IT202100008798A1 - Uso del microrna hsa-mir-197-3p come marcatore di esposizione all’amianto e di mesotelioma maligno della pleura - Google Patents
Uso del microrna hsa-mir-197-3p come marcatore di esposizione all’amianto e di mesotelioma maligno della pleura Download PDFInfo
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Description
Descrizione della domanda di brevetto per invenzione industriale dal titolo: Uso del microRNA hsa-miR-197-3p come marcatore di esposizione all?amianto e di mesotelioma maligno della pleura
Sfondo dell?invenzione
La presente invenzione riguarda il settore delle biotecnologie ed in particolare il settore della diagnostica in quanto descrive l?uso del microRNA denominato hsa-miR-197-3p come biomarcatore per la valutazione dell?esposizione all?amianto, del livello di esposizione nei lavoratori ex-esposti all?amianto, l?insorgenza e lo sviluppo del mesotelioma maligno della pleura e l?identificazione dei diversi istotipi del mesotelioma maligno della pleura.
Stato dell?arte
Il mesotelioma maligno della pleura (altres? detto mesotelioma pleurico maligno o MPM) ? un tumore particolarmente aggressivo, il cui principale fattore di rischio ? l'esposizione all'amianto (Hiriart, E., Deepe, R. & Wessels, A. Mesothelium and malignant mesothelioma. Journal of Developmental Biology 7, 2019; Beckett, P. et al. Demographics, management and survival of patients with malignant pleural mesothelioma in the National Lung Cancer Audit in England and Wales. Lung Cancer 88, 344?8, 2015.
L?impiego di questo minerale cancerogeno ? stato bandito in Italia dal 1992, mentre in altri Paesi l?amianto ? tuttora in uso, favorendo quindi l?insorgenza del mesotelioma pleurico maligno, per il quale si prevede un picco di incidenza nei prossimi anni (Bibby, A. C. et al. Malignant pleural mesothelioma: An update on investigation, diagnosis and treatment. Eur. Respir. Rev. 25, 472? 486, 2016; Marinaccio, A. et al. Pleural malignant mesothelioma epidemic: Incidence, modalities of asbestos exposure and occupations involved from the Italian National Register. Int. J. Cancer 130, 2146?2154, 2012). Attualmente, gli strumenti diagnostici per il mesotelioma pleurico maligno risultano inadeguati, ed essendo questo tumore diagnosticato quasi sempre negli stadi avanzati, risulta inevitabilmente fatale (Carbone, M. et al. Mesothelioma: Scientific clues for prevention, diagnosis, and therapy. CA. Cancer J. Clin.
69, 402?429, 2019, Ledda, C., Senia, P. & Rapisarda, V. Biomarkers for early diagnosis and prognosis of malignant pleural mesothelioma: The quest goes on. Cancers, Basel, 10, 2018). Pertanto, l?identificazione di marcatori sensibili e specifici ? di fondamentale importanza. In particolare, per contrastare questa patologia, ? indispensabile individuare prima di tutto biomarcatori che consentano una diagnosi precoce, nonch? marcatori indicativi di prognosi ed evoluzione della malattia. A tal fine, ? da tenere in considerazione l?eterogeneit? del mesotelioma pleurico maligno (Pasello, G. et al. Malignant pleural mesothelioma immune microenvironment and checkpoint expression: correlation with clinical?pathological features and intratumor heterogeneity over time. Clin. Ann. Oncol. 29, 1258?1265, 2018; Comertpay, S. et al. Evaluation of clonal origin of malignant mesothelioma. J. Transl. Med. 12, 301, 2014); se ne possono distinguere infatti tre principali istotipi: epitelioide, sarcomatoide e bifasico. La classificazione viene effettuata sia in base alla componente cellulare predominante, che al comportamento biologico (Arif, Q. & Husain, A. N. Malignant mesothelioma diagnosis. Arch. Pathol. Lab. Med. 139, 978?980, 2015; Al?, G., Bruno, R. & Fontanini, G. The pathological and molecular diagnosis of malignant pleural mesothelioma: A literature review. Journal of Thoracic Disease 10, S276?S284, 2018). Il sottotipo epitelioide del mesotelioma maligno della pleura rappresenta la forma pi? comune (50-70% dei casi), ed ? caratterizzato da cellule cuboidali o poligonali simili a quelle dei carcinomi; il tipo sarcomatoide (10-20%), con morfologia a cellule fusate, ? simile ai sarcomi; mentre il bifasico (30%) ? composto sia da forme epitelioidi che sarcomatoidi, in proporzione variabile (Husain, A. N. et al. Guidelines for pathologic diagnosis of Malignant Mesothelioma: 2017 Update of the consensus statement from the International Mesothelioma Interest Group. Archives of Pathology and Laboratory Medicine 142, 89?108, 2018). ? stato inoltre dimostrato che i diversi istotipi differiscono anche in base alla responsivit? alle terapie, ripercuotendosi quindi sulla sopravvivenza media (Rossini, M. et al. New Perspectives on Diagnosis and Therapy of Malignant Pleural Mesothelioma. Front. Oncol. 8, 91, 2018; Berardi, R. et al. Clinical and pathologic predictors of clinical outcome of malignant pleural mesothelioma. Tumori 102, 190?195, 2016). Il sottotipo epitelioide ? quello che presenta una maggiore sensibilit? alla chemioterapia, con un tasso di sopravvivenza pi? alto contrariamente a quanto si osserva per gli istotipi bifasico e sarcomatoide. Quest?ultimo ? considerato il pi? aggressivo e quello con la prognosi pi? sfavorevole (Bill?, A., Krug, L. M., Woo, K. M., Rusch, V. W. & Zauderer, M. G. Contemporary Analysis of Prognostic Factors in Patients with Unresectable Malignant Pleural Mesothelioma. J. Thorac. Oncol. 11, 249?55, 2016). La corretta identificazione del sottotipo istologico influenza la prognosi e le decisioni terapeutiche, tuttavia la distinzione degli istotipi del mesotelioma pleurico maligno ? spesso piuttosto complessa (Rossini, M. et al. New Perspectives on Diagnosis and Therapy of Malignant Pleural Mesothelioma. Front. Oncol. 8, 91, 2018).
Inoltre, considerando il lungo periodo di latenza che intercorre tra l?esposizione all?amianto e l?insorgenza del mesotelioma pleurico maligno (Mossman, B. T. et al. New insights into understanding the mechanisms, pathogenesis, and management of malignant mesotheliomas. American Journal of Pathology 182, 1065?1077, 2013), gli individui esposti alle fibre di amianto potrebbero beneficiare di marcatori indicativi dei livelli di esposizione e delle modificazioni biologiche associate agli effetti tossici di questo minerale cancerogeno.
Tra le diverse molecole indagate, numerose evidenze indicano che i microRNA (miRNA) presentano un?espressione aberrante in pazienti affetti da differenti patologie, incluso il mesotelioma pleurico maligno, rispetto ai soggetti sani (Di Leva, G., Garofalo, M. & Croce, C. M. MicroRNAs in Cancer. Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 9, 287?314 (2014); Birnie, K. A., Pr?le, C. M., Thompson, P. J., Badrian, B. & Mutsaers, S. E. Targeting microRNA to improve diagnostic and therapeutic approaches for malignant mesothelioma. Oncotarget 8, 78193?78207, 2017). ? emerso inoltre che l?esposizione ad agenti tossici ambientali causa modificazioni a livello biochimico, le quali si riflettono anche in un?alterata espressione dei miRNA (Vrijens, K., Bollati, V. & Nawrot, T. S. MicroRNAs as potential signatures of environmental exposure or effect: A systematic review. Environmental Health Perspectives 123, 399?411, 2015, Santarelli, L. et al. Four-miRNA signature to identify asbestos-related lung malignancies. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 28, 119?126, 2019). Specifici miRNA sono gi? stati proposti e validati come marcatori di differenti condizioni patologiche, in quanto queste piccole molecole di RNA sono facilmente rilevabili e quantificabili sia a livello intracellulare che nei fluidi biologici (Wang, H., Peng, R., Wang, J., Qin, Z. & Xue, L. Circulating microRNAs as potential cancer biomarkers: The advantage and disadvantage. Clinical Epigenetics 10, 2018); Mitchell, P. S. et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10513?10518, 2008; Ferracin, M. et al. Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients. Oncotarget 6, 14545?14555, 2015).
La domanda di brevetto Internazionale, pubblicazione n. WO2014140797 si riferisce a oligonucleotidi ad RNA (mimic) che mimano microRNA, corrispondenti alla famiglia miR-15/107, e alla metodologia per il loro utilizzo nel trattamento del mesotelioma pleurico maligno, al fine di ripristinare la corretta regolazione dell'espressione dei geni bersaglio della famiglia miR-15/107 in cellule tumorali di mesotelioma pleurico maligno.
Il miR-197-3p ? stato descritto essere deregolato in diverse patologie umane, comprese quelle oncologiche (Remon, J. et al. miRNA-197 and miRNA-184 are associated with brain metastasis in EGFR-mutant lung cancers. Clin. Transl. Oncol. 18, 153?159, 2016; Shaker, O., Maher, M., Nassar, Y., Morcos, G. & Gad, Z. Role of microRNAs -29b-2, -155, -197 and -205 as diagnostic biomarkers in serum of breast cancer females. Gene 560, 77?82, 2015; Hamada, S. et al. miR-197 induces epithelial-mesenchymal transition in pancreatic cancer cells by targeting p120 catenin. J. Cell. Physiol. 228, 1255? 63, 2013; Wang, H. et al. Reciprocal control of miR-197 and IL-6/STAT3 pathway reveals miR-197 as potential therapeutic target for hepatocellular carcinoma. Oncoimmunology 4, 2015; Wang, D. dan et al. miR-197: A novel biomarker for cancers. Gene 591, 313?319, 2016).
Il miR-197-3p ? descritto e registrato con il seguente accession number n. MIMAT0000227 nella banca dati miRBase (http://www.mirbase.org/cgi-bin/mature.pl?mature_acc=MIMAT0000227).
Problema tecnico
Sebbene la ricerca sia molto attiva nel campo di studio del mesotelioma pleurico maligno e dei miRNA, ad oggi non sono ancora stati identificati dei marcatori sensibili e specifici, che conferiscano maggiore sensibilit? e specificit? in combinazione con quelli gi? esistenti, nell?ambito del pannello di marcatori diagnostici e/o prognostici disponibili nell?arte. Risulta pertanto fortemente sentita la necessit? di individuare biomarcatori per il mesotelioma pleurico maligno e per la valutazione dell?esposizione all?amianto che siano in grado contemporaneamente di consentire una diagnosi precoce della patologia, siano indicativi di prognosi, possano essere valutativi dell?evoluzione della malattia, siano in grado di permettere l?identificazione di diversi istotipi della patologia e siano indicativi dei livelli di esposizione alle fibre di amianto. In particolare, quest?ultima caratteristica risulta importante dal momento che ? ipotizzata una correlazione tra il livello di esposizione e il rischio di sviluppare la patologia (Marinaccio, A. et al. Predictions of mortality from pleural mesothelioma in Italy: A model based on asbestos consumption figures supports results from age-period-cohort models. Int. J. Cancer 115, 142?147, 2005; Cavone, D. et al. Epidemiology of Mesothelioma. Environments 6, 76, 2019; Luberto, F. et al. Cumulative asbestos exposure and mortality from asbestos related diseases in a pooled analysis of 21 asbestos cement cohorts in Italy. Environ. Heal. A Glob. Access Sci. Source 18, 2019). Ulteriormente i biomarcatori devono essere indicativi delle modificazioni biologiche associate agli effetti tossici dell?amianto, cosicch? consentano di monitorare nel tempo i soggetti esposti ed evidenziare quelli maggiormente a rischio di sviluppare il mesotelioma pleurico maligno (Bononi, I. et al. Circulating microRNAs found dysregulated in ex-exposed asbestos workers and pleural mesothelioma patients as potential new biomarkers. Oncotarget 7, 82700?82711, 2016).
Sebbene il biomarcatore miR-197-3p sia gi? stato descritto in correlazione con altre patologie anche oncologiche, gli inventori della presente invenzione hanno investigato e sorprendentemente ed inaspettatamente verificato che il microRNA hsa-miR-197-3p ? quantitativamente espresso in maniera diversa nel siero di pazienti MPM affetti da mesotelioma maligno della pleura, lavoratori exesposti all?amianto (WEA) e soggetti sani (HS).
L?espressione del marcatore microRNA hsa-miR-197-3p ? deregolata nei campioni biologici di soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto e con mesotelioma pleurico maligno dei diversi istotipi.
La deregolazione del marcatore microRNA hsa-miR-197-3p permette di identificare di evidenziare tre specifiche coorti soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto, soggetti con mesotelioma pleurico maligno e soggetti sani.
L?analisi dei livelli del miR-197-3p in campioni biologici permette l?identificazione di mesotelioma pleurico maligno, al fine dell?adozione di terapie pi? mirate e personalizzate.
miR-197-3p ? sotto-espresso nei soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto rispetto a soggetti sani.
miR-197-3p ? sovra-espresso nei pazienti soggetti con mesotelioma pleurico maligno rispetto ai soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto.
Nei soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto si potrebbe evidenziare in una fase precoce l?insorgenza di mesotelioma quando si riscontra un incremento di espressione del miR-197-3p circolante rispetto ai soggetti sani.
Oggetto dell?invenzione
Il suddetto problema tecnico ? pertanto risolto fornendo l?uso del microRNA hsa-miR-197-3p con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC come marcatore per la diagnosi del mesotelioma pleurico maligno, anche in soggetti lavoratori exesposti all?amianto.
Il suddetto problema tecnico ? pertanto risolto fornendo l?uso del microRNA hsa-miR-197-3p con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC come marcatore per distinguere gli istotipi del mesotelioma pleurico maligno istotipo epitelioide, l?istotipo bifasico. l?istotipo sarcomatoide.
Il suddetto problema tecnico ? pertanto risolto fornendo l?uso del microRNA hsa-miR-197-3p con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC come marcatore del livello di esposizione cumulativa alle fibre all?amianto in soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto.
Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione un procedimento per la diagnosi del mesotelioma pleurico maligno che comprende la quantificazione in campioni biologici del marcatore microRNA hsa-miR-197-3p con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC in cui la deregolazione di detto marcatore ? un indicatore della presenza della patologia nei sottoinsiemi di soggetti affetti da mesotelioma pleurico maligno, lavoratori exesposti all?amianto e soggetti sani in cui la sovra-espressione di SEQ ID NO. 1 rispetto a soggetti sani ? indicativa di soggetti con mesotelioma pleurico maligno, e la sotto-espressione di SEQ ID NO. 1 rispetto a soggetti sani ? indicativa di soggetti lavoratori exesposti all?amianto.
Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione un procedimento per l?identificazione dei sottotipi istologici (istotipi) epitelioide, sarcomatoide e bifasico del mesotelioma pleurico maligno che comprende la quantificazione in campioni biologici del biomarcatore microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC in cui i livelli maggiori di SEQ ID NO. 1: sono indicativi del sottotipo istologico bifasico, i livelli intermedi sono indicativi del sottotipo sarcomatoide e i livelli inferiori sono indicativi dell?istotipo epitelioide.
Costituisce un ulteriore oggetto della presente invenzione un kit per lo svolgimento del procedimento che comprende: materiali necessari per l?estrazione dell?RNA totale, materiali necessari per la retrotrascrizione dell?RNA totale estratto fino ad ottenere cDNA, materiali necessari per l?analisi del cDNA mediante PCR.
Ulteriori caratteristiche della presente invenzione risulteranno chiare dalla descrizione dettagliata che segue con riferimento alle figure allegate e ai dati sperimentali presentati.
Breve descrizione delle figure
La figura 1 mostra in grafico, nel pannello A l?espressione di miR-197-3p nelle coorti MPM, WEA e HS, rilevata mediante la tecnica di RT-qPCR, in cui la quantit? di miR-197-3p ? rappresentata come copie/?l di cDNA analizzato, nei pannelli B e C delle rappresentazioni delle curve di ROC riferite ai confronti in cui le differenze nell'espressione miR-197-3p sono statisticamente significative.
La figura 2 mostra in grafico (nel pannello A l?espressione di miR-197-3p nelle coorti MPM, WEA e HS, rilevata mediante la tecnica di ddPCR. La quantit? di miR-197-3p ? rappresentata come copie/?l di cDNA analizzato, nei pannelli B e C delle rappresentazioni delle curve di ROC riferite ai confronti in cui le differenze nell'espressione miR-197-3p sono statisticamente significative.
La figura 3 mostra in grafico la correlazione tra i valori di espressione del miR-197-3p ottenuti in RT-qPCR e in ddPCR. I livelli del miR-197-3p (copie / ?l) sono stati misurati con entrambe le tecniche di qPCR in 206 campioni.
La figura 4 mostra in grafico i livelli di espressione del miR-197-3p in correlazione al livello di esposizione cumulativa all?amianto. L?espressione del miR-197-3p, valutata in RT-qPCR (A) e in ddPCR (B), ? espressa in copie del miRNA su ?L di cDNA analizzato. L?unit? di misura dell?esposizione cumulativa all?amianto ? fibre di amianto su cm<3 >di aria inalata (ff / cc).
La figura 5 mostra in grafico i livelli di espressione del miR-197-3p in correlazione al sottotipo istologico di MPM. L?espressione del miR-197-3p, valutata in RT-qPCR (A) e in ddPCR (B), ? espressa in copie del miRNA su ?L di cDNA analizzato.
Descrizione dettagliata dell?invenzione
Nell?abito della presente invenzione per WEA (workers ex-esposed to asbestos) si intendono lavoratori ex-esposti all?amianto.
Nell?abito della presente invenzione per mesotelioma pleurico maligno MPM si intende il tumore di origine mesoteliale a carico della pleura.
Nell?abito della presente invenzione per mesotelioma pleurico maligno di istotipo epitelioide si intende la forma istologica caratterizzata da cellule cuboidali o poligonali simili a quelle dei carcinomi.
Nell?abito della presente invenzione per mesotelioma pleurico maligno di istotipo sarcomatoide si intende la forma istologica caratterizzata da morfologia a cellule fusate, simili ai sarcomi.
Nell?abito della presente invenzione per mesotelioma pleurico maligno di istotipo bifasico si intende la forma istologica caratterizzata dalla presenza di forme sia con morfologia epitelioidi che sarcomatoide in proporzione variabile.
Nell?abito della presente invenzione per HS (healty subject) si intendono i soggetti sani.
Nell?abito della presente invenzione per hsa-miR-197-3p si intende il microRNA (miRNA o miR), denominato hsa-miR-197-3p, ove hsa sta per Homo sapiens, con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC, miRBase accession number n. MIMAT0000227 (http://www.mirbase.org/cgi-bin/mature.pl?mature_acc=MIMAT0000227).
Nell?ambito della presente invenzione per quantificazione di hsamiR-197-3p si intende l?analisi quantitativa condotta mediante tecniche di reazione di polimerasi a catena (PCR), come per esempio la Real-Time PCR quantitativa (RT-qPCR) e la droplet digital PCR (ddPCR).
La presente invenzione fornisce
l?uso del microRNA hsa-miR-197-3p con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC come marcatore per la diagnosi del mesotelioma pleurico maligno, anche in soggetti lavoratori exesposti all?amianto;
l?uso del microRNA hsa-miR-197-3p con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC come marcatore per distinguere gli istotipi del mesotelioma pleurico maligno istotipo epitelioide, l?istotipo bifasico. L?istotipo sarcomatoide;
l?uso del microRNA hsa-miR-197-3p con la seguente sequenza: SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC come marcatore del livello di esposizione cumulativa alle fibre all?amianto in soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto;
un procedimento per la diagnosi del mesotelioma pleurico maligno che comprende la quantificazione in campioni biologici del marcatore microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC in cui la deregolazione di detto marcatore ? un indicatore della presenza della patologia nei sottoinsiemi di soggetti affetti da mesotelioma pleurico maligno, lavoratori exesposti all?amianto e soggetti sani ? indicativa di soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto, in cui la sovra-espressione di SEQ ID NO. 1 rispetto a soggetti sani ? indicativa di soggetti con mesotelioma pleurico maligno, e la sotto-espressione di SEQ ID NO. 1 rispetto a soggetti sani ? indicativa di soggetti lavoratori exesposti all?amianto;
un procedimento per l?identificazione dei sottotipi istologici (istotipi) epitelioide, sarcomatoide e bifasico del mesotelioma pleurico maligno che comprende la quantificazione in campioni biologici del biomarcatore microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1: UUCACCACCUUCUCCACCCAGC in cui i livelli maggiori di SEQ ID NO. 1: sono indicativi del sottotipo istologico bifasico, i livelli intermedi sono indicativi del sottotipo sarcomatoide e i livelli inferiori sono indicativi dell?istotipo epitelioide;
Un kit per lo svolgimento del procedimento che comprende: materiali necessari per l?estrazione dell?RNA totale, materiali necessari per la retrotrascrizione dell?RNA totale estratto fino ad ottenere cDNA, materiali necessari per l?analisi del cDNA mediante PCR.
L?analisi dei livelli del miR-197-3p ? svolta su campioni biologici, preferibilmente siero.
Il marcatore microRNA hsa-miR-197-3p ? quantificato preferibilmente mediante tecniche di PCR.
Preferibilmente le tecniche di PCR sono almeno una tecnica scelta nel gruppo consistente di: PCR quantitativa (qPCR), Real-Time PCR quantitativa (RT-qPCR), droplet digital PCR (ddPCR).
Esempi
L?espressione del miR-197-3p circolante ? stata indagata in sieri di (i) pazienti affetti da MPM (n=69), (ii) lavoratori ex-esposti all?amianto (WEA; n=75) e soggetti sani (HS; n=62).
I sieri di pazienti con diagnosi di MPM sono stati forniti dalla Banca Biologica del Mesotelioma Maligno, Unit? di Anatomia Patologica dell?Azienda Ospedaliera Santi Antonio e Biagio e Cesare Arrigo, di Alessandria, mentre i sieri dei lavoratori ex-esposti all?amianto sono stati ottenuti dalla sezione di Medicina del Lavoro, Universit? di Ferrara. I campioni di siero appartenenti a soggetti sani, ovvero soggetti che sono stati classificati in buona salute al momento del prelievo, sono stati forniti dal Laboratorio Analisi dell?Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara Arcispedale S. Anna di Cona. Lo studio ? stato approvato dal Comitato Etico di Ferrara.
I campioni sono stati raccolti in forma anonima e contrassegnati con un codice di riconoscimento al quale corrispondevano ulteriori informazioni riguardo l?et? e il genere. I soggetti hanno firmato un consenso informato.
Per permettere uno studio di tipo comparativo tra le varie coorti di MPM, WEA, HS sono stati analizzati campioni appartenenti a soggetti/pazienti aventi et? paragonabili.
Per le coorti di MPM e WEA sono state raccolte informazioni riguardanti le caratteristiche clinico-patologiche, occupazionali e di anamnesi, che hanno permesso di valutare l?eventuale effetto/associazione di queste variabili e i livelli di espressione del miR-197-3p. Per verificare i possibili effetti dell?esposizione all?amianto e al fumo di tabacco, le tre coorti sono state suddivise in sottogruppi, ciascuno con circa lo stesso numero di soggetti. Per quanto riguarda la coorte degli WEA, sono stati formati i seguenti sottogruppi: (i) tre sottogruppi per la durata dell?esposizione all?amianto (unit? di misura: anni): <21, 21-30 e >30; (ii) quattro sottogruppi per gli anni dall?ultima esposizione all?amianto (unit? di misura: anni): <11, 11-20, 21-30 e >30; (iii) quattro sottogruppi per l?esposizione cumulativa all?amianto (unit? di misura: ff/cc, fibre/cm<3>): <10, 10,1-50, 50,1-140, >140; (iv) quattro sottogruppi per l?esposizione al fumo di tabacco (unit? di misura: P/Y, pacchetti di sigarette per anno): 0, 0,1-10, 10,1-20, >20.
Tra i parametri sopra riportati, l?esposizione cumulativa ? particolarmente importante per monitorare i lavoratori esposti all?amianto, dal momento che questo valore si ricava da una formula che tiene conto del tempo, della frequenza e dell?intensit? dell?esposizione alle fibre di amianto. Ci sono evidenze che esista una relazione tra i livelli di esposizione cumulativa e la mortalit? associata alle patologie legate all?amianto, incluso il MPM (Luberto, F. et al. Cumulative asbestos exposure and mortality from asbestos related diseases in a pooled analysis of 21 asbestos cement cohorts in Italy. Environ. Heal. A Glob. Access Sci. Source 18, 2019).
Inoltre, ? stata valutata l?influenza di altre variabili cliniche. Nello specifico per la coorte degli WEA: asbestosi o altre patologie correlate all?amianto, altre morbosit?, non correlate all?amianto, stato di fumatore, ex-fumatore o non-fumatore e (iv) terapie farmacologiche. Riferendosi al gruppo degli MPM, sono stati presi in considerazione: sottotipi istologici di MPM, esposizione all?amianto, stato di fumatore, ex-fumatore o non-fumatore, interventi chirurgici, inclusi interventi per metastasi, terapie farmacologiche, patologie concomitanti, non correlate all?amianto.
I campioni di siero sono stati aliquotati e conservati a -80?C fino al momento delle analisi.
Il RNA totale, compresi i miRNA, ? stato estratto usando il kit Qiagen miRNeasy Mini Kit (cod.217004; Qiagen, Hilden, Germania), seguendo un protocollo supplementare specifico fornito dalla stessa ditta produttrice, con alcune modifiche. Nello specifico, a 200 ?l di siero, subito dopo l?aggiunta di 1 ml di Qiazol Lysis Reagent (Qiagen), sono stati aggiunti 2,5 ?l di un miRNA sintetico non umano, il cel-miR-39 (5 nM), come controllo di estrazione (Bononi, I. et al. Circulating microRNAs found dysregulated in ex-exposed asbestos workers and pleural mesothelioma patients as potential new biomarkers. Oncotarget 7, 82700?82711, 2016; Brunet-Vega, A. et al. Variability in microRNA recovery from plasma: Comparison of five commercial kits. Anal. Biochem. 488, 28?35, 2015; Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S. & Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.032).
Successivamente, sono stati aggiunti 200 ?l di cloroformio privo di Rnasi e il campione ? stato incubato a temperatura ambiente per 2-3 minuti. In seguito, il campione ? stato centrifugato per 15 minuti a 15000 rpm, a 4?C, permettendo la separazione dello stesso in tre fasi. La fase superiore, incolore, acquosa, contenete il RNA totale, ? stata trasferita in una nuova provetta e sono stati aggiunti 1,5 volumi di etanolo 100%, mescolando pi? volte con la pipetta. Successivamente, il campione, compreso l?eventuale precipitato, ? stato trasferito in una colonnina Rnasy-Mini, e sono stati eseguiti tre lavaggi mediante buffer RWT e RPE. Infine, il RNA ? stato eluito in 30 ?l di acqua priva di Rnasi e quantificato allo spettrofotometro NanoDrop 2000 (ND-1000; NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).
I campioni di RNA estratto sono stati poi conservati a -80?C fino al momento dell?utilizzo.
La retrotrascrizione dei miRNA, estratti da siero, ? stata effettuata utilizzando il kit miRCURY LNA RT kit (Qiagen cod.
339340), seguendo il protocollo indicato dalla ditta produttrice. Per la reazione di trascrizione inversa sono stati utilizzati 2 ?l dell?RNA totale precedentemente estratto, 2 ?l di buffer di reazione 5X, 1 ?l di enzima trascrittasi inversa e acqua priva da Rnasi, fino ad arrivare a un volume finale di 10 ?l. Inoltre, per verificare che l?efficienza della reazione fosse la medesima per tutti campioni, ? stato introdotto anche un controllo esogeno ovvero l?RNA sintetico spike-in Unisp6, fornito dal kit di retrotrascrizione (Brunet-Vega, A. et al. Variability in microRNA recovery from plasma: Comparison of five commercial kits. Anal. Biochem. 488, 28?35, 2015; miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR Instruction manual v6.2, 2016).Le condizioni impiegate per la reazione sono le seguenti: 42?C per 60 minuti, 95?C per 5 minuti, utilizzando il termociclatore SimpliAmp Thermal Cycler (Life Technologies). Il cDNA cos? ottenuto ? stato conservato a -20?C ed in seguito ? stato utilizzato nelle analisi di Real-Time qPCR e Droplet Digital PCR (ddPCR). Ogni campione di cDNA ? stato diluito 1:60 prima di procedere alle reazioni di RT-qPCR, secondo le istruzioni della ditta produttrice, per limitare le interferenze tra gli enzimi e i reagenti delle varie mix di reazione (miRCURY LNA miRNA PCR Handbook ? QIAGEN, 2017).
La concentrazione del hsa-miR-197-3p ? stata analizzata tramite le tecniche di PCR quantitativa (qPCR), RT-qPCR e ddPCR, con l?utilizzo di miRCURY LNA miRNA PCR Assay specifico per il miR-197-3p, Qiagen cod.339306-YP00204380.
Dal momento che, nel siero, non sono stati ancora identificati dei geni housekeeping affidabili per la quantificazione dei miRNA circolanti (Donati, S., Ciuffi, S. & Brandi, M. L. Human Circulating miRNAs Real-time qRT-PCR-based Analysis: An Overview of Endogenous Reference Genes Used for Data Normalization. Mol. Sci. (2019). Doi:10.3390/ijms20184353), per poter valutare i livelli di espressione del miR-197-3p ? stata utilizzata una retta standard ottenuta attraverso diluizioni seriali del miR-197-3p sintetico. Nello specifico, si tratta di un oligonucleotide sintetico Locked Nucleic Acid (LNA) con la sequenza del miRNA d?interesse:
synthetic hsa-miR-197-3p: SEQ ID NO. 1
5?-rUrUrCrArCrCrArCrCrUrUrCrUrCrCrArCrCrCrArGrC-3? (Qiagen cod.
339411-YCO0082026).
La soluzione stock (100 ?M) di miRNA sintetico ? stata preparata aggiungendo acqua priva di Rnasi e Dnasi, come specificato nella scheda tecnica della ditta produttrice. In seguito, sono state effettuate delle diluizioni seriali 1:10 da 10<13 >copie/?l fino a 10<0 >copie/?l. La curva cos? ottenuta ? stata utilizzata per la quantificazione assoluta in RT qPCR (ampomenosi, P. et al. A comparison between quantitative PCR and droplet digital PCR technologies for circulating microRNA quantification in human lung cancer. BMC Biotechnol. 16, 60, 2016) e come controllo positivo in ddPCR.
Per le analisi in RT-qPCR ? stato utilizzato il miRCURY LNA SYBR Green PCR Kit (Qiagen cod.339346) seguendo il protocollo della ditta produttrice. Nello specifico, sono stati usati 3 ?l di cDNA, diluito 1:60, 0,5 ?l di miRCURY LNA miRNA PCR assay, specifico per hsa-miR-197-3p, e 5 ?l di miRCURY LNA SYBR Green, per un volume totale di reazione di 10 ?l. I campioni sono stati analizzati in triplicato con l?utilizzo del termociclatore CFX96 Touch (Bio-Rad). Il programma di amplificazione impiegato si compone di uno stadio iniziale di denaturazione a 95?C per 2 minuti, seguito da due fasi, 95?C per 10 s e 56?C per 1 minuto, ripetuti per 40 cicli. Infine, ? stato inserito un passaggio da 60?C a 95?C per l?analisi delle curve di melting (fusione), per verificare che non fossero presenti prodotti di amplificazione aspecifici. Contemporaneamente ai campioni sono state analizzate anche le curve standard per permettere la quantificazione assoluta del miR-197-3p.
La droplet digital PCR (ddPCR) ? un potenziamento della tecnica di qPCR convenzionale, che consente una quantificazione pi? sensibile e accurata degli acidi nucleici (Mazzoni, E. et al. Detection of Merkel Cell Polyomavirus DNA in Serum Samples of Healthy Blood Donors. Front. Oncol. 7, 294, 2017; Tagliapietra, A. et al. Dropletdigital PCR assay to detect Merkel cell polyomavirus sequences in chorionic villi from spontaneous abortion affected females. J. Cell. Physiol., 2019, doi:10.1002/jcp.29213; Torreggiani, E. et al. Protocol for the long-term culture of human primary keratinocytes from the normal colorectal mucosa. J. Cell. Physiol. 234, 9895?9905, 2019; Tagliapietra, A. et al. Footprints of BK and JC polyomaviruses in specimens from females affected by spontaneous abortion. Hum. Reprod. 34, 433?440, 2019; Ferracin, M. & Negrini, M. Quantification of circulating micrornas by droplet digital PCR. In Methods in Molecular Biology 1768, 445?457, Humana Press Inc., 2018; Miotto, E. et al. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: Comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23, 2638?2642, 2014).
La ddPCR ? in grado di superare le problematiche relative a potenziali criticit? nelle analisi di qPCR. Nello specifico la ddPCR, rispetto alla tradizionale RT-qPCR, mostra i seguenti vantaggi: consente una quantificazione assoluta basata sui principi del partizionamento del campione e della statistica di Poisson, superando cos? i problemi legati alla normalizzazione e alle curve di calibrazione (Ferracin, M. et al. Absolute quantification of cell-free microRNAs in cancer patients. Oncotarget 6, 14545?14555, 2015; Campomenosi, P. et al. A comparison between quantitative PCR and droplet digital PCR technologies for circulating microRNA quantification in human lung cancer. BMC Biotechnol. 16, 60,2016); ? meno sensibile agli inibitori della reazione di PCR (Ra?ki, N., Dreo, T., Gutierrez-Aguirre, I., Blejec, A. & Ravnikar, M. Reverse transcriptase droplet digital PCR shows high resilience to PCR inhibitors from plant, soil and water samples. Plant Methods 10, 2014; Huggett, J. F. et al. Differential susceptibility of PCR reactions to inhibitors: An important and unrecognised phenomenon. BMC Res. Notes 1, 2008; Doi, H. et al. Droplet digital polymerase chain reaction (PCR) outperforms real-time PCR in the detection of environmental DNA from an invasive fish species. Environ. Sci. Technol. 49, 5601?5608, 2015); presenta maggiore precisione e sensibilit? anche nel rilevare target poco espressi (Mazzoni, E. et al. Detection of Merkel Cell Polyomavirus DNA in Serum Samples of Healthy Blood Donors. Front. Oncol. 7, 294, 2017; Zhao, S. et al. Sensitive detection of Porcine circovirus-2 by droplet digital polymerase chain reaction. J. Vet. Diagnostic Investig. 27, 784?788, 2015; Brunetto, G. S. et al. Digital droplet PCR (ddPCR) for the precise quantification of human T-lymphotropic virus 1 proviral loads in peripheral blood and cerebrospinal fluid of HAM/TSP patients and identification of viral mutations. J. Neurovirol. 20, 341?351, 2014); fornisce il risultato dell?analisi direttamente espresso come numero di copie del target per microlitro di reazione (Campomenosi, P. et al. A comparison between quantitative PCR and droplet digital PCR technologies for circulating microRNA quantification in human lung cancer. BMC Biotechnol. 16, 60, 2016; Torreggiani, E. et al. Protocol for the long-term culture of human primary keratinocytes from the normal colorectal mucosa. J. Cell. Physiol. 234, 9895?9905, 2019; Hindson, B. J. Et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83, 8604?8610, 2011). Anche in ddPCR, tuttavia, ? utile impiegare un controllo positivo ai fini di identificare pi? accuratamente il cluster degli eventi positivi. A questo scopo pertanto ? stato utilizzato lo stesso oligonucleotide sintetico LNA hsa-miR-197-3p impiegato per la curva standard in RT-qPCR (Qiagen cod. 339411-YCO0082026).
Per le analisi in ddPCR sono stati utilizzati gli stessi primer specifici-LNA miRNA (Qiagen), menzionati precedentemente per l?analisi di RT-qPCR, utilizzando il QX200 ddPCR System (Bio-Rad). Nello specifico per la reazione di ddPCR sono stati usati: 10 ?l di cDNA diluito 1:60, 0,5 ?l di miRCURY LNA PCR primer set specifico per il miR-197-3p, 11 ?l di 2X EvaGreen supermix (Bio-Rad cod.
1864035) e 0,5 ?l di acqua per un volume totale di 22 ?l. In seguito alla generazione delle droplets nell?Automated Droplet Generator (Bio-Rad), la piastra da 96 pozzetti ? stata termosaldata con apposite pellicole perforabili e inserita nel termociclatore. Il programma di amplificazione per l?EvaGreen assay prevede una fase iniziale a 95?C per 5 minuti seguita da 40 cicli a 95?C per 30 secondi e 56?C per 1 minuto, infine 4?C per 5 minuti, 90?C per 5 minuti per la stabilizzazione della sonda. Per ogni esperimento sono stati inseriti un controllo negativo (NTC) e un controllo positivo composto da un oligonucleotide sintetico LNA del miR-197-3p. Per la rielaborazione dei dati, in seguito alla lettura nel Reader, ? stato utilizzato il software QuantaSoft che permette di determinare il numero di eventi positivi e negativi presenti al termine dei 40 cicli di amplificazione.
Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il software statistico Prism 8.0 (GraphPad software, La Jolla, CA, USA). In particolare, sono state testate le differenze nei livelli del miR-197-3p nelle tre coorti (MPM, WEA e HS). I dati distribuiti in modo normale sono stati analizzati mediante il test ANOVA e il test t di Student, con, se necessario, la correzione di Welch; i dati che non seguono la distribuzione normale sono stati analizzati mediante i test di Kruskal-Wallis e di Mann-Whitney.
L?analisi delle curve di ROC ? stata utilizzata per valutare l?accuratezza dei risultati di RT-qPCR e ddPCR nel discriminare i dati comparativi nelle tre coorti in studio.
La correlazione tra i risultati di RT-qPCR e di ddPCR ? stata testata utilizzando il modello di regressione lineare. L?analisi di correlazione ? stata eseguita per valutare le potenziali correlazioni tra i livelli di espressione del miR-197-3p e le variabili indipendenti prese in considerazione. I valori di p value (p) inferiori a 0,05 (p<0,05) sono stati considerati statisticamente significativi.
L?espressione del miR-197-3p ? stata analizzata nei campioni di siero dapprima attraverso la tecnica di RT-qPCR. Il miR-197-3p ? stato rilevato in tutti i 206 campioni considerati. In particolare, nel gruppo dei pazienti affetti da MPM, sono state identificate una media di 777,7 copie di miR/ ?l di cDNA, negli WEA 336,0 copie di miR/ ?l e nei soggetti sani 870,1 copie di miR/ ?l. Il miR-197-3p ? risultato deregolato in maniera statisticamente significativa nel confronto tra le tre coorti considerate (test ANOVA; p=0,0009***). Nello specifico, nei confronti due a due dei gruppi in studio, il miR-197-3p ? risultato sotto-espresso negli WEA in maniera statisticamente significativa sia rispetto agli MPM (p=0,0009***), che rispetto agli HS (p=0,0001***). Il confronto tra pazienti affetti da MPM e soggetti sani HS non ha invece mostrato differenze significative. Successivamente ? stata calcolata la curva di ROC per stabilire con quanta accuratezza il miR-197-3p potesse distinguere i lavoratori ex-esposti all?amianto dai pazienti affetti da mesotelioma oppure dai soggetti sani, ovvero nei confronti risultati significativi. La curva di ROC per MPM vs WEA ha mostrato un?area sotto la curva (AUC) di 0,682 (p=0,0002***; intervallo di confidenza al 95% tra 0,594 e 0,771). Allo stesso modo ? stata calcolata la curva di ROC per il confronto tra WEA e HS che ha mostrato, in questo caso, una AUC di 0,727 (p=0,0001***; intervallo di confidenza al 95% tra 0,641 e 0,813). I dati ottenuti indicano che il miR-1973p ? in grado di discriminare in maniera significativa gli WEA sia dagli MPM che dagli HS, come mostrato in figura 1.
Sugli stessi 206 campioni analizzati in RT-qPCR, il miR-197-3p ? stato investigato anche con la tecnica di ddPCR. ? stato possibile individuare il miR-197-3p in tutti i campioni con una media di 1170 copie di miR/ ?l per la coorte degli MPM, 525 copie di miR/ ?l per il gruppo degli WEA e 1316 copie di miR/ ?l per gli HS. Sono stati poi eseguiti gli stessi confronti mostrati in precedenza con, in primo luogo, l?analisi della varianza (ANOVA) che ha mostrato una deregolazione significativa di questo miRNA nel confronto tra le tre coorti (p=0,0004***). Il test-t di Student ha evidenziato una sottoespressione del miR-197-3p nella coorte degli WEA, sia rispetto agli MPM (p=0,0004***) che rispetto agli HS (p=0,0001***). La differenza tra MPM e HS non ? risultata statisticamente significativa. La curva di ROC sui dati raccolti in ddPCR ha mostrato un?AUC di 0,677 nel confronto tra MPM vs WEA (p=0,0002**; intervallo di confidenza al 95% tra 0,589 e 0,764), e di 0,755 nel confronto tra WEA e HS (p<0,0001***; intervallo di confidenza al 95% tra 0,675 e 0,835). Questi dati confermano che il miR-197-3p ? in grado di discriminare in maniera significativa i lavoratori ex-esposti all?amianto sia dai soggetti sani che dagli individui che hanno sviluppato mesotelioma maligno della pleura, come mostrato in figura 2.
? stata eseguita un?analisi di regressione lineare per indagare la corrispondenza tra i dati ottenuti con le due tecniche di PCR quantitativa utilizzate per rilevare l?espressione del miR-197-3p nei 206 campioni di siero. I risultati ottenuti in RT-qPCR e in ddPCR hanno mostrato una correlazione lineare statisticamente significativa con un R-quadro (Rsq) di 0,900 (p<0,0001***), come mostrato in figura 3.
Sono stati calcolati i coefficienti di correlazione di Spearman tra la quantit? del miR-197-3p e le variabili indipendenti (i parametri clinico-patologici) valutate, mostrate nelle tabelle 2 e 3 che seguono, in cui nella tabella 1 sono mostrati i coefficienti di correlazione tra l?espressione del miR-197-3p e le variabili indipendenti valutate per la coorte degli WEA. I coefficienti di correlazione sono stati calcolati secondo il test di Spearman. I livelli del miR-197-3p sono stati espressi come copie/?l di cDNA analizzato. Correlazioni con p <0,05 (*) sono state considerate statisticamente significative.
Tabella 1
Nella tabella 2 sono mostrati i coefficienti di correlazione tra l?espressione del miR-197-3p e le variabili indipendenti valutate per la coorte degli MPM. I coefficienti di correlazione sono stati calcolati secondo il test di Spearman. I livelli del miR-197-3p sono stati espressi come copie/?l di cDNA analizzato. Correlazioni con p <0,05 (*) sono state considerate statisticamente significative.
Tabella 2
Nella coorte degli WEA ? stata osservata una correlazione negativa tra i livelli del miR-197-3p e l?esposizione cumulativa all?amianto. Nello specifico la concentrazione del miR-197-3p ? risultata pi? bassa nei soggetti con una maggiore esposizione cumulativa all?amianto (>140 ff/cc), rispetto ai soggetti con valori di esposizione pi? bassi (intervallo 0-10 ff/cc, p=0,0218*, e intervallo 10,1-50 ff/cc, p=0,0303*), in entrambe le analisi di PCR, come mostrato in figura 4.
Analizzando la coorte degli MPM, ed in particolare suddividendo i pazienti in base all?istotipo di mesotelioma, si ? evidenziato che i livelli del miR-197-3p sono maggiori nel sottotipo istologico bifasico rispetto agli altri due istotipi, con una differenza significativa nel confronto con l?istotipo epitelioide (p=0,0366*), come mostrato in figura 5.
SEQUENCE LISTING
<110> UNIVERSITA' DEGLI STUDI DI FERRARA
<120> Uso del microRNA hsa-miR-197-3p come marcatore di esposizione
all'amianto e di mesotelioma maligno della pleura
<130> RBI17430-IT
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
uucaccaccu ucuccaccca gc 22
Claims (6)
1. Uso del microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1 come marcatore per la diagnosi del mesotelioma pleurico maligno, anche in soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto.
2. Uso del microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1 come marcatore per distinguere gli istotipi del mesotelioma pleurico maligno istotipo epitelioide, l?istotipo bifasico. L?istotipo sarcomatoide.
3. Uso del microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1 come marcatore del livello di esposizione cumulativa alle fibre all?amianto in soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto.
4. Procedimento per la diagnosi del mesotelioma pleurico maligno che comprende la quantificazione in campioni biologici del marcatore microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1 in cui la deregolazione di detto marcatore ? un indicatore della presenza della patologia nei sottoinsiemi di soggetti affetti da mesotelioma pleurico maligno, lavoratori ex-esposti all?amianto e soggetti sani in cui la sovra-espressione di SEQ ID NO. 1 rispetto a soggetti sani ? indicativa di soggetti con mesotelioma pleurico maligno, e la sotto-espressione di SEQ ID NO. 1 rispetto a soggetti sani ? indicativa di soggetti lavoratori ex-esposti all?amianto.
5. Procedimento per l?identificazione dei sottotipi istologici (istotipi) epitelioide, sarcomatoide e bifasico del mesotelioma pleurico maligno che comprende la quantificazione in campioni biologici del biomarcatore microRNA hsa-miR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1 in cui i livelli maggiori di SEQ ID NO. 1: sono indicativi del sottotipo istologico bifasico, i livelli intermedi sono indicativi del sottotipo sarcomatoide e i livelli inferiori sono indicativi dell?istotipo epitelioide.
6. Kit di parti per uso contemporaneo e/o sequenziale per la quantificazione in campioni biologici del biomarcatore microRNA hsamiR-197-3p di sequenza SEQ ID NO. 1 che comprende: i materiali necessari per l?estrazione dell?RNA totale, i materiali necessari per la retrotrascrizione dell?RNA totale estratto fino ad ottenere cDNA, i materiali necessari per l?analisi del cDNA mediante PCR.
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