KR20150130444A

KR20150130444A - 악성 흉막 중피종을 치료하기 위한 마이크로ｒｎａ-기반 방법

Info

Publication number: KR20150130444A
Application number: KR1020157028356A
Authority: KR
Inventors: 글렌 레이드; 니코 반 잔드윅
Original assignee: 아스베스토스 디지즈 리서치 파운데이션
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-12
Publication date: 2015-11-23
Also published as: CA2905682A1; CN105283205A; EP2968604A4; US20150209382A1; KR102099718B1; JP6437930B2; AU2014229648B2; US9006200B2; IL241300A0; US9220724B2; JP2016515804A; WO2014140797A1; ES2664759T3; EP2968604A1; US20140275223A1; EP2968604B1; IL241300B; SG11201507103YA; CN105283205B; CA2905682C

Abstract

본 발명은 miR-15/107 패밀리에 상응하는 마이크로RNA, 및 MPM 종양 세포에서 miR-15/107의 표적 유전자의 발현 조절을 회복함으로써 악성 흉막 중피종(MPM)을 치료하기 위해 마이크로RNA 모방체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

악성 흉막 중피종을 치료하기 위한 마이크로ＲＮＡ-기반 방법 {MicroRNA-BASED APPROACH TO TREATING MALIGNANT PLEURAL MESOTHELIOMA}

관련 출원의 교차 참조

본 출원은, 이의 내용이 전체로서 본원에서 참조로 도입되는, 2013년 3월 13일자로 출원된 미국 출원번호 제13/801,010호에 대해 35 U.S.C. 120하에서의 이익을 청구한다.

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 암 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 miR-15/107 패밀리에 상응하는 마이크로RNA, 및 MPM 종양 세포에서 miR-15/107의 표적 유전자의 발현 조절을 회복함으로써 악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma: MPM)을 치료하기 위해 마이크로RNA 모방체를 사용하는 방법에 관한 것이다.

악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma: MPM)은 이용 가능한 치료법이 적은 항상 치명적 암이다. 새로운 치료법이 긴급하게 요구되고 있고, 이상조절된 마이크로RNA 발현은 새로운 치료학적 표적의 근원을 제공한다.

마이크로RNA는 RNA 폴리머라제 II(pol II) 또는 RNA 폴리머라제 III(pol III)에 의해 전사된다[참조: Qi et al. (2006) Cellular & Molecular Immunology, Vol. 3: 411-19]. 이들은 일차 마이크로RNA 전사물(프리-마이크로(pri-micro)RNA)로 불리우는 초기 전사물로부터 발생하고, 이는 일반적으로 수천개 염기 길이이다. 프리-마리크로RNA는 RNase 드로샤에 의해 핵에서 약 70 내지 약 100-뉴클레오티드 헤어핀-형상 전구체(프레-마이크로(pre-micro)RNA)로 처리된다. 세포질로 수송 후, 헤어핀-프레-마이크로RNA는 이중-스트랜드 성숙 마이크로RNA를 생성하기 위해 다이서(Dicer)에 의해서 추가로 처리된다. 이어서, 성숙 마이크로RNA 스트랜드는, 염기-쌍 상보성에 의해 이의 표적 mRNA와 회합하는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC) 내로 도입된다. 마이크로RNA 염기가 mRNA 표적과 완전히 쌍을 이루는 비교적 드문 경우에, 이는 mRNA 분해를 촉진한다. 보다 통상적으로, 마이크로RNA는 표적 mRNA와의 불완전 헤테로듀플렉스를 형성하여, mRNA 안정성에 영향을 미치거나 mRNA 번역을 억제한다.

다수의 연구는 잠재적 표적을 동정하기 위해 MPM에서 mRNA 유전자 발현을 프로파일링하고 있고, 보다 최근에, 마이크로RNA 발현 프로파일은, 정상 및 종양 세포주, MPM 종양 및 풀링된 정상 심막, 또는 MPM 및 폐암으로부터 유래하는 샘플을 사용하여 진단 목적을 위해 최초로 생성되었다. 이들은 또한 MPM 종양의 상이한 분류 내에서 진단 목적을 위해 생성되었다[참조: Busacca et al., Am. J. Respir . Cell. Mol. Biol . 42: 312-19 (2010)]. 그러나, MPM 종양과 정상 흉막 조직 사이의 광범위한 비교는 전혀 이루어지지 않았다.

추가로, 시험관내에서 사용하는 것이 비교적 용이하지만, 마이크로RNA 모방체는 전형적으로 생체내 효능의 관점에서 2가지 문제에 기인하여 고통받고 있다: (1) 불량한 활성(낮은 RISC 도입 및 오프-타겟 효과 포함) 및 (2) 비효율적 전달(안정성 및 작용 부위에 대한 특이적/선택적 분포와 관련).

언급된 바와 같이, 다수의 연구는 MPM에서 유전자 발현을 프로파일링하고 있다. 이는 잠재적 단백질을 동정하기 위한 것 뿐만 아니라 질환 프로세스를 이해하기 위한 목적을 갖는다. 이들 연구는, 화학요법에 대한 저항성과 관련된 변경된 아폽토시스 반응과 연관되어 아폽토시스 유전자에서 추가의 변경과 함께 MPM에서 대사 및 사이클 유전자의 일반적 상향조절을 특징으로 한다. 지금까지. 이들 연구는 MPM 종양에 통상적인 표현형의 유전자 조절의 포괄적 메카니즘을 밝혀내지 못했다. 그러나, 마이크로RNA가 유전자 발현의 전반적 조절인자인 것으로 고려됨에 따라, 마이크로RNA 발현의 하향조절은 유전자 패밀리의 상향조절에 대한 잠재적 설명을 나타낸다(즉, 마이크로RNA 발현의 손실은 표적 유전자 상향조절을 유발한다).

본 발명은, 발병되지 않은 개체의 정상 흉막 조직과 비교하여 악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma: MPM) 종양 샘플에서 하향-조절되는 마이크로RNA 패밀리의 동정에 부분적으로 기반한다. 특히, 본 발명자들은 MPM 조직에서 miR-15/107 패밀리의 발현에 있어서 현저한 하향-조절을 발견했다.

따라서, 본 발명의 한 가지 양상은 악성 흉막 중피종(malignant leural mesothelioma: MPM)의 치료에 유용한 이중-스트랜드 마이크로RNA 모방체(double-stranded microRNA mimic)에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 miRNA 모방체는

(1) miR-15/107 패밀리 구성원에 상응하고 5' 말단에 위치 2 내지 7 또는 1 내지 6에서 AGCAGC를 함유하는 성숙 서열; 및 (2) 화학적 변형에 의해 불활성화될 수 있는 패신저 스트랜드(passenger strand)를 포함한다. 성숙 서열은 서열번호 11 내지 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다. 패신저 서열은 서열번호 15 내지 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.

또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 질환을 앓고 있는 대상체에서 MPM을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 기재된 바와 같은 유효량의 이중-스트랜드 miRNA를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 이러한 투여는 miR-15/107 패밀리의 내인성 발현을 모방하여, 대상체에서 miR-15/107 패밀리의 표적 유전자의 발현 조절을 회복시킨다. 투여는 바람직하게는 miRNA 모방체의 전달을 위한 무손상, 세균 유래 미니세포를 사용하여 수행된다. 본 발명의 방법에 따르면, 마이크로RNA 모방체를 투여하는 단계는 대상체에게 보조 항암 요법의 동시 또는 연속 공-투여를 포함한다.

본 발명의 추가의 양상에서, 항암 요법의 세포독성 효과에 대한 MPM 암 세포의 감수성을 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은, MPM 암 세포의 감수성이 증가되도록, 상기 기재된 바와 같은 적어도 하나의 miRNA 모방체를 세포에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 이들 및 기타 양상은 하기에 추가로 기재된다.

명백하게 본 발명의 상술된 특징, 이점 및 목적 뿐만 아니라 기타의 것들이 달성되고 상세히 이해될 수 있도록 하기 위해, 상기 간단히 요약된 본 발명의 보다 구체적인 기재 및 특정 실시형태가 첨부 도면에서 설명되어 있다. 이들 도면은 본 명세서의 일부를 형성한다. 이들은 본 발명의 구체적 실시형태를 설명하며, 따라서 이를 제한하지 않는다.
도 1은 악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma: MPM) 세포주 및 종양에서 하향조절되는 miR-15/107 패밀리의 발현을 나타낸다.
도 2는 연속 크리소타일 노출이 MeT-5A 불멸화 중피 세포에서 miR-15/107 패밀리 마이크로RNA 발현을 감소시키는 것을 설명한다.
도 3은 miR-15a, miR-15b 또는 miR-16의 발현 회복이 시험관 내에서 MPM 세포의 성장 억제를 유도하는 것을 나타낸다.
도 4는 miR-15/107 컨센서스에 상응하는 서열을 포함하는 모방체가 MPM 세포 증식을 억제하는데 있어서 천연 miR-16보다 더욱 효과적임을 나타낸다.
도 5는 miR-16을 사용한 형질감염이 표적 유전자를 하향조절하는 것을 설명한다.
도 7은 ^EGFR미니세포_miR-16(이중특이적 항체에서 종양 세포 표적화 서열이 EGFR로 지향되는 이중특이적 항체 표적화 미니세포-팩키징 miR-16 모방체)으로서 전달된 생체내 MPM에서 miR-16 대체의 효과를 나타낸다.
도 8은 컨센서스로부터 유래된 모방체인 con15/107.2의 생체 내 종양 성장에 대한 효과를 나타낸다.

서술된 바와 같이, 본 발명의 중요한 양상은, 발병되지 않은 개체의 정상 흉막 조직과 비교하여 악성 흉막 중피종(malginant pleural mesothelioma: MPM) 종양 샘플에서 하향-조절되는 마이크로RNA 패밀리의 동정이다. 따라서, 마이크로RNA의 miR-15/107 패밀리의 발현의 현저한 하향-조절이 MPM 조직에서 발생한다.

따라서, 예시적 실시형태에서, 본 발명은 MPM을 치료하기 위한 miR-15/107 패밀리에 상응하는 치료학적 마이크로RNA의 설계, 합성, 제조, 조성, 특성화 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, miR-15/107 패밀리의 내인성 구성원의 활성을 모방하고 이에 의해 MPM 세포 성장의 조절을 재확립함으로써 MPM 종양 세포에서 miR-15/107 패밀리의 발현을 회복하도록 작용하는 마이크로RNA 모방체에 관한 것이다. 따라서, 마이크로RNA 모방체는 MPM 세포에서 miR-15/107 패밀리의 발현을 회복시키기 위해 대체 요법에서 사용될 수 있다.

추가의 예시적 실시형태에서, 마이크로RNA 모방체는 안정성을 개선시키고 오프-타겟 효과를 감소시키고 활성을 증가시키도록 변형된다. 추가의 실시형태는 마이크로RNA 모방체를 전달하기 위한 미니세포의 사용에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 양상에서, 마이크로RNA 모방체는 MPM의 치료를 위한 기타 임상적으로 사용된 약물의 효능을 증강시키도록 작동한다.

miR-15/107 패밀리

miR-15/107 패밀리는 이전에 동정되었고, 각 구성원이 성숙 마이크로RNA 스트랜드의 5' 말단으로부터 제1 또는 제2 뉴클레오티드에서 개시하는 서열 AGCAGC를 함유하는 마이크로RNA 슈퍼 패밀리로서 특성화되어 있다. miR-15/107 패밀리는 암 치료 및 기타 질환 및 장애의 치료를 위한 개입 지점을 나타내는 다수의 세포 활성의 조절에 관여하고 있다[참조: Finnerty et al. (2010) J. Mol. Biol., Vol. 402:491-509, 이의 내용은 이의 전체가 본원에서 참조로서 도입된다.]. 예를 들면, miR-15/107 패밀리는 인간 암, 심혈관 질환 및 신경퇴행성 질환 뿐만 아니라 척추동물 종에서 세포 분화, 대사, 스트레스 반응 및 혈관신생에 관한 유전자 발현을 조절하는데 관여하는 것으로 생각된다.

암 치료법을 개발하는 신규 방법에 대한 검색은 종양 세포의 특이적 또는 선택적 표적화를 가능하게 하기 위해 종종 정상 조직과 종양 조직 사이의 차이를 동정하는 시도로 개시한다. MPM에 있어서, 이는 유전자 발현의 다수의 변화가, 종양 세포에 대해 특이적이지만, 표적화될 수 없거나(즉, 약물이 될거 같지 않은) 또는 과도하게 좁은 치료 윈도우를 제공(즉, 정상 세포가 발병되는)하기 때문에 곤란한 것으로 판명되었다. 추가로, 표적 발현은 치료 성공과 항상 상관되는 것은 아니다. 이전 연구는 다수의 마이크로RNA가 MPM에서 종양-억제인자 또는 종양형성 기능을 갖는 것을 나타내고 있지만, 이들은 종양 또는 세포주의 거대 모집단에서 빈번하게 발생하는 것이 관찰되어 있지 않았다. 이러한 문맥에서, 전체 miR-15/107 패밀리가 분석된 모든 MPM 세포주 및 종양(도 1)에서 하향조절된다는 발견은 치료 방법으로서 이들 변화를 표적화하는 강력한 이론적 근거를 제공한다. 마이크로RNA의 MiR-5/107 패밀리의 아스베스토-유도된 하향조절을 나타내는 데이터와 함께, 이는 MPM 생물학에서 이들 변화의 중요한 원인 역할을 증명한다(도 2). 이와 관련하여, miR-15/107 패밀리의 하향조절의 동정은 적어도 2가지 이유에서 중요하다: 첫째, 이는 MPM에 대해 고도로 특이적이고(변화는 모든 샘플에 존재한다, 도 1); 둘째, miR15/107 패밀리의 수준 증가는 MPM 세포 성장에 영향을 미치지만, 정상 중피 세포에 대해서는 영향이 없다(도 3). 또한, MPM에 대한 치료 실체로서 마이크로RNA를 사용하는 것은 단일 제제에서 복수의 이상 발현된 유전자를 수정하는 능력을 제공하여(도 5) 증식을 저하시키고(도 3) 약물 감수성을 증가시킨다(도 6). miR-15/107 패밀리의 발현을 회복시킬 수 있는 마이크로RNA를 제형화하기 위해, 본 발명자들은 효과적인 마이크로RNA 치료학적 접근법을 준비할 수 있도록 서열 유사성 등의 특성을 고려했다.

miR-15/107 패밀리는 공통 씨드 서열을 공유하고, 따라서 각 구성원의 mRNA 표적은 상당히 중첩한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로RNA 패밀리"는, 문헌[참조: Brennecke, J. et al., PloS biol 3 (3):pe85 (2005)]에 기재된 바와 같이 "씨드 서열"로서 지칭되는, 적어도 6개 연속 뉴클레오티드에 걸쳐 동일성을 공유하는 miRNA의 그룹을 지칭한다. 이러한 기재에 사용된 바와 같이, "씨드 서열"은 성숙 miRNA 서열의 위치 1 내지 6, 1 내지 7, 2 내지 7 또는 2 내지 8에서의 뉴클레오티드를 의미한다. 마이크로RNA 씨드 서열은 전형적으로 miRNA의 5' 말단에 위치한다. "성숙 서열"은 RISC에 도입되는 완전히 처리된 마이크로RNA의 스트랜드를 지칭한다.

따라서, 본 발명의 목적을 위해, miR-15/107 패밀리는 다음과 같은 10개 서열로 구성된다:

miR-15a-5p(서열번호 1 uagcagcacauaaugguuugug, MIMAT0000068);

miR-15b-5p(서열번호 2 uagcagcacaucaugguuuaca, MIMAT0000417);

miR-16-5p(서열번호 3 uagcagcacguaaauauuggcg, MIMAT0000069);

miR-195-5p(서열번호 4 uagcagcacagaaauauuggc, MIMAT0000461);

miR-424-5p(서열번호 5 cagcagcaauucauguuuugaa, MIMAT0001341);

miR-497-5p(서열번호 6 cagcagcacacugugguuugu, MIMAT002820);

miR-503-5p(서열번호 7 uagcagcgggaacaguucugcag, MIMAT0002874);

miR-646-5p(서열번호 8 aagcagcugccucugaggc, MIMAT0003316);

miR-103a-3p(서열번호 9 agcagcauuguacagggcuauga, MIMAT0000101); 및

miR-107(서열번호 10 agcagcauuguacagggcuauca, MIMAT0000104).

miR-15/107 패밀리의 모든 표적을 효과적으로 조절하기 위해, 이론상 모든 10개 구성원은 상기 수록된 각 서열에 특이적인 마이크로RNA 모방체를 사용하여 MPM 세포에 재도입될 필요가 있다. 그러나, 이는 임상 치료에 효과적인 접근법이 아니다. 대신에, 본 발명은 마이크로RNA 모방 접근법을 제공하며, 여기서 내인성 miR-15/107 패밀리의 기능을 수행하여 MPM 세포에서 miR-15/107의 발현을 회복하도록 모방체로서 작동하는 전체 miR-15/107 패밀리의 컨센서스 서열이 설계되었다(도 3). 이러한 기재에 사용된 바와 같이, 문구 "컨센서스 서열"은 서열 그룹 중에서 고도의 서열, 구조절 및/또는 기능적 동일성을 공유하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이와 관련하여, 컨센서스 서열을 포함하는 마이크로RNA 모방체는 전체 miR-15/107 패밀리의 기능을 모방할 수 있다. 따라서, 전체 miR-15/107 패밀리의 컨센서스 서열의 설계는, 내인성 발현이 모방할 수 있고 동시에 모방체의 수를 단일 서열 실체로 제한할 수 있는, 목적하는 표적의 수(즉 10개의 miR-15/107 패밀리 구성원)를 최대화하는 이점을 제공한다.

따라서, 특정 실시형태에서, 마이크로RNA 모방체는 MPM 세포를 치료하기 위해 대체 요법의 형태로서 사용되고, 여기서 마이크로RNA 모방체는 miR-15/107 패밀리의 기능을 수행하여 miR-15/107 패밀리의 발현을 회복할 수 있다. 이와 같이, 본 개시의 문맥에서, 용어 "발현을 회복"은 내인성 miR-15/107 패밀리의 기능을 모방할 수 있는 마이크로RNA 모방체의 사용을 통해 miR-15/107 패밀리의 발현의 회복을 지칭한다.

마이크로RNA 모방체

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로RNA 모방체"는 RNAi 경로에 도입되어 유전자 발현을 조절할 수 있는 합성 비-코딩 RNA를 지칭한다. 본 발명에 사용된 바와 같이, "합성 마이크로RNA"는 내인성 마이크로RNA 이외의 임의 종류의 RNA 서열을 지칭한다. 마이크로RNA 모방체는 내인성 마이크로RNA의 기능을 모방하고, 성숙 이중-스트랜드 분자 또는 모방 전구체(예: 프리- 또는 프레-마이크로RNA)로서 설계될 수 있다. 마이크로RNA 모방체는 변형되거나 비변형된 RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드 또는 대체 핵산 화학물질로 구성될 수 있다.

상기 개시된 바와 같이, miR-15/107 패밀리는 활성(가이드) 스트랜드의 5'-말단에서 서열 5'-AGCAGC-3'을 공유하는 10개 마이크로RNA를 포함한다. miR-15/107 패밀리의 모든 구성원이 동일한 씨드 서열을 갖는다는 사실은 단일 마이크로RNA 모방체를 사용한 유전자 발현의 전반적 조절을 수정하는 기회를 제공한다. 따라서, 본 발명은 컨센서스 서열을 포함하는, miR-15/107 패밀리에 상응하는 마이크로RNA 모방체를 제공하고, 여기서 마이크로RNA 모방체는 전체 miR-15/107 패밀리의 내인성 활성을 모방할 수 있다. 따라서, 마이크로RNA 발현의 회복은 이들 마이크로RNA 모방체의 사용을 통해 달성된다.

본 발명의 예시적 컨센서스 서열은 다음과 같다:

con15/107.1(서열번호 11 UAGCAGCACAUAAUGGUUUGCG);

con15/107.2(서열번호 12 UAGCAGCACAUAAUGGUUUGCGGA;

con15/107.3(서열번호 13 UAGCAGCACAUAAUGGUUUGCU); 및

con15/107.4(서열번호 14 UAGCAGCACAGUAUGGUUUGCG).

con15/107.1, 보체 A(서열번호 15 CGCAAACCAUUAUGUGCUGCUA);

con15/107.2, 보체 A(서열번호 16 UCCGCAAACCAUUAUGUGCUGCUA);

con15/107.3, 보체 A(서열번호 17 AGCAAACCAUUAUGUGCUGCUA);

con15/107.4, 보체 A(서열번호 18 CGCAAACCAUACUGUGCUGCUA);

con15/107.1, 보체 B(서열번호 19 CGCAAACCAUUAUGUGCUGCUU);

con15/107.2, 보체 B(서열번호 20 UCCGCAAACCAUUAUGUGCUGCUU);

con15/107.3, 보체 B(서열번호 21 AGCAAACCAUUAUGUGCUGCUU);

con15/107.4, 보체 B(서열번호 22 CGCAAACCAUACUGUGCUGCUU);

con15/107.1, 보체 C(서열번호 23 CGCAAACCAUUAUGUGCUGCUUUA);

con15/107.2, 보체 C(서열번호 24 UCCGCAAACCAUUAUGUGCUGCUUUA);

con15/107.3, 보체 C(서열번호 25 AGCAAACCAUUAUGUGCUGCUUUA);

con15/107.4, 보체 C(서열번호 26 CGCAAACCAUACUGUGCUGCUUUA);

con15/107.1, 보체 D(서열번호 27 CGCAAACCAUUAUGUGCUGCUUUA);

con15/107.2, 보체 D(서열번호 28 UCCGCAAACCAUUAUUGUGCUGCUUUA);

con15/107.3, 보체 D(서열번호 29 AGCAAACCAUUAUUGUGCUGCUUUA); 및

con15/107.4, 보체 D(서열번호 30 CGCAAACCAUACUUGUGCUGCUUUA).

본 발명의 바람직한 실시형태는 패신저 스트랜드(passenger strand)로서 상보성 서열(서열번호 15 내지 18)과 함께 합성 컨센서스 마이크로RNA("가이드") 서열을 완전 또는 부분적으로 포함한다(서열번호 11 내지 14). 말단 부정합, 돌출부 및/또는 내부 벌지(bulge)가, RISC 부하를 증가시키기 위해 가이드 및 패신저 스트랜드 사이에 도입되어 있는 이중-스트랜드 RNA 모방체는 본 발명에 의해 고려된다(서열번호 21 내지 30 참조). 씨드 서열 AGCAGC가 가이드 스트랜드의 최초 7개 뉴클레오티드 내에, 즉 위치 1 내지 6 또는 위치 2 내지 7에 존재하는 모든 패밀리 구성원의 컨센서스 서열에 상응하는 서열의 다른 변이체가 또한 고려된다. 당해 기술분야의 숙련가는 다른 변이가 RISC 부하를 촉진시켜 활성을 증가시킬 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 이들은 가이드 스트랜드의 3' 말단에 1 또는 2개의 뉴클레오티드 돌출부; 패신저 스트랜드의 3' 말단에 DNA 뉴클레오티드(또는 기타 화학적 변형)를 포함한다.

화학적 변형

일반적으로, 마이크로RNA 모방체는 수술 용도에 비효율적인 것으로 밝혀졌다. 이와 관련하여, 효율을 개선시키기 위해, 본 발명은 구조적 및 화학적으로 변형된 이중-스트랜드 RNA를 포함하는 마이크로RNA 모방체를 사용한다. 예시적 실시형태에서, 마이크로RNA 모방체의 제한을 극복하기 위해, 모방체 서열에 대한 무독성 화학적 변형을 도입하여 안정성을 개선시키고 오프-타겟 효과를 감소시키고 활성을 증가시켰다.

한 가지 실시형태에서, 마이크로RNA 모방체는 성숙 마이크로RNA 서열 및 패신저 스트랜드를 포함하는 RNA 이중쇄를 포함한다. 한 가지 양상에서, 패신저 스트랜드는 구조적 및 화학적으로 변형되어, 패신저 스트랜드를 불활성화시키면서 이중쇄 모방체의 활성의 유지를 가능하게 함으로써 오프-타겟 효과를 감소시킨다. 추가의 양상에서, 화학적 변형은 뉴클레아제 활성을 억제하여 안정성을 증가시킨다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 마이크로RNA 모방체는 이들의 활성을 증강시키도록 변형된 뉴클레오티드의 사용을 고려한다. 이러한 뉴클레오티드는, 분자 내에 내장되어 있는 것들 뿐만 아니라, RNA의 5' 또는 3' 말단에 존재하는 것들을 포함한다. 마이크로RNA의 상보성 스트랜드에 사용된 변형된 뉴클레오티드는 RNA의 5' OH 또는 포스페이트를 차단하거나, 마이크로RNA의 불활성 스트랜드의 흡수 및 활성을 방지하는 내부 당 변형을 도입한다. 마이크로RNA 억제제에 대한 변형은, 세포에서 분자를 안정화시킬 뿐만 아니라 하이브리드화를 증강시키는 내부 당 변형, 및 세포에서 핵산을 추가로 안정화시키는 말단 변형을 포함한다. 마이크로RNA를 함유하는 세포를 동정하기 위해 현미경 또는 기타 방법에 의해 검출될 수 있는 변형도 또한 고려된다.

다른 양상에서, 변형은 마이크로RNA 활성을 방해하지 않고서 마이크로RNA 또는 프레-마이크로RNA의 서열에 대해 이루어질 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 마이크로RNA 서열의 용어 "기능적 변이체"는 천연 마이크로RNA 서열과 상이하지만 마이크로RNA의 하나 이상의 기능적 특성(예를 들면, 화학요법제에 대한 암 세포 감수성의 증강, 암 세포 증식 억제, 암세포 아폽토시스의 유도, 특이적 마이크로RNA 표적 억제)을 보유하는 올리고뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 마이크로RNA 서열의 기능적 변이체는 마이크로RNA의 모든 기능적 특성을 보유한다. 특정 실시형태에서, 마이크로RNA의 기능적 변이체는, 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 또는 그 이상의 뉴클레오염기의 영역에 걸쳐 마이크로RNA 또는 이의 전구체와 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나, 기능적 변이체가 엄격한 하이브리드화 조건하에 마이크로RNA 또는 이의 전구체의 상보체와 하이브리드화하는 뉴클레오염기 서열을 갖는다. 따라서, 특정 실시형태에서, 기능적 변이체의 뉴클레오염기 서열은 마이크로RNA의 하나 이상의 표적 서열과 하이브리드화할 수 있다.

일부 실시형태에서, 상보성 스트랜드는 포스페이트 또는 하이드록실 이외의 화학적 그룹이 이의 5' 말단에 존재하도록 변형된다. 5' 변형의 존재는 상보성 스트랜드의 흡수를 명백하게 배제하고, 마이크로RNA 단백질 복합체에 의한 활성 스트랜드의 흡수를 조장한다. 5' 변형은 NH₂, NHCOCH₃ 및 비오틴을 포함하여 당해 기술분야에 공지된 다양한 임의의 분자일 수 있다.

추가의 실시형태에서, 마이크로RNA 경로에 의한 상보성 스트랜드의 흡수는 당 변형을 갖는 뉴클레오티드를 상보성 스트랜드의 최초 2-6 뉴클레오티드에 도입함으로써 감소된다. 이러한 당 변형은 마이크로RNA 활성을 추가로 증강시키기 위해 상기 기재된 5' 말단 변형과 조합될 수 있음에 유의해야 한다. 마이크로RNA 모방체에서 고려되는 당 변형은, 이로써 제한되지 않지만, O-, S- 또는 N-알킬; 또는 O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬(여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C₁ 내지 C₁₀ 알킬 또는 C₂ 내지 C₁₀ 알케닐 및 알키닐일 수 있다.)로부터 선택되는 당 치환체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이들 그룹은 O(CH₂)_xOCH₃, O((CH₂)_xO)_yCH₃, O(CH₂)_xNH₂, O(CH₂)_xCH₃, O(CH₂)_xONH₂ 및 O(CH₂)_xON((CH₂)_xCH₃)₂(여기서, x 및 y는 1 내지 10이다.)로부터 선택될 수 있다.

변화된 염기 잔기 또는 변화된 당 잔기는 또한 마이크로RNA 모방체의 목적과 일치하는 다른 변형을 포함한다. 이러한 올리고머성 화합물은 천연 발생 또는 합성 비변형된 올리고뉴클레오티드와 구조적으로 구별가능하거나 기능적으로 교환가능한 것으로 기재되어 있다. 이와 같이, 모든 이러한 올리고머성 화합물은, 이들이 miR-15/107 패밀리에 상응하는 목적하는 RNA 올리고뉴클레오티드 스트랜드의 구조 또는 기능을 모방하기 위해 효과적으로 기능하는 한 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

일부 실시형태에서, 상보성 스트랜드는 상보성 스트랜드의 3' 말단 중의 뉴클레오티드가 활성 스트랜드에 상보적이지 않도록 설계된다. 이는 활성 스트랜드의 3' 말단에서 안정하지만 활성 스트랜드의 5' 말단에서 비교적 불안정한 이중-스트랜드 하이브리드 RNA를 제공한다. 안정성의 이러한 차이는 마이크로RNA 경로에 의한 활성 스트랜드의 흡수를 증강시키는 한편, 상보성 스트랜드의 흡수를 감소시켜 마이크로RNA 활성을 증강시킨다.

본 발명의 실시에서의 사용이 고려되는 기타 변형과 관련하여, 특히 miRNA 모방체의 센스 스트랜드에 대한 2'-O-메틸 변형의 부가가 당해 분자에 대해 음성 효과를 가질 수 있다는 미국 특허 공개공보 제2012/0259001호의 개시를 참조한다. 이들 음성 효과의 개선은, (i) 센스 스트랜드의 뉴클레오티드의 약 40% 내지 약 90%가 화학적으로 변형되어 있는, 약 16 내지 약 31개 뉴클레오티드의 크기 범위의 센스 스트랜드; (ii) 안티센스 스트랜드의 뉴클레오티드의 약 40% 내지 약 90%가 화학적으로 변형된 뉴클레오티드인, 약 16 내지 31개 뉴클레오티드의 크기 범위의 안티센스 스트랜드; 및 (iii) 안티센스 스트랜드 상의 뉴클레오티드 1과 센스 스트랜드 상의 반대측 뉴클레오티드 사이의 적어도 하나의 부정합; 및 안티센스 스트랜드 상의 뉴클레오티드 7과 센스 스트랜드 상의 반대측 뉴클레오티드 사이의 부정합을 포함하는 miRNA 모방체이다. 또한, 약 3 내지 약 9개 원자 길이의 링커 분자를 통해, 콜레스테롤, 콜레스타놀, 스티그마스테롤, 콜라닌산 및 에르고스테롤로 이루어진 그룹으로부터 선택된 접합체 잔기의 miRNA 모방체의 센스 스트랜드에 대한 부착이, 개시된 바와 같이, 이러한 맥락에서 유리하다. 링커 분자는, 예를 들면, 5 내지 8개 원자 길이일 수 있고, 링커 분자는 접합체 잔기를 센스 스트랜드의 3' 말단에 부착시킬 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 마이크로RNA 서열은 마이크로RNA 서열과 동일한 RNA 분자 또는 별개의 RNA 분자 상에 위치할 수 있는 제2 RNA 서열과 회합할 수 있다. 이러한 경우, 마이크로RNA 서열은 활성 스트랜드로서 지칭될 수 있는 반면, 마이크로RNA 서열에 적어도 부분적으로 상보성인 코딩된 RNA 서열은 상보성 스트랜드로서 지칭될 수 있다. 활성 및 상보성 스트랜드는 하이브리드화하여, 천연 발생 마이크로RNA 전구체와 유사한 이중-스트랜드 RNA를 생성할 수 있다. 마이크로RNA의 활성은, 활성 스트랜드의 흡수를 최대화함으로써 및 유전자 번역을 조절하는 마이크로RNA 단백질 복합체에 의한 상보성 스트랜드의 흡수를 최소화함으로써 최적화할 수 있다. 이는, 예를 들면, 상보성 스트랜드의 변형 및/또는 설계를 통해 수행할 수 있다.

핵산은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 임의의 기술, 예를 들면, 화학적 합성, 효소적 생산 또는 생물학적 생산에 의해 제조할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본발명의 마이크로RNA 구성은 화학적으로 합성 될 수 있다.

바람직한 실시형태는 이러한 변형의 특정 세트를 갖는다. 이들은 2' O-메틸-변형된 당을 사용하여 패신저 스트랜드의 각 말단에서 2 내지 6개 뉴클레오티드의 화학적 변형이고, 패신저 스트랜드의 5' 말단에서 2, 3, 4, 5 또는 6개 변형된 뉴클레오티드와 패신저 스트랜드의 3' 말단에서 2, 3, 4, 5 또는 6개 변형된 뉴클레오티드와의 임의의 조합을 포함한다. 유사한 기능성을 부여하는 대안적 화학적 변형 전략은 당해 기술분야의 숙련가에게 명백할 것이다.

투여 방법

마이크로RNA 모방체는 이들 화합물을 대상체의 암 세포에 전달하는데 적합한 임의의 수단에 의해 대상체에게 투여할 수 있다. 예를 들면, 마이크로RNA 모방체는, 당해 모방체, 또는 이들 화합물을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산으로 대상의 체의 세포를 형질감염시키기에 적합한 방법에 의해 투여할 수 있다. 한 가지 실시형태에서, 세포는 마이크로RNA 모방체를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드 또는 바이러스 벡터로 형질감염된다.

본 발명의 한 가지 특정 실시형태에서, 생체내에서 비효율적 전달과 연관된 문제를 회피하기 위해, 본 발명에 따르는 모방체는 바람직하게는 무손상, 세균에 의해 유도된 미니세포의 사용에 기반하는 엔제네익 몰레큘라 딜리버리 피티와이 리미티드(EnGeneIC Molecular Delivery Pty Ltd)(Sydney)가 개발한 "엔제네익 딜리버리 비히클(EnGeneIc Delivery Vehicle" 시스템을 통해 전달된다. EDV^TM 시스템은, 예를 들면, 각각의 내용이 본원에서 참조로서 도입되는 공개된 국제출원 공개공보 제WO　2006/021894호 및 제WO　2009/027830호 기재되어 있다.

따라서, 예시적 실시형태에서, 본원에 기재된 마이크로RNA 모방체는 무손상의 세균에 의해 유래된 미니세포를 사용하여 전달된다. 이들 미니세포는 이중특이적 항체를 사용하여 표적 조직에 특이적으로 전달된다. 이러한 항체의 하나의 암(arm)은 표적 조직에 대한 특이성을 갖는 반면, 다른 암은 미니세포에 대한 특이성을 갖는다. 항체는 미니세포를 표적 세포 표면으로 가져오고, 이어서 미니세포를 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 가져온다. 종양 세포 내로의 흡수 후, 미니세포의 내용물, 즉 마이크로RNA 모방체(들)의 방출이 있다. 이와 관련하여 항체에 있어서, MPM을 위한 임의의 세포 표면 마커에 대한 특이성이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 본 문맥에서 이중특이적 항체에 적합한 이러한 특이성의 예시는 치료학적 항체가 개발중에 있는 100% 상피 중피종 상에서 발현된 인간 메소텔린[참조: Kelly et al., Mol. Cancer Ther. 11: 517-22 (2012)], 또는 MPM 및 소화관 고블릿 세포에서 특이적으로 발현되는 인텔렉틴-1[참조: Washimi et al., PLoS One 7: e39889 (2012)]에 대한 특이성일 수 있다.

핵산을 투여하는 다른 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 특히, 현재 사용되는 제형과 함께, 핵산 요법을 위해 이미 사용중에 있는 투여 경로는 핵산에 대한 바람직한 투여 경로 및 제형을 제공한다. 핵산 조성물은, 이로써 제한되지 않지만, 경구, 정맥내, 복막내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하 또는 직장 수단을 포함하는 다수의 경로에 의해 투여할 수 있다.

핵산은 또한 리포좀 또는 나노입자를 통해 투여할 수 있다. 이러한 투여 경로 및 적절한 제형은 일반적으로 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 본원에 기재된 제형의 투여는 마이크로RNA 또는 마이크로RNA를 코딩하는 핵산이 이의 표적에 도달하도록 하는 임의의 허용되는 방법에 의해 달성될 수 있다. 선택된 특정 방식은 물론 특정 제형, 치료되는 대상체 상태의 중증도 및 치료학적 효능에 요구되는 투여량 등의 예시적 인자에 따라 달라질 것이다. 본원에서 일반적으로 사용된 바와 같이, 핵산의 "유효량"은, 당해 제형이 투여되는 대상체에서, 화합물 또는 치료제를 제공받지 않은 정합 대상체와 비교하여, 암 또는 관련 질환의 하나 이상의 증상을 치료하거나 암 또는 관련 질환의 하나 이상의 증상을 역전시키거나 암 또는 관련 질환의 하나 이상의 증상의 진행을 중지시키거나 암 또는 관련 질환의 하나 이상의 증상의 발생을 예방할 수 있는 양이다. 약물의 실제 사용량은 사용되는 특정 약물 또는 이의 조합, 제형화된 특정 조성, 투여 방식, 및 대상체의 연령, 체중, 병태, 및 치료되는 증상 또는 병태의 중증도에 따라 달라질 것이다.

적합한 기타 전달 시스템은, 이로써 제한되지 않지만, 시간 방출, 지연 방출, 지속 방출 또는 조절된 방출 전달 시스템을 포함한다. 이러한 시스템은 다수의 경우에 반복된 투여를 회피하여 대상체 및 의사의 편의성을 향상시킬 수 있다. 다수 종류의 방출 전달 시스템은 이용가능하고, 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 이들은, 예를 들면, 폴리머-계 시스템, 예를 플면, 폴리락트산 및/또는 폴리글리콜산, 폴리무수물, 폴리카프롤락톤, 코폴리옥살레이트, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리하이드록시부티르산 및/또는 이들의 조합을 포함한다.

마이크로RNA 모방체를 함유하는 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 통상의 약제학적 부형제 및/또는 첨가제를 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 부형제는 안정화제, 항산화제, 삼투압조정제, 완충제 및 pH 조정제를 포함한다. 적합한 첨가제는, 예를 들면, 생리학적 생체적합성 완충제(예: 트로메타민 하이드로클로라이드), 킬레이트제(예: DTPA 또는 DTPA-비스아미드), 또는 칼슘 킬레이트 복합제(예: 칼슘 DTPA, CaNaDTPA-비스아미드)의 첨가, 또는 선택적으로 칼슘 또는 나트륨 염(예: 염화칼슘, 칼슘 아스코르베이트, 칼슘 글루코네이트 또는 칼슘 락테이트)의 첨가를 포함한다.

투약

마이크로RNA 발현의 손실과 MPM 사이의 관계는 샘플에서 일정하기 때문에, 본 발명의 한 가지 양상은 MPM 종양 세포에서 마이크로RNA 대체에 관한 것이다. 이러한 양상에서, 초기 동물 실험에 기반하여, MPM의 진행은 본 발명의 miR-함유 miR을 사용한 치료에 의해 중지될 것으로 생각된다. 추가의 양상에서, 연속 시간 프레임에 걸쳐 복수회 용량이 대상체에 투여될 수 있을 것으로 생각된다. 일부 양상에서, 1주 1회 용량이 적합하게 효율적인 효과를 가질 수도 있지만, 일부 대상체는 증가하는 빈도 및/또는 증가하는 투여량에 반응하여 보다 현저하게 효율적인 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시형태에서, 만성 투여는 MPM 질환 조절을 달성할 것이다. 다른 실시형태에서, 마이크로RNA 모방체를 제공받은 MPM 종양 세포는 영구 성장 정지에 들어갈 것으로 생각된다. 이와 관련하여, 영구 성장 정지는 마이크로RNA 모방체의 작용 메카니즘(세포 사이클- 및 대사-촉진 유전자, 항-아폽토시스 프로-생존 유전자 및 약물 내성 유전자의 하향조절) 및 표현형 결과(세포 사이클 중지)에 기여할 수 있다. 따라서, 연속 치료는, 본 발명의 한 가지 양상에 따라서, 질환 조절 또는 유지(즉, 안정한 질환)을 유도하는 것으로 생각된다. 본 발명의 양상에 따라, 종양 퇴축(즉, 부분/완전 반응)은 MPM 종양이 영구 세포 성장 중지에 들어가는 경우에 고려된다.

추가로, 하기에 추가 상세히 설명된 바와 같이, 본 발명의 마이크로RNA 모방체는 화학요법 및 방사선 등의 통상의 암 요법에 대해 세포를 감작화시키는 기능을 한다. 이러한 양상에서, 모방체를 화학요법과 조합하는 것이 추가의 치료 효과를 제공할 것으로 생각된다.

MPM을 위한 현재 모든 치료에 있어서, 치료에 대한 반응은 항상 재발이 계속된다. 따라서, 본 발명의 또 다른 양상에서, 종양은 마이크로RNA 발현과 MPM 사이의 관계에 비추어 재발할 때에 이러한 발현 프로파일을 보유할 것으로 생각된다. 이와 관련하여, 기재된 바와 같은 재발은 본원에 개시된 동일한 마이크로RNA 모방체를 사용한 재-치료를 가능하게 할 것이다. 이러한 실시형태에서, 장기간 종양 억제는 질환의 성질을 변화시키고, 잠재적으로 MPM을 만성 질환 형태로 변화시킨다.

다른 양상에서, 특정 대상체를 위한 투여량은 통상의 고려사항(예를 들면, 적절한 통상의 약리학적 프로토콜에 의해)을 사용하여 당해 기술분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 의사는, 예를 들면, 첫날에 비교적 낮은 용량을 처방하고, 이어서 적절한 반응이 수득될 때까지 용량을 증가시킬 수 있다. 대상체에게 투여된 용량은 시간 경과에 따라 대상체에서 유리한 치료 반응을 수행하거나, 용도에 따라 증상 또는 기타 적절한 활성을 감소시키는데 충분하다. 용량은 특정 제형의 효능 및 사용된 마이크로RNA의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 대상체의 병태 뿐만 아니라 치료되는 대상체의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다. 용량의 크기는 또한 특정 대상체에서 특정 벡터 및 제형의 투여에 동반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정된다.

병용 요법

본원에 기재된 마이크로RNA는, 이로써 제한되지 않지만, 항체 투여, 백신 투여, 세포독성제의 투여, 천연 아미노산 폴리펩티드, 핵산, 뉴클레오티드 유사체 및 생물학적 반응 개질제를 포함하는 임의의 공지된 통상의 요법에 의해 치료 조건을 보충할 수 있다. 2개 이상의 조합된 화합물은 함께 또는 순차로 사용할 수 있다. 예를 들면, 마이크로RNA 모방체는 또한 항암 칵테일의 일부로서 치료학적 유효량으로 투여할 수 있다. 항암 칵테일은 전달용의 약제학적으로 허용되는 담체 이외에 마이크로RNA 모방체(들)와 하나 이상의 항암 약물과의 혼합물이다. 암 치료로서 항암 칵테일의 사용이 통상적이다.

한 가지 실시형태에서, 다른 치료학적 양식과 조합하여 마이크로RNA 모방체를 사용하는 것이 예상된다. 따라서, 상기 기재된 마이크로RNA 치료에 더하여, 이로써 제한되지 않지만, 통상의 암 치료제 등의 보다 "표준" 치료를 대상체에게 제공할 수 있다.

당해 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 핵산과 조합하여 치료제로서 사용될 수 있는 항암 약물은, 이로써 제한되지 않지만, 액티노마이신 D, 아미노글루테티미드, 아스파라기나제, 블레오마이신, 부설판, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴(시스-DDP), 사이클로포스파미드, 시타라빈 HCl(시토신 아라비노사이드), 다카르바진, 팩티노마이신, 다우노루비신 HCl, 독소루비신 HCl, 에스타라무스틴 포스페이트 나트륨, 에토포사이드(VP 16-213), 플록수리딘, 5-플루오로우라실(5-FU), 플루타미드, 하이드록시우레아(하이드록시카바미드), 이포스파미드, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 류프롤리드 아세테이트(LHRH-방출 인자 유사체), 로무스틴, 메클로르에타민 HCl(질소 머스타드), 멜팔란, 머캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트(MTX), 미토마이신, 미톡산트론 HCl, 옥트레오티드, 플리카마이신, 프로카바진 HCl, 스트렙토조신, 타목시펜 시트레이트, 티오구아닌, 티오테파, 빈블라스틴 설페이트, 빈크리스틴 설페이트, 암사크린, 아자시티딘, 헥사메틸멜라민, 인터류킨-2, 미토구아존, 펜토스타틴, 세무스틴, 테니포사이드 및 빈데신 설페이트를 포함한다.

화학요법제는, 예를 들면, DNA를 직접 교차 결합시키는 제제, DNA 내로 삽입되는 제제, 및 핵산 합성에 영향을 미침으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 제제일 수 있다. 핵산, 구체적으로 DNA를 직접 교차 결합시키는 제제는 상승작용적 항신생물 조합을 유도하는 DNA 손상으로 귀착하는 것으로 본원에서 예상되고 제시되어 있다. 시스플라틴과 같은 제제, 및 다른 DNA 알킬레이팅 제제도 사용될 수 있다. DNA를 손상시키는 제제는 또한 DNA 복제, 유사분열 및 염색체 분리를 간섭하는 화합물은 포함한다. 이들 화합물의 예는 아드리아마이신(또한 독소루비신으로 공지됨), 또한 에토포사이드로 공지된 VP-16, 베라파밀, 포도필로독신 등을 포함한다. 예시적 화학요법제는 적어도 1) 항생물질, 예를 들면, 독소루비신, 다우노루비신, 미토마이신, 액티노마이신 D; 2) 백금계 제제, 예를 들면, 시스플라틴; 3) 식물 알칼로이드, 예를 들면, 탁솔 및 빈크리스틴, 빈블라스틴; 4) 알킬화제, 예를 들면, 카르무스틴, 멜팔란, 사이클로포스파미드, 클로람부실, 부설판 및 로무스틴을 포함한다.

본 발명의 예시적 실시형태에 있어서, 마이크로RNA 모방체(들)는 단일 제제로서 투여할 수 있지만, 기타 약물, 예를 들면, 페메트렉시드, 시스플라틴(또는 카보플라틴) 및 젬시타빈 등과 조합하여 사용될 수 있다.

병용 요법은 MPM 종양 세포를, 하나 이상의 마이크로RNA 및 제2 암 치료제를 포함하는 단일 조성물 또는 약리학적 제형과 접촉시키거나, 종양 세포를 2개의 상이한 조성물 또는 제형(여기서, 하나의 조성물은 하나 이상의 마이크로RNA 모방체를 포함하고, 다른 하나는 제2 암 치료제를 포함한다.)과 동시에 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 마이크로RNA 모방체의 투여는 수분 내지 수주 범위의 간격으로 다른 암 치료제의 투여에 선행하거나 후속할 수 있다. 다른 암 치료제 및 하나 이상의 마이크로RNA 모방체가 대상체에게 별도로 적용되는 실시형태에서, 암 치료제 및 하나 이상의 마이크로RNA 모방체가 여전히 종양 세포에 대한 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록, 일반적으로 상당한 시간이 각각의 전달 시간 사이에 실효하지 않는 것을 보장할 것이다.

추가의 약리학적 치료제 및 투여 방법, 투여량 등은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있고[참조: "Physicians Desk Reference," Klaasen's "The Pharmacological Basis of Therapeutics," "Remington's Pharmaceutical Sciences," and "The Merck Index, Eleventh Edition," 본원의 관련 부분에서 참조로서 도입됨], 본원의 개시에 비추어 본 발명과 조합될 수 있다. 투여량에서의 일부 변동은 치료되는 대상체의 병태에 따라 필연적으로 발생할 것이다. 투여 책임자는, 임의의 사례에서, 개개 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이고, 이러한 개개 결정은 당해 기술분야의 숙련가의 기술 범위 내이다.

실시예

하기 실시예는 본 발명의 다양한 실시형태를 설명하기 위한 목적으로 제공된다. 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것을 의미하지 않는다. 당해 기술분야의 숙련가는 본 발명이 본원에 고유한 임의의 목적, 목표 및 이점 뿐만 아니라 목적을 수행하고 언급된 목표 및 이점을 수득하기 위해 양호하게 조정된다는 것을 이해할 것이다. 본 실시예(본원에 기재된 방법과 함께)는 현재 바람직한 실시형태를 나타낸다. 이들은 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 정신의 범위 내에 포함되는 변형태 및 기타 용도는 당해 기술분야의 숙련가에게 일어날 수 있다.

실시예 1

MPM에서 miR-15/107 패밀리의 감소된 발현의 발견

마이크로RNA는 암 발달에서 중요한 역할을 갖고, 이들의 발현은 MPM을 포함하는 종양에서 이상조절된다. 본 발명자들은 MPM 세포주 및 작은 세트의 종양 샘플에서 miR-16 발현의 변화를 동정했고, MPM 세포주 및 보다 큰 세트의 종양 시료에서 관련 마이크로RNA의 전체 miR-15/107 패밀리의 발현을 추가로 평가했다(도 1).

7개 MPM 세포주의 패널을 중피 세포주 MeT-5A와 비교했다. 세포는 ATCC(H28, H2052, H2452, H226 및 MSTO-211H) 및 협력요소(MM05 및 Ren)로부터 수득하고, 권장된 배지에서 37℃에서 5% CO₂로 배양했다. 전체 RNA는 트리졸(TirZOL^R)(Life Technologies)을 사용하여 세포(80% 컨플루언스로 성장시킴)로부터 단리했다. 60개 종양 시료는 포르말린-고정된, 파라핀-매립된 블록으로 구성되었다. 종양 마이크로RNA 발현을 정상 흉막 조직의 23개 포르말린-고정된 샘플과 비교했다. 종양 시료로부터 RNA를 단리하기 위해, 경험이 있는 병리의는 종양 함유량을 농후화하기 위해 레이저 포착 현미해부용 가이드로서 사용된 각 블록으로부터 H&E 염색된 슬라이드 상에 종양 함유량을 표시했다. 요약하면, 샘플을 막 슬라이드(Zeiss) 상에 탑재하고, LCM은 PALM 시스템(Zeiss)을 사용하여 수행했다. 포획된 조직은 부착 수집 튜브에 수집하고, 탈파라핀화를 크실렌에서 수행했다. RNA는 제조업자의 지시에 따라 FFPE RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 포획된 종양 시료 및 정상 조직으로부터 추출했다. 세포주 및 조직 샘플로부터의 RNA는 260 및 280nm에서의 판독치로 나노포소미터(Nanophotometer)를 사용하여 정량화했다. 세포주 및 종양 샘플 둘 다에 있어서, 역전사(RT)는 마이크로RNA-특이적 줄기-루프 프라이머(Life Technologies)를 사용했다. 4㎕ RT 프라이머 혼합물(등몰량 혼합물에서 다중화된 최대 10개 마이크로RNA-특이적 RT 프라이머를 가짐)을 또한 포함하는 100ng의 전체 RNA를 RT 반응에서 주형으로 사용하고, 반응은 10㎕의 용적에서 제조업자의 지시에 따라 수행했다. 수득되는 상보성 DNA(cDNA)는 57.8㎕ 물을 첨가하여 희석시키고, 이러한 희석으로부터, 2.25㎕ cDNA를 qPCR 반응에 대한 주형으로 첨가했다. qPCR은 10㎕의 전체 반응 용적으로 마이크로RNA-특이적 TaqMan 프라이머/프로브 및 TaqMan GeneExpression Mastermix(둘 다 Life Technologies)를 함유했다. 반응물은 수동으로 설정하고, 95℃에서 10분 효소 활성화, 이어서 95℃에서 15초 변성 및 60℃에서 60초 어닐링/신장의 40회 사이클로 Mx3000P 실시간 PCR 기계(Stratagene) 상에 이중으로 작동시켰다. Cq에 대한 값(정량화 사이클)은 MxPro 소프트웨어를 사용하여 적응 기준 및 배경-기반 역치 알고리즘을 적용하여 결정했다. qPCR 결과의 분석은 2^-△△Cq 방법[참조: 리박(Livak) 등에 의해 기재됨]을 사용하여 수행하고, RNU6B 발현 수준으로의 정규화를 포함했다. 각 샘플에서의 발현은 대조군의 평균 발현과 비교하여 계산했다.

miR-15/107 패밀리 중의 10개 마이크로RNA 중에서, 6개(miR-16, miR-15a, miR-15b, miR-195, miR-103 및 miR-107)은 모든 샘플에서 검출되었고, 4개(miR-424, miR-497, miR-503 및 miR-646)은 검출되지 않았다. 세포주에서, 모든 6개의 검출가능한 마이크로RNA의 평균 2 내지 5배 하향조절이 불멸화 정상 중피 세포에서의 발현과 비교하여 관찰되었다(도 1 참조). 종양에서, 정상 흉막에서 이들 마이크로RNA의 수준과 비교하는 경우(id.), miR-16, miR-15a, miR-15b 및 miR-195는 평균 8 내지 25배까지 하향조절되는 반면, miR-103 및 miR-107은 4 내지 6배 하향조절되었다.

실시예 2

크리소타일 아스베스토 섬유에 대한 MPM 세포의 노출시 miR -15/107 패밀리 발현의 감소

아스베스토는 MPM에서 병원체이지만, 마이크로RNA 발현에 대한 효과는 알려져 있지 않다. 아스베스토 노출 후에 관찰된 변화는 MPM 생물학에서 원인의 역할을 시사할 것이다. 당해 기술분야에서의 이전의 연구는, 아스베스토 섬유의 세포독성 농도에 대한 급성 노출의 세포에 대한 효과에 초점이 맞춰져 있었다. 유전자 발현의 변화가 이들 사례에서 관찰되지만, 이러한 치료의 주요 결과는 광범위한 세포독성 및 세포 사멸을 유도하는 조합 아폽토시스 및 괴사이다.

중피 세포에서 마이크로RNA 발현에 대한 아스베스토 노출의 생리학적 관련 효과를 동정하기 위해, MeT-5A 세포를 크리소타일 아스베스토 섬유에 연속 노출시켰다. MeT-5A 세포는 3개월 동안 연속적으로 0, 0.1 또는 1㎍ 크리소타일 아스베스토 섬유의 존재하에 권장된 배양 조건에서 성장시켰다. 지시된 시점에서, 세포를 수거하고, RNA는 마이크로RNA 발현 측정을 위해 단리했다. RNA 단리 및 RT-qPCR은 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행했다. 마이크로RNA의 수준은 U6 발현으로 정규화하고, 무처리 세포에서 정규화 발현과 비교하여 나타낸다. 도 2는 1μM에서 아스베스토에 대한 연속 노출이 모든 시점에서 miR-16, miR-15b, miR-195, miR-103 및 miR-107의 감소된 발현을 유도하고, 70일로부터 miR-15a 발현이 감소하는 것을 입증한다. 이들 결과는 일반적으로 아스베스토 노출을 마이크로RNA 발현의 변화에 연관시키는 최초의 것이고, 장기간 아스베스토 노출과 관련된 유전자 발현에서의 변화를 분석하는 최초의 것이다. 이들은 아스베스토 노출과 miR-15/107 패밀리 발현 사이의 직접 연관을 제공하고, 따라서 이들이 MPM 진행에서 초기의 중요한 변화일 수 있음을 시사한다.

실시예 3

miR -15/107 패밀리의 대체는 시험관내에서 MPM 세포의 성장 억제를 유도한다.

MPM 세포 성장에 대해 miR-15/107 패밀리 구성원을 회복하는 효과를 결정하기 위해, MPM 세포주를 마이크로RNA 모방체로 형질감염시키고, 세포 성장에 대한 효과를 측정했다. 모방체는 성숙 miR-16, miR-15a 또는 miR-15의 서열에 상응하는 이중-스트랜드 RNA 또는 miR-15/107 패밀리의 컨센서스 서열에 상응하는 합성 서열로 구성되었고, HPLC-정제된 동결건조 이중쇄로서 제공되었다(Shanghai GenePharma). 모방체를 20μM의 농도로 물에 재현탁시켰다. 이어서, 이들은 지시된 농도에서 리포펙타민 RNAiMAX ('LRM', Life Technologies)을 사용하여 세포 내로 역 형질감염시켰다. 먼저, 리포플렉스는 혈청-비함유 배지 중의 적절한 농도의 모방체를 혈청-비함유 배지 중의 동일 용적의 LRM 1% 용액과 혼합하고 20 내지 120분 동안 실온에서 배양함으로써 생성했다. 리포플렉스는 다중웰 플레이트를 복제하기 위해 분산시키고, 현탁액(10% FCS를 함유하는 배지) 중의 세포를 각 웰 중의 리포플렉스 혼합물에 첨가하여 세포의 최종 밀도가 7500/cm²으로 되게 했다. 형질감염은, 배지를 10% FCS를 함유하는 신선한 배지로 교체하고 수거할 때까지 37℃에서 추가로 배양한 후에 24시간 동안 진행시켰다. 이어서, 복제 플레이트를 형질감염후 48, 72, 96 및 120시간에서 수거했고, 이는 -80℃에서 배지 및 동결 플레이트의 제거를 수반했다. 실험의 결론에서, 플레이트를 해동시키고, 0.01% SYBR 그린을 함유하는 150㎕ 용해 완충제를 각 웰에 첨가하여 DNA 함유량을 측정했다. 암 상태로 밤새 배양한 후, DNA 함유량은 485nm의 여기 및 535nm의 방사로 설정된 플루오스타 옵티마 형광계측기에서 형광을 측정하여 정량화했다. 이러한 검정에서 전체 형광(즉, 웰당 DNA)은 세포 수와 선형 관계를 나타내어 증식을 측정할 수 있게 했다.

도 3은 서열에 있어서 miR-15a, miR-15b 또는 miR-16에 상응하는 마이크로RNA 모방체로 형질감염 후, 4MPM 세포주(H28, MM05, H2052 및 MSTO)에서 증식의 용량 및 시간 의존적 감소가 있었음을 나타낸다. 정상 중피 세포주 MeT-5A에 대한 이들 치료의 어떠한 효과도 없었다. 따라서, 마이크로RNA 발현의 회복 및 따라서 표적 유전자 발현의 조절은 MPM 세포의 증식 억제를 특이적으로 생성했다.

MPM 세포에 대한 miR-15/107 패밀리의 효과를 추가로 조사하기 위해, 당해 패밀리의 컨센서스 서열에 상응하는 모방체를 설계했다. 컨센서스 서열을 이하에 나타낸다.

모방체	센스 (패신저)	안티센스 (가이드)
con15/107.1	mCmGmCmAAACCAUUAUGUGCUmGmCmUmA	UAGCAGCACAUAAUGGUUUGCG
con15/107.2	mUmCmCmGCAAACCAUUAUGUGCUmGmCmUmA	UAGCAGCACAUAAUGGUUUGCGGA
con15/107.3	mAmGmCmAAACCAUUAUGUGCUmGmCmUmA	UAGCAGCACAUAAUGGUUUGCU
con15/107.4	mCmGmCmAAACCAUACUGUGCUmGmCmUmA	UAGCAGCACAGUAUGGUUUGCG

이들 컨센서스 서열은, miR-15 패밀리 단독(con15/107.1)로부터 전체 15/107 패밀리(con15/107.2 내지 4)까지 상이한, 정렬에 포함된 마이크로RNA의 수에 의존하여 상이했다. con15/107.3에서 컨센서스 길이는 일부 마이크로RNA의 보다 긴 성숙 서열을 고려하여 증가했다. 이어서, 이들 4개 컨센서스 마이크로RNA를 상이한 농도에서 MSTO 또는 H28 세포 내로 형질감염시키고, 세포 성장에 대한 효과를 상기와 같이 평가했다. 도 4는 miR-15/107 컨센서스 서열에 기반한 모든 모방체가 천연 miR-16 서열보다 더욱 성장 억제성있었음을 나타낸다. 이는 컨센서스 서열이 천연 miR-16보다 더욱 유망한 치료학적 후보임을 나타낸다.

실시예 4

miR -16을 사용한 형질감염은 표적 유전자를 하향조절한다.

마이크로RNA는 전사후 유전자 조절에 관여할 수 있다. 마이크로RNA의 주요 작용 메카니즘은 단백질 내로 mRNA의 번역의 억제를 통한 것이지만, 이는 빈번히 표적 RNA의 탈안정화를 유도한다. 따라서, 예측된 표적의 유전자 발현을 조절하는 마이크로RNA의 능력은 목적 마이크로RNA의 조절 후 표적 mRNA 수준을 분석함으로써 측정할 수 있다. 이어서, 이러한 방식으로 조절된 표적은 마이크로RNA 모방체 형질감염 후에 관찰된 표현형 효과에 관여하는 유전자에 대한 후보이다. 단백질 수준에서 또한 하향조절된 이들 유전자는 마이크로RNA의 선의의 표적일 가능성이 높은 것으로 생각된다.

MPM 세포의 세포 생물학에 대한 모방 형질감염의 효과를 연관시키기 위해, 24개 후보 miR-16 표적 유전자의 발현을 miR-16 모방체로 처리한 MPM 세포에서 측정했다(도 5). H28 및 MSTO 세포는 실시예 3에 기재된 방법에 따라 miR-16 모방체 또는 대조군(각각 5nM)으로 6-웰 플레이트에서 역 형질감염시켰다. 48시간 형질감염 후, RNA는 TriZOL을 사용하여 단리하고, 나노분광계를 사용하여 정량화했다(Implen, Munich, Germany). 복제 웰로부터, 단백질을 단리하고, 피어스 BCA 단백질 검정(Thermo Fisher Scientific)으로 정량화했다. cDNA의 합성은 주형으로 250ng RNA를 사용했고, 프라이머로서 랜덤 올리고 및 올리고dT의 혼합물을 사용했다. 이어서, 이러한 cDNA는, 제조업자의 지시에 따라 브릴리언트 II SYBR 그린 화학(Agilent Technologies) 혼합물을 사용하여 miR-16의 예측된 표적에 특이적인 프라이머와의 10㎕ qPCR 반응에서 주형으로 사용하고, 반응은 MX300P 실시간 PCR 기계(Agilent Technologies) 상에서 작동시켰다. qPCR 결과는 △△Ct 방법에 의해 분석하고, 이에 의해 표적 유전자 발현을 18S의 발현에 대해 표준화하고, 모방체-형질감염된 세포로부터의 결과를 대조군-형질감염된 세포에서 표적의 표준화 발현과 비교하여 나타냈다. 이들 결과는 24개 표적에서 1.2 내지 4배 범위의 하향-조절을 입증했다. 단백질 수준에서, CCND1 및 Bcl-2의 발현은 웨스턴 블롯으로 분석했다. 단백질(20㎍)은 10% 프리캐스트 폴리아크릴아미드 겔(Mini Protein TGX Precast Gels, Biorad) 상에서 분리하고, 바이오라드 트랜스-블롯 터보 트랜스퍼 시스템(Biorad Trans-Blot Turbo Transfer System)(Biorad, NSW, Australia)를 사용하여 PVDF 막으로 옮겼다. 막은 우유 분말을 사용하여 차단한 다음, 표적 특이적 항체(Bcl-2; CCND1)으로 검출하고, 이어서 래빗 또는 마우스 특이적 2차 항체(모두 Cell Signaling Inc.사의 항체)로 검출했다. 화학발광(Supersignal West Femto Maximum Sensitivity substrate kit, Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 단백질을 존재를 검출하고, 코닥 지오로직(Kodak Geologic) 2200 화상 시스템을 사용하여 측정했다. 베타-액틴(β-액틴)의 발현은 동등한 단백질 로딩을 조절하기 위해 포함되었다. CCND1 및 Bcl-2 둘 다의 단백질 발현은 대조군과 비교하여 miR-16 처리된 세포에서 현저히 하향-조절되었다(도 5 참조). 함께, mRNA 및 단백질 발현의 이들 변화는 miR-16 모방체 형질감염의 관찰된 표현형 효과가 증식 및 변화된 아폽토시스 반응에 관여하는 유전자와 관련되는 것을 나타낸다.

실시예 5

MPM 세포에서 젬시타빈 및 페메트렉시드 독성에 대한 miR-16의 효과

MPM은 화학요법에 대해 내성이 있는 것으로 간주되고, 이러한 내성은 종양 세포의 아폽토시스 반응의 변화와 관련되는 것으로 생각된다. miR-15/107 패밀리의 다수의 예측된 표적은 이들 프로세스와 관련된 유전자이기 때문에, 마이크로RNA 모방체는 MPM 세포를 화학요법 약물로 감작화시킬 수 있을 것으로 예측할 수 있다. 이에 대해 miR-16 및 약물 젬시타빈 및 페메트렉시드의 조합을 시험했다(도 6).

약물 독성에 대한 miR-16 발현을 회복하는 효과를 시험하기 위해 정상 중피 세포주 MeT-5A(A, D) 및 2개의 MPM 세포주 -MM05(B, E) 및 MSTO-211H(C,F)를 실시예 3에 기재된 바와 같이 96-웰 플레이트에서 1 또는 5nM miR-16(폐쇄된 심볼) 또는 대조군 모방체(폐쇄된 심볼)로 형질감염시켰다. 이어서, 배지를, 24시간 후에, 삼중으로 분석한 각각의 농도를 갖는 페메트렉시드(1.95 내지 500nM) 또는 젬시타빈(0.625 내지 160nM)의 연속 희석액을 함유하는 배지로 대체했다. 72시간 후, 플레이트를 수거하고, DNA 함유량을 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정했다. 약물에 노출된 세포의 성장은 무처리 세포에 대해 정규화하고, 50%까지 성장을 억제시키는 농도(IC₅₀ 값)를 측정했다. 약물 감수성에 대한 miR-16의 효과는 모방체 및 대조군 형질감염된 세포에서 IC₅₀ 값을 비교함으로써 측정했다. 이는 두 약물에 대한 MMO5(B, E) 및 MSTO-211H(C, F) 세포의 용량-의존성 2배 내지 5배 감작화를 나타내지만 정상 MeT-5A 세포(A, D)에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않는 도 6에서 입증되었다.

실시예 6

VectEDVmiR-16으로 전달된 생체내 MPM에서 miR-16 대체의 효과

암에서 종양 억제인자 마이크로RNA의 상실된 발현의 회복시에 관찰된 성장(및 기타) 억제 효과는 이들이 신규한 치료학적 표적을 나타내는 것을 시사한다. 이러한 가능성을 조사하기 위해 이는 임상전 마우스 모델에서 시험되어야 한다. 그러나, 생체내 상황에서 이들 시험관내 효과를 복제하기 위해, 마이크로RNA 모방체는 이들의 치료학적 효과를 갖는 종양 내에서 세포로의 전달을 제한하는 장애를 극복해야 한다. 여기서, miR-16 또는 컨센서스 모방체의 전달은 표적화된 미니세포 접근법을 사용했다. 미니세포는 미국 특허 공개공보 제2011/0111041호 대한 참조로서 상기 개시된 바와 같이 세균의 비동시 분화로부터 유래된 나노입자이다.

miR-16 회복의 생체내 효능은 누드 마우스에서 MPM의 피하 인간 이종이식 모델에서 평가했다(도 7 및 8). 무흉선(nu/nu) 마우스(4 내지 6주령)을 애니멀 리소스 센터(Perth Western Australia)에서 구입하고, 모든 동물 실험은 시드니 지역 보건 지구 동물 윤리 위원회(Sydney Local Health Districts Animal Ethics Committee, Concord and RPAH)에 의해 승인되었다. MSTO 세포를 배양하고, 50㎕ 성장 인자 감소된 마트리겔(BD Biosciences)과 함께 50㎕ 혈청-비함유 배지에서 1.5×10⁶ 세포를 견갑골 사이에 피하 주사했다. 종양 용적(mm³)은 길이(l) 및 폭(w)을 측정하고 지시된 날에 기재된 바와 같이 용적(V=lw²/2)을 계산함으로써 측정했다. 실험 및 대조군 처리는 종양 용적이 평균 100mm³으로 되면 수행했고, 이때 종양 괴는, 종양의 여기 및 조직 검사 후에 측정된 바와 같이, 명백하게 감지할 수 있고 혈관화되었다. 마우스는 다양한 처리를 개시하기 전에 상이한 그룹으로 랜덤화했다. 모든 종양 용적-측정은 투여된 치료제에 대해 맹검 연구자에 의해 수행했다.

3개 실험을 수행했다. 제1 실험에서, 마우스는 지시된 용량의 1×10⁹ miR-16- 또는 대조군 함유 미니세포로 지시된 날에 1주 1, 2 또는 4회 처리했다(도 7). 대조군 마우스(염수 또는 공 미니세포로 처리)의 종양은 실험 과정에서 100에서 400mm³으로 증가했다. miR-16 모방체를 제공받은 이들 마우스의 종양은 보다 서서히 성장했고, 효과는 처리 수에 의존적이었다. 1주 1회 용량을 제공받은 종양-함유 마우스는 대조군-처리된 마우스보다 더욱 서서히 성장하는 종양을 가졌고, 이러한 성장 억제는 30일까지 유지되었으며, 이 시점에서 이들 종양의 크기는 대조군의 것과 유사했다. 1주 2회 용량을 제공받은 마우스는 33일의 실험 종료까지 대략 200mm³으로 크기가 증가한 종양을 가졌고, 전체에 걸쳐 대조군 미니세포를 제공받은 마우스의 것보다 상당히 작았다. 1주 4회 처리한 마우스는 miR-16 모방체의 초기 투여 후에 첫주 동안 크기가 증가하지 않은 종양을 가졌다. 실험 종료까지, 이들 종양은 단지 170mm³으로 크기가 증가했고, 이는 대조군과 비교할 때 75% 성장 억제에 상응한다.

제2 실험에서, 마우스를 2×10⁹ miR-16 또는 대조군-부하된 미니세포의 용량으로 1주 4회 처리했다(도 7). 이 실험에서, 대조군 미니세포로 처리한 마우스의 종양은 절반 용량을 제공받은 제1 실험의 것에 필적하는 속도로 성장했다. 증가된 용량의 miR-16을 제공받은 마우스에서는 miR-16 모방체의 항-종양 효과의 현저한 증가가 있었다. 처리 후의 초기 단계에서, 이들 종양의 용적은 100mm³ 출발점으로부터 감소했다. 이로부터, 종양 용적은 대략 80mm³로 유지했고, 26일째의 치료 중단 및 29일째의 실험 종료 후에 약간의 증가에도 불구하고, 100mm³ 미만으로 잔류했다. 이는, 염수 및 대조군-처리된 그룹과 비교하여, 이들 miR-16-처리된 동물에서 종양 성장의 완전한 억제에 상응한다.

제3 실험에서, 마우스는 1×10⁹ con15/107.2 모방체 또는 대조군-부하된 미니세포의 용량으로 1주 4회 처리했고, 처리는 종양이 평균 100mm³에 도달하면 개시한다(도 8). 이 실험에서, 대조군 미니세포로 처리한 마우스의 종양은 제1 실험과 유사한 속도로 성장했고, 염수-처리된 마우스의 종양과 비교하여 성장이 약간 감소했다. con15/107.2 모방체를 제공받은 마우스에서는 명백한 항-종양 효과가 있었다. 8개 처리에 상응하는 실험의 최초 10일 동안, 종양의 용적은 100mm³의 초기 크기 미만이었다. 그 후, 종양 용적은, 각각 염수 및 대조군-처리된 마우스의 250 및 225mm³과 비교하여, 실험 종료까지 대략 150mm³으로 점차 증가했다.

^VectEDV_miR-16 또는 ^VectEDV_con15/107.2의 투여후 마우스에서 관찰된 MSTO-211H-유래된 이종이식 종양의 성장 억제는 의외로 강력하고, 동일한(및 기타) MPM 세포의 배양물에서 시험관내에서 관찰된 억제를 초과한다(도 3을 도 7 및 8과 비교한다). 이는 세포의 시험관내 >95%가 miR 모방체로 형질감염되는 반면, 모방체를 제공받은 종양의 세포의 생체내 수가 ≤10%일 가능성이 있다는 사실을 고려하면 현저한 것이다.

관찰된 효과는 상피 세포에 대한 miR-16(또는 기타 패밀리 구성원)의 억제 효과에 의해 유발되고, 이에 의해 종양 성장에 요구되는 혈관신생에 관여하는 종양 세포 및 간질 세포 둘 다를 효과적으로 표적화하는 것으로 생각된다. 피하 이종이식 모델에서 모방체 치료의 성장 억제 효과는 동일한 모델에서 다른 전신 치료에 대해 보고된 효과보다 더욱 크다.

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본 발명은 본원에 고유한 것들 뿐만 아니라 언급된 목표 및 이점을 달성하기 위해 양호하게 적용된다. 상기 개시된 특정 실시형태는, 본 발명이 상이하지만 본원의 교시의 이점을 갖는 당해 기술분야의 숙련가에게 명백한 동등한 방식으로 변형 및 실시될 수 있기 때문에, 단지 예시적이다. 추가로, 하기 특허청구범위에 기재된 것들 이외에, 본원에 제시된 구성 또는 설계의 상세에 대해 어떠한 제한도 의도되지 않는다. 따라서, 상기 개시된 특정 예시적 실시형태는 변화 또는 변경될 수 있고, 이러한 모든 변형태는 본 발명의 범위 및 정신 내에 있는 것으로 간주됨이 명백하다.

Claims

악성 흉막 중피종(malignant pleural mesothelioma, MPM)의 치료를 위한 이중-스트랜드 마이크로RNA 모방체(double-stranded microRNA mimic)로서,
상기 마이크로RNA 모방체는
(a) miR-15/107 패밀리 구성원에 상응하는 성숙 서열; 및
(b) 패신저 스트랜드(passenger strand)를 포함하고,
상기 성숙 서열은 5' 말단에 위치 2 내지 7 또는 1 내지 6에서 AGCAGC를 함유하는, 이중-스트랜드 마이크로RNA 모방체.
제1항에 있어서, 상기 성숙 서열이 서열번호 11 내지 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 이중-스트랜드 마이크로RNA 모방체.
제1항에 있어서, 상기 패신저 스트랜드가 서열번호 15 내지 18로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 이중-스트랜드 마이크로RNA 모방체.
제1항에 있어서, 상기 패신저 스트랜드가 화학적 변형에 의해 불활성화되는, 이중-스트랜드 마이크로RNA 모방체.
제1항에 따르는 유효량의 이중-스트랜드 마이크로RNA 모방체를 MPM을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, MPM을 갖는 대상체에서 MPM을 치료하는 방법.
제5항에 있어서, 투여 단계가 마이크로RNA 모방체를 전달하기 위해 미니세포의 사용을 추가로 포함하는, 방법.
제5항에 있어서, 대상체에게 마이크로RNA 모방체의 투여가 보조적 항암 요법의 동시 또는 연속 공-투여를 포함하는, 방법.
제1항에 따르는 마이크로RNA 모방체를 MPM 암 세포에 투여하는 것을 포함하는, 항암 요법에 대한 MPM 암 세포의 감수성을 증가시키는 방법.