CN112587662A - 一种miR-155/PEA15信号通路抑制剂在病理性心脏重构药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明第一方面提供了一种miR‑155/PEA15信号通路抑制剂；本发明第二方面提供了一种含有miR‑155/PEA15信号通路抑制剂的靶向药物；本发明第三方面提供了靶向药物在制备用于预防、治疗病理性心脏重构药物的应用；本发明通过qRT‑PCR发现在病理性心室重构中，miR‑155表达明显升高，进一步的功能性实验发现，通过运动或miR‑155 sponge抑制miR‑155的表达可以降低下游基因PEA15表达并显著改善心室重构，而且通过运动抑制PEA15表达亦可显著改善心室重构。据此，可将miR‑155/PEA15分子信号通路应用于开发抑制病理性心脏重构的靶向药物。

Description

一种miR-155/PEA15信号通路抑制剂在病理性心脏重构药物 中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药工程领域，本发明涉及一种miR-155/PEA15信号通路抑制剂在病理性心脏重构药物中的应用。

背景技术

心肌梗死(简称心梗)是全球发病率和死亡率最高的疾病之一，我国累计约有2.9亿心血管病患者，而每年新发心梗患者高达250万。病理性心脏重构是在心脏遭受缺血、缺氧、负荷增加等病理性刺激后所发生的一种适应性改变，是多种心血管疾病发生发展的重要阶段，进一步将导致心功能下降、心脏纤维化，并最终发展为心力衰竭。临床上针对急性心肌梗死患者最关键也最有效的方法就是缺血早期的再灌注治疗，这虽然有效地改善了急性心肌梗死的死亡率，但是心肌组织缺血后再重新恢复血流的过程也会造成大量的心肌细胞坏死和凋亡，这种现象被称为心肌缺血再灌注损伤。临床上常见的病理性心脏重构可发生于心肌缺血再灌注损伤后的重构期，也可发生于高血压、瓣膜反流、心肌梗死等其它心血管疾病中。

运动训练是防治多种心血管疾病的辅助治疗方法。国内外的相关研究表明持久有规律的运动可以促进心脏的生理性肥大和心脏再生，从而保护心肌缺血再灌注损伤及主动脉弓缩窄所致的病理性心脏重构。目前对于病理性心脏重构的治疗，临床上没有特效药物，大部分药物在缓解病理性心脏重构症状的同时具有不可避免的毒副作用。综上，从分子水平寻找病理性心脏重构的诊断指标与干预靶点具有重要的临床意义。

微小RNA是一大类长度约22个碱基的非编码RNA，主要通过作用于靶基因的3’端非翻译区(3’UTR)，降低靶基因mRNA的稳定性或抑制其翻译，在转录后水平负调控靶基因的表达。微小RNA在心脏生理和心血管病中的作用已受到广泛关注。miRNA的功能失调与心梗、心肌肥厚、心力衰竭和心律失常等的发生密切相关。有研究miR-222在运动诱导的生理性心肌肥厚中显著上调，进一步的功能学实验证实miR-222具备抵抗病理性心肌肥厚和心力衰竭的作用。此外，miR-1、miR-15、miR-29、miR-92a、miR-126、miR-133、miR-195、miR-208、miR-320、miR-378和miR-499等均参与心肌缺血再灌注损伤的发生和保护机制。

因而，开发一种miR-155/PEA15信号通路抑制剂用于病理性心脏重构疾病迫在眉睫。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题：如何将miR-155/PEA15信号通路抑制剂应用于病理性心脏重构。本发明采用以下技术方案来实现的。

本发明第一方面，提供了一种miR-155/PEA15信号通路抑制剂，抑制剂能够抑制细胞和组织中miR-155/PEA15的表达、或能够破坏细胞和组织中miR-155/PEA15的稳定性、或能够降低细胞和组织中miR-155/PEA15的活性、或能够降低细胞或者组织中miR-155/PEA15的有效作用时间；

其中，miR-155为一段微小RNA，miR-155包含以下SEQ ID NO；1序列的核酸分子与其前体或成熟体，或基于SEQ ID NO；1序列的核酸分子进行修饰后的核苷酸序列，PEA15为miR-155的下游基因，人PEA15在NCBI GENE数据库的基因ID：8682；小鼠PEA15在NCBI GENE数据库的基因ID：181611。

本发明第二方面，提供了的miR-155/PEA15信号通路抑制剂在病理性心脏重构中的应用。

进一步地，病理性心脏重构是由于心肌梗死、缺血再灌注损伤导致的心脏重构。

本发明第二方面，提供了一种含有miR-155/PEA15信号通路抑制剂的靶向药物，靶向药物的主要成分为miR-155/PEA15信号通路抑制剂，用于治疗病理性心脏重构的靶向药物。

进一步地，miR-155/PEA15信号通路抑制剂包括：蛋白、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。

进一步地，靶向药物的来源是人工合成的，或使用可以过表达该药物的载体转染细胞获得。

进一步地，靶向药物的药物载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂或吸附载体，最终药物疗效为能抑制细胞或组织内的miR-155/PEA15的表达。

进一步地，靶向药物以口服给药或注射给药。

进一步地，注射给药包括静脉注射、肌肉注射、冠状动脉注射或心肌注射。

本发明第三方面，提供了靶向药物在制备用于预防、治疗病理性心脏重构药物的应用。

进一步地，病理性心脏重构包括心肌梗死、心肌缺血损伤。

发明人在研究发现miR-155参与调控心室重构,miR-155在心梗后显著升高，通过运动抑制miR-155的表达可以显著改善心室重构；此外，抑制miR-155可以降低下游基因PEA15表达并显著改善心室重构，而且通过运动抑制PEA15表达亦可显著改善心室重构，同时还发现心肌梗死后miR-155下游基因PEA15亦升高，抑制miR-155可以降低PEA15表达并显著改善心室重构。因此基于miR-155/PEA15抑制剂的病理性心脏重构的创新性靶向药物的研发可以填补靶向药领域的技术空白。

附图说明

图1是小动物心脏超声监测小鼠心功能的结果示意图，结果显示游泳可以提高心肌梗死小鼠的心功能，包括左室射血分数(Ejection Fraction，％)和左室短轴缩短率(Fractional Shortening，％)(n＝8-12)，其中试验分组分别为：静息+假手术组(Sed+Sham)；游泳+假手术组(Swim+Sham)；静息+心梗组(Sed+MI-3W)；游泳+心梗组(Swim+MI-3W)，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001；

图2是荧光定量PCR检测运动后miR-155的表达示意图，结果显示miR-155在心肌梗死小鼠心脏组织中表达升高，且运动可以降低心梗导致的miR-155表达的(U6 RNA作为内参，n＝4)，其中试验分组分别为：静息+假手术组(Sed+Sham)；游泳+假手术组(Swim+Sham)；静息+心梗组(Sed+MI-3W)；游泳+心梗组(Swim+MI-3W)，*，P<0.05；**，P<0.01；

图3是小动物心脏超声监测小鼠心功能的结果示意图，结果显示抑制miR-155可以提高心肌梗死小鼠的心功能，包括左室射血分数(Ejection Fraction，％)和左室短轴缩短率(Fractional Shortening，％)(n＝5-9)，其中试验分组分别为：对照病毒+假手术组(Fugw+Sham)；miR-155抑制慢病毒+假手术组(miR-155Sponge+Sham)；对照病毒+心梗组(Fugw+MI-3W)；miR-155抑制慢病毒+心梗组(miR-155Sponge+MI-3W)，**，P<0.01；***，P<0.001；

图4是免疫印迹法检测心梗小鼠心脏组织中凋亡水平(Bax/Bcl2和Cleaved-caspase3/caspase3的比值)的结果示意图，结果显示抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏组织的凋亡水平(n＝3)，其中试验分组分别为：对照病毒+假手术组(Fugw+Sham)；miR-155抑制慢病毒+假手术组(miR-155Sponge+Sham)；对照病毒+心梗组(Fugw+MI-3W)；miR-155抑制慢病毒+心梗组(miR-155Sponge+MI-3W)，**，P<0.01；***，P<0.001，其中A1-A6分别对应Bax、Bcl2、β-actin、Caspase3、cleaved Caspase3、β-actin；

图5是免疫印迹法检测心梗小鼠心脏组织中纤维化水平(Collagen1/β-actin的比值)的结果示意图，结果显示抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏组织的纤维化水平(n＝3)，其中试验分组分别为：对照病毒+假手术组(Fugw+Sham)；miR-155抑制慢病毒+假手术组(miR-155Sponge+Sham)；对照病毒+心梗组(Fugw+MI-3W)；miR-155抑制慢病毒+心梗组(miR-155Sponge+MI-3W)，***，P<0.001，其中A7-A8分别对应Collagen1、β-actin；

图6是荧光定量PCR法检测心梗小鼠心脏组织中纤维化水平(Col-1a1和α-SMA)的结果示意图，结果显示抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏组织的纤维化水平(n＝5-6)，其中试验分组分别为：对照病毒+假手术组(Fugw+Sham)；miR-155抑制慢病毒+假手术组(miR-155Sponge+Sham)；对照病毒+心梗组(Fugw+MI-3W)；miR-155抑制慢病毒+心梗组(miR-155Sponge+MI-3W)，***，P<0.001；

图7是荧光定量PCR法检测心梗小鼠心脏组织中心脏病理性重构基因的表达水平(ANP和BNP)的结果示意图，结果显示抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏病理性重构基因的表达(n＝5-6)，其中试验分组分别为：对照病毒+假手术组(Fugw+Sham)；miR-155抑制慢病毒+假手术组(miR-155Sponge+Sham)；对照病毒+心梗组(Fugw+MI-3W)；miR-155抑制慢病毒+心梗组(miR-155Sponge+MI-3W)，*，P<0.05；**，P<0.01。

图8是免疫印迹法检测miR-155的下游基因PEA15的结果示意图，结果显示抑制miR-155通过抑制下游基因PEA15，从而抑制病理性心肌重构(n＝3)，其中(A)试验分组分别为：静息+假手术组(Sed+Sham)；游泳+假手术组(Swim+Sham)；静息+心梗组(Sed+MI-3W)；游泳+心梗组(Swim+MI-3W)，(B)试验分组分别为：对照病毒+假手术组(Fugw+Sham)；miR-155抑制慢病毒+假手术组(miR-155Sponge+Sham)；对照病毒+心梗组(Fugw+MI-3W)；miR-155抑制慢病毒+心梗组(miR-155Sponge+MI-3W)，*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001，其中B1-B2分别对应PEA15、β-actin。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1、心肌梗死手术

首先，用腹腔注射麻药方式对小鼠进行麻醉，待小鼠完全麻醉后，用医用胶带将小鼠四肢固定在热毯上，脱毛膏脱毛。然后用75％酒精消毒手术区域，显微剪剪开小鼠颈部皮肤，钝性分离颈部肌肉和组织，暴露出气管，与呼吸机连接，观察小鼠呼吸频率与呼吸机频率相同后开始手术。借助体视镜，在镜下用小剪刀在小鼠左胸口第四肋间和第五肋间处剪开一个开口，露出心脏，轻轻分离心包膜，找到心脏左前降支位置，用带线缝合线进行结扎，30秒后观察到结扎位点以下的区域变白了，说明结扎成功，然后缝合肋骨，再缝合肌肉，最后缝合皮肤。观察小鼠呼吸情况，当小鼠恢复自主呼吸后，拔掉气管插管，把小鼠放回鼠笼继续饲养，术后3周运用小动物心脏超声测定小鼠心功能。

实施例2、小动物心脏超声

设置麻醉诱导盒异氟烷浓度为3％，气流速度为1.0L/分，对小鼠进行麻醉处理。待其翻身反射消失后，迅速将其从麻醉诱导盒中取出，以仰卧位姿势放置于加热板上并将鼻罩戴好，将异氟烷浓度调至1％进行麻醉维持。胸部及上腹部脱毛后，应用高频小动物超声仪Vevo2100(Fujifilm VisualSonics)检测心功能，小鼠心率控制在450-500次/分。在B模下，探头首先寻找到标准胸骨旁左室长轴切面，使得心尖和左心室流出道基本在同一水平，看到左心室乳头肌，并且使左室流出道通畅。切换至M模，将测量轴置于左室长轴的中央位置(乳头肌稍左侧)。分别采集左室长轴M模和B模图像。获得左室射血分数EF和左心室短轴缩短率FS，结果如图1、3所示，结果显示游泳可以提高心肌梗死小鼠的心功能，抑制miR-155可以提高心肌梗死小鼠的心功能。

实施例3、SYBR法检测miR-155、ANP、BNP、α-SMA和Col1a1的相对表达量

细胞和组织RNA提取及miR-155、ANP、BNP、α-SMA和Col1a1的检测：利用RNeasy分钟i Kit(Qiagen)提取细胞和组织中的总RNA。利用SYBR法检测miR-155、ANP、BNP、α-SMA和Col1a1的相对表达量。以U6作为miR-155内参引物，以18S作为其他基因内参引物，采用2^-ΔΔCt法进行计算，检测结果如图2、6、7所示，miR-155在心肌梗死小鼠心脏组织中表达升高，且运动可以降低心梗导致的miR-155表达，抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏组织的纤维化水平，抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏病理性重构基因的表达。

实施例4、蛋白免疫印迹法检测

运用RIPA裂解液添加1％PMSF裂解细胞和组织蛋白，运用BCA Protein Assay Kit测定总蛋白浓度。将蛋白上清液和5×Loading buffer(4:1)混匀后，用100℃水浴5分钟，待温度冷却后放置–20℃储存。配制所需浓度的SDS凝胶，将等量总蛋白上样，经凝胶电泳后转移至PVDF膜。用5％脱脂奶粉封闭2小时。用5％脱脂奶粉按1:1000比例配置一抗Bax、Bcl2和Caspase3，于4℃摇床孵育一抗过夜。次日，用TBST清洗(每次10分钟，洗3次)，用5％脱脂奶粉按1:10000比例配置相应二抗，室温孵育2小时。用TBST清洗，最后使用ECL发光试剂盒在显色仪中曝光显影，蛋白条带使用Image J软件进行灰度值测量，用β-actin作为内参，检测结果如图4、5、8所示，抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏组织的凋亡水平，抑制miR-155可以降低心梗小鼠心脏组织的纤维化水平，抑制miR-155通过抑制下游基因PEA15，从而抑制病理性心肌重构。

实施例5、运动方案设置

将实验小鼠放入直径为80cm，装有33℃温水的水桶里(桶内水深10-12cm)。每个塑料桶1次可供6只小鼠同时进行游泳训练。正式开始试验前一天将小鼠放入水中适应环境，小鼠游泳训练第1天，上午和下午各游泳1次，每次10分钟；第2天，将每次游泳训练的时间增加10分钟。以此类推，直到每次游泳时间递增到90分钟，之后每次游泳时间固定为90分钟，且上午和下午两次游泳训练之间要留出4到6分钟的时间间隔，以供小鼠休息。每次游泳结束后，将小鼠从桶中捞出，暖风吹干毛发后再放回鼠笼饲养。小鼠游泳训练周期为三周。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 上海市徐汇区中心医院，上海大学

<120> 一种miR-155/PEA15信号通路抑制剂在病理性心脏重构药物中的应用

<130> 2020

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

uuaaugcuaa uugugauagg gguu 24

Claims (10)

1.一种miR-155/PEA15信号通路抑制剂，其特征在于，所述抑制剂能够抑制细胞和组织中miR-155/PEA15的表达、或能够破坏细胞和组织中miR-155/PEA15的稳定性、或能够降低细胞和组织中miR-155/PEA15的活性、或能够降低细胞或者组织中miR-155/PEA15的有效作用时间；

其中，所述miR-155为一段微小RNA，所述miR-155包含以下SEQ ID NO；1序列的核酸分子与其前体或成熟体，或基于SEQ ID NO；1序列的核酸分子进行修饰后的核苷酸序列，所述PEA15为所述miR-155的下游基因。

2.如权利要求1所述的miR-155/PEA15信号通路抑制剂的应用，在病理性心脏重构中的应用，所述病理性心脏重构是由于心肌梗死、缺血再灌注损伤导致的心脏重构。

3.一种基于权利要求1所述miR-155/PEA15信号通路抑制剂的靶向药物，其特征在于，所述靶向药物的主要成分为miR-155/PEA15信号通路抑制剂，所述靶向药物是治疗病理性心脏重构的靶向药物。

4.如权利要求3所述的靶向药物，其特征在于，所述miR-155/PEA15信号通路抑制剂包括：蛋白、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。

5.如权利要求3所述的靶向药物，其特征在于，所述靶向药物的来源是人工合成的，或使用可以过表达该药物的载体转染细胞获得。

6.如权利要求3所述的靶向药物，其特征在于，所述靶向药物的药物载体包括但不限于稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂或吸附载体，最终药物疗效为能抑制细胞或组织内的miR-155/PEA15的表达。

7.如权利要求3-6中任一项所述的靶向药物，其特征在于，所述靶向药物以口服给药或注射给药。

8.如权利要求7所述的靶向药物，其特征在于，所述注射给药包括静脉注射、肌肉注射、冠状动脉注射或心肌注射。

9.如权利要求3-6中任一项所述的靶向药物在制备用于预防、治疗病理性心脏重构药物的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病理性心脏重构包括心肌梗死、心肌缺血损伤。

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