WO2015133637A1 - マイクロｒｎａ封入ナノ粒子及びその医薬用途 - Google Patents

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stent
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亘 尾野
成達 齋藤
正康 出原
木村　剛
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Definitions

  • the present invention relates to a microRNA-eluting stent and luminal treatment using the same. More specifically, the present invention relates to a stent formed by laminating nanoparticles encapsulating miR-126, and a conventional drug-eluting stent in which the stent is placed in a stenotic site and miR-126 is gradually released. (DES) relates to vascular treatment with reduced risk of serious side effects. The present invention also relates to treatment of trauma using the nanoparticles encapsulating the miR-126.
  • Coronary intervention is widely practiced as a treatment for ischemic heart disease. Since heart accidents are reduced compared to the original balloon plastic surgery, stent placement has been widely performed, but complications such as restenosis and stent thrombosis are regarded as clinical problems.
  • the drug-eluting stent (DES) suppresses restenosis by coating the surface of the stent with a smooth muscle cell growth inhibitor and releasing it slowly, and the frequency of restenosis decreased with the appearance of DES.
  • the cause of restenosis is thought to be the initial inflammatory reaction after stent placement and intimal thickening due to smooth muscle cell proliferation occurring within 1-2 months, and various drug release controls to suppress them DES with added sex has been proposed.
  • biocompatible nanoparticles with positively charged surfaces as drug carriers for stents, the affinity with negatively charged tube walls is improved and hydrophilic nucleic acid molecules are efficiently enclosed. Possible DES has been reported (Patent Documents 1 and 2).
  • Antiplatelet therapy plays a major role in the prevention of stent thrombosis, but long-term use of antiplatelet agents increases the risk of bleeding during surgery for the elderly, and thus it is a problem that spans multiple departments It has become.
  • the same Limus-type drug as before is used, and therefore, delayed regeneration of endothelial cells and delayed thrombosis may continue to be problems. Therefore, development of a novel DES with reduced risk of developing late or very late thrombosis as well as restenosis is eagerly desired.
  • microRNA is known as an endogenous non-coding RNA of about 20 to 25 bases encoded on the genome.
  • MicroRNA is first transcribed as a primary transcript (Primary miRNA, Pri-miRNA) with a length of several hundred to several thousand bases from miRNA genes on genomic DNA, and then processed to about 60-70 bases. It becomes pre-miRNA (precusor miRNA) having a moderate hairpin structure. After that, it moves from the nucleus to the cytoplasm and is further processed to become a double-stranded mature miRNA of about 20-25 bases.
  • Primary miRNA Primary miRNA
  • precusor miRNA precusor miRNA
  • double-stranded mature miRNAs function to inhibit target gene translation by forming a complex with a protein called RISC, and then acting on the mRNA of the target gene. . Since microRNA has a plurality of target genes, a plurality of useful actions can be exhibited simultaneously. Therefore, if microRNA can be expressed safely and continuously locally in the living body, it is considered possible to develop a new vascular treatment method. There are no cases of treatment.
  • An object of the present invention is to provide a novel DES with reduced risk of complications such as restenosis, late or very late thrombosis, and to provide a safer vascular treatment means. .
  • miR-126 is known to exhibit angiogenic activity by suppressing the expression of SPRED1 and PIK3R2, which are negative regulators of the vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway (Dev Cell 15 : 272-284 (2008)).
  • SPRED1 and PIK3R2 are negative regulators of the vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway
  • miR-126 suppresses the invasion of leukocytes into the blood vessel wall by suppressing the expression of vascular cell adhesion factor 1 (VCAM1), which mediates the adhesion of leukocytes to endothelial cells, and exhibits anti-inflammatory action Is also known (Cardiovasc Res 79: 581-588 (2008)).
  • VCAM1 vascular cell adhesion factor 1
  • miR-126 which has both vascular endothelial cell regeneration promoting action and anti-inflammatory action, can be released slowly from the stent, the side effects of drugs used in conventional DES can be avoided and serious It is expected to reduce the risk of developing late thrombosis, a complication.
  • Phosphorothioate is used so that the antisense strand of miR-126 is less susceptible to degradation.
  • the miR-126-encapsulated PLGA nanoparticles prepared as described above were coated on a stent and placed in the iliac artery of a rabbit loaded with a high fat diet. As a result, after 4 weeks, miR-126-loaded stents significantly inhibited neointimal (smooth muscle cell proliferation) compared to control RNA.
  • the present inventors encapsulated a miR-126 precursor in which cholesterol is added to a 27-base double-stranded RNA that generates mature miR-126 by dicer cleavage in biocompatible polymer nanoparticles.
  • miR-126 is fully expressed in the cells of the blood vessel wall and exerts the desired endothelial cell regeneration effect and anti-inflammatory effect.
  • miR-126 promotes angiogenesis through vascular endothelial cell regeneration and thereby has miRNA-126 encapsulation under the idea that it has a healing effect on trauma such as skin damage.
  • Nanoparticles were administered topically to the site of mouse skin injury. As a result, it was revealed that miRNA-126-encapsulated nanoparticles promote the healing of skin damage.
  • the present inventors have found that miRNA-126-encapsulated nanoparticles are useful not only for reducing side effects in DES but also for healing wounds, and thus completed the present invention.
  • the present invention is as follows. [1] 27-mer double-stranded RNA to which cholesterol is added at the end, and biocompatible polymer nanoparticles encapsulating double-stranded RNA that generates mature miR-126 by dicer. [2] The nanoparticle according to [1], wherein the biocompatible polymer is a lactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA). [3] The nanoparticle according to [1] or [2], wherein the antisense strand of mature miR-126 is phosphorothioated. [4] A vascular endothelial cell regeneration promoter comprising the nanoparticle according to any one of [1] to [3] as an active ingredient.
  • PLGA lactic acid / glycolic acid copolymer
  • [6] A drug-eluting stent obtained by coating the stent body with the nanoparticles according to any one of [1] to [3].
  • [7] A therapeutic agent for stenosis or occlusion of a tube, comprising the drug-eluting stent according to [6], with reduced risk of complication after placement of the stent.
  • the therapeutic agent according to [7] wherein the tube is a blood vessel.
  • the agent according to [4] which is used for treatment of trauma.
  • miR-126 precursor encapsulated in nanoparticles eluted from the stent placement site is efficiently taken up into cells of the vessel wall, and expresses mature miR-126 in the cell while avoiding interferon response Therefore, the endothelial cell regeneration action and anti-inflammatory action of miR-126 suppresses the proliferation of smooth muscle cells and the inflammatory reaction, and significantly reduces the risk of complications such as restenosis and late thrombosis.
  • miR-126-encapsulated nanoparticles locally administered to the wound site promote healing of the trauma. Therefore, a patch containing the miR-126-encapsulated nanoparticles as an active ingredient has a nanoparticle sustained release effect and nucleic acid modification. Due to the stabilization effect, the wound healing effect lasts for a long period of time, so there is no need to reattach frequently and the burden on the patient can be reduced.
  • Angiography was performed immediately after placement (left panel) and 4 weeks later (right panel). Went. It is a figure which shows the introduction
  • A is a photograph of the wound site immediately after subcutaneous injection of miR-126 NP and control nanoparticles (Day 0) and 5 days later (Day 5). B shows the change over time in the area of the wound site.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the effect of administration using the hydrogel of miR-126 enclosure PLGA nanoparticle (miR-126NP) in a skin injury mouse model.
  • A is a photograph of the wound site recorded immediately after application of miR-126 NP and control nanoparticles (Day 0) and every 2 days (Days 2, 4, 6, 8).
  • B shows the time course of the wound closure rate.
  • the present invention relates to a biocompatible polymer nanoparticle encapsulating a miR-126 precursor (also simply referred to as “miR-126 encapsulated nanoparticle”), and a drug-eluting stent (“ Also referred to as “DES of the present invention”).
  • the DES of the present invention is composed of (1) double-stranded RNA (dsRNA) as a drug, (2) nanoparticles composed of a biocompatible polymer, and (3) a stent body.
  • Double-stranded RNA (dsRNA)
  • the dsRNA used in the present invention consists of a 27mer RNA duplex.
  • the RNA duplex means a part where the sense strand and the antisense strand are in complementary pairing, and does not form a base pair at the 3 ′ end of the sense strand and / or the antisense strand. Allow to contain 2 nucleotide overhangs.
  • the double-stranded RNA is composed of a 27-mer RNA duplex with no overhangs (blunt ends).
  • the dsRNA of the present invention is not particularly limited as long as it produces mature miR-126 by dicer.
  • mature miR-126 means that the antisense strand (the strand that forms the 3 ′ stem in the pre-miRNA hairpin structure) is the same as or substantially the same as 5′-ACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCG-3 ′ (SEQ ID NO: 1).
  • the sense strand (the strand that forms the 5 'stem in the pre-miRNA hairpin structure) is complementary or substantially complementary to the antisense strand. It is a dsRNA consisting of a sequence of 21-22 bases that are complementary to each other.
  • mature miR-126 has base number 3 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • -24 comprising an antisense strand sequence identical or substantially identical to the partial base sequence shown by -24, and a sense strand sequence complementary or substantially complementary to the antisense strand of the row.
  • substantially the same nucleotide sequence means the target mRNA (eg, SPRED1, PIK3R2, VCAM1) of the antisense strand of miR-126 (also referred to as miR-126-3p) under physiological conditions in the cell. Etc.) and a base sequence capable of inhibiting the translation of the protein from the mRNA.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or a partial base sequence represented by base numbers 3-24 in the base sequence).
  • 1 or 2 bases are replaced with other bases in the base sequence having identity or the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or the partial base sequence shown by base numbers 3-24 in the base sequence) Sequence.
  • substantially complementary to the antisense strand means that a mature double-stranded RNA of 21-22 bases that is correctly recognized by dicer when the sense strand and the antisense strand form a double-stranded RNA.
  • the antisense strand is complementary to the antisense strand to the extent that it does not have undesirable effects such as inducing an interferon response or reducing nuclease resistance. Specifically, it is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or a partial base sequence represented by base numbers 3-24 in the base sequence).
  • One or two bases in the base sequence having complementarity or the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (or the partial base sequence shown by base numbers 3-24 in the base sequence) are non-complementary Examples include base sequences.
  • the dsRNA of the present invention comprises an antisense strand consisting of the 27-mer base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and a 27-mer base sequence (5'-CGGCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGU-3 '(SEQ ID NO: 2)) that is completely complementary thereto. ) In the sense strand.
  • the dsRNA of the present invention includes RNA that is a polymer of ribonucleotides, chimeric nucleic acids composed of RNA and DNA, and nucleotides in which at least one nucleotide of these nucleic acids is substituted with a molecule having a function equivalent to that nucleotide It may be a polymer.
  • molecules having a function equivalent to nucleotides include nucleotide derivatives.
  • the nucleotide derivative may be any molecule as long as it is a modified nucleotide.
  • RNA in order to improve or stabilize nuclease resistance compared to RNA, in order to increase affinity with complementary strand nucleic acid, In order to increase cell permeability or to make it visible, a molecule in which ribonucleotides are modified is preferably used.
  • nucleotide examples include a sugar moiety-modified nucleotide, a phosphodiester bond-modified nucleotide, a base-modified nucleotide, and a nucleotide in which at least one of the sugar moiety, phosphodiester bond and base is modified.
  • any or all of the chemical structure of the sugar of the nucleotide may be modified or substituted with any substituent, or substituted with any atom.
  • '-Modified nucleotides are preferably used.
  • 2′-modified nucleotides include, for example, the 2′-OH group of ribose is H, OR, R, R′OR, SH, SR, NH 2 , NHR, NR 2 , N 3 , CN, F, Cl, Br and Substituted with a substituent selected from the group consisting of I (R is alkyl or aryl, preferably alkyl having 1 to 6 carbon atoms, and R ′ is alkylene, preferably alkylene having 1 to 6 carbon atoms)
  • a nucleotide preferably a nucleotide in which the 2′-OH group is substituted with H, F or a methoxy group, more preferably a nucleotide in which the 2′-OH group is substituted with F or a methoxy group.
  • 2'-OH group is 2- (methoxy) ethoxy group, 3-aminopropoxy group, 2-[(N, N-dimethylamino) oxy] ethoxy group, 3- (N, N-dimethylamino) propoxy group, 2- A substituent selected from the group consisting of [2- (N, N-Dimethylamino) ethoxy] ethoxy group, 2- (methylamino) -2-oxoethoxy group, 2- (N-methylcarbamoyl) etoxy group and 2-cyanoetoxy group Examples thereof include substituted nucleotides.
  • sugar-modified nucleotide examples include a crosslinked structure-type artificial nucleic acid (BNA) having two cyclic structures by introducing a crosslinked structure into the sugar moiety, and specifically, an oxygen at the 2 ′ position.
  • BNA Locked Nucleic Acid
  • LNA Locked Nucleic Acid
  • ENA Ethylene bridged nucleic acid
  • PNA peptide nucleic acids
  • OPNA oxypeptide nucleic acids
  • OPNA oxypeptide nucleic acids
  • OPNA oxypeptide nucleic acids
  • PRNA peptide ribonucleic acid
  • the phosphodiester bond-modified nucleotide is any nucleotide that has been modified or substituted with an arbitrary substituent for a part or all of the chemical structure of the phosphodiester bond of the nucleotide, or with any atom.
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorothioate bond a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with a phosphorodithioate bond
  • a nucleotide in which a phosphodiester bond is replaced with an alkylphosphonate bond a phosphate
  • Examples thereof include nucleotides in which a diester bond is substituted with a phosphoramidate bond.
  • the dsRNA of the present invention is a phosphate of a nucleotide constituting at least an antisense strand of mature miR-126 (that is, a partial base sequence represented by base number 3-24 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1).
  • the diester bond is replaced with another bond having high nuclease resistance, preferably a phosphorothioate bond.
  • any or all of the nucleotide base chemical structure modified or substituted with an arbitrary substituent or substituted with an arbitrary atom may be used.
  • oxygen atoms are substituted with sulfur atoms
  • hydrogen atoms are substituted with alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms, halogens, etc.
  • methyl groups are hydrogen, hydroxymethyl, alkyl groups with 2 to 6 carbon atoms, etc.
  • amino group is substituted with an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkanoyl group having 1 to 6 carbon atoms, an oxo group, a hydroxy group, or the like.
  • a hydrophobic substance such as a lipid (eg, phospholipid, cholesterol, etc.) is added for the purpose of enhancing the interaction with the cell membrane or increasing the uptake of dsRNA.
  • lipids for addition include cholesterol and derivatives thereof (eg, cholesteryl chloroformate, cholic acid, etc.). Lipids can be attached to the 3 ′ or 5 ′ end of either strand of the dsRNA, but can be designed to be removed from mature miR-126 double stranded DNA by dicer cleavage.
  • the antisense strand (miR-126-3p) that inhibits translation of the target mRNA
  • a lipid such as cholesterol
  • Lipids such as cholesterol can be attached to dsRNA via bases, sugars, intramolecular nucleoside bonds.
  • the dsRNA of the present invention is a compound represented by the following structural formula. In the formula, S indicates that the phosphodiester bond is substituted with a phosphorothioate bond.
  • the method for producing the dsRNA of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include a method using a known chemical synthesis or an enzymatic transcription method.
  • methods using known chemical synthesis include phosphoramidite method, phosphorothioate method, phosphotriester method, CEM method [Nucleic Acid Research, 35, 3287 (2007)].
  • ABI3900 high-throughput nucleic acid synthesizer Applied Biosystems. After the synthesis is completed, elimination from the solid phase, deprotection of the protecting group, purification of the target product, and the like are performed. It is desirable to obtain a nucleic acid having a purity of 90% or more, preferably 95% or more by purification.
  • the sense and antisense strands synthesized and purified are in an appropriate ratio, for example, 0.1 to 10 equivalents, preferably 0.5 to 2 equivalents, more preferably 0.9 to 1.1 equivalents, more preferably 1 equivalent to 1 equivalent of the antisense strand. May be used after being mixed in equimolar amounts and then annealed, or may be used directly without the step of annealing the mixture. Annealing may be performed under any conditions that can form a double strand. Usually, after the sense strand and the antisense strand are mixed in approximately equimolar amounts, the mixture is heated at about 94 ° C. for about 5 minutes. , By slowly cooling to room temperature.
  • Examples of the enzymatic transcription method for producing the dsRNA of the present invention include a transcription method using a phage RNA polymerase such as T7, T3, or SP6 RNA polymerase using a plasmid or DNA having a target base sequence as a template.
  • Cholesterol can be added to the 5 ′ end of the synthesized sense strand or antisense strand using, for example, commercially available 5′-cholesteryl-triethylene glycol (TEG) phosphoramidite (eg, Glen Research). it can.
  • commercially available 3′-cholesteryl-TEG CPG for example, manufactured by Glen Research
  • Nanoparticles made of biocompatible polymers include polybutyl methacrylate and polyethylene that have been used in conventional drug-eluting stents (DES).
  • biodegradable polymer includes polylactic acid / glycolic acid copolymer (PLGA), polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polyaspartic acid, aspartic acid / lactic acid copolymer (PAL). And aspartic acid / lactic acid / glycolic acid copolymer (PALG), etc., and PLGA is preferred.
  • the molecular weight of PLGA is preferably in the range of 5,000 to 200,000, and more preferably in the range of 15,000 to 25,000.
  • the composition ratio of lactic acid to glycolic acid may be 1:99 to 99: 1, but glycolic acid is preferably 0.333 with respect to lactic acid 1.
  • PLGA having a lactic acid and glycolic acid content in the range of 25 wt% to 65 wt% is preferably used because it is amorphous and soluble in an organic solvent such as acetone.
  • the PLGA surface can be modified with polyethylene glycol (PEG) to facilitate encapsulation so that the affinity with dsRNA is improved.
  • PEG polyethylene glycol
  • the nanoparticle of the biocompatible polymer in which the dsRNA of the present invention is encapsulated can be produced, for example, by the method described in Japanese Patent No. 4272721 and Japanese Patent No. 4340744. Specifically, it is produced by encapsulating the dsRNA of the present invention inside the biocompatible polymer nanoparticles using a spherical crystallization method (Eur J Pharm Biopharm 45: 41-48 (1998)). Since the spherical crystallization method is a particle preparation method that does not generate high shearing force, it can be particularly suitably used when encapsulating dsRNA that is weak against external stress.
  • the emulsion solvent diffusion (ESD) method can be preferably used.
  • ESD emulsion solvent diffusion
  • a good solvent that can dissolve the biocompatible polymer and a poor solvent that does not dissolve the polymer are used, and the biocompatible polymer is dissolved in the good solvent so that the polymer does not precipitate.
  • Add and mix dsRNA solution in good solvent When this mixed solution is dropped into the poor solvent while stirring, the good solvent (organic solvent) in the mixed solution rapidly diffuses and moves into the poor solvent. As a result, self-emulsification of the good solvent occurs in the poor solvent, and submicron sized good solvent emulsion droplets are formed.
  • the organic solvent continuously diffuses from the emulsion to the poor solvent, so that the solubility of the biocompatible polymer and dsRNA in the emulsion droplets is lowered, and finally , Biocompatible polymer nanospheres of spherical crystal particles containing dsRNA are produced.
  • the good solvent and the poor solvent can be appropriately selected according to the type of the biocompatible polymer. Examples of the good solvent include halogenated alkanes, acetone, methanol, ethanol, ethyl acetate, diethyl ether, cyclohexane, benzene, toluene, and the like.
  • acetone or a mixture of acetone and ethanol that has little adverse effect on the environment and the human body. are preferably used.
  • the poor solvent include water or water to which a surfactant is added.
  • a polyvinyl alcohol aqueous solution to which polyvinyl alcohol is added as a surfactant is preferably used.
  • surfactants other than polyvinyl alcohol include lecithin, hydroxymethylcellulose, hydroxypropylcellulose, and the like.
  • DsRNA exists as an anion molecule having a negative charge in an aqueous solution.
  • a cationic polymer when added to the poor solvent, the encapsulation rate of dsRNA inside the nanoparticles can be increased.
  • the encapsulated bioactive substance is hydrophilic (water-soluble), the bioactive substance dispersed and mixed in the good solvent leaks and dissolves in the poor solvent, and only the polymer that forms the nanoparticles is deposited.
  • cationic polymers include chitosan and chitosan derivatives, cationized cellulose in which a plurality of cationic groups are bonded to cellulose, polyamino compounds such as polyethyleneimine, polyvinylamine, and polyallylamine, polyamino acids such as polyornithine and polylysine, and polyvinylimidazole.
  • Polyvinylpyridinium chloride, alkylaminomethacrylate quaternary salt polymer (DAM), alkylaminomethacrylate quaternary salt / acrylamide copolymer (DAA) and the like, and chitosan or derivatives thereof are particularly preferably used.
  • the obtained suspension of nanoparticles is used as it is, or if necessary, the organic solvent which is a good solvent is distilled off under reduced pressure. And used in the next nanoparticle adhesion step.
  • the nanoparticles When the nanoparticles are once powdered, they may be combined with aggregated particles that can be redispersed together with a binder (for example, trehalose) to form composite particles.
  • a binder for example, trehalose
  • the biocompatible nanoparticles thus obtained have an average particle size of less than 1,000 nm.
  • the diameter of the nanoparticles is several tens to several hundreds of nm.
  • the biocompatible polymer nanoparticles in which the dsRNA of the present invention is encapsulated are in a suspension state as described above or powdered and redispersed at the time of use as a vascular endothelial cell regeneration promoter, It can be administered to subjects who require regeneration (eg, patients at risk of complications after PCI, trauma patients, etc.) as they are or after preparing a suitable dosage form according to the purpose of use.
  • subjects who require regeneration eg, patients at risk of complications after PCI, trauma patients, etc.
  • it can be administered as is to patients who have undergone PCI by stent implantation.
  • it is preferably formulated as a drug eluting stent (DES) by coating the stent body.
  • DES drug eluting stent
  • the stent body used in the DES of the present invention is not particularly limited as long as it is conventionally used.
  • a pipe made of metal such as iridium, tungsten, or cobalt alloy is cut into a mesh shape.
  • a superelastic alloy such as nickel titanium is preferable because it needs to be restored to its original shape.
  • stainless steel or the like that does not easily return to its shape after expansion is preferable, and among them, SUS316L having the highest corrosion resistance is preferably used.
  • the size of the stent body can also be appropriately selected according to the application location.
  • the outer diameter before expansion is 1.0 to 3.0 mm and the length is about 5.0 to 50 mm.
  • the biocompatible polymer nanoparticles encapsulating the dsRNA of the present invention can be coated on the stent body by, for example, the method described in Japanese Patent No. 4272721 and Japanese Patent No. 4340744.
  • a method of attaching the nanoparticles a method of physically attaching the nanoparticles to the stent body by immersion in a nanoparticle suspension or mist coating may be used.
  • the stent body when using nanoparticles whose surface is positively charged with cationic particles, the stent body can be coated firmly and uniformly by electrically attaching the nanoparticles.
  • an electrophoresis method in which a stent body is energized in a suspension of biocompatible nanoparticles as a negative electrode, and a spray method in which biocompatible nanoparticle-containing droplets are attached to a negatively charged stent surface.
  • a single-stranded nucleic acid in which a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (first sequence) and its complementary sequence (second sequence) are linked via a hairpin loop part A nucleic acid in which the first sequence has a shape of a double-stranded structure with the second sequence by taking a hairpin loop type structure is also a preferred embodiment of the nucleic acid of the present invention.
  • DES of the present invention The thus obtained stent coated with biocompatible polymer nanoparticles encapsulating the dsRNA of the present invention (DES of the present invention) was used for blood vessels, trachea, esophagus in the same manner as DES conventionally used. It is used to maintain an open state by being placed in a stenosis site or an occlusion site generated in a lumen such as the urethra.
  • the DES of the present invention efficiently and continuously expresses miR-126 in the cells of the vessel wall for a long period of time by slowly releasing the precursor of miR-126 having both endothelial cell regeneration and anti-inflammatory effects from the stent placement site. Can be made.
  • the DES of the present invention reduces the risk of complications such as restenosis and late stent thrombosis, which have been a concern in conventional DES, especially when used for stenosis / occlusion of blood vessels including coronary arteries. can do.
  • the amount (dose) of dsRNA mounted on the DES of the present invention varies depending on the purpose of administration, the administration method, and the situation (gender, age, weight, etc.) of the administration subject, When administered, the amount of dsRNA is usually preferably 1 pmol / kg or more and 10 nmol / kg or less.
  • the agent for preventing complications after stent placement of the present invention is safely administered to mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, monkeys, etc.).
  • mammals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, monkeys, etc.
  • Trauma treatment agent The biocompatible polymer nanoparticles encapsulating the dsRNA of the present invention promote angiogenesis through vascular endothelial cell regeneration. Can promote healing of trauma.
  • the nanoparticles can be administered topically to patients with trauma, as in suspension, or in powder form and redispersed for use.
  • the biocompatible polymer nanoparticles in which the dsRNA of the present invention is encapsulated can be administered by injecting locally into the trauma in a suspension state, but can also be used by being contained in a skin adhesive base.
  • the skin adhesive base is not particularly limited as long as it can contact the skin surface and introduce the active ingredient, miR-126 precursor, into the vascular endothelial cells at the wound site.
  • semi-solid or solid agents such as ointments, gels, emulsions, suspensions, cataplasms, patches, etc .; bases that can constitute liquids such as lotions and liniments are used. be able to.
  • ointment base fats and oils, waxes, hydrocarbon compounds and the like as hydrophobic bases can be generally used. Specific examples include mineral bases such as yellow petrolatum, white petrolatum, paraffin, liquid paraffin, plastibase, and silicone, and animal and plant bases such as beeswax and animal and vegetable fats and oils.
  • gel base carboxyvinyl polymer, polyvinyl alcohol, hyaluronic acid, chitosan, dextran, pullulan, gelatin, gel base, fat-free ointment, polyethylene glycol and the like as a hydrogel base can be used.
  • Emulsion bases include water / oil bases such as hydrophilic ointments and vanishing creams; oil / water bases such as hydrophilic petrolatum, purified lanolin, aquahole, euthelin, neothelin, hydrolanolin, cold cream, hydrophilic plastibase, etc. Is mentioned.
  • the suspension base include a FAPG base (Fatty alcohol-propylene glycol) in which fine particles such as a lotion agent, stearyl alcohol, cetyl alcohol and the like are suspended in propylene glycol, that is, a liogel base.
  • Examples of bases for poultices include gelatin, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, sodium polyacrylate, kaolin, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, glycerin, propylene glycol, water and the like.
  • Lotions are preparations in which an active ingredient is finely and uniformly dispersed in an aqueous liquid, and there are suspension lotions and emulsion lotions.
  • the suspending agent include gum arabic, sodium alginate, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, bentonine and the like.
  • As the emulsifier sodium lauryl sulfate, sorbitan fatty acid ester and the like can be used.
  • Liniment agents can be classified into oily solution type, alcohol solution type, emulsified type and suspension type.
  • liniment water, ethanol, fatty oil, glycerin, soap, emulsifier, suspending agent, other additives and the like can be used.
  • natural oils eg, almond oil, corn oil, peanut oil, castor oil, olive oil, or derivatives thereof (eg, polyoxyl castor oil)]
  • sheep oil or derivatives thereof, fatty acids and And / or esters eg, stearic acid, oleic acid, isopropyl myristate.
  • the wound treatment agent of the present invention it is preferable to protect or fix the wound treatment agent of the present invention after applying or applying to the application site with an adhesive sheet or a bandage, so that it can be used without soiling clothes or fingers.
  • the therapeutic agent for trauma of the present invention in the form of a patch formed on one side of a sheet-like support because the amount of drug to be administered can be easily adjusted and the sticking operation can be easily performed.
  • the wound healing agent of the present invention in the form of a patch, it is preferable to form an adhesive layer on one side of the support using an adhesive as the main component so as to have adhesiveness. . In order to prevent the adhesive layer from unnecessarily adhering to equipment, containers, etc.
  • the adhesive layer until immediately before application to the skin surface. It is desirable to cover and protect the exposed surface with a release liner. Then, during use, the release liner is peeled to expose the pressure-sensitive adhesive layer, which is then applied to the skin.
  • the pressure-sensitive adhesive contained in the pressure-sensitive adhesive layer is not particularly limited as long as it has adhesiveness at room temperature (about 20 to 30 ° C.) and does not cause fogging when coming into contact with the skin surface.
  • Adhesives are acrylic adhesives, natural rubber adhesives, synthetic rubber adhesives (synthetic isoprene rubber, polyisobutylene, styrene-butadiene rubber, conventionally used as medical adhesives in this technical field. (Styrene-isoprene-styrene rubber), a silicone-based adhesive, a vinyl ester-based adhesive, a vinyl ether-based adhesive, and the like.
  • an acrylic pressure-sensitive adhesive is preferably used because it is easy to control skin irritation, skin adhesiveness, and the like.
  • the amount of dsRNA blended in the trauma therapeutic agent of the present invention is usually 0.5 to 60% by weight, preferably 1 to 30% by weight, based on the total weight of the trauma therapeutic agent.
  • the dose of the therapeutic agent for trauma of the present invention varies depending on the purpose of administration, administration method, and the situation (gender, age, body weight, etc.) of the administration subject, but when locally injecting to the trauma site, the amount of dsRNA is usually 10 ng / mm 2 or more and 1000 ng / mm 2 or less, preferably 100 ng / mm 2 or more and 500 ng / mm 2 or less can be administered every 1-3 days.
  • the dsRNA amount is usually 10 ng / mm 2 or more and 1000 ng / mm 2 or less, preferably 100 ng / mm 2 or more and 500 ng / mm 2 or less. And can be held for 5-10 days.
  • the trauma therapeutic agent of the present invention is safely administered to mammals (eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, monkeys, etc.).
  • mammals eg, humans, rats, mice, guinea pigs, rabbits, sheep, horses, pigs, cows, monkeys, etc.
  • Reference Example 1 Drug Release of DES of the Present Invention Coronary balloon formation (POBA) caused dissection of the intima and media of the rabbit artery and rupture of the inner elastic plate.
  • PLGA nanoparticles encapsulating FITC were prepared by the method described in Japanese Patent No. 4272721 and Japanese Patent No. 4340744, administered to this rabbit, and the release of the drug from the nanoparticles was examined by observing the fluorescence image It was. The results are shown in FIG. It was confirmed that it had good introduction efficiency for blood vessels.
  • Example 1 Preparation of stent coated with dsRNA-encapsulated PLGA nanoparticles Using a DNA / RNA automatic synthesizer, the sense strand and the antisense strand (3rd to 24th nucleotides are phosphorothioated) of miR-126 precursor were synthesized respectively. did.
  • Sense strand 5'-CGGCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGU-3 '(SEQ ID NO: 2)
  • Antisense strand 5'-ACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCG-3 '(SEQ ID NO: 1) Cholesterol was added to the 5 ′ end of the sense strand by a conventional method using 5′-cholesteryl-TEG phosphoramidite.
  • PLGA PLGA-7505 (829-11946), Wako Pure Chemicals
  • dsRNA aqueous polyvinyl alcohol solution
  • pseudo emulsion droplets were formed, and PLGA nanoparticles encapsulating dsRNA were obtained by co-precipitation of PLGA and dsRNA in the emulsion droplets by mutual diffusion of both solvents.
  • the charge of the nanoparticles was controlled and used to electrically adhere to the stent surface.
  • This method is an application of a coating method called elctro-deposition paint.
  • elctro-deposition paint Specifically, dsRNA-encapsulated PLGA nanoparticles at a concentration of 50 mg / mL were suspended in distilled water and electrodeposited onto a stainless steel stent negatively charged with a direct current of 2.0 mA (J Am Coll Cardiol Intv 2009 ; 2: 277-83).
  • Example 2 Verification in an animal model
  • the miR-126-encapsulated nanoparticle-laminated stent and the control RNA-encapsulated nanoparticle-laminated stent were placed on the left and right intestines, respectively. It was placed in the bone artery. After 4 weeks, angiography and optical coherence tomography (OCT) were used to evaluate the neointimal inhibitory effect in the microRNA-126-loaded stent compared with control RNA (Fig. 2, Table 1).
  • OCT optical coherence tomography
  • Example 3 Introduction of encapsulated drug by nanoparticles into vascular endothelial cells
  • fluorescein isothiocyanate FITC
  • FITC-NP fluorescein isothiocyanate
  • FITC uptake into HUVEC cells was observed using a fluorescence microscope.
  • PLGA nanoparticles can efficiently introduce encapsulated drugs into vascular endothelial cells.
  • Example 4 Effect of miR-126 Encapsulated Nanoparticles in Skin Damage Model (1) Administration by Subcutaneous Injection After anesthetizing the mouse, the hair on the back was shaved and the hair was removed with a depilatory agent. A skin defect was created in the exposed mouse skin with a 5 mm biopsy punch. MiR-126-encapsulated nanoparticles prepared in the same manner as in Example 1 were suspended in physiological saline, and 80 ⁇ L per wound (4 ⁇ g of RNA amount) was divided into 4 locations and injected into the defect hole. As a control, nanoparticles encapsulating the same amount of control RNA were used.
  • the skin defect site was protected with tegaderm, and miR-126-encapsulated nanoparticles or control nanoparticles were repeatedly administered every 2 days. From the day after the start of administration, defect holes were photographed every 2 days to evaluate wound healing. The results are shown in FIG. In the miR-126-encapsulated nanoparticle-administered group, the damaged area was significantly smaller than that of the control 5 days after the start of administration, and miR-126 was confirmed to promote wound healing.
  • the DES of the present invention can compensate for the shortcomings of conventional DES and can be co-administered with drugs. It is also possible to exert more desirable functions by combining administration of a plurality of microRNAs.
  • the therapeutic agent for trauma of the present invention can be formulated as an external preparation that can be applied continuously for a long period of time, and can contribute to reducing the burden on the patient in the treatment of trauma.
  • microRNAs are currently considered to be used as therapeutic tools and therapeutic targets in various diseases, and if this research makes it possible to express them locally, it will be safer and more effective. It can be a high treatment.
  • the scope of its application is not limited to cardiovascular diseases, but is expected to be very wide, including areas such as cancer and lifestyle-related diseases.

Abstract

　本発明は、末端にコレステロールが付加された27merの二本鎖RNAであって、dicerにより成熟miR-126を生じる二本鎖RNAが封入された、乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）などの生体適合性ポリマーナノ粒子；該ナノ粒子をステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント；該薬剤溶出型ステントを含有してなる、ステント留置後の合併症リスクが低減された、管、特に血管の狭窄もしくは閉塞の治療剤を提供する。　本発明はまた、前記ナノ粒子をが有してなる外傷治療剤を提供する。

Description

マイクロＲＮＡ封入ナノ粒子及びその医薬用途
　本発明は、マイクロＲＮＡ溶出型ステント及びそれを用いた管腔治療に関する。より詳細には、本発明は、miR-126を封入したナノ粒子を積層してなるステント、並びに該ステントを狭窄部位に留置し、miR-126を徐放させることによる、従来の薬剤溶出型ステント（DES）における重篤な副作用のリスクが低減された血管治療に関する。
　本発明はまた、前記miR-126を封入したナノ粒子を用いた外傷の治療に関する。
　冠動脈インターベンション（PCI）は虚血性心疾患の治療として広く実施されている。当初のバルーン形成術に比べて心事故が減少することから、ステント留置術が広く行われるようになったが、再狭窄やステント血栓症等の合併症が臨床上問題視されている。
　薬剤溶出型ステント（DES）は、平滑筋細胞増殖抑制剤等をステント表面にコーティングして徐放させることで再狭窄を抑制するものであり、DESの出現によって再狭窄の頻度は減少した。再狭窄の原因は、ステント留置後初期の炎症反応と、1-2か月の間に起こる平滑筋細胞増殖による内膜肥厚と考えられており、それらを抑制する目的で、さまざまな薬物放出制御性を付与したDESが提案されている。特に、ステントへの薬剤キャリアとして、表面が正電荷修飾された生体適合性ナノ粒子を用いることにより、負荷電の管壁との親和性を向上させるとともに、親水性の核酸分子をも効率よく封入可能なDESが報告されている（特許文献１、２）。
　しかし、再狭窄のリスクが低減される一方で、ステント血栓症については、従来の金属ステント（BMS）ではあまり見られなかった遅発性又は超遅発性血栓症による急性冠症候群（急性心筋梗塞、不安定狭心症）を発症する症例がDESで認められたことから、新たな懸念材料となっている。その原因としては、DESに用いられる薬剤が、ステント留置後の過剰な平滑筋増殖を抑制する反面、内皮細胞の再生遅延、骨髄由来の内皮前駆細胞の分化抑制、炎症反応の惹起といった副作用を示すことが示唆されている。
　また、ステント血栓症の予防には、抗血小板療法が大きな役割を果たしているが、抗血小板剤の長期内服により高齢者の手術の際に出血の危険性が増えるため、複数の診療科にまたがる問題となっている。第二世代のDESにおいても、従来と同様のLimus系薬剤が用いられているため、内皮細胞の再生遅延と遅発性血栓症は継続する問題となる可能性がある。
　そのため、再狭窄のみならず、遅発性又は超遅発性血栓症の発症リスクが低減された新規なDESの開発が切望されている。
　ところで、ゲノム上にコードされた内在性の20～25塩基程度の非コード（non-coding）RNAとして、マイクロRNA（miRNA, miR）が知られている。マイクロRNAは、ゲノムDNA上のmiRNA遺伝子から、まず数百～数千塩基程度の長さの一次転写物（Primary miRNA, Pri-miRNA）として転写され、次にプロセッシングを受けて約60～70塩基程度のヘアピン構造を有するpre-miRNA（precusor miRNA）となる。その後、核から細胞質へ移動し、さらにプロセッシングを受けて20～25塩基程度の二本鎖成熟miRNAとなる。二本鎖成熟miRNAは、そのうちの一本鎖がRISCと呼ばれるタンパク質と複合体を形成し、標的遺伝子のmRNAに作用することで、標的遺伝子の翻訳を阻害する働きをすることが知られている。マイクロRNAは複数の標的遺伝子を有することから、複数の有用な作用を同時に発揮させることが可能である。従って、マイクロRNAを生体内の局所で安全かつ持続的に発現させることができれば、新規の血管治療法を開発することが可能であると考えられるが、これまでにステント局所からマイクロRNAを徐放化して治療した例はない。
特許第4297221号公報 特許第4340744号公報
　本発明の目的は、再狭窄や遅発性又は超遅発性血栓症等の合併症リスクが低減された新規なDESを提供し、以ってより安全な血管治療手段を提供することにある。
　本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、マイクロRNAを用いて、遅発性血栓症の原因である内皮細胞の再生遅延と炎症反応を同時に改善することを着想し、マイクロRNAとしてmiR-126に着目した。
　miR-126は、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）のシグナル伝達経路の負の調節因子であるSPRED1やPIK3R2の発現を抑制することにより、血管新生作用を示すことが知られている（Dev Cell 15: 272-284 (2008)）。また、miR-126は、内皮細胞への白血球の接着を媒介する血管細胞接着因子1（VCAM1）の発現を抑制することにより、白血球の血管壁への浸潤を抑制し、抗炎症作用を示すことも知られている（Cardiovasc Res 79: 581-588 (2008)）。このように、血管内皮細胞の再生促進作用と抗炎症作用とを併せ持つmiR-126をステントから徐放させることができれば、従来のDESに用いられる薬剤の副作用を回避することができ、重篤な合併症である遅発性血栓症の発症リスクを低減できるものと期待される。しかし、miR-126の当該生理作用を十分に発揮させるためには、ステント留置局所での長期持続的な薬物放出に加え、細胞膜透過性、インターフェロン応答の回避、ヌクレアーゼ抵抗性といった様々な問題をクリアする必要がある。
　そこで、本発明者らは、以下の工夫：
(1) 細胞膜透過性を上昇させるために、miR-126の末端にコレステロールを結合させる。
(2) 内因性のヌクレアーゼ抵抗性にするために、2本鎖合成RNAを用いる。
(3) Dicerの基質となるが、インターフェロン応答やプロテインキナーゼRの活性化を引き起こさないように、miR-126の両端に塩基を付加し、27塩基の2本鎖合成RNAとする。
(4) miR-126のアンチセンス鎖が分解を受けにくいように、ホスホロチオエート化する。
(5) 2本鎖合成RNAが持続的に局所で発現できるように、乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）ナノ粒子に封入させる。
を行った。上記のようにして作製したmiR-126封入PLGAナノ粒子をステントにコーティングして、高脂肪食負荷したウサギの腸骨動脈に留置した。その結果、4週間後、miR-126搭載ステントにおいて、コントロールRNAと比較して有意に新生内膜（平滑筋細胞の増殖）の抑制効果を認めた。
　以上の知見より、本発明者らは、dicer切断により成熟miR-126を生じる27塩基の2本鎖RNAにコレステロールを付加したmiR-126前駆体を生体適合性ポリマーのナノ粒子に封入させた「miRNA-126封入ナノ粒子」をステントにコーティングしてDESとして用いることで、miR-126を血管壁の細胞内で十分に発現させ、所望の内皮細胞再生効果及び抗炎症効果を発揮させて、再狭窄や遅発性又は超遅発性血栓症等の術後合併症のリスクを大いに低減することに成功した。
　さらに、本発明者らは、miR-126は血管内皮細胞再生を介して血管新生を促進することで、皮膚損傷などの外傷の治癒効果を有するのではないかとの発想の下、miRNA-126封入ナノ粒子をマウスの皮膚損傷部位に局所投与した。その結果、miRNA-126封入ナノ粒子は皮膚損傷の治癒を促進することが明らかとなった。
　このように、本発明者らは、miRNA-126封入ナノ粒子がDESにおける副作用低減のみならず、外傷治癒にも有用であることを見出して、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は以下のとおりである。
［１］末端にコレステロールが付加された27merの二本鎖RNAであって、dicerにより成熟miR-126を生じる二本鎖RNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子。
［２］生体適合性ポリマーが乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）である、［１］記載のナノ粒子。
［３］成熟miR-126のアンチセンス鎖がホスホロチオエート化されている、［１］又は［２］記載のナノ粒子。
［４］［１］～［３］のいずれかに記載のナノ粒子を有効成分とする、血管内皮細胞再生促進剤。
［５］ステント留置後の合併症予防用である、［４］記載の剤。
［６］［１］～［３］のいずれかに記載のナノ粒子をステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント。
［７］［６］記載の薬剤溶出型ステントを含有してなる、ステント留置後の合併症リスクが低減された、管の狭窄もしくは閉塞の治療剤。
［８］管が血管である、［７］記載の治療剤。
［９］外傷の治療用である、［４］記載の剤。
　本発明によれば、ステント留置局所から溶出したナノ粒子に封入されたmiR-126前駆体が管壁の細胞に効率よく取り込まれ、インターフェロン応答を回避しつつ細胞内で成熟miR-126を発現するので、miR-126の内皮細胞再生作用と抗炎症作用により、平滑筋細胞の増殖や炎症反応が抑制され、再狭窄や遅発性血栓症等の合併症のリスクが顕著に低減される。
　また、外傷部位に局所投与されたmiR-126封入ナノ粒子は、外傷の治癒を促進するので、該miR-126封入ナノ粒子を有効成分とする貼付剤は、ナノ粒子の徐放効果と核酸修飾による安定化効果により、外傷治癒効果が長期間持続するので、頻繁に貼り替える必要がなく、患者の負担を軽減できる。
PLGAナノ粒子による薬剤の導入効果を示す図である。冠動脈バルーン形成術（POBA）による内膜と中膜の解離及び内弾性板の断裂に対し、蛍光マーカーFITCを封入したPLGAナノ粒子を投与した後、蛍光像を観察し薬剤（FITC）の導入効率を確認した。 miR-126封入PLGAナノ粒子でコーティングしたステントの治療効果を示す図である。高脂肪食負荷したウサギの右腸骨動脈にmiR-126搭載ステントを、左腸骨動脈にコントロールRNA搭載ステントをそれぞれ留置し、留置直後（左パネル）と4週間後（右パネル）に血管造影を行った。 PLGAナノ粒子によるヒト臍帯静脈内皮細胞へのFITCの導入を示す図である。 皮膚損傷マウスモデルにおけるmiR-126封入PLGAナノ粒子（miR-126 NP）の皮下注射の効果を示す図である。Ａは、miR-126 NP及びコントロールナノ粒子を皮下注射した直後（Day0）と5日後（Day5）における創傷部位の写真である。Ｂは、創傷部位の面積の経時変化を示す。 皮膚損傷マウスモデルにおけるmiR-126封入PLGAナノ粒子（miR-126NP）のハイドロゲルを用いた投与の効果を示す図である。Ａは、miR-126 NP及びコントロールナノ粒子を塗布した直後（Day0）と2日おき（Days 2, 4, 6, 8）に記録した創傷部位の写真である。Ｂは、創傷の閉鎖率の経時変化を示す。
　本発明は、miR-126前駆体を封入した生体適合性ポリマーナノ粒子（単に「miR-126封入ナノ粒子」、ともいう）、及びそれをステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント（「本発明のDES」ともいう）を提供する。本発明のDESは、（１）薬剤としての二本鎖RNA（dsRNA）、（２）生体適合性ポリマーからなるナノ粒子及び（３）ステント本体から構成される。
（１）二本鎖RNA（dsRNA）
　本発明に用いられるdsRNAは、27merのRNA二重鎖からなる。RNA二重鎖とは、センス鎖とアンチセンス鎖とが相補的な対合をなしている部分を意味し、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の3’末端に塩基対を形成しない、1-2ヌクレオチドのオーバーハングを含むことを許容する。好ましくは、該二本鎖RNAは、オーバーハングを有しない（平滑末端の）27merのRNA二重鎖で構成される。
　本発明のdsRNAは、dicerにより成熟miR-126を生じるものであれば特に制限されない。ここで「成熟miR-126」とは、アンチセンス鎖（pre-miRNAヘアピン構造において3’側のステムを形成する鎖）が、5’-ACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCG-3’（配列番号１）と同一もしくは実質的に同一の塩基配列中の連続する21-22塩基の部分塩基配列からなり、センス鎖（pre-miRNAヘアピン構造において5’側のステムを形成する鎖）が、該アンチセンス鎖と相補的もしくは実質的に相補的な21-22塩基の配列からなるdsRNAである。Dicerによる切断は正確さを欠く場合があり、切断点に1ないし2塩基のずれが生じることがあるが、好ましくは、成熟miR-126は、配列番号１で表される塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列と同一もしくは実質的に同一なアンチセンス鎖配列と、該アンチセンス鎖該列と相補的もしくは実質的に相補的なセンス鎖配列とからなる。
　ここで「実質的に同一の塩基配列」とは、細胞内の生理的条件下で、miR-126のアンチセンス鎖（miR-126-3pともいう）の標的mRNA（例、SPRED1、PIK3R2、VCAM1等）に特異的にハイブリダイズし、かつ該mRNAからのタンパク質の翻訳を阻害し得る塩基配列をいう。具体的には、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性を有する塩基配列、あるいは、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）において1もしく2個の塩基が他の塩基で置換された配列が挙げられる。
　また、アンチセンス鎖と「実質的に相補的」とは、センス鎖とアンチセンス鎖とが二本鎖RNAを形成した際に、dicerによって正しく認識されて21-22塩基の成熟二本鎖RNAにプロセッシングされ、かつインターフェロン応答の惹起やヌクレアーゼ抵抗性の低下等の望ましくない影響を及ぼさない程度にアンチセンス鎖に対して相補的であることを意味する。具体的には、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）と80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の相補性を有する塩基配列、あるいは、配列番号１で表される塩基配列（又は該塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）において1もしく2個の塩基が非相補的である塩基配列が挙げられる。
　より好ましくは、本発明のdsRNAは、配列番号１で表される27merの塩基配列からなるアンチセンス鎖と、それと完全相補的な27merの塩基配列（5’-CGGCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGU-3’(配列番号２)）からなるセンス鎖とが対形成したものである。
　本発明のdsRNAは、リボヌクレオチドの重合体であるRNAの他、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体であってもよい。ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等があげられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子あってもよいが、例えばRNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーをあげるため、細胞透過性をあげるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
　ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等があげられる。
　糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2’-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
　2’-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2’-OH基がH、OR、R、R’OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1～6のアルキルであり、R’はアルキレン、好ましくは炭素数1～6のアルキレンである)から選択される置換基で置換されたヌクレオチド、好ましくは2’-OH基がH、Fまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチド、より好ましくは2’-OH基がFまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドがあげられる。また、2’-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-Dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)etoxy 基および2-cyanoetoxy 基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等もあげられる。
　糖部修飾ヌクレオチドとしては、糖部に架橋構造を導入することにより2つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)があげられ、具体的には、2’位の酸素原子と4’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックト人工核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)、エチレン架橋構造型人工核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)]等があげられ、さらにペプチド核酸(PNA)[Acc. Chem. Res., 32, 624 (1999)]、オキシペプチド核酸(OPNA)[J. Am. Chem. Soc., 123, 4653 (2001)]、ペプチドリボ核酸(PRNA)[J. Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)]等もあげられる。
　リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等があげられる。
　好ましくは、本発明のdsRNAは、少なくとも成熟miR-126のアンチセンス鎖（即ち、配列番号１で表される塩基配列中塩基番号3-24で示される部分塩基配列）を構成するヌクレオチドのリン酸ジエステル結合がヌクレアーゼ抵抗性の高い他の結合、好ましくはホスホロチオエート結合に置換されたものである。
　塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1～6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2～6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1～6のアルキル基、炭素数1～6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものがあげられる。
　本発明のdsRNAには、細胞膜との相互作用を高めたり、dsRNAの取込みを増大せしめる目的で、脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性物質が付加されている。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。脂質は、dsRNAのいずれかの鎖の3'端または5'端に付着させることができるが、dicer切断により成熟miR-126二本鎖DNAから除去されるように設計できる。本発明では、目的のmRNAの翻訳を阻害するのはアンチセンス鎖（miR-126-3p）であるため、コレステロール等の脂質はセンス鎖に付加することがより好ましい。コレステロール等の脂質は、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介してdsRNAに付着させることができうる。
　好ましい一実施態様において、本発明のdsRNAは、下記構造式で表される化合物である。式中、Sはリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明のdsRNAを製造する方法としては、特に限定されず、公知の化学合成を用いる方法、あるいは、酵素的転写法等があげられる。公知の化学合成を用いる方法として、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、CEM法[Nucleic AcidResearch, 35, 3287 (2007)]等をあげることができ、例えば、ABI3900ハイスループット核酸合成機(アプライドバイオシステムズ社製)により合成することができる。合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護および目的物の精製等を行う。精製により、純度90%以上、好ましくは95%以上の核酸を得るのが望ましい。合成および精製したセンス鎖、アンチセンス鎖を適当な比率、例えば、アンチセンス鎖1当量に対して、センス鎖0.1～10当量、好ましくは0.5～2当量、より好ましくは0.9～1.1当量、さらに好ましくは等モル量で混合した後、アニーリングを行って用いてもよいし、または、混合したものをアニーリングする工程を省いて直接用いてもよい。アニーリングは、二本鎖を形成できる条件であればいかなる条件で行ってもよいが、通常、センス鎖、アンチセンス鎖をほぼ等モル量で混合した後、94℃程度で5分程度加熱したのち、室温まで徐冷することにより行われる。本発明のdsRNAを製造する酵素的転写法としては、目的の塩基配列を有したプラスミドまたはDNAを鋳型としてファージRNAポリメラーゼ、例えば、T7、T3、またはSP6RNAポリメラーゼを用いた転写による方法があげられる。
　コレステロールは、例えば、市販の5’-コレステリル-トリエチレングリコール（TEG）ホスホロアミダイト（例えば、Glen Research社製）を用いて、合成したセンス鎖又はアンチセンス鎖の5’末端に付加することができる。あるいは、市販の3’-コレステリル-TEG CPG（例えば、Glen Research社製）を用いて、合成したセンス鎖又はアンチセンス鎖の3’末端に付加することができる。
（２）生体適合性ポリマーからなるナノ粒子
　上記本発明のdsRNAを封入させるナノ粒子を構成する生体適合性ポリマーとしては、従来薬剤溶出型ステント（DES）に使用されてきたポリブチルメタクリレート、ポエチレンビニルアセテート、トリブロック共重合体ポリマー、ホスホコリンポリマー、フッ化ポリマー等、さらには、ポリエチレン、ポリプロピレンのようなポリアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテルおよびポリビニルエステルのようなポリビニル化合物、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンテレフタレート、アクリル酸とメタクリル酸とのポリマー、セルロースおよび他の多糖類、ならびにペプチドまたはタンパク質、あるいはそれらのコポリマーまたは混合物等を用いることもできるが、これらは非生体吸収性であるため、血管壁に残存する。ポリマーの残存はフィブリンの沈着、アレルギー反応、炎症の惹起・慢性化、遅発性又は超遅発性（包括的に晩期という場合がある）ステント血栓症の発症を引き起こすおそれがあると考えられているので、より安全性の高い生体内分解性ポリマーの使用が望ましい。そのような生体内分解性ポリマーとしては、ポリ乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ乳酸（PLA）、ポリアスパラギン酸、アスパラギン酸・乳酸共重合体（PAL）やアスパラギン酸・乳酸・グリコール酸共重合体（PALG）などが挙げられるが、好ましくはPLGAである。
　PLGAの分子量は、5,000～200,000の範囲内であることが好ましく、15,000～25,000の範囲内であることがより好ましい。乳酸とグリコール酸との組成比は1:99～99:1であればよいが、乳酸1に対しグリコール酸酸0.333であることが好ましい。また、乳酸およびグリコール酸の含有量が25重量%～65重量%の範囲内であるPLGAは、非晶質であり且つアセトン等の有機溶媒に可溶であるから、好適に使用される。
　PLGAに封入される本発明のdsRNAは親水性であるため、封入を容易にするためにPLGA表面をポリエチレングリコール（PEG）で修飾し、dsRNAとの親和性を向上させておくこともできる。
　本発明のdsRNAを封入させた生体適合性ポリマーのナノ粒子は、例えば、特許第4297221号公報及び特許第4340744号公報に記載の方法により製造することができる。具体的には、球形晶析法（Eur J Pharm Biopharm 45: 41-48 (1998)）を用いて、生体適合性ポリマーのナノ粒子の内部に本発明dsRNAを封入することにより製造される。球形晶析法は高剪断力を発生しない粒子調製法であるため、外部応力に弱いdsRNAを封入する場合に、特に好適に用いることができる。
　球形晶析法の中でも、エマルジョン溶媒拡散（ESD）法が好ましく用いられ得る。ESD法では、生体適合性ポリマーを溶解できる良溶媒と、該ポリマーを溶解しない貧溶媒とを用い、良溶媒中に生体適合性ポリマーを溶解後、この該ポリマーが析出しないように、本発明のdsRNA溶液を良溶媒中へ添加混合する。この混合液を、貧溶媒中に攪拌下、滴下すると、混合液中の良溶媒（有機溶媒）が貧溶媒中へ急速に拡散移行する。その結果、貧溶媒中で良溶媒の自己乳化が起き、サブミクロンサイズの良溶媒のエマルジョン滴が形成される。さらに、良溶媒と貧溶媒の相互拡散により、エマルジョン内から有機溶媒が貧溶媒へと継続的に拡散していくので、エマルジョン滴内の生体適合性ポリマー及びdsRNAの溶解度が低下し、最終的に、dsRNAを包含した球形結晶粒子の生体適合性ポリマーナノスフェアが生成する。良溶媒及び貧溶媒は、生体適合性ポリマーの種類に応じて適宜選択することができる。良溶媒としては、ハロゲン化アルカン類、アセトン、メタノール、エタノール、エチルアセテート、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン等が挙げられるが、例えば環境や人体に対する悪影響が少ないアセトン、若しくはアセトンとエタノールの混合液が好適に用いられる。一方、貧溶媒としては、水、或いは界面活性剤を添加した水が挙げられる。例えば、界面活性剤としてポリビニルアルコールを添加したポリビニルアルコール水溶液が好適に用いられる。ポリビニルアルコール以外の界面活性剤としては、レシチン、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられる。
　dsRNAは、水溶液中で負の電荷を持つアニオン分子として存在する。この場合、貧溶媒にカチオン性高分子を添加すると、ナノ粒子内部へのdsRNAの封入率を高めることができる。通常、封入される生理活性物質が親水性（水溶性）の場合、良溶媒中に分散混合した生理活性物質が貧溶媒中に漏出、溶解してしまい、ナノ粒子を形成する高分子だけが沈積するため、生理活性物質がほとんど封入されないが、カチオン性高分子を貧溶媒中に添加すると、ナノ粒子表面に吸着したカチオン性高分子がエマルション滴表面に存在するアニオン性薬物と相互作用し、貧溶媒中へのアニオン性薬物の漏出を抑制できるものと考えられる。
　カチオン性高分子としては、キトサン及びキトサン誘導体、セルロースに複数のカチオン基を結合させたカチオン化セルロース、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等のポリアミノ化合物、ポリオルニチン、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリビニルイミダゾール、ポリビニルピリジニウムクロリド、アルキルアミノメタクリレート４級塩重合物（ＤＡＭ）、アルキルアミノメタクリレート４級塩・アクリルアミド共重合物（ＤＡＡ）等が挙げられるが、特にキトサン或いはその誘導体が好適に用いられる。
　得られたナノ粒子の懸濁液をそのまま、或いは必要に応じて良溶媒である有機溶媒を減圧留去し、さらに必要に応じて凍結乾燥等によりナノ粒子を一旦粉末化させた後、再度水に分散させて次のナノ粒子付着工程に用いる。ナノ粒子を一旦粉末化する場合、結合剤（例えばトレハロース等）と共に再分散可能な凝集粒子に複合化して複合粒子としてもよい。
　こうして得られる生体適合性ナノ粒子は、1,000nm未満の平均粒子径を有する。好ましくはナノ粒子の直径は、数10～数100nmである。
　本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子は、上記のような懸濁液の状態で、あるいは粉末化し、用時再分散させて、血管内皮細胞再生促進剤として、血管内皮細胞の再生を必要とする対象（例、PCI後の合併症リスクのある患者、外傷患者等）に対して、そのまま、あるいは使用目的に応じて適切な剤形に調製した後、投与することができる。
　例えば、ステント留置後の合併症（例えば、再狭窄、晩期ステント血栓症、それによる急性冠症候群）の予防剤として用いる場合、ステント植え込みによるPCIを実施した患者にそのままの状態で投与することもできるが、好ましくは、ステント本体にコーティングすることにより、薬剤溶出型ステント（DES）として製剤化される。
（３）ステント本体
　本発明のDESに使用されるステント本体は、従来より使用されているものであれば特に制限はなく、ステンレス、マグネシウム、タンタル、チタン、ニッケル－チタン合金、インコネル、金、プラチナ、イリジウム、タングステン、コバルト系合金等の金属製のパイプを、網目状に切削したもの等が用いられる。ステントが自己拡張タイプの場合、元の形状への復元性が必要なことからニッケルチタン等の超弾性合金等が好ましい。一方、バルーン拡張タイプの場合、拡張後の形状復帰の起こりにくいステンレス等が好ましく、中でも最も耐腐食性に優れたＳＵＳ３１６Ｌが好適に用いられる。ステント本体の大きさも適用箇所に応じて適宜選択することができる。例えば、心臓の冠状動脈に用いる場合は、通常、拡張前における外径は1.0～3.0mm、長さは5.0～50mm程度が好ましい。
　本発明のdsRNAを封入させた生体適合性ポリマーのナノ粒子は、例えば、特許第4297221号公報及び特許第4340744号公報に記載の方法により、ステント本体にコーティングすることができる。ナノ粒子を付着させる方法としては、ナノ粒子懸濁液への浸漬やミストコート等によりナノ粒子をステント本体に物理的に付着させる方法を用いても良い。
　上述のように、ナノ粒子表面がカチオン粒子により正に帯電したナノ粒子を用いる場合、ナノ粒子を電気的に付着させることによりステント本体に強固且つ均一にコーティング可能となる。例えば、生体適合性ナノ粒子の懸濁液中でステント本体を負極として通電する電気泳動法と、負に帯電させたステント表面に生体適合性ナノ粒子含有液滴を付着させる噴霧法が挙げられる。
　また、ヘアピンループ部分を介して、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖核酸であって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２本鎖構造状の形状を有する核酸も本発明の核酸の好ましい態様の１つである。
　このようにして得られた、本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子でコーティングしたステント（本発明のDES）は、従来使用されているDESと同様にして、血管、気管、食道、尿道等の管腔に生じた狭窄部位、閉塞部位に留置することにより、その開放状態を維持するのに用いられる。本発明のDESは、内皮細胞再生作用及び抗炎症作用を併せ持つmiR-126の前駆体を、ステント留置局所から徐放することにより、管壁の細胞で効率よくmiR-126を長期持続的に発現させることができる。従って、本発明のDESは、特に冠動脈をはじめとする血管の狭窄・閉塞に対して用いることにより、従来のDESにおいて懸念材料となっている再狭窄や晩期ステント血栓症などの合併症リスクを低減することができる。
　本発明のDESに搭載されるdsRNAの量（投与量）は、投与の目的、投与方法、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、成人の血管内に留置して局所投与する場合、通常、dsRNA量として1pmol/kg以上10nmol/kg以下が望ましい。
　本発明のステント留置後の合併症予防剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル等）に対して安全に投与される。
（４）外傷治療剤
　また、本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子は、血管内皮細胞再生を介して血管新生を促進するので、外傷部位に局所投与することにより、血管新生を介して外傷の治癒を促進することができる。
　該ナノ粒子は、DESに用いる場合と同様に、懸濁液の状態で、あるいは粉末化し、用時再分散させて、外傷を有する患者に局所投与することができる。
　本発明のdsRNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子は、懸濁液の状態のまま、外傷局所に注射することにより投与することもできるが、皮膚接着基剤に含有させて用いることもできる。
　皮膚接着基剤としては、皮膚面に接触して活性成分であるmiR-126前駆体を外傷部位の血管内皮細胞に導入することができるものであれば特に限定されない。具体的には、軟膏剤、ゲル剤、乳剤、懸濁剤、パップ剤、貼付剤等の半固形剤や固形剤；ローション剤、リニメント剤等の液剤を構成することが可能な基剤を用いることができる。
　軟膏基剤としては、一般に疎水性基剤としての油脂類、ロウ、炭化水素化合物等を用いることができる。具体的には、黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、流動パラフィン、プラスチベース、シリコーン等の鉱物性基剤、ミツロウ、動植物性油脂等の動植物性基剤等が挙げられる。
　ゲル基剤としては、ハイドロゲル基剤としてのカルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸、キトサン、デキストラン、プルラン、ゼラチン、ゲルベース、無脂肪性軟膏、ポリエチレングリコール等を用いることができる。
　乳剤用基剤としては、親水軟膏、バニシングクリーム等の水／油型基剤；親水ワセリン、精製ラノリン、アクアホール、オイセリン、ネオセリン、加水ラノリン、コールドクリーム、親水プラスチベース等の油／水型基剤が挙げられる。
　懸濁用基剤としては、ローション剤、ステアリルアルコール、セチルアルコール等の微粒子をプロピレングリコール中に懸濁させたＦＡＰＧ基剤（Fatty alcohol-propylene glycol）、すなわちリオゲル基剤等が挙げられる。
　パップ剤用基剤としては、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリアクリル酸ナトリウム、カオリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、グリセリン、プロピレングリコール、水等が挙げられる。
　ローション剤としては、活性成分を水性の液中に微細に均質分散した製剤であり、懸濁性ローション剤と、乳濁性ローション剤とがある。懸濁化剤としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ベントナイン等が挙げられる。乳化剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、ソルビタン脂肪酸エステル等を用いることができる。
　リニメント剤は、油性溶液型、アルコール溶液型、乳化型及び懸濁型に分類することができる。リニメント剤には、水、エタノール、脂肪油、グリセリン、セッケン、乳化剤、懸濁化剤、その他添加剤等を用いることができ、例えば、硬パラフィン、軟パラフィン、液パラフィン、グリセリン、パラフィン油、蜜蝋、金属石鹸；粘液（mucilage）；天然油［例：アーモンド油、コーン油、ピーナッツ油、ヒマシ油、オリーブ油、またはそれらの誘導体（例えば、ポリオキシルヒマシ油）］；羊脂若しくはその誘導体、脂肪酸及び／又はエステル（例：ステアリン酸、オレイン酸、ミリスチン酸イソプロピル）が挙げられる。
　また、本発明の外傷治療剤は、適用部位へ貼付又は塗布した後、これを粘着シートや包帯等で保護、固定することが好ましく、これにより衣服や手指を汚すことなく使用できる。また、本発明の外傷治療剤をシート状の支持体の片面に形成した貼付剤の形態で使用すると、投与すべき薬物量を調整しやすく、貼付操作も簡便に行うことができるため好ましい。なお、本発明の外傷治療剤を貼付剤の形態で使用する場合には、粘着性を有するように、その主成分に粘着剤を用いて支持体の片面に粘着剤層を形成すると好適である。また、製造、運搬又は保存中に粘着剤層が、いたずらに器具、容器等に接着することを防止するために、また製剤の劣化を防止するために、皮膚面へ貼付する直前まで粘着剤層の露出面を剥離ライナーで被覆、保護することが望ましい。そして、使用時に剥離ライナーを剥離して粘着剤層を露出させ、皮膚に貼付して投与する。
　粘着剤層に含まれる粘着剤としては、常温（２０～３０℃程度）で粘着性を有し、皮膚面に接した際にカブレ等を生じなければ特に限定されるものではない。粘着剤は、当該技術分野において医療用の粘着剤として従来から用いられている、アクリル系粘着剤、天然ゴム系粘着剤、合成ゴム系粘着剤（合成イソプレンゴム、ポリイソブチレン、スチレン－ブタジエンゴム、スチレン－イソプレン－スチレンゴム）、シリコーン系粘着剤、ビニルエステル系粘着剤、ビニルエーテル系粘着剤等で構成されることが好ましい。これらの粘着剤の中でも、皮膚刺激性、皮膚接着性等の制御が容易である点から、アクリル系粘着剤を用いることが好ましい。
　本発明の外傷治療剤に配合されるdsRNAの量は、外傷治療剤の全重量を基準として通常０．５～６０重量％、好ましくは１～３０重量％である。
　本発明の外傷治療剤の投与量は、投与の目的、投与方法、投与対象者の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、外傷部位に局所注射する場合、通常、dsRNA量として10ng/mm2以上1000ng/mm2以下、好ましくは100ng/mm2以上500ng/mm2以下を、1-3日毎に投与することができる。また、ハイドロゲル基材にナノ粒子を含浸させて外傷部位に塗布する場合、通常、dsRNA量として10ng/mm2以上1000ng/mm2以下、好ましくは100ng/mm2以上500ng/mm2以下を塗布し、5-10日間保持することができる。
　本発明の外傷治療剤は、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル等）に対して安全に投与される。
　以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例になんら限定されるものではない。
参考例１　本発明のDESの薬剤放出性
　冠動脈バルーン形成術（POBA）によりウサギ動脈の内膜と中膜の解離及び内弾性板の断裂を生じさせた。特許第4297221号公報及び特許第4340744号公報に記載の方法によりFITCを封入したPLGAナノ粒子を作製して、このウサギに投与し、蛍光像を観察してナノ粒子からの薬物の放出性を調べた。結果を図１に示す。血管に対して良好な導入効率を有していることを確認した。
実施例１　dsRNA封入PLGAナノ粒子でコーティングしたステントの作製
　DNA/RNA自動合成機を用いて、miR-126前駆体のセンス鎖及びアンチセンス鎖（3～24番目のヌクレオチドはホスホロチオエート化）をそれぞれ合成した。
センス鎖：　　　5’-CGGCGCAUUAUUACUCACGGUACGAGU-3’(配列番号２)
アンチセンス鎖：5’-ACUCGUACCGUGAGUAAUAAUGCGCCG-3’(配列番号１)
　5’-コレステリル-TEGホスホロアミダイトを用いて、常法により、センス鎖の5’末端にコレステロールを付加した。センス鎖とアンチセンス鎖とをアニーリングさせ、さらに凍結乾燥してdsRNAを調製した。
　PLGAナノ粒子への封入は、水中エマルション溶媒拡散法にて実施した。具体的には、PLGA（PLGA-7505（829-11946）・和光純薬）と上記dsRNAをアセトン/エタノール混合液に溶解し、これをポリビニルアルコール水溶液中に滴下し、エマルション界面での自己乳化作用により擬似的なエマルション滴を形成させ、さらに両溶媒の相互拡散によりエマルション滴内でPLGAとdsRNAを共沈させてマトリックス化することにより、dsRNAが封入されたPLGAナノ粒子を得た。
　ナノ粒子の電荷を制御し，これを用いてステント表面に電気的に接着した。この方法は電着塗装（elctro-deposition paint）という塗装方法を応用したものである。具体的には50mg/mLの濃度でdsRNA封入PLGAナノ粒子を蒸留水に懸濁し、2.0mAの直流電流で陰性に荷電させたステンレススチール製のステントに電着させた (J Am Coll Cardiol Intv 2009;2:277-83)。
実施例２　動物モデルでの検証
　高脂肪食（ピーナッツオイル5%+コレステロール 1%）を負荷したウサギに対し、miR-126封入ナノ粒子積層ステントおよびコントロールRNA封入ナノ粒子積層ステントを、それぞれ左右の腸骨動脈に留置した。4週間後、血管造影および光コヒーレンストモグラフィー（OCT）を用いて評価したところ、マイクロRNA-126搭載ステントにおいて、コントロールRNAと比較して、有意に新生内膜の抑制効果を認めた（図２、表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例３　血管内皮細胞へのナノ粒子による封入薬剤の導入
　実施例１に記載の方法に準じて、PLGAナノ粒子にフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を封入した（FITC-NP）。FITC-NPを0.05重量%の濃度となるように添加したDMEM培地500μLを含む24-wellプレートに、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を1x104細胞播種し、37℃、5%CO2の条件下で1日間インキュベートした後、蛍光顕微鏡を用いてHUVEC細胞内へのFITCの取り込みを観察した。対照として、薬剤未封入のPLGAナノ粒子を添加した培地で、HUVECを同様にインキュベートしたものを用いた。結果を図３に示す。
　PLGAナノ粒子は、封入した薬剤を血管内皮細胞内に効率よく導入し得ることが確認された。
実施例４　皮膚損傷モデルにおけるmiR-126封入ナノ粒子の効果
（１）皮下注射による投与
　マウスを麻酔後、背中の毛を剃り除毛剤で毛を除いた。露出したマウスの皮膚に、5mm biopsy punchで皮膚欠損を作製した。実施例１と同様にして調製したmiR-126封入ナノ粒子を生理食塩水に懸濁し、1つの傷あたり80μL(RNA量として4μg)を4箇所に分けて欠損孔内に注射した。コントロールとして同量のコントロールRNAを封入したナノ粒子を使用した。皮膚欠損部位をテガダームで保護し、2日おきにmiR-126封入ナノ粒子又はコントロールナノ粒子を反復投与した。投与開始翌日から、2日おきに欠損孔を撮影し、創傷治癒を評価した。結果を図４に示す。
　miR-126封入ナノ粒子投与群では、投与開始5日後にコントロールに比べて顕著に損傷面積が小さくなっており、miR-126による外傷治癒促進効果が確認された。
（２）ハイドロゲルを用いた投与
　マウスを麻酔後、背中の毛を剃り除毛剤で毛を除いた。露出したマウスの皮膚に、5mm biopsy punchで皮膚欠損を作製した。実施例１と同様の方法により調製したmiR-126封入ナノ粒子を生理食塩水に懸濁し、該懸濁液20μL(RNA 4μg相当)を30% F-127 pluronic gel (Sigma) 4℃に混ぜた。このハイドロゲル製剤を創傷部位に塗布し、8日間塗布を続けた。コントロールとして、スクランブルRNAを封入したナノ粒子をゲルに混ぜて、反対側に塗布した。2日おきに創傷の治癒過程を記録した。結果を図５に示す。
　miR-126封入ナノ粒子投与群では、コントロールに比べて顕著に損傷部位の閉鎖が早く進み、ハイドロゲル基材を用いた場合にも、miR-126による外傷治癒促進効果が確認された。
　ここで述べられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
本出願は、それぞれ2014年3月7日付で日本国に出願された特願2014-44463を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。
　本発明のDESは、従来のDESの欠点を補うことができる上、薬剤との同時投与も可能である。また複数のマイクロRNAの投与を組みあわせることによって、より望ましい機能を発揮させることも可能である。
　また、本発明の外傷治療剤は、長期間持続塗布可能な外用剤として製剤化することができ、外傷の治療における患者の負担軽減に寄与し得る。
　さらに、マイクロRNAは現在さまざまの疾患において治療のためのツールや治療標的として応用が考えられており、本研究によって、持続的に局所で発現させることが可能となれば、さらに安全で有効性の高い治療となりうる。また、その応用範囲は循環器疾患にとどまらず、癌・生活習慣病などの領域も含め、大変広いと推察されるため、分野を越えた多くの知財を生み出す可能性がある。

Claims (9)

  1. 　末端にコレステロールが付加された27merの二本鎖RNAであって、dicerにより成熟miR-126を生じる二本鎖RNAが封入された生体適合性ポリマーナノ粒子。
  2. 　生体適合性ポリマーが乳酸・グリコール酸共重合体（PLGA）である、請求項１記載のナノ粒子。
  3. 　成熟miR-126のアンチセンス鎖がホスホロチオエート化されている、請求項１又は２記載のナノ粒子。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のナノ粒子を有効成分とする、血管内皮細胞再生促進剤。
  5. 　ステント留置後の合併症予防用である、請求項４記載の剤。
  6. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のナノ粒子をステント本体にコーティングしてなる、薬剤溶出型ステント。
  7. 　請求項５記載の薬剤溶出型ステントを含有してなる、ステント留置後の合併症リスクが低減された、管の狭窄もしくは閉塞の治療剤。
  8. 　管が血管である、請求項７記載の治療剤。
  9. 　外傷の治療用である、請求項４記載の剤。
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