JPWO2015133637A1 - マイクロｒｎａ封入ナノ粒子及びその医薬用途 - Google Patents

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Abstract

本発明は、末端にコレステロールが付加された27merの二本鎖RNAであって、dicerにより成熟miR-126を生じる二本鎖RNAが封入された、乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）などの生体適合性ポリマーナノ粒子；該ナノ粒子をステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント；該薬剤溶出型ステントを含有してなる、ステント留置後の合併症リスクが低減された、管、特に血管の狭窄もしくは閉塞の治療剤を提供する。本発明はまた、前記ナノ粒子をが有してなる外傷治療剤を提供する。

Description

本発明は、マイクロＲＮＡ溶出型ステント及びそれを用いた管腔治療に関する。より詳細には、本発明は、miR-126を封入したナノ粒子を積層してなるステント、並びに該ステントを狭窄部位に留置し、miR-126を徐放させることによる、従来の薬剤溶出型ステント（DES）における重篤な副作用のリスクが低減された血管治療に関する。
本発明はまた、前記miR-126を封入したナノ粒子を用いた外傷の治療に関する。
冠動脈インターベンション（PCI）は虚血性心疾患の治療として広く実施されている。当初のバルーン形成術に比べて心事故が減少することから、ステント留置術が広く行われるようになったが、再狭窄やステント血栓症等の合併症が臨床上問題視されている。
薬剤溶出型ステント（DES）は、平滑筋細胞増殖抑制剤等をステント表面にコーティングして徐放させることで再狭窄を抑制するものであり、DESの出現によって再狭窄の頻度は減少した。再狭窄の原因は、ステント留置後初期の炎症反応と、1-2か月の間に起こる平滑筋細胞増殖による内膜肥厚と考えられており、それらを抑制する目的で、さまざまな薬物放出制御性を付与したDESが提案されている。特に、ステントへの薬剤キャリアとして、表面が正電荷修飾された生体適合性ナノ粒子を用いることにより、負荷電の管壁との親和性を向上させるとともに、親水性の核酸分子をも効率よく封入可能なDESが報告されている（特許文献１、２）。
しかし、再狭窄のリスクが低減される一方で、ステント血栓症については、従来の金属ステント（BMS）ではあまり見られなかった遅発性又は超遅発性血栓症による急性冠症候群（急性心筋梗塞、不安定狭心症）を発症する症例がDESで認められたことから、新たな懸念材料となっている。その原因としては、DESに用いられる薬剤が、ステント留置後の過剰な平滑筋増殖を抑制する反面、内皮細胞の再生遅延、骨髄由来の内皮前駆細胞の分化抑制、炎症反応の惹起といった副作用を示すことが示唆されている。
また、ステント血栓症の予防には、抗血小板療法が大きな役割を果たしているが、抗血小板剤の長期内服により高齢者の手術の際に出血の危険性が増えるため、複数の診療科にまたがる問題となっている。第二世代のDESにおいても、従来と同様のLimus系薬剤が用いられているため、内皮細胞の再生遅延と遅発性血栓症は継続する問題となる可能性がある。
そのため、再狭窄のみならず、遅発性又は超遅発性血栓症の発症リスクが低減された新規なDESの開発が切望されている。
ところで、ゲノム上にコードされた内在性の20〜25塩基程度の非コード（non-coding）RNAとして、マイクロRNA（miRNA, miR）が知られている。マイクロRNAは、ゲノムDNA上のmiRNA遺伝子から、まず数百〜数千塩基程度の長さの一次転写物（Primary miRNA, Pri-miRNA）として転写され、次にプロセッシングを受けて約60〜70塩基程度のヘアピン構造を有するpre-miRNA（precusor miRNA）となる。その後、核から細胞質へ移動し、さらにプロセッシングを受けて20〜25塩基程度の二本鎖成熟miRNAとなる。二本鎖成熟miRNAは、そのうちの一本鎖がRISCと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のmRNAに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。マイクロRNAは複数の標的遺伝子を有することから、複数の有用な作用を同時に発揮させることが可能である。従って、マイクロRNAを生体内の局所で安全かつ持続的に発現させることができれば、新規の血管治療法を開発することが可能であると考えられるが、これまでにステント局所からマイクロRNAを徐放化して治療した例はない。
特許第4297221号公報 特許第4340744号公報
本発明の目的は、再狭窄や遅発性又は超遅発性血栓症等の合併症リスクが低減された新規なDESを提供し、以ってより安全な血管治療手段を提供することにある。
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、マイクロRNAを用いて、遅発性血栓症の原因である内皮細胞の再生遅延と炎症反応を同時に改善することを着想し、マイクロRNAとしてmiR-126に着目した。
miR-126は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）のシグナル伝達経路の負の調節因子であるSPRED1やPIK3R2の発現を抑制することにより、血管新生作用を示すことが知られている（Dev Cell 15: 272-284 (2008)）。また、miR-126は、内皮細胞への白血球の接着を媒介する血管細胞接着因子1（VCAM1）の発現を抑制することにより、白血球の血管壁への浸潤を抑制し、抗炎症作用を示すことも知られている（Cardiovasc Res 79: 581-588 (2008)）。このように、血管内皮細胞の再生促進作用と抗炎症作用とを併せ持つmiR-126をステントから徐放させることができれば、従来のDESに用いられる薬剤の副作用を回避することができ、重篤な合併症である遅発性血栓症の発症リスクを低減できるものと期待される。しかし、miR-126の当該生理作用を十分に発揮させるためには、ステント留置局所での長期持続的な薬物放出に加え、細胞膜透過性、インターフェロン応答の回避、ヌクレアーゼ抵抗性といった様々な問題をクリアする必要がある。
そこで、本発明者らは、以下の工夫：
(1) 細胞膜透過性を上昇させるために、miR-126の末端にコレステロールを結合させる。
(2) 内因性のヌクレアーゼ抵抗性にするために、2本鎖合成RNAを用いる。
(3) Dicerの基質となるが、インターフェロン応答やプロテインキナーゼRの活性化を引き起こさないように、miR-126の両端に塩基を付加し、27塩基の2本鎖合成RNAとする。
(4) miR-126のアンチセンス鎖が分解を受けにくいように、ホスホロチオエート化する。
(5) 2本鎖合成RNAが持続的に局所で発現できるように、乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）ナノ粒子に封入させる。
を行った。上記のようにして作製したmiR-126封入PLGAナノ粒子をステントにコーティングして、高脂肪食負荷したウサギの腸骨動脈に留置した。その結果、4週間後、miR-126搭載ステントにおいて、コントロールRNAと比較して有意に新生内膜（平滑筋細胞の増殖）の抑制効果を認めた。
以上の知見より、本発明者らは、dicer切断により成熟miR-126を生じる27塩基の2本鎖RNAにコレステロールを付加したmiR-126前駆体を生体適合性ポリマーのナノ粒子に封入させた「miRNA-126封入ナノ粒子」をステントにコーティングしてDESとして用いることで、miR-126を血管壁の細胞内で十分に発現させ、所望の内皮細胞再生効果及び抗炎症効果を発揮させて、再狭窄や遅発性又は超遅発性血栓症等の術後合併症のリスクを大いに低減することに成功した。
さらに、本発明者らは、miR-126は血管内皮細胞再生を介して血管新生を促進することで、皮膚損傷などの外傷の治癒効果を有するのではないかとの発想の下、miRNA-126封入ナノ粒子をマウスの皮膚損傷部位に局所投与した。その結果、miRNA-126封入ナノ粒子は皮膚損傷の治癒を促進することが明らかとなった。
このように、本発明者らは、miRNA-126封入ナノ粒子がDESにおける副作用低減のみならず、外傷治癒にも有用であることを見出して、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］末端にコレステロールが付加された27merの二本鎖RNAであって、dicerにより成熟miR-126を生じる二本鎖RNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子。
［２］生体適合性ポリマーが乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）である、［１］記載のナノ粒子。
［３］成熟miR-126のアンチセンス鎖がホスホロチオエート化されている、［１］又は［２］記載のナノ粒子。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載のナノ粒子を有効成分とする、血管内皮細胞再生促進剤。
［５］ステント留置後の合併症予防用である、［４］記載の剤。
［６］［１］〜［３］のいずれかに記載のナノ粒子をステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント。
［７］［６］記載の薬剤溶出型ステントを含有してなる、ステント留置後の合併症リスクが低減された、管の狭窄もしくは閉塞の治療剤。
［８］管が血管である、［７］記載の治療剤。
［９］外傷の治療用である、［４］記載の剤。
本発明によれば、ステント留置局所から溶出したナノ粒子に封入されたmiR-126前駆体が管壁の細胞に効率よく取り込まれ、インターフェロン応答を回避しつつ細胞内で成熟miR-126を発現するので、miR-126の内皮細胞再生作用と抗炎症作用により、平滑筋細胞の増殖や炎症反応が抑制され、再狭窄や遅発性血栓症等の合併症のリスクが顕著に低減される。
また、外傷部位に局所投与されたmiR-126封入ナノ粒子は、外傷の治癒を促進するので、該miR-126封入ナノ粒子を有効成分とする貼付剤は、ナノ粒子の徐放効果と核酸修飾による安定化効果により、外傷治癒効果が長期間持続するので、頻繁に貼り替える必要がなく、患者の負担を軽減できる。
PLGAナノ粒子による薬剤の導入効果を示す図である。冠動脈バルーン形成術（POBA）による内膜と中膜の解離及び内弾性板の断裂に対し、蛍光マーカーFITCを封入したPLGAナノ粒子を投与した後、蛍光像を観察し薬剤（FITC）の導入効率を確認した。 miR-126封入PLGAナノ粒子でコーティングしたステントの治療効果を示す図である。高脂肪食負荷したウサギの右腸骨動脈にmiR-126搭載ステントを、左腸骨動脈にコントロールRNA搭載ステントをそれぞれ留置し、留置直後（左パネル）と4週間後（右パネル）に血管造影を行った。 PLGAナノ粒子によるヒト臍帯静脈内皮細胞へのFITCの導入を示す図である。 皮膚損傷マウスモデルにおけるmiR-126封入PLGAナノ粒子（miR-126 NP）の皮下注射の効果を示す図である。Ａは、miR-126 NP及びコントロールナノ粒子を皮下注射した直後（Day0）と5日後（Day5）における創傷部位の写真である。Ｂは、創傷部位の面積の経時変化を示す。 皮膚損傷マウスモデルにおけるmiR-126封入PLGAナノ粒子（miR-126NP）のハイドロゲルを用いた投与の効果を示す図である。Ａは、miR-126 NP及びコントロールナノ粒子を塗布した直後（Day0）と2日おき（Days 2, 4, 6, 8）に記録した創傷部位の写真である。Ｂは、創傷の閉鎖率の経時変化を示す。
本発明は、miR-126前駆体を封入した生体適合性ポリマーナノ粒子（単に「miR-126封入ナノ粒子」、ともいう）、及びそれをステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント（「本発明のDES」ともいう）を提供する。本発明のDESは、（１）薬剤としての二本鎖RNA（dsRNA）、（２）生体適合性ポリマーからなるナノ粒子及び（３）ステント本体から構成される。
（１）二本鎖RNA（dsRNA）
本発明に用いられるdsRNAは、27merのRNA二重鎖からなる。RNA二重鎖とは、センス鎖とアンチセンス鎖とが相補的な対合をなしている部分を意味し、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の3’末端に塩基対を形成しない、1-2ヌクレオチドのオーバーハングを含むことを許容する。好ましくは、該二本鎖RNAは、オーバーハングを有しない（平滑末端の）27merのRNA二重鎖で構成される。
本発明のdsRNAは、dicerにより成熟miR-126を生じるものであれば特に制限されない。ここで「成熟miR-126」とは、アンチセンス鎖（pre-miRNAヘアピン構造において3’側のステムを形成する鎖）が、5’-ACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCG-3’（配列番号１）と同一もしくは実質的に同一の塩基配列中の連続する21-22塩基の部分塩基配列からなり、センス鎖（pre-miRNAヘアピン構造において5’側のステムを形成する鎖）が、該アンチセンス鎖と相補的もしくは実質的に相補的な21-22塩基の配列からなるdsRNAである。Dicerによる切断は正確さを欠く場合があり、切断点に1ないし2塩基のずれが生じることがあるが、好ましくは、成熟miR-126は、配列番号１で表される塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列と同一もしくは実質的に同一なアンチセンス鎖配列と、該アンチセンス鎖該列と相補的もしくは実質的に相補的なセンス鎖配列とからなる。
ここで「実質的に同一の塩基配列」とは、細胞内の生理的条件下で、miR-126のアンチセンス鎖（miR-126-3pともいう）の標的mRNA（例、SPRED1、PIK3R2、VCAM1等）に特異的にハイブリダイズし、かつ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害し得る塩基配列をいう。具体的には、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列、あるいは、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）において1もしく2個の塩基が他の塩基で置換された配列が挙げられる。
また、アンチセンス鎖と「実質的に相補的」とは、センス鎖とアンチセンス鎖とが二本鎖RNAを形成した際に、dicerによって正しく認識されて21-22塩基の成熟二本鎖RNAにプロセッシングされ、かつインターフェロン応答の惹起やヌクレアーゼ抵抗性の低下等の望ましくない影響を及ぼさない程度にアンチセンス鎖に対して相補的であることを意味する。具体的には、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の相補性を有する塩基配列、あるいは、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）において1もしく2個の塩基が非相補的である塩基配列が挙げられる。
より好ましくは、本発明のdsRNAは、配列番号１で表される27merの塩基配列からなるアンチセンス鎖と、それと完全相補的な27merの塩基配列（5’-CGGCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGU-3’(配列番号２)）からなるセンス鎖とが対形成したものである。
本発明のdsRNAは、リボヌクレオチドの重合体であるRNAの他、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体であってもよい。ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子あってもよいが、例えばRNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がH、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換されたヌクレオチド、好ましくは2’-OH基がH、Fまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチド、より好ましくは2’-OH基がFまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドがあげられる。また、2’-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)etoxy 基および2-cyanoetoxy 基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等もあげられる。
糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)があげられ、具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等もあげられる。
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。
好ましくは、本発明のdsRNAは、少なくとも成熟miR-126のアンチセンス鎖（即ち、配列番号１で表される塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）を構成するヌクレオチドのリン酸ジエステル結合がヌクレアーゼ抵抗性の高い他の結合、好ましくはホスホロチオエート結合に置換されたものである。
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものがあげられる。
本発明のdsRNAには、細胞膜との相互作用を高めたり、dsRNAの取込みを増大せしめる目的で、脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性物質が付加されている。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。脂質は、dsRNAのいずれかの鎖の3'端または5'端に付着させることができるが、dicer切断により成熟miR-126二本鎖DNAから除去されるように設計できる。本発明では、目的のmRNAの翻訳を阻害するのはアンチセンス鎖（miR-126-3p）であるため、コレステロール等の脂質はセンス鎖に付加することがより好ましい。コレステロール等の脂質は、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介してdsRNAに付着させることができうる。
好ましい一実施態様において、本発明のdsRNAは、下記構造式で表される化合物である。式中、Sはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されていることを示す。
本発明のdsRNAを製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等があげられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法[Nucleic AcidResearch, 35, 3287 (2007)]等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度90%以上、好ましくは95%以上の核酸を得るのが望ましい。合成および精製したセンス鎖、アンチセンス鎖を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖1当量に対して、センス鎖0.1〜10当量、好ましくは0.5〜2当量、より好ましくは0.9〜1.1当量、さらに好ましくは等モル量で混合した後、アニーリングを行って用いてもよいし、または、混合したものをアニーリングする工程を省いて直接用いてもよい。アニーリングは、二本鎖を形成できる条件であればいかなる条件で行ってもよいが、通常、センス鎖、アンチセンス鎖をほぼ等モル量で混合した後、94℃程度で5分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行われる。本発明のdsRNAを製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法があげられる。
コレステロールは、例えば、市販の5’-コレステリル-トリエチレングリコール（TEG）ホスホロアミダイト（例えば、Glen Research社製）を用いて、合成したセンス鎖又はアンチセンス鎖の5’末端に付加することができる。あるいは、市販の3’-コレステリル-TEG CPG（例えば、Glen Research社製）を用いて、合成したセンス鎖又はアンチセンス鎖の3’末端に付加することができる。
（２）生体適合性ポリマーからなるナノ粒子
上記本発明のdsRNAを封入させるナノ粒子を構成する生体適合性ポリマーとしては、従来薬剤溶出型ステント（DES）に使用されてきたポリブチルメタクリレート、ポエチレンビニルアセテート、トリブロック共重合体ポリマー、ホスホコリンポリマー、フッ化ポリマー等、さらには、ポリエチレン、ポリプロピレンのようなポリアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテルおよびポリビニルエステルのようなポリビニル化合物、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタレート、アクリル酸とメタクリル酸とのポリマー、セルロースおよび他の多糖類、ならびにペプチドまたはタンパク質、あるいはそれらのコポリマーまたは混合物等を用いることもできるが、これらは非生体吸収性であるため、血管壁に残存する。ポリマーの残存はフィブリンの沈着、アレルギー反応、炎症の惹起・慢性化、遅発性又は超遅発性（包括的に晩期という場合がある）ステント血栓症の発症を引き起こすおそれがあると考えられているので、より安全性の高い生体内分解性ポリマーの使用が望ましい。そのような生体内分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ乳酸（PLA）、ポリアスパラギン酸、アスパラギン酸・乳酸共重合体（PAL）やアスパラギン酸・乳酸・グリコール酸共重合体（PALG）などが挙げられるが、好ましくはPLGAである。
PLGAの分子量は、5,000〜200,000の範囲内であることが好ましく、15,000〜25,000の範囲内であることがより好ましい。乳酸とグリコール酸との組成比は1:99〜99:1であればよいが、乳酸1に対しグリコール酸酸0.333であることが好ましい。また、乳酸およびグリコール酸の含有量が25重量%〜65重量%の範囲内であるPLGAは、非晶質であり且つアセトン等の有機溶媒に可溶であるから、好適に使用される。
PLGAに封入される本発明のdsRNAは親水性であるため、封入を容易にするためにPLGA表面をポリエチレングリコール（PEG）で修飾し、dsRNAとの親和性を向上させておくこともできる。
本発明のdsRNAを封入させた生体適合性ポリマーのナノ粒子は、例えば、特許第4297221号公報及び特許第4340744号公報に記載の方法により製造することができる。具体的には、球形晶析法（Eur J Pharm Biopharm 45: 41-48 (1998)）を用いて、生体適合性ポリマーのナノ粒子の内部に本発明dsRNAを封入することにより製造される。球形晶析法は高剪断力を発生しない粒子調製法であるため、外部応力に弱いdsRNAを封入する場合に、特に好適に用いることができる。
球形晶析法の中でも、エマルジョン溶媒拡散（ESD）法が好ましく用いられ得る。ESD法では、生体適合性ポリマーを溶解できる良溶媒と、該ポリマーを溶解しない貧溶媒とを用い、良溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解後、この該ポリマーが析出しないように、本発明のdsRNA溶液を良溶媒中へ添加混合する。この混合液を、貧溶媒中に攪拌下、滴下すると、混合液中の良溶媒（有機溶媒）が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の自己乳化が起き、サブミクロンサイズの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内の生体適合性ポリマー及びdsRNAの溶解度が低下し、最終的に、dsRNAを包含した球形結晶粒子の生体適合性ポリマーナノスフェアが生成する。良溶媒及び貧溶媒は、生体適合性ポリマーの種類に応じて適宜選択することができる。良溶媒としては、ハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等が挙げられるが、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトン、若しくはアセトンとエタノールの混合液が好適に用いられる。一方、貧溶媒としては、水、或いは界面活性剤を添加した水が挙げられる。例えば、界面活性剤としてポリビニルアルコールを添加したポリビニルアルコール水溶液が好適に用いられる。ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
dsRNAは、水溶液中で負の電荷を持つアニオン分子として存在する。この場合、貧溶媒にカチオン性高分子を添加すると、ナノ粒子内部へのdsRNAの封入率を高めることができる。通常、封入される生理活性物質が親水性（水溶性）の場合、良溶媒中に分散混合した生理活性物質が貧溶媒中に漏出、溶解してしまい、ナノ粒子を形成する高分子だけが沈積するため、生理活性物質がほとんど封入されないが、カチオン性高分子を貧溶媒中に添加すると、ナノ粒子表面に吸着したカチオン性高分子がエマルション滴表面に存在するアニオン性薬物と相互作用し、貧溶媒中へのアニオン性薬物の漏出を抑制できるものと考えられる。
カチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）等が挙げられるが、特にキトサン或いはその誘導体が好適に用いられる。
得られたナノ粒子の懸濁液をそのまま、或いは必要に応じて良溶媒である有機溶媒を減圧留去し、さらに必要に応じて凍結乾燥等によりナノ粒子を一旦粉末化させた後、再度水に分散させて次のナノ粒子付着工程に用いる。ナノ粒子を一旦粉末化する場合、結合剤（例えばトレハロース等）と共に再分散可能な凝集粒子に複合化して複合粒子としてもよい。
こうして得られる生体適合性ナノ粒子は、1,000nm未満の平均粒子径を有する。好ましくはナノ粒子の直径は、数10〜数100nmである。
本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子は、上記のような懸濁液の状態で、あるいは粉末化し、用時再分散させて、血管内皮細胞再生促進剤として、血管内皮細胞の再生を必要とする対象（例、PCI後の合併症リスクのある患者、外傷患者等）に対して、そのまま、あるいは使用目的に応じて適切な剤形に調製した後、投与することができる。
例えば、ステント留置後の合併症（例えば、再狭窄、晩期ステント血栓症、それによる急性冠症候群）の予防剤として用いる場合、ステント植え込みによるPCIを実施した患者にそのままの状態で投与することもできるが、好ましくは、ステント本体にコーティングすることにより、薬剤溶出型ステント（DES）として製剤化される。
（３）ステント本体
本発明のDESに使用されるステント本体は、従来より使用されているものであれば特に制限はなく、ステンレス、マグネシウム、タンタル、チタン、ニッケル−チタン合金、インコネル、金、プラチナ、イリジウム、タングステン、コバルト系合金等の金属製のパイプを、網目状に切削したもの等が用いられる。ステントが自己拡張タイプの場合、元の形状への復元性が必要なことからニッケルチタン等の超弾性合金等が好ましい。一方、バルーン拡張タイプの場合、拡張後の形状復帰の起こりにくいステンレス等が好ましく、中でも最も耐腐食性に優れたＳＵＳ３１６Ｌが好適に用いられる。ステント本体の大きさも適用箇所に応じて適宜選択することができる。例えば、心臓の冠状動脈に用いる場合は、通常、拡張前における外径は1.0〜3.0mm、長さは5.0〜50mm程度が好ましい。
本発明のdsRNAを封入させた生体適合性ポリマーのナノ粒子は、例えば、特許第4297221号公報及び特許第4340744号公報に記載の方法により、ステント本体にコーティングすることができる。ナノ粒子を付着させる方法としては、ナノ粒子懸濁液への浸漬やミストコート等によりナノ粒子をステント本体に物理的に付着させる方法を用いても良い。
上述のように、ナノ粒子表面がカチオン粒子により正に帯電したナノ粒子を用いる場合、ナノ粒子を電気的に付着させることによりステント本体に強固且つ均一にコーティング可能となる。例えば、生体適合性ナノ粒子の懸濁液中でステント本体を負極として通電する電気泳動法と、負に帯電させたステント表面に生体適合性ナノ粒子含有液滴を付着させる噴霧法が挙げられる。
また、ヘアピンループ部分を介して、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖核酸であって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造状の形状を有する核酸も本発明の核酸の好ましい態様の１つである。
このようにして得られた、本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子でコーティングしたステント（本発明のDES）は、従来使用されているDESと同様にして、血管、気管、食道、尿道等の管腔に生じた狭窄部位、閉塞部位に留置することにより、その開放状態を維持するのに用いられる。本発明のDESは、内皮細胞再生作用及び抗炎症作用を併せ持つmiR-126の前駆体を、ステント留置局所から徐放することにより、管壁の細胞で効率よくmiR-126を長期持続的に発現させることができる。従って、本発明のDESは、特に冠動脈をはじめとする血管の狭窄・閉塞に対して用いることにより、従来のDESにおいて懸念材料となっている再狭窄や晩期ステント血栓症などの合併症リスクを低減することができる。
本発明のDESに搭載されるdsRNAの量（投与量）は、投与の目的、投与方法、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、成人の血管内に留置して局所投与する場合、通常、dsRNA量として1pmol/kg以上10nmol/kg以下が望ましい。
本発明のステント留置後の合併症予防剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル等）に対して安全に投与される。
（４）外傷治療剤
また、本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子は、血管内皮細胞再生を介して血管新生を促進するので、外傷部位に局所投与することにより、血管新生を介して外傷の治癒を促進することができる。
該ナノ粒子は、DESに用いる場合と同様に、懸濁液の状態で、あるいは粉末化し、用時再分散させて、外傷を有する患者に局所投与することができる。
本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子は、懸濁液の状態のまま、外傷局所に注射することにより投与することもできるが、皮膚接着基剤に含有させて用いることもできる。
皮膚接着基剤としては、皮膚面に接触して活性成分であるmiR-126前駆体を外傷部位の血管内皮細胞に導入することができるものであれば特に限定されない。具体的には、軟膏剤、ゲル剤、乳剤、懸濁剤、パップ剤、貼付剤等の半固形剤や固形剤；ローション剤、リニメント剤等の液剤を構成することが可能な基剤を用いることができる。
軟膏基剤としては、一般に疎水性基剤としての油脂類、ロウ、炭化水素化合物等を用いることができる。具体的には、黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、流動パラフィン、プラスチベース、シリコーン等の鉱物性基剤、ミツロウ、動植物性油脂等の動植物性基剤等が挙げられる。
ゲル基剤としては、ハイドロゲル基剤としてのカルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、キトサン、デキストラン、プルラン、ゼラチン、ゲルベース、無脂肪性軟膏、ポリエチレングリコール等を用いることができる。
乳剤用基剤としては、親水軟膏、バニシングクリーム等の水／油型基剤；親水ワセリン、精製ラノリン、アクアホール、オイセリン、ネオセリン、加水ラノリン、コールドクリーム、親水プラスチベース等の油／水型基剤が挙げられる。
懸濁用基剤としては、ローション剤、ステアリルアルコール、セチルアルコール等の微粒子をプロピレングリコール中に懸濁させたＦＡＰＧ基剤（Fatty alcohol-propylene glycol）、すなわちリオゲル基剤等が挙げられる。
パップ剤用基剤としては、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、カオリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、グリセリン、プロピレングリコール、水等が挙げられる。
ローション剤としては、活性成分を水性の液中に微細に均質分散した製剤であり、懸濁性ローション剤と、乳濁性ローション剤とがある。懸濁化剤としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ベントナイン等が挙げられる。乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタン脂肪酸エステル等を用いることができる。
リニメント剤は、油性溶液型、アルコール溶液型、乳化型及び懸濁型に分類することができる。リニメント剤には、水、エタノール、脂肪油、グリセリン、セッケン、乳化剤、懸濁化剤、その他添加剤等を用いることができ、例えば、硬パラフィン、軟パラフィン、液パラフィン、グリセリン、パラフィン油、蜜蝋、金属石鹸；粘液（mucilage）；天然油［例：アーモンド油、コーン油、ピーナッツ油、ヒマシ油、オリーブ油、またはそれらの誘導体（例えば、ポリオキシルヒマシ油）］；羊脂若しくはその誘導体、脂肪酸及び／又はエステル（例：ステアリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸イソプロピル）が挙げられる。
また、本発明の外傷治療剤は、適用部位へ貼付又は塗布した後、これを粘着シートや包帯等で保護、固定することが好ましく、これにより衣服や手指を汚すことなく使用できる。また、本発明の外傷治療剤をシート状の支持体の片面に形成した貼付剤の形態で使用すると、投与すべき薬物量を調整しやすく、貼付操作も簡便に行うことができるため好ましい。なお、本発明の外傷治療剤を貼付剤の形態で使用する場合には、粘着性を有するように、その主成分に粘着剤を用いて支持体の片面に粘着剤層を形成すると好適である。また、製造、運搬又は保存中に粘着剤層が、いたずらに器具、容器等に接着することを防止するために、また製剤の劣化を防止するために、皮膚面へ貼付する直前まで粘着剤層の露出面を剥離ライナーで被覆、保護することが望ましい。そして、使用時に剥離ライナーを剥離して粘着剤層を露出させ、皮膚に貼付して投与する。
粘着剤層に含まれる粘着剤としては、常温（２０〜３０℃程度）で粘着性を有し、皮膚面に接した際にカブレ等を生じなければ特に限定されるものではない。粘着剤は、当該技術分野において医療用の粘着剤として従来から用いられている、アクリル系粘着剤、天然ゴム系粘着剤、合成ゴム系粘着剤（合成イソプレンゴム、ポリイソブチレン、スチレン−ブタジエンゴム、スチレン−イソプレン−スチレンゴム）、シリコーン系粘着剤、ビニルエステル系粘着剤、ビニルエーテル系粘着剤等で構成されることが好ましい。これらの粘着剤の中でも、皮膚刺激性、皮膚接着性等の制御が容易である点から、アクリル系粘着剤を用いることが好ましい。
本発明の外傷治療剤に配合されるdsRNAの量は、外傷治療剤の全重量を基準として通常０．５〜６０重量％、好ましくは１〜３０重量％である。
本発明の外傷治療剤の投与量は、投与の目的、投与方法、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、外傷部位に局所注射する場合、通常、dsRNA量として10ng/mm2以上1000ng/mm2以下、好ましくは100ng/mm2以上500ng/mm2以下を、1-3日毎に投与することができる。また、ハイドロゲル基材にナノ粒子を含浸させて外傷部位に塗布する場合、通常、dsRNA量として10ng/mm2以上1000ng/mm2以下、好ましくは100ng/mm2以上500ng/mm2以下を塗布し、5-10日間保持することができる。
本発明の外傷治療剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル等）に対して安全に投与される。
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。
参考例１ 本発明のDESの薬剤放出性
冠動脈バルーン形成術（POBA）によりウサギ動脈の内膜と中膜の解離及び内弾性板の断裂を生じさせた。特許第4297221号公報及び特許第4340744号公報に記載の方法によりFITCを封入したPLGAナノ粒子を作製して、このウサギに投与し、蛍光像を観察してナノ粒子からの薬物の放出性を調べた。結果を図１に示す。血管に対して良好な導入効率を有していることを確認した。
実施例１ dsRNA封入PLGAナノ粒子でコーティングしたステントの作製
DNA/RNA自動合成機を用いて、miR-126前駆体のセンス鎖及びアンチセンス鎖（3〜24番目のヌクレオチドはホスホロチオエート化）をそれぞれ合成した。
センス鎖： 5’-CGGCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGU-3’(配列番号２)
アンチセンス鎖：5’-ACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCG-3’(配列番号１)
5’-コレステリル-TEGホスホロアミダイトを用いて、常法により、センス鎖の5’末端にコレステロールを付加した。センス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせ、さらに凍結乾燥してdsRNAを調製した。
PLGAナノ粒子への封入は、水中エマルション溶媒拡散法にて実施した。具体的には、PLGA（PLGA-7505（829-11946）・和光純薬）と上記dsRNAをアセトン/エタノール混合液に溶解し、これをポリビニルアルコール水溶液中に滴下し、エマルション界面での自己乳化作用により擬似的なエマルション滴を形成させ、さらに両溶媒の相互拡散によりエマルション滴内でPLGAとdsRNAを共沈させてマトリックス化することにより、dsRNAが封入されたPLGAナノ粒子を得た。
ナノ粒子の電荷を制御し，これを用いてステント表面に電気的に接着した。この方法は電着塗装（elctro-deposition paint）という塗装方法を応用したものである。具体的には50mg/mLの濃度でdsRNA封入PLGAナノ粒子を蒸留水に懸濁し、2.0mAの直流電流で陰性に荷電させたステンレススチール製のステントに電着させた (J Am Coll Cardiol Intv 2009;2:277-83)。
実施例２ 動物モデルでの検証
高脂肪食（ピーナッツオイル5%+コレステロール 1%）を負荷したウサギに対し、miR-126封入ナノ粒子積層ステントおよびコントロールRNA封入ナノ粒子積層ステントを、それぞれ左右の腸骨動脈に留置した。4週間後、血管造影および光コヒーレンストモグラフィー（OCT）を用いて評価したところ、マイクロRNA-126搭載ステントにおいて、コントロールRNAと比較して、有意に新生内膜の抑制効果を認めた（図２、表１）。
実施例３ 血管内皮細胞へのナノ粒子による封入薬剤の導入
実施例１に記載の方法に準じて、PLGAナノ粒子にフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を封入した（FITC-NP）。FITC-NPを0.05重量%の濃度となるように添加したDMEM培地500μLを含む24-wellプレートに、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を1x104細胞播種し、37℃、5%CO2の条件下で1日間インキュベートした後、蛍光顕微鏡を用いてHUVEC細胞内へのFITCの取り込みを観察した。対照として、薬剤未封入のPLGAナノ粒子を添加した培地で、HUVECを同様にインキュベートしたものを用いた。結果を図３に示す。
PLGAナノ粒子は、封入した薬剤を血管内皮細胞内に効率よく導入し得ることが確認された。
実施例４ 皮膚損傷モデルにおけるmiR-126封入ナノ粒子の効果
（１）皮下注射による投与
マウスを麻酔後、背中の毛を剃り除毛剤で毛を除いた。露出したマウスの皮膚に、5mm biopsy punchで皮膚欠損を作製した。実施例１と同様にして調製したmiR-126封入ナノ粒子を生理食塩水に懸濁し、1つの傷あたり80μL(RNA量として4μg)を4箇所に分けて欠損孔内に注射した。コントロールとして同量のコントロールRNAを封入したナノ粒子を使用した。皮膚欠損部位をテガダームで保護し、2日おきにmiR-126封入ナノ粒子又はコントロールナノ粒子を反復投与した。投与開始翌日から、2日おきに欠損孔を撮影し、創傷治癒を評価した。結果を図４に示す。
miR-126封入ナノ粒子投与群では、投与開始5日後にコントロールに比べて顕著に損傷面積が小さくなっており、miR-126による外傷治癒促進効果が確認された。
（２）ハイドロゲルを用いた投与
マウスを麻酔後、背中の毛を剃り除毛剤で毛を除いた。露出したマウスの皮膚に、5mm biopsy punchで皮膚欠損を作製した。実施例１と同様の方法により調製したmiR-126封入ナノ粒子を生理食塩水に懸濁し、該懸濁液20μL(RNA 4μg相当)を30% F-127 pluronic gel (Sigma) 4℃に混ぜた。このハイドロゲル製剤を創傷部位に塗布し、8日間塗布を続けた。コントロールとして、スクランブルRNAを封入したナノ粒子をゲルに混ぜて、反対側に塗布した。2日おきに創傷の治癒過程を記録した。結果を図５に示す。
miR-126封入ナノ粒子投与群では、コントロールに比べて顕著に損傷部位の閉鎖が早く進み、ハイドロゲル基材を用いた場合にも、miR-126による外傷治癒促進効果が確認された。
ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は、それぞれ2014年3月7日付で日本国に出願された特願2014-44463を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。
本発明のDESは、従来のDESの欠点を補うことができる上、薬剤との同時投与も可能である。また複数のマイクロRNAの投与を組みあわせることによって、より望ましい機能を発揮させることも可能である。
また、本発明の外傷治療剤は、長期間持続塗布可能な外用剤として製剤化することができ、外傷の治療における患者の負担軽減に寄与し得る。
さらに、マイクロRNAは現在さまざまの疾患において治療のためのツールや治療標的として応用が考えられており、本研究によって、持続的に局所で発現させることが可能となれば、さらに安全で有効性の高い治療となりうる。また、その応用範囲は循環器疾患にとどまらず、癌・生活習慣病などの領域も含め、大変広いと推察されるため、分野を越えた多くの知財を生み出す可能性がある。

Claims (9)

  1. 末端にコレステロールが付加された27merの二本鎖RNAであって、dicerにより成熟miR-126を生じる二本鎖RNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子。
  2. 生体適合性ポリマーが乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）である、請求項１記載のナノ粒子。
  3. 成熟miR-126のアンチセンス鎖がホスホロチオエート化されている、請求項１又は２記載のナノ粒子。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子を有効成分とする、血管内皮細胞再生促進剤。
  5. ステント留置後の合併症予防用である、請求項４記載の剤。
  6. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノ粒子をステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント。
  7. 請求項５記載の薬剤溶出型ステントを含有してなる、ステント留置後の合併症リスクが低減された、管の狭窄もしくは閉塞の治療剤。
  8. 管が血管である、請求項７記載の治療剤。
  9. 外傷の治療用である、請求項４記載の剤。
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