CN113564114A - 一种cmt93-dc-t细胞的三维细胞模型的构建方法和应用 - Google Patents

一种cmt93-dc-t细胞的三维细胞模型的构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种CMT93‑DC‑T细胞的三维细胞模型的构建方法和应用，该构建方法包括：第一，取500μL密度为以1×105cells/mL的CMT93细胞悬液接种于12孔Tranwell小室表面，置于细胞培养箱中培养，每天更换培养基，直至细胞单层紧密；第二，在超净工作台中，取1mL密度为5×105cells/mL的DC细胞培养液于12孔板中，待CMT93细胞在Tranwell小室上布满之后，将Tranwell小室插入12孔板中，置于细胞培养箱中培养36h；第三，之后将下层的细胞培养液500g，5min离心取上清，将上清加入到在12孔板中培养的1mL密度为5×105cells/mL的T细胞悬液中，盖上盖，转移至细胞培养箱中培养36h，即得到CMT93‑DC‑T细胞的三维细胞模型。本发明制得的CMT93‑DC‑T细胞的三维细胞模型能够鉴定致敏原，可以应用各种针对食物过敏的理论与应用研究。

Description

一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞模型的技术领域，具体涉及一种用于蛋白致敏性评估的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型及其构建方法。
背景技术
当前主要致敏原有八大类，其中海产品是亚洲地区的高发致敏原之一，蛋类产品也是人们生活中不可或缺的。
近年来，食物过敏患者的人群不断增加，虽然有越来越多的研究者探究食物过敏的机理，但是目前还是没有很好的针对食物过敏的药物和治疗方法，这都归因于没有高效而简便的研究食物过敏的模型和方法。为了加快控制食物过敏的脚步，迫切地需要准确研究、诊断、预防和治疗食物过敏的手段，这就需要更好的研究食物过敏的模型和方法来支撑。
目前，动物模型常用于食物过敏的研究，但是动物模型由于其费用高，耗时长等缺点而无法普及，这极大拖延了食物过敏的研究速度。近年来研究者都将重心放于细胞模型，单一细胞模型无法模拟肠道免疫环境这一致命缺点限制了其用于食物过敏的研究，越来越多的研究者倾向于结合多种细胞模拟肠道免疫环境。所以急需构建可靠的细胞模型来加快食物过敏的研究进程。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法。该构建方法得到CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型。
本发明的第二个目的在于提供一种食物致敏原的鉴定应用。
为此，在本发明的一方面，本发明提出了一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
(1)取500μL密度为以1×105cells/mL的CMT93细胞悬液接种于12孔Tranwell小室表面，置于细胞培养箱中培养，每天更换培养基，直至细胞单层紧密；
(2)在超净工作台中，取1mL密度为5×105cells/mL的DC细胞培养液于12孔板中，待CMT93细胞在Tranwell小室上布满之后，将Tranwell小室插入12孔板中，置于细胞培养箱中培养36h；
(3)之后将下层的细胞培养液500g，5min离心取上清，将上清加入到在12孔板中培养的1mL密度为5×105cells/mL的T细胞悬液中，盖上盖，转移至细胞培养箱中培养36h。
由此，本发明的一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型兼具动物模型的系统性和细胞模型的可操作性，能够更好用于致敏原的鉴定和食物过敏的研究。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，在所述步骤(1)中，CMT93细胞的TEER值需达到220Ω·cm2。
通过以下步骤检测：
于70％乙醇溶液中浸泡15min，然后在空气中干燥15s，然后浸泡在与培养液相似的无菌电解质中15min，打开电源，将开关转到欧姆处，将电极短的一端插入上腔，长的一端插入下腔，稳定读数，并记录电阻值，首先测量两个空白(无细胞)的电阻值，然后测样品电阻值，最后测空白孔电阻值，求平均值。
按下式计算：
TEER＝(Rs－Ro)×0.66cm2
其中Rs为样品电阻值；R0为空白孔电阻值。
根据本发明的实施例，在所述步骤(2)中，DC细胞需要分离纯化，纯化的DC细胞通过以下步骤制得：
一、制备细胞分层剂：A液为75％泛影葡胺60mL加68mL双蒸水；B液为15.6g聚蔗糖400加160mL双蒸水。将A液120mL与B液210mL混合，调节ρ＝1.080，高压灭菌，避光4℃保存备用。
二、提取DC细胞：脱颈法处死小鼠，在无菌条件下，将取出的脾脏捻碎并滤过200目无菌钢网，收集脾细胞悬液，然后加至ρ＝1.080的细胞分层剂上，500g，5min得低密度细胞。用1640培养基20mL重悬低密度细胞于250mL培养瓶中，细胞培养箱内孵育3h。用1640培养基20mL剧烈冼摇培养瓶，并吸弃悬液，重复操作4次；加入培养基20mL，置于细胞培养箱内孵育过夜，收集悬浮细胞，即为DC细胞。
根据本发明的实施例，在所述步骤(3)中，T细胞需要分离纯化，纯化的T细胞通过以下步骤制得：
1、脱颈法处死小鼠，在无菌条件下，将取出的脾脏捻碎并滤过200目无菌钢网，收集脾细胞悬液。
2、用超纯水将BD IMagTM Buffer(10×)稀释，置于冰上。
3、加入1mL的1×BD IMagTM Buffer洗涤细胞，离心去上清液。
4、彻底涡旋BD IMagTM anti-mouse CD4 Magnetic Particles-DM，并为每1×107总细胞添加50μL。
5、彻底混合，4℃孵育30min。
6、使用1×BD IMagTM Buffer将BD IMagTM颗粒体积提高到1-8×107cells/mL，然后立即将试管放在细胞分离磁铁上，在室温下孵育6-8min。
7、将试管置于分离磁铁上，小心吸出上清液，该上清液含有阴性部分。
8、从细胞分离磁铁中取出试管，并添加与步骤7中相同体积的1×BD IMagTMBuffer，通过短暂移液轻轻重悬细胞，然后再将试管放回细胞分离磁体中2-4min。
9、将试管置于分离磁铁上，小心吸出上清液并丢弃。
10、重复步骤8和9。
11、在最后的洗涤步骤之后，将阳性组分重悬在1640培养基中，放入细胞培养箱进行培养。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型构建方法。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种如上述CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的应用，该应用是以所述CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型鉴定食物致敏原，有利于发现新的食物致敏原。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明的一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法所需的DC细胞的分离纯化图；
图2为本发明的一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法所需的T细胞的分离纯化图；
图3为本发明的一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法所需的CMT93细胞的TEER值；
图4为本发明所构建的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型能够对OVA致敏原产生过敏反应的示意图；
图5为本发明表明CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型能够对OVA致敏原产生过敏反应的一个示意图；
图6为本发明表明CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型能够对OVA致敏原产生过敏反应的另一个示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1
CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建：
参照图1～3的示意，取500μL密度为以1×105cells/mL的CMT93细胞悬液接种于12孔Tranwell小室表面，置于细胞培养箱中培养，每天更换培养基，直至细胞单层紧密。CMT93细胞的TEER值需达到220Ω·cm2。达到这一数值后可以认为肠道上皮细胞屏障建立，蛋白等物质无法直接穿过细胞间空袭，需要由细胞介导运输。
步骤1，DC细胞的提纯：
一、制备细胞分层剂：A液为75％泛影葡胺60mL加68mL双蒸水；B液为15.6g聚蔗糖400加160mL双蒸水。将A液120mL与B液210mL混合，调节ρ＝1.080，高压灭菌，避光4℃保存备用。
二、提取DC细胞：脱颈法处死小鼠，在无菌条件下，将取出的脾脏捻碎并滤过200目无菌钢网，收集脾细胞悬液，然后加至ρ＝1.080的细胞分层剂上，500g，5min得低密度细胞。用1640培养基20mL重悬低密度细胞于250mL培养瓶中，细胞培养箱内孵育3h。用1640培养基20mL剧烈冼摇培养瓶，并吸弃悬液，重复操作4次；加入培养基20mL，置于细胞培养箱内孵育过夜，收集悬浮细胞，即为DC细胞。
步骤2，T细胞的提纯：
1、脱颈法处死小鼠，在无菌条件下，将取出的脾脏捻碎并滤过200目无菌钢网，收集脾细胞悬液。
2、用超纯水将BD IMagTM Buffer(10×)稀释，置于冰上。
3、加入1mL的1×BD IMagTM Buffer洗涤细胞，离心去上清液。
4、彻底涡旋BD IMagTM anti-mouse CD4 Magnetic Particles-DM，并为每1×107总细胞添加50μL。
5、彻底混合，4℃孵育30min。
6、使用1×BD IMagTM Buffer将BD IMagTM颗粒体积提高到1-8×107cells/mL，然后立即将试管放在细胞分离磁铁上，在室温下孵育6-8min。
7、将试管置于分离磁铁上，小心吸出上清液，该上清液含有阴性部分。
8、从细胞分离磁铁中取出试管，并添加与步骤7中相同体积的1×BD IMagTMBuffer，通过短暂移液轻轻重悬细胞，然后再将试管放回细胞分离磁体中2-4min。
9、将试管置于分离磁铁上，小心吸出上清液并丢弃。
10、重复步骤8和9。
11、在最后的洗涤步骤之后，将阳性组分重悬在1640培养基中，放入细胞培养箱进行培养。
再次参照图1～2的示意，可知通过优化的纯化条件可以达到的细胞提取效果(纯度)。
步骤3，取500μL密度为以1×105cells/mL的CMT93细胞悬液接种于12孔Tranwell小室表面，置于细胞培养箱中培养，每天更换培养基，直至细胞单层紧密；
步骤4，在超净工作台中，取1mL密度为5×105cells/mL的DC细胞培养液于12孔板中，待CMT93细胞在Tranwell小室上布满之后，将Tranwell小室插入12孔板中，置于细胞培养箱中培养36h；
步骤5，之后将下层的细胞培养液500g，5min离心取上清，将上清加入到在12孔板中培养的1mL密度为5×105cells/mL的T细胞悬液中，盖上盖，转移至细胞培养箱中培养36h。
本发明通过物理上隔离3种细胞达到分布反应的目的，并可以对每一个步骤展开深入研究。传统共培养一般缺乏这种物理隔离。本发明可以研究过敏的致敏阶段，结果更加符合体内情况，能够同时观察到上皮细胞、DC、T细胞在过敏中的变化。
实施例2
qPCR检测过敏相关基因：
在CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型中加入过0.22μm滤膜的OVA溶液(终浓度1μg/mL，10μg/mL和100μg/mL)，之后按照上述实施例1进行操作；
按照美国Omega公司RNA提取试剂盒提取RNA，采用上海翊圣生物科技有限公司qPCR试剂盒操作，所有使用的引物如表1所示，GAPDH为内参基因，目的基因的相对表达量按照2-ΔΔCt法计算。
表1荧光定量PCR上下游引物序列
Figure BDA0002901606700000051
Figure BDA0002901606700000061
由图4可知，本发明所构建的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型能够对OVA致敏原产生过敏反应。加入致敏原后数值升高，表明这些基因表达上升，进一步表明对应的细胞的活化(致敏相关活性增强)。其中A表示肠道上皮细胞，B表示树突状细胞，C表示T细胞。现有细胞模型无法在上皮细胞、树突状细胞、T细胞的任何一个层面上观察到显著的过敏反应，而本发明可以同时在3个层面上都观察到。
实施例3
T细胞分化测定：
(1)表面抗体染色：取100μL细胞溶液加入流式管中，加入1μg CD4抗体，4℃避光放置30min；除实验管外，每个抗体均准备一个单染管用于调整补偿。
(2)洗涤：用PBS溶液清洗未结合的抗体，4℃，500g，离心5min，共洗涤2次。
(3)Fix/Perm：细胞表面染色完成后，弃上清液，涡旋以重悬细胞，然后加入1mL1×Fix/Perm缓冲液，之后将样品在4℃下避光孵育40-50min。
(4)洗涤：直接在含有1×Fix/Perm缓冲工作液的管中加入1mL 1×Perm/WashBuffer，4℃，350g离心6min，丢弃上清液；向沉淀的细胞中再加入1mL 1×Perm/WashBuffer，重复离心，并弃去洗涤液。
(5)胞内染色：向样品中加入1×Perm/Wash Buffer和1μg胞内荧光抗体，涡旋并4℃避光孵育50min。
(6)洗涤：先轻轻涡旋样品管3-4s，然后使用1mL 1×Perm/Wash Buffer去洗涤细胞，500g，4℃离心5min，吸出或倾倒上清液；向沉淀的细胞中再加入1mL 1×Perm/WashBuffer，重复离心，并将洗涤液弃去。
(7)上机样品制备：用350μL Stain Buffer将细胞沉淀重悬于EP管中，使用流式细胞仪进行检测。流式细胞中的抗体标记如下表2所示。
表2流式细胞中的抗体标记
Figure BDA0002901606700000071
结果如图5，6所示，表明CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型能够对OVA致敏原产生过敏反应。
综上，本发明的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型，兼具动物模型的系统性和细胞模型的可操作性的三维细胞模型，能够更好用于致敏原的鉴定，且作用效果能够达到预期结果。本发明细胞模型中得到的数据与体内过敏的情况吻合，表明该模型成功模拟了过敏反应，可用于后续相关的研究和应用。
同时上述CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型能够运用于各种食物过敏机制的研究，加快免疫学的发展。本发明相比动物模型，更快、更便宜、通路更高且可操作性更强，所谓课操作性：比如更便于进行基因编辑、物质刺激、高通量组学分析、拆分模型等等；相比细胞模型，能更真实地反应过敏地情况。如前所述，目前已有的细胞模型实际上都无法再现体内的过敏反应。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取500μL密度为以1×105cells/mL的CMT93细胞悬液接种于12孔Tranwell小室表面，置于细胞培养箱中培养，每天更换培养基，直至细胞单层紧密；
(2)在超净工作台中，取1mL密度为5×105cells/mL的DC细胞培养液于12孔板中，待CMT93细胞在Tranwell小室上布满之后，将Tranwell小室插入12孔板中，置于细胞培养箱中培养36h；
(3)之后将下层的细胞培养液500g，5min离心取上清，将上清加入到在12孔板中培养的1mL密度为5×105cells/mL的T细胞悬液中，盖上盖，转移至细胞培养箱中培养36h。
2.如权利要求1所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，CMT93细胞的TEER值需达到220Ω·cm2。
3.如权利要求1或2所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，DC细胞需要分离纯化，纯化的DC细胞通过以下步骤制得：
制备细胞分层剂：A液为75％泛影葡胺60mL加68mL双蒸水；B液为15.6g聚蔗糖400加160mL双蒸水。将A液120mL与B液210mL混合，调节ρ＝1.080，高压灭菌，避光4℃保存备用；
提取DC细胞：脱颈法处死小鼠，在无菌条件下，将取出的脾脏捻碎并滤过200目无菌钢网，收集脾细胞悬液，然后加至ρ＝1.080的细胞分层剂上，500g，5min得低密度细胞。用1640培养基20mL重悬低密度细胞于250mL培养瓶中，细胞培养箱内孵育3h。用1640培养基20mL剧烈冼摇培养瓶，并吸弃悬液，重复操作4次；加入培养基20mL，置于细胞培养箱内孵育过夜，收集悬浮细胞，即为DC细胞。
4.如权利要求3所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中T细胞需要分离纯化，纯化的T细胞通过以下步骤制得：
(3.1)脱颈法处死小鼠，在无菌条件下，将取出的脾脏捻碎并滤过200目无菌钢网，收集脾细胞悬液；
(3.2)用超纯水将BD IMagTMBuffer(10×)稀释，置于冰上；
(3.3)加入1mL的1×BD IMagTMBuffer洗涤细胞，离心去上清液；
(3.4)彻底涡旋BD IMagTManti-mouse CD4 Magnetic Particles-DM，并为每1×107总细胞添加50μL；
(3.5)彻底混合，4℃孵育30min；
(3.6)使用1×BD IMagTMBuffer将BD IMagTM颗粒体积提高到1-8×107cells/mL，然后立即将试管放在细胞分离磁铁上，在室温下孵育6-8min；
(3.7)将试管置于分离磁铁上，小心吸出上清液，该上清液含有阴性部分；
(3.8)从细胞分离磁铁中取出试管，并添加与步骤7中相同体积的1×BD IMagTMBuffer，通过短暂移液轻轻重悬细胞，然后再将试管放回细胞分离磁体中2-4min；
(3.9)将试管置于分离磁铁上，小心吸出上清液并丢弃；
(3.10)重复步骤(3.8)和(3.9)；
(3.11)在最后的洗涤步骤之后，将阳性组分重悬在1640培养基中，放入细胞培养箱进行培养。
5.一种CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的鉴定致敏原的应用，其特征在于，添加的致敏原为过0.22μm滤膜的溶液。
6.如权利要求5所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的鉴定致敏原的应用，其特征在于，所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型中的CMT93的TSLP，IL-25和IL-33基因表达量会经致敏原刺激而上升。
7.如权利要求5或6所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的鉴定致敏原的应用，其特征在于，所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型中的DC细胞中的OX40L,IL-6基因表达量会经致敏原刺激而上升。
8.如权利要求7所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的鉴定致敏原的应用，其特征在于，所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型中的T细胞中的IL-4,GATA3基因表达量会经致敏原刺激而上升。
9.如权利要求8所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型的鉴定致敏原的应用，其特征在于，所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型中的T细胞经致敏原刺激会向Th2型细胞分化。
10.如权利要求书8或9所述的应用，其特征在于，所述的CMT93-DC-T细胞的三维细胞模型应用于检测致敏原和研究食物过敏机制。
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