CN111286490A - 构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的模型及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用表达上调水平的miRNA‑155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的体外模型以及该模型在开发肿瘤疫苗中的用途。具体而言，本发明涉及采用离体的肿瘤细胞培养上清液构建得到肿瘤相关条件培养基，同时将miRNA‑155的编码基因导入离体的树突状细胞中来上调树突状细胞中的miRNA‑155的表达水平，随后将miRNA‑155表达水平上调后的树突状细胞与所述肿瘤相关条件培养基和水凝胶混合后，通过3D细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。

Description

构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的模型及用途
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫学领域，更具体而言，涉及一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的体外模型以及该模型在开发肿瘤疫苗中的用途。
背景技术
在肿瘤免疫疗法和疫苗开发的背景下，由于其具有激活幼稚T细胞的独特能力，树突状细胞（DC）作为免疫系统的核心处理单元尤为令人关注（参见，X. Zheng等，SilencingIDO in dendritic cells: a novel approach to enhance cancer immunotherapy in amurine breast cancer model，International journal of cancer，132(4)，(2013) 967-77）。同时，本领域已知树突状细胞在控制肿瘤发生发展的过程中扮演着重要角色，而且在肿瘤疫苗开发中，DC作为“天然的佐剂”而受到关注。然而，肿瘤微环境形成的免疫抑制是肿瘤成功地实现免疫逃逸的重要机制之一。
另外，本领域已知在适应性免疫系统和先天免疫系统的细胞中选择性地表达100多种微小RNA（miRNA），且已知miRNA可以调节多种免疫细胞（例如，T细胞、NK细胞和B细胞等）的功能（J.C. Dudda等，MicroRNA-155 is required for effector CD8+ T cellresponses to virus infection and cancer，Immunity，38(4) (2013) 742-53）。但是，目前对于miRNA与构建肿瘤微环境之间的关系，尚缺乏相关的研究。
就肿瘤疫苗开发而言，由于体内代谢过程较为复杂，采用动物模型难以有效、直观地观察到该疫苗在动物体内的肿瘤环境中的情况以及肿瘤免疫逃逸的情况。并且，相对于细胞模型而言，动物模型的开发更加复杂且成本更高。然而，目前的细胞模型与体内肿瘤微环境差异明显。因此，如何成功地构建能够良好地模拟体内肿瘤微环境的体外模型，对于肿瘤疫苗开发而言具有重要意义。
发明内容
针对上述技术问题，本发明人通过研究发现，当DC处于体外的肿瘤微环境中时，通常会导致DC功能障碍，表现为不成熟的状态，这将造成体外的肿瘤微环境模型与体内的肿瘤微环境之间存在极大的差异，并由此使得无法通过体外模型直观地研究疫苗在体内的代谢情况；而通过上调miRNA-155的表达水平能够增强离体的DC的活力和迁移，并由此提高成熟标记物CD80和MHCII的表达，从而使DC以成熟的状态存在于肿瘤微环境（TME）体外模型中，由此得到的TME体外模型能良好地模拟体内肿瘤微环境。
本发明的一个方面是提供一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法，其中，所述方法包括：
（1）对离体的肿瘤细胞进行培养，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；
（2）将miRNA-155的编码基因导入离体的树突状细胞中，经培养后得到表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；
（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与细胞培养基混合，制备肿瘤相关条件培养基，向所述肿瘤相关条件培养基中加入所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞，得到细胞悬液；
（4）将所述细胞悬液与水凝胶混合，得到含有水凝胶的细胞悬液，然后将所述含有水凝胶的细胞悬液、所述肿瘤相关条件培养基以及细胞培养刺激物分别加入预定形状的支持物中进行三维（3D）细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。
本发明的另一方面是提供采用上述方法构建得到的肿瘤微环境体外模型，其中，所述体外模型包括：水凝胶，以及进行三维细胞培养后的表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞。
本发明的又一方面是提供上述的肿瘤微环境体外模型在开发肿瘤疫苗中的用途。
相对于利用miRNA-155表达水平未上调的树突状细胞制备的肿瘤微环境体外模型而言，采用本发明的方法制备的肿瘤微环境体外模型具有如下优点：（1）能够保持细胞的活力并使细胞迁移能力提高大于1倍；（2）分别增高DC的成熟标志物CD80和MHCII的表达水平，且提高总荧光强度；（3）提升激活特异性T细胞增殖的能力并分别增高抗肿瘤因子IFN-γ和IL-2的分泌。而且，相对于采用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞进行二维培养来制备肿瘤微环境体外模型而言，采用本发明的方法制备的肿瘤微环境体外模型能够更好地模拟体内肿瘤的微环境，为开发疫苗奠定基础。
附图说明
图1为示出树突状细胞的miRNA-155的相对表达水平的图表。其中示出了在三维肿瘤培养环境中，野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl中的miRNA-155的相对表达水平。NS代表差异不显著，*代表P<0.05，**代表P<0.01。
图2为示出野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl的细胞迁移率的图表，其中，在相同的条件下，相对于野生型BMDC，BMDC-155表现出显著更高的迁移率。NS代表差异不显著，*代表P<0.05。
图3为示出树突状细胞的成熟度的图表。其中，图3A示出了通过流式细胞术检测到的各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）表面的成熟标志物CD80的表达百分比和总荧光强度；图3B示出了通过流式细胞术检测到的各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）表面的成熟标志物MHCII的表达百分比和总荧光强度。其中，NS代表差异不显著，*代表P<0.05。
图4为示出不同的DC激活的T淋巴细胞增殖程度的图表。其中，通过流式细胞术检测到，比起野生型BMDC，BMDC-155与T细胞混合培养后，能够显著激活T细胞的增殖能力。
图5为示出细胞因子IFN-γ和IL-2各自的表达量的图表。图5A示出了各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）和T淋巴细胞混合培养后的细胞培养上清中的IFN-γ的表达量；图5B示出了示出了各组DC（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）和T淋巴细胞混合培养后的细胞培养上清中的IL-2的表达量。NS代表差异不显著，*代表P<0.05。
图6为示出3D培养的野生型BMDC和BMDC-155的共聚焦显微镜图像，其中，箭头指示出伸展的细胞。
图7为示出2D培养的DC（左侧）和3D培养的DC（右侧）的共聚焦显微镜图像，其中，箭头指示出伸展的细胞。
图8为示出将经2D培养的DC和经3D培养的DC分别同T淋巴细胞混合培养后的细胞培养上清中的细胞因子IFN-γ的表达量的图表。其中，*代表P<0.05。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的科技术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。参见例如Singleton等，Dictionary of Microbiology andMolecular Biology 2nd ed.，J. Wiley & Sons （New York，NY 1994）；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press（Cold SpringsHarbor，NY 1989）。
本领域技术人员将认识到可用于实施本发明的、与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。实际上，本发明并不限于本文所描述的方法和材料，而是可基于本发明的精神，进行各种常规调整或修改，并且调整或修改后的方案仍落入了本发明的保护范围之内。
除非上下文明确地指出，否则本文所使用的术语“一个”和“一种”等涵盖了复数的对象。
在本文中，通过术语“约”修饰的对象涵盖了由于测量误差等引起的误差范围内的近似值。
在本文中，除非另有定义，所使用的术语“肿瘤微环境”是指肿瘤细胞的发生及生活的内环境，具有低氧、低PH以及高压的特点，这些特点使得肿瘤微环境中存在大量的生长因子、细胞趋化因子和各种蛋白水解酶所产生的免疫炎性反应，从而有利于肿瘤的增殖、侵袭、粘附、血管生成以及抗放射化疗，促使恶性肿瘤产生。
在一个实施方式中，本发明涉及一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法，其中，所述方法包括：
（1）对离体的肿瘤细胞进行培养，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；
（2）将miRNA-155的编码基因导入离体的树突状细胞中，经培养后得到表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；
（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与细胞培养基混合，制备肿瘤相关条件培养基，向所述肿瘤相关条件培养基中加入所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞，得到细胞悬液；
（4）将所述细胞悬液与水凝胶混合，得到含有水凝胶的细胞悬液，然后将所述含有水凝胶的细胞悬液、所述肿瘤相关条件培养基以及细胞培养刺激物分别加入预定形状的支持物中进行三维（3D）细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。
在一个优选的实施方式中，所述肿瘤细胞可为本领域已知的任何肿瘤细胞，例如，来自选自如下的一种或多种癌症的细胞：肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、白血病及淋巴瘤。仅作为示例，但不受限地，所述肿瘤细胞可选自人非小细胞肺癌细胞NCI-H810、人鼻咽癌细胞CNE1、人食管鳞癌细胞KYSE-150、人胃癌细胞BGC-823、人大肠癌细胞CCL229、人肝癌细胞SNU-368、小鼠乳腺癌4T1细胞、人乳腺癌MDA-231、MCF-7细胞、SKBR3细胞、Hela细胞、小鼠结肠癌细胞CT-26、人结肠癌细胞WiDr、人结肠腺癌细胞CW-2、小鼠肾癌细胞Renca、人白血病细胞NB4、人白血病细胞HL-60、HepG2细胞、A549细胞、HT-29细胞或人淋巴瘤细胞HTL-90。
在本发明的一个优选的实施方式中，在步骤（1）中，所述肿瘤细胞的培养可以采用本领域已知的任何的合适的培养基（例如，可参见如下中的记载：http://www.cellbank.org.cn/peiyang.asp；https://www.atcc.org/）进行，例如但不限于含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基、含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。在进一步优选的实施方式中，所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行。在更进一步优选的实施方式中，所述培养的过程包括：将所述肿瘤细胞在所述培养基中生长至60%~80%的汇合度后，弃去培养液并利用PBS缓冲液进行洗涤，随后向洗涤后的培养物中加入新鲜培养基并继续培养36h以上、例如36~72h、优选40~50h。
在一个优选的实施方式中，采用孔径为0.2~0.45μm的过滤材料对所述细胞培养上清液进行过滤。过滤得到的细胞培养上清液中主要包含：肿瘤细胞分泌的蛋白质（包括作为影响免疫细胞功能的主要物质的多种细胞因子）；非编码RNA（包括小RNA和长链RNA等）；DNA等。
本文中提到的树突状细胞可为可商购得到的树突状细胞，或者可为采用本领域已知的常规手段分离得到的树突状细胞。
在一个优选的实施方式中，用含有miRNA-155的编码基因的重组表达载体转染离体的树突状细胞，从而导入所述miRNA-155的编码基因。
在一个优选的实施方式中，所述重组表达载体可以为miRNA-155过表达慢病毒载体、miRNA-155过表达腺病毒载体、miRNA-155过表达重组质粒载体。关于所述含有miRNA-155的编码基因的重组表达载体的构建，可采用本领域已知的技术手段进行，所述手段记载于例如，J. 萨姆布鲁克等著，贺福初翻译，《分子克隆实验指南（第四版）》，科学出版社，2017年3月。
在一个优选的实施方式中，相对于导入所述miRNA-155的编码基因之前的树突状细胞，所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞中的miRNA-155的表达水平上调2倍以上，例如2-5倍，优选3-4倍（例如3.6倍）。
在本发明的一个优选的实施方式中，可以将导入miRNA-155的编码基因的离体的树突状细胞在本领域已知的任何的合适的培养基（例如，可参见如下中的记载：http://www.cellbank.org.cn/peiyang.asp；https://www.atcc.org/）中进行所述培养，所述培养基例如但不限于含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基、含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。在进一步优选的实施方式中，所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行。在更进一步优选的实施方式中，所述培养进行36h以上、例如36~72h、优选40~50h。
在一个优选的实施方式中，将所述经过滤的细胞培养上清液与所述细胞培养基以1:(2~6)、例如1:4的体积比进行混合。
在一个优选的实施方式中，在步骤（3）中，所述细胞培养基可为本领域已知的任何的合适的培养基（例如，可参见如下中的记载：http://www.cellbank.org.cn/peiyang.asp；https://www.atcc.org/），例如但不限于含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基、含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
在本文中，所述水凝胶为可商购的或者本领域技术人员按照现有的技术知识制备的能够用于细胞三维培养的任何水凝胶。作为优选的示例，所述水凝胶例如包括但不限于，Geltrex® Matrix基质胶、PuraMatrix®肽水凝胶（即，RADA16）、Corning® Matrigel®基质胶、VitroGelTM 3D水凝胶或GrowDex水凝胶。
在一个优选的实施方式中，以1:(1~5)、优选1:(2~4)、例如1:3的体积比将所述水凝胶与所述细胞悬液进行混合。
在一个优选的实施方式中，每mL所述含有水凝胶的细胞悬液中，具有1×104~1×107个、优选5×104~1×106个、例如1×105个所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞。
在一个优选的实施方式中，所述预定形状的支持物可为三维细胞培养支架、细胞培养皿、细胞培养瓶、细胞培养微孔板、双层细胞培养板或本领域已知的任何适用于三位细胞培养的系统，例如6孔细胞培养微孔板、12孔细胞培养微孔板、24孔细胞培养微孔板、96孔细胞培养微孔板、24孔双层细胞培养板或本领域可商购的任何细胞培养微孔板，例如由Thermofisher、FlexCell等提供的商业化的三维细胞培养系统。
在一个优选的实施方式中，所述细胞培养刺激物选自LPS、CpG或OVA。优选地，所述细胞培养刺激物为0.1-10 μg/mL、例如0.5-2 μg/mL的LPS。
在一个优选的实施方式中，所述3D细胞培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行2-72h、例如3-72h、6-72h。
在一个实施方式中，本发明涉及采用上述方法构建得到的肿瘤微环境体外模型，其中，所述体外模型包括：水凝胶，以及进行三维细胞培养后的表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞。
在一个优选的实施方式中，所述水凝胶为可商购的或者本领域技术人员按照现有的技术知识制备的能够用于细胞三维培养的任何水凝胶，作为优选的示例，所述水凝胶例如包括但不限于，Geltrex® Matrix基质胶、PuraMatrix®肽水凝胶、Corning® Matrigel®基质胶、VitroGelTM 3D水凝胶或GrowDex水凝胶。
在一个优选的实施方式中，相对于导入所述miRNA-155的编码基因之前的树突状细胞，所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞中的miRNA-155的表达水平上调2倍以上，例如2-5倍，优选3-4倍（例如3.6倍）。
在一个实施方式中，本发明涉及上述的肿瘤微环境体外模型在开发肿瘤疫苗中的用途。例如，通过将经常规的物理、化学或生物方法处理后的自体或同种异体肿瘤细胞接种至该肿瘤微环境体外模型来开发适宜的肿瘤疫苗。
例如，将含有胎牛血清和青霉素的RPMI-1640完全培养基用于培养小鼠乳腺癌4T1细胞。具体而言，取对数期生长的4T1细胞，以每孔1~3 ml接种于6孔板中，至细胞浓度为0.1~10×106个/孔。当细胞生长至60%~80%汇合度时，弃去培养液并用PBS缓冲液洗涤两次。向洗涤后的培养物中加入新鲜的上述的完全培养基并继续培养例如36~72小时，收集肿瘤细胞培养上清液，并通过0.22μm或0.45μm的过滤器过滤。将过滤后的肿瘤细胞培养上清液例如按1:(2~6)的体积比与上述的完全培养基混合，配制肿瘤相关条件培养基，并随后将该培养基与表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞和水凝胶进行混合以用于进行3D细胞培养，从而制备得到肿瘤微环境体外模型。
本发明的示例性的技术方案可通过如下编号段落中记载的内容加以说明：
1. 一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法，其中，所述方法包括：
（1）对离体的肿瘤细胞进行培养，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；
（2）将miRNA-155的编码基因导入离体的树突状细胞中，经培养后得到表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；
（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与细胞培养基混合，制备肿瘤相关条件培养基，向所述肿瘤相关条件培养基中加入所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞，得到细胞悬液；
（4）将所述细胞悬液与水凝胶混合，得到含有水凝胶的细胞悬液，然后将所述含有水凝胶的细胞悬液、所述肿瘤相关条件培养基以及细胞培养刺激物分别加入预定形状的支持物中进行三维（3D）细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。
2. 如段落1所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为来自选自如下的一种或多种癌症的细胞：肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、白血病及淋巴瘤。
3. 如段落1或2所述的方法，其中，所述肿瘤细胞选自人非小细胞肺癌细胞NCI-H810、人鼻咽癌细胞CNE1、人食管鳞癌细胞KYSE-150、人胃癌细胞BGC-823、人大肠癌细胞CCL229、人肝癌细胞SNU-368、小鼠乳腺癌4T1细胞、人乳腺癌MDA-231、MCF-7细胞、SKBR3细胞、Hela细胞、小鼠结肠癌细胞CT-26、人结肠癌细胞WiDr、人结肠腺癌细胞CW-2、小鼠肾癌细胞Renca、人白血病细胞NB4、人白血病细胞HL-60、HepG2细胞、A549细胞、HT-29细胞或人淋巴瘤细胞HTL-90。
4. 如段落1-3中任一段所述的方法，其中，在步骤（1）中，采用选自如下的培养基对所述离体的肿瘤细胞进行培养：含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基或含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
5. 如段落1-4中任一段所述的方法，其中，在步骤（1）中，所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行。
6. 如段落5所述的方法，其中，所述培养的过程包括：将所述肿瘤细胞在所述培养基中生长至60%~80%的汇合度后，弃去培养液并利用PBS缓冲液进行洗涤，随后向洗涤后的培养物中加入新鲜培养基并继续培养36h以上、例如36~72h、优选40~50h。
7. 如段落1-6中任一段所述的方法，其中，采用孔径为0.2~0.45μm的过滤材料对所述细胞培养上清液进行过滤。
8. 如段落1-7中任一段所述的方法，其中，用含有miRNA-155的编码基因的重组表达载体转染离体的树突状细胞，从而导入所述miRNA-155的编码基因。
9. 如段落1-8中任一段所述的方法，其中，所述重组表达载体选自miRNA-155过表达慢病毒载体、miRNA-155过表达腺病毒载体或miRNA-155过表达重组质粒载体。
10. 如段落1-9中任一段所述的方法，其中，相对于导入所述miRNA-155的编码基因之前的树突状细胞，所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞中的miRNA-155的表达水平上调2倍以上，例如2-5倍，优选3-4倍。
11. 如段落1-10中任一段所述的方法，其中，将导入所述miRNA-155的编码基因的离体的树突状细胞在选自如下的培养基中进行所述培养：含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基或含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
12. 如段落11所述的方法，其中，所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行。
13. 如段落11或12所述的方法，其中，所述培养进行36h以上、例如36~72h、优选40~50h。
14. 如段落1-13中任一段所述的方法，其中，将所述经过滤的细胞培养上清液与所述细胞培养基以1:(2~6)的体积比进行混合。
15. 如段落1-14中任一段所述的方法，其中，在步骤（3）中，所述细胞培养基选自：含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基或含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
16. 如段落1-15中任一段所述的方法，其中，所述水凝胶选自Geltrex® Matrix基质胶、PuraMatrix®肽水凝胶（即，RADA16）、Corning® Matrigel®基质胶、VitroGelTM3D水凝胶或GrowDex水凝胶。
17. 如段落1-16中任一段所述的方法，其中，以1:(1~5)、优选1:(2~4)的体积比将所述水凝胶与所述细胞悬液进行混合。
18. 如段落1-17中任一段所述的方法，其中，每mL所述含有水凝胶的细胞悬液中，具有1×104~1×107个、优选5×104~1×106个、例如1×105个所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞。
19. 如段落1-18中任一段所述的方法，其中，所述预定形状的支持物选自三维细胞培养支架、细胞培养皿、细胞培养瓶、细胞培养微孔板或双层细胞培养板。
20. 如段落19所述的方法，其中，所述预定形状的支持物选自6孔细胞培养微孔板、12孔细胞培养微孔板、24孔细胞培养微孔板、96孔细胞培养微孔板或24孔双层细胞培养板。
21. 如段落1-20中任一段所述的方法，其中，所述细胞培养刺激物选自LPS、CpG或OVA。
22. 如段落21所述的方法，其中，所述细胞培养刺激物为0.1-10 μg/mL、例如0.5-2 μg/mL的LPS。
23. 如段落1-22中任一段所述的方法，其中，所述3D细胞培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行2-72h。
24. 采用段落1-23中任一段所述的方法构建得到的肿瘤微环境体外模型，其中，所述体外模型包括：水凝胶，以及进行三维细胞培养后的表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞。
25. 如段落24所述的方法，其中，所述水凝胶选自Geltrex® Matrix基质胶、PuraMatrix®肽水凝胶、Corning® Matrigel®基质胶、VitroGelTM 3D水凝胶或GrowDex水凝胶。
26. 如段落24或25所述的方法，其中，相对于导入所述miRNA-155的编码基因之前的树突状细胞，所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞中的miRNA-155的表达水平上调2倍以上，例如2-5倍，优选3-4倍。
27. 段落24-26中任一段所述的肿瘤微环境体外模型在开发肿瘤疫苗中的用途。
以下通过实施例对本发明的方案进行进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例
如下的实施例仅用于说明的目的，而并非旨在限定本申请的保护范围。除非另有说明，否则如下的实施例中使用的所有试剂、材料和设备均为可商购的，或者可根据本领域公知的现有技术进行配制或获得。除非另有说明，否则如下的实施例中涉及的具体实验手段均为本领域的现有技术（例如，《分子克隆实验指南》（第4版），J. 萨姆布鲁克等编著，贺福初主译，科学出版社，2017年；《医学免疫学》（第7版），曹雪涛主编，人民卫生出版社，2018年）中记载的常规手段。
实施例1 肿瘤细胞培养上清液的制备
将含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素的RPMI-1640完全培养基以2mL/孔的体积分别加入6孔板的各孔中，用于培养小鼠乳腺癌4T1细胞。取对数期生长的4T1细胞培养液，以每孔2mL接种于6孔板中，至细胞浓度为1×106个/孔。在37℃、5% CO2下于培养箱中进行培养。当细胞生长至70%汇合度时，弃去培养液并用2 mL的PBS（磷酸盐缓冲盐水）缓冲液洗涤两次。然后，向各孔的培养物中以2mL/孔的体积加入上述的RPMI-1640完全培养基并继续培养48小时，收集细胞培养上清液，并通过0.22μm过滤器过滤。将过滤后的肿瘤细胞培养上清液按1:4的体积比与上述的RPMI-1640完全培养基混合后，作为肿瘤相关条件培养基1备用。
按照如上所述的操作，进一步得到MDA-231、HepG2、A549、HT-29肿瘤细胞培养上清液，并分别按1:4的比与上述的完全培养基混合后，作为肿瘤相关条件培养基2-5置于-80℃冰箱备用。
实施例2 小鼠骨髓树突状细胞（BMDC）的分离和培养
将C57BL/6小鼠安乐死并分离股骨和胫骨。将分离后的股骨和胫骨浸泡在70 vol%酒精中消毒2分钟，用10 mL的PBS缓冲液洗涤两次，然后剪断骨的两端，通过注射器利用1 mL的PBS缓冲液反复洗涤骨髓细胞，通过200目滤器过滤，向所得的过滤物中加入3倍体积的红细胞裂解液（购自Solarbio有限公司，货号：R1010）进行裂解，收集细胞。将细胞以2×106个/mL的密度接种于6孔板中，各孔预先分别加入2mL的含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素的RPMI-1640培养基，该培养基补充有GM-CSF（20ng/mL）和IL-4（20ng/mL）。在37℃、5% CO2下于培养箱中进行培养。在培养的第3天和第5天更换新鲜培养基，在培养的第6天收集得到BMDC细胞。
实施例3 miRNA-155过表达慢病毒载体和对照载体的构建
根据miRBase数据库记载的登录号MIMAT0000165的相关信息，通过北京合生基因有限公司合成miRNA-155序列（UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU；SEQ ID No: 1）作为目的片段，将miRNA-155目的片段利用T4连接酶体系（购自NEB）按照制造商的说明书插入载体pHS-AMR中，完成载体构建后，对载体进行测序验证并构建得到miRNA-155过表达正确的质粒（即，miRNA-155过表达慢病毒载体）。同时以未插入序列的空载体作为对照质粒（即，对照载体）。
实施例4 表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞的制备和3D细胞培养
将实施例2中于培养第6天收集得到的BMDC用含有10%胎牛血清和100U/mL青霉素的RPMI-1640完全培养基调整为5×104个/mL并接种于96孔板中。将构建得到的miRNA-155过表达慢病毒载体和对照载体分别用上述完全培养基稀释为1×107 TU/mL，然后向上述96孔板的各孔中加入50 μL。转染后12h将培养基更换回新鲜的上述完全培养基，保持细胞正常生长，在37℃、5% CO2下于培养箱中培养48小时后，收集转染后的细胞进行后续实验。
将收集到的转染上述慢病毒载体后的BMDC重悬于实施例1制备的各肿瘤相关条件培养基1-5中，得到相应的各细胞悬液（4×105个细胞/mL）。将Geltrex® Matrix基质胶溶液置于4℃冰箱过夜缓慢解冻后，于冰上将Geltrex® Matrix基质胶与上述的各细胞悬液分别按照1:3的体积比混合均匀，调整其中的细胞浓度为1×105个/mL，于37℃孵育30分钟以促进基质胶凝，得到包含凝胶的各细胞悬液。取无菌的24孔双层细胞培养板（置于冰上），在上层细胞培养板中，每孔加入200 μL上述的包含凝胶的各细胞悬液。在下层细胞培养板中分别加入实施例1中制备的相应的肿瘤相关条件培养基1-5（各500 μL）及1 μg/mL的LPS（购自购自Solarbio有限公司，货号：L8880），于37℃、5% CO2孵箱中进行3D培养，分别培养3h（采用肿瘤相关条件培养基1）、16h（采用肿瘤相关条件培养基2）、24h（采用肿瘤相关条件培养基3）、48h（采用肿瘤相关条件培养基4）、72h（采用肿瘤相关条件培养基5）后，得到了各肿瘤微环境体外模型。
实施例5 实时定量PCR测定miRNA-155的相对表达水平
将实施例2中得到的野生型BMDC直接重悬于实施例1中利用4T1细胞制备的肿瘤相关条件培养基1中以得到相应的细胞悬液（4×105个/mL），按照实施例4所述的3D培养操作和条件（采用肿瘤相关条件培养基1），对野生型BMDC进行3D细胞培养（记为“BMDC”），得到对照的肿瘤微环境体外模型。使用Trizol试剂（购自Thermofisher公司）分别提取BMDC和实施例4中制备的用miRNA-155过表达慢病毒载体和对照载体转染后的BMDC（分别记为“BMDC-155”和“BMDC-ctrl”）的总RNA，按照A260:A280的比例测定纯度，并使用PrimeScript miRNA RT试剂盒按照制造商的说明书进行逆转录（引物为Oligo dT）。采用SYBR-Green PCR MasterMix（Roche）试剂，在ABI PRISM 7500系统上进行实时定量PCR（上游引物F：GTGGGTTAATGCTAATTGTGAT（SEQ ID No: 2），下游引物R：GTG CAGGGTCCG AGGT（SEQ ID No:3））。以GAPDH为对照（上游引物F’：GGTGAAGGT CGGTGTGAACG（SEQ ID No: 4），下游引物R’：CTCGCTCCTGGAAGATGGTG（SEQ ID No: 5）），来确定miRNA-155的相对表达水平。将结果在下表中示出（见图1）。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例6 细胞迁移实验
采用24孔Transwell培养小室（8.0 μm，Corning，NY，USA）进行细胞迁移测定。将野生型BMDC（称为“BMDC”）、BMDC-155和BMDC-ctrl细胞悬液（利用肿瘤相关条件培养基1配制，4×105个/mL）与Geltrex® Matrix基质胶按实施例4中的混合比例和操作进行混合后，将5×104个细胞接种到细胞板上部小室中，在37℃、5% CO2下于培养箱中培养48小时后取出，用棉签擦拭未迁移至下层的细胞，同时对迁移至下层的细胞用DAPI染色并通过荧光显微镜观察，每组随机选择5个视野，统计细胞数目。
结果如图2所示，可以看出，相比于野生型BMDC（简称为“BMDC”），BMDC-ctrl表现出实质上相同的迁移能力，而本发明的BMDC-155具有显著更好的迁移能力，这表明通过提高树突细胞表达的miRNA-155的水平，能够保持细胞的活力并有助于提高树突状细胞的迁移能力（提高约1.22倍）。
实施例7 利用流式细胞术分析DC成熟度
对于野生型BMDC、实施例4中制备的BMDC-155和BMDC-ctrl，从上述的各组细胞中取1×106个细胞利用流式细胞仪来分析各组细胞的表面标志物。其中，对于各组的细胞，按剂量1µg/2×106个细胞添加两组不同的荧光抗体：小鼠CD11c-APC和MHCII-FITC荧光抗体以及小鼠CD11c-APC和CD80-FITC荧光抗体；其中，以未用荧光抗体染色的细胞作为空白对照。避光于4℃冰上孵育30分钟后，将各组细胞用1mL在4℃冰上预冷的PBS缓冲液洗涤两次，然后分别在BD Accuri C6流式细胞仪上进行检测（测定细胞表面的CD11c、CD80和CD11c、MHCII的表达百分比），将得到的数据使用BD Accuri C6软件（BD Biosciences，美国）进行分析。结果在图3A和图3B中示出。
由图3A和图3B可以看出，与野生型BMDC（简称为“BMDC”）比较，转染对照载体的DC（BMDC-ctrl）的成熟标志物CD80和MHCII的阳性百分比和总荧光强度表达水平基本上没有提高，差异并不显著（P<0.05）；转染miRNA-155过表达病毒载体的BMDC-155细胞中的CD80和MHCII的阳性细胞百分比分别提高约7.7%和7.5%，总荧光强度提高27%和17%，在统计学上显著（P<0.05）。这些结果表明，更高水平的miRNA-155能够有效地激活BMDC共刺激分子的表达，增强离体的树突状细胞的成熟水平，从而有助于促进T细胞免疫应答。
实施例8 确定BMDC激活特异性T淋巴细胞增殖的能力
取6-8周龄的C57/BL-6雌性小鼠，将OVA（50μg/只）接种于小鼠腹股沟处，隔周免疫，共免疫两次。于末次免疫后4天取淋巴结，分离纯化T淋巴细胞，CFSE标记后（终浓度为5 μM）与各组（野生型BMDC、BMDC-155和BMDC-ctrl）灭活的DC按50:1的密度比混合，同时加入2.5μg/mL的OVA刺激并接种200μL于细胞培养板中，在与实施例4相同的3D培养条件（采用肿瘤相关条件培养基1）下培养72小时后，流式细胞仪检测T淋巴细胞的增殖情况。结果在图4中示出。
由图4可以看出，与T淋巴细胞混合并共培养3天后，BMDC-155能够显著激活OVA特异性的T细胞增殖，而BMDC-ctrl和野生型BMDC（简称为“BMDC”）几乎没有激活T细胞的增殖。
实施例9 酶联免疫吸附测定（ELISA）
收集实施例8中的T淋巴细胞与各组BMDC的混合物的细胞培养上清作为待测样品，采用IFN-γ和IL-2检测试剂盒（eBioscience），根据制造商的说明书测量IFN-γ和IL-2的细胞因子浓度。简而言之，根据双抗体夹心ELISA法测定样品中的细胞因子IFN-γ和IL-2的浓度。以100μl/孔捕获抗体包被酶标板，用1 × Assay Diluent按1:4的体积比稀释样品，同时按1:2000比例稀释IFN-γ和IL-2标准品，将稀释后的样品和标准品取100μl加入96孔的培养板中，室温孵育2小时，用200μl的PBST清洗后继续添加100μl的生物素标记的抗鼠IL-2和IFN-γ抗体，室温30分钟后用250 μl × 5次的PBST清洗，加入100μl的辣根过氧化物酶标记的亲和素底物，用250 μl × 7次的PBST洗去未结合成分，加入显色液，在OD450 nm下读取数值。根据标准曲线计算细胞因子浓度。结果在图5中示出。
由图5可以看出，相比于野生型BMDC（简称为“BMDC”）与T淋巴细胞的混合物，在共培养3天后，BMDC-155与T淋巴细胞的混合物的培养上清中的IFN-γ和IL-2的分泌分别提高1.52倍和1.37倍，而BMDC-ctrl与T淋巴细胞的混合物的培养上清中的IFN-γ和IL-2的表达量基本上没有变化。
对比例1 野生型的树突状细胞的3D细胞培养和测定
除了将实施例2中得到的野生型BMDC直接重悬于实施例1中利用4T1细胞制备的肿瘤相关条件培养基中以得到相应的细胞悬液（4×105个/mL）之外，按照实施例4所述的3D培养操作和条件（采用肿瘤相关条件培养基1），对野生型BMDC进行3D细胞培养，得到对照的肿瘤微环境体外模型。
如图6所示，与上述的对照的肿瘤微环境体外模型相比，在实施例4中采用肿瘤相关条件培养基1对转染miRNA-155过表达慢病毒载体后的BMDC进行3D培养得到的肿瘤微环境体外模型中，细胞呈现为球状，更多的细胞显示出树突状突起，因而能够更好的模拟体内肿瘤微环境。
对比例2 表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞的2D细胞培养和测定
将实施例4中制备的转染miRNA-155过表达慢病毒载体后的BMDC重悬于实施例1中利用4T1细胞制备的肿瘤相关条件培养基1中，得到相应的细胞悬液。向所述细胞悬液中加入1 μg/mL的LPS（购自购自Solarbio有限公司，货号：L8880），于37℃、5% CO2孵箱中培养6小时。
如图7所示，作为对比的经2D培养的DC细胞生长在平面环境下，容易形成集落，细胞多呈现出圆形；相比而言，实施例4中的经3D培养的DC细胞处于立体的生长环境中，细胞能够充分伸展，呈现为球状，更多的细胞显示出树突状突起，接近于体内的形态，因而能够更好的模拟体内肿瘤微环境。同时，如图8所示，相比于将该对比例的经2D培养的DC细胞与T淋巴细胞进行的混合培养（按照实施例9的培养条件和操作进行），将实施例4中的经3D培养的DC细胞与T淋巴细胞混合培养后，能够分泌显著更高量的细胞因子IFN-γ（P<0.05）。
序列表
<110> 南通大学
<120> 构建肿瘤微环境体外模型的方法、由此构建的模型及用途
<130> 20200303
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
uuaaugcuaa ucgugauagg ggu 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgggttaat gctaattgtg at 22
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtgaaggtc ggtgtgaacg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctcgctcctg gaagatggtg 20

Claims (10)

1.一种利用表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞来构建肿瘤微环境体外模型的方法，其中，所述方法包括：
（1）对离体的肿瘤细胞进行培养，得到细胞培养上清液并进行过滤，得到经过滤的细胞培养上清液；
（2）将miRNA-155的编码基因导入离体的树突状细胞中，经培养后得到表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；
（3）将所述经过滤的细胞培养上清液与细胞培养基混合，制备肿瘤相关条件培养基，向所述肿瘤相关条件培养基中加入所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞，得到细胞悬液；
（4）将所述细胞悬液与水凝胶混合，得到含有水凝胶的细胞悬液，然后将所述含有水凝胶的细胞悬液、所述肿瘤相关条件培养基以及细胞培养刺激物分别加入预定形状的支持物中进行三维（3D）细胞培养，得到肿瘤微环境体外模型。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述肿瘤细胞为来自选自如下的一种或多种癌症的细胞：肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、白血病及淋巴瘤；
优选地，所述肿瘤细胞选自人非小细胞肺癌细胞NCI-H810、人鼻咽癌细胞CNE1、人食管鳞癌细胞KYSE-150、人胃癌细胞BGC-823、人大肠癌细胞CCL229、人肝癌细胞SNU-368、小鼠乳腺癌4T1细胞、人乳腺癌MDA-231、MCF-7细胞、SKBR3细胞、Hela细胞、小鼠结肠癌细胞CT-26、人结肠癌细胞WiDr、人结肠腺癌细胞CW-2、小鼠肾癌细胞Renca、人白血病细胞NB4、人白血病细胞HL-60、HepG2细胞、A549细胞、HT-29细胞或人淋巴瘤细胞HTL-90；
优选地，在步骤（1）中，采用选自如下的培养基对所述离体的肿瘤细胞进行培养：含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基或含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基；
优选地，在步骤（1）中，所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行；进一步优选地，所述培养的过程包括：将所述肿瘤细胞在所述培养基中生长至60%~80%的汇合度后，弃去培养液并利用PBS缓冲液进行洗涤，随后向洗涤后的培养物中加入新鲜培养基并继续培养36h以上、例如36~72h、优选40~50h；
优选地，采用孔径为0.2~0.45μm的过滤材料对所述细胞培养上清液进行过滤。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，用含有miRNA-155的编码基因的重组表达载体转染离体的树突状细胞，从而导入所述miRNA-155的编码基因；
优选地，所述重组表达载体选自miRNA-155过表达慢病毒载体、miRNA-155过表达腺病毒载体或miRNA-155过表达重组质粒载体；
优选地，相对于导入所述miRNA-155的编码基因之前的树突状细胞，所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞中的miRNA-155的表达水平上调2倍以上，例如2-5倍，优选3-4倍。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，将导入所述miRNA-155的编码基因的离体的树突状细胞在选自如下的培养基中进行所述培养：含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基或含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基；
优选地，所述培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行；
优选地，所述培养进行36h以上、例如36~72h、优选40~50h。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，将所述经过滤的细胞培养上清液与所述细胞培养基以1:(2~6)的体积比进行混合；
优选地，在步骤（3）中，所述细胞培养基选自：含有胎牛血清的RPMI-1640培养基、含有胎牛血清的DMEM培养基、含有胎牛血清的F-12培养基或含有胎牛血清的DMEM/F-12培养基。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述水凝胶选自Geltrex® Matrix基质胶、PuraMatrix®肽水凝胶（即，RADA16）、Corning® Matrigel®基质胶、VitroGelTM 3D水凝胶或GrowDex水凝胶；
优选地，以1:(1~5)、优选1:(2~4)的体积比将所述水凝胶与所述细胞悬液进行混合；
优选地，每mL所述含有水凝胶的细胞悬液中，具有1×104~1×107个、优选5×104~1×106个、例如1×105个所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述预定形状的支持物选自三维细胞培养支架、细胞培养皿、细胞培养瓶、细胞培养微孔板或双层细胞培养板；优选地，所述预定形状的支持物选自6孔细胞培养微孔板、12孔细胞培养微孔板、24孔细胞培养微孔板、96孔细胞培养微孔板或24孔双层细胞培养板。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述细胞培养刺激物选自LPS、CpG或OVA；优选地，所述细胞培养刺激物为0.1-10 μg/mL、例如0.5-2 μg/mL的LPS；
优选地，所述3D细胞培养在30℃~40℃、3%~10% CO2的条件下进行2-72h。
9.采用权利要求1-8中任一项所述的方法构建得到的肿瘤微环境体外模型，其中，所述体外模型包括：水凝胶，以及进行三维细胞培养后的表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞；
优选地，所述水凝胶选自Geltrex® Matrix基质胶、PuraMatrix®肽水凝胶、Corning® Matrigel®基质胶、VitroGelTM 3D水凝胶或GrowDex水凝胶；
优选地，相对于导入所述miRNA-155的编码基因之前的树突状细胞，所述表达上调水平的miRNA-155的树突状细胞中的miRNA-155的表达水平上调2倍以上，例如2-5倍，优选3-4倍。
10.权利要求9所述的肿瘤微环境体外模型在开发肿瘤疫苗中的用途。
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CN113564114A (zh) * 2021-01-16 2021-10-29 浙江工商大学 一种cmt93-dc-t细胞的三维细胞模型的构建方法和应用

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