CN110093246B - 一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置及其方法，包括细胞分离管道，所述细胞分离管道内设有中心隔离杆，所述细胞分离管道与中心隔离杆之间形成流通缓冲液和样品液的腔室，所述腔室内通过隔离层隔离成缓冲液流通腔室和样品液流通腔室，所述隔离层上设有连通缓冲液流通腔室和样品液流通腔室的互通通道，所述互通通道下沿为一圈斜面，所述细胞分离管道外壁对应互通通道的位置设有多个用于牵引抗体磁珠的磁性牵引机构，本发明通过隔离层和多极磁场装置，实现阳性磁珠细胞团从样品液到缓冲液的连续分离。

Description

一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置及其方法

技术领域

本发明涉及一种细胞分离系统，特别涉及一种多极磁场连续磁珠胰岛细胞团分离装置及其方法。

背景技术

免疫磁珠细胞分选(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)技术是20世纪80年代出现的细胞分离方法，目前已经广泛运用于分离基因、靶细胞及造血干细胞等。常规MACS技术采用磁性标记的细胞通过一个强而稳定磁场中的分选柱，实现细胞的阳性或阴性分选。MACS技术是一种集合了免疫学、细胞生物学、磁力学等知识于一体的高度特异性细胞分选技术，其高度特异性来自抗体对抗原的特异性识别。MACS技术已成为许多细胞分选的标准方法，从实验室到临床，从小规模到大规模，从常见细胞到稀有细胞和复杂的细胞亚群，从人类和小鼠细胞到其它种系的细胞，MACS技术提供了一种可在每一个实验室进行高品质细胞分选的方法。

德国美天旎生物技术有限公司(Miltenyi Biotec GmbH)在该领域拥有较多专利产品，其开发了一系列细胞分选、细胞生物学、相关分子生物学产品和技术，尤其在干细胞分选、DC细胞分选与分析、细胞因子分泌细胞分选与分析、免疫治疗、再生医学方面占有极大的优势，CD133、BDCA-2(CD303)、BDCA-4(CD304)单抗为其专利产品。美天旎公司的MACS技术主要组成成分为MACS微珠、MACS分选柱和MACS分选器。MACS微珠是与高度特异性单克隆抗体相偶联的超顺磁化微粒。MACS分选柱置于一个永久性磁场--MACS分选器中，可以将磁力增强1000倍，足以滞留仅标记极少量微珠的目的细胞。用缓冲液冲洗分选柱，所有未标记的细胞被冲洗掉。分选柱离开磁场，即可获得被标记的细胞组分。所有的操作在2.5－30分钟内即可完成，得到的细胞可立即用于后继实验。

MACS技术优点：

1、稳定、高质量的分选。使用MACS技术，可获得高纯度(90-99％)、高回收率的分选细胞群。

2、对细胞无损伤。50nm微珠和MACS分选柱均无毒性，对细胞无损伤，可以纯化有活力和功能活性的细胞而不影响其活性。

3、操作简便、快速。MACS技术操作简单，消毒方便。磁珠孵育时间很短，仅需15分钟。手动分选可在30分钟内完成，自动MACS分选可在2.5-10分钟之内完成。

4、从实验室到临床。MACS技术可以实现从10⁵到10¹¹个细胞分选。如果使用频率高，可选用自动MACS；密闭系统内无菌分选细胞，可选用临床级别MACS。

5、分选后细胞适用于后续实验。流式细胞术、显微镜分析和分子生物学研究显示MACS分选对细胞没有任何影响。分选后细胞适用于细胞培养和体内实验。此外，分选得到的标记和未标记细胞组分均可回收利用。

6、从细胞到分子分选。MACS技术不仅可以分选各种细胞，还可以分选转染细胞、亚细胞物质、蛋白质、DNA、RNA及mRNA。

但该技术在细胞团的连续分离上效果还不理想，尤其是人和大动物胰岛细胞团的分离。因为人胰腺组织在消化后，组织中有很多胰管、血管等组织，还有包被和未包被的胰岛组织之分，组织块大小不均匀，细胞消化后释放的核酸链也会导致外分泌腺组织和胰岛组织的粘连等。因此常规MACS分选柱容易被大量的胰腺消化后组织堵塞，导致分离系统失效。

发明内容

针对现有的技术不足，本发明提供一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置及其方法。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置，包括细胞分离管道，所述细胞分离管道内设有中心隔离杆，所述细胞分离管道与中心隔离杆之间形成流通缓冲液和样品液的腔室，所述腔室内通过隔离层隔离出缓冲液流通腔室和样品液流通腔室，所述隔离层上设有连通缓冲液流通腔室和样品液流通腔室的互通通道，为防止阴性组织在互通通道处沉积，所述互通通道下沿为一圈斜面，斜面与水平面的夹角为45-90°，所述细胞分离管道外壁对应互通通道的位置设有多个用于牵引抗体磁珠的磁性牵引机构，所述缓冲液流通腔室两端分别连通有缓冲液输入管和缓冲液流出管，所述样品液流通腔室两端分别连通有样品液输入管和样品液流出管，同一长度的样品液流通腔室与样品液输入管容积一致，同一长度的缓冲液流通腔室与缓冲液输入管容积一致，以减少管路变径对液体流变学的影响。

所述的隔离层的厚度为0.5-3.0cm，优选为1.0cm。

所述的磁性牵引机构为电磁铁，所述电磁铁均匀分布设置在细胞分离管道外壁对应互通通道的部位，数量为1-10个。

一种多极磁场连续磁珠细胞分离方法，该方法为，缓冲液输入管接入缓冲液，样品液输入管接入样品液和抗体磁珠；抗体磁珠与样品液中的阳性组织结合形成阳性细胞团；阳性细胞团通过电磁铁的吸附作用下从样品液流通腔室穿过隔离筛网进入缓冲液流通腔室，样品液中的阴性细胞团从样品液流出管流入阴性组织收集容器内，缓冲液中与抗体磁珠结合的阳性细胞团从缓冲液流出管流入阳性组织收集容器内。

所述样品液为胰腺组织消化后的混悬液、带胰岛膜蛋白抗体的磁珠。

所述缓冲液为Hanks液、CMRL 1066、RPMI 1640或DMEM。

所述阴性细胞团包括胰腺外分泌腺细胞及其团块、被外分泌腺组织包被的胰岛组织、胰腺内结缔组织。

所述阳性细胞团包括裸露的胰岛细胞团。

本发明的有益效果：本发明提供一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置及其方法，本发明通过隔离层、互通通道和多极磁场装置，实现阳性磁珠细胞团从样品液到缓冲液的分离，通过控制同一长度下的样品液输入管和样品液流通腔室的容积保持一致，同一长度下的缓冲液输入管和缓冲液流通腔室的容积保持一致，从而减少因管路变径导致液体流变学行为的变化，使样品液输入管、缓冲液输入管、样品液出口和缓冲液出口的速度保持一致，从而提高细胞分离成功率和效果。

附图说明

图1为本发明多极磁场连续磁珠细胞分离装置的结构示意图；

图2为实施例1的样品液和缓冲液出口样品的溶液吸光度结果图；

图3为实施例1的样品液和缓冲液出口样品的吸光度比值结果图；

图4为实施例1的不同粒径磁铁粉在样品液和缓冲液出口样品中磁铁粉重量比值结果图。

具体实施方式

如图1所示，一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置，包括细胞分离管道100，所述细胞分离管道100内设有中心隔离杆200，所述细胞分离管道100与中心隔离杆200之间形成流通缓冲液和样品液的腔室，所述腔室内通过隔离层300隔离成样品液流通腔室400和缓冲液流通腔室500，所述隔离层300上设有连通样品液流通腔室400和缓冲液流通腔室500的互通通道600，所述细胞分离管道100外壁对应互通通道的位置设有多个用于牵引抗体磁珠的磁性牵引机构700，所述样品液流通腔室400两端分别连通有样品液输入管和样品液流出管，所述缓冲液流通腔室500两端分别连通有缓冲液输入管和缓冲液流出管，同一长度的缓冲液流通腔室500与缓冲液输入管容积一致，同一长度的样品液流通腔室400与样品液输入管容积一致，容积一致的目的是为了起到保证样品液输入管与样品液流动腔室400以及样品液流出管的流通速度不变；同理缓冲液也是一样。

所述的隔离层300的厚度为0.5-3.0cm，优选为1.0cm，加厚隔离层300是为了防止样品液中的阴性细胞和水溶性物质进入到缓冲液中。

所述的磁性牵引机构700为电磁铁，所述电磁铁均匀分布设置在细胞分离管道100外壁对应互通通道600的部位，采用电磁铁有助于控制加磁与终止磁性，如果采用永磁体的话，会导致带抗体的磁珠和阳性细胞团被吸附在细胞分离管道内壁上，易造成堵塞，使细胞分离效果变差，电磁铁数量为1-10个，优选为4个。

所述的互通通道高度为0.5-2.5cm，互通通道下沿为一圈斜面，斜面与水平面的夹角为45-90°。

一种多极磁场连续磁珠细胞分离方法，该方法为，缓冲液输入管接入缓冲液，样品液输入管接入样品液和抗体磁珠；抗体磁珠与样品液中的阳性组织结合形成阳性细胞团；阳性细胞团通过电磁铁的吸附作用下从样品液流通腔室穿过隔离层互通通道进入缓冲液流通腔室，样品液中的阴性细胞团从样品液流出管流入阴性组织收集容器内，缓冲液中与抗体磁珠结合的阳性细胞团从缓冲液流出管流入阳性组织收集容器内。

所述样品液为胰腺组织消化后的混悬液、带胰岛膜蛋白抗体的磁珠。

所述缓冲液为Hanks液、CMRL 1066、RPMI 1640或DMEM。

所述阴性细胞团包括胰腺外分泌腺细胞及其团块、被外分泌腺组织包被的胰岛组织、胰腺内结缔组织。

所述阳性细胞团包括裸露的胰岛细胞团。

本发明的有益效果：本发明提供一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置及其方法，本发明通过隔离层、互通通道和多极磁场装置，实现阳性磁珠细胞团从样品液到缓冲液的分离，通过控制同一长度下的样品液输入管和样品液流通腔室的容积保持一致，同一长度下的缓冲液输入管和缓冲液流通腔室的容积保持一致，从而使样品液输入管、缓冲液输入管、样品液出口和缓冲液出口的速度保持一致，从而提高细胞分离成功率和分离效果。

实施例1：

1.1实验材料：碳素墨水；四氧化三铁粉(粒径分别为20nm和20μm左右)；蠕动泵(BT300-2J)；UW分光光度计(TU-1901，)；电子天平(AR224CN)；烘箱(101-OSB)；电磁铁(直径10mm*厚度5mm，表面磁场强度180mT)；四极磁场连续磁珠细胞团分离系统自制(垂直相对排列四个电磁铁)，隔离层300的厚度为1.0cm，磁铁开关时间为开10秒，停10秒；样品液入口、缓冲液入口、样品液出口和缓冲出口的速度分别由不同的蠕动泵控制调节。

1.2实验方法

1.2.1以碳素墨水为模型考察该分离系统对样品液中水溶性物质的分离效果。为考察该分离系统对缓冲液中水溶性成分的保留效果，本实验以碳素墨水为模型物，测试不同样品液和缓冲液入口和出口速度对缓冲液、样品液出口中墨水浓度的影响。方法：样品液为含碳素墨水的蒸馏水液，缓冲液为蒸馏水。预先设定样品液、缓冲液的入口和出口速度(如下表1所示)，同时开启各蠕动泵，让系统平衡1min，然后开始收集样品液出口和缓冲液出口的样品。等收集的样品液出口或缓冲液出口液量达到400-500ml时，停止收集样品，并取各组样品液出口和缓冲液出口的样品，在紫外分光光度仪上进行波长扫描，选择最大吸收波长600nm处进行吸光度测定。

表1不同样品液、缓冲液入口和出口的蠕动泵转速(rpm)

1.2.2以不同粒径的磁铁粉为模型考察该分离系统对样品液中微粒的分离效果。为考察该分离系统(不含磁极)对不同粒径磁铁粉的保留效果，本实验分别以粒径20μm和20nm两种四氧化三铁粉为模型物，测试不同样品液和缓冲液入口和出口速度对缓冲液、样品液出口中微粒重量比的影响。方法：称取约3g干燥的磁铁粉，分散到50ml蒸馏水中作为样品液。样品液、缓冲液的入口和的出口速度见下表2。样品的分离和收集方法同“1.2.1以碳素墨水为模型考察该分离系统对样品液中水溶性物质的分离效果”。收集缓冲液和样品液出口中磁铁粉，经120℃干燥后分别称重，观察各组磁铁粉在样品液和缓冲液中的重量比例。

表2以两种不同粒径磁铁粉为模型的样品液、缓冲液入口和出口的蠕动泵转速(rpm)

*注：粒径20μm和20nm磁铁粉的样品液、缓冲液入口和出口的蠕动泵速度一致。

1.2.3四极磁场对磁铁粉分离的影响。在该分离系统的互通通道外筒壁前后左右四边各加一个电磁铁，形成四极磁场。再经样品液入口通入含上述两种不同粒径磁铁粉的水混悬液，样品液入口：样品液出口的蠕动泵速度为100：120；缓冲液入口：缓冲液出口的速度为80：60；收集样品液和缓冲液出口中的磁铁粉，120℃干燥后测定两者重量的比例。

1.2.4统计学方法：采用SPSS 17.0统计软件包进行分析，实验结果以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用配对t检验，多组间比较采用方差分析，P<0.05表示有统计学差异。

2结果

2.1分离系统对样品液中碳素墨水的分离结果

按表1试验编号收集不同样品液、缓冲液出口的样品，在600nm处可见光波长下进行吸光度测定，以试验编号为横坐标，缓冲液出口和样品液出口样品的吸光度和吸光度比值为纵坐标，得到的结果如下图2、3所示。

注：A：各试验编号下收集的样品液和缓冲液出口样品的吸光度结果；B：各试验编号下收集的缓冲液出口样品：样品液出口样品平均吸光度比值结果；I：样品液入口速度：样品液出口速度＝100：100；II：样品液入口速度：样品液出口速度＝100：110；III：样品液入口速度：样品液出口速度＝100：120；X：样品液出口样品中的吸光度；Y：缓冲液出口样品中的吸光度；横坐标数值对应表1的试验编号。

由图2结果可知，样品液入口：样品液出口的速度比例越小，收集的样品液出口样品(X)的吸光度越小，说明样品液中的墨水含量少，这主要是被缓冲液稀释的缘故；随着缓冲液入口和缓冲液出口的速度逐渐增大，样品液出口样品(X)的吸光度有缓慢减少，缓冲液出口样品(Y)的吸光度逐渐增大，说明墨水有少量扩散分配到了缓冲液出口中。

图3结果反映了随着样品液入口：样品液出口比例越小，缓冲液中墨水的吸光度与样品液中墨水的平均吸光度比值越低；随着缓冲液入口和缓冲液出口速度增大，缓冲液出口样品中墨水浓度与样品液出口中墨水浓度比值略有提高。此说明样品液出口速度大于样品液入口的速度，缓冲液入口和缓冲液出口的速度小，有利于墨水尽可能的保留在样品液中，并减少在缓冲液出口样品(Y)中的分布。

2.2分离系统对样品液中不同粒径磁铁粉的分离结果

以20μm和20nm磁铁粉水混悬液为样品液，经表2的样品液、缓冲液入口和出口速度系统后，收集的缓冲液和样品液样品中磁铁粉重量的比值结果如图4所示。

注：I：样品液入口速度：样品液出口速度＝100：100；II：样品液入口速度：样品液出口速度＝100：110；III：样品液入口速度：样品液出口速度＝100：120；A：20μm磁铁粉；B：20nm磁铁粉；横坐标数值对应表2的试验编号。

由图4结果可见，在未加磁场情况下，20μm磁铁粉微粒较20nm磁铁粉微粒更易进入缓冲液中，并且随着缓冲液入口和出口的速度增加，磁铁粉进入缓冲液的量也略有增加，但重量比例变异较大。采用样品液入口速度：样品液出口速度＝100：120，缓冲液入口速度：缓冲液出口速度＝80：60和20nm的磁铁粉，缓冲液出口样品中可收集得到的磁铁粉较少。

2.3加磁场后的磁铁粉分离结果

经在互通通道外的前、后、左、右四边各加一个电磁铁，电磁铁时间为开10秒，关10秒循环；并采用样品液入：样品液出＝100：120，缓冲液入：缓冲液出＝80：60。结果显示，加电磁铁后样品液中绝大部分20μm和20nm的磁铁粉都被吸引到互通通道外的缓冲液的筒壁上，并在电磁铁关闭的时候磁铁粉随缓冲液从缓冲液出口排出；缓冲液出口：样品液出口样品中磁铁粉的重量比分别为2.51±0.37倍和5.35±1.22倍(n＝3)；说明粒径20nm的磁铁粉在磁场作用下更易进入缓冲液中，即使是残存的电磁铁也可以将磁珠吸引至缓冲液管；而粒径较大的20μm磁铁粉在样品液中残留较多，可能为重力和流速惯性作用将磁铁粉带至样品液出口。

免疫磁珠细胞分选方法可以在几分钟内从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的细胞，并已在临床和研究工作中有较好的应用。本文研究的多极连续磁珠分选系统，在未加磁场条件下，所提供的样品液和缓冲液速度能保证大部分水溶性成分(碳素墨水)和不溶性微粒(磁铁粉)保留在样品液出口样品中；在所提供的磁场的作用力下，能保证大部分磁珠微粒，尤其是20nm磁铁粉进入到缓冲液出口样品中。

但本研究结果也发现，在加电磁场条件下，粒径较大的20μm微粒依然有较多进入到样品液系统，显示会影响阳性细胞团的分离效率，得到的阳性细胞团样本量会有所下降，因此最好进行二次或多次磁场分离纯化，或者在同一管路上连续连接两个该分离系统，前一个分离系统选择开启电磁场时，后一个选择关闭电磁场；相反前一个系统选择关闭磁场时，后一个选择开启，这样可得到纯度较高的产品。

2.4以家兔胰岛分离中的应用结果如下：

缓冲液为Hank’s液，磁珠市售，粒径为200纳米，并用氨基(-NH)包被，家兔胰岛膜蛋白多克隆抗体自制，并在胰岛分离实验开始前完成抗体对磁珠的包被。

胰腺的胶原酶灌注和获取：取成年家兔(2-3kg)，禁食12h后，耳缘静脉注射3％戊巴比妥钠60mg/kg麻醉，依次腹部剃毛、消毒；沿腹白线打开腹腔，将肠管推向腹腔右侧，沿十二指肠下行至小肠部位，找到总胰管，用动脉夹夹闭总胰管至小肠入口，耳缘静脉注射空气针处死家兔；用30G1/2针头进行逆行胰管插管和灌注胶原酶V(1mg/mL，溶剂为Hank’s液)约15mL，待胰腺充分膨胀后，用眼科剪和镊子沿小肠壁、十二指肠壁和胃壁处快速完整摘取膨胀的胰腺组织。

胰腺消化与胰岛分离：将摘取的膨胀后的胰腺组织略剪碎，放置于含30mL同浓度胶原酶的100mL消化罐中，在消化过程中加入家兔胰岛膜蛋白抗体包被的磁珠，连接并开启进口样品液的蠕动泵，转速100rpm；开启缓冲液蠕动泵，开启连接磁分离器样品进样管上的蠕动泵，速度为110rpm，开启缓冲液出口管的蠕动泵，速度为80rpm，间断式开启电磁铁电源(开10s，停10s)，观察缓冲液出口和样品出口中组织量的变化，

对缓冲液管收集的组织用双硫腙溶液(DTZ)染色后观察胰岛的纯度，用CMRL 1066(含10％胎牛血清和青链霉素)，在37℃5％CO₂培养箱中培养。

实验结果：分离得到的胰岛大小不一，但均较完整，边缘清晰，部分胰岛有被少量外分泌腺组织包裹；经DTZ染色后得到胰岛组织纯度可达88.5％；胰岛量为2344±357个，胰岛当量为(818.6±231.7)IEQ；培养6h后经二乙酸荧光素-碘化吡啶(FD-PI)染色液染色显示胰岛活性为93.5±3.9％。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本领域内普通的技术人员的简单更改和替换都是本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置，其特征在于，包括细胞分离管道，所述细胞分离管道内设有中心隔离杆，所述细胞分离管道与中心隔离杆之间形成流通缓冲液和样品液的腔室，所述腔室内通过隔离层隔离出缓冲液流通腔室和样品液流通腔室，所述隔离层上设有连通缓冲液流通腔室和样品液流通腔室的互通通道，所述细胞分离管道外壁对应互通通道的位置设有多个用于牵引抗体磁珠的磁性牵引机构，所述缓冲液流通腔室两端分别连通有缓冲液输入管和缓冲液流出管，所述样品液流通腔室两端分别连通有样品液输入管和样品液流出管，同一长度的样品液流通腔室与样品液输入管容积一致，同一长度的缓冲液流通腔室与缓冲液输入管容积一致；所述的磁性牵引机构为电磁铁，所述电磁铁均匀分布设置在细胞分离管道外壁对应互通通道的部位，数量为1-10个；所述的隔离层互通通道高度为0.5-2.5cm，互通通道下沿为一圈斜面，斜面与水平面的夹角为45-90°。

2.如权利要求1所述的一种多极磁场连续磁珠细胞分离装置，其特征在于，所述的隔离层的厚度为0.5-3.0cm。

3.一种利用权利要求1所述的多极磁场连续磁珠细胞分离装置分离细胞的方法，其特征在于，该方法为，缓冲液输入管接入缓冲液，样品液输入管接入样品液和抗体磁珠；抗体磁珠与样品液中的阳性组织结合形成阳性细胞团；阳性细胞团通过电磁铁的吸附作用下从样品液流通腔室穿过隔离层互通通道进入缓冲液流通腔室，样品液中的阴性细胞团从样品液流出管流入阴性组织收集容器内，缓冲液中与抗体磁珠结合的阳性细胞团从缓冲液流出管流入阳性组织收集容器内。

4.如权利要求3所述的多极磁场连续磁珠细胞分离装置分离细胞的方法，其特征在于，所述样品液包括胰腺组织消化后的混悬液、带胰岛膜蛋白抗体的磁珠。

5. 如权利要求3所述的多极磁场连续磁珠细胞分离装置分离细胞的方法，其特征在于，所述缓冲液为Hanks液、CMRL 1066、RPMI 1640或DMEM。

6.如权利要求3所述的多极磁场连续磁珠细胞分离装置分离细胞的方法，其特征在于，所述阴性细胞团包括胰腺外分泌腺细胞及其团块、被外分泌腺组织包被的胰岛组织、胰腺内结缔组织。

7.如权利要求3所述的多极磁场连续磁珠细胞分离装置分离细胞的方法，其特征在于，所述阳性细胞团为裸露的胰岛细胞团。

Images