KR101559131B1

KR101559131B1 - ｍｉＲＮＡ를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물

Info

Publication number: KR101559131B1
Application number: KR1020130140091A
Authority: KR
Inventors: 권희충; 김은숙; 송지영
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2013-11-18
Filing date: 2013-11-18
Publication date: 2015-10-07
Also published as: US20150141486A1; KR20150057139A; US9175288B2

Abstract

본 발명은 miR-499b-5p를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다.

Description

ｍｉＲＮＡ를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물{Composition comprising miRNA for enhancing radiation sensitivity}

본 발명은 miRNA를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 ATM 발현 조절을 통해 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는, miR-499b-5p 및 그의 방사선 병용 치료제로서의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 교육과학기술부의 기초연구사업(일반연구자 지원사업)의 일환으로 수행한 연구로부터 도출된 것이다.

[과제명: p53 표적 방사선 치료 증진 miRNA 개발]

고형 종양의 일종인 유방암과 폐암은 다방법 병합치료(multimodality therapy)에도 불구하고, 암 관련 사망의 주된 요인으로 추정되고 있다. 방사선 치료는 고형 종양 환자에 시술되는 보편적 치료 방법으로, 고형 종양 환자가 방사선 치료를 받는 암환자의 40 내지 60%를 차지한다. 그러나 이러한 고형 종양은 방사선에 의한 암세포 사멸 효능을 저하시키는 방사선 저항성(radioresistance)을 나타낸다고 알려져 있다. 따라서, 효과적인 항암 치료를 위해 방사선 조사에 의한 암세포의 사멸을 증대시킬 수 있는 방사선 민감제의 개발이 필수적으로 요구된다.

miRNA(microRNA)는 세포 내에서 발현되는 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 이루어진 길이의 매우 작은 단일가닥 RNA로, 인간에는 수백 종류 이상의 miRNA가 존재하며, 유전자의 발현을 조절함으로써 발생, 성장, 노화, 사멸 등의 생명 현상에 관여하는 것으로 알려져 있다. 정상 조직과 암 조직에서 특이적 miRNA의 발현 양상으로 인하여, miRNA의 암 치료에 있어 예측 표지자로서의 유용성이 주목받고 있다. 또한 miR-21은 종양 억제 유전자를 표적으로 작용하여 종양의 성장과 침윤, 및 전이에 중요한 역할을 함으로써 종양 발생의 병태생리학적 기전을 매개한다고 알려져 있다.

방사선 조사(Ionizing radiation; IR)는 궁극적으로 세포 내 DNA 손상을 일으켜 세포 사멸을 초래한다. IR에 의한 세포 내 이중나선의 파괴 (double strand break; DSB)는 DNA 손상 반응(DNA damage response, DDR) 신호 전달을 유도하고, 이러한 DDR 신호 전달의 역할은 DNA 수선 (DNA repair)을 위한 세포 주기 정지 (cell cycle arrest) 또는 과도한 DNA 파괴로 인한 세포사(apoptosis)를 결정하는 것으로 알려져 있다. 이미 DDR 신호 전달 체계에 관련된 주요 유전자를 표적으로 하는 miRNA가 보고되어, 방사선에 의한 DDR 신호 전달 체계에서 miRNA의 새로운 역할이 주목받고 있다. 지속적으로 새로운 인간 miRNA가 밝혀지고 있고, 방사선 민감성을 증진시키면서, 부작용은 최소화하여 효과적으로 방사선 치료법과 병용할 수 있는 치료 물질에 대한 요구가 높아지고 있다.

이에 본 발명자들은 DDR 신호 전달 체계의 주요 유전자에 작용하여 방사선 병용 치료제로 사용될 수 있는 miRNA에 대한 연구를 수행하여, 방사선 저항성 암세포에서 방사선 민감성을 증가시키는 활성을 갖는 miRNA를 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 miR-499b-5p를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, miR-499b-5p를 투여하는 단계 및 방사선 요법을 적용하는 단계를 포함하는, 방사선 저항성 암을 치료하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태에 따라, 서열번호 1의 miR-499b-5p를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물이 제공된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "방사선 민감성 증진"은 방사선 저항성을 갖는 세포의 방사선 민감성을 높여서 방사선 요법의 치료 효과를 상승시키는 조성물을 의미하며, 방사선 병용 치료를 위해 이용된다. 암세포의 방사선 민감성이 증진되면, 방사선 요법에 의한 암세포의 살상 및 증식 억제 효과가 증가된다.

마이크로 RNA는 세포 내에서 대부분 염색체의 인트론 등에 존재하며 RNA 폴리머라아제 II에 의해 일차 miRNA(primary miRNA)로 전사된 후, 핵 내에서 RNase III인 드로샤(Drosha)와 파샤(Pasha) 등에 의해 전구체 miRNA(precursor miRNA)로 절단된다. 그 후, 전구체 miRNA는 엑스포틴-5(Exportin-5)에 의해 핵에서 세포질로 이동되고, 세포질 내에서 RNase III인 다이서(Dicer)에 의해 약 22bp 정도 길이의 불완전한 이중가닥 miRNA가 된다. 이 miRNA가 RISC (RNA interference silencing complex)와 결합하여 단일 가닥으로 분리되며, 분리된 단일가닥의 miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR(untranslated region)의 염기서열에 상보적으로 결합하여 리보솜에 의해 mRNA가 단백질로 번역되는 과정을 억제하거나 또는 표적 mRNA가 분해되도록 하여 유전자의 발현을 억제하는 것으로 알려져 있다(Nature, 425(6956):415-9, 2003; Nature, 432(7014):235-40, 2004; 및 Trends Cell Biol., 17:118-126, 2007)

miR-499b-5p는 DDR 신호 전달 체계에서 주요 유전자인 p53 프로모터 영역에 존재하는 p53 특이적 결합 부위를 12회 반복하는 서열과 리포터 유전자인 루시퍼라아제를 포함하는 DNA를 안정적으로 발현하는 인간 대장암 세포주 HCT116p53-LUC를 이용한 스크리닝에서 방사선 조사에 의해 증가된 p53 활성을 저하시키는 miRNA로 선별되었다.

대장암 세포주 HCT116 p53 (wild-type)에서, miR-499b-5p의 과발현은 암 세포 내 p53 유전자의 단백질 발현 수준을 저하시키며, 6 Gy 방사선 조사 후, 대조군 miRNA에 비해 암 세포의 방사선 민감도를 향상시키는 것으로 확인되었다. 또한, miR-499b-5p에 존재하는 6개의 염기서열 (CAGAAU)이 방사선에 유도되는 DNA 손상기전과 복구기전에 관여하는 주요 분자인 ATM의 3'UTR (175번 내지 181번 GUCUUAA:Human ATM NM_000051 3' UTR length: 3591 기준)에 결합하는 부분이라는 것을 TargetScan 분석 프로그램(http://www.targetscan.org)을 통해 확인하였다.

따라서, miR-499b-5p는 방사선 저항성이 강한 암세포의 방사선 민감성을 증진시킴으로써 암세포의 방사선 치료 시 방사선 민감성 증진제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

miR-499b-5p는 ATM의 3'-UTR에 결합하는 것에 의해 ATM 단백질의 발현 수준을 크게 저하시키고, 이에 의해 방사선 민감성을 증진시킨다.

본 발명의 일 구체예에서, miR-499b-5p는 서열번호 1(유전자 등록번호: MIMAT0019897, 서열: ACAGACUUGCUGUGAUGUUCA)이 바람직하나 이에 한정되지 않으며, 상기 염기서열에 80% 이상 상동성을 갖는 서열도 사용할 수 있다. miR-499b-5p는 18 내지 25개, 또는 그 이상의 뉴클레오티드로 이루어진 길이일 수 있으며, 서열번호 1의 염기 서열이 결실, 치환, 또는 삽입에 의해 변형되었으나, miR-499b-5p와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 조성물은 암의 방사선 민감성을 증진시키기 위해 이용된다.

본 발명의 miRNA-499-5p는 세포 내에서 ATM에 결합하여, p53의 발현을 억제하는 것에 의해 방사선 저항성 암세포의 방사선 저항성을 낮추어 방사선에 대한 민감성을 증진시킨다. 본 발명의 miRNA-499-5p를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 방사선 치료를 적용할 수 있는 모든 세포에 적용이 가능하며, 특히 암세포의 방사선 민감성을 증진시키는 데 이용하는 것이 바람직하다.

miR-499b-5p는 방사선 저항성이 강한 대장암, 유방암, 폐암 등의 세포에서 과발현시 방사선 민감성을 증진시키는 것으로 확인되었다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 자궁암, 전립선암, 뇌종양, 및 림프종으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 miR-499b-5p는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터에 포함되어 제공되거나 또는 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다. 발현 벡터는 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.

본 발명의 miRNA는 다양한 형질전환 기술을 이용하여 세포 내로 도입시킬 수 있는데, 이를 위해 세포 내로의 효율적인 도입을 가능하게 하는 전달체 내에 포함된 형태일 수 있다. 상기 전달체는 바람직하게는 벡터이며, 바이러스 벡터 및 비바이러스 벡터 모두 사용 가능하다. 바이러스 벡터(viral vector)로서 예를 들면, 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipox virus) 벡터 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 렌티바이러스 벡터이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 렌티바이러스는 레트로바이러스의 일종으로 핵공(nucleopore)이나 완전한 핵막으로의 능동 도입을 가능하게 하는 사전-통합 복합체(바이러스 쉘(shell))의 친핵성으로 인해 분열 세포 뿐만 아니라 미분열 세포도 감염시킬 수 있는 특징이 있다.

본 발명의 miRNA는 세포 내로 도입시켜 암세포의 방사선 민감성을 증진시킬 수 있는데, 여기서 "도입"은 형질감염(transfection) 또는 형질도입(transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시키는 것을 의미한다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당해 기술 분야에서 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 또는 바이러스 벡터 입자를 사용하여 세포 내로 유전자를 전달시키는 것을 의미한다.

본 발명의 miRNA-499-5p를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 담체와 함께 제제화될 수 있다.

본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 miRNA-499-5p 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물은 이를 유효성분으로 포함하는 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 경구용 또는 비경구용 제형으로 제조할 수 있으며, 투여의 용이성과 투여량의 균일화를 위해 단위 투여 형태로 제형화할 수 있다. 본 발명의 조성물의 제형은 구강(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 국소(topical), 피하, 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral) 투여에 적당한 것 또는 흡입(inhalation) 또는 주입(insufflation)에 의한 투여에 적당한 형태를 포함한다.

본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물은 주사용 제형으로 제조되어 방사선 치료가 적용될 종양 부위에 주사하거나 또는 겔 조성물 또는 경피전달용 조성물의 제형으로 제조되어 종양 부위에 직접 도포하거나 부착시켜서 투여될 수 있고, 좌제 제형이나, 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 제형으로 투여될 수 있다. 주사용 제형으로 제제화하기 위해서 본 발명의 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 좌제로 주입하기 위해서는, 코코아버터 또는 다른 글리세라이드 등 통상의 좌약 베이스를 포함하는 좌약 또는 체료 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화할 수 있다. 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 miR-499b-5p를 포함하는 방사선 민감성 조성물을 투여하는 단계 및 방사선 요법을 적용하는 단계를 포함하는, 방사선 저항성 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, miRNA-499-5p의 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체에 의한 운반을 포함한다. 본 발명의 조성물이 암세포 내로 도입되면, ATM의 발현을 저해함으로써, 방사선 민감성을 증진시키게 된다.

본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 경피, 비측내, 흡입, 안구 내 또는 피내경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 바람직하게는 해당 조직에 국소 투여한다.

본 발명의 방사선 저항성 암을 치료하는 방법은 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 상기 치료적 유효량은 방사선에 대해 암세포 내의 종양의 민감성을 효과적으로 증진시키는 양을 의미한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 주치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 방출율, 치료기간, 및 조사되는 방사선량을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 방사선 민감성 증진용 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다. 또한, 경우에 따라, 본 발명의 방사선 민감성 증진용 조성물과 함께 공지의 항암제를 병용 투여하여 방사선 치료 효과를 포함한 항암 효과를 증대시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 방사선 저항성 암을 치료하는 방법은 miR-499b-5p의 투여에 의한 ATM 발현 저하로 인해 방사선 민감성이 증진될 수 있는 대상에 적용가능하며, 이 대상은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 동물을 포함한다.

본 발명의 방사선 저항성 암을 치료하는 방법은 암세포에 본 발명의 조성물을 투여하고, 방사선을 조사하는 것을 포함하는데, 여기서 "방사선 조사"란 이온화 방사선, 특히, 특별하게는 오늘날 통상 사용하고 있는 선형 가속기(linear accelerators) 또는 방사핵종(radionuclides)에 의해 방사된 감마 방사선을 의미한다. 방사핵종에 의한 종양에의 방사선 요법은 외부적 또는 내부적으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, miR-499b-5p를 포함하는 조성물의 투여는 방사선 요법을 적용하기 전에, 바람직하게는, 방사선 요법의 적용 1개월 전, 특히 10일 또는 1주일 전에 개시한다. 또한, 방사선 요법의 적용시, 최초 방사선 조사 시점과 최후 방사선 조사 시점 사이에 본 발명의 방사선 민감성 조성물의 투여를 지속하는 것이 유리할 수 있다.

투여되는 miRNA-499-5p의 양, 방사선 조사량 및 방사선 조사의 빈도는 암의 종류, 암의 위치, 화학 요법 또는 방사선 요법에 대한 환자의 반응과 같은 일련의 요소에 따라 결정된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 그에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 miR-499b-5p는 방사선 저항성 암세포에서 ATM 유전자의 발현을 억제하는 것에 의해 방사선 민감성을 증진시키므로, 방사선 병용 치료제로서 사용되어 방사선 요법의 치료 효과를 크게 증진시킬 수 있다.

도 1은 방사선 민감성 증진 활성을 갖는 miRNA를 선별하기 위한, 대장암 세포주, HCT116p53-LUC를 이용한 miRNA 라이브러리의 스크리닝을 보여주는 모식도이다.
도 2는 HCT116p53-LUC 세포에서 방사선 조사 후, miRNA 과발현에 따른 p53 루시퍼라아제 활성을 보여준다.
도 3은 HCT116p53-LUC 세포에서 방사선 조사 후, miRNA 과발현에 따른 p53 단백질 발현 수준을 보여준다. 상단은 웨스턴 블롯의 결과이며, 하단은 p53 단백질의 단백질 발현 수준을 나타내는 그래프이다.
도 4는 HCT116p53-LUC 세포에서 방사선 조사 후, miRNA 과발현에 따른 p53 mRNA 발현 수준을 보여준다.
도 5는 HCT116p53 야생형 세포에서 방사선 조사 후, miRNA의 과발현에 의한 방사선 민감도를 보여준다.
도 6은 생물공학적정보 분석 검사(bioinformatic analysis, TargetScan)를 통해 확인된, 방사선 특이적 miR-499b-5p의 표적 유전자, ATM의 3' UTR에 결합하는 염기서열을 보여준다.
도 7은 MCF-7 세포에서 miR-499b-5p 과발현에 의한 세포 내 ATM mRNA 발현 수준을 확인하기 위한 실시간 PCR의 결과를 보여준다. miR-499b-5p의 과발현은 ATM mRNA의 발현에는 유의성 있는 변화를 초래하지 않았다.
도 8은 MCF-7, H460, 및 HCT116 세포에서 miR-499b-5p 과발현에 의한 ATM 단백질 수준의 변화를 보여준다. 우측의 Low intensity로 표시된 사진은 MCF-7 세포주에서의 ATM 발현 수준을 감광 시간을 짧게 하여 관찰한 것이다.
도 9는 MCF-7 세포에서 miR-499b-5p 과발현에 의한 방사선 민감도의 증가를 보여준다.
도 10은 MCF-7 세포에서 miR-499b-5p 과발현의 세포 증식에 대한 영향을 보여준다.

실시예 1. 인간의 대장암 세포주 HCT116p53 - 루시퍼라아제를 이용한 방사선 민감성 증진 활성을 갖는 miRNA 의 대량 고속 스크리닝

1-1. 세포 배양

인간의 대장암 세포주 HCT116p53-루시퍼라아제(HCT116p53-LUC), HCT116p53 야생형, 유방암 세포주 MCF-7, 폐암 세포주 H460를 각각 5% CO₂가 공급되는 항온 항습기 (humidified chamber)에서 10% 우 태아혈청 (fetal bovine serum; FBS) 및 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 술페이트를 포함하는 RPMI-1640(LM011-01, 주식회사 웰진) 또는 DMEM(LM001-05, 주식회사 웰진)에서 37℃로 배양하였다.

대장암 세포주 HCT116p53-루시퍼라아제(HCT116p53-LUC)는 p53 발현량의 증가를 용이하게 검출하기 위해 p53 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 p53 특이적 결합 부위 12개가 연결된 서열을 루시퍼라아제 분석에 사용하는 벡터에 삽입하고, 이 벡터를 p53이 야생형인 인간 대장암 세포주인 HCT116에 형질감염에 의해 도입하여 제조하였다. 요약하면, HCT116 세포들을 제조사의 설명서에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)을 이용하여 p53-Luc 리포터 벡터로 형질감염시키고, 안정적으로 형질감염된 세포주들을 G418(1mg/ml)을 함유하는 배지를 이용하여 선별하였다(The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 44(2012)1214-1222).

p53은 정상적인 조건에서는 낮은 발현 수준을 유지하고, 단수명의 단백질이나, 방사선 조사나 항암제 등의 스트레스에 의해 발현량이 증가하고 안정화되고, DNA 손상 신호 전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. HCT116p53-루시퍼라아제는 p53 발현량 증가에 비례하여 루시퍼라아제 활성을 나타내는 것을 확인하고, 방사선 민감성 증진 활성을 갖는 miRNA의 선별을 위해 이용하였다.

1-2. 방사선 조사

이온화 방사선 조사 (ionizing radiation; IR)를 위해, Gammacell 3000 Elan 방사선 조사장치 (irradiator)([137Cs] γ-ray source; MDS Nordin, 캐나다)를 이용하여 감마 이온화 방사선을 조사하였다.

1-3. p53 - 루시퍼라아제 활성을 통한 방사선 민감성 증진 miRNA 선별

miRNA의 발현에 의한 방사선 민감성에 대한 효과를 확인하기 위해, 인간 대장암 세포주 HCT116p53-루시퍼라아제에 G-펙틴(G-fectin)(Genolution, 한국)을 이용하여 miRNA를 다음과 같이 형질감염(transfection)시키고, 방사선 조사에 따른 p53 발현, 즉, 루시퍼라아제 활성에 대한 효과를 조사하였다.

선별(screening)은 p53, 세포 증식 및 세포 주기와 관련된 문헌에 기초하여 선정한 539개의 miRNA(Genolution Pharmaceuticals Inc.) 라이브러리를 대상으로 수행했다.

먼저, 96 웰 플레이트의 각 웰에 각각의 miRNA (10 nM)와 1 ㎕의 G-펙틴을 넣고, 총 부피가 10 ㎕가 되도록 OPTI-MEM (Invitrogen, 미국)을 첨가하고 상온에서 방치하였다. 10분 경과 후, HCT116p53-루시퍼라아제를 2x10⁴ 세포/90 ㎕/웰로 96 웰 플레이트에 첨가했다. 형질감염 24시간 경과 후, 방사선 조사를 하지 않은 대조군과 방사선 조사(6 Gy, 8 시간)를 한 처리군의 세포들을 대상으로 Luciferase reporter assay kit (BioVison)를 사용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 도 1은 p53-루시퍼라아제 활성 측정에 의한 miRNA 선별 과정의 모식도를 보여준다.

총 539개 인간 miRNA의 라이브러리를 대상으로 루시퍼라아제 활성을 3회 반복 측정하여, 대조군(miRNA 불포함 대조군 처리 후, IR 조사) 대비, 방사선 조사시 루시퍼라아제 활성의 저하를 나타내는 4종의 miRNA를 선별하였다. 도 2는 방사선 조사 후 측정된 루시퍼라아제 활성을 보여준다. miRNA 불포함 군(Mock)과 비교하여 선별된 4종의 miRNA 처리군에서 방사선 조사 후 루시퍼라아제 활성의 감소를 보여준다. Mock 군은 miRNA를 넣지 않은 것을 제외하고는 처리군과 동일하게 준비되었다.

실시예 2. 선별된 miRNA 의 과발현에 따른 p53 유전자의 mRNA 및 단백질 발현에 대한 효과

2-1. 선별된 4종의 miRNA 과발현에 의한 p53 단백질 발현 저하

실시예 1에서 선별된 4 종의 miRNA를 대상으로 세포 내 p53 단백질 발현 수준 변화를 확인하기 위해 인간 대장암 세포주 HCT116(p53 야생형을 가짐)에 miRNA를 형질감염시키고 p53 발현의 변화를 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다.

HCT116 (p53 야생형) 세포를 6 웰 플레이트 중 하나의 웰에 4x10⁵ 세포로 형질감염 하루 전 날 준비하였다. 하나의 튜브에 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 10 ㎕ 와 OPTI-MEM 250 ㎕를 담고, 또 다른 하나의 튜브에 100 nM의 miRNA와 총 부피가 250 ㎕ 되도록 OPTI-MEM을 첨가한 후 상온에서 방치하였다. 상온 방치 5분 후, 두 개의 튜브를 섞어 다시 상온에서 20분간 방치하고 전날 미리 준비해 놓은 세포에 첨가하였다. 24시간 경과 후, 세포를 떼어 이등분하고 다음날 방사선을 조사하였다. 방사선 조사 (6 Gy) 8시간 후, Proprep-protein extraction solution (Intron Biotechnology, PROPREP^TM protein extraction buffer)을 이용하여, 세포 단백질을 추출하고 Bradford assay(Bio-Rad)를 이용하여 단백질을 정량하였다. SDS-PAGE에 의해 분리시킨 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 니트로셀룰로오스 막을 0.05% TBST(mixture of Tris-Buffered Saline and Tween 20) 중 5% 탈지유 용액으로 블럭킹시켰다. 그 후, 1차 항체 (항-p53 (Santa Cruz Biotechnology), 항-ATM (Epitomics), 항-GAPDH (Cell Signaling), 및 항-β-액틴(Sigma))를 첨가하고 4℃에서 하루 밤 동안 반응시키고, 0.05% TBST 용액으로 막을 세척하였다. 2차 항체(염소-항-마우스 Ig-HRP 또는 염소-항-토끼-HRP, Santa Cruz Biotehcnolgy)를 첨가하여, 상온에서 1시간 반응시키고, 0.05% TBST 용액으로 막을 세척하였다. 그 후, EZ-Western detection kit (DOGEN, DAEILLAB SERVICE)를 이용하여 X-선 필름을 감광시키는 것에 의해 형광발색 반응을 검출했다.

도 3에 표시된 바와 같이, miRNA 불포함 군(Mock)과 비교하여 선별된 4종의 miRNA 처리군에서 p53의 단백질 발현 수준이 50% 이하로 저하되었으며, 방사선 조사 후에도 선별된 miRNA 처리에 의한 p53 발현 저하는 계속 유지되는 것을 확인하였다. 이 결과는 선별된 miRNA가 p53 단백질의 발현을 효과적으로 저하시킨다는 것을 보여준다.

2-2. 실시간 PCR ( Real - time PCR )을 이용한 p53 mRNA 발현 조사

실시예 2-1에서 확인된, 선별된 miRNA에 의한 p53 단백질 발현 저하가 p53 mRNA의 발현 저하에 의한 것인지 확인하고자 다음과 같이 실시간 PCR을 수행하였다.

인간의 대장암 세포주에 miRNA (100 nM)를 실시예 2-1과 동일한 방법으로 형질감염시킨 후, RNeasy mini kit (QIAGen, 미국)를 이용하여 총 RNA를 추출하고 총 1 ㎍의 RNA를 주형으로 PrimeScript RT Master Mix (Takara, 일본) 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR은 qPCR SYBR Green 2X Master mix kit (m. Biotech, 한국)를 이용하여 수행했고, 사용된 프라이머 염기 서열은 다음과 같다.

p53 정방향 프라이머: CTGCCTTCCGGGTCACTGCC (서열번호 2),

p53 역방향 프라이머: TTGGGACGGCAAGGGGGACA (서열번호 3),

GAPDH 정방향 프라이머: CCGTCTAGAAAAACCTGCC (서열번호 4),

GAPDH 역방향 프라이머: GCCAAATTCGTTGTCATACC(서열번호 5).

도 4는 방사선 조사가 없는 경우 및 방사선 조사를 수행한 경우의 p53 mRNA의 발현 수준을 보여준다. 실시예 1에서 선별된 4 종의 miRNA 과발현에 의한 세포 내 p53의 miRNA의 발현 수준에는 유의성 있는 변화가 없었다. 따라서 선별된 miRNA는 p53의 전사조절 (transcriptional regulation)이 아닌 해독 조절(translational regulation) 기전을 통해 p53의 발현을 저하시킴을 확인하였다.

2-3. HCT116p53 (야생형)을 이용한 방사선 민감성 조사

인간 대장암 세포주를 대상으로 실시예 1에서 선별된 miRNA 과발현에 의한 암세포의 방사선 민감도를 조사하기 위해 콜로니형성능 분석(clonogenic assay)을 수행하였다. 실시예 2-1과 동일한 방법으로 4종의 miRNA를 인간 대장암 세포주 HCT116p53에 형질감염시키고, 24시간 후, 60 mm-디쉬에 각각 100개의 세포 및 2000 개의 세포를 넣고 다음날 방사선을 0 및 6 Gy로 조사하였다. 방사선 조사 10일 경과 후, 0.4% 크리스탈 바이올렛을 이용하여 생성된 콜로니를 염색하고 그 수를 계수하였다.

도 5는 miRNA 발현에 따라 대장암 세포의 방사선에 대한 민감도가 대조군에 비해 유의성 있게 증가한다는 것을 보여준다. 선별된 4개의 miRNA 중 방사선 민감도 증진 효과가 miRNA 9b에서 가장 컸으며, 이 miRNA는 miR-499b-5p로 확인되었다.

실시예 3. 선별된 miRNA 의 표적 분자 규명

실시예 1과 2를 통해 선별된 4종의 miRNA를 대상으로 miRNA 표적(target) 예측 프로그램을 이용한 분석을 수행하였다 (http://www.targetscan.org).

도 6에 도시된 바와 같이, miR-499b-5p의 염기서열이 ATM 유전자의 3' UTR 영역(175번 내지 181번 GUCUUAA:Human ATM NM_000051 3' UTR length: 3591 기준)에 위치하는 6개의 염기서열에 결합하여 ATM 단백질 발현을 조절하는 것으로 확인하였다.

실시예 4. miR -499b-5p 과발현에 의한 ATM 유전자의 mRNA 및 단백질 발현에 대한 효과

방사선 민감성 증진 효과에 의해 선별된 miR-499b-5p에 의한 표적 유전자의 발현에 대한 영향을 조사하기 위해, miR-499b-5p를 인간 유방암 세포주 MCF-7에 형질감염시켰다.

실시예 2-1에서와 동일한 방법으로 MCF-7에 miR-499b-5p (100 nM)를 형질감염시키고, 웨스턴 블롯을 수행하고, 실시예 2-2에서와 동일한 방법으로 하기의 프라이머를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다.

ATM 정방향 프라이머: TGCTGACAATCATCACCAAGTTC (서열번호 6),

ATM 역방향 프라이머: TCTCCCTTCCTGTCCTGGAA (서열번호 7).

그 결과, 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, miR-499b-5p 과발현에 의한 세포 내 ATM mRNA 발현 수준은 크게 영향받지 않았으나, ATM 단백질의 발현 수준은 저하되는 것으로 확인되었다.

또한, 실시예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 여러 암세포를 대상으로 miRNA-499b-5p 과발현에 의한 ATM의 단백질 발현을 조사한 결과, 유방암 세포주 외에, 폐암(H460) 및 대장암 세포주(HCT116)에서 ATM 단백질 발현의 저하를 확인하였다. 그 결과가 도 8에 도시된다.

실시예 5. miR -499b-5p 과발현의 방사선 민감성에 대한 효과

유방암 세포주, MCF-7에 실시예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 유방암 세포의 방사선 민감도를 조사하기 위해 miR-499b-5p를 형질감염시켰다. 형질감염 24 시간 후, 60 mm-디쉬에 각각 100, 200, 400, 1000 개의 세포를 넣고 다음 날 방사선을 0, 1, 2, 5 Gy로 조사하였다. 방사선 조사 10일 경과 후, 0.4% 크리스탈 바이올렛을 이용하여 생성된 콜로니를 염색하고 그 수를 계수하였다.

그 결과, 도 9에서와 같이 대조군 miRNA(miRNA 불포함)와 비교하여 miR-499b-5p 과발현에 의한 방사선 민감도가 2 Gy의 선량에서 차이가 나타나기 시작하였으며, 5 Gy에서 급격한 증가한다는 것을 확인하였다.

실시예 6. miR -499b-5p 과발현의 세포 증식에 대한 효과

miR-499b-5p 과발현에 의한 유방암 세포의 증식 변화를 조사하기 위해 실시 예 2-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 miR-499b-5p를 MCF-7에 형질감염시켰다. 형질감염 후 24 시간 경과시, 96 웰 플레이트의 각 웰에 1x10³ 세포를 첨가하였다. 다음날 방사선 조사 (6 Gy)를 수행하고 방사선 조사일을 시작으로 2일 간격으로 세포의 증식 정도를 EZ-Cytox kit (Daeil Lab Service, 한국)를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 도 10에 표시된 바와 같이, 대조군 miRNA와 miR-499b-5p 과발현에 의한 유방암 세포의 증식에 대한 영향은 큰 차이가 없었다.

따라서, miR-499b-5p는 방사선에 의해 유도되는 DNA 복구 기전 유전자 ATM의 단백질 발현 수준을 저하시킴으로써, 유방암 세포의 방사선 민감성을 향상시킨다는 것을 확인하였다.

<110> Korea Institute of Radiological & Medical Sciences <120> Composition comprising miRNA for enhancing radiation sensitivity <130> PN101892 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 acagacuugc ugugauguuc a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 forward primer <400> 2 ctgccttccg ggtcactgcc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p53 reverse primer <400> 3 ttgggacggc aagggggaca 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 4 ccgtctagaa aaacctgcc 19 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 5 gccaaattcg ttgtcatacc 20 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATM forward primer <400> 6 tgctgacaat catcaccaag ttc 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATM reverse primer <400> 7 tctcccttcc tgtcctggaa 20

Claims

서열번호 1의 miR-499b-5p를 포함하는 방사선 민감성 증진용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 miR-499b-5p는 ATM(Ataxis telangiectasia mutated) 유전자의 3'-UTR(3'-untranslated region)에 결합하여 ATM 발현을 저하시키는 것인 방사선 민감성 증진용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 암의 방사선 민감성을 증진시키기 위한 것인 방사선 민감성 증진용 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 암은 유방암, 대장암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 자궁암, 전립선암, 뇌종양, 및 림프종으로부터 선택되는 것인 방사선 민감성 증진용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 miR-499b-5p는 세포 내 전달을 위한 발현 벡터 중에 존재하는 것인 방사선 민감성 증진용 조성물.