JP2013520197A - miRNAに関連する癌を検出および処置するための方法および組成物およびmiRNAインヒビターおよび標的 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、癌(血液悪性疾患、特にT細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)が含まれる)の診断、管理、および処置、ならびに処置に対する応答の予測および評価に関する。本発明は、癌(血液学的悪性疾患(T細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)など)が含まれる)に関連するマイクロRNA(miRNA)ならびに癌の処置および管理におけるその評価および調整に関する。
癌(血液悪性疾患が含まれる)の処置ならびに特定の処置レジメンに対する癌および癌細胞の応答の予測および評価への従来のアプローチは、存在する腫瘍型の適切な分類に依る。適切な分類は、今度は、臨床的特徴、腫瘍細胞の形態学、腫瘍細胞の免疫表現型に主に依存し、より少ない程度に、腫瘍細胞の染色体異常に依存する。しかし、所与の腫瘍型の範囲内でさえ、特定の処置レジメンに対する応答は、しばしば、非常に多様であり、分子レベルでの分析により、従来の分類スキームによって定義された腫瘍型がしばしば非常に不均一であることが明らかである。
その最も広い態様では、本発明は、癌(血液悪性疾患が含まれる)の診断および処置ならびに処置に対する応答の予測および評価のための方法および組成物に及ぶ。特異的miRNAを、癌(特に、血液学的悪性疾患、特に、白血病およびリンパ腫)の病原における関与因子として提供し、疾患の予防、処置、または緩和における有効な標的として証明されている。
(a)上記哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
(b)上記サンプル中のmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(c)少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を、参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、少なくとも2つのmiRNAの発現または活性が参照サンプルと比較して変化する。本方法の1つの態様では、3つ以上のmiRNAの発現または活性を測定し、比較し、発現または活性が変化する。さらなる態様では、癌は、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される。特定の態様では、癌は血液学的悪性疾患である。
(a)候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択されるmiRNAを発現する細胞をインキュベートする工程、および
(b)候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される上記miRNAの発現または活性を検出または測定する工程
を含み、それにより、
上記候補化合物または薬剤の存在下 対 上記候補化合物または薬剤の非存在下でのmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される上記miRNAの発現の減少が、上記化合物または薬剤がmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択されるmiRNAの発現を阻害することを示す。
(a)化合物をmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAを発現する細胞と接触させる工程、および
(b)上記miRNAのうちの1つ以上の発現または活性を決定する工程
を含み、
ここで、上記miRNAの発現または活性が阻害されるか減少する。
(a)上記哺乳動物から血液または血球のサンプルを得る工程、
(b)miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(c)1つ以上のmiRNAの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程を含み、
1つ以上のmiRNAのうちの少なくとも1つの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する。
(a)上記哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
(b)上記サンプル中のmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(c)少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
上記miRNAのうちの少なくとも2つの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する。
本発明によれば、当業者の範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えDNA技術を使用することができる。かかる技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Sambrookら、,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”(1989);“Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I−III [Ausubel,R.M.,ed.(1994)];“Cell Biology:A Laboratory Handbook” Volumes I−III [J.E.Celis,ed.(1994))];“Current Protocols in Immunology” Volumes I−III [Coligan,J.E.,ed.(1994)];“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait ed.1984);“Nucleic Acid Hybridization” [B.D.Hames & S.J.Higgins eds.(1985)];“Transcription And Translation” [B.D.Hames & S.J.Higgins,eds.(1984)];“Animal Cell Culture” [R.I.Freshney,ed.(1986)];“Immobilized Cells And Enzymes” [IRL Press,(1986)];B.Perbal,“A Practical Guide To Molecular Cloning”(1984)を参照のこと。
非極性R基を有するアミノ酸:アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
非荷電極性R基を有するアミノ酸:グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
荷電極性R基を有するアミノ酸(Ph6.0で負に荷電):アスパラギン酸、グルタミン酸
塩基性アミノ酸(pH6.0で正に荷電):リジン、アルギニン、ヒスチジン(pH6.0で)。別の群は、フェニル基を有するアミノ酸であり得る:フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
別の群は、分子量(すなわち、R基のサイズ)に従い得る:
グリシン(75)、アラニン(89)、セリン(105)、プロリン(115)、バリン(117)、トレオニン(119)、システイン(121)、ロイシン(131)、イソロイシン(131)、アスパラギン(132)、アスパラギン酸(133)、グルタミン(146)、リジン(146)、グルタミン酸(147)、メチオニン(149)、ヒスチジン(pH6.0で)(155)、フェニルアラニン(165)、アルギニン(174)、チロシン(181)、トリプトファン(204)。特に好ましい置換は以下である:正電荷を保持することができるようなLysへのArgの置換またはその逆;負電荷を保持することができるようなGluへのAspの置換またはその逆;遊離−OHを保持することができるようなSerへのThrの置換;遊離NH2を保持することができるようなGinへのAsnの置換。
本発明は、1つ以上のmiRNA標的(特に、miR19b、miR26a、miR26、miR92、miR148、およびmiR223から選択されるmiRNA)に実質的に相補的なアンタゴミア、オリゴヌクレオチド、核酸を提供する。前述のオリゴヌクレオチドは1つ以上のmiRNA標的の発現または活性を阻害する。例示的なアンタゴミアを以下の表2に提供する。以下の例示的な配列を使用し、本明細書中に提供した実施例中でその活性を証明した。
本発明の診断的および医学的な有用性は、哺乳動物(特に、ヒト患者)における癌、悪性疾患、リンパ腫、および/または白血病をスクリーニングするか評価するためのアッセイにおける本発明のmiRNA標的の使用にまで及ぶ。したがって、本発明は、そのmiRNAの存在範囲の定量的分析またはその活性を模倣または遮断することができる薬物または他の薬剤の同定のための試験キットの形態で調製することができるアッセイ系を含む。
(a)候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択されるmiRNAを発現する細胞をインキュベートする工程、および
(b)候補化合物または薬剤の存在下および非存在下でmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択されるmiRNAの発現または活性を検出または測定する工程
を含み、それにより、
候補化合物または薬剤の存在下対候補化合物または薬剤の非存在下でのmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択されるmiRNAの発現の減少が、化合物または薬剤がmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択されるmiRNAの発現を阻害することを示す、癌に関連する1つ以上のmiRNAの発現を阻害する化合物または薬剤の同定方法を提供する。
(a)哺乳動物から血液または血球のサンプルを得る工程、
(b)miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(c)1つ以上のmiRNAの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
1つ以上のmiRNAのうちの少なくとも1つの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する、哺乳動物における悪性疾患(血液学的悪性疾患が含まれる)の検出または評価方法を含む。
(a)哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
(b)サンプル中のmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(c)少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
少なくとも2つのmiRNAの発現または活性が参照サンプルと比較して増加する、哺乳動物における癌を検出または評価する方法を意図し、提供する。
本発明は、さらに、本発明の治療方法の実施で有用な治療組成物を意図する。本治療組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤(キャリア)および有効成分としての本明細書中に記載のアンタゴミア、オリゴヌクレオチド、miRNA標的アンタゴニストのうちの1つ以上を混合物で含む。好ましい実施形態では、組成物は、本発明のmiRNAの標的細胞(特に、癌細胞または前癌細胞)内のその標的への特異的結合を調整することができる薬剤を含む。
マイクロRNA(miRNA)は、正常な発生、分化、および疾患(癌が含まれる)に関与する生物学的過程の遍在性制御因子である。これらは、転写レベルおよび翻訳レベルでの遺伝子発現の制御によって作用する(Bartel,2004)。miRNAの17〜92クラスターは造血系癌で高発現し、in vivoでのリンパ球増殖およびc−Myc誘導性白血病誘発/リンパ腫誘発を増強する(Heら、2005)(Xiaoら、2008)。17〜92クラスターおよびそのパラログはまた、多様な固形腫瘍(乳房、結腸、肺、膵臓、前立腺、および胃由来の固形腫瘍が含まれる)で発現される(Voliniaら、2006)(Petroccaら、2008)。
確立された造血形質転換のin vitroアッセイ(Plas,Talapatra,Edinger,Rathmell,& Thompson,2001)を使用して、17〜92クラスターおよびそのパラログ内の重要な発癌活性を同定した。固有のシード配列ファミリーを示す全てのmiRNA(具体的には、miR−17、miR−18a、miR−19b−1(miR−19)、miR−20a、miR−106a、miR−106b、およびmiR−25)を試験した(図1a)。アッセイは、IL3から除去した場合にアポトーシスを受けるFL5−12リンパ球のIL3依存性に基く。競合実験では、FL5−12細胞を、GFP+個別のmiRNAまたは空のベクターで部分的に形質導入し、これらの混合した集団を、その相対的比率の変化について蛍光標示式細胞分取(FACS)によってモニタリングした(図1b)。miR−19を発現するFL5−12細胞はIL3枯渇の際に親細胞を超えて迅速に富化され、他のmiRNAはこの防御効果に関連しなかった(t検定によってmiR−19:p<0.002、全ての他のmiRNAおよびベクターp>0.05)(図1c)。この効果は、主に、アポトーシスからの防御に起因し、細胞周期動態を有意に変化させなかった(図2)。それ故、17〜92クラスターおよびそのパラログ内で、miR−19は、in vitroでのリンパ球生存を増強する異なる能力を有する。
ヒトリンパ悪性疾患におけるmiR−19の発現を評価した。扁桃腺由来の非悪性リンパ球と比較して、T−ALLにおいてmiR−19発現が5〜17倍増加し、B−ALLではいくらかより少なく増加した(図3a)。さらに、新規の再配列がT−ALLにおいて認められた−miR−17〜92クラスターがT細胞受容体遺伝子座(TCRA/D)と並列する転座(t(13;14)(q32;q11))(図3bおよびcならびに図4)。この変化は、第2の転座t(9;14)(q34;q11)(他のTCRA/D対立遺伝子に影響を及ぼし、構成的に活性な短縮形態のノッチ1(エクソン29〜34)を発現させる)と共に起こる(図5)(Palermo、ら、.,2006),(Ellisenら、1991)。miR−19はまた浸潤性B細胞リンパ腫(DLBCLおよびバーキットリンパ腫など)で高発現されたが、無痛性濾胞性リンパ腫ではあまり豊富でなかった。特に、FL5−12細胞中のmiR−19のレトロウイルス発現は、いくつかの腫瘍標本における発現に匹敵するレベルであった(図3a)。したがって、miR−19は浸潤性のリンパ性癌で高発現し、T細胞白血病における新規の染色体再配列の標的である。
miRNAはin vivoでリンパ悪性疾患の発症を駆動することができるだろうか?miR−19発現および転座データに基づいて、miR−19をT−ALLマウスモデルにおいて評価した(Pearら、1996)。簡潔に述べれば、ほとんどのT−ALL症例はノッチ1遺伝子中に変異を有し、t(9;14)(q34;q11)転座のように、これらはノッチ1の構成的に活性な細胞内ドメイン(ノッチ−ICN)を生成する(Wengら、2004)。miR−19のin vivoでノッチ−ICN誘導性T−ALLを促進する能力を試験するために、HPCを照射レシピエントに養子導入した(図3d)。ノッチ−ICNおよびmiR−19を発現するHPCを投与したマウスはT−ALLをすぐに発症し、これらの全動物は2ヵ月以内に瀕死の状態であった。同時に、ノッチ−ICNのみを発現するHPCを投与した80%のマウスは無疾患のままであった(p=0.0003)(図3e)。病理学により、血液塗抹標本上の豊富な芽球、骨髄、脾臓、およびリンパ節の浸潤、ならびにT細胞マーカーの排他的発現を用いてT−ALLの診断を確認した(図3f〜hおよび図6)。miR−19は、バーキットリンパ腫のΕμΜycモデルで類似の効果を示した。これは、全クラスターについて報告されるように(Heら、2005)、p53依存性アポトーシスの遮断によってc−Mycと協力する能力を示した(図7)。それ故、miR−19は、in vivoでB細胞系統およびT細胞系統から生じる浸潤性悪性疾患における癌遺伝子として作用する。
標的予想および遺伝子発現分析。miR−19の発癌活性を担う分子標的を決定した。最初に、コンピュータ標的同定および遺伝子発現分析を組み合わせた。Targetscanにより、938種のヒトおよび744種のマウスの潜在的miR−19標的を検索した。miR−19またはベクターで形質導入したFL5−12細胞における遺伝子発現プロフィールは、中程度の発現の変化しか示さなかった(平均倍率変化0.2±標準偏差(SD)0.39](図8)。全体的にみて、予想される全miR−19標的(Pten腫瘍抑制遺伝子が含まれる)の発現レベルは、他の遺伝子よりも減少した(p<2e−04、コルモゴロフ・スミルノフ検定による)。しかし、より明白な(1.5または2SD)発現の減少を示す遺伝子のうちでmiR−19標的の有意な富化は認められなかった(2SDでp>0.46;1.5SDでp>0.077、フィッシャーの正確検定)(図8)。
細胞培養、生存度、増殖アッセイ、およびベクター構築物。FL5−12マウスリンパ球、IL3枯渇研究、およびウイルス形質導入は記載の通りであった(Mavrakisら、2008)(Plas,Talapatra,Edinger,Rathmell,& Thompson,2001)。細胞周期およびGuava TechnologiesのViacountアッセイを使用したDNA染色色素(LDS751)の取り込みに基づいた細胞周期および細胞死アッセイを、報告されているように行った(Mavrakisら、2008)。レトロウイルスベクターは、マウス幹細胞ウイルス(MSCV)に基づき、miR 17、miR 18a、miR 19b−1(miR−19)、miR 106a、miR 106b、miR 25をコードするmiRNA発現ベクター(Heら、2005)、ノッチ−ICN(W.Pearからの提供)(Pearら、1996)およびBcl2(Wendelら、2004)をコードするベクター、各shRNAベクター(図17)、およびライブラリーベクター(MRP)(図18aおよびb)が含まれる。miRNAインヒビターオリゴヌクレオチド(アンタゴミア)MZIP 19a−PA−1、MZIP 19b−PA−1、およびスクランブルドコントロール(MZIP000−PA−1)はSystem Biosciencesから入手した。
レトロウイルスで形質導入したHPCの養子移入に基づいたノッチ1誘導性T−ALLおよびEμMycリンパ種のマウスモデルが報告されている(Pearら、1996)、(Wendelら、2004)。データを、統計的有意性についてのログランク(Mantel−Cox)検定を使用してカプラン・マイヤー形式で分析した。ヘテロ接合性ポリメラーゼ連鎖反応(LOH PCR)のp53喪失および表面マーカー分析による免疫表現型検査は記載の通りであった(Wendelら、2004)。
全細胞溶解物由来の免疫ブロットを記載のように行った(Wendelら、2004)。簡潔に述べれば、50μgのタンパク質/サンプルをSDS−PAGEゲルで分離し、Immobilon−P膜(Millipore)に移した。抗体は以下に対する抗体であった:Prkaa1(2532、1:1000、Cell Signaling)、Bim/Bcl2L11(AAP−330、1:1000,Assay Designs)、FoxO1(94545、1:1000、Cell Signaling)、FoxO3a(9467、1:1000、Cell Signaling)、Phospho−FoxO3a(94665、1:1000、Cell Signaling)、Ppp2r5e(NB 100−845、NOVUS)、Pten(9559、1:1000、Cell Signaling)、チューブリン(1:5000;Sigma、B−5−1−2)、アクチン(1:5000;Sigma、AC−15)、Bnip3(3769、1:1000、Cell Signaling)、リン酸化S6(2215、1:1000、Cell Signaling)、リン酸化Akt(4058、1:1000、Cell Signaling)、およびDock5(Alan Hall(MSKCC)からの提供)。増強型化学発光を検出のために使用した(ECL,Amersham)。
総RNAおよびmiRNA富化RNAを、Allprep DNA/RNA/Proteinキット(Qiagen)およびmiRNeasyミニキット(Qiagen)をそれぞれ使用して細胞および腫瘍サンプルから抽出した。病理学的診断を、Weill Cornell Medical Collegeの熟達した血液病理学者が行った。cDNA合成およびqRT−PCRおよびΔΔCt法による分析は記載の通りであった(Mavrakisら、2008)。TaqMan遺伝子発現アッセイを、以下のために使用した:Bcl2L11(Mm00437796_m1)、Dock5(Mm00555757_m1)、FoxO1(Mm00490672_m1)、FoxO3(Mm01185722_m1)、Ppp2r5e(Mm00803759_m1)、Prkaa1(Mm01296695_m1)、およびPten(Mm01212532_m1)。マウスGAPD(GAPDH)(4352932)およびmiR−19b(000396)は、Applied Biosystemsから入手した。発現を、RNU6B(001093,Applied Biosystems)に対して正規化した。
Dock5、Ppp2r5e、Prkaa1、およびBimの3’−UTRフラグメントをPCRによって生成し、psi−CHECK−2ベクター(Promega)にクローニングした。記載のようにアッセイを行った(Xiaoら、2008)。部位特異的変異誘発によって結合部位変異体を生成した。
患者の初代リンパ芽球から作製した中期染色体調製物を、標準的手順にしたがって核型分析に供した。13q32に存在するゲノムクローンRP11−97P7およびRP11−980D6をInvitrogenから入手した。DNAを、ニック翻訳によってスペクトラムオレンジdUTP蛍光色素(Vysis,Downers Grove,IL)を使用して標識した。スペクトラムグリーン標識したRB1プローブを、染色体13qハイブリッド形成のコントロールとして使用した。細胞遺伝学的分析のために使用される細胞に対して標準的な方法によってFISHを行った。Nikon Eclipse 600顕微鏡に取りつけられたCytovisionイメージングシステム(Applied Imaging,Santa Clara,CA)を使用して、ハイブリッド形成シグナルを、DAPI染色スライド上の少なくとも20の中期スプレッドに関してスコアリングした。
ClontechのNucleotrap mRNA抽出キットを用いて患者の初代リンパ芽球からmRNAを抽出し、ノッチ1遺伝子のエクソン29配列に相補的なオリゴヌクレオチドプライマー(5’−TCGTCCATGAGGGCACCGTCTGAAG−3’)を使用してSMART RACEキット(Clontech)にて5’RACEを行った。
このプールshRNAスクリーニングの根底にあるテクノロジーが記載されており、ハーフヘアピンアレイ検出の使用も記載されている(Mavrakisら、2008)、(Silvaら、2008)、(Chang,Elledge,& Harmon,2006)。簡潔に述べれば、shRNAライブラリーをMRPベクターにクローニングし、p53 shRNAについてタンパク質ノックダウンを確認した。FL5−12細胞を、低感染多重度にて1,000個のshRNAを含むライブラリープールで形質導入し、3つに分割し、それぞれを2サイクルのIL3枯渇およびレスキューに供した。DNA単離、組み込まれたshRNAまたは基準としてのライブラリーのPCR増幅のために生存度が回復した後にサンプルを回収し、標識し、ハイブリッド形成した。画像スキャン(Axon 4000Bスキャナ)から作成したデータ(Nimblescanソフトウェア)を、処理および分析のためにRバージョン2.4にインポートした。各Nimblegen 12−plexカスタムアレイは、12,033個のハーフヘアピンプローブからなる。ほとんどがライブラリー中でshRNAによって示され、残りをバックグラウンドの見積もりのために使用した。予想通り、これらのネガティブコントロールスポットは、各アレイ上の実験プローブよりも低い強度を示した。バックグラウンドより低いシグナル値をバックグラウンド概算値と置換して、低シグナルに起因する比率の高さを小さくした。次いで、各アレイについての2つのチャネルを、LOESS正規化を使用して正規化した。正規化された強度のlog比を、さらなる分析で使用した。
分析を、R中、マイクロアレイ用Bioconductor線形モデル(LIMMA)(Yang,Paquet,& Dudoit,2006)、マイクロアレイの有意性分析(SAM)(Tusher,Tibshirani,& Chu,2001)、および遺伝子組分析(GSA)(Efron & Tibshirani,2007)ライブラリーを使用して行った。生物学的レプリケート間の相関を、各時点について主成分分析(principal component analysis)(PCA)によって計算して実験効果および生物学的レプリケートの大きさを決定した。生物学的レプリケートは、実験におけるばらつきの主な原因を構成していなかった。生物学的レプリケートの平均相関は0.60(±0.17)であり、おそらく、集団が培養中に変動した確率変動を反映していた。生物学的に有意なシグナルをSAMソフトウェアを使用して同定して、shRNAの相対存在量の相違を反映するプローブを選択した。条件にわたる各特徴の独立したサンプルを想定する対応のない2クラスのアルゴリズムを使用した。Q値を経験的に計算し、有意な特徴の同定のために使用した。全体的にみて、そのshRNAプローブが以下のこれらの基準を満たすことが見出された場合、遺伝子を潜在的候補とスコアリングした:倍率変化(FC)1.65超、p<0.05、および対応するタンパク質を伴う現在の遺伝子バンク注釈づけ。GSAを使用してさらなる試験を行って、同一遺伝子をターゲティングする複数のヘアピン由来のデータに基づいて候補を同定し(各遺伝子が2〜4つのヘアピンによってターゲティングされる場合)、その倍率変化をまとめている。この統計値を包括的順列由来の同一の統計値と比較して、各遺伝子の経験的p値に到達させた。GSA分析において正の倍率変化を示す全ての遺伝子組を検証に含めた(嗅覚受容体481を除く)。これらのカットオフは比較的任意であり、偽陽性を最小にするための控えめな基準として選択した。
いくつかのコンピュータ分析を行って、スクリーニングの結果がオフターゲット効果に寄与し得るかどうかを調査した。以下の2つの仮説を考慮した:(1)スクリーニングで過剰に出現したshRNAがmiR−19自体と配列が類似し、したがって、3’UTR中の部位を介してmiR−19活性を模倣すること;(2)スクリーニングの結果が、少数の重要な遺伝子に及ぼすマイクロRNA様オフターゲット効果によって説明可能であること。
総RNAを上記のように単離し、RNA 6000 NanoAssayおよびBioanalyzer2100(Agilent)を使用して品質について分析した。2mgの総RNAをcDNA合成のために使用した。cRNAの合成、線形増幅、および標識を、MessageAmp aRNAキット(Ambion)およびビオチン化ヌクレオチド(Enzo Diagnostics)を使用したin vitro転写によって行った。次いで、10マイクログラムの標識し、断片化したcRNAを、製造者(Affymetrix)の説明書にしたがってGeneChipとハイブリッド形成させた。チップを、GS3000スキャナ(Affymetrix)内でスキャニングし、GCOS1.4(GeneChip Operating Software,Affymetrix)を使用して定量し、Partekソフトウェア(Partek(登録商標)Genomic Suite(商標)6.4)を使用して分析した。「R」ソフトウェアパッケージ中の「affy」および「gcrma」ライブラリーを使用して、マイクロアレイプローブレベルデータのロバストマルチアレイ分析(robust multi−array analysis)(RMA)正規化を行った。さらに、「mas5」関数を使用して、プローブのpresent/absentコールを同定した。1つを超えるプローブが技術的レプリケート中に存在しない場合、プローブをさらなる分析から除外した。プローブの正確な標的遺伝子を同定するために、RefSeqリリース35由来のマウス転写物に対する「Affymetrix Mouse430A_2 Target Sequences」について「blastn」プログラムを使用してBLAST検索を行った。パラメーター−v1−bl−e.05−S1をBLAST検索で使用した。遺伝子発現のlog比を計算するために、プローブレベルデータにわたるメジアン分散分析(median polish)を行って遺伝子発現値(すなわち、レプリケートにわたるプローブ強度のメジアンを算出し、同一遺伝子をターゲティングするプローブにわたるこれらのプローブ値のメジアンを使用した)を得、実験対コントロールのlogの相違を計算した。統計分析のために、遺伝子の平均log2(発現の変化)を使用してデータを中心におき、全遺伝子にわたってlog2の単位分散(発現変化)を有するように正規化した。この正規化により、データの拡張Z変換(modifid Z transformation)(Zスコア)が得られる。
miR−19標的対全遺伝子の発現の変化を比較するために、そのlog(発現変化)値の分布を、片側KS統計を使用して比較した。片側KS統計は、一方の組についての発現変化の分布が他の組の分布と比較して有意に下向きにシフトする(下方制御される)かどうかを評価する。KS統計は、経験的累積分布関数(cdf):
マイクロRNA(miRNA)は、正常な発生、分化、および疾患(癌が含まれる)に関与する生物学的過程の遍在性制御因子である。これらは、転写レベルおよび翻訳レベルでの遺伝子発現の調節によって作用する(Bartel,2004)。miRNAによる遺伝子発現の制御は複雑である。多数のmRNAはその3’UTR内に複数のmiRNAのための結合部位を含み、ほとんどのmiRNAは多数の遺伝子を潜在的にターゲティングすることができる(Bartel,2004)。配列分析によって予想されるあらゆるmiRNA結合部位が表現型に寄与するわけではないことが明らかである。逆に、複数のmiRNAが単一の細胞経路に影響を及ぼし得る(Mavrakisら、2010)、(Liら、2007)。
T−ALL細胞および細胞株で高発現したmiRNAの同定
不偏miRNAライブラリースクリーニングを使用して、ヒトT−ALL中のmiRNA発現パターンを決定した(図19a)。定量的PCR(Mestdaghら、2009)を使用して、異なる細胞遺伝学的群を代表する50種の臨床T−ALL標本(Aifantis,Raetz,& Bu,2008)(TLX1、TLX3、HOXA、およびTAL1/LMO2が含まれる)および一連の18種のヒトT−ALL細胞株中の430種のmiRNAの発現を測定した。10種のmiRNAが高発現されたのに対して、ほとんどの他のmiRNAは辛うじて検出可能であった。これらの「上位10」miRNAは以下であった(発現レベルに関して降順):miR−223、miR−19b、miR−20a、miR−92、miR−142−3p、miR−150、miR−93、miR−26a、miR−16、およびmiR−342(図1b)。全体的なmiRNA発現パターンは細胞遺伝学的群の間で酷似しており、ヒトT−ALL細胞株においても保存されていた(図19c、図20a)。精製前駆体(CD34+およびCD4+CD8+CD3−)細胞集団および正常な(CD4+CD8+CD3+ダブルポジティブ、CD4+シングルポジティブ、またはCD8+シングルポジティブ)T細胞集団との比較により、miR−223発現は白血病特異的に増加し、miR−376およびmiR−662の発現の白血病特異的増加は遥かに小さかったことが明らかとなった(図20bおよびc)。それ故、少数のmiRNAがヒトT−ALLで高発現する。
b分析に含まれる12の全遺伝子の和を計算する。
c同一のシード配列を有する相同miRNAを示す。
T−ALL患者サンプル。50人のT−ALL患者の診断用骨髄サンプルを、異なる欧州の施設から得た(UZ Ghent,Ghent;UZ Leuven,Leuven;Hopital Purpan,Toulouse;CHU de Nancy−Brabois,Vandoeuvre−Les−Nancy)。得られたT−ALL患者のコホートは、15人のTAL/LMO(7人のLMO2再配列および8人のSIL−TAL)、12人のHOXA(4人のMLL再配列、6人のinv(7)(p15q35)、および2人のCALM−AF10)、10人のTLX3および5人のTLX1再配列患者のサンプルからなる。残りの8人のT−ALL患者を、既知のT−ALL亜群に分類することができない。白血病サンプル由来の総RNAを、以前に記載のように(Van Vlierbergheら、2006)TRIzol試薬(Invitrogen,Belgium)を使用して単離した。本研究(2008/531)は、Medical Ethical Commission of Ghent University Hospital(Belgium)によって承認された。
Claims (25)
- 血液学的悪性疾患の処置または予防のための化合物の同定するための方法であって、該化合物は、該悪性疾患に関連するmiRNAの発現または活性をアンタゴナイズするかまたは阻害し、該方法は:
(a)化合物と、miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAを発現する細胞とを接触させる工程、および
(b)1つ以上の該miRNAの発現または活性を決定する工程
を包含し、
ここで、該miRNAの発現または活性が阻害または軽減される、方法。 - 前記1つ以上のmiRNAの発現または活性を、該miRNAの量、1つ以上のmiRNA標的である腫瘍抑制遺伝子の活性もしくは発現、または該miRNAを発現する白血病細胞もしくはリンパ腫細胞の成長もしくは生存度を決定することによって評価する、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上のmiRNA標的である腫瘍抑制遺伝子が、Pten、Bim/Bcl2111、Phf6、Ikzf1、Nf1、およびFbxw7から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記白血病細胞または前記リンパ腫細胞がT−ALL患者の細胞サンプルまたはT−ALL細胞株である、請求項2に記載の方法。
- 哺乳動物における血液学的悪性疾患を検出または評価するための方法であって、該方法は:
(a)該哺乳動物由来の血液または血球のサンプルを得る工程、
(b)miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(c)該1つ以上のmiRNAの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、該1つ以上のmiRNAのうちの少なくとも1つの発現または活性が該参照サンプルと比較して増加する、方法。 - 2つ以上のmiRNAの発現または活性を測定し、比較し、該発現または活性が増加する、請求項5に記載の方法。
- 前記血液学的悪性疾患が、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B−ALL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、およびバーキットリンパ腫から選択される、請求項5に記載の方法。
- 哺乳動物における癌を検出または評価するための方法であって、該方法は:
(d)該哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
(e)該サンプル中のmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(f)該少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、該miRNAのうちの少なくとも2つの発現または活性が、該参照サンプルと比較して増加する、方法。 - 3つ以上のmiRNAの発現または活性を測定し、比較し、該発現または活性が増加する、請求項8に記載の方法。
- 前記癌が、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、胃癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 哺乳動物における癌をモニタリングするか癌治療に対する応答を評価するための方法であって、該方法は:
(g)該哺乳動物から細胞サンプルを得る工程、
(h)該サンプル中のmiR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を測定する工程、および
(i)該少なくとも2つのmiRNAの発現または活性を参照サンプル中のまたはそれに由来する発現または活性と比較する工程
を含み、
ここで、該miRNAのうちの少なくとも2つの発現または活性が、該参照サンプルと比較して変化する、方法。 - 3つ以上のmiRNAの発現または活性を測定し、比較し、該発現または活性が変化する、請求項11に記載の方法。
- 前記癌が、膵臓癌、肺癌、皮膚癌、尿路癌、膀胱癌、肝臓癌、甲状腺癌、結腸癌、腸癌、胃癌、白血病、リンパ腫、神経芽細胞腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、消化管癌、食道癌、および前立腺癌の群から選択される、請求項11に記載の方法。
- 血液学的悪性疾患の処置に使用するための組成物であって、miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAに相補的な1つ以上のアンタゴミアを含む、組成物。
- 血液学的悪性疾患の処置に使用するための、miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAに実質的に相補的な1つ以上のオリゴヌクレオチドを含む組成物。
- 前記血液学的悪性疾患が、T細胞急性リンパ芽球性白血病(T−ALL)、B細胞急性リンパ芽球性白血病(B−ALL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、およびバーキットリンパ腫から選択される、請求項14または15に記載の組成物。
- 癌の処置に使用するための組成物であって、miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される少なくとも2つのmiRNAに相補的な少なくとも2つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
- 前記アンタゴミアまたは前記オリゴヌクレオチドが少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項14、15、または17に記載の組成物。
- miR−19、miR26、およびmiR−92から選択される少なくとも2つのmiRNAに相補的な少なくとも2つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドを含む、請求項14、15、または17に記載の組成物。
- 抗癌剤または治療薬、有糸分裂阻害剤、アポトーシス剤もしくは抗体、または免疫調節剤から選択される1つ以上のさらなる化合物をさらに含む、請求項14、15、または17に記載の組成物。
- 治療有効量の、miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAに実質的に相補的なアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチド、ならびに薬学的に許容され得るキャリアまたは希釈剤を含む、薬学的組成物。
- Pten、Bim/Bcl2111、Phf6、Ikzf1、Nf1、およびFbxw7から選択される腫瘍抑制遺伝子の発現を増強または増加させる方法であって、該腫瘍抑制遺伝子のうちの1つ以上を発現することができる細胞と、miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAに実質的に相補的な1つ以上のアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、方法。
- 細胞と、miR−19、miR26、およびmiR−92から選択される少なくとも2つのmiRNAに実質的に相補的な少なくとも2つのアンタゴミアまたはオリゴヌクレオチドとを接触させる工程を含む、請求項22に記載の方法。
- miR17〜92クラスターが増幅または過剰発現される癌を処置または緩和する方法であって、miR−19、miR−20、miR−26、miR−92、miR−148、およびmiR−223から選択される1つ以上のmiRNAの発現または活性を阻害する1つ以上の化合物を投与する工程を含む、方法。
- miR−19、miR−26、およびmiR−92を阻害する1つ以上の化合物を投与する、請求項24に記載の方法。
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