikasnosti terapija u prevenciji, lečenju ili ublažavanju jednog ili više simptoma beta-kloto-posredovane bolesti. Najzad, zahvaljujući sinergističkom dejstvu kombinovanih terapija (npr., terapijski agensi) moguće je izbeći ili smanjiti štetna ili neželjena sporedna dejstva povezana sa upotrebom bilo koje pojedinačne terapije.

[0183] Pojam "terapija" odnosi se na bilo koji protokol, metod i/ili agens koji može da se koristi u prevenciji, kontrolisanju, lečenju i/ili ublažavanju beta-kloto-posredovane bolesti, poremećaja, ili stanja. U određenim primerima izvođenja, pojmovi "terapije" i "terapija" odnose se na

2

biološku terapiju, suportivnu terapiju, i/ili druge terapije korisne u prevenciji, kontrolisanju, lečenju i/ili ublažavanju beta-kloto-posredovane bolesti, poremećaja, ili stanja, poznate stručnjaku u ovoj oblasti, kao što je medicinsko osoblje.

[0184] Pojam "detektabilna proba" odnosi se na kompoziciju koja obezbeđuje detektabilni signal. Pojam uključuje, bez ograničenja, bilo koji fluorofor, hromofor, radioaktivnu oznaku, enzim, antitelo ili fragment antitela, i slično, koji obezbeđuje detektabilni signal putem svoje aktivnosti.

[0185] Pojam "dijagnostički agens" odnosi se na supstancu datu subjektu koja pomaže u dijagnostikovanju bolesti, poremećaja, ili stanja. Takve supstance mogu da se koriste za otkrivanje, određivanje, i/ili definisanje lokalizacije procesa koji izaziva bolest. Dijagnostički agens je supstanca koja je konjugovana sa anti-beta-kloto antitelom pronalaska, koja kada se primeni kod subjekta ili dovede u kontakt sa uzorkom uzetim od subjekta pomaže u dijagnostikovanju beta-kloto-posredovane bolesti.

[0186] Pojam "detektabilni agens" odnosi se na supstancu koja može da se koristi za utvrđivanje postojanja ili prisustva željenog molekula, kao što je anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano, u uzorku ili kod subjekta. Detektabilni agens može da bude supstanca koja može da se vizualizuje ili supstanca koja može da se odredi i/ili meri na drugi način (npr., kvantifikovanjem).

[0187] Pojam "kodira" ili njegovi gramatički ekvivalenti, kako se koristi u vezi sa molekulom nukleinske kiseline, odnosi se na molekul nukleinske kiseline u njegovom nativnom stanju ili kojim je manipulisano postupcima dobro poznatim stručnjacima u ovoj oblasti koji može da bude transkribovan da bi proizveo iRNK, koja se zatim translatira u polipeptid i/ili njegov fragment. Antisens lanac je komplement takvog molekula nukleinske kiseline, i kodirajuća sekvenca može da bude izvedena iz njega.

[0188] Pojam "ekscipijens" odnosi se na inertnu supstancu koja se obično koristi kao razblaživač, vehikulum, konzervans, vezivno sredstvo, ili stabilizator, i uključuje, ali nije ograničen na proteine (npr., serumski albumin, itd.), aminokiseline (npr., asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, lizin, arginin, glicin, histidin, itd.), masne kiseline i fosfolipide (npr., alkil sulfonate, kaprilat, itd.), surfaktante (npr., SDS, polisorbat, nejonski surfaktant, itd.), saharide (npr., saharozu, maltozu, trehalozu, itd.) i poliole (npr., manitol, sorbitol, itd.). Videti, takođe, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

[0189] U kontekstu peptida ili polipeptida, pojam "fragment", kako se ovde koristi, odnosi se na peptid ili polipeptid koji sadrži manje od cele dužine aminokiselinske sekvence. Takav fragment može da nastane, na primer, skraćivanjem amino-terminalnog kraja, skraćivanjem na karboksiterminalnom kraju, i/ili internom delecijom rezidue/rezidua iz aminokiselinske sekvence. Fragmenti mogu, na primer, da rezultuju iz alternativnog splajsinga RNK ili iz in vivo proteazne aktivnosti. Kao što je ovde opisano fragmenti beta-kloto uključuju polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu najmanje 5 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 10 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 15 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 20 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 25 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 40 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 50 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 60 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 70 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 80 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 90 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 100 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 125 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 150 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 175 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 200 susednih aminokiselinskih rezidua, najmanje 250, najmanje 300, najmanje 350, najmanje 400, najmanje 450, najmanje 500, najmanje 550, najmanje 600, najmanje 650, najmanje 700, najmanje 750, najmanje 800, najmanje 850, najmanje 900, ili najmanje 950, susednih aminokiselinskih rezidua aminokiselinske sekvence polipeptida beta-kloto ili antitela koji se vezuje za polipeptid beta-kloto. Kao što je ovde opisano, fragment polipeptida beta-kloto ili antitelo koji se vezuje za beta-kloto antigen zadržava najmanje 1, najmanje 2, ili najmanje 3 ili više funkcija polipeptida ili antitela.

[0190] Pojmovi "kontrolisati", "kontrolisanje" i "kontrola" odnose se na korisna dejstva koja subjekat ima od terapije (npr., profilaktički ili terapijski agens), koja ne rezultuju izlečenjem bolesti. Subjektu se daje jedna ili više terapija (npr., profilaktički ili terapijski agensi, kao što je ovde obezbeđeno antitelo) da bi se "kontrolisala" beta-kloto-posredovana bolest, jedan ili više njenih simptoma, kako bi se sprečila progresija ili pogoršanje bolesti.

[0191] Pojmovi "oko" ili "približno" znače u okviru 20%, u okviru 15%, u okviru 10%, u okviru 9%, u okviru 8%, u okviru 7%, u okviru 6%, u okviru 5%, u okviru 4%, u okviru 3%, u okviru 2%, u okviru ili 1% ili manje od date vrednosti ili opsega.

[0192] "Primeniti" ili "primena" se odnosi na čin injektovanja ili drugačije fizičke isporuke supstance kakva postoji van tela (npr., anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano) pacijentu, kao što je mukozna, intradermalna, intravenska, intramuskularna isporuka i/ili bilo koji drugi postupak za fizičku isporuku koji je opisan u ovom dokumentu ili poznat u stanju tehnike. Kada se bolest, poremećaj, ili stanje, ili njegov simptom leči, primena supstance tipično se odvija posle početka bolesti, poremećaja, ili stanja, ili njegovih simptoma. Kada se bolest, poremećaj, ili stanje ili njegovi simptomi, sprečavaju, primena supstance tipično se odvija pre početka bolesti, poremećaja, ili stanja, ili njegovih simptoma.

[0193] U kontekstu polipeptida, pojam "analog", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji ima sličnu ili identičnu funkciju kao polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto,

4

ili anti-beta-kloto antitelo, nema nužno sličnu ili identičnu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili anti-beta-kloto antitelo, ili ima sličnu ili identičnu strukturu polipeptida beta-kloto, fragmenta polipeptida beta-kloto, ili anti-beta-kloto antitela. Polipeptid koji ima sličnu aminokiselinsku sekvencu odnosi se na polipeptid koji zadovoljava najmanje jedno od sledećeg: (a) polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci polipeptida beta-kloto (npr., SEQ ID NO:297, fragmenta polipeptida beta-kloto, ili anti-beta-kloto antitela kao što je ovde opisano; (b) polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom koja hibridizuje pod strogim uslovima sa nukleotidnom sekvencom koja kodira polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili anti-beta-kloto antitelo (ili njihov VH ili VL region) kao što je ovde opisano od najmanje 5 aminokiselinskih rezidua, najmanje 10 aminokiselinskih rezidua, najmanje 15 aminokiselinskih rezidua, najmanje 20 aminokiselinskih rezidua, najmanje 25 aminokiselinskih rezidua, najmanje 40 aminokiselinskih rezidua, najmanje 50 aminokiselinskih rezidua, najmanje 60 aminokiselinskih rezidua, najmanje 70 aminokiselinskih rezidua, najmanje 80 aminokiselinskih rezidua, najmanje 90 aminokiselinskih rezidua, najmanje 100 aminokiselinskih rezidua, najmanje 125 aminokiselinskih rezidua, ili najmanje 150 aminokiselinskih rezidua (videti, npr., Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY); i (c) polipeptid je kodiran nukleotidnom sekvencom koja je najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identična nukleotidnoj sekvenci koja kodira polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili anti-beta-kloto antitelo (ili njihov VH ili VL region) kao što je ovde opisano. Polipeptid koji ima sličnu strukturu kao polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano odnosi se na polipeptid koji ima sličnu sekundarnu, tercijarnu ili kvaternarnu strukturu kao polipeptid beta-kloto, fragment betakloto, ili anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano. Struktura polipeptida može da se odredi metodama poznatim stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući, ali bez ograničenja, kristalografiju rendgenskim zracima, nuklearnu magnetnu rezonancu, i kristalografsku elektronsku mikroskopiju.

[0194] Pojam "kompozicija" namenjen je da obuhvati proizvod koji sadrži navedene sastojke (npr., antitelo koje je ovde opisano) u, opciono, navedenim količinama, kao i bilo koji proizvod koji rezultuje, direktno ili indirektno, iz kombinacije navedenih sastojaka u, opciono, navedenim količinama.

[0195] U kontekstu polipeptida, pojam "derivat", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu polipeptida beta-kloto, fragmenta polipeptida beta-kloto, ili antitela koje se vezuje za polipeptid beta-kloto koja je izmenjena uvođenjem supstitucija, delecija ili adicija aminokiselinskih rezidua. Pojam "derivat", kako se ovde koristi, takođe se odnosi se na polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili antitelo koje se vezuje za polipeptid beta-kloto koji je hemijski modifikovan, npr., kovalentnim vezivanjem bilo kog tipa molekula za polipeptid. Na primer, ali ne u smislu ograničenja, polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili beta-kloto antitelo može hemijski da se modifikuje, npr., glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem za ćelijski ligand ili drugi protein, itd. Derivati su modifikovani na način koji je drugačiji od prirodnih ili polaznih peptida ili polipeptida, bilo po vrsti ili lokaciji vezanog molekula. Derivati dalje uključuju deleciju jedne ili više hemijskih grupa koje su prirodno prisutne na peptidu ili polipeptidu. Derivat polipeptida beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili beta-kloto antitelo može da bude hemijski modifikovano hemijskim modifikacijama upotrebom tehnika poznatih stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući, ali bez ograničenja, specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formulaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Dalje, derivat polipeptida beta-kloto, fragmenta polipeptida beta-kloto, ili beta-kloto antitelo mogu da sadrže jednu ili više neklasičnih aminokiselina. Derivat polipeptida ima sličnu ili identičnu funkciju kao polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, ili beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano.

KOMPOZICIJE I POSTUPCI ZA NJIHOVU PRIPREMU

[0196] Opisani su vezujući proteini kao što su antitela koja se vezuju za beta-kloto (npr., betakloto čoveka ili cinomolgus majmuna). Antitela predmetnog otkrića su korisna, na primer, za dijagnostikovanje ili lečenje bolesti, poremećaja, ili stanja povezanih sa ekspresijom beta-kloto. U određenim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska su korisna za dijagnostikovanje ili lečenje bolesti, poremećaja, ili stanja kao što su dijabetes tipa 2, gojaznost, dislipidemija, NASH, kardiovaskularna bolest, metabolički sindrom ili uopšteno bilo koja bolest, poremećaj, ili stanje kod koga je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju.

[0197] U ovom dokumentu opisana su antitela koja se vezuju za polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, peptid beta-kloto, ili epitop beta-kloto. Anti-beta-kloto antitela se vezuju za vanćelijski domen (ECD) beta-kloto. Opisana su i antitela koja kompetitivno sprečavaju antibeta-kloto antitelo koje je ovde opisano da se veže za polipeptid beta-kloto. Ovde opisana antibeta-kloto antitela mogu takođe da budu konjugovana ili rekombinantno fuzionisana sa dijagnostičkim agensom, detektabilnim agensom ili terapijskim agensom. Pored toga, obezbeđene su i kompozicije koje sadrže beta-kloto antitelo pronalaska.

[0198] U ovom dokumentu obezbeđeni su i izolovani molekuli nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulinski teški lanac, laki lanac, VH region, VL region, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 anti-beta-kloto antitela koja se vezuju za polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, peptid beta-kloto ili epitop beta-kloto kao što je definisano u patentnim zahtevima. Dodatno su obezbeđeni i vektori i ćelije-domaćini koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira anti-beta-kloto antitela koja se vezuju za polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, peptid beta-kloto ili epitop beta-kloto kao što je definisano u patentnim zahtevima. Takođe su opisani i postupci za pravljenje antitela koja se vezuju za polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, peptid beta-kloto ili epitop betakloto.

[0199] Obezbeđeni su postupci za upotrebu anti-beta-kloto antitela pronalaska. Postupci uključuju lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja, uključujući lečenje, prevenciju ili ublažavanje jednog ili više simptoma bolesti, poremećaja ili stanja kod subjekta. Neograničavajući primeri bolesti, poremećaja, ili stanja uključuju poremećaje korišćenja glukoze i posledice bolesti povezane sa njima, uključujući dijabetes melitus (tip 1 i tip 2), gestacioni dijabetes, hiperglikemiju, insulinsku rezistanciju, abnormalni metabolizam glukoze, "predijabetes" (oštećena glukoza pri gladovanju (IFG) ili oštećena tolerancija na glukozu (IGT)), ili druge fiziološke poremećaje povezane sa, ili koji rezultuju iz, hiperglikemijskog stanja, uključujući, na primer, histopatološke promene kao što su uništavanje β-ćelija pankreasa. Na primer subjekti sa bolešću, poremećajima, ili stanjima, kojima je lečenje potrebno mogu da imaju nivo glukoze u plazmi pri gladovanju (FPG) veći od oko 100 mg/dl. Ostali poremećaji povezani sa hiperglikemijom uključuju oštećenje bubrega (npr., oštećenje tubula ili nefropatiju), degeneraciju jetre, oštećenje oka (npr., dijabetičku retinopatiju ili kataraktu), i poremećaje dijabetičkog stopala. Ostale bolesti, poremećaji, ili stanja uključuju dislipidemije i posledice bolesti kao što su, na primer, ateroskleroza, koronarna arterijska bolest, cerebrovaskularni poremećaji i slično, ili druge bolesti, poremećaje, ili stanja koja mogu da budu povezana sa metaboličkim sindromom, kao što su gojaznost i povećana telesna masa (uključujući stanja komorbiditeta kao što su, ali bez ograničenja, nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH) i sindrom policističnih jajnika (PCOS)), ili tromboze, hiperkoagultivna i protrombotična stanja (arterijska i venska), hipertenzija, kardiovaskularna bolest, moždani udar i srčana slabost. Ove bolesti, poremećaji, ili stanja uključuju aterosklerozu, hronične zapaljenske bolesti creva (npr., Kronova bolest i ulcerozni kolitis), astmu, eritemski lupus, artritis, ili druge zapaljenske reumatske poremećaje. Druge bolesti, poremećaji, ili stanja uključuju tumore adipoznih ćelija, lipomatozne karcinome uključujući, na primer, liposarkome, solidne tumore i neoplazme. Ostale bolesti, poremećaji, ili stanja uključuju neurodegenerativne bolesti i/ili demijelinizirajuće poremećaje centralnog i perifernog nervnog sistema i/ili neurološke bolesti koje uključuju neuroinflamatorne procese i/ili druge periferne neuropatije, uključujući Alchajmerovu bolest, multiplu sklerozu, Parkinsonovu bolest, progresivnu multifokalnu leukoencefalopatiju i Guillian-Barre-ov sindrom. Druge bolesti, poremećaji, ili stanja uključuju poremećaje kože i dermatološke poremećaje i/ili poremećaje procesa zarastanja rana, uključujući eritemato-skvamozne dermatoze. Druge bolesti, poremećaji, ili stanja uključuju sindrom X, osteoartritis, i akutni respiratorni distres sindrom. Kako se ovde koristi, pojam "hiperglikemijski" ili "hiperglikemija", kada se koristi u vezi sa bolešću, poremećajem, ili stanjem subjekta, odnosi se na prolazno ili hronično abnormalno visok nivo glukoze prisutan u krvi subjekta. Bolest, poremećaj, ili stanje može da bude uzrokovano kašnjenjem metabolizma glukoze ili apsorpcijom, tako da subjekat ispoljava netoleranciju na glukozu ili ima povišen nivo glukoze koji se obično ne javlja kod normalnih subjekata (npr., kod osoba sa predijabetesom netolerantnih na glukozu u riziku od razvoja dijabetesa, ili kod osoba sa dijabetesom). Na primer, nivoi glukoze u plazmi pri gladovanju (FPG) kod normoglikemije mogu da budu manji od oko 100 mg/dl, kod oštećenog metabolizma glukoze, između oko 100 i 126 mg/dl, a kod dijabetičara veći od oko 126 mg/dl. Metode prevencije (npr., kod subjekata sa predispozicijom za određeni poremećaj/poremećaje), povezane sa odlaganjem, usporavanjem ili inhibicijom progresije ili pojave, ili lečenjem (npr., ublažavanjem) gojaznosti ili nepoželjne telesne mase (npr., veći od normalnog indeksa telesne mase, ili "BMI" u odnosu na odgovarajući uporedni subjekat uporedivih godina, pola, rase, itd.). Metode lečenja gojaznosti ili nepoželjne telesne mase (uključujući stanja ko-morbiditeta gojaznosti, na primer, opstruktivnu apneu u snu, artritis, kancer (npr., dojke, endometrijuma, i debelog creva), kamen u žuči ili hiperglikemija, uključuju dovođenje u kontakt ili primenu vezujućeg proteina kao što je anti-beta-kloto antitelo kao što je ovde opisano u količini efikasnoj za lečenje gojaznosti ili nepoželjne telesne mase. Na primer, subjekat može da ima indeks telesne mase veći od 25, na primer, 25-30, 30-35, 35-40, ili veći od 40. Metod prevencije (npr., kod subjekata koji imaju predispoziciju za određeni poremećaj/poremećaje), odnosi se na odlaganje, usporavanje ili inhibiranje progresije ili pojave, ili lečenje nepoželjnih nivoa ili abnormalno povišeni serumski/plazmatski LDL, VLDL, trigliceride ili holesterol, od kojih svi, pojedinačno ili u kombinaciji, mogu da vode, na primer, formiranju plaka, sužavanju ili začepljenju krvnih sudova, i povećanom riziku od hipertenzije, moždanog udara i koronarne arterijske bolesti. Takve bolesti, poremećaji, ili stanja mogu da budu uzrokovane, na primer, genetskom predispozicijom ili načinom ishrane.

Anti-Beta-kloto Antitela

[0200] Predmetno otkriće obezbeđuje anti-beta-kloto antitela koja ovde mogu da nađu primenu kao terapijski agensi. Primeri antitela uključuju poliklonska, monoklonska, humanizovana, humana, bispecifična antitela i heterokonjugate antitela, kao i njihove varijante koje imaju poboljšani afinitet ili druga svojstva.

[0201] U ovom dokumentu obezbeđena su antitela kao što je definisano u patentnim zahtevima koja se vezuju za beta-kloto, uključujući polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, peptid beta-kloto ili epitop beta-kloto. U nekim primerima izvođenja anti-beta-kloto antitela su humanizovana antitela (npr., koja sadrže humane konstantne regione) koja vezuju beta-kloto, uključujući polipeptid beta-kloto, fragment polipeptida beta-kloto, peptid beta-kloto ili epitop beta-kloto.

[0202] Anti-beta-kloto antitelo sadrži VH region, VL region, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 kao što je definisano u patentnim zahtevima. Prema tome, izolovano antitelo ili njegov funkcionalni fragment obezbeđen u ovom dokumentu sadrži tri CDR regiona teškog lanca i tri CDR regiona lakog lanca iz antitela označenog kao 5H23 kao što je prikazano u tabeli 1.

[0203] Antitelo označeno kao 5H23 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:25 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:26.

[0204] Antitelo označeno kao 1C17 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:51 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:52.

[0205] Antitelo označeno kao 1D19 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:77 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:78.

[0206] Antitelo označeno kao 2L12 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:103 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:104.

[0207] Antitelo označeno kao 3L3 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:129 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:130.

[0208] Antitelo označeno kao 3N20 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:155 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:156.

[0209] Antitelo označeno kao 4P5 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:181 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:182.

[0210] Antitelo označeno kao 5C23 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:207 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:208.

[0211] Antitelo označeno kao 5F7 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:233 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:234.

[0212] Antitelo označeno kao IG19 sadrži VH sekvencu koja je SEQ ID NO:259 i VL sekvencu koja je SEQ ID NO:260.

[0213] Antitela kao što je ovde opisano mogu da sadrže VH region ili VH domen. Antitela kao što je ovde opisano mogu takođe da sadrže VL region ili VL lanac. Antitela kao što je ovde opisano mogu da imaju kombinaciju (i) VH domena ili VH regiona; i/ili (ii) VL domena ili VL regiona.

[0214] Antitelo kao što je ovde opisano sadrži ili se sastoji od šest CDR regiona, VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 identifikovanih u tabelama 2-10. Antitelo kao što je ovde opisano može da sadrži manje od šest CDRs. Kao što je ovde opisano antitelo može da sadrži ili da se sastoji od jednog, dva, tri, četiri ili pet CDR regiona odabranih iz grupe koja se sastoji od VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 identifikovanih u tabelama 1-10. Kao što je ovde opisano, antitelo može da sadrži ili da se sastoji od jednog, dva, tri, četiri ili pet CDR regiona odabranih iz grupe koja se sastoji od VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 mišjeg monoklonskog antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od: (a) antitela označenog kao 5H23; (b) antitela označenog kao 1C17; (c) antitela označenog kao 1D19; (d) antitela označenog kao 2L12; (e) antitela označenog kao 3L3; (f) antitela označenog kao 3N20; (g) antitela označenog kao 4P5; (h) antitela označenog kao 5C23; (i) antitela označenog kao 5F7; (j) antitela označenog kao 1G19 kao što je ovde opisano. Prema tome, antitelo kao što je ovde opisano može da sadrži ili da se sastoji od jednog, dva, tri, četiri ili pet CDR regiona bilo kog od VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2, i/ili VL CDR3 identifikovanih u tabelama 1-10.

[0215] Ovde opisana antitela sadrže jedan ili više (npr., jedan, dva ili tri) VH CDRs navedenih u tabelama 1-10. Ovde opisana antitela mogu takođe da sadrže jedan ili više (npr., jedan, dva ili tri) VL CDRs navedenih u tabelama 1-10. Ovde opisana antitela sadrže jedan ili više (npr., jedan, dva ili tri) VH CDRs navedenih u tabelama 1-10 i jedan ili više VL CDRs navedenih u tabelama 1-10. Prema tome, ovde opisana antitela mogu da sadrže VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122,131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252. Ovde opisana antitela mogu da sadrže VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258. Ovde opisana antitela mogu da sadrže VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254. Ovde opisana antitela mogu da sadrže VH CDR1 i/ili VH CDR2 i/ili VH CDR3 nezavisno odabran od VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3 kao što je prikazano u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci prikazanih u tabelama 1-10. Ovde opisana antitela mogu da sadrže VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255. Ovde opisana antitela mogu da sadrže VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256. Ovde opisana antitela mogu da sadrže VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257. Ovde opisana antitela mogu da sadrže VL CDR1 i/ili VL CDR2 i/ili VL CDR3 nezavisno odabran od VL CDR1, VL CDR2, VL CDR3 kao što je prikazano u bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci prikazanih u tabelama 1-10.

[0216] Ovde opisana antitela mogu da sadrže varijabilni (VH) region teškog lanca koji sadrži: (1) VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:1, 27, 53, 79, 105, 131, 157, 183, 209, i/ili 235, (ii) SEQ ID NO:7, 33, 59, 85, 111, 137, 163, 189, 215 ili 241, (iii) SEQ ID NO:12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220 ili 246, (iv) SEQ ID NO:13, 39, 65, 91, 117, 143, 169, 195, 221 ili 247, i (v) SEQ ID NO:18, 44, 70, 96, 122, 148, 174, 200, 226 ili 252; (2) VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:2, 28, 54, 80, 106, 132, 158, 184,210, i ili 236, (ii) SEQ ID NO:8, 34, 60, 86, 112, 138, 164, 190, 216 ili 242, (iii) SEQ ID NO:14, 40, 66, 92, 118, 144, 170, 196, 222 ili 248, (iv) SEQ ID NO:19, 45, 71, 97, 123, 149, 175, 201, 227 ili 253, i (v) SEQ ID NO:24, 50, 76, 102, 128, 154, 180, 206, 232 ili 258; i (3) VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO: 3, 29, 55, 81, 107, 133, 159, 185, 211, i ili 237, (ii) SEQ ID NO:9, 35, 61, 87, 113, 139, 165, 191, 217 ili 243, (iii) SEQ ID NO:15, 41, 67, 93, 119, 145, 171, 197, 223 ili 249, i (iv) SEQ ID NO:20, 46, 72, 98, 124, 150, 176, 202, 228 ili 254; i/ili varijabilni (VL) region lakog lanca koji sadrži: (1) VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:4, 30, 56, 82, 108, 134, 160, 186, 212, i ili 238, (ii) SEQ ID NO:10, 36, 52, 88, 114, 140, 166, 192, 218 ili 244, (iii) SEQ ID NO:16, 42, 68, 94, 120, 146, 172, 198, 224 ili 250, i (iv) SEQ ID NO:21, 47, 73, 99, 125, 151, 177, 203, 229 ili 255; (2) VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:5, 31, 57, 83, 109, 135, 161, 187, 213, i ili 239, (ii) SEQ ID NO:11, 37, 63, 89, 115, 141, 167, 193, 219 ili 245, i (iii) SEQ ID NO:22, 48, 74, 100, 126, 152, 178, 204, 230 ili 256; i (3) VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:6, 32, 58, 84, 110, 136, 162, 188, 214, i/ili 240, (ii) SEQ ID NO:17, 43, 69, 95, 121, 147, 173, 199, 225 ili 251, i (iii) SEQ ID NO:23, 49, 75, 101, 127, 153, 179, 205, 231 ili 257.

[0217] Ovde opisana antitela mogu da sadrže varijabilni (VH) region teškog lanca koji sadrži: (1) VH CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:1, 27, 53, 79, 105, 131, 157, 183, 209, i ili 235, (ii) SEQ ID NO:7, 33, 59, 85, 111, 137, 163, 189, 215 ili 241, (iii) SEQ ID NO:12, 38, 64, 90, 116, 142, 168, 194, 220 ili 246, (iv) SEQ ID NO:13, 39, 65, 91, 117, 143, 169, 195, 221 ili 247, i (v) SEQ ID NO:18, 44, 70, 96, 122, 148, 174, 200, 226 ili 252; (2) VH CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:2, 28, 54, 80, 106, 132, 158, 184, 210, i ili 236, (ii) SEQ ID NO:8, 34, 60, 86, 112, 138, 164, 190, 216 ili 242, (iii) SEQ ID NO:14, 40, 66, 92, 118, 144, 170, 196, 222 ili 248, (iv) SEQ ID NO:19, 45, 71, 97, 123, 149, 175, 201, 227 ili 253, i (v) SEQ ID NO:24, 50, 76, 102, 128, 154, 180, 206, 232 ili 258; i (3) VH CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO: 3, 29, 55, 81, 107, 133, 159, 185, 211, i/ili 237, (ii) SEQ ID NO:9, 35, 61, 87, 113, 139, 165, 191, 217 ili 243, (iii) SEQ ID NO:15, 41, 67, 93, 119, 145, 171, 197, 223 ili 249, i (iv) SEQ ID NO:20, 46, 72, 98, 124, 150, 176, 202, 228 ili 254.

[0218] Ovde opisana antitela mogu da sadrže varijabilni (VL) region lakog lanca koji sadrži: (1) VL CDR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:4, 30, 56, 82, 108, 134, 160, 186, 212, i ili 238, (ii) SEQ ID NO:10, 36, 52, 88, 114, 140, 166, 192, 218 ili 244, (iii) SEQ ID NO:16, 42, 68, 94, 120, 146, 172, 198, 224 ili 250, i (iv) SEQ ID NO:21, 47, 73, 99, 125, 151, 177, 203, 229 ili 255; (2) VL CDR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:5, 31, 57, 83, 109, 135, 161, 187, 213, i ili 239, (ii) SEQ ID NO:11, 37, 63, 89, 115, 141, 167, 193, 219 ili 245, i (iii) SEQ ID NO:22, 48, 74, 100, 126, 152, 178, 204, 230 ili 256; i (3) VL CDR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: (i) SEQ ID NO:6, 32, 58, 84, 110, 136, 162, 188, 214, i/ili 240, (ii) SEQ ID NO:17, 43, 69, 95, 121, 147, 173, 199, 225 ili 251, i (iii) SEQ ID NO:23, 49, 75, 101, 127, 153, 179, 205, 231 ili 257.

[0219] Ovde su opisana i antitela koja sadrže jedan ili više VH CDRs i jedan ili više (npr., jedan, dva ili tri) VL CDRs navedena u tabelama 1-10. Konkretno, ovde je opisano antitelo koje sadrži VH CDR1 (SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252.) i VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160,

11

166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255); VH CDR1 (SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252); VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VH CDR1 (SEQ ID NOS 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252) VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257) i VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258); VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258); i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255); VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258) i VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255); VH CDR1 (SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258) i VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR1 (SEQ ID NOS: : 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257);a VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255), VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232,

11

236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252.), VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137,142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5,11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186,

11

192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS: 1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR1 (SEQ ID NOS: 4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56,

11

62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS: 3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254) i VL CDR2 (SEQ ID NOS: 5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS: 2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232,

11

236, 242, 248, 253, i 258), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR3 (SEQ ID NOS: 6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145,

11

150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255); VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46,

12

55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255) i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256), i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR1 (SEQ ID NOS:1, 7, 12, 13, 18, 27, 33, 38, 39, 44, 53, 59, 64, 65, 70, 79, 85, 90, 91, 96, 105, 111, 116, 117, 122, 131, 137, 142, 143, 148, 157, 163, 168, 169, 174, 183, 189, 194, 195, 200, 209, 215, 220, 221, 226, 235, 241, 246, 247, i 252), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256), i VL CDR3 (SEQ ID NOS:6, 17, 23, 32, 43, 49, 58, 69, 75, 84, 95, 101, 110, 121, 127, 136, 147, 153, 162, 173, 179, 188, 199, 205, 214, 225, 231, 240, 251, i 257); VH CDR2 (SEQ ID NOS:2, 8, 14, 19, 24, 28, 34, 40, 45, 50, 54, 60, 66, 71, 76, 80, 86, 92, 97, 102, 106, 112, 118, 123, 128, 132, 138, 144, 149, 154, 158, 164, 170, 175, 180, 184, 190, 196, 201, 206, 210, 216, 222, 227, 232, 236, 242, 248, 253, i 258), VH CDR3 (SEQ ID NOS:3, 9, 15, 20, 29, 35, 41, 46, 55, 61, 67, 72, 81, 87, 93, 98, 107, 113, 119, 124, 133, 139, 145, 150, 159, 165, 171, 176, 185, 191, 197, 202, 211, 217, 223, 228, 237, 243, 249, i 254), VL CDR1 (SEQ ID NOS:4, 10, 16, 21, 30, 36, 42, 47, 56, 62, 68, 73, 82, 88, 94, 99, 108, 114, 120, 125, 134, 140, 146, 151, 160, 166, 172, 177, 186, 192, 198, 203, 212, 218, 224, 229, 238, 244, 250, i 255), VL CDR2 (SEQ ID NOS:5, 11, 22, 31, 37, 48, 57, 63, 74, 83, 89, 100, 109, 115, 126, 135, 141, 152, 161, 167, 178, 187, 193, 204, 213, 219, 230, 239, 245, i 256) ili bilo koju kombinaciju VH CDRs i VL CDRs navedenih u tabelama 1-10.

[0220] U još jednom aspektu, ovde opisani CDRs uključuju konsenzusne sekvence poreklom iz grupa srodnih antitela (videti, npr., tabele 1-10). Kao što je ovde opisano, "konsenzusna sekvenca" odnosi se na aminokiselinske sekvence koje imaju konzervativne aminokiseline uobičajene za brojne sekvence i varijabilne aminokiseline koje variraju unutar datih aminokiselinskih sekvenci. Obezbeđene konsenzusne sekvence CDR uključuju CDR regione koji odgovaraju CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i/ili CDRL3. Konsenzusne sekvence CDRs anti-beta-kloto antitela prikazane su na slici 2.

[0221] U određenim primerima izvođenja, antitelo predmetnog pronalaska sadrži VH region koji sadrži: (1) VH FR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 278, 279, 280 i 378; (2) VH FR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 281, 282, i 283; (3) VH FR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 284, 285, 286, 287 i 379-381; i/ili (4) VH FR4 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 288. Prema tome, u nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VH region koji uključuje VH FR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 278, 279, 280 i 378. U nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VH region koji uključuje VH FR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 281, 282, i 283. U nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VH region koji uključuje VH FR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 284, 285, 286, 287 i 379-381. U nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VH region koji uključuje VH FR4 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 288.

[0222] U određenim primerima izvođenja, antitelo predmetnog pronalaska sadrži VL region koji sadrži: (1) VL FR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 289, 290 i 382-384; (2) VL FR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 291, 292 i 385-392; (3) VL FR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 293, 294, 295 i 393-404; i/ili (4) VL FR4 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 296 i 405-407. Prema tome, u nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VL region koji uključuje VL FR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 289, 290 i 382-384. U nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VL region koji uključuje VL FR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 291, 292 i 385-392. U nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VL region koji uključuje VL FR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 293, 294, 295 i 393-404. U nekim aspektima, humanizovano antitelo sadrži VL region koji uključuje VL FR4 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 296 i 405-407.

[0223] U određenim primerima izvođenja, antitelo predmetnog pronalaska sadrži VH region i VL region, pri čemu VH region dodatno sadrži: (1) VH FR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 278, 279, 280 i 378; (2) VH FR2 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 281, 282, i 283; (3) VH FR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 284, 285, 286, 287 i 379-381; i/ili (4) VH FR4 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 288; i pri čemu VL region dodatno sadrži: (1) VL FR1 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 289, 290 i 382-384; (2) VL FR2 koji ima

12

aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 291, 292 i 385-392; (3) VL FR3 koji ima aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 293, 294, 295 i 393-404; i/ili (4) VL FR4 koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 296 i 405-407.

[0224] Ovde su obezbeđena i antitela koja sadrže jedan ili više (npr., jedan, dva, tri ili četiri) VH FRs i jedan ili više VL FRs navedenih u tabeli 19. Konkretno, ovde je obezbeđeno antitelo koje sadrži VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404);a VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407);a VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID

12

NO:288) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i

12

378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i

12

385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID

12

NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL

12

FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR4 (SEQ ID

1

NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID

1 1

NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404), i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1

1 2

(SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL

1

FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR3 (SEQ ID

1 4

NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR1 (SEQ ID NOS:278, 279, 280 i 378), VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); VH FR2 (SEQ ID NOS:281, 282, i 283), VH FR3 (SEQ ID NOS:284, 285, 286, 287 i 379-381), VH FR4 (SEQ ID NO:288), VL FR1 (SEQ ID NOS:289, 290 i 382-384), VL FR2 (SEQ ID NOS:291, 292 i 385-392), VL FR3 (SEQ ID NOS:293, 294, 295 i 393-404) i VL FR4 (SEQ ID NO:296 i 405-407); ili bilo koju njihovu kombinaciju od VH FRs (SEQ ID NOS: 278, 279, 280, 378, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 379-381 i 288) i VL FRs (SEQ ID NOS: 289, 290, 382-384, 291, 292, 385-392, 293, 294, 295, 393-404, 296, 405-407) navedenih u tabeli 19.

[0225] U još jednom aspektu, opisana su antitela koja kompetiraju sa jednim od ilustrativnih antitela ili funkcionalnih fragmenata za vezivanje za (i) beta-kloto ili (ii) kompleks koji sadrži beta-kloto i jedan od FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, i FGFR4. Takva antitela mogu takođe da se vežu za isti epitop kao i jedno od ovde ilustrovanih antitela, ili epitop koji se preklapa. Očekuje se da antitela i fragmenti koji kompetiraju sa, ili se vezuju za isti epitop kao ilustrativna antitela, pokazuju slična funkcionalna svojstva. Ilustrativni antigen-vezujući proteini i fragmenti uključuju one sa VH i VL regionima, i CDRs kao što je ovde opisano, uključujući one u tabelama 1-10. Prema tome, kao specifični primer, antitela koja su opisana uključuju ona koja kompetiraju sa antitelom koje sadrži: (a) 1, 2, 3, 4, 5 ili svih 6 od CDRs navedenih za antitelo

1

navedeno u tabelama 1-10; (b) VH i VL odabrane od VH i VL regiona navedenih za antitelo navedeno u tabelama 1-10, kao što je za antitelo 5H23 (tabela 1) ili (c) dva laka lanca i dva teška lanca koja sadrže VH i VL kako je naznačeno za antitelo navedeno u tabelama 1-10.

[0226] U još jednom aspektu, ovde su opisana antitela koja se vezuju za region, uključujući epitop, humanog beta-kloto ili beta-kloto cinomolgus majmuna. Na primer, ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za KLB2 domen humanog beta-kloto koji sadrži aminokiselinske rezidue 509 do 1044 iz SEQ ID NO:297. Kao drugi primer, ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za glikozil hidrolaza 1 region KLB2 domena humanog beta-kloto koji sadrži aminokiselinske rezidue 517 do 967 iz SEQ ID NO:297. Antitelo predmetnog pronalaska vezuje se za region humanog betakloto koji sadrži aminokiselinske rezidue 657 do 703 iz SEQ ID NO:297. Kao još jedan primer, ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za region beta-kloto cinomolgus majmuna koji sadrži aminokiselinske rezidue 657 do 703 iz SEQ ID NO:299.

[0227] U sledećem aspektu, ovde opisana antitela koja se vezuju za specifični epitop humanog beta-kloto. Na primer, ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto koji sadrži najmanje jednu od aminokiselinskih rezidua 657, 701 i/ili 703 humanog beta-kloto (SEQ ID NO: 297). Prema tome, ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto, pri čemu epitop humanog beta-kloto sadrži najmanje aminokiselinsku reziduu 657 iz SEQ ID NO: 297. Ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto, pri čemu epitop humanog beta-kloto sadrži najmanje aminokiselinsku reziduu 701 iz SEQ ID NO: 297. Ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto, pri čemu epitop humanog betakloto sadrži najmanje aminokiselinsku reziduu 703 iz SEQ ID NO: 297. Ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto, pri čemu epitop humanog beta-kloto sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 657 i 701 iz SEQ ID NO: 297. Ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto, pri čemu epitop humanog beta-kloto sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 657 i 703 iz SEQ ID NO: 297. Ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto, pri čemu epitop humanog beta-kloto sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 701 i 703 iz SEQ ID NO: 297. Ovde obezbeđeno antitelo vezuje se za epitop humanog beta-kloto, pri čemu epitop humanog beta-kloto sadrži najmanje aminokiselinske rezidue 657, 701 i 703 iz SEQ ID NO: 297. Takva antitela opisana iznad u tekstu mogu da indukuju prenos signala sličan onom putem FGF19 i/ili prenos signala sličan onom putem FGF21 u ćeliji koja eksprimira beta-kloto čoveka i FGF receptor. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano, humano ili himerno antitelo.

1. Poliklonska antitela

1

[0228] Antitela predmetnog otkrića mogu da sadrže poliklonska antitela. Postupci za pripremu poliklonskih antitela poznati su stručnjaku u ovoj oblasti. Poliklonska antitela mogu da nastanu u telu sisara, na primer, pomoću jedne ili više injekcija imunizujućeg agensa i, po želji, adjuvansa. Tipično, imunizujući agens i/ili adjuvans će biti injektovani u telo sisara višestrukim subkutanim ili intraperitonealnim injekcijama. Imunizujući agens može da uključuje polipeptid beta-kloto ili njegov fuzioni protein. Može da bude korisno konjugovati imunizujući agens za protein za koji se zna da je imunogen za sisara imunizovanog ili imunizovati sisara proteinom i jednim ili više adjuvanasa. Primeri takvih imunogenih proteina uključuju, ali nisu ograničeni na hemocijanin iz limfe puža, serumski albumin, goveđi tiroglobulin, i inhibitor tripsina soje. Primeri adjuvanasa koji mogu da se koriste uključuju Ribi, CpG, Poly 1C, Freund-ov kompletni adjuvans i MPL-TDM adjuvans (monofosforil Lipid A, sintetski trehalozaa dikorinomikolat). Protokol imunizacije može da izabere stručnjak u oblasti bez nepotrebnog eksperimentisanja. Može da se uzme krv od sisara, i da se serum ispita na titar beta-kloto antitela. Po želji, sisar može da prima buster doze dok titar antitela ne poraste ili dostigne plato. Prema tome ili alternativno, limfociti mogu da se dobiju od imunizovane životinje za fuziju i pripremu monoklonskih antitela iz hibridoma kao što je opisano u nastavku teksta.

2. Monoklonska antitela

[0229] Antitela predmetnog otkrića mogu alternativno da budu monoklonska antitela. Monoklonska antitela mogu da se naprave upotrebom metoda hibridoma koji je prvi opisao Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ili mogu da budu napravljena metodama rekombinantna DNK (videti, npr., SAD patent br.4,816,567).

[0230] U metodu hibridoma, miš ili druga odgovarajuća životinja-domaćin, kao što je hrčak, imunizuje se kao što je gore opisano da bi se podstakli limfocite koji proizvode ili mogu da proizvode antitela koja će se specifično vezati za protein upotrebljen za imunizaciju. Alternativno, limfociti mogu da budu imunizovani in vitro. Posle imunizacije, limfociti se izoluju, a zatim fuzionišu sa ćelijama mijeloma upotrebom pogodnih agenasa za fuzionisanje, kao što je polietilen glikol, za obrazovanje ćelija hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

[0231] Tako pripremljene ćelije hibridoma se zasejavaju i rastu u pogodnom medijumu za kulturu koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, parentalnih ćelija mijeloma (takođe označenih kao fuzioni partner). Na primer, ako parentalnim ćelijama mijeloma nedostaje enzim hipokaantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), selektivni medijum za kulturu za hibridome tipično će uključivati

1

hipoksantin, aminopterin i timidin (HAT medijum), gde ove supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija.

[0232] Poželjni fuzioni partner ćelija mijeloma je onaj koji efikasno fuzioniše, podržava stabilnu proizvodnju visokog nivoa antitela u selektovanim ćelijama koje proizvode antitelo, i osetljiv je na selektivni medijum koji selektivno deluje protiv nefuzionisanih parentalnih ćelija. Poželjne ćelijske linije mijeloma su mišje linije mijeloma, kao što su SP-2 i derivati, na primer, X63-Ag8-653 ćelije dostupne u Američkoj kolekciji tipova kultura, Manassas, Virginia, SAD i one koje potiču od MOPC-21 i MPC-11 tumora miša dostupne kod Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California SAD. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišje-humanog heteromijeloma takođe su opisane u proizvodnji humanih monoklonskih antitela (Kozbor, J., Immunol., 133:3001 (1984); i Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

[0233] Proizvodnja monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena ispituje se u medijumu za kulturu u kome ćelije hibridoma rastu. Specifičnost vezivanja monoklonskih antitela proizvedenih u ćelijama hibridoma određuje se imunoprecipitacijom ili in vitro testom vezivanja, kao što je radioimunoesej (RIA) ili enzimski-vezan imunosorbentni test (ELISA). Afinitet vezivanja monoklonskog antitela može, na primer, da se odredi pomoću Scatchard analize opisane kod Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0234] Kada se ćelije hibridoma koje proizvode antitela željene specifičnosti, afiniteta, i/ili aktivnosti identifikuju, klonovi mogu da budu subklonirani postupcima graničnog razblaženja i gajeni standardnim metodama (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Pogodni medijumi za kulturu za ovu svrhu uključuju, na primer, D-MEM ili RPMI-1640 medijum. Pored toga, ćelije hibridoma mogu da se gaje in vivo kao ascitni tumori u životinjama, na primer, putem i.p. injekcije ćelija u miševe.

[0235] Monoklonska antitela koja izlučuju subklonovi se pogodno izdvajaju iz medijuma za kulturu, ascitnih fluida, ili seruma uobičajenim procedurama za prečišćavanje antitela kao što su, na primer, afinitetna hromatografija (npr., upotrebom proteina A ili protein G-sefaroze) ili jonoizmenjivačkom hromatografijom, hidroksilapatitnom hromatografijom, gel elektroforezom, dijalizom, itd.

[0236] DNK koja kodira monoklonska antitela se lako izoluje i sekvencira upotrebom uobičajenih procedura (npr., upotrebom oligonukleotidnih proba koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teški i laki lanac mišjeg antitela). Ćelije hibridoma služe kao poželjan izvor takve DNK. Kada se izoluje, DNK može da se ubaci u ekspresione vektore, koji se zatim transfekuju u ćelije-domaćine kao što su ćelije E. coli , majmunske ćelije COS, ćelije jajnika

1

kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein antitela, da bi se dobila sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama-domaćinima. Pregledni članci o rekombinantnoj ekspresiji DNK koja kodira antitelo u bakterijama uključuju Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) i Plückthun, Immunol. Revs.130:151-188 (1992).

[0237] Kao što je ovde opisano, antitelo koje se vezuje za epitop beta-kloto sadrži aminokiselinsku sekvencu VH domena i/ili aminokiselinsku sekvencu VL domena kodiranu nukleotidnom sekvencom koja hibridizuje sa (1) komplementom nukleotidne sekvence koja kodira bilo koji od VH i/ili VL domena kao što je ovde opisano pod strogim uslovima (npr., hibridizacija sa DNK vezanom za filter u 6x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na oko 45° C praćena jednim ili većim brojem pranja u 0.2xSSC/0.1% SDS na oko 50-65° C) pod uslovima visoke strogosti (npr., hibridizacija sa nukleinskom kiselinom vezanom za filter u 6xSSC na oko 45° C praćena jednim ili većim brojem pranja u 0.1xSSC/0.2% SDS na oko 68° C), ili pod drugim strogim uslovima hibridizacije poznatim stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., New York na stranama 6.3.1-6.3.6 i 2.10.3).

[0238] Kao što je ovde opisano, antitelo koje vezuje epitop beta-kloto sadrži aminokiselinsku sekvencu VH CDR ili aminokiselinsku sekvencu VL CDR kodiranu nukleotidnom sekvencom koja hibridizuje sa komplementom nukleotidne sekvence koja kodira bilo koji od VH CDRs i/ili VL CDRs prikazanih u tabelama 1-10 pod strogim uslovima (npr., hibridizacija sa DNK vezanom za filter u 6X SSC na oko 45° C praćena jednim ili većim brojem pranja u 0.2X SSC/0.1% SDS na oko 50-65° C), pod uslovima visoke strogosti (npr., hibridizacija sa nukleinskom kiselinom vezanom za filter u 6X SSC na oko 45° C praćena jednim ili većim brojem pranja u 0.1X SSC/0.2% SDS na oko 68° C), ili pod drugim strogim uslovima hibridizacije poznatim stručnjacima u ovoj oblasti (videti, na primer, Ausubel, F.M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., New York na stranama 6.3.1-6.3.6 i 2.10.3)

[0239] Monoklonska antitela ili fragmenti antitela mogu da budu izolovani iz fagnih biblioteka antitela stvorenih upotrebom tehnika opisanih u, na primer, Antibody Phage Display: Methods and Protocols, P.M. O'Brien i R. Aitken, eds, Humana Press, Totawa N.J., 2002. U principu, klonovi sintetskog antitela se selektuju skriningom fagnih biblioteka koje sadrže fag koji ispoljava različite fragmente varijabilnog regiona (Fv) antitela fuzionisane za protein omotača faga. Takve fagne biblioteke se ispituju protiv željenog antigena. Klonovi koji eksprimiraju Fv fragmente sposobne da se vežu za željeni antigen adsorbuju se na antigen i tako razdvajaju od

1

klonova iz biblioteke koji se ne vezuju. Klonovi koji se vezuju se zatim eluiraju sa antigena, i mogu dalje da se obogate dodatnim ciklusima adsorpcije/elucije sa antigena.

[0240] Varijabilni domeni mogu funkcionalno da se ispolje na fagu, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti, u kojima su VH i VL kovalentno vezani preko kratkog, fleksibilnog peptida, ili kao Fab fragmenti, u kojim je svaki od njih fuzionisan sa konstantnim domenom i interaguje nekovalentno, kako je opisano, na primer, kod Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994).

[0241] Repertoari VH i VL gena mogu posebno da se kloniraju pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR) i rekombinuju nasumično u fagne biblioteke, u kojima zatim može da se obavi pretraga za antigen-vezujućim klonovima kao što je opisano kod Winter et al.,iznad. Biblioteke iz imunizovanih izvora obezbeđuju visokoafinitetna antitela na imunogen bez potrebe za konstruisanjem hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može da bude kloniran da bi se obezbedio pojedinačni izvor humanog antitela na širok opseg antigena koji nisu sopstveni, kao i sopstvenih antigena, bez ikakve imunizacije, kao što je opisano kod Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički kloniranjem nerearanžiranih V-genskih segmenata iz matičnih ćelija, i upotrebom prajmera za PCR koji sadrže nasumičnu sekvencu za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje rearanžmana in vitro kao što je opisano, na primer, kod Hoogenboom i Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

[0242] Pretraživanje biblioteka može da se ostvari različitim tehnikama poznatim u ovoj oblasti. Na primer, beta-kloto, (npr., polipeptid beta-kloto, fragment ili epitop) može da se koristi za oblaganje bunarčića adsorpcionih ploča, ekspresiju na ćelijama-domaćinima pričvršćenim za adsorpcione ploče ili da se upotrebi pri ćelijskom sortiranju, ili da se konjuguje sa biotinom za hvatanje pomoću perli obloženih streptavidinom, ili upotrebljen u bilo kom drugom postupku za selekciju prema afinitetu (panning-eng.) biblioteka prikaza. Selekcija antitela sa sporom kinetikom disocijacije (npr., dobri vezujući afiniteti) može da se podstakne upotrebom dugotrajnih pranja i monovalentnim prikazom na fagu kao što je opisano kod Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990) i u WO 92/09690, i malom gustinom oblaganja antigenom kao što je opisano kod Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

[0243] Anti-beta-kloto antitela mogu da se dobiju dizajniranjem pogodnog postupka za skrining antigena za selektovanje klona faga od interesa, praćenim konstruisanjem klona anti-beta-kloto antitela cele dužine upotrebom VH i/ili VL sekvenci (npr., Fv sekvenci), ili različitih CDR sekvenci iz VH i VL sekvenci, iz klona faga od interesa, i sekvenci pogodnih konstantnih

14

regiona (npr., Fc) opisanih kod Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3.

3. Fragmenti antitela

[0244] Predmetno otkriće obezbeđuje antitela i fragmente antitela koji se vezuju za beta-kloto. U određenim okolnostima postoje prednosti upotrebe fragmenata antitela, pre nego celih antitela. Manja veličina fragmenata omogućava brzi klirens, i može da dovede do poboljšanog pristupa ćelijama, tkivima ili organima. Za pregled određenih fragmenata antitela, videti Hudson et al. (2003) Nat. Med.9:129-134.

[0245] Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti potiču od proteolitičke digestije intaktnih antitela (videti, npr., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); i Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Međutim, ovi fragmenti mogu sada da se proizvedu direktno pomoću rekombinantnih ćelija-domaćina. Fragmenti antitela Fab, Fv i ScFv mogu da budu eksprimirani i izlučeni iz E. coli ili ćelija kvasca, čime je omogućena laka proizvodnja velikih količina ovih fragmenata. Fragmenti antitela mogu da se izoluju iz fagnih biblioteka antitela kao što je razmatrano u tekstu iznad. Alternativno, Fab'-SH fragmenti mogu direktno da se izdvoje iz E. coli i hemijski spoje tako da obrazuju F(ab')2fragmente (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, F(ab')2fragmenti mogu direktno da se izoluju iz kulture rekombinantnih ćelija-domaćina. Fab i F(ab')2fragmenti sa produženim polu-životom u in vivo uslovima koji sadrže rezidue epitopa koji vezuje receptor za spašavanje opisani su, na primer, u SAD pat. br. 5,869,046. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnjaku u ovoj oblasti. U određenim primerima izvođenja, antitelo je jednolančani Fv fragment (scFv) (videti, npr., WO 93/16185; SAD pat. br. 5,571,894; i 5,587,458). Fv i scFv imaju intaktna mesta vezivanja kojima nedostaju konstantni regioni; stoga su pogodni za smanjivanje nespecifičnog vezivanja kada se koriste in vivo. Fuzioni proteini scFv mogu da budu konstruisani tako da daju fuziju efektorskog proteina i scFv na amino ili karboksi terminalnom kraju. (Videti, npr., Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, gore). Fragment antitela može takođe da bude "linearno antitelo", na primer, kako je opisano, na primer, u gore navedenim referencama. Takva linearna antitela mogu da budu monospecifična ili multi-specifična, na primer, bispecifična.

[0246] Manje vezujuće strukture poreklom od antitela su odvojeni varijabilni domeni (V domeni) takođe označeni kao antitela sa jednim varijabilnim domenom (SdAbs). Određene vrste organizama, kamelide i hrskavičave ribe, imaju visokoafinitetne pojedinačne domene slične V domenu vezane za strukturu koja je ekvivalent Fc domena kao deo svog imunog sistema. (Woolven et al., Immunogenetics 50: 98-101, 1999; Streltsov et al., Proc Natl Acad Sci USA.

101:12444-12449, 2004). Domeni slični V domenu (označeni kao VhH kod kamelida i V-NAR kod ajkula) tipično imaju duge površinske petlje, koje omogućavaju prodiranje u šupljine ciljnih antigena. One takođe stabilizuju izolovane VH domene maskiranjem hidrofobnih površinskih područja.

[0247] Ovi VhH i V-NAR domeni su upotrebljeni za konstruisanje sdAbs. Varijante humanih V domena dizajnirane su upotrebom selekcije iz fagnih biblioteka i drugim pristupima koji su rezultovali stabilnim domenima sa velikom jačinom vezivanja koji potiču od VL i VH.

[0248] Antitela koji se vezuju za beta-kloto opisana u ovom dokumentu uključuju, ali nisu ograničena na sintetska antitela, monoklonska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, multispecifična antitela (uključujući bi-specifična antitela), humana antitela, humanizovana antitela, kamelizovana antitela, himerna antitela, intra-tela, anti-idiotipska (anti-Id) antitela, i funkcionalne fragmente, (npr., beta-kloto-vezujuće fragmente) bilo čega od gore navedenog. Neograničavajući primeri funkcionalnih fragmenata (npr., fragmenata koji se vezuju za betakloto) uključuju jednolančane Fvs (scFv) (npr., uključujući monospecifične, bispecifične, itd.), Fab fragmente, F(ab') fragmente, F(ab)2 fragemente, F(ab')2 fragmente, disulfidno-vezane Fvs (sdFv), Fd fragmente, Fv fragmente, diatela, tria-tela, tetra-tela i mini-tela.

[0249] Antitela koja su ovde obezbeđena uključuju, ali nisu ograničena na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, na primer, molekul koji sadrži antigen-vezujuće mesto koje se vezuju za epitop beta-kloto. Molekuli imunoglobulina koji su ovde obezbeđeni mogu da budu bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklase imunoglobulinskog molekula.

[0250] Varijante i derivati antitela uključuju funkcionalne fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost da se vežu za epitop beta-kloto. Primeri funkcionalnih fragmenata uključuju Fab fragmente (npr., fragment antitela koji sadrži antigen-vezujući domen i sadrži laki lanac i deo teškog lanca povezane disulfidnom vezom); Fab' (npr., fragment antitela koji sadrži jedan antivezujući domen koji sadrži Fab i dodatni deo teškog lanca povezane zglobnim regionom); F(ab')2 (npr., dva Fab' molekulu spojena međulančanim disulfidnim vezama u zglobnim regionima teških lanaca; Fab' molekul može da bude usmeren na isti ili različite epitope); bispecifični Fab (npr., Fab molekul koji ima dva antigen-vezujuća domena, od kojih svaki može da bude usmeren na različite epitope); jednolančani Fab fragment koji sadrži varijabilni region, poznat i kao, sFv (npr., varijabilni, antigen-vezujući determinativni region sa jednim lakim i teškim lancem antitela povezanim pomoću lanca od 10-25 aminokiselina); disulfidno-vezani Fv, ili dsFv (npr., varijabilni, antigen-vezujući determinativni region sa jednim lakim i teškim lancem antitela povezanim disulfidnom vezom); kamelizovani VH (npr., varijabilni, antigenvezujući determinativni region sa jednim teškim lancem antitela u kome su neke aminokiseline na dodirnoj površini VH one koje se nalaze u teškom lancu prirodnih antitela kamile); bispecifični sFv (npr., molekul sFv ili dsFv koji ima dva antigen-vezujuća domena, od kojih svaki može da bude usmeren na različite epitope); diatelo (npr., dimerizovani sFv obrazovan spajanjem VH domena prvog sFv sa VL domenom drugog sFv i spajanjem VL domena prvog sFv sa VH domenom drugog sFv; dva antigen-vezujuća regiona diatela mogu da budu usmerena na isti ili različite epitope); i tria-telo (npr., trimerizovani sFv, obrazovan na način sličan diatelu, ali u kome su tri antigen-vezujuća domena stvorena u jednom kompleksu; tri antigen vezujuća domena mogu da budu usmerena na iste ili različite epitope). Derivati antitela takođe uključuju jednu ili više CDR sekvenci vezujućeg mesta antitela. CDR sekvence mogu da budu međusobno povezane na skafoldu kada su prisutne dve ili više CDR sekvenci. U određenim primerima izvođenja, antitelo sadrži jednolančani Fv ("scFv"). scFvs su fragmenti antitela koji sadrži VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni na jednom polipeptidnom lancu. Polipeptid scFv može dalje da sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava da scFv obrazuje željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled fragmenata scFvs, videti Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

4. Humanizovana antitela

[0251] Predmetno otkriće obezbeđuje humanizovana antitela koja vezuju beta-kloto, uključujući beta-kloto čoveka ili cinomolgus majmuna. Humanizovana antitela predmetnog otkrića mogu da sadrže jedan ili više CDRs kao što je prikazano u tabelama 1-10. Različiti postupci za humanizovanje nehumanih antitela su poznati u stanju tehnike. Na primer, humanizovano antitelo može da ima jednu ili više aminokiselinskih rezidua koja je u njega uvedena iz izvora koji nije čovek. Ove aminokiselinske rezidue nehumanog porekla često su označene kao "importovane" rezidue, koje su obično uzete iz "importovanog" varijabilnog domena. Humanizacija može da se sprovede, na primer, prema postupku Wintera i saradnika (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), supstitucijom sekvenci hipervarijabilnog regiona za odgovarajuće sekvence humanog antitela.

[0252] U nekim slučajevima, humanizovana antitela konstruišu se graftovanjem CDR, pri čemu se aminokiselinske sekvence šest regiona koji određuju komplementarnost (CDRs) parentalnog

14

nehumanog antitela (npr., glodarskog) kaleme na region okvira humanog antitela. Na primer, Padlan et al. (FASEB J.9:133-139, 1995) su odredili da samo oko jedne trećine rezidua u CDRs zaista dolazi u kontakt sa antigenom, i označili ih kao "rezidue koje određuju specifičnost" ili SDRs. U tehnici graftovanja SDR, samo SDR rezidue se kaleme na region okvira humanog antitela (videti, npr., Kashmiri et al., Methods 36: 25-34, 2005).

[0253] Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, za upotrebu u pravljenju humanizovanog antitela može da bude važan za smanjenje antigenosti. Na primer, prema takozvanom metodu "najboljeg uklapanja", sekvenca varijabilnog domena antitela koje nije humano (npr., glodarsko) ispituje se naspram cele biblioteke humanih sekvenci varijabilnih domena. Humana sekvenca koja je najbliža glodarskoj može da bude odabrana kao humani region okvira za humanizovano antitelo (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Drugi metod koristi određeni region okvira poreklom iz konsenzusne sekvence svih humanih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti region okvira može da se koristi za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623. U nekim slučajevima, region okvira potiče od konsenzusnih sekvenci najzastupljenijih humanih potklasa, VL6 podgrupe I (VL6I) i VHpodgrupe III (VHIII). U još jednom metodu, geni humane klicine linije koriste se kao izvor regiona okvira.

[0254] U alternativnoj paradigmi zasnovanoj na poređenju CDRs, nazvanoj superhumanizacija, homologija FR nije značajna. Postupak se sastoji od poređenja nehumane sekvence sa repertoarom funkcionalnih gena humane klicine linije. Zatim se odabiraju oni geni koje kodiraju iste ili blisko povezane kanonske strukture mišjim sekvencama. Nakon toga, među genima koji dele kanonske strukture sa nehumanim antitelima, kao donori FR biraju se ona sa najvećom homologijom unutar CDRs. Najzad, nehumani CDRs se kaleme na ove FRs (videti, npr., Tan et al., J. Immunol. 169: 1119-1125, 2002).

[0255] Dalje je uopšteno poželjno da antitela budu humanizovana uz očuvanje njihovog afiniteta prema antigenu i drugih poželjnih bioloških svojstava. Da bi se ovaj cilj postigao, prema jednom postupku, humanizovana antitela se pripremaju analizom parentalnih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda upotrebom trodimenzionalnih modela parentalnih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su obilno dostupni i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata za imunoglobulinske sekvence. Oni uključuju, na primer, WAM (Whitelegg and Rees, Protein Eng. 13: 819-824, 2000), Modeller (Sali and Blundell, J. Mol. Biol. 234: 779-815, 1993), i Swiss PDB Viewer (Guex and Peitsch, Electrophoresis 18: 2714-2713, 1997). Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge rezidua u funkcionisanju imunoglobulinske sekvence-kandidata, npr., analizu rezidua koje utiču na sposobnost imunoglobulinskog kandidata da se veže za antigen. Na ovaj način, FR rezidue mogu da se odaberu i kombinuju iz recipijenta i importovanih sekvenci kako bi se postigla željena karakteristika antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen/antigene. Uopšteno, rezidue hipervarijabilnog regiona direktno i najznačajnije utiču na vezivanje antigena.

[0256] Još jedan postupak za humanizaciju antitela zasniva se na indeksu humanizacije antitela nazvanom „Sadržaj humanog lanca“ (HSC). Ovim postupkom poredi se mišja sekvenca sa repertoarom gena humane klicine linije i razlike se ocenjuju kao HSC. Ciljna sekvenca se zatim humanizuje povećanjem njenog HSC, a ne upotrebom zajedničke ocene identičnosti za stvaranje nekoliko različitih humanizovanih varijanti. (Lazar et al., Mol. Immunol.44: 1986-1998, 2007).

[0257] Pored gore opisanih postupaka, za stvaranje i selekciju humanizovanih antitela mogu da se koriste i empirijske metode. Ove metode uključuju one koje se zasnivaju na stvaranju velikih biblioteka humanizovanih varijanti i selekciji najboljih klonova upotrebom tehnologija obogaćivanja ili tehnika skrininga visoke propusnosti. Varijante antitela mogu da se izoluju iz biblioteka prikaza na fagu, ribozomima i kvascu, kao i skriningom bakterijskih kolonija (videti, npr., Hoogenboom, Nat. Biotechnol. 23: 1105-1116, 2005; Dufner et al., Trends Biotechnol. 24: 523-529, 2006; Feldhaus et al., Nat. Biotechnol. 21: 163-70, 2003; Schlapschy etal., Protein Eng. Des. Sel.17: 847-60, 2004).

[0258] Kod pristupa biblioteke FR, kolekcija varijanti rezidua introdukuje se na specifičnim pozicijama u FR nakon čega se obavlja selekcija biblioteke da bi se odabrali FR koji najbolje podržavaju graftovani CDR. Rezidue koje treba zameniti mogu da obuhvataju neke ili sve "Vernier" rezidue identifikovane kao one koje potencijalno doprinose CDR strukturi (videti, npr., Foote and Winter, J. Mol. Biol.224: 487-499, 1992), ili iz ograničenijeg niza ciljnih rezidua koje je identifikovao Baca et al. (J. Biol. Chem.272: 10678-10684, 1997).

[0259] Kod pregrupisanja FR, celi FRs se kombinuju sa nehumanim CDRs umesto stvaranja kombinatorijalnih biblioteka odabranih varijanti rezidua (videti, npr., Dall'Acqua et al., Methods 36: 43-60, 2005). Biblioteke mogu da budu pregledane za procenu vezivanja u dvostepenom selekcionom postupku, prvo za humanizovanje VL, a zatim VH. Alternativno, može da se koristi jednostepeni postupak pregrupisanja FR. Takav postupak se pokazao efikasnijim od dvostepenog skrininga, budući da nastala antitela imaju poboljšana biohemijska i fiziko-hemijska svojstva uključujući poboljšanu ekspresiju, povećani afinitet i termičku stabilnost (videti, npr., Damschroder et al., Mol. Immunol.44: 3049-60, 2007).

14

[0260] Postupak "humaneering" zasniva se na eksperimentalnoj identifikaciji ključnih minimalnih determinanti specifičnosti (MSDs) i sekvencijalnom ubacivanju nehumanih fragmenata u biblioteke humanih FRs i proceni vezivanja. Postupak počinje sa regionima CDR3 nehumanih VH i VL lanaca, i nastavlja se ubacivanjem drugih regiona nehumanog antitela u humane FRs, uključujući CDR1 i CDR2 VH i VL. Ova metodologija obično rezultuje zadržavanjem epitopa i identifikovanjem antitela različitih potklasa sa posebnim humanim CDR regionima V segmenta. Postupak "humaneering" omogućava izdvajanje antitela koja su 91-96% homologa antitelima kodiranim genima humane klicine linije. (videti, npr., Alfenito, Cambridge Healthtech Institute's Third Annual PEGS, The Protein Engineering Summit, 2007).

[0261] Postupak konstruisanja humanih antitela "human engineering" uključuje promenu nehumanog antitela ili fragmenta antitela, kao što je mišje ili himerno antitelo ili fragment antitela, uvođenjem specifičnih izmena u aminokiselinsku sekvencu antitela tako da se dobije modifikovano antitelo sa smanjenom imunogenošću kod čoveka koje ipak zadržava poželjna svojstva vezivanja originalnog nehumanog antitela. Uopšteno, tehnika uključuje klasifikovanje aminokiselinskih rezidua nehumanog (npr., mišjeg) antitela kao rezidua "niskog rizika", "umerenog rizika", ili "visokog rizika". Klasifikacija se sprovodi upotrebom izračunavanja ukupnog odnosa rizika i koristi koji ocenjuje predviđenu korist od uvođenja određene supstitucije (npr., za imunogenost kod ljudi) naspram rizika da će supstitucija uticati na savijanje rezultujućeg antitela i/ili su supstituisane humanim reziduama. Konkretna humana aminokiselinska rezidua koja treba da se zameni na datoj poziciji (npr., niskog ili umerenog rizika) sekvence nehumanog (npr., mišjeg) antitela može da se odabere poravnanjem aminokiselinske sekvence iz varijabilnih regiona nehumanog antitela sa odgovarajućim regionom specifične ili konsenzusne sekvence humanog antitela. Aminokiselinske rezidue na pozicijama sa niskim ili umerenim rizikom u nehumanoj sekvenci mogu da budu supstituisane za odgovarajuće rezidue u sekvenci humanog antitela prema poravnanju. Tehnike pravljenja humanih konstruisanih proteina opisane su detaljnije kod Studnicka et al., Protein Engineering, 7: 805-814 (1994), u SAD patentima br.5,766,886, 5,770,196, 5,821,123, i 5,869,619, i objavi PCT prijave WO 93/11794.

5. Humana antitela

[0262] Humana anti-beta-kloto antitela mogu da se konstruišu kombinovanjem sekvence/sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka prikaza na fagu humanog porekla sa poznatom sekvencom/sekvencama humanog konstantnog domena. Alternativno, humana monoklonska anti-beta-kloto antitela predmetnog otkrića mogu da se

14

naprave metodom hibridoma. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela opisani su, na primer, kod Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

[0263] Takođe je moguće proizvesti transgene životinje (npr., miševe) koji mogu, nakon imunizacije da proizvedu ceo repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnja imunoglobulina. Transgeni miševi koji eksprimiraju repertoare humanog antitela korišćeni su za stvaranje sekvence visokoafinitetnih humanih monoklonskih antitela protiv širokog spektra potencijalnih ciljnih lekova (videti, npr., Jakobovits, A., Curr. Opin. Biotechnol.1995, 6(5):561-6; Brüggemann and Taussing, Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8(4):455-8; SAD pat. br.

6,075,181 i 6,150,584; i Lonberg et al., Nature Biotechnol. 23: 1117-1125, 2005).

[0264] Alternativno, humano antitelo može da se pripremi imortalizacijom humanih B limfocita koji proizvode antitelo usmereno protiv ciljnog antigena (npr., takvi B limfociti mogu da se izdvoje iz tela osobe ili da budu imunizovani in vitro) (videti, npr., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991); i US Pat No.5,750,373).

[0265] Pregrupisanje gena može takođe da se koristi za dobijanje humanih antitela iz nehumanih, na primer, glodarskih, antitela, gde humano antitelo ima slične afinitete i specifičnosti kao polazno nehumano antitelo. Prema ovom postupku, koji se naziva i "imprinting epitopa" ili "vođena selekcija", varijabilni region teškog ili lakog lanca fragmenta nehumanog antitela dobijen tehnikama prikaza na fagu, kao što je ovde opisano, zamenjuje se repertoarom gena humanog V domena, čime se stvara populacija scFv ili Fab himera koja sadrži nehumani lanac/humani lanac. Selekcija pomoću antigena rezultuje izdvajanjem himernih scFv ili Fab sa nehumanim lancem/humanim lancem u kojima se u humanom lancu ponovo javlja antigenvezujuće mesto koje je uništeno uklanjanjem odgovarajućeg nehumanog lanca u primarnom klonu prikaza na fagu, (npr., epitop vodi (obeležava) izbor partnerskog humanog lanca). Kada se postupak ponovi u cilju zamene preostalog nehumanog lanca, dobija se humano antitelo (videti, npr., PCT WO 93/06213; i Osbourn et al., Methods., 36, 61-68, 2005). Za razliku od uobičajene humanizacije nehumanih antitela putem graftovanja CDR, ova tehnika obezbeđuje potpuno humana antitela, koja nemaju FR ili CDR rezidue nehumanog porekla. Primeri vođene selekcije za humanizaciju mišjih antitela protiv antigena ćelijske površine uključuju protein koji vezuje folat prisutan na ćelijama kancera jajnika (videti, npr., Figini et al., Cancer Res., 58, 991-

14

996, 1998) i CD147, koji je visoko eksprimiran na ćelijama hepatocelularnog karcinoma (videti, npr., Bao et al., Cancer Biol. Ther., 4, 1374-1380, 2005).

[0266] Potencijalni nedostatak pristupa vođene selekcije je to što bi pregrupisanje jednog lanca antitela uz zadržavanje drugog konstantnim moglo da rezultuje postepenom promenom (driftom) epitopa. Kako bi epitop ostao prepoznatljiv za nehumano antitelo, može da se primeni zadržavanje CDR (videti, npr., Klimka et al., Br. J. Cancer., 83, 252-260, 2000; VH CDR2 Beiboer et al., J. Mol. Biol., 296, 833-49, 2000) U ovom postupku, CDR3 nehumanog VH se obično zadržava, budući da ovaj CDR može da bude u centru antigen-vezujućeg mesta i može da bude najvažniji region antitela za prepoznavanje antigena. U nekim slučajevima, međutim, mogu da se zadrže VH CDR3 i VL CDR3, kao i VH CDR3, VL CDR3 i VL CFR1 nehumanog antitela.

6. Bispecifična antitela

[0267] Bispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena. Kao što je ovde opisano, bispecifična antitela mogu da budu humana ili humanizovana antitela. Jedna od specifičnosti vezivanja može da bude prema betakloto, a druga može da bude za bilo koji drugi antigen. Jedna od specifičnosti vezivanja može da bude prema beta-kloto, a druga prema drugom površinskom antigenu eksprimiranom na ćelijama koje eksprimiraju beta-kloto i FGF receptor (npr., FGFR1c, FGFR2c, FGFR3c, FGFR4). Bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa u beta-kloto. Bispecifična antitela mogu da se pripreme kao antitela cele dužine ili fragmenti antitela (npr., F(ab')2bispecifična antitela).

[0268] Postupci za pravljenje bispecifičnih antitela su poznati u stanju tehnike, kao što su, na primer, ko-ekspresija dva para teški lanac-laki lanac imunoglobulina, pri čemu dva teška lanca imaju različite specifičnosti (videti, npr., Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Za dodatne detalje o generisanju bispecifičnih antitela videti, na primer, Bispecific Antibodies, Kontermann, ed., Springer-Verlag, Hiedelberg (2011).

7. Multivalentna antitela

[0269] Multivalentno antitelo može da bude internalizovano (i/ili katabolizovano) brže nego bivalentno antitelo u ćeliji koja eksprimira antigen za koji se antitela vezuju. Antitela predmetnog otkrića mogu da budu multivalentna antitela (koja nisu IgM klase) sa tri ili više antigen-vezujućih mesta (npr., tetravalentna antitela), koja mogu lako da se proizvedu rekombinantnom ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira polipeptidne lance antitela.

14

Multivalentno antitelo može da sadrži dimerizacioni domen i tri ili više antigen-vezujućih mesta. Dimerizacioni domen može da sadrži (ili da se sastoji od) Fc regiona ili zglobnog regiona. U ovom slučaju, antitelo će sadržati Fc region i tri ili više antigen-vezujućih mesta aminoterminalno u odnosu na Fc region. Multivalentno antitelo može da sadrži (ili da se sastoji od) tri do oko osam antigen-vezujućih mesta. Multivalentno antitelo može da sadrži (ili da se sastoji od) četiri antigen-vezujuća mesta. Multivalentno antitelo sadrži najmanje jedan polipeptidni lanac (na primer, dva polipeptidna lanca), pri čemu polipeptidni lanac/lanci sadrže dva ili više varijabilnih domena. Na primer, polipeptidni lanac/lanci mogu da sadrže VD1-(X1)n -VD2-(X2)n -Fc, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen, VD2 je drugi varijabilni domen, Fc je jedan polipeptidni lanac Fc regiona, X1 i X2 predstavljaju aminokiselinu ili polipeptid, i n je 0 ili 1. Na primer, polipeptidni lanac/lanci mogu da sadrže: lanac VH-CH1-fleksibilni linker-VH-CH1-Fc region; ili lanac VH-CH1-VH-CH1-Fc region. Multivalentno antitelo u ovom dokumentu može dalje da sadrži najmanje dva (na primer, četiri) polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Multivalentno antitelo u ovom dokumentu može, na primer, da sadrži od oko dva do oko osam polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Polipeptidi varijabilnog domena lakog lanca koji su ovde razmatrani sadrže varijabilni domen lakog lanca i, opciono, dodatno sadrže CL domen.

8. Konstruisanje Fc

[0270] Može da bude poželjna modifikacija antitela protiv beta-kloto putem konstruisanja Fc, uključujući, u odnosu na efektorsku funkciju, na primer, tako da se smanji ili otkloni ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antigena (ADCC) i/ili citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) antitela. Ovo može da se postigne uvođenjem jeden ili više aminokiselinskih supstitucija u Fc region antitela. Na primer, pokazano je da supstitucija u humanom IgG1 upotrebom IgG2 rezidua na pozicijama 233-236 i IgG4 rezidua na pozicijama 327, 330 i 331 snažno smanjuje ADCC i CDC (videti, npr., Armour et al., Eur. J. Immunol.

29:(8):2613-24 (1999); Shields et al., J. Biol..Chem. 276(9): 6591-604 (2001).

[0271] Za povećanje serumskog polu života antitela, u antitelo može da se ugradi epitop koji vezuje receptor za spašavanje (posebno fragment antitela), na primer, kao što je opisano u SAD patentu 5,739,277. Pojam "epitop koji vezuje receptor za spašavanje" odnosi se na epitop Fc regiona IgG molekula (npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4) koji je odgovoran za produžavanje in vivo serumskog polu života IgG molekula.

9. Alternativni vezujući agensi

14

[0272] Predmetno otkriće obuhvat neimunoglobulinske vezujuće agense koji se specifično vezuju za isti epitop kao anti-beta-kloto antitelo koje je ovde opisano. Kao što je ovde opisano, neimunoglobulinski vezujući agens je identifikovan kao agens koji istiskuje ili je istisnut antibeta-kloto antitelom predmetnog otkrića u testu kompetitivnog vezivanja. Ovi alternativni vezujući agensi mogu da uključuju, na primer, bilo koji od konstruisanih proteinskih skafolda poznatih u stanju tehnike. Takvi skafoldi mogu da sadrže jedan ili više CDRs kao što je prikazano u tabelama 1-10. Takvi skafoldi uključuju, na primer, antikaline, koji se zasnivaju na lipokalinskom skafoldu, proteinskoj strukturi koja se odlikuje rigidni beta-cilindar koji podržava četiri hipervarijabilne petlje koje obrazuju ligand-vezujuće mesto. Nove specifičnosti vezivanja mogu da budu konstruisane ciljnom nasumičnom mutagenezom u regionima petlje, u kombinaciji sa funkcionalnim prikazom i vođenom selekcijom (videti, npr., Skerra (2008) FEBS J. 275: 2677-2683). Drugi pogodni skafoldi mogu da uključuju, na primer, adnektine, ili monotela, koja se zasnivaju na desetom vanćelijskom domenu humanog fibronektina III (videti, npr., Koide and Koide (2007) Methods Mol. Biol. 352: 95-109); afi-telima, zasnovanim na Z domenu stafilokoknog proteina A (videti, npr., Nygren et al. (2008) FEBS J. 275: 2668-2676)); DARPins, na bazi proteina sa ankirinskim ponovcima (videti, npr., Stumpp et al. (2008) Drug. Discov. Today 13: 695-701); finomere, na bazi SH3 domena humane Fyn protein kinaze (Grabulovski et al. (2007) J. Biol. Chem. 282: 3196-3204); afitine, na bazi Sac7d iz Sulfolobus acidolarius (videti, npr., Krehenbrink et al. (2008) J. Mol. Biol. 383: 1058-1068); afiline, na bazi humanog y-B-kristalina (videti, npr., Ebersbach et al. (2007) J. Mol. Biol. 372: 172-185); avimere, na bazi A domena membranskih receptorskih proteina (videti, npr., Silverman et al. (2005) Biotechnol. 23: 1556-1561); cisteinom-bogate knottin peptide (videti, npr., Kolmar (2008) FEBS J. 275: 2684-2690); i konstruisane inhibitore tipa Kunitz (videti, npr., Nixon and Wood (2006) Curr. Opin. Drug. Discov. Dev. 9: 261-268). Za pregled, videti, na primer, Gebauer i Skerra (2009) Curr. Opin. Chem. Biol.13: 245-255.

Varijante antitela

[0273] Kao što je ovde opisano, u ovom dokumentu razmatra se modifikacija/modifikacije aminokiselinske sekvence antitela koja se vezuju za beta-kloto ili koja su ovde opisana. Na primer, može da bude poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela, uključujući, ali bez ograničenja specifičnost, termostabilnost, nivo ekspresije, efektorske funkcije, glikozilaciju, redukovanu imunogenost ili rastvorljivost. Prema tome, pored ovde opisanih anti-beta-kloto antitela, predviđeno je da mogu da se pripreme varijante anti-beta-kloto antitela. Na primer, varijante anti-beta-kloto antitela mogu da se pripreme uvođenjem

1

odgovarajućih nukleotidnih izmena u kodirajuću DNK, i/ili sintezom željenog antitela ili polipeptida. Stručnjaci u ovoj oblasti će znati da aminokiselinske izmene mogu da promene posttranslacione procese anti-beta-kloto antitela, kao što je promena broja ili pozicije glikozilacionih mesta ili izmena karakteristika povezanih sa učvršćivanjem u membrani.

[0274] Antitela predmetnog pronalaska mogu da budu hemijski modifikovana, na primer, kovalentnim vezivanjem bilo kog tipa molekula za antitelo. Derivati antitela mogu da uključuju antitela koja su hemijski modifikovana, na primer, glikozilacijom, acetilacijom, pegilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem za ćelijski ligand ili drugi protein, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može da se sprovede poznatim tehnikama, uključujući, ali bez ograničenja specifično hemijsko cepanje, acetilaciju, formulaciju, metaboličku sintezu tunikamicina, itd. Prema tome, antitelo može da sadrži jednu ili više aminokiselina koje nisu klasične.

[0275] Varijacije mogu da budu supstitucije, delecije ili insercije jednog ili više kodona koji kodiraju antitelo ili polipeptid koje rezultuju promenom aminokiselinske sekvence u poređenju sa nativnom sekvencom antitela ili polipeptida. Aminokiselinske supstitucije mogu da budu rezultat zamene jedne aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima slična strukturna i/ili hemijska svojstva, kao što je zamena leucina serinom, npr., konzervativne aminokiselinske zamene. Insercije ili delecije mogu opciono da budu u opsegu od oko 1 do 5 aminokiselina. The supstitucija, delecija ili insercija može da uključuje manje od 25 aminokiselinskih supstitucija, manje od 20 aminokiselinskih supstitucija, manje od 15 aminokiselinskih supstitucija, manje od 10 aminokiselinskih supstitucija, manje od 5 aminokiselinskih supstitucija, manja od 4 aminokiselinske supstitucije, manje od 3 aminokiselinske supstitucije, ili manje od 2 aminokiselinske supstitucije u odnosu na originalni molekul. Supstitucija može da bude konzervativna aminokiselina supstitucija uvedena na jednoj ili više predviđenih neesencijalnih aminokiselinskih rezidua. dozvoljena varijacija može da se odredi sistematskim uvođenjem insercija, delecija ili supstitucija aminokiselina u sekvencu i ispitivanjem aktivnosti rezultujućih varijanti koju ispoljava cela ili zrela nativna sekvenca.

[0276] Insercije aminokiselinske sekvence uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije čija dužina varira od jedne rezidue do polipeptida koji sadrže sto ili više rezidua, kao i insercije unutar sekvence jedne ili više aminokiselinskih rezidua. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnom metionil reziduom. Ostale varijante insercija molekula antitela uključuju fuziju N- ili C-terminalnog kraja antitela sa enzimom (npr., za terapiju enzim-prolek usmerenu antitelom) ili polipeptidom koji produžava serumski polu život antitela.

1 1

[0277] Suštinske modifikacije u biološkim svojstvima antitela postižu se selekcijom supstitucija koje se značajno razlikuju po svom dejstvu na održavanje (a) strukture osnovnog lanca polipeptida u oblasti supstitucije, na primer, konformacije naborane ploče ili spirale, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) veličine bočnog lanca. Alternativno, mogu da budu uvedene konzervativne (npr., unutar aminokiselinske grupe sa sličnim svojstvima i/ili bočnim lancima) supstitucije, tako da se svojstva zadrže, ili da se ne izmene značajno. Aminokiseline mogu da budu grupisane prema sličnosti svojstava bočnih lanaca (videti, npr., A. L. Lehninger, in Biochemistry, 2nd Ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) nepolarne: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) nenaelektrisane polarne: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) kisele: Asp (D), Glu (E); i (4) bazne: Lys (K), Arg (R), His(H).

[0278] Alternativno, prirodne rezidue mogu da se podele u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca: (1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) kisele: Asp, Glu; (4) bazne: His, Lys, Arg; (5) rezidue koje utiču na orjentaciju lanca: Gly, Pro; i (6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

[0279] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaju razmenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom. Takve supstituisane rezidue takođe mogu da budu uvedene na mesta konzervativne supstitucije ili, na preostala (nekonzervativna) mesta. Prema tome, kao što je ovde opisano, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za epitop beta-kloto sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci mišjeg monoklonskog antitela kao što je ovde opisano. Kao što je ovde opisano, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za epitop beta-kloto sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u tabelama 1-10. Kao što je ovde opisano, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za epitop beta-kloto sadrži VH CDR i/ili VL CDR aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci VH CDR prikazanoj u tabelama 1-10 i/ili aminokiselinskoj sekvenci VL CDR prikazanoj u tabelama 1-10. Varijacije mogu da se uvedu upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike kao što je oligonukleotidom-posredovana (mesto-specifična)

1 2

mutageneza, skeniranje alanina, i PCR mutageneza. Mesto-specifična mutageneza (videti, npr., Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), kasetna mutageneza (videti, npr., Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), mutageneza na bazi restrikcione selekcije (videti, npr., Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) ili druge poznate tehnike mogu da se sprovedu na kloniranoj DNK da bi se proizvela varijanta DNK anti-beta-kloto antitela.

[0280] Bilo koja cisteinska rezidua koja nije uključena u održavanje ispravne konformacije antibeta-kloto antitela takođe može da bude supstituisana, na primer, drugom aminokiselinom kao što je alanin ili serin, da bi se poboljšala oksidativna stabilnost molekula i sprečilo aberantno umrežavanje. Suprotno, cisteinska veza/veze mogu da se dodaju anti-beta-kloto antitelu da bi se poboljšala njegova stabilnost (npr., kada je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment).

[0281] Molekul anti-beta-kloto antitela predmetnog otkrića može da bude "deimunizovano" antitelo. "Deimunizovano" anti-beta-kloto antitelo je antitelo poreklom od humanizovanog ili himernog anti-beta-kloto antitela, koje ima jednu ili više izmenu u svojoj aminokiselinskoj sekvenci koja dovodi do smanjenja imunogenosti antitela, u poređenju sa odgovarajućim originalnim antitelom koje nije deimunizovano. Jedna od procedura za stvaranje takvih mutanata antitela uključuje identifikaciju i uklanjanje T-ćelijskih epitopa molekula antitela. U prvom koraku, imunogenosti molekula antitela može da se odredi pomoću nekoliko metoda, na primer, in vitro određivanjem T-ćelijskih epitopa ili predviđanjem takvih epitopa u uslovima in silico, kao što je poznato u stanju tehnike. Kada se ključna rezidua za funkcionisanje T-ćelijskog epitopa identifikuje, mogu da se uvedu mutacije za uklanjanje imunogenosti i zadržavanje aktivnosti antitela. Za pregled, videti, na primer, Jones et al., Methods in Molecular Biology 525: 405-423, 2009.

1. In vitro sazrevanje afiniteta

[0282] Kao što je ovde opisano, varijante antitela koje imaju poboljšana svojstva kao što su afinitet, stabilnost, ili nivo ekspresije u poređenju sa parentalnim antitelom mogu da se pripreme sazrevanjem afiniteta in vitro. Kao prirodni prototip, sazrevanjem afiniteta in vitro zasniva se na principima mutacije i selekcije. Biblioteke antitela su prikazane u vidu fragmenata Fab, scFv ili V domena na površini organizma (npr., fag, bakterija, kvasac ili sisarska ćelija) ili povezanih (npr., kovalentno ili nekovalentno) sa njihovom kodirajućom iRNK ili DNK. Afinitetna selekcija prikazanih antitela omogućava izolaciju organizama ili kompleksa koji nose genetsku informaciju koja kodira antitela. Dva ili tri ciklusa mutacije i selekcije upotrebom metoda prikaza kao što je prikaz na fagu obično rezultuju fragmentima antitela sa afinitetima u

1

niskom nanomolarnom opsegu. Poželjna antitela sazrelog afiniteta imaće nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljni antigen.

[0283] Prikaz na fagu je široko rasprostranjeni postupak za prikaz i selekciju antitela. Antitela su prikazana na površini Fd ili M13 bakteriofaga kao fuzije sa proteinom omotača bakteriofaga. Selekcija uključuje izlaganje antigenu da bi se omogućilo antitelima prikazanim na fagu da se vežu za svoje ciljne molekule, u procesu označenom kao selekcija prema afinitetu. Fazi vezani za antigen se izdvajaju i njima se inficiraju bakterije da bi se proizveli fazi za sledeće cikluse selekcije. Za pregled, videti, na primer, Hoogenboom, Methods. Mol. Biol. 178: 1-37, 2002; Bradbury i Marks, J. Immuno. Methods 290: 29-49, 2004).

[0284] U sistemu prikaza na kvascu (videti, npr., Boder et al., Nat. Biotech. 15: 553-57, 1997; Chao et al., Nat. Protocols 1:755-768, 2006), antitelo može da bude prikazano kao jednolančane varijabilne fuzije (scFv) u kojima su teški i laki lanci spojeni fleksibilnim linkerom. scFv je fuzionisan sa adhezionom podjedinicom aglutininskog proteina kvasca Aga2p, koji se vezuje za ćelijski zid kvasca preko disulfidnih veza sa Aga1p. Prikaz proteina preko Aga2p odvaja protein dalje od ćelijske površine, smanjujući potencijalne interakcije sa drugim molekulima na zidu ćelija kvasca. Magnetno razdvajanje i protočna citometrija se koriste za pregledanje biblioteke da bi se odabrala antitela sa poboljšanim afinitetom ili stabilnošću. Vezivanje za solubilni antigen od interesa određuje se obeležavanjem kvasca biotinilisanim antigenom i sekundarnim reagensom kao što je streptavidin konjugovan sa fluoroforom. Varijacije u površinskoj ekspresiji antitela mogu da se mere pomoću imunofluorescentnog obeležavanja hemaglutinina ili epitopske oznake c-Myc koja ograničava scFv. Pokazano je da je ekspresija u korelaciji sa stabilnošću prikazanog proteina, i na taj način antitela mogu da budu selektovana prema poboljšanoj stabilnosti, kao i afinitetu (videti, npr., Shusta et al., J. Mol. Biol.

292: 949-956, 1999). Dodatna prednost prikaza na kvascu je to što se prikazani proteini savijaju u endoplazmatičnom retikulumu eukariotskih ćelija kvasca, koristeći šaperone i mašineriju za kontrolu kvaliteta endoplazmatičnog retikuluma. Kada je sazrevanje završeno, afinitet antitela može pogodno da bude 'titriran' dok je ono prikazano na površini kvasca, čime se otklanja potreba za ekspresijom i prečišćavanjem svakog klona. Teoretsko ograničenje prikaza na površini kvasca je potencijalno manja funkcionalna veličina biblioteke nego kod drugih metoda prikaza; međutim, nedavno razvijeni pristup koristi sistem za sparivanje ćelija kvasca za stvaranje kombinatorne raznolikosti procenjene na veličinu od 10<14>(videti, npr., SAD patentnu objavu 2003/0186,374; Blaise et al., Gene 342: 211-218, 2004).

[0285] Kod ribozomalnog prikaza, stvoreni su kompleksi antitelo-ribozom-iRNK (ARM) za selekciju u sistemu bez ćelija. DNK biblioteka koja kodira konkretnu biblioteku antitela je

1 4

genetički fuzionisana za spejsersku sekvencu kojoj nedostaje stop kodon. Ova spejserska sekvenca, kada se translatira, i dalje je spojena sa peptidil tRNK i zauzima ribozomski tunel, omogućavajući tako proteinu od interesa da se pruža van ribozoma i da se savija. Rezultujući kompleks iRNK, ribozoma, i proteina može da se veže za ligand vezan na površini, što omogućava istovremeno izolovanje antitela i iRNK koja ga kodira putem afinitetnog hvatanja ligandom. iRNK vezana za ribozom se zatim reverznom transkripcijom ponovo prevodi u cDNK, koja zatim može da se podvrgne mutagenezi i koristi u sledećem ciklusu selekcije (videti, npr., Fukuda et al., Nucleic Acids Res. 34, e127, 2006). Kod prikaza iRNK, kovalentna veza između antitela i iRNK uspostavljena je upotrebom puromicina kao molekula adaptera (Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 3750-3755, 2001).

[0286] Kako se ovi postupci u celini izvode in vitro, oni obezbeđuju dve glavne prednosti u odnosu na druge tehnologije selekcije. Prvo, raznovrsnost biblioteke nije ograničena efikasnošću transformacije bakterijskih ćelija, već samo brojem ribozoma i različitih iRNK molekula prisutnih u epruveti. Drugo, nasumične mutacije mogu lako da se uvedu posle svakog ciklusa selekcije, na primer, pomoću polimeraza koje ne ispravljaju greške, jer nijedna biblioteka ne mora da se transformiše posle bilo kog koraka diverzifikacije.

[0287] Diverzitet može da se uvede u CDRs ili cele V gene biblioteka antitela na ciljni način ili putem nasumične introdukcije. Prvi pristup uključuje uzastopno ciljno delovanje na sve CDR antitela putem visokog ili niskog nivoa mutageneze ili ciljnim delovanjem na izolovane vruće tačke somatskih hipermutacija (videti, npr., Ho, et al., J. Biol. Chem. 280: 607-617, 2005) ili rezidua za koje se smatra da utiču na afinitet na osnovu eksperimenata ili strukturnih razloga. Nasumične mutacije mogu da se uvedu duž celog V gena upotrebom E. coli mutatorskih sojeva, replikacije sklone greškama pomoću DNK polimeraza (videti, npr., Hawkins et al., J. Mol. Biol.

226: 889-896, 1992) ili RNK replikaza. Diverzitet takođe može da se uvede zamenom regiona koji su prirodno raznoliki pregrupisanjem DNK ili sličnim tehnikama (videti, npr., Lu et al., J. Biol. Chem. 278: 43496-43507, 2003; SAD pat. br. 5,565,332; SAD pat. br. 6,989,250). Alternativne tehnike koje ciljno deluju na hipervarijabilne petlje koje se pružaju na rezidue regiona okvira (videti, npr., Bond et al., J. Mol. Biol. 348: 699-709, 2005) koriste delecije i insercije petlji u CDRs ili koriste diverzifikaciju na bazi hibridizacije (videti, npr., SAD patentnu objavu br. 2004/0005709). Dodatni postupci za stvaranje raznolikosti u CDRs opisani su, na primer, u SAD pat. br.7,985,840.

[0288] Pretraživanje biblioteka može da se postigne različitim tehnikama poznatim u ovoj oblasti. Na primer, beta-kloto može da bude imobilisan na čvrstim podlogama, kolonama, pinovima ili membranama od celuloze/poli(viniliden fluorida) / drugim filterima, eksprimiran na ćelijama-

1

domaćinima pričvršćenim za adsorpcione ploče ili upotrebljen u ćelijskom sortiranju, ili konjugovan sa biotinom za hvatanje perlama obloženim streptavidinom, ili upotrebljen u bilo kom drugom postupku za selekciju prema afinitetu biblioteka prikaza.

[0289] Za pregled postupaka za sazrevanje afiniteta in vitro, videti, npr., Hoogenboom, Nature Biotechnology 23: 1105-1116, 2005 i Quiroz and Sinclair, Revista Ingeneria Biomedia 4: 39-51, 2010 i reference u njima.

2. Modifikacije anti-beta-kloto antitela

[0290] Kovalentne modifikacije anti-beta-kloto antitela uključuju reakciju ciljnih aminokiselinskih rezidua anti-beta-kloto antitela sa organskim derivatizujućim agensom koji može da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N- ili C- terminalnim reziduama anti-betakloto antitela. Druge modifikacije uključuju deamidaciju glutaminil i asparaginil rezidua u odgovarajuće glutamil i aspartil rezidue, redom, hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil rezidua, metilaciju α-amino grupa bočnih grupa lizina, arginina, i histidina (videti, npr., T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilaciju N-terminalnog amina i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0291] Druge vrste kovalentnih modifikacija anti-beta-kloto antitela uključuju izmenu prirodnog obrasca glikozilacije antitela ili polipeptida (videti, npr., Beck et al., Curr. Pharm. Biotechnol.9: 482-501, 2008; Walsh, Drug Discov. Today 15: 773-780, 2010), i vezivanje antitela za jedan od raznih neproteinskih polimera, npr., polietilen glikol (PEG), polipropilen glikol, ili polioksialkileni, na način prikazan, na primer, u SAD patentima br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337.

[0292] Anti-beta-kloto antitelo predmetnog otkrića može takođe da bude modifikovano tako da obrazuje himerni molekul koji sadrži anti-beta-kloto antitelo fuzionisano sa drugim, heterologim polipeptidom ili aminokiselinskom sekvencom, na primer, oznakom epitopa (videti, npr., Terpe, Appl. Microbiol. Biotechnol. 60: 523-533, 2003) ili Fc regionom IgG molekula (videti, npr., Aruffo, "Immunoglobulin fusion proteins" in Antibody Fusion Proteins, S.M. Chamow and A. Ashkenazi, eds., Wiley-Liss, New York, 1999, pp.221-242).

[0293] U ovom dokumentu opisani su i fuzioni proteini koji sadrže ovde obezbeđeno antitelo koje se vezuje za beta-kloto antigen i heterologi polipeptid. Heterologi polipeptid sa kojim je antitelo fuzionisano koristan je za usmeravanje antitela na ćelije koje imaju površinski eksprimiran beta-kloto.

1

[0294] U ovom dokumentu opisani su i paneli antitela koji se vezuju za beta-kloto antigen. Paneli antitela imaju različite konstante brzine asocijacije, različite konstante brzine disocijacije, različite afinitete za beta-kloto antigen, i/ili različite specifičnosti za beta-kloto antigen. Paneli mogu da sadrže ili da se sastoje od oko 10, oko 25, oko 50, oko 75, oko 100, oko 125, oko 150, oko 175, oko 200, oko 250, oko 300, oko 350, oko 400, oko 450, oko 500, oko 550, oko 600, oko 650, oko 700, oko 750, oko 800, oko 850, oko 900, oko 950, ili oko 1000 antitela ili više. Paneli antitela mogu da se koriste, na primer, u pločama sa 96 bunarčića ili pločama sa 384 bunarčića, kao što su ploče za testove kao ELISA.

Priprema anti-beta-kloto antitela

[0295] Anti-beta-kloto antitela mogu da se proizvedu gajenjem ćelija koje su transformisane ili transfekovane vektorom koji sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju anti-beta-kloto antitelo. Polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne komponente antitela predmetnog otkrića mogu da se dobiju upotrebom standardnih rekombinantnih tehnika. Željene polinukleotidne sekvence mogu da budu izolovane i sekvencirane iz ćelija koje proizvode antitela kao što su ćelije hibridoma. Alternativno, polinukleotidi mogu da budu sintetisani upotrebom uređaja za sintezu polinukleotida ili PCR tehnika. Kada se dobiju, sekvence koje kodiraju polipeptide insertuju se u rekombinantni vektor sposoban za replikaciju i eksprimiranje heterologih polinukleotida u ćelijama-domaćinima. Mnogi vektori koji su dostupni i poznati u stanju tehnike mogu da se koriste u svrhu predmetnog otkrića. Selekcija odgovarajućeg vektora zavisiće uglavnom od veličine nukleinskih kiselina koje treba da se insertuju u vektor i konkretne ćelijedomaćina koja treba da se transformiše vektorom. Ćelije-domaćini pogodni za eksprimiranje antitela predmetnog otkrića uključuju prokariote kao što su Archaebacteria i Eubacteria, uključujući Gram-negativne ili Gram-pozitivne organizme, eukariotske mikrobe kao što su filamentozne gljive ili kvasci, ćelije beskičmenjaka kao što su ćelije insekata ili biljaka, i ćelije kičmenjaka kao što su linije sisarskih ćelija-domaćina. Ćelije-domaćini se transformišu gore opisanim ekspresionim vektorima i gaje u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim tako da budu odgovarajući za indukovanje promotora, selekciju transformanata, ili umnožavanje gena koji kodiraju željene sekvence. Antitela koja proizvedu ćelije-domaćini prečišćavaju se upotrebom standardnih postupaka za prečišćavanje proteina poznatim u stanju tehnike.

[0296] Postupci za proizvodnju antitela koji uključuju konstruisanje vektora, ekspresiju i prečišćavanje dodatno su opisani, u Plückthun et al., (1996) u Antibody Engineering: Producing antibodies in Escherichia coli: From PCR to fermentation (McCafferty, J., Hoogenboom, H. R.,

1

and Chiswell, D. J., eds), 1 Ed., pp.203-252, IRL Press, Oxford; Kwong, K. & Rader, C., E. coli expression and purification of Fab antibody fragments, Current protocols in protein science editorial board John E Coligan et al., Chapter 6, Unit 6.10 (2009); Tachibana and Takekoshi, "Production of Antibody Fab Fragments in Escherischia coli," u Antibody Expression and Production, M. Al-Rubeai, Ed., Springer, New York, 2011; Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (ed Z. An), John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, NJ, USA.

[0297] Podrazumeva se, naravno, da alternativne metode, koje su dobro poznate u stanju tehnike, mogu da se koriste za pripremu anti-beta-kloto antitela. Na primer, odgovarajuća aminokiselinska sekvenca, ili njeni delovi, može da se proizvede direktnom sintezom peptida upotrebom tehnika na čvrstoj fazi (videti, npr., Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)). In vitro sinteza proteina može da se sprovede upotrebom ručnih ili automatskih tehnika. Različiti delovi anti-beta-kloto antitela mogu posebno da se sintetizuju hemijski i da se kombinuju upotrebom hemijskih ili enzimskih metoda da bi se proizvelo željeno anti-beta-kloto antitelo. Alternativno, antitela mogu da se prečiste iz ćelija ili telesnih tečnosti, kao što je mleko, transgene životinje konstruisane da eksprimira antitelo, kao što je opisano, na primer, u SAD pat. br. 5,545,807 i SAD pat. br.5,827,690.

Imunokonjugati

[0298] Predmetno otkriće takođe obezbeđuje konjugate koji sadrže anti-beta-kloto antitela predmetnog pronalaska kovalentno vezana pomoću sintetskog linkera za jedan ili više agenasa koji nisu antitelo.

[0299] Razni radioaktivni izotopi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju At<211>, 14, 14, Y4, Re4, Re4, Sm4, Bi4, P4, Pb4 i radioaktivne izotope Lu. Kada se konjugat koristi za detekciju, on može da sadrži radioaktivni atom za scintigrafska ispitivanja, na primer tc4 ili 14, ili oznaku spina za snimanje nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (takođe poznato kao magnetno rezonantno snimanje, MRI), kao što su jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, mangan ili gvožđe. Radioizotopi mogu da budu ugrađeni u konjugat na poznate načine kao što je opisano, npr., kod Reilly, "The radiochemistry of monoclonal antibodies and peptides," in Monoclonal Antibody and Peptide-Targeted Radiotherapy of Cancer, R.M. Reilly, ed., Wiley, Hoboken N.J., 2010.

[0300] Antitela predmetnog pronalaska mogu da budu konjugovana ili rekombinantno fuzionisana za dijagnostički, detektabilni ili terapijski agens ili bilo koji drugi molekul.

1

Konjugovana ili rekombinantno fuzionisana antitela mogu da budu korisna, na primer, za praćenje ili prognoziranje početka, razvoja, progresije i/ili ozbiljnosti beta-kloto-posredovane bolesti kao deo procedure kliničkog ispitivanja, kao što je određivanje efikasnosti određene terapije.

[0301] Takva dijagnostika i detekcija može da se ostvari, na primer, kuplovanjem antitela sa detektabilnim supstancama uključujući, ali bez ograničenja, različite enzime, kao što su, ali bez ograničenja, peroksidaza rena, alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza, ili acetilholinesteraza; prostetičke grupe, kao što su, ali bez ograničenja, streptavidin/biotin i avidin/biotin; fluorescentne materijale, kao što su, ali bez ograničenja, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijnat, rodamine, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; luminescentne materijale, kao što su, ali bez ograničenja, luminol; bioluminescentne materijale, kao što su, ali bez ograničenja, luciferaza, luciferin, i aekvorin; hemiluminescentne materijale, kao što su, ali bez ograničenja, jedinjenja na bazi akridinijuma ili HALOTAG; radioaktivne materijale, kao što su, ali bez ograničenja, jod (<131>I,<125>I,<123>I, i<121>I,), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<115>In,<113>In,<112>In, i<111>In,), tehnecijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn i<117>Sn; i metale koji emituju pozitrone upotrebom različitih pozitronskih emisionih tomografija, i neradioaktivne paramagnetne metalne jone.

[0302] Ovde su obezbeđena i antitela predmetnog pronalaska koja su konjugovana ili rekombinantno fuzionisana sa terapijskim fragmentom (ili jednim ili više terapijskih fragmenata), kao i njihove upotrebe. Antitelo može da bude konjugovano ili rekombinantno fuzionisana sa terapijskim fragmentom, uključujući citotoksin kao što je citostatički ili citocidni agens, terapijskim agensom ili radioaktivnim metalnim jonom kao što su alfa-emiteri. Citotoksin ili citotoksični agens uključuje bilo koji agens koji je štetan za ćelije.

[0303] Dalje, antitelo predmetnog pronalaska može da bude konjugovano ili rekombinantno fuzionisano sa terapijskim fragmentom ili fragmentom leka koji modifikuje dati biološki odgovor. Terapijske fragmente ili fragmente leka ne treba posmatrati kao ograničene na klasične hemijske terapijske agense. Na primer, fragment leka može da bude protein, peptid, ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, toksin kao što su abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, toksin kolere, ili toksin difterije; protein kao što su faktor nekroze tumora, γ-interferon, α-interferon, faktor rasta nerava, faktor rasta poreklom iz trombocita, tkivni aktivator plazminogena, apoptotski agens, npr., TNF-γ, TNF-γ, AIM I (videti, npr., međunarodnu objavu br. WO 97/33899), AIM II (videti, npr., međunarodnu objavu

1

br. WO 97/34911), Fas Ligand (videti, npr., Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567-1574), i VEGF (videti, npr., međunarodnu objavu br. WO 99/23105), anti-angiogeni agens, uključujući, na primer angiostatin, endostatin ili komponentu puta koagulacije (npr., tkivni faktor); ili, modifikator biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokin (npr., interferon gama, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-5 ("IL-5"), interleukin-6 ("IL-6"), interleukin-7 ("IL-7"), interleukin 9 ("IL-9"), interleukin-10 ("IL-10"), interleukin-12 ("IL-12"), interleukin-15 ("IL-15"), interleukin-23 ("IL-23"), faktor stimulacije granulocitno-makrofagnih kolonija ("GM-CSF"), i faktor stimulacije granulocitnih kolonija ("G-CSF")), ili faktor rasta (npr., hormon rasta ("GH")), ili koagulacioni agens (npr., kalcijum, vitamin K, tkivni faktori, kao što su, ali bez ograničenja, faktor Hagemana (faktor XII), visokomolekularni kininogen (HMWK), prekalikrein (PK), koagulacioni proteini-faktori II (protrombin), faktor V, XIIa, VIII, XIIIa, XI, Xla, IX, IXa, X, fosfolipid, i fibrinski monomer).

[0304] U ovom dokumentu obezbeđena su i antitela predmetnog pronalaska koja su rekombinantno fuzionisana ili hemijski konjugovana (kovalentne ili nekovalentne konjugacije) sa heterologim proteinom ili polipeptidom (ili njegovim fragmentom, na primer, sa polipeptidom od oko 10, oko 20, oko 30, oko 40, oko 50, oko 60, oko 70, oko 80, oko 90 ili oko 100 aminokiselina) da bi se generisali fuzioni proteini, kao i njihove upotrebe. Konkretno, ovde su obezbeđeni fuzioni proteini koji sadrže antigen-vezujući fragment antitela predmetnog pronalaska (npr., Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, F(ab)2fragment, VH domen, VH CDR, VL domen ili VL CDR) i heterologi protein, polipeptid, ili peptid. Heterologi protein, polipeptid, ili peptid sa kojim je antitelo fuzionisano može da bude koristan za usmeravanje antitela ka određenoj vrsti ćelija, kao što ćelija koja eksprimira beta-kloto ili beta-kloto receptor. Na primer, antitelo koje se vezuje za receptor ćelijske površine koji eksprimira određeni ćelijski tip (npr., imuna ćelija) može da bude fuzionisan ili konjugovan sa modifikovanim antitelom kao što je ovde opisano.

[0305] Pored toga, antitelo predmetnog pronalaska može da bude konjugovano sa terapijskim fragmentima kao što je radioaktivni metalni jon, kao što su alfa-emiteri kao što su<213>Bi ili makrociklični helatori korisni za konjugovanje radiometalnih jona, uključujući, ali bez ograničenja,<131>In,<131>LU,<131>Y,<131>Ho,<131>Sm, sa polipeptidima. Makrociklični helator može da bude 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N",N'''-tetrasirćetna kiselina (DOTA) koja može da bude vezana za antitelo preko linkerskog molekula. Takav linkerski molekuli su uobičajeno poznati u stanju tehnike i opisani, na primer, u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res.

4(10):2483-90; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10(4):553-7; i Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol.26(8):943-50.

1

[0306] Osim toga, antitela predmetnog pronalaska mogu da budu fuzionisana sa sekvencama markera ili "oznake", kao što je peptid, da bi se olakšalo prečišćavanje. Aminokiselina sekvenca markera ili oznake može da bude heksahistidinski peptid, kao što je oznaka obezbeđena u pQE vektoru (videti, npr., QIAGEN, Inc.), između ostalog, od kojih su mnogi komercijalno dostupni. Na primer, kao što je opisano kod Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824, heksahistidin omogućava pogodno prečišćavanje fuzionog proteina. Druge peptidne oznake korisne za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničene na hemaglutininsku ("HA") oznaku, koja odgovara epitopu koji potiče od proteina hemaglutinina influence (Wilson et al., 1984, Cell 37:767), i oznaku "FLAG".

[0307] Postupci za fuzionisanje ili konjugovanje terapijskih fragmenata (uključujući polipeptide) sa antitelima su dobro poznati, (videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58; SAD pat. br.5,336,603, 5,622,929, 5,359,046, 5,349,053, 5,447,851, 5,723,125, 5,783,181, 5,908,626, 5,844,095, i 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; EP 394,827; PCT objave WO 91/06570, WO 96/04388, WO 96/22024, WO 97/34631, i WO 99/04813; Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10535-10539, 1991; Traunecker et al., Nature, 331:84-86, 1988; Zheng et al., J. Immunol., 154:5590-5600, 1995; Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11337-11341, 1992).

[0308] Fuzioni proteini mogu da se generišu, na primer, tehnikama pregrupisanja gena, pregrupisanja motiva, pregrupisanja egzona, i/ili pregrupisanja kodona (zajednički označenim kao "pregrupisanje DNK"). Pregrupisanje DNK može da se koristi za promenu aktivnosti antibeta-kloto antitela kao što je ovde opisano, uključujući, na primer, antitela sa višim afinitetima i nižim brzinama disocijacije (videti, npr., SAD patente br. 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5,834,252, i 5,837,458; Patten et al., 1997, Curr. Opinion Biotechnol.8:724-33; Harayama, 1998, Trends Biotechnol. 16(2):76-82; Hansson et al., 1999, J. Mol. Biol. 287:265-76; i Lorenzo and Blasco, 1998, Biotechniques 24(2):308- 313). Antitela, ili kodirana antitela, mogu da budu izmenjena podvrgavanjem nasumičnoj mutagenezi pomoću PCR tehnike sklone greškama,

1 1

nasumične nukleotidne insercije ili drugih metoda pre rekombinacije. Polinukleotid koji kodira ovde obezbeđeno antitelo može da bude rekombinovan sa jednom ili više komponenata, motiva, odeljaka, delova, domeni, fragmenata, itd. jednog ili više heterologih molekula.

[0309] Obezbeđeno antitelo predmetnog pronalaska može takođe da bude konjugovano sa drugim antitelom da bi se obrazovao heterokonjugat antitela kao što je opisano, na primer, u SAD patentu br.4,676,980.

[0310] Terapijski fragment ili lek konjugovan ili rekombinantno fuzionisan sa antitelom predmetnog pronalaska koje se vezuje za beta-kloto (npr., polipeptid beta-kloto, fragment, epitop) treba da bude odabran tako da se postigne željeno profilaktičko ili terapijsko dejstvo/dejstva. Antitelo može da bude modifikovano antitelo. Kliničar ili drugo medicinsko osoblje može da razmotri, na primer, sledeće, kada odlučuje o tome koji terapijski fragment ili lek treba da se konjuguje ili rekombinantno fuzioniše sa ovde obezbeđenim antitelom: prirodu bolesti, ozbiljnost bolesti, i stanje subjekta.

[0311] Antitela koji se vezuju za beta-kloto koja su ovde obezbeđena mogu takođe da budu vezana za čvrste podloge, koje su posebno korisne za imunoeseje ili prečišćavanje ciljnog antigena. Takve čvrste podloge uključuju, ali nisu ograničene na staklo, celulozu, poliakrilamid, najlon, polistiren, polivinil hlorid ili polipropilen.

[0312] Linker može da bude "odvojivi linker" koji olakšava oslobađanje konjugovanog agensa u ćeliji, ali su ovde obuhvaćeni i neodvojivi linkeri. Linkeri za upotrebu u konjugatima predmetnog otkrića uključuju bez ograničenja linkere nestabilne pod uticajem kiselina (npr., hidrazonske linkere), linkere koji sadrže disulfid, linkere osetljive na peptidazu (npr., peptidne linkere koji sadrži aminokiseline, na primer, valin i/ili citrulin kao što su citrulinvalin ili fenilalanin-lizin), fotolabilne linkere, dimetil linkere (videti, npr., Chari et al., Cancer Research 52:127-131 (1992); SAD patent br. 5,208,020), tioetarske linkere, ili hidrofilne linkere dizajnirane da izbegnu višestruku rezistenciju na lekove posredovanu transporterima (videti, npr. Kovtun et al., Cancer Res.70: 2528-2537, 2010).

[0313] Konjugati antitela i agensa mogu da budu napravljeni upotrebom raznih bifunkcionalnih protein-kuplujućih agenasa kao što su BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat). Predmetno otkriće dalje podrazumeva da konjugati antitela i agenasa mogu da se pripreme upotrebom pogodnih metoda kao što je opisano u stanju tehnike, (videti, npr., u Bioconjugate Techniques, 2nd Ed., G.T. Hermanson, ed., Elsevier, San Francisco, 2008).

1 2

[0314] Uobičajene strategije konjugacije za antitela i agense zasnivaju se na hemijama nasumične konjugacije koje uključuju ε-amino grupu Lys rezidua ili tiol grupu Cys rezidua, koje rezultuju heterogenim konjugatima. Nedavno razvijene tehnike omogućavaju mesto-specifičnu konjugaciju sa antitelima, koja rezultuje homogenim konjugatima i izbegavanjem subpopulacija konjugata sa izmenjenim vezivanjem antigena ili farmakokinetikom. Ove tehnike uključuju konstruisanje "tiomonoklonskih antitela" koja sadrže supstitucije aminokiselinskih ostataka cisteina teškog i lakog lanca na pozicijama koje obezbeđuju reaktivne tiolske grupe i ne ometaju savijanje i sklapanje imunoglobulina ili ne menjaju vezivanje antigena (videti, npr., Junutula et al., J. Immunol. Meth.332: 41-52 (2008); Junutula et al., Nat. Biotechnol.26: 925-932, 2008). U drugom postupku, selenocistein se kotranslatorno insertuje u sekvencu antitela menjanjem funkcije stop kodona UGA iz terminacije transkripcije u inserciju selenocisteina, čime se omogućava mesto-specifična kovalentna konjugacija na nukleofilnoj selenol grupi selenocisteina u prisustvu drugih prirodnih aminokiselina (videti, npr.,Hofer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 12451-12456 (2008); Hofer et al., Biochemistry 48(50): 12047-12057, 2009).

Farmaceutske formulacije

[0315] Anti-beta-kloto antitela predmetnog otkrića mogu da se primene bilo kojim putem koji je pogodan za stanje koje treba da se leči. Antitelo će tipično biti primenjeno parenteralno, na primer, infuzijom, subkutano, intramuskularno, intravenski, intradermalno, intratekalno i epiduralno. Doza antitela će varirati u zavisnosti od prirode i/ili ozbiljnosti bolesti, kao i od stanja subjekta, doze mogu da uključuju između 1 mg i 100 mg. Doze mogu takođe da uključuju one između 1 mg/kg i 15 mg/kg. Doza može da bude između oko 5 mg/kg i oko 7.5 mg/kg. Doza može da bude oko 5 mg/kg. Doza može da bude oko 7.5 mg/kg. Fiksne doze su odabrane iz grupe koja se sastoji od: (a) 375-400 mg svake dve nedelje i (b) 550-600 mg svake tri nedelje. Fiksna doza može da bude 375-400 mg svake dve nedelje. Fiksna doza može da bude 550-600 mg svake tri nedelje. Fiksna doza može da bude 400 mg svake dve nedelje. Fiksna doza može da bude 600 mg svake tri nedelje. Tokom sekvencijalnog doziranja, prva doza i druga doza mogu da budu svaka između 1 mg/kg i 15 mg/kg pri čemu se druga doza uvodi između 1 i 4 nedelje posle prve doze. Prva doza i druga doza mogu da budu svaka između 5 mg/kg i 7.5 mg/kg i druga doza se uvodi između 2 i 3 nedelje posle prve doze. Prva doza i druga doza mogu da budu svaka 5 mg/kg, i druga doza sledi 2 nedelje posle prve doze. Prva doza i druga doza mogu da budu svaka 7.5 mg/kg, i druga doza sledi 3 nedelje posle prve doze.

[0316] Za lečenje bolesti, poremećaja i stanja, antitelo može da se primeni putem intravenske infuzije. Doza primenjena infuzijom je u opsegu od oko 1 µg/m<2>do oko 10,000 µg/m<2>po dozi,

1

uopšteno jedna doza nedeljno, ukupno jedna, dve, tri ili četiri doze. Alternativno, dozni opseg je od oko 1 µg/m<2>do oko 1000 µg/m<2>, oko 1 µg/m<2>do oko 800 µg/m<2>, oko 1 µg/m<2>do oko 600 µg/m<2>, oko 1 µg/m<2>do oko 400 µg/m<2>; alternativno, oko 10 µg/m<2>do oko 500 µg/m<2>, oko 10 µg/m<2>do oko 300 µg/m<2>, oko 10 µg/m<2>do oko 200 µg/m<2>, i oko 1 µg/m<2>do oko 200 µg/m<2>. Doza može da bude primenjena jednom dnevno, jednom nedeljno, više puta nedeljno, ali manje od jednom dnevno, više puta mesečno, ali manje od jednom dnevno, više puta mesečno, ali manje od jednom nedeljno, jednom mesečno ili povremeno za oslobađanje ili olakšavanje simptoma bolesti, poremećaja, ili stanja. Primena može da se nastavi u bilo kom od opisanih intervala do poboljšanja bolesti, poremećaja ili stanja, ili ublažavanja simptoma bolesti, poremećaja ili stanja koje se leči. Primena može da se nastavi posle postizanja remisije ili ublažavanja simptoma kada se takva remisija ili ublažavanje produžava takvim nastavljanjem primene.

[0317] U jednom aspektu, predmetno otkriće dalje obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže najmanje jedno anti-beta-kloto antitelo predmetnog pronalaska. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska formulacija sadrži 1) anti-beta-kloto antitelo predmetnog pronalaska, i 2) farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska formulacija može takođe da sadrži 1) anti-betakloto antitelo predmetnog pronalaska i/ili njegov imunokonjugat, i opciono, 2) najmanje jedan dodatni terapijski agens.

[0318] Farmaceutske formulacije koje sadrže antitelo pripremaju se za skladištenje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće sa opcionim fiziološki prihvatljivim nosačem, ekscipijensima ili stabilizatorima (videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) u obliku vodenih rastvora ili liofilizovanih ili drugih suvih formulacija. Formulacije u ovom dokumentu mogu takođe da sadrže više od jednog aktivnog jedinjenja ako je neophodno za konkretnu indikaciju koja se leči, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koja ne utiču negativno jedna na druga. Na primer, pored anti-beta-kloto antitela, može da bude poželjno da u formulaciju bude uključeno dodatno antitelo, npr., drugo anti-betakloto antitelo koje vezuje drugačiji epitop na polipeptidu beta-kloto, ili antitelo protiv nekog drugog ciljnog molekula. Alternativno, ili dodatno, kompozicija može dalje da sadrži još jedan agens, uključujući, na primer, hemoterapijski agens, citotoksični agens, citokin, agens inhibicije rasta, anti-hormonalni agens, i/ili kardioprotektant. Formulacija može da uključuje alkilirajući agens (npr., hlorambucil, bendamustin hidrohlorid ili ciklofosfamid) nukleozidni analog (npr., fludurabin, pentostatin, kladribin ili citarabin) kortikosteroid (npr., prednizon, prednizolon ili metilprednizolon), imunomodulatorni agens (npr., lenalidomid), antibiotik (npr., dokksorubicin, daunorubicin idarubicin ili mitoksentron), sintetski flavon

1 4

(npr., flavopiridol), Bcl2 antagonist, (npr., oblimersen ili ABT-263), hipometilacioni agens (npr., azacitidin ili decitabin), inhibitor FLT3 (npr., midostaurin, sorafenib i AC220). Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za namenjenu svrhu.

[0319] Antitela predmetnog otkrića mogu da budu formulisana u bilo kom obliku pogodnom za isporuku u ciljnu ćeliju/tkivo, npr., kao mikrokapsule ili makroemulzije (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980); Park et al., Molecules 10: 146-161 (2005); Malik et al., Curr. Drug. Deliv. 4: 141-151 (2007)); kao formulacije sa produženim oslobađanjem (Putney and Burke, Nature Biotechnol. 16: 153-157, (1998)) ili u lipozomima (Maclean et al., Int. J. Oncol.11: 235-332 (1997); Kontermann, Curr. Opin. Mol. Ther.8: 39-45 (2006)).

[0320] Ovde obezbeđeno antitelo može takođe da bude okruženo mikrokapsulom pripremljenom, na primer, tehnikama koacervacije ili međufazne polimerizacije, na primer, mikrokapsula od hidroksimetilceluloze ili želatina i poli-(metilmetakrilata), redom, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike opisane su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.

[0321] Poznati su razni sistemi za isporuku i oni mogu da se koriste za davanje profilaktičkog ili terapijskog agensa (npr., antitelo koje se vezuje za beta-kloto kao što je ovde opisano), uključujući, ali bez ograničenja, inkapsulaciju u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju antitelo, endocitozu posredovanu receptorom (videti, npr., Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), konstrukciju nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Profilaktički ili terapijski agens, ili kompozicija kao što je ovde opisano može da bude isporučena u sistemu sa kontrolisanim ili produženim oslobađanjem. Za postizanje kontrolisanog ili produženog oslobađanja može da se koristi pumpa (videti, npr., Langer, iznad; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.

14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Polimerni materijali mogu da se koriste za postizanje kontrolisanog ili produženog oslobađanja profilaktičkog ili terapijskog agensa (npr., antitela koje se vezuje za beta-kloto kao što je ovde opisano) ili kompozicije pronalaska (videti, npr., Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; videti takođe Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); SAD patent br. 5,679,377; SAD patent br. 5,916,597; SAD

1

patent br. 5,912,015; SAD patent br. 5,989,463; SAD patent br. 5,128,326; PCT objavu br. WO 99/15154; i PCT objavu br. WO 99/20253). Primeri polimera koji se koriste u formulacijama sa produženim oslobađanjem uključuju, ali nisu ograničeni na, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilnu kiselinu), poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(metakrilnu kiselinu), poliglikolide (PLG), polianhidride, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilen glikol), polilaktide (PLA), poli(laktid-ko-glikolide) (PLGA) i poliortoestre. Polimer koji se koristi u formulaciji sa produženim oslobađanjem može da bude inertan, bez nečistoća koje se ispiraju, stabilan pri skladištenju, sterilan i biorazgradiv.

[0322] Sistem sa kontrolisanim ili produženim oslobađanjem može da bude postavljen u blizini terapijskog cilja, na primer, nazalnih puteva ili pluća, zahtevajući stoga samo deo sistemske doze (videti, npr., Goodson, u Medical Applications of Controlled Release, iznad, vol. 2, pp.115-138 (1984)). Sistemi sa kontrolisanim oslobađanjem razmatraju se, na primer, kod Langer (1990, Science 249:1527-1533). Bilo koja tehnika poznata stručnjaku u oblasti može da se koristi za proizvodnju formulacija sa produženim oslobađanjem koje sadrže jedno ili više antitela koja se vezuju za beta-kloto kao što je ovde opisano. (Videti, npr., SAD patent br. 4,526,938, PCT objavu WO 91/05548, PCT objavu WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179- 189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.24:853-854, i Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759-760).

Terapijski postupci

[0323] Antitelo predmetnog otkrića može da se koristi, na primer, u in vitro, ex vivo, i in vivo terapijskim postupcima. U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje antitela za upotrebu u postupcima za lečenje ili prevenciju bolesti, poremećaja, ili stanja, in vivo ili in vitro, pri čemu postupak obuhvata izlaganje ćelije anti-beta-kloto antitelu.

[0324] U jednom aspektu, antitelo predmetnog otkrića koristi se za lečenje ili prevenciju bolesti, poremećaja, ili stanja, uključujući, na primer, dijabetes tipa 2, gojaznost, dislipidemiju, NASH, kardiovaskularnu bolest, metabolički sindrom ili uopšteno bilo koju bolest, poremećaj, ili stanje kod koga je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju.

1

[0325] U jednom aspektu, antitela za upotrebu u postupcima su obezbeđena za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja koje obuhvata primenu kod osobe efikasne količine anti-beta-kloto antitela ili njegovog fragmenta. Upotreba antitela u postupku za lečenje bolesti, poremećaja, ili stanja obuhvata primenu kod osobe efikasne količine farmaceutske formulacije koja sadrži anti-betakloto antitelo predmetnog pronalaska i, opciono, najmanje jedan dodatni terapijski agens, kao što su oni koji su ovde opisani.

[0326] Anti-beta-kloto antitelo ili njegov fragment može da se primeni kod čoveka u terapijske svrhe. Osim toga, anti-beta-kloto antitelo ili njegov fragment može da se primeni kod sisara koji nije čovek koji eksprimira beta-kloto sa kojim antitelo unakrsno reaguje (npr., primat, svinja, pacov, ili miš) u veterinarske svrhe ili kao životinjskog modela za humanu bolest. U pogledu poslednjeg, takvi životinjski modeli mogu da budu korisni za procenu terapijske efikasnosti antitela predmetnog otkrića (npr., ispitivanje doza i vremenskog toka primene).

[0327] Antitela predmetnog pronalaska mogu da se koriste sama ili u kombinaciji sa drugim kompozicijama u terapiji. Na primer, anti-beta-kloto antitelo predmetnog pronalaska mogu da se primene zajedno sa najmanje jednim dodatnim terapijskim agensom i/ili adjuvansom. U nekim primerima izvođenja, dodatno jedinjenje je terapijsko antitelo drugačije od anti-beta-kloto antitela.

[0328] Takve kombinovane terapije navedene iznad obuhvataju kombinovanu primenu (kada su dva ili više terapijskih agenasa uključena u istu ili posebne formulacije), i odvojenu primenu, u kom slučaju, primena anti-beta-kloto antitela ili njegovog fragmenta predmetnog otkrića može da se odvija pre, istovremeno, i/ili posle, primene dodatnog terapijskog agensa i/ili adjuvansa. Antitela predmetnog otkrića mogu takođe da se koriste u kombinaciji sa dodatnim terapijskim režimima uključujući, bez ograničenja, one koji su ovde opisani.

[0329] Antitelo predmetnog otkrića (i bilo koji dodatni terapijski agens ili adjuvans) može da se primeni na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralnu, subkutanu, intraperitonealnu, intrapulmonalnu i intranazalnu, i, ako je poželjno lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijalnu, intraperitonealnu, ili subkutanu primenu. Pored toga, antitelo ili konjugat se pogodno primenjuje pulsnom infuzijom, posebno sa opadajućim dozama antitela ili njegovog fragmenta. Doziranje može da se sprovede bilo kojim pogodnim putem, na primer, injekcijama, kao što su intravenske ili subkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična.

[0330] Antitela predmetnog otkrića biće formulisana, dozirana, i primenjena na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koji se razmatraju u ovom kontekstu uključuju konkretan poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog

1

pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, način primene, raspored primene, i druge faktore poznate medicinskim radnicima. Anti-beta-kloto antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste za prevenciju ili lečenje poremećaja koji je u pitanju. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela ili imunokonjugata prisutne u formulaciji, vrste poremećaja ili tretmana, i drugih faktora koji su gore razmatrani. Oni se uglavnom koriste u istim dozama i istim putevima primene kao što je ovde opisano, ili oko od 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i bilo kojim putem koji se empirijski/klinički odredi kao pogodan.

[0331] Za prevenciju ili lečenje bolesti, poremećaja, ili stanja, odgovarajuće doziranje anti-betakloto antitela predmetnog otkrića (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapijskih agenasa, kao što su agensi koji su ovde opisani) zavisiće od vrste bolesti, poremećaja, ili stanja, koje treba da se leči, vrste antitela, ozbiljnosti i toka bolesti, poremećaja, ili stanja, od toga da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapijske svrhe, prethodne terapije, kliničke anamneze pacijenta i odgovora na antitelo, i diskrecionog prava nadležnog lekara. Antibeta-kloto antitelo se pogodno primenjuje kod pacijenta odjednom ili tokom serije tretmana. U zavisnosti od vrste i ozbiljnosti bolesti, oko 1 µg/kg do 100 mg/kg (npr., 0.1 mg/kg-20 mg/kg, 1 mg/kg-15 mg/kg, itd.) antitela može da bude kandidat za početnu dozu za primenu kod pacijenta, bilo, na primer, u jednoj ili više odvojenih primena, ili kontinuiranom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može da varira od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se obično produžava sve dok se ne pojavi željeno suzbijanje simptoma bolesti. Primeri doza antitela mogu da budu u opsegu od oko 0.05 mg/kg do oko 10.0 mg/kg. Prema tome, jedna ili više doza od oko 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 6.0 mg/kg, 7.0 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9.0 mg/kg, ili 10.0 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) antitela može da se primeni kod pacijenta. Takve doze mogu da se daju sa prekidima, npr., svake nedelje ili na svake tri nedelje (npr., tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr., oko šest doza antitela). Može da se primeni početna viša udarna doza, praćena jednom ili većim brojem nižih doza. Primer doznog režima obuhvata primenu početne udarne doze, praćene dozom za održavanje (npr., nedeljno) antitela. Početna udarna doza može da bude veća od doze za održavanje. Međutim, i drugi dozni režimi mogu da budu korisni. Napredak ove terapije lako se prati uobičajenim tehnikama i testovima.

Dijagnostički postupci i postupci za detekciju

1

[0332] U jednom aspektu, anti-beta-kloto antitela i njihovi fragmenti prema predmetnom otkriću korisni su za detekciju prisustva beta-kloto u biološkom uzorku. Takva anti-beta-kloto antitela mogu da uključuju ona koja se vezuju za beta-kloto čoveka ili cinomolgus majmuna, ali ne indukuju signalnu aktivnost sličnu onoj putem FGF19 i/ili sličnu onoj putem FGF21. Pojam "detektovanje", kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. Biološki uzorak može da sadrži ćeliju ili tkivo.

[0333] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za detekciju prisustva betakloto u biološkom uzorku. Postupak može da obuhvata dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa anti-beta-kloto antitelom pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-beta-kloto antitela sa beta-kloto, i detektovanje da li se formirao kompleks između anti-beta-kloto antitela i beta-kloto.

[0334] U jednom aspektu, predmetno otkriće obezbeđuje postupak za dijagnostikovanje poremećaja povezanog sa ekspresijom beta-kloto. Postupak može da obuhvata dovođenje u kontakt ispitivane ćelije sa anti-beta-kloto antitelom; određivanje nivoa ekspresije (kvantitativno ili kvalitativno) beta-kloto kod ispitivane ćelije detektovanjem vezivanja anti-beta-kloto antitela sa beta-kloto; i poređenje nivoa ekspresije beta-kloto kod ispitivane ćelije sa nivoom ekspresije beta-kloto kod kontrolne ćelije (npr., normalna ćelija poreklom iz istog tkiva kao ispitivana ćelija ili ćelija koja eksprimira beta-kloto na nivoima uporedivim sa onim kod normalne ćelije), pri čemu viši nivo ekspresije beta-kloto kod ispitivane ćelije u poređenju sa kontrolnom ćelijom ukazuje na prisustvo poremećaja povezanog sa povećanom ekspresijom beta-kloto. Ispitivana ćelija može da se dobije od osobe za koju se sumnja da ima bolest, poremećaj ili stanje povezano sa ekspresijom beta-kloto i/ili bolest, poremećaj ili stanje kod koga je poželjno da se in vivo dejstva FGF19 i/ili FGF21 oponašaju ili pojačaju. Bolest, poremećaj ili stanje mogu da budu, na primer, dijabetes tipa 2, gojaznost, dislipidemija, NASH, kardiovaskularna bolest ili metabolički sindrom. Takve bolesti, poremećaji ili stanja date kao primer, mogu da se dijagnostikuju upotrebom anti-beta-kloto antitelo predmetnog otkrića.

[0335] Postupak za dijagnostikovanje ili detektovanje, kao što su oni koji su gore opisani, može da obuhvata detekciju vezivanja anti-beta-kloto antitela sa beta-kloto eksprimiranim na površini ćelije ili u membranskom preparatu dobijenom iz ćelije koja eksprimira beta-kloto na svojoj površini. Postupak može da obuhvata dovođenje u kontakt ćelije sa anti-beta-kloto antitelom pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje anti-beta-kloto antitela sa beta-kloto, i utvrđivanje da li je došlo do formiranja kompleksa između anti-beta-kloto antitela i beta-kloto na površini ćelije. Primer testa za detektovanje vezivanja anti-beta-kloto antitela sa beta-kloto eksprimiranim na površini ćelije je "FACS" test.

1

[0336] Za detektovanje vezivanja anti-beta-kloto antitela sa beta-kloto mogu da se koriste i određeni drugi postupci. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na antigen-vezujuće testove koji su dobro poznati u stanju tehnike, kao što su western blotovi, radioimunoeseji, ELISA (enzimski vezan imunosorbentni test), "sendvič" imunološki testovi, imunoprecipitacioni testovi, fluorescentni imunološki testovi, imunološki testovi sa proteinom A i imunohistohemija (IHC).

[0337] Obeležena ati-beta-kloto antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na oznake ili fragmente koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektron-guste, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i fragmente, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, na primer, putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore kao što su retki zemljani helati ili fluorescein i njegove derivate, rodamin i njegove derivate, dansil, umbeliferon, luceriferaze, na primer, luciferazu svitaca i bakterijsku luciferazu (videti, npr., SAD pat. br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindione, peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, saharid oksidaze, npr., glukozo-oksidazu, galaktozo-oksidazu, i glukozo-6-fosfat dehidrogenazu, heterociklične oksidaze kao što su urikaza i ksantin oksidaza, kuplovane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje kao što je HRP, laktoperoksidaza, ili mikroperoksidaza, biotin/avidin, spin-oznake, bakteriofagne oznake, stabilne slobodne radikale, i slično.

[0338] Anti-beta-kloto antitela imobilizovana na nerastvorljivoj matrici. Imobilizacija podrazumeva razdvajanje anti-beta-kloto antitela od svog beta-kloto koji preostaje slobodan u rastvoru. Ovo se obično postiže pretvaranjem anti-beta-kloto antitela u nerastvorljivi oblik pre izvođenja procedure testa, na primer adsorpcijom na matricu ili površinu nerastvorljivu u vodi (videti, npr., Bennich et al., U.S.3,720,760), ili kovalentnim kuplovanjem (na primer, upotrebom umrežavanja glutaraldehidom), ili prevođenjem anti-beta-kloto antitela u nerastvorljivi oblik posle formiranja kompleksa između anti-beta-kloto antitela i beta-kloto, na primer, imunoprecipitacijom.

[0339] Bilo koji od gore navedenih postupaka za dijagnostikovanje ili detektovanje može da se izvede upotrebom imunokonjugata predmetnog otkrića umesto, ili pored anti-beta-kloto antitela.

Testovi

[0340] Fizička/hemijska svojstva i/ili biološke aktivnosti anti-beta-kloto antitela predmetnog otkrića mogu da se okarakterišu različitim testovima poznatim u stanju tehnike.

1. Testovi aktivnosti

1

[0341] U jednom aspektu, opisani su testovi za identifikovanje anti-beta-kloto antitela pronalaska koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može da uključuje, na primer, testove koji mere dejstva na glukozni i/ili lipidni metabolizam. Na primer, može da se koristi test za glukozu u krvi. Glukoza u krvi (npr., u uzorku dobijenom incizijom repa miša ili u uzorku krvi čoveka) može da se meri upotrebom ACCU-CHEK Test-trake Active očitavaju se pomoću uređaja ACCU-CHEK Active meter (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) prema uputstvima proizvođača. Pored toga, na primer, može da se koristi test za određivanje lipidnog profila. Puna krv (npr., iz uzorka dobijenog incizijom repa miša ili iz uzorka krvi čoveka) može da se sakupi u obične kapilarne epruvete (BD Clay Adams SurePrep, Becton Dickenson and Co. Sparks, MD). Serum i krvne ćelije mogu da se razdvoje centrifugiranjem epruveta u Autocrit Ultra 3 (Becton Dickinson and Co. Sparks, MD). U uzorcima seruma može da se odredi lipidni profil (trigliceridi, ukupni holesterol, HDL, i ne-HDL) upotrebom kliničkog analizatora Integra 400 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) prema uputstvima proizvođača.

2. Testovi vezivanja i drugi testovi

[0342] U jednom aspektu, ispituje se antigen-vezujuća aktivnost anti-beta-kloto antitela. Na primer, može da se ispita sposobnost anti-beta-kloto antitela da se veže za egzogeni ili endogeni beta-kloto eksprimiran na površini ćelije. Za takvo ispitivanje može da se koristi FACS test.

[0343] Panel monoklonskih antitela indukovanih protiv beta-kloto može da bude grupisan na osnovu epitiopa koje antitela prepoznaju, postupkom poznatim kao sortiranje na osnovu vezanog epitopa (binning-eng.). Sortiranje na osnovu vezanog epitopa se tipično sprovodi upotrebom testova kompeticije, koji ocenjuju sposobnost antitela da se vežu za antigen u prisustvu drugog antitela. U ilustrativnom testu kompeticije, imobilizovani beta-kloto se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo koje se vezuje za beta-kloto i drugo neobeleženo antitelo čija sposobnost da kompetira sa prvim antitelom za vezivanje za beta-kloto se ispituje. Drugo antitelo može da bude prisutno u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilizovani beta-kloto se inkubira u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, ali ne i drugo neobeleženo antitelo. Posle inkubacije pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje prvog antitela za beta-kloto, višak nevezanog antitela se uklanja, i količina oznake vezane za imobilizovani beta-kloto se meri. Ako je količina oznake povezane sa imobilizovanim beta-kloto suštinski redukovana u ispitivanom uzorku u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje na to da drugo antitelo kompetira sa prvim antitelom za vezivanje za beta-kloto. Imobilizovani beta-kloto je prisutan na površini ćelije ili u membranskom preparatu dobijenom iz ćelije koja eksprimira beta-kloto na svojoj površini.

1 1

[0344] Postupci visoke propusne moći za sortiranje na osnovu vezanog epitopa takođe su poznati u stanju tehnike (videti, npr., Jia et al., J. Immunol. Methods 2004, 288(1-2):91-98, koji opisuje postupak za multipleksno kompetitivno sortiranje antitela na osnovu vezanog epitopa za karakterizaciju monoklonskih antitela; i Miller et al., J. Immunol. Methods 2011, 365(1-2):118-25, koji opisuje sortiranje na osnovu vezanog epitopa mišjih monoklonskih antitela pomoću multipleksnog testa sparivanja).

3. Mapiranje epitopa

[0345] Mapiranje epitopa je postupak identifikacije mesta vezivanja, ili epitopa, antitela na njegovom ciljnom proteinskom antigenu. Epitopi antitela mogu da budu linearni epitopi ili konformacioni epitopi. Linearne epitope čini kontinuirana sekvenca aminokiselina u proteinu. Konformacione epitope formiraju aminokiseline koje imaju diskontinuiranu proteinsku sekvencu, ali koje su dovedene u blizak položaj nakon savijanja proteina u trodimenzionalnu strukturu.

[0346] Različiti postupci za mapiranje epitopa antitela na ciljnim proteinskim antigenima su poznati u stanju tehnike. Oni uključuju postupke mutageneze, postupke skeniranja peptida, postupke prikaza, postupke koji uključuju masenu spektroskopiju i određivanje strukture.

[0347] Postupak mesto-usmerene mutageneze uključuje ciljnu mesto-usmerenu mutagenezu kod koje se kritične aminokiseline identifikuju sistemskim uvođenjem supstitucija duž proteinske sekvence, a zatim određivanjem delovanja svake supstitucije na vezivanje antitela. Ovo može da se ostvari pomoću "alanin-skenirajuće mutageneze", kao što je opisano, na primer, kod Cunningham i Wells (1989) Science 244: 1081-1085, ili nekog drugog oblika tačkaste mutageneze aminokiselinskih rezidua u beta-kloto čoveka. Studije mutageneze, međutim, mogu takođe da otkriju aminokiselinske rezidue koje su ključne za ukupnu trodimenzionalnu strukturu beta-kloto, a koje nisu direktno uključene u kontakte antitelo-antigen, i stoga za potvrđivanje funkcionalnog epitopa određenog upotrebom ovog postupka mogu da budu neophodne druge metode.

[0348] Mapiranje upotrebom mutageneze metodom "genskog pištolja" zasniva se na opsežnoj biblioteci plazmida koji sadrže mutaciju ciljnog gena, pri čemu svaki klon u biblioteci nosi jedinstvenu aminokiselinsku mutaciju i cela biblioteka obuhvata svaku aminokiselinu u ciljnom proteinu. Klonovi koji čine biblioteku mutacija su pojedinačno raspoređeni na mikropločama, eksprimirani u živim sisarskim ćelijama, i imunoreaktivnost im je ispitana sa antitelima od interesa. Aminokiseline koje su ključne za epitope antitela identifikuju se preko gubitka reaktivnosti i zatim mapiraju na proteinsku strukturu za vizualizaciju epitopa. Automatizacijom analize, nove mape epitope mogu da se dobiju za nekoliko dana do nedelja. Budući da se koristi

1 2

nativna struktura proteina u sisarskim ćelijama, tehnika omogućava mapiranje linearnih, kao i konformacionih struktura epitopa na kompleksnim proteinima. (Videti, npr., Paes et al., J. Am. Chem. Soc. 131(20): 6952-6954 (2009); Banik i Doranz, Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28 (2010)).

[0349] Epitop vezan sa anti-beta-kloto antitelom može takođe da se odredi upotrebom postupaka skeniranja peptida. Kod skeniranja peptida, u bibliotekama kratkih peptidnih sekvenci preklapajućih segmenata ciljnog proteina, beta-kloto, ispituje se sposobnost vezivanja antitela od interes. Peptidi se sintetizuju i ispituje se njihovo vezivanje, npr., upotrebom testa ELISA ili BIACORE, ili na čipu, bilo kojom od raznih metoda za skeniranje na čvrstoj fazi (videti, npr., Reineke et al., Curr. Opin. Biotechnol. 12: 59-64, 2001) kao kod "Pepscan" metodologije (videti, npr., WO 84/03564; WO 93/09872). Takvi postupci za skeniranje peptida možda nisu u mogućnosti da detektuju neke diskontinuirane funkcionalne epitope, tj. funkcionalne epitope koji uključuju aminokiselinske rezidue koje nisu kontinuirane duž primarne sekvence lanca polipeptida beta-kloto.

[0350] Nedavno razvijena tehnologija nazvana CLIPS (hemijsko vezivanje peptida na skafolde) može da se koristi za mapiranje konformacionih epitopa. Slobodni krajevi peptida pričvršćuju se na sintetske skafolde, tako da peptid na skafoldu može da zauzme istu prostornu strukturu kao odgovarajuća sekvenca intaktnog proteina. CLIPS tehnologija se koristi za fiksiranje linearnih peptida u ciklične strukture (format 'jedne petlje'), kao i za kombinovanje različitih delova vezujućih mesta proteina (format 'dvostruke petlje', 'trostruke petlje', itd.), kako bi se stvorili konformacioni epitopi kod kojih može da se ispita vezivanje antitela (videti, npr., SAD pat. br.

7,972,993).

[0351] Epitopi vezani antitelima predmetnog otkrića mogu takođe da se mapiraju upotrebom tehnika prikaza, uključujući, na primer, fagni prikaz, mikrobni prikaz, i ribozomalni/iRNK prikaz, kao što je gore opisano. U ovim postupcima, biblioteke peptidnih fragmenata prikazuju se na površini faga ili ćelije. Epitopi se zatim mapiraju skriningom mAbs protiv ovih fragmenata upotrebom selektivnih testova vezivanja. Razvijeni su brojni kompjuterski alati koji omogućavaju predviđanje konformacionih epitopa na osnovu linearnih peptida selektovanih prema afinitetu dobijenih upotrebom fagnog prikaza (videti, npr.,Mayrose et al., Bioinformatics 23: 3244-3246 , 2007). Dostupni su i postupci za detekciju konformacionih epitopa pomoću fagnog prikaza. Sistemi mikrobnog prikaza mogu takođe da se koriste za eksprimiranje pravilno savijenih antigenih fragmenata na površini ćelije za identifikaciju konformacionih epitopa (videti, npr., Cochran et al., J. Immunol. Meth. 287: 147-158, 2004; Rockberg et al., Nature Methods 5: 1039-1045, 2008).

1

[0352] Postupci koji uključuju proteolizu i masenu spektroskopiju mogu takođe da se koriste za određivanje epitopa antitela (videti, npr., Baerga-Ortiz et al., Protein Sci. 2002 June; 11(6): 1300-1308). U ograničenoj proteolizi, antigen se cepa različitim proteazama, u prisustvu i u odsustvu antitela, i fragmenti se identifikuju masenom spektrometrijom. Epitop je region antigena koji postaje zaštićen od proteolize nakon vezivanja antitela (videti, npr., Suckau et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9848-9852, 1990). Dodatni postupci na bazi proteolize uključuju, na primer, selektivnu hemijsku modifikaciju (videti, npr., Fiedler et al., Bioconjugate Chemistry 1998, 9(2): 236-234, 1998), isecanje epitopa (videti, npr., Van de Water et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 1997, 85(3): 229-235, 1997), i nedavno razvijen postupak izmene vodonikdeuterijum (H/D) (videti, npr., Flanagan, N., Genetic Engineering and Biotechnology News 3(2): 25-28, 2010).

[0353] Epitop vezan antitelima predmetnog otkrića može takođe da se odredi pomoću strukturnih metoda, kao što su određivanje kristalne strukture rendgenskim zracima (videti, npr., WO 2005/044853), molekulsko modelovanje i spektroskopiju nuklearne magnetne rezonance (NMR), uključujući određivanje pomoću NMR brzina izmene H-D labilnih vodonika amidnih grupa u slobodnom obliku i obliku vezanom u kompleksu sa antitelom od interesa (videti, npr., Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31:11335-11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32:6884-6891).

[0354] Dodatna antitela koja se vezuju za isti epitop kao antitelo predmetnog otkrića mogu da se dobiju, na primer, skriningom antitela indukovanih protiv beta-kloto za vezivanje za epitop, imunizacijom životinje peptidom koji sadrži fragment humanog beta-kloto koji sadrži sekvencu epitopa, ili selekcijom antitela za vezivanje za sekvencu epitopa upotrebom fagnog prikaza. Može se očekivati da antitela koji se vezuju za isti funkcionalni epitop ispoljavaju slične biološke aktivnosti, kao što su blokiranje biološke aktivnosti beta-kloto, i takve aktivnosti mogu da se potvrde funkcionalnim ispitivanjem antitela.

Dodatni testovi za ispitivanje aktivnosti

[0355] Anti-beta-kloto antitelo predmetnog otkrića može da bude antagonističko antitelo koje ispoljava biološku aktivnost beta-kloto. Anti-beta-kloto antitela predmetnog otkrića mogu da se ispitaju da bi se odredilo da li inhibiraju biološku aktivnost beta-kloto.

[0356] U jednom aspektu, prečišćena anti-beta-kloto antitela mogu dodatno da se okarakterišu nizom testova uključujući, ali bez ograničenja, N-terminalno sekvenciranje, analizu aminokiselina, ekskluzionu tečnu hromatografiju visokog pritiska (HPLC) u nedenaturišućim uslovima, masenu spektrometriju, jonoizmenjivačku hromatografiju i digestiju papainom.

1 4

[0357] Predmetno otkriće obuhvata izmenjeno antitelo koje ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini poželjnim kandidatom za mnoge primene u kojima je polu život antitela in vivo važan, a u isto vreme, određene efektorske funkcije (kao što je citotoksičnost zavisna od komplementa i ADCC) su nepotrebne ili štetne. Aktivnosti Fc antitela mogu da se mere da bi se osiguralo da su zadržana samo poželjna svojstva. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti mogu da se sprovedu da bi se potvrdilo smanjenje/iscrpljivanje CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja sa receptorom Fc (FcR) mogu da se sprovedu da bi se osiguralo da antitelu nedostaje vezivanje FcγR (stoga mu verovatno nedostaje i ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. In vitro test za ocenu ADCC aktivnosti molekula od interesa opisan je, na primer, u SAD patentu br. 5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili prema tome, ADCC aktivnost molekula od interesa može da se oceni in vivo, na primer, u životinjskom modelu kao što su oni opisani kod Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Mogu da se sprovedu i testovi vezivanja C1q da bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i stoga mu nedostaje CDC aktivnost. Za procenu aktivacije komplementa, može da se sprovede CDC test, na primer, kao što je opisano kod Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Ispitivanje vezivanja FcRn i određivanje in vivo klirensa/polu života antitela može takođe da se obavi upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike.

PRIMERI

[0358] U nastavku su dati primeri postupaka i kompozicije predmetnog otkrića.

PRIMER 1: GENERISANJE ANTITELA PROTIV BETA-KLOTO

[0359] Antitela protiv beta-kloto generisana su, na primer, imunizacijom miševa (i) ćelijama koje eksprimiraju beta-kloto čoveka (HuKLB) i FGF receptor 1c (FGFRIc ili RIc) i (ii) pomoću HuKLB i beta-kloto proteina cinomolgus majmuna (cyno KLB).

[0360] Na primer, ćelije koje eksprimiraju beta-kloto pripremljene su na sledeći način. Ćelije 293EXPI (Invitrogen) su tranzijentno ko-transfekovane sekvencama nukleinske kiseline koja kodira varijantu FGFR1c sa mutacijom na aminokiselinskoj poziciji 623 (videti, npr., SEQ ID NO:308 ali sa mutacijom D623N) i HuKLB (SEQ ID NO:297). U ćelijama je analizirana ekspresija R1c i HuKLB odgovarajućim specifičnim antitelima FACS analizom. Ćelije su oprane 2 puta u PBS, staložene centrifugiranjem i zamrznute u pojedinačnim fiolama pri 6 x 10<7>ćelija za imunizaciju. Životinje 129/B6 su imunizovane pomoću 1 x 10<7>ćelija sa adjuvansima (Ribi, CpG, i PolylC). Životinjama je davana buster doza na svake 2 nedelje tokom vremena potrebnog

1

za indukciju pogodnog titra. Životinjama je davana buster doza sa HuKLB i CyKLB proteinom posle 4 buster doze 293EXPI ćelija koje prekomerno eksprimiraju R1c i HuKLB. Titrovi su određeni ELISA i FACS analizama. Suspenzije pojedinačnih ćelija limfocita dobijene su iz slezine i dreniranjem limfnih čvorova životinja sa odgovarajućim titrovima. Ćelije su fuzionisane sa SP2/0 ćelijama mijeloma u odnosu 1:2 pomoću elektrofuzije. Fuzionisane ćelije su zasejane pri 2.5 x 10<6>ćelija po ploči u 70 µL u dvadeset četiri ploče sa 384 bunarčića u prisustvu HAT selekcije. Posle 7 dana, 50 µL supernatanta je uklonjeno i zamenjeno svežim medijumom koji sadrži HAT. Posle 10-14 dana kultivacije, supernatanti su sakupljeni i podvrgnuti skriningu FACS analizom upotrebom 293EXPI ćelija koje prekomerno eksprimiraju R1c i HuKLB ili Biacore analizom upotrebom HuKLB proteina za potvrdu vezivanja. Pozitivni klonovi su dalje selektovani i podvrgnuti subkloniranju.

[0361] U prvoj kampanji imunizacija i fuzionisanja, najmanje 25-30 ploča sa 384 bunarčića je ispitano na vezivanje za HuKLB (npr., HuKLB protein i/ili ćelije koje eksprimiraju HuKLB). U drugoj kampanji imunizacija i fuzionisanja, ispitan je sličan broj ploča kao što je opisano za prvu kampanju. Hiljade klonova su ispitane i stotine klonova su selektovane za dodatno ispitivanje, uključujući testove vezivanja, afiniteta i specifičnosti epitopa kao što je opisano u primerima 2 i 3. Stotine supernatanta hibridoma su takođe ispitane u funkcionalnim testovima kao što je opisano u primerima 4 i 5, uključujući agonističku aktivnost sličnu ligandima FGF receptora FGF19 i/ili FGF21 (npr., aktivnost signalizacije slična FGF19 i/ili onoj kod FGF21).

PRIMER 2: SKRINING I SELEKCIJA ANTITELA PROTIV BETA-KLOTO

[0362] Antitela protiv beta-kloto generisana su iz hibridoma, na primer, kao što je opisano u primeru 1. Supernatanti hibridoma su podvrgnuti skriningu za određivanje vezivanja za betakloto (npr., beta-kloto čoveka ili cinomolgus majmuna) u testovima na bazi FACS i/ili Biacore analiza.

[0363] Na primer, posle 2 nedelje kultivacije, supernatanti hibridoma podvrgnuti su skriningu na monoklonska antitela koja se vezuju za beta-kloto čoveka pomoću skrininga vezivanja na bazi FACS analize. Ukratko, supernatanti hibridoma su ko-inkubirani sa ćelijama koje prekomerno eksprimiraju beta-kloto čoveka 30 minuta na 4°C. Posle pranja smešom PBS/1% BSA/0.1% azida, ćelije koje prekomerno eksprimiraju beta-kloto čoveka su ko-inkubirane sa obeleženim anti-mišjim Fc (Jackson Immunoresearch) 30 minuta na 4°C. Posle pranja smešom PBS/1% BSA/0.1% azida, ćelije su nanete na protočni citometar (FACS Calibur) i analizirane pomoću analitičkog programa za citometriju (FlowJo). Vezujuće antitelo je ono čiji je signal pomeren u odnosu na signal ćelija inkubiranih samo sa obeleženim anti-mišjim Fc.

1

[0364] Na primer, posle 2 nedelje kultivacije, supernatanti hibridoma su skenirani na prisustvo monoklonskih antitela koja se vezuju za beta-kloto čoveka pomoću skrininga vezivanja na bazi Biacore. Ukratko, antitelo protiv Fc miša (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) je imobilizovano na sve četiri protočne ćelije CM5 čipa upotrebom reagensa za kuplovanje amina (GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ). Supernatanti hibridoma su razblaženi tri puta puferom PBS-P (PBS koji sadrži 0.005% P20) i ubrizgavani tokom 30 sekundi na protočne ćelije 2, 3 i 4 za hvatanje antitela (protočna ćelija 1 upotrebljena je kao referentna). Ovo je praćeno kratkim ubrizgavanjem humanog beta-kloto (25 nM, R&D Systems, Minneapolis, MN) tokom 60 sekundi pri protoku od 30 µL/min za ispitivanje vezivanja za uhvaćeno antitelo na svakoj protočnoj ćeliji.

[0365] Iz dve kampanje imunizacije i fuzionisanja, kao što je opisano u primeru 1, ispitano je vezivanje supernatanta hibridoma iz pedeset-šezdeset ploča sa 384 bunarčića pomoću FACS i /ili Biacore testa. Iz ovih testova, identifikovano je približno 250 antitela kao ona koja se vezuju za beta-kloto čoveka. Ova antitela su prečišćena i nakon toga ispitan je njihov afinitet vezivanja za beta-kloto čoveka i beta-kloto cinomolgus majmuna pomoću Biacore testa, i njihova funkcionalna aktivnost pomoću reporterskog testa kao što je opisano u primeru 3.

[0366] U dodatnim testovima vezivanja/skrininga na bazi Biacore analize, mereni su afiniteti vezivanja antitela za beta-kloto čoveka i cinomolgus majmuna. Na primer, antitela su rangirana na osnovu svog afiniteta vezivanja za beta-kloto čoveka i beta-kloto cinomolgus majmuna merenjem KDniske rezolucije pomoću Biacore. Ukratko, antitelo protiv Fc miša (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) je imobilizovano na sve četiri protočne ćelije CM5 čipa upotrebom reagensa za kuplovanje amina (GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ). Prečišćena antitela su hvatana (∼100 RUs) na protočnim ćelijama 2, 3 i 4 upotrebom protočne ćelije 1 kao referentne. Ovo je praćeno ubrizgavanjem beta-kloto čoveka ili cinomolgus majmuna (25 nM u PBS-P puferu) pri brzini protoka od 70 µL/min i praćenjem kinetike vezivanja na 25°C.

[0367] Merenja afiniteta vezivanja su takođe urađena u dodatnim testovima na bazi Biacore. Na primer, merenja ravnotežne konstante disocijacije (KD) sprovedena su pomoću prečišćenih antitela da bi se procenilo njihovo vezivanje za beta-kloto čoveka i beta-kloto cinomolgus majmuna. Kao što je gore pomenuto, antitelo protiv Fc miša (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) je imobilizovano na sve četiri protočne ćelije CM5 čipa upotrebom reagensa za kuplovanje amina (GE Healthcare LifeSciences, Piscataway, NJ). Prečišćena antitela su hvatana (∼100 RUs) na protočnim ćelijama 2, 3 i 4 upotrebom protočne ćelije 1 kao referentne. Ovo je praćeno ubrizgavanjem različitih koncentracija beta-kloto čoveka ili cinomolgus majmuna (1.56 nM do

1

25 nM, dvostruka razblaženja u PBS-P puferu) pri brzini protoka od 70 µL/min i procenom kinetike vezivanja na 25°C.

[0368] Reprezentativni rezultati su prikazani kao KD(nM) vrednosti kao što je prikazano u tabeli 11 ispod.

Tabela 11

PRIMER 3: SKRINING I SELEKCIJA ANTITELA PROTIV BETA-KLOTO

[0369] Antitela koja su selektovana za vezivanje za beta-kloto, na primer, kao što je opisano u primeru 2, ocenjivana su u testovima kompetitivnog vezivanja i eksperimentima sortiranja prema vezanom epitopu.

[0370] Na primer, u testovima kompetitivnog vezivanja pomoću FACS analize, pripremljeni su standardi antitela koji su konjugovani sa fluorohromom upotrebom kompleta za obeležavanje antitela A488 ili A647 (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Titracija doze konjugovanih standarda antitela ocenjena je upotrebom ćelija koje prekomerno eksprimiraju HuKLB. Plato maksimalnog signala vezivanja antitela je EC=100 i pozadinski signal je EC=0. Kompeticija pomoću FACS analize sa fluorohromom obeleženim antitelom sprovedena je preinkubacijom ćelija koje prekomerno eksprimiraju HuKLB sa supernatantima hibridoma tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Bez pranja, dodat je standard antitela obeležen sa A488 ili A647 u koncentraciji od EC=10. Koncentracija EC=10 za pojedinačno antitelo određena je kao 10%

1

signala, primenom maksimalnog signala za 100% i pozadinskog signala za 0%. Posle 30 minuta na 4°C, ćelije su oprane i analizirane pomoću FACS. U ovim testovima, kompetitivno antitelo je ono čiji je signal uporediv sa signalom kompetitivnog antitela 5H23. Nekompetitivno antitelo je ono čiji signal je jednak signalu samo obeleženog antitela. Delimično kompetitivno antitelo je ono čiji signal ima vrednost između signala samo obeleženog antitela i pozadinskog signala. Smatra se da antitela koja pokazuju potpunu kompeticiju sa standardnim antitelom pripadaju istoj grupi.

[0371] U ilustrativnim eksperimentima kompetitivnog vezivanja pomoću FACS, antitelo 5H23 ili 3I13 upotrebljeno je ka standard antitela za pozitivnu kontrolu (kompetitivno antitelo) ili negativnu kontrolu (nekompetitivno antitelo), redom. Reprezentativni rezultati prikazani su u tabeli 12 ispod, prikazani kao srednji intenzitet fluorescencije (MFI). Pri tumačenju rezultata ovih eksperimenata, signal uporediv sa signalom samog obeleženog antitela odgovara nekompetitivnom antitelu, dok signal uporediv sa signalom kompeticije u prisustvu antitela 5H23 odgovara kompetitivnom antitelu.

Tabela 12

1

[0372] Da bi se dodatno procenila mesta vezivanja antitela protiv beta-kloto čoveka, eksperimenti kompeticije su takođe postavljeni pomoću sistema Biacore. Na primer, dva antitela su imobilizovana na dve protočne ćelije CM5 čipa. Kompleksi antitela protiv beta-kloto čoveka pripremljeni su sa različitim antitelima (koncentracija antitela je titrirana od 0.1-50 nM uz održavanje koncentracije beta-kloto konstantnom na 5 nM) u mikroploči sa 96 bunarčića i ubrizgani po površini antitela. Izmereni signal (jedinica odgovora, RU) grafički je prikazan naspram koncentracije rastvora antitela [nM]. Ako je antitelo u rastvoru prepoznalo isti epitop kao antitelo imobilizovano na površini čipa, tada se sa povećanjem koncentracije antitela u rastvoru zapaža opadanje RU (pokazujući kompeticiju za mesto vezivanja na beta-kloto). Međutim, ako je antitelo u rastvoru prepoznalo drugačiji epitop u odnosu na imobilizovano antitelo, zapaža se porast RU. U ovom drugom slučaju, kompleks antitelo-kloto je mogao da se veže za površinu sa imobilizovanim antitelom što dovodi do zapaženog porasta signala.

[0373] U ilustrativnim eksperimentima kompetitivnog vezivanja pomoću sistema Biacore, antitelo 5H23 je u kompeticiji sa sobom za vezivanje za HuKLB i dodatna antitela 1C17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4P5, 5C23, 5F7 i 1G19 su u kompeticiji sa 5H23. Ova antitela su označena kao članovi epitopske grupe antitela 5H23. Sekvence ovih antitela, srodnih po vezanom epitopu, su poravnate i prikazane na slikama 1 i 2. Slika 2 takođe prikazuje konzervativne aminokiselinske sekvence CDR regiona ovih srodnih antitela.

PRIMER 4: FUNKCIONALNI TESTOVI

[0374] Antitela protiv beta-kloto generisana, na primer, kao što je opisano u primeru 1, ispitana su za određivanje funkcionalne aktivnosti u testovima na bazi ćelija sa reporterskim genom.

[0375] Na primer, testovi na bazi ELK1-luciferaznog reporterskog gena, koji mere prenos signala FGFRIc/beta-kloto, sprovedeni su upotrebom tranzijentno transfekovanih ćelija HEK293, HEK293T, ili L6 (ATCC). Plazmidi za transfekovanje su se sastojali od dva reporterska plazmida Gal4-Elk1 i 5×UAS-Luc (Agilent Technologies PathDetect Elk1 trans-reporting system kat. br. 219005), i plazmida koji kodiraju beta-kloto čoveka (GeneCopoeia kat. br. EX-E1104-MO2) ili beta-kloto cinomolgus majmuna (beta-kloto cinomolgus majmuna) i humani FGFR1c (GeneCopoeia kat. br. EX-A0260-MO2). U ovim testovima, aktivacija rekombinantno eksprimiranog kompleksa receptor FGFR1 c/beta-kloto u ćelijama indukuje intracelularnu transdukciju signala, koja vodi fosforilaciji ERK, a zatim i Elk1. Posle fosforilacije Gal4-Elk1, Gal4-Elk1 se vezuje za region promotora 5×UAS i pokreće transkripciju reporterskog gena za luciferazu. Aktivnost luciferaze se zatim meri enzimskim testovima za luciferazu.

1

[0376] U ovim eksperimentima, gore pomenuta četiri plazmida (npr., 2 reporterska plazmida, beta-kloto, R1c) su transfekovana u sveže sakupljene ćelije u suspenziji upotrebom reagensa za transfekciju FuGene6 ili Fugene HD (Promega). Gustina ćelija i količina reagensa za transfekciju su optimizovani za svaki tip ćelija i svaku seriju Fugene. Odnos DNK beta-kloto i FGFR1c pri transfekciji je optimizovan za svaku ćelijsku liniju i varirao je od 6:1 do 27:1. Transfekovane ćelije su zasejane u ploče sa 96 bunarčića (30 000 ćelija/100 µL/ bunarčiću), ili ploče sa 384 bunarčića (7500 ćelija/25 µL/bunarčiću) u normalnom medijumu za rast. Posle inkubacije preko noći na 37°C, dodata su različita antitela protiv beta-kloto. Posle 6 časova inkubacije na 37°C sa antitelima, dodata je jednaka zapremina reagensa Bright-Glo (Promega) i luminescentni signal je očitan upotrebom čitača Enspire (Perkin Elmer).

[0377] Reprezentativni rezultati upotrebom beta-kloto čoveka i beta-kloto cinomolgus majmuna, transfekovanih u ćelije HEK 293, prikazani su kao EC50 vrednosti date u tabeli 13, odnosno tabeli 14, ispod.

Tabela 13

Tabela 14

1 1

[0378] Reprezentativni rezultati upotrebom beta-kloto čoveka, transfekovanog u ćelije L6, prikazani su kao EC50 vrednosti date u tabeli 15 ispod.

Tabela 15

[0379] Ćelijama L6 nedostaju endogeni receptori i često se koriste za ispitivanje specifičnosti antitela za različite podtipove tranfekovanih FGF receptora. Aktivacija receptora putem FGFR1c/beta-kloto signalizacije u odsustvu liganda (npr., FGF19 (npr., SEQ ID NO: 304) ili FGF21(npr., SEQ ID NO: 429)) pod dejstvom ilustrativnih anti-beta-kloto antitela prema predmetnom otkriću zapažena je u ćelijama L6 transfekovanim sa FGFR1 c (R1c), ali ne i u

1 2

ćelijama L6 transfekovanim sa FGFR2c (R2c), FGFR3c (R3c), ili FGFR4 (R4), dok je aktivacija u ćelijama L6 transfekovanim sa R1c, R2c, R3c i R4 zapažena pod dejstvom kontrolnog FGF19.

PRIMER 5: DODATNI FUNKCIONALNI TESTOVI

[0380] Antitela protiv beta-kloto generisana, na primer, kao što je opisano u primeru 1, ispitivana su da bi se odredila njihova funkcionalna aktivnost u testu na bazi ćelija, kao što je test na adipocitima, koji meri endogeni prenos signala koji uključuje FGFR1 c/beta-kloto. FGF19 ili FGF21 stimulišu fosforilaciju ERK, povećavaju preuzimanje glukoze i lipolizu u gajenim adipocitima. Adipociti se smatraju fiziološki relevantnim modelom za demonstriranje funkcionalne aktivnosti liganda receptora ili agonista antitela koji oponašaju funkciju liganda (npr., signalizaciju receptora pod dejstvom liganda).

[0381] Na primer, zamrznuti humani preadipociti (Lonza kat. br. PT-5005) su odmrznuti 1. dana, diferencirani 3. dana i održavani u medijumu za diferencijaciju oko dve nedelje pre eksperimenta (npr., zatim izgladnjivani 17. dana, i ispitivani 18. dana). Medijum za zasejavanje bio je 1:1 DMEM/F12K 10% FBS. Gustina ćelija pri zasejavanju bila je 25000 ćelija/100 µL/bunarčiću u ploči sa 96 bunarčića. Na dan 3, medijum je zamenjen medijumom za diferencijaciju humanih adipocita (Cell Applications Inc). Od tada nadalje, svež medijum za diferencijaciju dodavan je u ćelije svaka 2-3 dana. Na dan 17 (dan pre testa), ćelije su isprane dva puta i ostavljene u DMEM /0.1% BSA (Sigma kat. br. A3803 BSA bez esencijalnih masnih kiselina) preko noći. Sledećeg dana, dodat je svež medijum DMEM /0.1% BSA tokom 1 časa pre nego što su ćelije tretirane ispitivanim anti-beta-kloto antitelima tokom 15 minuta na 37°C. Komplet za test Cis-bio Cellul'erk (kat. br. 64ERKPEH) je upotrebljen za ispitivanje nivoa fosforilacije ERK prema protokolu proizvođača.

[0382] Reprezentativni rezultati dobijeni upotrebom humanih adipocita prikazani su kao EC50 vrednosti date u tabeli 16 ispod:

Tabela 16

1

PRIMER 6: KOMPETICIJA LIGANDA

[0383] Testovi kompeticije liganda (FGF19 ili FGF21) sprovedeni su da bi se ocenilo da li interakcija antitelo-beta-kloto čoveka utiče na vezivanje beta-kloto za njegov prirodni ligand, FGF19 ili FGF21.

[0384] Na primer, postavljeni su testovi kompeticije na bazi sistema Biacore u kojima su FGF19 (npr., SEQ ID NO: 304) ili FGF21 (npr., SEQ ID NO: 429) imobilizovani na protočnoj ćeliji (Fc2) CM5 čipa (upotrebom Fc1 kao referentne površine). Kompleksi beta-kloto čoveka-antitelo protiv beta-kloto pripremljeni su upotrebom ilustrativnih antitela predmetnog otkrića, kao što su 5H23 (npr., VH SEQ ID NO: 25 i VL SEQ ID NO: 26) ili humanizovanog antitela 5H23 (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276)). Na primer, koncentracije 5H23 i kontrolnog antitela su titrirane od 0.1-67 nM uz održavanje koncentracije beta-kloto konstantnom na 5 nM u mikroploči sa 96 bunarčića i ubrizgane na površinu sa FGF19. U drugom primeru, koncentracije humanizovanog 5H23 (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) su titrirane od 0.001-67 nM uz održavanje koncentracije beta-kloto konstantnom na 2.5 nM u mikroploči sa 96 bunarčića i ubrizgane na površinu sa FGF 21. Izmereni signal (jedinica odgovora, RU) grafički je prikazan naspram koncentracije rastvora antitela [nM]. Ako je antitelo u rastvoru prepoznalo isti epitop kao FGF19 ligand ili FGF21 ligand imobilizovan na površini čipa, tada se sa povećanjem koncentracije antitela u rastvoru zapaža opadanje RU, demonstrirajući kompeticiju sa FGF19 ligandom ili FGF21 ligandom za mesto vezivanja na beta-kloto. Međutim, ako je antitelo u rastvoru prepoznalo drugačiji epitop u odnosu na imobilizovani FGF19 ligand ili FGF21 ligand, zapaža se porast RU. U ovom drugom slučaju, kompleks antitelo-kloto je mogao da se veže za površinu sa imobilizovanim ligandom FGF19 ili

1 4

imobilizovanim ligandom FGF21 što vodi zapaženom porastu signala. U eksperimentalnim podacima prikazanim ispod u tabeli 17A, kontrolno antitelo je delimično kompetiralo sa FGF19 ligandom rezultujući značajnim smanjenjem RU signala, pri čemu 5H23 nije kompetiralo sa FGF19 ligandom za vezivanje za beta-kloto. U eksperimentalnim podacima prikazanim ispod u tabeli 17B, kontrolno antitelo je kompetiralo sa FGF21 ligandom rezultujući značajnim smanjenjem RU signala, pri čemu humanizovano antitelo 5H23 nije kompetiralo sa FGF21 ligandom za vezivanje za beta-kloto.

Tabela 17A

Tabela 17B

1

[0385] Budući da se 5H23 i humanizovano 5H23 antitelo vezuju za drugačiji epitop beta-kloto u poređenju sa endogenim ligandima, kao što su FGF19 i FGF21, sprovedeni su eksperimenti da bi se ispitalo da li postoje sinergistička dejstva između FGF21 i 5H23 ili humanizovanog 5H23 antitela. U testu sa reporterskim genom u HEK293 (videti, npr., primer 4), kombinacije FGF21 i humanizovanog 5H23 antitela (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) ispitivane su u molarnom odnosu 1:1 ili fiksiranjem koncentracije jednog i titriranjem koncentracije drugog. Nisu zapaženi dokazi o sinergističkim dejstvima; maksimalno dejstvo FGF21 nije pojačano pomoću humanizovanog 5H23 antitela, i obrnuto.

PRIMER 7: HUMANIZACIJA

[0386] Pripremljena su humanizovana anti-beta-kloto antitela, uključujući antitela selektovana kao što je opisano u primerima 1-6.

[0387] Za sekvenciranje su odabrana brojna anti-beta-kloto antitela i njihovi VH i VL regioni, uključujući CDR regione, prikazani su u tabelama 1-10 i na slikama 1 i 2. Ilustrativno anti-betakloto antitelo, 5H23, odabrano je za humanizaciju. Upotrebljeno je nekoliko postupaka za humanizaciju. Kod nekih od humanizovanih antitela, postupak za humanizaciju bio je empirijski i delimično zasnovan na strukturnim informacijama koje se odnose na varijabilne regione imunoglobulina uključujući molekulske modele i zahteve strukturne stabilnosti antitela (videti, npr., Ewert et al., 2004, Methods 34:184-199; Honegger, 2008, Handb. Exp. Pharmacol.

1

181:47-68; Kügler et al., 2009, Protein Eng. Des. Sel. 22: 135-147). Postupak se takođe delom zasnivao na rezultatima razmatranja rezidua koje dolaze u kontakt sa antigenom i/ili rezidua bitnih za stabilnost regiona okvira. Na primer, razmatranje tipičnih rezidua koje dolaze u kontakt sa antigenom zavisi od veličine antigena, posebno rezidua izvan CDR koje mogu da dođu u kontakt sa antigenom, odeljka oblasti gornjeg jezgra, centralnog jezgra i donjeg jezgra, rezidua kontaktne površine VH:VL, konzervativnih Pro/Gly (pozitivni uglovi fi) i odgovarajućih rezidua u korelaciji sa podtipom VH (videti, npr., Ewert et al., gore; Honegger, gore; Kügler et al., gore).

[0388] Na primer, izvršena je pretraga humanih VH sekvenci homologih sa sekvencama regiona okvira VH 5H23 i kao akceptor za humanizaciju odabrana je sekvenca VH kodirana pomoću IGHV1-3*01 humane klicine linije (videti, npr., Ehrenmann et al., 2011, Cold Spring Harbor Protoc. G:737-749). Kod nekih od humanizovanih antitela, CDR sekvence VH 5H23 su prvo prenete na odgovarajuće pozicije IGHV1-3*01. Zatim je nekoliko aminokiselinskih rezidua VH 5H23 supstituisano za odgovarajuće humane rezidue, pojedinačno ili u kombinacijama.

[0389] Takođe, na primer, izvršena je pretraga humanih VL sekvenci homologih sa sekvencama regiona okvira VL 5H23, i kao akceptor za humanizaciju odabran je humani Vκ region kodiran pomoću IGKV4-1*01 (videti, npr., Ehrennmann et al., gore). Kod nekih od humanizovanih antitela, CDR sekvence VL 5H23 su prvo prenete na odgovarajuće pozicije IGKV4-1*01. Zatim je nekoliko aminokiselinskih rezidua VL 5H23 supstituisano za odgovarajuće humane rezidue, pojedinačno ili u kombinacijama.

[0390] Kod nekih humanizovanih antitela, postupak za humanizaciju koristi algoritam za konstruisanje trodimenzionalne mape mišjih varijabilnih regiona. Ovaj postupak je takođe omogućio identifikaciju aminokiselina regiona okvira i rezidua koje su važne za formiranje CDR strukture ili su neophodne za vezivanje za beta-kloto. Pored toga, aminokiselinske sekvence humanog VH i VL sa visokim stepenom homologije sa mišjim sekvencama odabrane su za moguće sekvence regiona okvira za humanizaciju. Kao što je gore opisano, CDR sekvence 5H23 antitela mogu da budu prenete u takve dodatne sekvence humanog regiona okvira. Razne sekvence humanog regiona okvira, uključujući sekvence klicine linije (npr., IGHV1-3, IGHV1-46, IGHV1-69, IGKV4-1, IGKV1-39 ili IGKV3-20) i zrele pojedinačne sekvence, mogu da budu pogodne za postupak humanizacije. Zatim, nekoliko aminokiselinskih rezidua 5H23 VH i/ili 5H23 VL može da bude supstituisano za odgovarajuće humane rezidue, pojedinačno ili u kombinaciji.

[0391] Za neke od humanizovanih lakih lanaca, izvršeno je pretraživanje pomoću IG BLAST za identifikovanje sekvenci humane klicine linije koje su se podudarale po sekvenci sa 5H23 VL i/ili koje su bile uobičajeno korišćene sekvence, uključujući, na primer, IGKV1-39 i IGKV3-20.

1

Za neke od humanizovanih lakih lanaca, CDR sekvence 5H23 VL su prvo prenete na odgovarajuće pozicije u IGKV1-39 ili IGKV3-20, a zatim su određene aminokiseline empirijski odabrane za supstituciju.

[0392] Aminokiselinske sekvence rezultujućih humanizovanih sekvenci VH (vH1-vH9) i VL (vL1 do vL5, v1-39a do v1-39p i v3-20a do v3-20j) prikazane su sa sekvencama 5H23 VH i VL na slikama 3A-3D. Na primer, upotrebom različitih postupaka humanizacije opisanih u ovom primeru, nekoliko aminokiselinskih rezidua VH i VL5H23 je supstituisano za odgovarajuće humane rezidue da bi se dobile humanizovane sekvence kao što je prikazano na slikama 3A-3D.

[0393] Humanizovana beta-kloto antitela mogu da se pripreme upotrebom bilo koje od CDR sekvenci u tabeli 18 u kombinaciji sa bilo kojom od sekvenci regiona okvira u tabeli 19.

Tabela 18

1

1 VH CDR3

Tabela 19

1

11 R S S S S S S S S S S R S S S S S S S S S S S S S S S

R

12

[0394] Na primer, humanizovano anti-beta-kloto antitelo može da sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži: FR1 (npr., SEQ ID NO:278, 279, 280, ili 378); CDR1 (npr., SEQ ID NO:1, 27, 53, 79, 105, 131, 157, 183, 209, 235); FR2 (npr., SEQ ID NO:281, 282, ili 283); CDR2 (npr., SEQ ID NO:2, 28, 54, 80, 106, 132, 158, 184, 210, ili 236); FR3 (npr., SEQ ID NO:284, 285, 286, 287, 379, 380, ili 381); CDR3 (npr., SEQ ID NO:3, 29, 55, 81, 107, 133, 159, 185, 211, ili 237); i/ili FR4 (npr., SEQ ID NO:288); i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži: FR1 (npr., SEQ ID NO:289, 290, 382, 383, ili 384); CDR1 (npr., SEQ ID NO:4, 30, 56, 82, 108, 134, 160, 186, 212, ili 238); FR2 (npr., SEQ ID NO:291, 292, ili 385-392); CDR2 (npr., SEQ ID NO:5, 31, 57, 83, 109, 135, 161, 187, 213, ili 239); FR3 (npr., SEQ ID NO:293, 294, 295, ili 393-404); CDR3 (npr., SEQ ID NO:6, 32, 58, 84, 110, 136, 162, 188, 214, 240); i/ili FR4 (npr., SEQ ID NO:296, 405, 406, ili 407).

[0395] Kao što je opisano u ovom primeru, humanizovana anti-beta-kloto antitela su empirijski dizajnirana i eksprimirana kao beta-kloto-vezujući proteini, uključujući devet humanizovanih varijanti VH regiona antitela 5H23 i trideset jednu humanizovanu varijantu VL regiona antitela 5H23 koje su pripremljene. Sekvence ovih ilustrativnih humanizovanih 5H23 VH i VL regiona prikazane su na slikama 3A-3D.

[0396] Humanizovana antitela su pripremljena sa humanizovanim VH i humanizovanim VL regionima sa sekvencama prikazanim na slikama 3A-3D. Na primer, konstruisano je osamnaest (6 X 3) kombinacija vH 1-6 i vL1-3 upotrebom IgG1 (ala-ala) konstantnog regiona (SEQ ID NO:316) i kapa konstantnog regiona (SEQ ID NO:318): vH1-VL1, vH1-vL2, vH1-vL3, vH2-vL1, vH2-vL2, vH2-vL3, vH3-vL1, vH3-vL2, vH3-vL3, vH4-vL1, vH4-vL2, vH4-vL3, vH5-vL1, vH5-vL2, vH5-vL3, vH6-vL1, vH6-vL2, vH6-vL3, sa sekvencama kao što je prikazano na slici 3A-3D. Dodatno, humanizovana antitela su konstruisana sa ilustrativnim humanizovanim VH regionom (npr., vH3) i dvadeset šest humanizovanih VL regiona (v1-39a do v1-39p i v3-20a do v3-20j) sa sekvencama kao što je prikazano na slici 3A-3D.

[0397] Humanizovana antitela su ispitana da bi se odredila njihova aktivnost u raznim testovima, uključujući, na primer, one opisane u primerima 2-6. Ekspresija humanizovanih antitela sa lakim lancima koji sadrže vL3 ili v1-39c bila je niska i ta antitela nisu dalje ispitivana. Ilustrativni

1

rezultati sa različitim humanizovanim anti-beta-kloto antitelima prikazani su u tabelama 20A i 20B ispod.

Tabela 20A

1 4

1 P

S

2

I

[0398] U dodatnim testovima, na primer, testovima sa reporterskim genom u ćelijama HEK293T, kao što je opisano u primeru 4, u kojima su ćelije transfekovane plazmidima koji kodiraju betakloto miša (npr., SEQ ID NO: 301), beta-kloto pacova (npr., SEQ ID NO: 356), beta-kloto hrčka (npr., SEQ ID NO: 408), beta-kloto kunića (npr., SEQ ID NO: 410), ili beta-kloto psa (npr., SEQ ID NO: 412) i takođe transfekovane plazmidima koji kodiraju himerni receptor FGFR1-βIIIc miša (npr., SEQ ID NO: 416), himerni receptor FGFR1-βIIIc pacova (npr., SEQ ID NO: 419), himerni FGFR1-βIIIc receptor hrčka (npr., SEQ ID NO: 417), himerni receptor FGFR1-βIIIc kunića (npr., SEQ ID NO: 420), ili receptor FGFR1-βIIIc psa (npr., SEQ ID NO: 418), redom, tretiranje anti-beta-kloto antitelom kao što je humanizovano 5H23 antitelo (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276), nije aktiviralo himerni kompleks beta-kloto miša, pacova, hrčka, kunića ili psa-FGFR1c receptor , redom. Anti-beta-kloto antitela koja su ovde opisana, uključujući 5H23 i humanizovana 5H23 antitela, kao i antitela koja kompetiraju sa 5H23 (npr., 1C17, 1D19, 2L12, 3L3, 3N20, 4P5, 5C23, 5F7 i 1G19, kao što je opisano u primeru 3) sa CDR sekvencama kao što je prikazano u tabelama 1-10, aktiviraju kompleks beta-kloto čoveka i cinomolgus majmuna/receptor FGF, ali ne i komplekse beta-kloto miša, pacova, hrčka, kunića ili psa/receptor FGF kao što je određeno gore opisanim testovima sa reporterskim genom. Kada je monovalentni Fab anti-beta-kloto antitela pripremljen papainskom digestijom anti-betakloto antitela, kao što je humanizovano 5H23 antitelo (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276), ispitan u testu sa reporterskim genom u HEK293 da bi se odredila njegova sposobnost

1

da aktivira kompleks receptor FGFR1 c/KLB čoveka, Fab nije pokazao aktivnost antitela sve do 67 nM, dok je humanizovano 5H23 antitelo pokazalo aktivnost u niskim nanomolarnim koncentracijama sličnim onim prikazani u tabeli 20B.

PRIMER 8: STUDIJE NA ŽIVOTINJAMA

[0399] Dejstva anti-beta-kloto antitela procenjena su u studijama na životinjama, uključujući cinomolgus majmune.

[0400] U studijama na gojaznim cinomolgus majmunima, primenjeno je ilustrativno anti-betakloto antitelo koje se vezuje za beta-kloto čoveka i beta-kloto cinomolgus majmuna (npr., antitelo 5H23 ili njegova humanizovana varijanta), kao i antitelo koje sadrži jedan ili više od CDR regiona 5H23 kao što je prikazano u tabeli 1 ili alternativno, antitelo koje sadrži jedan ili više od CDR regiona antitela ili njegove humanizovane varijante kao što je prikazano u tabelama 2-10 koje kompetira za vezivanje za beta-kloto čoveka sa 5H23, kao što je opisano u primeru 3. Mogu da se izmere dejstva na razne metaboličke parametre. Primeri parametara uključuju uzimanje hrane, telesnu težinu, indeks telesne mase (BMI), obim abdomena (AC), debljinu nabora kože (SFT), test tolerancije na oralno unetu glukozu (OGTT), nivoe glukoze u krvi (npr., u serumu) pri gladovanju i/ili nakon hranjenja (npr., postprandijalno), nivoe insulina, i/ili nivoe triglicerida.

[0401] U ovoj studiji, odabrano je dvadeset spontano gojaznih cinomolgus majmuna sa indeksom telesne mase jednakim ili iznad 40, i nasumično raspoređeno u grupu tretiranu vehikulumom (n = 10) i grupu tretiranu antitelom (n =10). Životinje su dobile subkutanu injekciju vehikuluma ili anti-beta-kloto antitela 1. i 14. dana. Uzimanje hrane pri svakom obroku je zabeleženo i telesna težina je merena jednom nedeljno. Uzorci krvi su uzimani jednom nedeljno tokom 7 nedelja za merenje glukoze, insulina, lipida i parametara od interesa u plazmi (alternativno, u serumu). Na dane 14, 28 i 49, sproveden je test tolerancije na oralno unetu glukozu.

[0402] Primeri dejstva tretmana mogu da uključuju redukovan unos hrane, sniženu telesnu težinu, snižen BMI, AC i/ili SFT, poboljšanu toleranciju na glukozu, snižene nivoe insulina, snižene nivoe glukoze pri gladovanju i/ili nakon hranjenja (npr., postprandijalno) u plazmi (alternativno, u serumu), nivoe insulina, i/ili redukovane nivoe triglicerida. Ova dejstva ukazuju na poboljšane metaboličke parametre pri tretmanu anti-beta-kloto antitelima.

[0403] Na primer, odabrano je dvadeset mužjaka cinomolgus majmuna za tretman humanizovanim 5H23 antitelom (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) ili kontrolom vehikuluma na osnovu njihovog BMI (> 40) i trenirano za imobilizaciju u stolici,

1

primanje subkutane injekcije, uzimanje uzoraka krvi i ishranu kroz želudačnu sondu. Uspostavljen je rutinski raspored hranjenja.

[0404] Bazalne vrednosti različitih parametara od interesa izmerene su pre tretmana. Na primer, na dan -7, izmerena je bazalna telesna težina, BMI, obim abdomena, i debljina nabora kože, i na cinomolgus majmunima pod ketaminskom anestezijom sprovedeno je skeniranje dualnom rendgenskim apsorpciometrijom ("DEXA") da bi se izmerila mineralna gustina kostiju. Uzorci krvi uzeti su na dan -3, nakon gladovanja preko noći. Izmereni su i analizirani bazalni nivoi serumske glukoze, insulina, ukupnog holesterola, LDL, HDL, triglicerida, i panel hematoloških i kliničkih hemijskih parametara. Odmah nakon uzimanja bazalnih uzoraka, životinje su podvrgnute testu tolerancije na oralno unetu glukozu (OGTT) primanjem 4 g/kg glukoze preko želudačne sonde i uzorci su uzimani 5, 15, 30, 60, 120 i 180 minuta posle opterećenja glukozom, i izmerena je serumska glukoza i insulin. Na osnovu bazalnih podataka, životinje su podeljene u dve grupe po 10 životinja u svakoj grupi (npr., jedna grupa za tretman antitelom i druga grupa kao kontrolna grupa vehikuluma) da bi se dostigli slični bazalni nivoi različitih parametara, npr., telesne težine, BMI, i nivoi serumske glukoze, insulina i triglicerida.

[0405] Počevši od 0. dana, jedna grupa životinja (n=10) primila je dozu subkutane injekcije od 10 mg/kg anti-beta-kloto antitela, kao što je humanizovano 5H23 antitelo (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) na dve nedelje (npr., 0, 14, 28, i 42. dana) za 4 doze. Kontrolna grupa vehikuluma primala je odgovarajući vehikulum istih dana. Tretmani su sprovođeni ujutru, 30 minuta pre jutarnjeg obroka, a zapremina doze bila je 0.1 do 0.2 mL/kg.

[0406] Parametri od interesa, npr., uzimanje hrane, telesna težina, klinička hemija i OGTT, praćeni su tokom cele studije. Na primer, uzimanje hrane mereno je svakodnevno. Telesna težina, BMI, obim abdomena, i debljina nabora kože mereni su nedeljno, npr., 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84, 91, i 98. dana. Uzorci krvi uzimani su nedeljno, npr., 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, i 70. dana, nakon gladovanja preko noći, za merenje glukoze, insulina i lipida, kao što su trigliceridi. Dodatni uzorak krvi uzet je 98. dana, nakon gladovanja preko noći. Testovi OGTT su sprovedeni posle početka studije, npr., 14, 28, i 56. dana, pri čemu su životinje dobile 4 g/kg glukoze putem želudačne sonde i uzorci su uzimani 5, 15, 30, 60, 120 i 180 minuta posle opterećenja glukozom, i izmerena je serumska glukoza i insulin. Skeniranje DEXA sprovedeno je 30 i 72. dana. Pored toga, hematološki panel i panel kliničke hemije analizirani su 28 i 70. dana. Dve životinje iz grupe koja je primala vehikulum i dve životinje iz grupe koja je primala anti-beta-kloto antitelo su eutanizirane i urađena im je nekropsija 50. dana, za procenu bezbednosti. Tokom studije, pažljivo je praćeno zdravstveno stanje svih životinja.

1

[0407] Primeri rezultata ove studije prikazani su u tabelama 21 do 25 ispod u tekstu. Kao što je prikazano u tabeli 21, telesna težina životinja koje su primale vehikulum ostala je konstantna (uz blago povećanje tokom studije); dok je telesna težina životinja koje su primale anti-beta-kloto antitelo progresivno snižena, i telesna težina se nije vratila na bazalni nivo tokom 8-14 nedelja (npr., faza oporavka). Slično, kao što je prikazano u tabeli 22, životinje koje su primale vehikulum pokazale su relativno stabilan BMI tokom studije, dok su životinje koje su primale anti-beta-kloto antitelo pokazale snižen nivo BMI tokom trajanja studije. Ni nivo BMI nije se vratio na bazalne vrednosti (npr., tokom faze oporavka). Ovi rezultati sugerišu da je tretman antibeta-kloto antitelom rezultovao smanjenjem masne mase.

[0408] Kao što je prikazano u tabeli 23, serumski nivoi insulina kod životinja koje su primale vehikulum porasli su tokom trajanja studije; dok su serumski nivoi insulina kod životinja koje su primale anti-beta-kloto antitelo značajno sniženi. Serumski nivoi glukoze su takođe redukovani kod životinja koje su primale anti-beta-kloto antitelo, kao što je prikazano u tabeli 24. Slično tome, kao što je prikazano u tabeli 25, nivoi triglicerida kod životinja koje su primale vehikulum porasli su tokom trajanja studije; dok su nivoi triglicerida kod životinja koje su primale anti-betakloto antitelo bili značajno redukovani.

[0409] Rezultati testova OGTT pokazali su da pre tretmana bazalni nivoi insulina nisu bili značajno različiti između grupa koje su primale vehikulum i onih koje su primale anti-beta-kloto antitelo. Nasuprot tome, posle tretmana, postojao je trend snižavanja nivoa glukoze i nivoi insulina bili su sniženi kod životinja koje su primale anti-beta-kloto antitelo u poređenju sa životinjama koje su primale vehikulum.

1

[0410] U još jednoj ilustrativnoj studiji, odabrano je četrdeset spontano gojaznih mužjaka cinomolgus majmuna, trenirano i hranjeno kao što je gore opisano.

[0411] Bazalne vrednosti različitih parametara su izmerene pre tretmana, kao što je gore razmatrano. Na primer, bazalna telesna težina, BMI, obim abdomena i debljina nabora kože mereni su na dan -4, a bazalni uzorci krvi uzeti su za merenja serumske glukoze, insulina, ukupnog holesterola, LDL, HDL i triglicerida na dan -3, nakon gladovanja preko noći. Na osnovu bazalnih podataka, životinje su raspoređene u 5 grupa (8 životinja u svakoj grupi) pri čemu 4 grupe primaju različite doze anti-beta-kloto antitela kao što je humanizovano 5H23 antitelo (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) i jedna grupa prima kontrolu vehikuluma.

[0412] Na dan 0, prva grupa životinja (n=8) primila je jednu dozu subkutane injekcije od 0.1 mg/kg anti-beta-kloto antitela; druga grupa životinja (n=8) primila je jednu dozu subkutane injekcije od 1 mg/kg anti-beta-kloto antitela, a treća grupa životinja (n=8) primila je jednu dozu subkutane injekcije od 10 mg/kg anti-beta-kloto antitela. Počevši od 0. dana, četvrta grupa životinja (n=8) primila je dozu subkutane injekcije od 0.1 mg/kg anti-beta-kloto antitela jednom na svake 4 nedelje tokom 12 nedelja. Kao kontrola, peta grupa životinja (n=8) primala je dozu vehikuluma jednom na svake 4 nedelje tokom 12 nedelja. Tretmani su sprovođeni ujutru 30 minuta pre jutarnjeg obroka, a zapremina doze bila je 0.2 mL/kg.

[0413] Parametri od interesa praćeni su tokom cele studije. Na primer, uzimanje hrane mereno je pri svakom obroku. Telesna težina, BMI, obim abdomena i debljina nabora kože mereni su nedeljno. Uzorci krvi uzimani su na, npr., 3, 6, 12 i 24 časa i 3, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 i 112 dana posle davanja doze/doza, i mereni su parametri od interesa, npr., serumska glukoza, insulin, ukupni holesterol, LDL, HDL i trigliceridi. Tokom cele studije, pažljivo je praćeno zdravstveno stanje svih životinja, kao što je gore opisano.

[0414] Primeri rezultata ove dozno-zavisne studije prikazani su u tabelama 26-29. Tabela 26 prikazuje relativne promene telesne težine kod životinja koje su primale anti-beta-kloto antitelo u poređenju sa promenama telesne težine kod životinja koje su primale vehikulum. Kao što je prikazano, jedna doza subkutane injekcije od 0.1 mg/kg, 1mg/kg, ili 10mg/kg anti-beta-kloto antitela, ili četiri doze subkutane injekcije od 1mg/kg anti-beta-kloto antitela značajno je smanjila telesnu težinu. Pored toga, smanjena telesna težina se održala 112. dana kod životinja koje su primile jednu dozu od 10 mg/kg anti-beta-kloto antitela, ili kod životinja koje su primile četiri doze od 1mg/kg anti-beta-kloto antitela u poređenju sa vehikulumom.

[0415] Kao što je prikazano u tabeli 27, jedna doza subkutane injekcije od 0.1 mg/kg, 1mg/kg, ili 10 mg/kg anti-beta-kloto antitela, ili četiri doze subkutane injekcije od 1mg/kg anti-beta-kloto

2

antitela snizila je serumski nivo insulina u poređenju sa kontrolnom grupom vehikuluma. Pored toga, četiri doze subkutane injekcije od 1mg/kg anti-beta-kloto antitela značajno su snizile serumski nivo glukoze, kao što je prikazano u tabeli 28. Osim toga, serumski nivoi triglicerida kod životinja koje su primile jednu dozu subkutane injekcije od 1 mg/kg, ili 10 mg/kg anti-betakloto antitela, ili četiri doze subkutane injekcije od 1 mg/kg anti-beta-kloto antitela, bili su sniženi u poređenju sa životinjama koje su primile vehikulum, kao što je prikazano u tabeli 29.

2

diliceri ig Tr29 ael ab T

[0416] Rezultati ovih studija na životinjama pokazuju poboljšane metaboličke parametre pri tretmanu ovde obezbeđenim anti-beta-kloto antitelima, na primer, kao što je smanjenje telesne težine, indeksa telesne mase, obima abdomena, zadebljanja nabora kože, glukoze (npr., serumske glukoze), insulina (npr., serumskog insulina) i/ili triglicerida (npr., serumskih triglicerida).

PRIMER 9: MAPIRANJE EPITOPA I DOMENA

[0417] Sprovedene su studije kako bi se lokalizovalo mesto vezivanja na humanom KLB za antibeta-kloto antitelo u epitopskoj grupi 5H23, uključujući 5H23 kao što je opisano u primeru 3, sa sekvencama prikazanim u tabelama 1-10 i na slikama 1-3, i humano anti-beta-kloto antitelo u epitopskoj grupi 5H23, kao što su humanizovana 5H23 antitela (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276). Na primer, sprovedeni su testovi vezivanja na bazi FACS za mapiranje domena u ćelijama Expi293 (Life Technologies, A14635) koje su tranzijentno transfekovane plazmidima koji kodiraju varijante KLB: čoveka, miša, cinomolgus majmuna, himernu verziju u kojoj sekvenca KL1 domena mišjeg KLB (M1-F506) zamenjuje KL1 domen humanog KLB (M1-F508) da bi nastao mišji-humani KLB (SEQ ID NO: 376), i drugu himeru u kojoj sekvenca KL1 čoveka (M1-F508) zamenjuje KL1 domen mišjeg KLB (M1-F506) da bi nastao mišjihumani KLB (SEQ ID NO: 374). Prema tome, ekspresioni vektor pYD7 koji ne nosi sekvencu KLB transfekovan je kao negativna kontrola.

[0418] U nekim studijama, vezivanje prečišćenog uzorka humanizovanog 5H23 antitela (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) za varijante KLB određeno je pomoću FACS analize. Dva dana posle transfekcije ćelije su ko-inkubirane sa prečišćenim antitelima: humanizovanim 5H23 antitelom (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276), kontrolnim antitelom (npr., VH SEQ ID NO: 358 i VL SEQ ID NO: 360), i negativnom kontrolom antitela (npr., antitelo protiv hemocijanina puža (KLH) eksprimirano sa konstrukta koji sadrži SEQ ID NO: 424 i 425) razblaženo do 1 µg/ml u PBS/1%BSA/0.1% azida tokom 30 minuta na 4°C. Posle pranja smešom PBS/1% BSA/0.1% azida, transfekovane ćelije su ko-inkubirane sa obeleženim antitelom protiv Fc čoveka (Jackson Immunoresearch) 30 minuta na 4°C. Posle pranja smešom PBS/1% BSA/0.1% azida, ćelije su nanete na protočni citometar (FACS Calibur) i analizirane pomoću analitičkog programa za citometriju (FlowJo). Da bi se prikazali dobijeni podaci, napravljeni su grafikoni koji prikazuju broj ćelija u funkciji intenziteta fluorescencije, a zatim je određena medijana intenziteta fluorescencije (MFI) za svaki uzorak kao što je prikazano u tabeli 30.

Tabela 30

* Srednji intenzitet fluorescencije izračunat iz podataka FACS analize upotrebom analitičkog programa FlowJo; Negativna kontrola je anti-KLH antitelo.

[0419] Ilustrativno humanizovano 5H23 antitelo (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) se vezalo za KLB čoveka i KLB cinomolgus majmuna, na šta ukazuje veliki udeo ćelija koje imaju visok intenzitet fluorescencije u poređenju sa ćelijama tretiranim anti-KLH negativnim kontrolnim antitelom, ali ilustrativno humanizovano 5H23 antitelo se nije vezalo za KLB miša. Ilustrativno humanizovano 5H23 antitelo takođe se vezalo za mišji-humani himerni protein KLB, ali ne i za humani-mišji himerni protein KLB što ukazuje na to da se anti-betakloto antitela u epitopskoj grupi 5H23, uključujući 5H23 kao što je opisano u primeru 3, sa sekvencama prikazanim u tabelama 1-10 i na slikama 1-3, i humana anti-beta-kloto antitela u epitopskoj grupi 5H23, kao što su humanizovana 5H23 antitela (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276) vezuju za KL2 domen humanog KLB. Nasuprot tome, kontrolno antitelo se vezalo za KL1 domen humanog KLB kao što je pokazano njegovim vezivanjem za ćelije transfekovane humanim-mišjim himernim proteinom KLB, ali ne i za mišji-humani himerni protein KLB.

[0420] U cilju da se dodatno identifikuju rezidue značajne za specifično vezivanje unutar KL2 domena beta-kloto čoveka, upotrebljena je mutageneza metodom "genskog pištolja" da bi se posebno mutirale pojedinačne rezidue KL2 domena humanog beta-kloto u alanin (npr., rezidue F508A-L1008A). Rezultujući beta-kloto mutantni proteini su eksprimirani u ćelijama HEK-293T i ispitani metodom sortiranja fluorescentno-aktiviranih ćelija (FACS) da bi se odredilo vezivanje za anti-beta-kloto antitela u epitopskoj grupi 5H23, koja uključuje 5H23 kao što je opisano u primeru 3, sa sekvencama prikazanim u tabelama 1-10 i na slikama 1-3, i humana anti-beta-kloto antitela u epitopskoj grupi 5H23, kao što je humanizovano 5H23 antitelo (npr., VH SEQ ID NO: 271 i VL SEQ ID NO: 276), ili monovalentni Fab fragment humanizovanog 5H23 antitela. Na

21

primer, skrining beta-kloto mutantnih proteina sproveden je u koncentraciji od 0.5 µg/ml za humanizovano 5H23 antitelo, 1.0 µg/ml za Fab fragment, i 2.0 µg/ml za poliklonska anti-betakloto antitela kao pozitivnu kontrolu.

[0421] Kao rezultat mapiranja, identifikovane su tri specifične vezujuće rezidue, H657, Y701 i R703, koje se ne vezuju za humanizovano 5H23 antitelo, ali se vezuju za kontrolna poliklonska anti-beta-kloto antitela. Ove rezidue predstavljaju aminokiseline čije promene bočnog lanca najviše doprinose energiji interakcije antitelo-epitop, kao što je prikazano u tabeli 31. Lokacije tri identifikovane rezidue modelirane su njihovim prikazivanjem (tamne sfere) na ekvivalentnim pozicijama na humanoj citosolnoj beta-glukozidazi (PDB ID# 2JFE; Tribolo et al., J. Mol. Biol.

370, 964-975 (2007)), određenoj poravnanjem dva proteina upotrebom BLAST, kao što je prikazano na slici 6. struktura prikazuje ekvivalent beta-kloto rezidua 521-963. Niža reaktivnost mutacija Y701A i R703A sa humanizovanim 5H23 antitelom ukazuje na to da Y701 i R703 najviše doprinose energiji vezivanja.

Tabela 31

[0422] Prema tome, ovde opisana anti-beta-kloto antitela, uključujući 5H23 i antitela u epitopskoj grupi 5H23 prepoznaju epitop u KLB2 domenu koji sadrži rezidue H657, Y701 i/ili R703. Takva antitela, kao što je opisano i predstavljeno u primeru 3, i koja sadrže CDR sekvence u tabelama 1-10 i na slikama 1-3, mogu da se upotrebe kao agonistička antitela za indukciju signalizacije posredovane FGF19 i/ili posredovane FGF21, uključujući, na primer, za smanjenje telesne težine, uzimanja hrane, BMI, nivoa insulina, glukoze i/ili triglicerida.

[0423] Prema tome, zajedničko svojstvo ovde opisanih anti-beta-kloto antitela je njihova sposobnost međusobne kompeticije za vezivanje beta-kloto (videti, npr., primer 3 koji opisuje antitela u epitopskoj grupi 5H23). Ova kompetitivna inhibicija ukazuje na to da se svako antitelo vezuje za isti region beta-kloto (npr., isti epitop), potvrđujući time slična dejstva. Kao što je ovde dodatno prikazano, anti-beta-kloto antitela uključuju humanizovana anti-beta-kloto antitela, uključujući humanizovana anti-beta-kloto antitela poreklom od, ili na bazi 5H23, 1C17, 1D19,

21

2L12, 3L3, 3N20, 4P5, 5C23, 5F7 i/ili 1G19 koja imaju CDR sekvence kao što je opisano u tabelama 1-10 ili na slikama 1-3, kao što su anti-beta-kloto antitela, uključujući humanizovana anti-beta-kloto antitela, vezuju se za specifični domen humanog beta-kloto (npr., KL2 (rezidue S509-S1044) kao što je gore opisano). Osim toga, takvo vezivanje može u velikoj meri da se pripiše određenim aminokiselinskim reziduama unutar KL2 regiona (npr., H657, Y701 i R703 kao što je gore opisano), koji sadrži epitop koji prepoznaju ovde opisana anti-beta-kloto antitela. Zajedno uzevši, ovi rezultati pokazuju da dejstva zapažena kod anti-beta-kloto antitela koje potiče od, ili se zasniva na 5H23 ili antitelu u epitopskoj grupi 5H23, uključujući antitelo koje ima jedan ili više CDR regiona opisanih u tabelama 1-10 ili na slikama 1-3, mogu da budu ekstrapolirana na druga ovde opisana anti-beta-kloto antitela koja imaju istu ili sličnu eptitopsku specifičnost (npr., iste ili slične CDR regione). Na primer, in vitro aktivnosti antitela kao što je prikazano u primerima 4-7 i iznad u tekstu, kao i in vivo dejstva prikazana u primeru 8 za ilustrativno humanizovano anti-beta-kloto antitelo, reprezentativna su za aktivnosti i dejstva ovde opisanih anti-beta-kloto antitela.

[0424] Kako se koristi u ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju oblike množine, osim ako sadržaj jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, pominjanje "antitela" može da uključuje smešu dva ili više takvih antitela, i slično.

[0425] Ostali primeri izvođenja su u okviru sledećih patentnih zahteva.

21

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje se vezuje unutar beta-kloto domena 2 (KLB2) koji sadrži aminokiselinske rezidue 657 do 703 humanog beta-kloto (SEQ ID NO:297), naznačeno time što antitelo sadrži:

(a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži:

CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:12, ili SEQ ID NO:13;

CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:14; i

CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:15;

i

(b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži:

CDR1 koji sadrži SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:16;

CDR2 koji sadrži SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i

CDR3 koji sadrži SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:17.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo sadrži:

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo sadrži:

4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo sadrži:

5. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:25 i varijabilni region lakog lanca ima najmanje 90% identičnosti sekvence sa SEQ ID NO:26.

6. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca sadrži SEQ ID NO:25 i varijabilni region lakog lanca sadrži SEQ ID NO:26.

7. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što varijabilni region teškog lanca sadrži SEQ ID NO:271 i varijabilni region lakog lanca sadrži SEQ ID NO:276.

8. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, naznačeno time što antitelo vezuje epitop koji sadrži najmanje jednu od aminokiselinskih rezidua 657, 701 i/ili 703 beta-kloto čoveka (SEQ ID NO: 297).

9. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što je antitelo monoklonsko antitelo, humanizovano antitelo, ili himerno antitelo.

10. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što je antitelo Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv, (scFv)2, molekul jednolančanog antitela, antitelo sa dvostrukim varijabilnim regionom, linearno antitelo, ili multispecifično antitelo formirano od fragmenata antitela.

11. Izolovani polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10.

12. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 11.

13. Ćelija-domaćin koja sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 11 ili vektor prema patentnom zahtevu 12.

14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Antitelo kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u postupku za poboljšanje metabolizma glukoze kod subjekta.

16. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 15, naznačeno time što postupak za poboljšanje metabolizma glukoze rezultuje u:

(a) sniženim nivoima glukoze;

(b) sniženim nivoima insulina;

(c) povećanoj osetljivosti na insulin;

(d) sniženoj insulinskoj rezistenciji;

(e) poboljšanoj toleranciji na glukozu; i/ili

(f) poboljšanoj funkciji pankreasa.

17. Antitelo kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 10 za upotrebu u postupku za lečenje dijabetesa tipa 1, dijabetesa tipa 2, dislipidemije, nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), kardiovaskularne bolesti, metaboličkog sindroma, gojaznosti, ili nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD).

18. Antitelo za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 15 do 17, naznačeno time što postupak dodatno obuhvata primenu jednog ili više terapijskih agenasa u kombinaciji sa antitelom.

19. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, naznačeno time što je jedan ili više terapijskih agenasa odabran iz grupe koja se sastoji od biguanida, sulfonilurea, tiazolidindiona, analoga GLP-1, agonista PPAR gama, inhibitora dipeptidil peptidaze-4 (DPP-4), bromokriptina, sekvestranata žučnih kiselina, insulina, inhibitora alfa glukozidaze, metformina, inhibitora SGLT-2, agenasa za suzbijanje apetita, i lekova za gubljenje težine.

22