CN113559266B

CN113559266B - Ckip-1 3` UTR在预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN113559266B
Application number: CN202110805266.3A
Authority: CN
Inventors: 李英贤; 凌树宽; 赵银龙
Original assignee: China Astronaut Research and Training Center
Current assignee: China Astronaut Research and Training Center
Priority date: 2021-07-16
Filing date: 2021-07-16
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2041-07-16
Also published as: CN113559266A

Abstract

本发明涉及Ckip‑1 3'UTR在预防和或治疗心力衰竭疾病药物中的应用，属于分子生物学和医学技术领域。本发明研究发现Ckip‑1 3'UTR过表达促进了有益的生理性心肌肥大。进而实现Ckip‑1 3'UTR在筛选或制备用于有益的生理性心脏肥大药物靶点的用途。同时还发现Ckip‑1 3'UTR过表达对TAC导致的病理性心肌肥大和心衰具有保护作用。进而实现Ckip‑1 3'UTR在筛选或制备用于预防和/或治疗心力衰竭疾病的药物靶点的用途；以及Ckip‑1 3'UTR作为预防和/或治疗心力衰竭疾病治疗靶点或作为心力衰竭疾病诊断靶点的用途。

Description

Ckip-1 3′UTR在预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及Ckip-1 3′UTR在预防和/或治疗心力衰竭疾病药物中的应用，属于分子生物学和医学技术领域。

背景技术

心力衰竭是一个日益严重的公共卫生问题，也是现代社会中发病和死亡的主要原因。心脏肥大是心力衰竭的一个重要的前期病变，最终将导致心力衰竭。心脏肥大的特点是心肌细胞增大，蛋白质合成增加，胎儿基因重新激活，细胞骨架重塑，以及纤维化增强。在临床上表现为心肌收缩和舒张功能受损，射血分数降低等心功能不全。然而，当前心衰的治疗和预后仍然存在严重的不良。因此，随着心衰负担的加重，亟需进一步加深对病理性心肌重塑的疾病过程、进展和分子机制的研究，寻找新的分子靶标。

运动锻炼对心脏的益处是众所周知的，并且临床研究表明，锻炼是一种可以改善心力衰竭患者心功能的有效干预措施。低强度、中等强度和剧烈运动都被证明能提供一定程度的益处。重复锻炼促进了心血管健康，并引起了重要的分子、结构和功能变化，然而这种生理性心肌生长与病理性心肌肥大有很大的不同。生理性心肌肥厚的特征是心脏质量增加，心功能正常或增强，没有证据表明心肌纤维化或细胞死亡。运动诱导的心脏重塑是一个复杂的过程，涉及运动诱导的刺激(儿茶酚胺、机械拉伸、激素和生长因子)调节心肌细胞内的许多过程。但是在与心脏病相关的信号通路中，仅识别和筛选出有限的信号通路对于运动训练后的心脏适应性生长是必不可少的。目前，已知的运动诱导的心脏保护的关键分子还是知之甚少，急需拓展新的研究方向。

mRNA分子都具有核心的一段编码序列，将根据这一指令来生成蛋白质。而编码序列两侧为3′非编码区(3′UTR)和5′非编码区(5′UTR)，3′UTR和5′UTR 不会生成蛋白质。mRNA的翻译、运输、储存和降解主要通过反式RNA结合蛋白(RBP)、miRNA或核糖核蛋白复合物等结合到顺式调控位点来完成。这些位点通常位于mRNA的3′UTR，因此转录后调控的主要中心枢纽是mRNA的3′ UTR。长链非编码RNA(lncRNAs)在基因转录本中占有很大比例，是各种心脏疾病的重要调节因子。尽管已有报道表明lncRNAs参与了多种心脏疾病的发病过程，但mRNA组成部分中非编码RNA 3′UTR在心衰中的作用仍知之甚少。

发明内容

有鉴于此。本发明的目的之一在于提供酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1的3′非编码区(CKIP-1 3′UTR)在筛选或制备用于有益的生理性心脏肥大药物靶点的用途，所述Ckip-13′UTR的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

进一步的，所述有益的生理性心脏肥大是由运动锻炼诱导的。

本发明的目的之二在于提供所述Ckip-1 3′UTR在筛选或制备用于预防和/ 或治疗心力衰竭疾病的药物靶点的用途。

本发明的目的之三在于提供所述Ckip-1 3′UTR作为预防和/或治疗心力衰竭疾病治疗靶点或作为心力衰竭疾病诊断靶点的用途。

进一步的，所述预防和/或治疗心力衰竭疾病是通过Ckip-1 3′UTR过表达抑制病理性心脏肥大的发生实现的。

本发明的目的之四在于提供所述一种携带Ckip-1 3′UTR的腺相关病毒在预防和/或治疗心力衰竭疾病中的用途。

进一步的，所述携带Ckip-1 3′UTR的腺相关病毒中，所述腺相关病毒的载体为具有心肌特异启动子启动的腺相关病毒载体。更进一步的，所述腺相关病毒的载体为AAV9载体。

进一步的，所述携带Ckip-1 3′UTR的腺相关病毒使用时采用静脉注射方式。

有益效果

1、本发明对野生型和Ckip-1 3′UTR转基因(3′UTR TG)小鼠进行21天游泳运动锻炼，通过检测心脏组织病理性切片和心脏功能，结果显示Ckip-1 3′ UTR过表达促进了有益的生理性心肌肥大。由此可实现Ckip-1 3′UTR在筛选或制备用于有益的生理性心脏肥大药物靶点的用途。

2、本发明对心脏特异性Ckip-1 3′UTR转基因(3′UTR TG)小鼠及其同龄的野生型(WT)同窝对照小鼠进行压力过负荷诱导建立心肌肥大模型，在主动脉弓缩窄(TAC)手术4周后，进行心肌组织学分析和心脏超声图像的监测，以评估心肌肥大、纤维化和心脏功能。结果显示Ckip-1 3′UTR过表达对TAC导致的病理性心肌肥大和心衰具有保护作用。由此可实现Ckip-1 3′UTR在筛选或制备用于预防和/或治疗心力衰竭疾病的药物靶点的用途；以及Ckip-1 3′UTR作为预防和/或治疗心力衰竭疾病治疗靶点或作为心力衰竭疾病诊断靶点的用途。

3、本发明中腺相关病毒包装Ckip-1 3′UTR尾静脉注射实验的结果显示可缓解TAC导致的心脏病理性重塑指标变化，说明Ckip-1 3′UTR体外给药能够治疗TAC导致的心肌肥大，预防心衰的发生。

附图说明

图1为实施例1中小鼠的H&E染色和Masson染色结果。

图2为实施例1中小鼠的左室射血分数EF结果。

图3为实施例1中小鼠的短轴缩短率FS结果。

图4为实施例2中小鼠各组织中Ckip-1 3′UTR的表达结果。

图5为实施例2中小鼠的H&E染色、Masson染色和WGA染色结果。

图6为实施例2中小鼠的WGA染色量化结果。

图7为实施例2中小鼠的左室射血分数EF结果。

图8为实施例2中小鼠的短轴缩短率FS结果。

图9为实施例2中小鼠心肌重塑相关基因ANP的表达结果。

图10为实施例2中小鼠心肌重塑相关基因BNP的表达结果。

图11为实施例2中小鼠心肌重塑相关基因Myh7的表达结果。

图12为实施例3中小鼠的左室射血分数EF结果。

图13为实施例3中小鼠的短轴缩短率FS结果。

图14为实施例3中小鼠的Masson染色和WGA染色结果。

图15为实施例3中小鼠的心脏重量指数变化。

图16为实施例3中小鼠心肌重塑相关基因ANP的表达结果。

图17为实施例3中小鼠心肌重塑相关基因BNP的表达结果。

图18为实施例3中小鼠心肌重塑相关基因Myh7的表达结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

以下实施例中：

1、所述Ckip-1 3′UTR的核苷酸序列为：

5’-aagggggggcaggtctgaaatttgggggggcacagactctttatctccaaatgttgcaggataaagcttttttatt tacctcaatccaaaaaaaaaaaaaa-3’。

2、实时定量PCR检测：

(1)组织RNA的提取

①组织加入500μL Trzol，同时加入100μL三氯甲烷剧烈振荡15s，室温放置3min。

②4℃，12000rpm离心15min，样品分层后取上层液体。

③上层液体转移到新离心管中，加入等体积异丙醇沉淀RNA，轻轻混匀，室温放置10min。

④4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

⑤用1mL体积分数为75％乙醇洗RNA沉淀，去除杂质，4℃，7500rpm 离心5min，弃上清，这一步骤在冰上进行。

⑥室温干燥RNA沉淀大约5-10min。

⑦加DEPC水，放置3min使RNA溶解，Nanodrop 2000测RNA浓度。

(2)RNA反转录

根据Takara PrimeScript RT reagent Kit(RR037A)进行反转录，20μl反应体系中加入RNA量为1000ng。步骤如下表1：

表1

反转录PCR反应条件如下表2：

表2

用400μL的DEPC水稀释20μL的cDNA液体。

(3)实时荧光定量PCR

根据TaKaRa TB Green^TMPremix Ex Taq^TMII(RR820A)进行RT-PCR实验，配制20μL反应体系如下表3：

表3

RT-PCR反应条件如下表4：

表4

数据Ct值分析，归一化处理。

3、小鼠主动脉弓缩窄(TAC)模型：

通过TAC手术模拟小鼠病理性心脏肥大。小鼠(8～10周龄，体重21～26g) 腹腔注射2，2，2-三溴乙醇麻醉。用脱毛膏脱净小鼠颈部到胸骨柄之间的毛，用一根线勾住小鼠的前牙并向前拉，用胶布将线固定在粘鼠板上(即把小鼠的头部放平，颈部舒展开，有助于气管插管)。使小鼠仰卧在粘鼠板上，用医用胶布固定四肢和尾巴，并插入气管导管。打开小动物呼吸机，调整参数(呼吸频率：90；呼吸比：1:1；潮气量：10；气压：0)，将插入气管中的针头另一端与呼吸机导管相连。用一把眼科剪自胸骨上窝处将皮剪开一个小口，用开胸剪贴着胸骨向下剪开至第二肋。将胸腔打开，并用扩胸器撑开。用两把眼科镊轻轻将胸腺掀开，暴露主动脉弓。用一把显微镊将头臂干和左颈总之间的主动脉弓区域的胸腺和脂肪组织钝性剥离，暴露手术部位。将25号针头平行放置在主动脉弓处，并用5-0不可吸收线结扎。待扎紧后，轻轻将针头移出。移开扩胸器，用5-0可吸收缝合线依次缝合肌肉和皮肤，完全缝合后，用棉签蘸碘伏涂在缝合处周围。假手术组(Sham)开胸但不进行主动脉弓结扎。

4、构建心肌特异性过表达Ckip-1 3′UTR(3′UTR TG)小鼠：

通过将Ckip-1 3′UTR片段插入心肌特异性启动子α-MHC下游的相应位点构建质粒，该质粒用Sal1和Hind3内切酶线性化。然后由清华大学实验动物研究中心将线性化后的αMHC-Ckip-1 3′UTR片段显微注射到C57BL/6J小鼠原核期胚胎中，然后将胚胎移植到B6D2F1(C57BL/6X DBA2)假孕雌性小鼠体内进行代孕繁殖。

5、超声分析：

将小鼠在小动物麻醉机容器内麻醉(体积分数为2％的异氟烷混合0.5L/min 的氧气)；麻醉后，利用脱毛剂对小鼠胸部脱毛；小鼠置于内嵌心电监护的保温台，并在四肢涂抹电极胶；利用Vevo公司随机配置的770B 30MHz的超声探头进行小鼠心脏功能测试，利用B-Model中二维图像从小鼠心脏短轴获取图像，利用系统自带软件获取超声心动图心功能观察指标：室间隔收缩末期厚度 (Systolic Interventricular Septal Thickness，IVSs)；左室舒张末期后壁厚度 (Diastolic Left Ventricular Posterior Wall Thickness，LVPWd)和左室收缩末期后壁厚度(Systolic Left Ventricular Anterior WallThickness，LVPWs)；左室舒张末期内径(Diastolic Left Ventricular InternalDiameter，LVIDd)和左室收缩末期内径(Systolic Left Ventricular InternalDiameter，LVIDs)；左室舒张末期容积(Diastolic Left Ventricular Volume，LV Vold)和左室收缩末期容积(Systolic Left Ventricular Internal Volume，LV Vols)；根据容量公式EF＝[(LV Vold－LV Vols) /LV Vold]×100％计算左室射血分数EF，根据公式FS＝[(LVIDd–LVIDs)/LVIDd] ×100％计算短轴缩短率FS。

6、小鼠心脏组织病理学分析：

颈椎脱臼法处死小鼠，将小鼠心脏取下称重；将小鼠心脏固定于组织固定液中，48小时后将心脏分别进行石蜡包埋和冰冻切片包埋剂包埋，进行石蜡切片和冰冻切片，分别用于H&E染色、Masson染色和WGA染色。

实施例1

Ckip-1 3′UTR过表达对小鼠游泳诱导生理性心肌肥大的心脏表型：

(1)小鼠游泳运动模型：通过游泳运动模拟小鼠生理性心脏肥大。水池中注入清水，加热使水温达到25±1℃。实验前9天为小鼠游泳锻炼适应期，从第一天开始上午、下午各训练1次，每次10分钟，测试完后将身上水擦干。往后始终坚持每天上午、下午各一次，但是每次游泳训练增加10分钟，直至第9天每次游泳90分钟。随后各组小鼠进入正式游泳运动12天，每天上午、下午各一次90分钟，游泳运动实验历时21天。需要注意的是上午、下午各一次时，中间应至少相隔4小时以上。

(2)对WT小鼠和3′UTR TG小鼠进行心脏组织病理学分析，H&E染色和Masson染色结果如图1所示，结果表明，Ckip-1 3′UTR过表达能够促进游泳锻炼导致的有益的心肌肥大。

(3)对WT小鼠和3′UTR TG小鼠进行超声分析，左室射血分数EF和短轴缩短率FS结果如图2和3所示，结果表明，WT小鼠游泳锻炼后出现心室射血分数EF和短轴缩短率FS显著升高，而3′UTR TG小鼠中Ckip-1 3′UTR的过表达则能够促进游泳锻炼导致的心脏功能增强。

实施例2

Ckip-1 3′UTR过表达对小鼠TAC诱导病理性心肌肥大的心脏表型

(1)提取WT小鼠和3′UTR TG小鼠各组织中的RNA，反转录后进行实时荧光定量PCR检测小鼠各个组织Ckip-1 3′UTR表达，其中PCR检测时Ckip-1 3′ UTR的引物序列如表5所示。

表5

Mouse Gapdh-F	SEQ NO.2：5’-actccactcacggcaaattca-3’
		Mouse Gapdh-R	SEQ NO.3：5’-ggcctcaccccatttgatg-3’
Mouse Ckip-1 3′UTR-F	SEQ NO.4：5’-gggggcaggtctgaaat-3’
		Mouse Ckip-1 3′UTR-R	SEQ NO.5：5’-tgcaacatttggagataaagag-3’

小鼠各组织中Ckip-1 3′UTR的表达结果如图4所示，结果表明，Ckip-1 3′ UTR在3′UTR TG小鼠的心脏组织中特异性高表达。

(2)对WT小鼠和3′UTR TG小鼠进行心脏组织病理学分析，假手术组和 TAC组的H&E染色、Masson染色和WGA染色结果如图5所示，结果表明， WT小鼠TAC后心脏出现心肌肥大、心肌纤维化和心肌细胞面积增大，而3′UTR TG能够有效缓解以上情况。WGA染色量化分析结果如图6所示，结果表明， 3′UTR TG能够有效缓解TAC导致的心肌细胞面积增大。

(3)对WT小鼠和3′UTR TG小鼠进行超声分析，左室射血分数EF和短轴缩短率FS结果如图7和8所示，结果表明，WT小鼠TAC后出现左心室射血分数EF和短轴缩短率FS显著下降，提示心脏功能下降，而3′UTR TG能够对抗TAC导致的心脏功能下降。

(4)提取WT小鼠和3′UTR TG小鼠心脏组织中的RNA，反转录后进行实时荧光定量PCR检测小鼠心肌重塑相关基因心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)和肌球蛋白重链7(Myh7)的表达；其中，PCR检测小鼠心肌重塑相关基因的引物序列如表6所示。

表6

Mouse Gapdh-F	SEQ NO.6：5’-tcaccaccatggagaaggc-3’
		Mouse Gapdh-R	SEQ NO.7：5’-gctaagcagttggtggtgca-3’
Mouse ANP-F	SEQ NO.8：5’-ttcgggggtaggattgacag-3’
		Mouse ANP-R	SEQ NO.9：5’-cacaccacaagggcttagga-3’
Mouse BNP-F	SEQ NO.10：5’-tgtttctgcttttcctttatctg-3’
		Mouse BNP-R	SEQ NO.11：5’-tctttttgggtgttcttttgtga-3’
Mouseβ-MHC-F	SEQ NO.12：5’-cctcagcagaggagtacagc-3’
		Mouseβ-MHC-R	SEQ NO.13：5’-ggctgagccttggattctca-3’

小鼠心肌重塑相关基因ANP、BNP和Myh7的表达结果如图9-11所示，结果表明，WT小鼠TAC后心肌重塑标志基因ANP、BNP和Myh7的表达显著升高，提示病理性心肌重塑启动，而3′UTR TG能够对抗TAC导致的病理性心肌重塑。

实施例3

腺相关病毒包装的Ckip-1 3′UTR静脉给药对TAC导致的心肌肥大的影响

(1)腺相关病毒包装的Ckip-1 3′UTR构建：将Ckip-1 3′UTR刻录至具有心肌特异启动子启动的腺相关病毒载体AAV9中，构建腺相关病毒包装的Ckip-1 3′UTR(AAV9-cTNT-3′UTR)。病毒构建及包装纯化由汉恒生物完成。

(2)对WT小鼠进行TAC手术，一周后尾静脉注射AAV9-cTNT-3′UTR (1*10¹¹vg/只)，三周后进行心脏超声分析。TAC 4周后的左室射血分数EF和短轴缩短率FS结果如图12和13所示，结果表明，注射AAV9-cTNT-3′UTR后能够对抗TAC导致的心脏功能下降。

(3)对TAC 4周后的WT小鼠进行心脏组织病理学分析，Masson染色和 WGA染色结果如图14所示，结果表明，注射AAV9-cTNT-3′UTR能够有效缓解TAC后心脏出现的心肌细胞横截面积增大和纤维化增加。

(4)小鼠TAC 4周后的心脏重量指数变化如图15所示，结果表明，注射 AAV9-cTNT-3′UTR能够有效缓解TAC后的心脏体重指数显著增高。

(5)提取小鼠心脏RNA，反转录后进行实时荧光定量PCR检测小鼠心肌重塑相关基因ANP、BNP和Myh7的表达，检测心肌重塑标志基因的引物序列同表6。小鼠心肌重塑相关基因ANP、BNP和Myh7的表达结果如图16-18所示，结果表明，注射AAV9-cTNT-3′UTR能够对抗TAC后导致的病理性心肌重塑。

综上所述，发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则之下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国航天员科研训练中心

<120> Ckip-1 3' UTR在预防和或治疗心力衰竭疾病药物中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 101

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagggggggc aggtctgaaa tttggggggg cacagactct ttatctccaa atgttgcagg 60

ataaagcttt tttatttacc tcaatccaaa aaaaaaaaaa a 101

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actccactca cggcaaattc a 21

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggcctcaccc catttgatg 19

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggggcaggt ctgaaat 17

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgcaacattt ggagataaag ag 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcaccaccat ggagaaggc 19

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctaagcagt tggtggtgca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcgggggta ggattgacag 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacaccacaa gggcttagga 20

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgtttctgct tttcctttat ctg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tctttttggg tgttcttttg tga 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctcagcaga ggagtacagc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggctgagcct tggattctca 20

Claims

1. 过表达Ckip-1 3' UTR的质粒在制备预防和/或治疗TAC导致的心力衰竭疾病的药物中的用途，所述Ckip-1 3' UTR的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

2. 一种携带Ckip-1 3' UTR的腺相关病毒在制备用于治疗TAC导致的心力衰竭疾病的药物中的用途，所述腺相关病毒的载体为AAV9载体，所述Ckip-1 3' UTR的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。

3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述携带Ckip-13' UTR的腺相关病毒使用时采用静脉注射方式。