CN109996878A

CN109996878A - 抗癌治疗干预法

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Publication number: CN109996878A
Application number: CN201780049961.3A
Authority: CN
Inventors: 帕特里西奥·索阿雷斯-达-席尔瓦
Original assignee: Fizart Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fizart Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-06-14
Filing date: 2017-06-14
Publication date: 2019-07-09
Also published as: US10590422B2; US20170362598A1; US20200231973A1; WO2017216278A2; JP2019517819A; US11319541B2; EP3469082A2; PT109454A; WO2017216278A3

Abstract

本发明涉及使用干扰RNA双链体介导基因沉默来治疗癌症的方法。本发明还涉及干扰RNA双链体和编码这种干扰RNA双链体的载体。

Description

抗癌治疗干预法

技术领域

本发明涉及使用干扰RNA双链体介导基因沉默来治疗癌症的方法。本发明还涉及干扰RNA双链体和编码这种干扰RNA双链体的载体(vector)。

背景技术

无论肿瘤来源如何，它们都需要持续的营养供应来支持其特有的无减缓生长。事实上，肿瘤细胞可能消耗的营养超过其自身代谢需要所需的营养(Medina et al.,1992b)，并且与其正常细胞对应物相比表现出不同的代谢特征。通过血管生成的共同过程和组成细胞的质膜中营养转运体的惊人表达，向肿瘤提供营养物以供给其代谢的需要。氨基酸是细胞氮的主要来源，用于核苷酸、谷胱甘肽、氨基糖和蛋白质的合成。恶性肿瘤的贪婪和明显浪费的氨基酸代谢导致癌症宿主中的负氮平衡等。此外，除葡萄糖和脂肪酸外，氨基酸的碳骨架通常被用作产生ATP的氧化燃料来源，并且还可能有助于甾醇和脂质的生物合成。(Baggetto,1992；Medina et al.,1992a)。与正常细胞或组织相比，癌细胞显示出增强和改变的氨基酸进入选择代谢途径的通道，其通常与肿瘤的有氧糖酵解特征相一致(Baggetto,1992)和(Mazurek et al.,2003)。实体瘤通常血管化不良，特别是在作为肿瘤形成和转移的特征的初期无血管阶段中，因此它们必须具有提取血浆氨基酸的有效机制以便与宿主组织竞争(Medina et al.,1992b)。反过来，癌症是进化的缩影，“最合适的”细胞通过适应局部微环境而持久生存；结果，具有赋予生长和存活优势的性质的氨基酸转运体被选择，并且通常以与亲体组织相比增加的水平表达。

在哺乳动物氨基酸转运体克隆和分离出现之前，Christensen提出特异性氨基酸转运体可以在转化细胞中上调，以支持生长和增殖所必需的高水平蛋白质合成(Christensen,1990)。在癌症基因组解剖学计划(CGAP)网站(http://cgap.nci.nih.gov)上搜索人类表达序列标签(EST)数据库，使用“cDNA虚拟northern”工具确定经典的中性氨基酸转运“系统”A、ASC、L和N在正常和癌组织中的表达水平显示，虽然五种转运体在癌组织中总体上显著增强，但有两种是突出的，即LAT1(大中性氨基酸转运体1)和ASCT2(ASC氨基酸转运体2)(Fuchs et al.,2005)。ASCT2和LAT1在各种癌组织中(共同地)上调三倍，其中它们的表达模式几乎相同(Fuchs et al.,2005)。

LAT1长期以来与癌细胞或增殖性细胞有关。当1998年首次分离并表征全长LAT1时，显示其在大鼠肝脏中不表达，但在大鼠肝癌(dRLh-84)和肝癌(FAA-HTC1)细胞系中检测到全长LAT1(Kanai et al.,1998)，其与人肝脏中ASCT2的表达模式一致，如下所述。用人细胞系进行Northern印迹分析显示在绒毛膜癌细胞系JEG-3和乳腺癌细胞系MDA-A1(Sang etal.,1995)以及胃印戒细胞癌(KATOIII)、肺小细胞癌(RERF-LC-MA)和恶性黑色素瘤(G-361)中表达TA1(Kanai et al.,1998)。在几种白血病细胞系、RERF-LC-MA肺小细胞癌细胞、HeLa子宫颈癌细胞和T-24膀胱癌细胞中均检测到4F2hc和LAT1(Yanagida et al.,2001)。通过共聚焦免疫荧光显微镜证实了T-24细胞的结果，显示LAT1和4F2hc在质膜中的共定位(Kim et al.,2002)。LAT1和4F2hc也已显示在KB人口腔表皮样癌细胞的质膜中共定位(Yoon et al.，2005)，并且可能对口腔鳞状上皮癌的发生很重要，因为免疫组织化学染色显示在口腔正常粘膜向口腔鳞状细胞癌进展的过程中它们的表达增加(Kim et al.,2004b)。

Kühne等人(Kuhne et al.,2007)公开了LAT1和LAT2基因的遗传多态性，并将这种多态性与美法仑的药代动力学联系起来。Shennan等人(Shennan et al.,2008)公开了抑制LAT1减少人乳腺癌细胞的生长。Nawashiro等人(Nawashiro et al.,2006)公开了LAT1是人星形细胞肿瘤中的潜在分子靶标。Yamauchi等人(Yamauchi et al.,2009)和Kim等人(Kimet al.,2008)公开了LAT1抑制剂用于阻断各种癌细胞的肿瘤活性的用途。在需要4F2hc分子伴侣实现LAT1活性的背景下，实时定量RT-PCR显示KB细胞中LAT1和4F2hc mRNA的水平相似(Yoon et al.,2005)。这与来自T-24细胞的数据相冲突，其中LAT1水平比4F2hc的高约1.5倍(Kim et al.,2002)，而在MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌细胞的结果中，LAT1 mRNA比4F2hc的高4.3至4.9倍(Shennan et al.,2004)。基于(Fuchs et al.,2005)的数据，似乎4F2hc mRNA的总体丰度与LAT1的相当，但应当记住，由于基因表达控制的多种机制，蛋白质和mRNA水平并不总是线性相关。此外，细胞无疑具有足以使两种组分的蛋白质水平匹配的机制，使得4F2hc对于重要的LAT1相关功能不具有限速性。

当将结肠癌RCN-9细胞注入大鼠脾脏时，所得转移性肝肿瘤的大小与LAT1表达直接相关(Ohkame et al.,2001；Tamai et al.,2001)。因此，已经提出抑制LAT1功能可以充当许多类型的癌症的潜在治疗剂(Kanai et al.,2001)。迄今为止，缺乏特别针对LAT1的研究。然而，在非人肝肿瘤细胞中体外LAT1反义表达在5天期间导致细胞数、活力和S期细胞相对于对照而言适度但统计学上显著的降低，尽管在此期间的L型转运没有显著降低(Storeyet al.,2005)。

针对4F2hc的反义寡核苷酸已显示抑制C6-BU-1大鼠胶质瘤细胞中Na⁺非依赖性异亮氨酸转运(Broer et al.,1997)，以及BeWo人细胞滋养层细胞中亮氨酸摄取(Kudo etal.,2004)，但没有报道对细胞生长的影响。抗4F2hc抗体抑制多种肿瘤细胞系的增殖(Yagita et al.,1986)，但这些影响可能是通过对除了LAT1或4F2hc的非转运相关功能以外的其他4F2“轻链”的共同影响来调节的(Feral et al.,2005)。在体外用针对核苷酸1173至1194的LAT1-siRNA敲减T-24细胞中的LAT1导致L-CSNO摄取减少(Li et al.,2005)，但未报道细胞存活是否受影响。因此，有关LAT1“轻链”与癌症生长相关的机制研究仍有待报道。

数个课题组已经公开了使用siRNA抑制LAT1基因表达的用途(Kim et al.,2006a；Kim et al.,2006b；Kaneko et al.,2007；Pinho et al.,2007a；Yin et al.,2008；Kuhneet al.,2009；Nicklin et al.,2009；Xia et al.,2010；Liang et al.,2011；Miko etal.,2011；Ohkawa et al.,2011；Denoyer et al.,2012；Hayashi et al.,2012；Dickenset al.,2013；Hayashi et al.,2013；Youland et al.,2013；Gaccioli et al.,2015；Habermeier et al.,2015；Wongthai et al.,2015；Furugen et al.,2016；Polet et al.,2016；Straka et al.,2016；Tomblin et al.,2016；Wei et al.,2016；Xu et al.,2016；Liu et al.,2017)。

最近，LAT1被认为是下表中列出的癌症类型的癌预后标志物：

系统ASC转运活性是普遍存在的，特征在于其优选小的中性氨基酸，包括丙氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。中性氨基酸转运体(SLC1A4和SLC1A5)的系统ASC属于溶质载体家族-1(solute carrier family-1，SLC1)，其还包括高亲和力谷氨酸转运体。通过人近端小管细胞系HKPT中的RT-PCR和酶限制性分析鉴定人ATB0，并且人ATB0对应于啮齿动物ASCT2。两种ASC转运体显示出不同的底物选择性。SLC1A4编码钠依赖性氨基酸转运体ASCT1，该ASCT1以立体定向方式接受L-丙氨酸、L丝氨酸、L-苏氨酸和L-半胱氨酸。ASCT2是ASC转运系统的第二种同种型，由SLC1A5编码。在肾脏和肠道中，ASCT2分别存在于近端小管细胞和肠细胞的刷状缘膜中。除了典型的系统ASC底物外，它还以较高的亲和力接受L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺以及以较低亲和力接受蛋氨酸、亮氨酸和甘氨酸。ASCT1和ASCT2均介导钠依赖性底物氨基酸的强制性交换(Pinho et al.,2007b)。

最近，ASCT2被认为是下表中列出的癌症类型的癌预后标志物：

ASCT2在结肠直肠腺癌中表达，并且患者存活率随着ASCT2阳性癌细胞百分比的增加而降低。这些结果表明，ASCT2在大量结肠直肠腺癌中表达，并且ASCT2表达与侵袭性生物学行为相关(Witte et al.,2002)。已经提出ASCT2似乎是非恶性和恶性前列腺中谷氨酰胺代谢所必需的。然而，ASCT2阳性前列腺腺癌似乎与更具攻击性的生物学行为有关。ASCT 2似乎与肿瘤进展有关(Li et al.,2003；Wang et al.,2015)。ASCT2表达在肺腺癌转移中起关键作用，并且其是预测术后预后不良的潜在分子标志物(Shimizu et al.,2014)。还发现ASCT2表达在肿瘤细胞生长中起重要作用，并且是用于预测胰腺癌中更差结果的有希望的病理学标志物(Kaira et al.,2015b；Kyoichi et al.,2015)。还发现高ASCT2表达与神经母细胞瘤患者的不良的预后和存活显著相关(Ren et al.,2015)。此外，其他人已经提出ASCT2抑制所发挥出的促凋亡作用超过仅谷氨酰胺饥饿的促凋亡作用(Bryan et al.,2004；Fuchs et al.,2004)。通过shRNA敲减证实了ASCT2在黑色素瘤中表达的重要性，所述shRNA敲减抑制谷氨酰胺摄取、mTORC1信号传导和细胞增殖(Wang et al.,2014)。

数个课题组已经公开了使用siRNA抑制ASCT2基因表达的用途(Wieland et al.,2005；Nicklin et al.,2009；Okudaira et al.,2011；Barel et al.,2012；Hassanein etal.,2013；Hassanein et al.,2015；Corbet et al.,2016；Straka et al.,2016；Zhou etal.,2016；Lee et al.,2017)。

RNA干扰(“RNAi”)是最近发现的转录后基因沉默的机制，其中对应于目的基因(或编码区)的双链RNA被引入生物体中，导致相应mRNA的降解。这种现象最初是在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中发现的(Fire et al.,1998)。

与反义技术不同，在重新获得基因表达之前，RNAi现象对多次细胞分裂持续存在。该过程以至少两个步骤发生：内源核糖核酸酶将较长的dsRNA切割成较短的长度为21、22或23个核苷酸的RNA，其被称作“小干扰RNA”或siRNA(Hannon，2002)。然后siRNA片段介导靶mRNA的降解。RNAi已经以与反义寡核苷酸相似但更有效的方式用于基因功能测定。通过RNAi在RNA水平上进行靶向敲除，而不是在DNA水平上使用常规基因敲除技术，可以快速有效地分析大量基因。因此，RNAi是一种用于分析基因功能的极其强大简单的方法。

已显示RNAi在培养的哺乳动物细胞中有效。在迄今描述的大多数方法中，通过显微注射将双链RNA引入细胞或通过将培养的细胞浸泡在双链RNA溶液中，以及用携带在合适的启动子控制下的发夹结构siRNA表达盒的质粒转染细胞来进行RNAi，所述合适的启动子例如U6、H1或巨细胞病毒(“CMV”)启动子(Elbashir et al.,2001；Harborth et al.,2001；Lee et al.,2001；Brummelkamp et al.,2002；Miyagishi et al.,2002；Paddison etal.,2002；Paul et al.,2002；Sui et al.,2002；Xia et al.,2002；Yu et al.,2002)。通过双链核糖核酸对基因表达的基因特异性抑制一般描述于美国专利第6,506,559号，其通过引用并入本文。siRNA技术的示例性用途在公开的美国专利申请第2003/01090635号和已公布的美国专利申请第20040248174号中进一步描述，其通过引用并入本文。Davis(Davis，2009)描述了使用纳米颗粒技术向人靶向递送siRNA。

发明内容

本发明的一个目的是使用RNA干扰技术来下调LAT1和/或ASCT2基因的表达以治疗或预防癌症。可以通过本发明治疗或预防的优选癌症包括膀胱癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、乳腺癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌和胃癌。本发明的组合物(或分子)包含短干扰核酸分子(siNA)及相关化合物或由短干扰核酸分子(siNA)及相关化合物组成，所述相关化合物包括但不限于siRNA。本发明包括siNA的组合物和使用方法，siNA包括但不限于能够介导RNA干扰的短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、安塔够妙(antagomir)和短发夹RNA(shRNA)。在一个实施例中，本发明的siNA分子可以并入RISC(RNA诱导的沉默复合物)中。

本发明的另一个目的是提供一种siRNA分子，其有效地下调LAT1基因和/或ASCT2基因的表达。

因此，在第一方面，本发明涉及siNA分子，其中所述分子特异性地靶向选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:104或其变体以及SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:297或其变体的至少一个序列。在一个替换实施例中，本发明涉及siNA分子，其中所述分子特异性地靶向与选自SEQID NO:1至SEQ ID NO:104或其变体以及SEQ ID NO:209-SEQ ID NO:207或其变体的至少一个序列互补的至少一个序列。在一个实施例中，本发明涉及分离的siNA分子，优选分离的siRNA分子。

在一个实施例中，siNA分子在引入细胞时降低(优选人)LAT1和/或ASCT2基因的表达。

在一个实施例中，siNA分子特异性地靶向选自SEQ ID No:4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87以及95至104的至少一种序列或其变体。优选地，siNA分子靶向选自SEQ IDNO:6、22、34、58和61或其变体的序列。甚至更优选地，siNA靶向SEQ ID NO:61或58或其变体。优选地，siNA分子在表达到细胞中时降低LAT1基因的表达。

在一个替换实施例中，siNA分子特异性地靶向选自SEQ ID NO:209、216、225、226、228、235至238、245、260、264、267、271、272、278、279以及281至297中的至少一个序列，优选地，siNA分子靶向选自SEQ ID NO:225、237、267或278或其变体的序列。甚至更优选地，siNA靶向SEQ ID NO:267或278或其变体。优选地，siNA分子在表达到细胞中时降低ASCT2基因的表达。

在进一步的实施例中，siNA优选包含双链RNA分子，所述双链RNA分子的反义链与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104中的任一个基本上互补，更优选与SEQ ID No 4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87和95至104中的任一个基本上互补，甚至更优选与SEQ ID NO:6、22、34、58和61中的任一个基本上互补，最优选与SEQ ID NO:61或58或其任何变体中的任一个基本上互补，所述双链RNA分子的有义链将包含与有义链互补的RNA序列，其中两条链通过核苷酸之间的标准碱基配对杂交。在进一步的实施例中，所述有义链包含选自SEQID NO:105至208的序列或由其组成，优选包含选自SEQ ID NO:108、110、114、117、126、138、162、165、185、187、191和199至208的序列或由其组成，更优选包含选自SEQ ID NO:110、126、138、162和165的序列或由其组成，最优选包含选自SEQ ID NO:162或165或其变体的序列或由其组成。相应的反义链在图26中描述。优选地，siNA分子在表达到细胞中时降低LAT1基因的表达。

在一个替换实施例中，siNA优选包含双链RNA分子，所述双链RNA分子的反义链与SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:297中的任一个基本上互补，更优选与SEQ ID NO:209、216、225、226、228、235至238、245、260、264、267、271、272、278、279和281至297中的任一个基本上互补，甚至更优选与SEQ ID NO 225、237、267或278中的任一个基本上互补，最优选地与SEQ ID NO:267或278或其任何变体中的任一个基本上互补，并且双链RNA分子的有义链将包含与有义链互补的RNA序列，其中两条链通过核苷酸之间的标准碱基配对杂交。在进一步的实施例中，所述有义链包含选自SEQ ID NO:298至386的序列或由其组成，优选包含选自SEQ ID NO:298、305、314、315、317、324-327、334、349、353、356、360、361、367、368和370至386的序列或由其组成，更优选包含选自SEQ ID NO:314、326、36和367或其变体的序列或由其组成，甚至更优选包含选自SEQ ID NO:356或367或其任何变体的序列或由其组成。相应的反义链在图27描述。优选地，siNA分子在表达到细胞中时降低ASCT2基因的表达。

在本发明的含义内，与靶mRNA序列“基本上互补”，也可以理解为与所述靶序列“基本上相同”。如本领域普通技术人员已知的“同一性”是通过匹配序列之间核苷酸的顺序和同一性而确定的核苷酸序列之间的序列相关性程度。在一个实施例中，若siRNA的反义链具有与靶mRNA序列的80％、以及80％至100％之间的互补性，例如85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或99％的互补性，则该siRNA的反义链被认为是基本上互补的并且可以用于本发明。互补百分比描述了第一核酸分子中的连续核苷酸的百分比，其可以沃森-克里克方式与第二核酸分子中的一组连续核苷酸碱基配对。

当例如siNA分子选择性地降低或抑制基因的表达时，根据本发明的siNA“靶向”基因。本文所用的短语“选择性地降低或抑制”包括影响LAT1和/或ASCT2表达的siNA。可供选择地，当siNA在严格条件下与基因转录物即其mRNA杂交时，siNA靶向基因。能够在“严格条件下”杂交意味着在标准条件(例如倾向于不利于杂交的高温和/或低盐含量)下退火至靶mRNA区。合适的方案(涉及0.1×SSC，68℃下2小时)描述于Maniatis,T.,et al.,分子克隆:实验指南,冷泉港实验室,1982,第387-389页中。

除非另有说明，否则本文引用的核酸序列以5'至3'方向书写。术语“核酸”是指DNA或RNA或其修饰形式，包括存在于DNA中的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”)或存在于RNA中的嘌呤或嘧啶碱基(腺嘌呤“A”、胞嘧啶“C”、鸟嘌呤“G”、尿嘧啶“U”)。本文提供的干扰RNA可以包含“T”碱基，例如在3'末端，即使“T”碱基不天然存在于RNA中。在一些情况下，这些碱基可以以“dT”表示以区分存在于核糖核苷酸链中的脱氧核糖核苷酸。

在本发明的一个实施例中，siNA分子的长度为40个碱基对或更少。优选地，siNA分子的长度为19至25个碱基对。在一个实施例中，siNA包含21个核苷酸的双链区或由21个核苷酸的双链区组成。优选地，siNA具有有义链和反义链。在一个替换实施例中，siNA分子包含19个核苷酸的双链区或由19个核苷酸的双链区组成。在一个实施例中，siNA具有平末端。在一个替换实施例中，siNA具有5'和/或3'突出端。优选地，突出端是1至5个核苷酸，更优选为2个核苷酸的突出端。突出端可以是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

在一个实施例中，根据本发明的siNA分子包含化学修饰。优选地，化学修饰在有义链、反义链或两者上。化学修饰的实例包括硫代磷酸酯核苷酸间连接、2'-O甲基化、2'-脱氧-氟核糖核苷酸、2'-脱氧核糖核苷酸、5-C甲基核苷酸、反式脱氧碱基残基并入或用脱氧胸苷核苷酸取代尿嘧啶核糖核苷酸或其组合。

在一个实施例中，5'或3'突出端是二核苷酸，优选胸苷二核苷酸。在优选的实施例中，5'或3'突出端是脱氧胸苷。在一个实施例中，有义链包含至少一个，优选两个3'突出端。优选地，所述有义链包含至少一个，优选两个3'脱氧胸苷。在一个替代实施例中，反义链包含至少一个，优选两个3'突出端。优选地，所述有义链包含至少一个，优选两个3'脱氧胸苷。在进一步优选的实施例中，有义链和反义链均包含如本文所述的3'突出端。

在进一步的实施例中，siNA分子优选包含双链RNA分子，其中优选地，有义链和反义链选自以下或其变体。

本文所用的“变体”是指与非变体核酸序列或核糖核酸序列具有25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的总体序列同一性的序列。

“下调”是指LAT1和/或ASCT2的表达与对照的水平相比降低多达或超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％。可供选择地，本文描述的siNA分子可以消除LAT1和/或ASCT2表达。术语“消除”意指检测不到LAT1和/或ASCT2的表达或不产生功能性LAT1和/或ASCT2蛋白。例如，至少LAT1和/或ASCT2表达的表达和/或蛋白质水平的降低可以是蛋白质和/或核酸水平的量度，并且可以通过本领域技术人员已知的任何技术测量，例如但不限于任何形式的凝胶电泳或色谱(例如HPLC)。

值得注意的是，在一些实施例中，siNA分子(5'或3'链或两者)可以以至少一个，优选两个丙氨酸核苷酸开始。可供选择地，如果靶序列以一个或两个丙氨酸序列开始，则这些丙氨酸序列可能不被包括(被靶向)在siNA分子中。

在一个实施例中，靶序列可以以以下为特征：序列3'末端的至少一个，优选两个丙氨酸核苷酸，和/或靶序列在序列5'末端缺少至少一个，优选两个丙氨酸核苷酸，和/或靶序列在序列内缺少两个连续的丙氨酸核苷酸。在优选的实施例中，本发明的siNA分子以它们靶向具有上述性质的序列为特征。

在一个实施例中，使用多个种类的siNA分子，其中所述多种siNA分子靶向相同或不同的mRNA种类。

在一个实施例中，siNA选自dsRNA、siRNA或shRNA。优选地，siNA是siRNA。

在进一步的实施例中，本发明涉及siNA分子，其如本文所述用作药物。在一个实施例中，本发明涉及用于治疗以LAT1和/或ASCT2的表达水平增加(与健康受试者的水平相比)为特征的病症的siNA。

在本发明的另一方面，提供了siNA分子，其如本文所述用于治疗癌症。

在另一方面，本发明涉及至少一种siNA分子如本文所述在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在另一方面，本发明涉及治疗癌症的方法，该方法包括将至少一种如本文所述的siNA分子给药至有需要的患者或受试者。

在一个实施例中，癌症选自膀胱癌、血液癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、乳腺癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌和子宫癌。

在本发明的另一方面，提供了药物组合物，其包含至少一种如本文所述的siNA分子和药学上可接受的载体(carrier)。

在本发明的又一方面，提供了一种方法，优选为抑制氨基酸摄入进细胞的体外方法，该方法包括将如本文所定义的siNA给药至细胞。优选地，氨基酸摄取是钠依赖性的亮氨酸摄取。可供选择地，氨基酸摄取是钠依赖性丙氨酸摄取。在一个实施例中，与对照中的水平相比，氨基酸摄取被抑制高达或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在本发明的又一方面，提供了减少细胞增殖的方法，该方法包括将至少一种如本文所述的siNA给药至细胞。在一个实施例中，与对照中的水平相比，所述细胞增殖的减少可以高达或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在本发明的又另一方面，提供了一种减少肿瘤体积的方法，优选为在患者体内减少肿瘤体积的方法，该方法包括给药至少一种如本文所述的siNA。在一个实施例中，与对照中的水平相比，所述肿瘤体积的减少可以高达或大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在所述方法的一个实施例中，给药至少一种LAT-1 siNA或至少一种ASCT2 siNA。在一个替换实施例中，给药至少一种LAT-1 siNA和至少一种ASCT2 siNA。

在另一个实施例中，本发明涉及减少癌细胞增殖的方法，该方法包括用本领域已知的一种或多种抗癌剂与本发明的siNA一起处理细胞，优选地，其中所述抗癌剂包含抗肿瘤剂(anti-antineoplastic agent)，更优选包含细胞毒性抗肿瘤剂，最优选包含5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(Cisp)和/或奥沙利铂(Oxa)。

本发明还涉及治疗癌症的方法，该方法包括将本发明的siNA与本领域已知的一种或多种抗癌剂组合给药，优选给药至有需要的患者，优选地，其中所述抗癌剂包含抗肿瘤剂，更优选包含细胞毒性抗肿瘤剂，最优选包含5-氟尿嘧啶(5-FU)、顺铂(Cisp)和/或奥沙利铂(Oxa)。本发明进一步涉及包含本发明的siNA和一种或多种抗癌剂的药物组合物。

在另一个实施例中，本发明涉及增加给予患者的抗癌疗法的功效的方法，该方法包括将本发明的siNA和该疗法组合给药。与siNA或抗癌剂单独给药的疗效相比，疗效增加可高达或超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在优选的实施例中，所述siNA靶向SEQ ID NO:58或SEQ ID NO:61(例如，siNA包含有义链，该有义链包含分别选自SEQ ID NO:162或165的序列)或其变体。在进一步替换实施例中，所述siNA包含有义链和反义链，其中该有义链的序列是SEQ ID NO:387或其变体，该反义链的序列是SEQ ID NO:388或其变体。可供选择地，所述siNA包含有义链和反义链，其中该有义链的序列是SEQ ID NO:393或其变体，该反义链的序列是SEQ ID NO:394或其变体。

在一个替换实施例中，所述siNA靶向SEQ ID NO:267或278或其变体(例如，siNA包含有义链，该有义链包含选自SEQ ID NO:356或367的序列)。在另一个替换实施例中，所述siNA包含有义链和反义链，其中该有义链的序列是SEQ ID NO:399或其变体，该反义链的序列是SEQ ID NO:400或其变体。可供选择地，所述siNA包含有义链和反义链，其中该有义链的序列是SEQ ID NO:405或其变体，该反义链的序列是SEQ ID NO:406或其变体。

在一个实施例中，在给药siNA之前、同时或之后给药抗癌剂。

如本文所述，“对照”在本文中是指不给药siNA的细胞或患者或给药溶媒的细胞。

发明的具体说明

本发明涉及作为癌症治疗的新策略的通过敲低或抑制LAT1基因和/或ASCT2基因的表达来靶向LAT1基因和/或ASCT2基因的方法。特别地，根据本发明的第一方面，提供了用于抑制LAT1基因和/或ASCT2基因表达的siRNA在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途，其中所述siRNA包含有义LAT1或ASCT2核酸和反义LAT1或ASCT2核酸。本发明还提供了编码用于抑制LAT1基因和/或ASCT2基因表达的siRNA的载体在制备用于治疗或预防癌症的药物中的用途。

根据本发明的第二方面，提供了治疗或预防癌症的方法，包括向个体给药有效量的抑制LAT1和/或ASCT2基因表达的siRNA，其中siRNA包含有义LAT1或ASCT2核酸和反义LAT1或ASCT2核酸。本发明还提供治疗或预防癌症的方法，包括向个体给药有效量的编码抑制LAT1和ASCT2基因表达的siRNA的载体。

LAT1转运体是系统L Na⁺非依赖性中性氨基酸转运体的同种型，其过表达是各种形式的癌症中非常普遍的观察结果。本发明基于以下令人惊讶的发现：对LAT1具有选择性的小干扰RNA(siRNA)对于治疗癌症是有效的。特别是膀胱癌、血液癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、乳腺癌、转移癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌和子宫癌。

siRNA或编码siRNA的载体、或包含siRNA或编码siRNA的载体的药物可通过肠内给药(例如，口服、直肠和鼻内)、肠胃外给药(例如，血管内给药、组织周围和/或组织内给药、皮下注射或沉积、皮下输注、眼内给药和在肿瘤部位或附近直接给药)来向个体给药。

根据本发明的第三方面，提供了抑制细胞中LAT1基因和/或ASCT2基因表达的体外方法，包括使细胞与如本文所述的抑制LAT1和/或ASCT2基因表达的siNA接触。在一个实施例中，所述siRNA包含有义LAT1和/或ASCT2核酸和反义LAT1和/或ASCT2核酸，其中有义LAT1或ASCT2核酸与LAT1或AST2mRNA中包含的靶序列基本一致。反义LAT1或ASCT2核酸与有义LAT1或ASCT2核酸互补。本发明还提供了抑制细胞中LAT1和/或ASCT2基因表达的体外方法，包括使细胞与编码抑制LAT1和/或ASCT2基因表达的siRNA的载体接触，所述siRNA包含有义LAT1和/或ASCT2核酸和反义LAT1和/或ASCT2核酸，其中有义LAT1或ASCT2核酸与LAT1或ASCT2 mRNA中包含的靶序列基本一致，并且反义LAT1或ASCT2核酸与有义LAT1或ASCT2核酸互补。

通过将双链核糖核酸(dsRNA)分子以足以抑制LAT1和/或ASCT2基因表达的量引入细胞中，可以抑制基因的表达。

据信，本发明中使用的siRNA引起LAT1或ASCT2 mRNA的RNAi介导降解，从而不产生LAT1或ASCT2基因的蛋白质产物或以减少的量产生。本发明中使用的siRNA可用于改变细胞中的基因表达，其中LAT1和/或ASCT2的表达被上调(例如，由于细胞的恶性转化)。siRNA与细胞中LAT1或ASCT mRNA转录物的结合导致细胞产生LAT1和ASCT2的减少。

术语“siRNA”用于表示阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。使用将siRNA引入细胞的标准技术，包括其中DNA是RNA转录的模板的那些技术。抑制LAT1或ASCT2基因表达的siRNA包括有义LAT1或ASCT2核酸序列和反义LAT1或ASCT2核酸序列。可以构建siRNA，使得单个转录物例如以发夹的形式具有来自靶基因的有义和互补反义序列。

siRNA优选包含靶向靶mRNA(即LAT1 mRNA或ASCT2 mRNA)的短双链RNA。siRNA包含通过标准沃森-克里克碱基配对相互作用(下文称为“碱基配对”)退火在一起的有义RNA链和互补反义RNA链。有义链包含与LAT1 mRNA或ASCT2 mRNA中包含的靶序列基本一致的核酸序列。

术语“有义/反义序列”和“有义/反义链”在本文中可互换使用，是指本发明的siRNA的与靶LAT1和ASCT2 mRNA序列基本上相同(有义)或与靶LAT1和ASCT2 mRNA序列基本上互补(反义)的部分。

如本文所用，与靶mRNA中包含的靶序列“基本一致”的核酸序列是与靶序列一致的核酸序列，或者与靶序列相差一个或多个核苷酸的核酸序列。优选地，基本一致的序列与靶序列一致或与靶序列相差一个、两个或三个核苷酸，更优选一个或两个核苷酸，最优选仅一个核苷酸。包含与靶序列基本上一致的核酸序列的有义链的特征是包含这种有义链的siRNA诱导含有靶序列的mRNA的RNAi介导降解。例如，本发明的siRNA可以包括包含与靶序列相差一个、两个、三个或更多个核苷酸的核酸序列的有义链，只要siRNA诱导靶mRNA的RNAi介导降解即可。

siRNA的有义链和反义链可以包含两个互补的单链RNA分子，或者可以包含其中两个互补部分碱基配对并且通过单链“发夹”区域共价连接的单个分子。也就是说，有义区和反义区可以通过接头分子共价连接。接头分子可以是多核苷酸或非核苷酸接头。siRNA还可以包含一个或多个核糖核苷酸碱基的改变、取代或修饰。例如，可以改变、取代或修饰本发明的siRNA以包含一个或多个，优选0、1、2或3个脱氧核糖核苷酸碱基。优选地，siRNA不含任何脱氧核糖核苷酸碱基。

siRNA可以包含部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA或重组产生的RNA，以及通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而不同于天然存在的RNA的改变的RNA。此类改变可包括添加非核苷酸材料，例如将其添加至siRNA的末端或siRNA的一个或多个内部核苷酸；使siRNA对核酸酶消化具有抗性的修饰(例如，2'-取代的核糖核苷酸的使用或对糖-磷酸骨架的修饰)；或者用脱氧核糖核苷酸取代siRNA中的一个或多个，优选0、1、2或3个核苷酸。

可以通过多种化学修饰来延迟或避免降解，所述化学修饰包括siRNA的核碱基、糖和磷酸酯主链的改变。所有这些化学修饰的siRNA仍然能够诱导siRNA介导的基因沉默，条件是siRNA的特定区域中不存在修饰并且以有限程度的程度包括修饰。通常，骨架修饰导致结合亲和力的少量损失，但提供核酸酶抗性。硫代磷酸酯(PS)-或硼烷磷酸酯(BS)修饰的siRNA具有显著的核酸酶抗性。siRNA双链体沉默也与某些类型的2'-糖修饰相容：2'-H、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、2'-氟代(2'-F)、锁定核酸(LNA)和乙烯桥核酸(ENA)。合适的化学修饰是本领域技术人员熟知的。

用于本发明的siRNA是包含有义链和反义链的双链分子，其中有义链包含对应于LAT1或ASCT2靶序列的核糖核苷酸序列或由对应于LAT1或ASCT2靶序列的核糖核苷酸序列组成，并且其中反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链和所述反义链彼此杂交形成所述双链分子，并且其中所述双链分子在被引入表达LAT1和ASCT2基因的细胞时抑制所述基因的表达。如下文进一步所示，所述LAT1靶序列优选包含选自由SEQID N° 4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87和95至104组成的组中的至少约10个连续的、更优选15至21个、最优选约19至21个连续的核苷酸。如下文进一步所示，所述ASCT2靶序列优选包含选自由SEQ ID N° 209、216、225、226、228、235至238、245、260、264、267、271、272、278、279、281至297组成的组中的至少约10个连续的、更优选15至21个、最优选约19至21个连续的核苷酸。

在本发明的一个实施例中，siRNA分子的所述有义链和反义链通过接头分子共价连接。所述接头分子可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。优选地，接头是环序列。环序列的长度优选为3至23个核苷酸。合适的环序列描述于http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html和(Jacque et al.,2002)。优选的环序列包括：

AUG：(Sui et al.,2002)。

CCC、CCACC或CCACACC：(Paul et al.,2002)。

UUCG：(Lee et al.,2002)。

CTCGAG或AAGCUU：(Biology,2003)。

UUCAAGAGA：(Yu et al.,2002)。

环序列可选自AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA。优选地，环序列是UUCAAGAGA(DNA中的“ttcaagaga”)。

可以使用本领域技术人员已知的许多技术获得本发明中使用的siRNA。例如，可以使用本领域已知的方法化学合成或重组产生siRNA，例如美国公开申请2002/0086356中描述的果蝇(Drosophila)体外系统，其全部公开内容通过引用并入本文。可以使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规DNA/RNA合成仪化学合成siRNA。siRNA可以作为两个独立的互补RNA分子合成，或作为具有两个互补区域的单个RNA分子合成。合成RNA分子或合成试剂的商业供应商包括Biospring(德国法兰克福)、Proligo(德国汉堡)、Dharmacon Research(美国科罗拉多州拉斐特)、Thermo Fisher Scientific(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、GlenResearch(美国弗吉尼亚州斯特灵)、ChemGenes(美国马萨诸塞州阿什兰)和Sigma-Aldrich(美国密苏里州圣路易)。

还可以使用任何合适的启动子从重组环状或线性DNA载体表达siRNA。用于从载体表达siRNA的合适启动子包括，例如U6或H1RNA pol III启动子序列和巨细胞病毒启动子。选择其他合适的启动子在本领域技术范围内。载体还可以包含可诱导的或可调节的启动子以用于在特定组织或特定细胞内环境中表达siRNA。

从载体表达的siRNA可以通过标准技术从培养的细胞表达系统中分离，或者可以在细胞内表达。载体可用于将siRNA递送至体内细胞，例如通过在体内在细胞内表达siRNA。siRNA可以从载体作为两个独立的互补RNA分子而表达，或作为具有两个互补区域的单个RNA分子而表达。选择适于表达siRNA的载体、用于将表达siRNA的核酸序列插入载体的方法、以及将载体递送至目的细胞的方法是本领域技术人员熟知的。

siRNA也可以在体内在细胞内从载体表达。如本文所用，术语“载体(vector)”意指用于递送所需核酸的任何基于核酸和/或病毒的技术。可以使用能够接受待表达的siRNA分子的编码序列的任何载体，包括质粒、粘粒、裸DNA(任选地与缩合剂缩合)、和病毒载体。合适的病毒载体包括衍生自以下的载体：腺病毒(AV)；腺相关病毒(AAV)；逆转录病毒(例如，慢病毒(LV)、弹状病毒、鼠白血病病毒)；疱疹病毒等。病毒载体的向性可以通过用包膜蛋白或来自其他病毒的其他表面抗原对载体进行假型化来修饰，或者通过适当地替换不同的病毒衣壳蛋白来修饰。当载体是慢病毒载体时，优选用来自水泡性口炎病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒或莫科拉病毒的表面蛋白来假型化。

例如通过将LAT1或ASCT2靶序列克隆到表达载体中来产生载体，使得可操作地连接的调节序列以允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)的方式位于LAT1或ASCT2序列的侧翼(Lee et al.,2002)。与LAT1 mRNA或ASCT2 mRNA反义的RNA分子由第一启动子(例如，在克隆的DNA的3'的启动子序列)转录，并且作为LAT1 mRNA或ASCT2 mRNA的有义链的RNA分子由第二启动子(例如，在克隆的DNA的5'的启动子序列)转录。有义链和反义链在体内杂交产生用于沉默LAT1基因或ASCT2基因的siRNA构建体。可供选择地，利用两种载体产生siRNA构建体的有义链和反义链。克隆的LAT1或ASCT2可以编码具有二级结构(例如发夹)的构建体，其中单个转录物具有来自靶基因的有义和互补反义序列。编码具有二级结构的构建体的这种转录物优选包含连接所述有义链和所述反义链的单链核糖核苷酸序列(环序列)。

siRNA优选是分离的。如本文所用，“分离的”是指合成的，或通过人为干预从天然状态中改变或移出的。例如，天然存在于活动物中的siRNA不是“分离的”，而合成的siRNA，或与siRNA天然状态的共存材料部分或完全分离的siRNA是“分离的”。分离的siRNA可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如，已经被递送siRNA的细胞中。举例来说，通过天然过程在细胞内产生但由“分离的”前体分子产生的siRNA本身是“分离的”分子。因此，可以将分离的dsRNA引入靶细胞，在靶细胞中所述分离的dsRNA通过Dicer蛋白(或其等同物)加工成分离的siRNA。

如本文所用，“抑制”是指LAT1或ASCT2基因表达产物的活性或LAT1或ASCT2基因表达产物的水平降低至低于不存在本发明siRNA分子时观察到的活性。用siRNA分子产生的抑制优选显著低于在不能介导RNAi应答的无活性或减活分子存在下观察到的水平。用siRNA分子对基因表达的抑制在siRNA分子存在下优选显著高于siRNA分子不存在时。优选地，siRNA抑制LAT1或ASCT2基因表达水平至少10％、更优选至少50％、最优选至少75％。

优选地，siRNA分子抑制LAT1或ASCT2基因表达，从而抑制含有LAT1或ASCT2基因的细胞的生长。抑制细胞生长意味着处理的细胞比未处理的细胞以更低的速率增殖或具有降低的活力。通过本领域已知的增殖测定法测量细胞生长。

如本文所用，“分离的核酸”是从其原始环境(例如天然存在情况下的天然环境)中移出，并因此从其天然状态合成地改变的核酸。在本发明中，分离的核酸包括DNA、RNA及其衍生物。当分离的核酸是RNA或其衍生物时，在核苷酸序列中碱基“t”应该用“u”代替。

如本文所用，术语“互补”是指多核苷酸的核苷酸单元之间的沃森-克里克或胡斯坦碱基配对，术语“结合”是指两个多肽或化合物或相关多肽或化合物或其组合之间的物理或化学相互作用。

如本文所用，短语“高度保守的序列区域”是指靶基因中的一个或多个区域的核苷酸序列从一代到另一代或从一个生物系统到另一个生物系统没有显著变化。

如本文所用，术语“互补性”或“互补的”是指核酸可通过传统的沃森-克里克或其他非传统类型的相互作用与另一核酸序列形成氢键。就本发明而言，siRNA分子与其互补序列的结合自由能足以使核酸的相关功能进行，例如RNAi活性。例如，siRNA分子的有义链和反义链之间的互补程度可以与siRNA的反义链和靶RNA序列之间的互补程度相同或不同。

百分比互补性表示核酸分子中可以与第二核酸序列形成氢键(例如，沃森-克里克碱基配对)的连续残基的百分比(例如10个中的5、6、7、8、9、10个即50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。优选地，术语“互补性”或“互补的”是指第一核酸有义链上的至少90％、更优选至少95％、最优选100％的残基可以与第二核酸序列形成氢结合。

互补核酸序列在适当条件下杂交以形成含有少量(一个或两个)或没有错配的稳定双链体。此外，siRNA的有义链和反义链可通过杂交形成双链核苷酸或发夹环结构。在优选的实施例中，这种双链体每10个配对中含有不超过1个错配。在特别优选的实施例中，双链体的有义链和反义链是完全互补的，即双链体不含错配。

如本文所用，术语“细胞”使用其通常的生物学意义来定义。细胞可以存在于生物体中，例如哺乳动物，例如人、牛、绵羊、猿、猴、猪、狗和猫。细胞可以是真核细胞(例如，哺乳动物细胞)。细胞可以是体细胞或生殖细胞来源的、全能的或多能的、分裂的或非分裂的。细胞还可以衍生自或可以包含配子或胚胎、干细胞、或完全分化的细胞。优选地，细胞是膀胱癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、乳腺癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌或胃癌细胞。

如本文所用，术语“RNA”意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”是指在β-D-核糖-呋喃糖部分的2'位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA，如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成的RNA、重组产生的RNA，以及通过一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代和/与改变而与天然存在的RNA不同的RNA。此类改变可包括添加非核苷酸材料，例如添加至siRNA的末端或内部，例如添加在RNA的一个或多个核苷酸处。本发明的RNA分子中的核苷酸也可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些改变的RNA可以称为天然存在的RNA的类似物。优选地，术语“RNA”仅由核糖核苷酸残基组成。

如本文所用，术语“生物体”是指由至少一个细胞组成的任何生物实体。活生物体可以像例如单个真核细胞一样简单，或者像包括人类的哺乳动物一样复杂。

如本文所用，术语“受试者”是指生物体，其是外植细胞的供体或受体或细胞自身。“受试者”还指可以给药本发明的核酸分子的生物体。受试者优选是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛。最优选地，受试者是人。

如本文所用，术语“生物样品”是指含有多核苷酸的任何样品。样品可以是组织或细胞样品、或含有多核苷酸的体液(例如，血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。样品可以是从整个生物体或其部分细胞、组织或组成部分或其碎片或部分制备的匀浆、裂解物、提取物、细胞培养物或组织培养物。最后，样品可以是其中生物体或生物体的细胞已经繁殖的培养基，例如营养肉汤或凝胶，其中样品含有多核苷酸。

本发明涉及抑制LAT1和/或ACST2基因表达的方法，抑制LAT1和/或ACST2基因表达导致抑制癌细胞生长。特别地，本发明提供了抑制癌细胞群生长的方法，该方法包括将LAT1和/或ASCT2 siRNA应用于所述癌细胞群。通过使细胞与LAT1和/或ASCT2 siRNA的组合物接触来抑制癌细胞生长。LAT1和ASCT2是在肿瘤中过表达的氨基酸转运体，例如膀胱癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、乳腺癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌和胃癌。可以通过LAT1或ASCT2 siRNA抑制表达LAT1或ASCT2的细胞的生长。可以进一步使细胞与转染增强剂接触，以增强siRNA或siRNA的编码载体向细胞的递送。根据本发明的具体方法，可以体外、体内或离体提供细胞。

从NCBI Entrez核苷酸数据库中提取关于人LAT1基因的序列信息(GenBank登录号NM_003486)。鉴定了多达104个mRNA片段。从NCBI Entrez核苷酸数据库中提取关于人ASCT2基因的序列信息(GenBank登录号NM_001145144)。鉴定了多达89个mRNA片段。设计具有抑制靶细胞中基因表达能力的双链RNA的方法是已知的。参见例如美国专利第6,506,559号和Elbashir et al.,2001，其全部内容通过引用并入本文。

siRNA靶位点的选择可以如下进行：

1.从转录物的ATG起始密码子开始，向下游扫描AA二核苷酸序列。记录每个AA和3'相邻的19个核苷酸的出现作为潜在的siRNA靶位点。Tuschal等人建议不要设计对应于5'和3'非翻译区(UTR)和起始密码子附近区域(75个碱基内)的siRNA，因为这些区域可能富含调节蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰siRNA核酸内切酶复合物的结合。

2.将潜在的靶位点与适当的基因组数据库(人、小鼠、大鼠等)进行比较，并且不考虑与其他编码序列具有显著同源性的任何靶序列。我们建议使用BLAST，BLAST可以在NCBI服务器上找到：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

3.选择合格的靶序列(即GC含量超过55％的序列)进行合成。

在本发明的一个方面，有义核酸的长度为至少10个核苷酸，并且可以与天然存在的LAT1转录物一样长。优选地，有义核酸的长度小于75、50或25个核苷酸。进一步优选地，有义核酸包含至少19个核苷酸。最优选地，有义核酸的长度为19至25个核苷酸。抑制哺乳动物细胞中LAT1表达的本发明的LAT1siRNA有义核酸的实例包括包含LAT1基因的以下靶序列中任一个的寡核苷酸：第145至165个核苷酸(SEQ ID N° 4)、第217至237个核苷酸(SEQ ID N°6)、第466至486个核苷酸(SEQ ID N° 10)、第628至648个核苷酸(SEQ ID N° 13)、第796至816个核苷酸(SEQ ID N° 22)、第1243至1263个核苷酸(SEQ ID N° 34)、第525至545个核苷酸(SEQ ID N° 58)、第624至644个核苷酸(SEQ ID N° 61)、第1245至1265个核苷酸(SEQ IDN° 81)、第1316至1336个核苷酸(SEQ ID N° 83)、第1410至1430个核苷酸(SEQ ID N° 87)、第147至165个核苷酸(SEQ ID N° 95)、第219至237个核苷酸(SEQ ID N° 96)、第468至486个核苷酸(SEQ ID N° 97)、第630至648个核苷酸(SEQ ID N° 98)、第798至816个核苷酸(SEQ ID N° 99)、第1247至1263个核苷酸(SEQ ID N° 100)、第527至545个核苷酸(SEQ IDN° 101)、第1247至1265个核苷酸(SEQ ID N° 102)、第1318至1336个核苷酸(SEQ ID N°103)、第1412至1430个核苷酸(SEQ ID N° 104)。

针对LAT-1产生了104个序列，其中列出了双链RNA的一条链的序列。这些包括以下核苷酸序列：

通过搜索NCBI BlastN数据库确认LAT1基因特异性。化学合成siRNA。

将所有42个纯化的siRNA双链体与脂质体复合，并将其在无血清培养基中添加到细胞中12小时。此后，将细胞在补充血清的培养基中培养72至96小时，在实验前24小时将补充血清的培养基替换为无血清培养基。使用乱序的阴性siRNA双链体作为对照。

LAT1-siRNA针对单个靶LAT1基因序列。可供选择地，siRNA针对多个靶LAT1基因序列。例如，该组合物含有针对两个、三个、四个、五个或更多个LAT1靶序列的LAT1-siRNA。LAT1靶序列是指与LAT1基因的一部分一致的核苷酸序列。靶序列可包括人LAT1基因的5'非翻译(UT)区、开放阅读框(ORF)或3'非翻译区。可供选择地，siRNA是与LAT1基因表达的上游或下游调节子互补的核酸序列。上游和下游调节子的实例包括结合LAT1基因启动子的转录因子、与LAT1多肽相互作用的激酶或磷酸酶、LAT1启动子或增强子。

与靶mRNA杂交的LAT1-siRNA通过与正常单链mRNA转录物结合而减少或抑制由LAT1基因编码的LAT1多肽产物的产生，从而干扰翻译并因此干扰蛋白质的表达。用于产生LAT1-siRNA的示例性核酸序列包括作为靶序列的第145至165个核苷酸(SEQ ID N° 4)、第217至237个核苷酸(SEQ ID N° 6)、第466至486个核苷酸(SEQ ID N° 10)、第628至648个核苷酸(SEQ ID N° 13)、第796至816个核苷酸(SEQ ID N° 22)、第1243至1263个核苷酸(SEQID N° 34)、第525至545个核苷酸(SEQ ID N° 58)、第624至644个核苷酸(SEQ ID N° 61)、第1245至1265个核苷酸(SEQ ID N° 81)、第1316至1336个核苷酸(SEQ ID N° 83)、第1410至1430个核苷酸(SEQ ID N° 87)、第147至165个核苷酸(SEQ ID N° 95)、第219至237个核苷酸(SEQ ID N° 96)、第468至486个核苷酸(SEQ ID N° 97)、第630至648个核苷酸(SEQ IDN° 98)、第798至816个核苷酸(SEQ ID N° 99)、第1247至1263个核苷酸(SEQ ID N° 100)、第527至545个核苷酸(SEQ ID N° 101)、第1247至1265个核苷酸(SEQ ID N° 102)、第1318至1336个核苷酸(SEQ ID N° 103)、第1412至1430个核苷酸(SEQ ID N° 104)。在进一步的实施例中，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到靶序列的反义链的3'末端。优选添加至少2个u，更优选添加2至10个u，最优选添加2至5个u。添加的u在siRNA的反义链的3'末端形成单链。

可以以能够结合mRNA转录物的形式将LAT1-siRNA直接引入细胞中。可供选择地，可以将编码LAT1-siRNA的载体引入细胞中。

由任意核苷酸序列组成的环序列可位于有义序列和反义序列之间，以形成发夹环结构。因此，本发明还提供了具有通式5'-[A]-[B]-[A']-3'的siRNA，其中[A]是与LAT1基因的靶序列对应的核糖核苷酸序列。优选地，[A]是选自由第145至165个核苷酸(SEQ ID N°4)、第217至237个核苷酸(SEQ ID N° 6)、第466至486个核苷酸(SEQ ID N° 10)、第628至648个核苷酸(SEQ ID N° 13)、第796至816个核苷酸(SEQ ID N° 22)、第1243至1263个核苷酸(SEQ ID N° 34)、第525至545个核苷酸(SEQ ID N° 58)、第624至644个核苷酸(SEQ IDN° 61)、第1245至1265个核苷酸(SEQ ID N° 81)、第1316至1336个核苷酸(SEQ ID N° 83)、第1410至1430个核苷酸(SEQ ID N° 87)、第147至165个核苷酸(SEQ ID N° 95)、第219至237个核苷酸(SEQ ID N° 96)、第468至486个核苷酸(SEQ ID N° 97)、第630至648个核苷酸(SEQ ID N° 98)、第798至816个核苷酸(SEQ ID N° 99)、第1247至1263个核苷酸(SEQ IDN° 100)、第527至545个核苷酸(SEQ ID N° 101)、第1247至1265个核苷酸(SEQ ID N°102)、第1318至1336个核苷酸(SEQ ID N° 103)、第1412至1430个核苷酸(SEQ ID N° 104)组成的组中的序列；[B]是由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；[A']是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。区域[A]与[A']杂交，然后形成由区域[B]组成的环。环序列的长度优选为3至23个核苷酸。合适的环序列描述于http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供了活性siRNA(Jacque et al.,2002)。优选的环序列包括：

AUG：(Sui et al.,2002)。

CCC、CCACC或CCACACC：(Paul et al.,2002)。

UUCG：(Lee et al.,2002)。

CTCGAG或AAGCUU：(Biology,2003)。

UUCAAGAGA：(Yu et al.,2002)。

在本发明的另一方面，有义核酸的长度为至少10个核苷酸，并且可以与天然存在的ASCT2转录物一样长。优选地，有义核酸的长度小于75、50或25个核苷酸。进一步优选地，有义核酸包含至少19个核苷酸。最优选地，有义核酸的长度为19至25个核苷酸。抑制哺乳动物细胞中ASCT2表达的本发明的ASCT2 siRNA有义核酸的实例包括寡核苷酸，寡核苷酸包含ASCT2基因的以下靶序列中任一个：第300至320个核苷酸(SEQ ID N° 209)、第452至472个核苷酸(SEQ ID N° 216)、第773至793个核苷酸(SEQ ID N° 225)、第776至796个核苷酸(SEQ ID N° 226)、第830至850个核苷酸(SEQ ID N° 228)、第1122至1142个核苷酸(SEQ IDN° 235)、第1123至1143个核苷酸(SEQ ID N° 236)、第1124至1144个核苷酸(SEQ ID N°237)、第1150至1170个核苷酸(SEQ ID N° 238)、第769至789个核苷酸(SEQ ID N° 260)、第994至1014个核苷酸(SEQ ID N° 264)、第1066至1086个核苷酸(SEQ ID N° 267)、第1131至1151个核苷酸(SEQ ID N° 271)、第1154至1174个核苷酸(SEQ ID N° 272)、第1264至1284个核苷酸(SEQ ID N° 278)、第1268至1288个核苷酸(SEQ ID N° 279)、第302至320个核苷酸(SEQ ID N° 281)、第454至472个核苷酸(SEQ ID N° 282)、第775至793个核苷酸(SEQ IDN° 283)、第778至796个核苷酸(SEQ ID N° 284)、第832至850个核苷酸(SEQ ID N° 285)、第1124至1142个核苷酸(SEQ ID N° 286)、第1125至1143个核苷酸(SEQ ID N° 287)、第1126至1144个核苷酸(SEQ ID N° 288)、第1152至1170个核苷酸(SEQ ID N° 289)、第771至789个核苷酸(SEQ ID N° 291)、第996至1014个核苷酸(SEQ ID N° 292)、第1068至1086个核苷酸(SEQ ID N° 293)、第1133至1151个核苷酸(SEQ ID N° 294)、第1156至1174个核苷酸(SEQ ID N° 295)、第1266至1284个核苷酸(SEQ ID N° 296)、第1270至1288个核苷酸(SEQ ID N° 297)。

针对ASCT2产生了89个序列，其中列出了双链RNA的一条链的序列。这些包括以下核苷酸序列：

通过搜索NCBI BlastN数据库确认ASCT2基因特异性。化学合成siRNA。

将所有42个纯化的siRNA双链体与脂质体复合，并将其在无血清培养基中添加到细胞12小时。此后，将细胞在补充血清的培养基中培养72至96小时，在实验前24小时将补充血清的培养基替换为无血清培养基。使用乱序的阴性siRNA双链体作为对照。

ASCT2-siRNA针对单个靶ASCT2基因序列。可供选择地，siRNA针对多个靶ASCT2基因序列。例如，该组合物含有针对两个、三个、四个、五个或更多个ASCT2靶序列的ASCT2-siRNA。ASCT2靶序列是指与ASCT2基因的一部分相同的核苷酸序列。靶序列可包括人ASCT2基因的5'非翻译(UT)区、开放阅读框(ORF)或3'非翻译区。可供选择地，siRNA是与ASCT2基因表达的上游或下游调节子互补的核酸序列。上游和下游调节子的实例包括结合ASCT2基因启动子的转录因子、与ASCT2多肽相互作用的激酶或磷酸酶、ASCT2启动子或增强子。

与靶mRNA杂交的ASCT2-siRNA通过与正常单链mRNA转录物结合而减少或抑制由ASCT2基因编码的ASCT2多肽产物的产生，从而干扰翻译并因此干扰蛋白质的表达。用于产生ASCT2-siRNA的示例性核酸序列包括作为靶序列的第300至320个核苷酸(SEQ ID N°209)、第452至472个核苷酸(SEQ ID N° 216)、第773至793个核苷酸(SEQ ID N° 225)、第776至796个核苷酸(SEQ ID N° 226)、第830至850个核苷酸(SEQ ID N° 228)、第1122至1142个核苷酸(SEQ ID N° 235)、第1123至1143个核苷酸(SEQ ID N° 236)、第1124至1144个核苷酸(SEQ ID N° 237)、第1150至1170个核苷酸(SEQ ID N° 238)、第769至789个核苷酸(SEQ ID N° 260)、第994至1014个核苷酸(SEQ ID N° 264)、第1066至1086个核苷酸(SEQID N° 267)、第1131至1151个核苷酸(SEQ ID N° 271)、第1154至1174个核苷酸(SEQ ID N°272)、第1264至1284个核苷酸(SEQ ID N° 278)、第1268至1288个核苷酸(SEQ ID N° 279)、第302至320个核苷酸(SEQ ID N° 281)、第454至472个核苷酸(SEQ ID N° 282)、第775至793个核苷酸(SEQ ID N° 283)、第778至796个核苷酸(SEQ ID N° 284)、第832至850个核苷酸(SEQ ID N° 285)、第1124至1142个核苷酸(SEQ ID N° 286)、第1125至1143个核苷酸(SEQ ID N° 287)、第1126至1144个核苷酸(SEQ ID N° 288)、第1152至1170个核苷酸(SEQID N° 289)、第771至789个核苷酸(SEQ ID N° 291)、第996至1014个核苷酸(SEQ ID N°292)、第1068至1086个核苷酸(SEQ ID N° 293)、第1133至1151个核苷酸(SEQ ID N° 294)、第1156至1174个核苷酸(SEQ ID N° 295)、第1266至1284个核苷酸(SEQ ID N° 296)、第1270至1288个核苷酸(SEQ ID N° 297)。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可以将核苷酸“u”添加到靶序列的反义链的3'末端。优选添加至少2个u，更优选添加2至10个u，最优选添加2至5个u。添加的u在siRNA的反义链的3'末端形成单链。

可以以能够结合mRNA转录物的形式将ASCT2-siRNA直接引入细胞中。可供选择地，可以将编码ASCT2-siRNA的载体引入细胞中。

由任意核苷酸序列组成的环序列可位于有义序列和反义序列之间，以形成发夹环结构。因此，本发明还提供了具有通式5'-[A]-[B]-[A']-3'的siRNA，其中[A]是与LAT1基因的靶序列对应的核糖核苷酸序列。优选地，[A]是选自由第300至320个核苷酸(SEQ ID N°209)、第452至472个核苷酸(SEQ ID N° 216)、第773至793个核苷酸(SEQ ID N° 225)、第776至796个核苷酸(SEQ ID N° 226)、第830至850个核苷酸(SEQ ID N° 228)、第1122至1142个核苷酸(SEQ ID N° 235)、第1123至1143个核苷酸(SEQ ID N° 236)、第1124至1144个核苷酸(SEQ ID N° 237)、第1150至1170个核苷酸(SEQ ID N° 238)、第769至789个核苷酸(SEQ ID N° 260)、第994至1014个核苷酸(SEQ ID N° 264)、第1066至1086个核苷酸(SEQID N° 267)、第1131至1151个核苷酸(SEQ ID N° 271)、第1154至1174个核苷酸(SEQ ID N°272)、第1264至1284个核苷酸(SEQ ID N° 278)、第1268至1288个核苷酸(SEQ ID N° 279)、第302至320个核苷酸(SEQ ID N° 281)、第454至472个核苷酸(SEQ ID N° 282)、第775至793个核苷酸(SEQ ID N° 283)、第778至796个核苷酸(SEQ ID N° 284)、第832至850个核苷酸(SEQ ID N° 285)、第1124至1142个核苷酸(SEQ ID N° 286)、第1125至1143个核苷酸(SEQ ID N° 287)、第1126至1144个核苷酸(SEQ ID N° 288)、第1152至1170个核苷酸(SEQID N° 289)、第771至789个核苷酸(SEQ ID N° 291)、第996至1014个核苷酸(SEQ ID N°292)、第1068至1086个核苷酸(SEQ ID N° 293)、第1133至1151个核苷酸(SEQ ID N° 294)、第1156至1174个核苷酸(SEQ ID N° 295)、第1266至1284个核苷酸(SEQ ID N° 296)、第1270至1288个核苷酸(SEQ ID N° 297)组成的组中的序列；[B]是由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列；[A']是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。区域[A]与[A']杂交，然后形成由区域[B]组成的环。环序列的长度优选为3至23个核苷酸。合适的环序列描述于http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html。此外，由23个核苷酸组成的环序列也提供了活性siRNA(Jacque et al.,2002)。优选的环序列包括：

AUG：(Sui et al.,2002)。

CCC、CCACC或CCACACC：(Paul et al.,2002)。

UUCG：(Lee et al.,2002)。

CTCGAG或AAGCUU：(Biology,2003)。

UUCAAGAGA：(Yu et al.,2002)。

本发明人惊奇地发现，靶向LAT1基因或ASCT2基因的某些靶序列的siRNA在分别抑制钠依赖性[¹⁴C]-L-亮氨酸摄取或钠依赖性[¹⁴C]-L-丙氨酸摄取上特别有效，分别在抑制LAT1或ASCT2表达、细胞生长和过表达LAT1和/或ASCT2转运体的肿瘤的生长上特别有效。

在本发明的具体实施例中，本发明中使用的LAT1 siRNA的有义链包含以下序列或由以下序列组成，所述序列选自包括SEQ ID N° 6、22、58和61的组。所述siRNA还包含相应的反义链。已发现使用这种siRNA在抑制钠非依赖性[¹⁴C]-L-亮氨酸转运中特别有效。在进一步的实施例中，LAT1 siRNA的有义链包含选自SEQ ID NO:110、126、138、162和165的至少一种序列或由选自SEQ ID N O:110、126、138、162和165的至少一种序列组成。

根据本发明的另一方面，提供了包含有义LAT1核酸和反义LAT1核酸的siRNA，并且有义LAT1核酸与LAT1 mRNA中包含的靶序列基本一致，反义LAT1核酸与有义LAT1核酸互补。有义和反义核酸彼此杂交形成双链分子。

本发明的siRNA分子具有在其被引入表达LAT1基因的细胞时抑制LAT1基因表达的性质。

本发明的siRNA分子具有在其被引入表达LAT1基因的细胞时抑制细胞生长的性质。

本发明的siRNA分子具有在其被引入表达LAT1基因的肿瘤时抑制肿瘤生长的性质。

在本发明的具体实施例中，本发明中使用的ASCT2 siRNA的有义链包含以下序列或由以下序列组成，所述序列选自包括SEQ ID N° 225、237、267和278的组。所述siRNA还包含相应的反义链。已发现使用这种siRNA在抑制钠非依赖性[¹⁴C]-L-亮氨酸转运中特别有效。在进一步的实施例中，ASCT2 siRNA的有义链包含选自314、326、356和367的至少一种序列或由选自314、326、356和367的至少一种序列组成。

根据本发明的另一方面，提供了包含有义ASCT2核酸和反义ASCT2核酸的siRNA，并且有义ASCT2核酸与ASCT2 mRNA中包含的靶序列基本一致，反义ASCT2核酸与有义ASCT2核酸互补。有义和反义核酸彼此杂交形成双链分子。

本发明的siRNA分子具有在被引入表达ASCT2基因的细胞时抑制ASCT2基因表达的性质。

本发明的siRNA分子具有在被引入表达ASCT2基因的细胞时抑制细胞生长的性质。

本发明的siRNA分子具有在被引入表达ASCT2基因的肿瘤时抑制肿瘤生长的性质。

当组合本发明的siRNA-LAT1和siRNA-ASCT2时，它们具有在被引入表达LAT1和ASCT2基因的细胞时抑制LAT1和ASCT2基因表达的性质。

当组合本发明的siRNA-LAT1和siRNA-ASCT2分子时，它们具有在被引入表达LAT1和ASCT2基因的细胞时抑制细胞生长的性质。

当组合本发明的siRNA-LAT1和siRNA-ASCT2分子时，它们具有在被引入表达LAT1和ASCT2基因的肿瘤时抑制肿瘤生长的性质。

本发明的另一方面涉及编码根据本发明第四方面的siRNA的核酸序列和载体，以及涉及包含它们的组合物，所述组合物可用于例如本发明的方法中。本发明的组合物可另外包含转染增强剂。核酸序列可以与诱导型或调节型启动子可操作地连接。上面讨论了合适的载体。优选地，载体是腺相关病毒载体。

本发明的组合物可另外包含用于治疗癌症的药剂，其中所述药剂不同于siRNA。优选地，所述药剂选自阿巴瑞克、氨磷汀、氨鲁米特、阿那曲唑、贝伐单抗、比卡鲁胺、博来霉素、硼替佐米、白消安、卡培他滨、卡铂、卡莫司汀、西妥昔单抗、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、多西他赛、多柔比星、厄洛替尼、4'-表阿霉素、表柔比星、雌莫司汀、依托泊苷、氟脲苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、氟他胺、吉非替尼、吉西他滨、戈舍瑞林、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、亮丙瑞林、甲地孕酮、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、喷司他丁、强的松、丙卡巴肼、利妥昔单抗、沙铂、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊苷、6-硫鸟嘌呤、塞替派、拓扑替康、托瑞米芬、曲妥珠单抗、曲普瑞林、戊柔比星、长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。

非病毒递送siRNA系统涉及核酸转染剂的产生。核酸转染剂具有两种基本性质。首先，它们必须以某种方式与核酸承载物相互作用。大多数情况下，这涉及允许形成核酸复合物的静电力。复合物的形成确保核酸和转染剂被同时呈递给细胞膜。根据递送试剂的性质，复合物可分为三类：脂质复合物；多聚复合物；和脂质多聚复合物。脂质复合物通过阴离子核酸与阳离子脂质的相互作用形成，多聚复合物通过阴离子核酸与阳离子聚合物的相互作用形成。脂质多聚复合物试剂可以结合阳离子脂质和聚合物的作用以递送核酸。将组蛋白、聚-L-赖氨酸和鱼精蛋白添加到一些阳离子脂质制剂导致递送水平高于单独的脂质或聚合物。组合制剂的毒性也可较低。与此目的最相关的生物相容性系统是特别根据核酸的物理化学设计的非病毒可生物降解纳米胶囊。它们具有被可生物降解聚合物包膜包围的水性核心，所述可生物降解聚合物包膜提供siRNA的保护和向细胞溶胶内的转运并允许siRNA在体内有效地起作用。

本发明还提供含有根据本发明第四方面的siRNA或本发明的载体的细胞。优选地，细胞是哺乳动物细胞，更优选是人细胞。进一步优选地，细胞是分离的细胞。

虽然前述公开内容提供了对包括在本发明范围内的主题的一般描述，包括制备和使用本发明的方法及其最佳方式，但提供以下实施例以进一步使本领域技术人员能够实施本发明的技术并提供其完整的书面描述。然而，本领域技术人员将理解，这些实施例的细节不应理解为对本发明的限制，本发明的范围应当从附属于本公开的权利要求及其等同物中理解。鉴于本公开，本发明的各种其他方面和实施方式对于本领域技术人员而言是显而易见的。

本说明书中提及的所有文献，包括对序列数据库标识符的引用，整体通过引用并入本文。除非另有说明，否则在引用序列数据库标识符时，版本号为1。

“和/或”在本文使用时，将被视为两个指定特征或组件中的每一个的具体公开具有或不具有另一个特征或组件。例如，“A和/或B”将被视为对(i)A、(ii)B和(iii)A和B中的每种情况的具体公开，就像每种情况在本文中单独列出一样。

除非上下文另有规定，否则上述特征的描述和定义不限于本发明的任何特定方面或实施方式，并且同样适用于所描述的所有方面和实施方式。在以下非限制性实施例中进一步描述本发明。

以下实施例进一步详细说明了本发明，但不应解释为限制本发明的范围。

附图说明

图1.通过蛋白质印迹检测的人肝癌SK-HEP-1细胞、人膀胱癌T24细胞、人纤维肉瘤HT-1080细胞和人结肠癌HTC-116细胞中LAT1蛋白和ASCT2蛋白的相对丰度(相对于GAPDH)。

图2.通过RT-PCR检测的在人肝癌SK-HEP-1细胞、人膀胱癌T24细胞、人纤维肉瘤HT-1080细胞和人结肠癌HTC-116细胞中LAT1 mRNA和ASCT2 mRNA的相对丰度(相对于GAPDH)。

图3.¹⁴C-L-亮氨酸通过LAT1的转运(对未标记的L-亮氨酸敏感)和¹⁴C-L-丙氨酸通过ASCT2的转运(对未标记的L-丙氨酸敏感)。与相应的对照值显著不同(****p<0.001)。

图4.使用0.5％脂质体2000作为转染剂，用针对核苷酸SEQ ID N° 6、22、34、58和61的10nM siRNA-LAT1处理24小时的肝癌SK-HEP-1细胞中LAT1 mRNA的相对丰度(A)，以及，用针对核苷酸SEQ ID N° 225、237、267和278的10nM siRNA-ASCT2处理6小时的肝癌SK-HEP-1细胞中在ASCT2 mRNA水平上ASCT2 mRNA在24小时时的相对丰度(B)。与相应的对照值(*p<0.01)和SEQ ID N° 34的值(#p<0.05)显著不同。

图5.使用0.4％脂质体2000作为转染剂，在用针对核苷酸SEQ ID N° 6、22、34、58和61的10nM siRNA-LAT1(A和C)(针对SEQ ID N° 6、22、34、58和61的抗-LAT1(A和C))处理6小时的肝癌SK-HEP-1细胞中，在24小时(A和B)或在48小时(C和D)时在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-亮氨酸(0.25μM)摄取(A和C)，以及使用0.4％脂质体2000作为转染剂，在用针对核苷酸SEQ ID N° 225、237、267和278的10nM siRNA-ASCT2处理6小时的肝癌SK-HEP-1细胞中，在24小时(A和B)或在48小时(C和D)时在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-丙氨酸(0.25μM)摄取(B和D)。与相应的对照值(*p<0.01)、SEQ ID N° 34的值(#p<0.05)和SEQ IDN° 267的值($p<0.05)显著不同。

图6.针对核苷酸SEQ ID N° 58、58t、58s1、58s2、61、61t、61s1和61s2的5'DNA有义链、5'有义链siRNA和3'反义链siRNA-LAT1。

图7.针对核苷酸SEQ ID N° 267、267t、267s1、267s2、278、278t、278s1和278s2的5'DNA有义链、5'有义链siRNA和3'反义链siRNA-ASCT2。

图8.用0.4％脂质体2000作为转染剂，在用5nM针对核苷酸SEQ ID N° 58、58t、61、61t的抗LAT1和一种商购的siRNA(来自QIAGEN的SI31011000)处理6小时的人纤维肉瘤HT-1080细胞中，在48小时时在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-亮氨酸(0.25μM)摄取(A)，以及用0.4％脂质体2000作为转染剂，用5nM针对核苷酸SEQ ID N° 267、267t、278、278t的siRNA-ASCT2和一种商购的siRNA(来自QIAGEN的SI00097930)处理6小时的人纤维肉瘤HT-1080细胞中，在48小时时在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-丙氨酸(0.25μM)摄取(B)。与相应的对照值(*p<0.01)和SEQ ID N° 267t的值($p<0.05)显著不同。

图9.用0.5％脂质体2000作为转染剂，用5或25nM针对核苷酸SEQ ID N° 58、58t、61、61t的siRNA-LAT1处理6小时的人结肠癌HTC-116细胞中，在24小时(A和B)或72小时(C和D)时的LAT1 mRNA(A和C)相对丰度，以及用0.5％脂质体2000作为转染剂，用5或25nM针对核苷酸SEQ ID N° 267、267t、278、278t的siRNA-ASCT2处理6小时的人结肠癌HTC-116细胞中，在24小时(A和B)或72小时(C和D)时的ASCT2 mRNA(B和D)相对丰度。与相应的对照值显著不同(*p<0.01)。

图10.在用(B)0.5％脂质体脂质体或注射素作为转染剂，用(A)针对核苷酸SEQ ID N° 58的siRNA-LAT1处理6小时的人结肠癌HTC-116细胞中，在72小时时的LAT1 mRNA相对丰度。与相应对照值(**p<0.01，***p<0.02；****p<0.001)和用的值(#p<0.05)显著不同。

图11.在72小时暴露后转染剂脂质体或对人结肠癌HTC-116细胞密度的作用。与相应的对照值显著不同(**p<0.01，***p<0.02)。

图12.通过琼脂糖凝胶电泳对(A)20μL和(B)80μL复合物体积的siRNA: 复合物进行siRNA复合分析。在图A中，siRNA:复合物的电泳显示当siRNA:比为1:1和在复合物混合物中的百分比大于0.9％时，siRNA完全复合。在图B中，当siRNA:比维持1:1，但在复合物混合物中的量等于或小于0.2％时，siRNA复合无效。

图13.使用(0.075和0.1％)或(0.25％)作为转染剂在72小时暴露时间时阴性对照siRNA商用(购自QIAGEN)序列NC-SI03650318和NC-SI03650325对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用。

图14.使用0.1％作为转染剂，(A)针对核苷酸SEQ ID N° 6、22、34、58、58t、58s1、58s2、61、61t，61s1、61s2的siRNA-LAT1和三种商购siRNA(分别来自QIAGEN、Thermofisher Scientific和Sigma-Aldrich的SI31011000、HSS112005和SASI_Hs01_00103513)，以及(B)针对核苷酸SEQ ID N° 225、237、267、267t、267s1、267s2、278、278t、278s1、278s2的siRNA-ASCT2和一种商购的siRNA(来自QIAGEN的SI00097930)分别在72小时的暴露时间下对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用。在图A中，值与相应的对照值(*p<0.01)、SEQ IDN° 34的值(#p<0.05)和SEQ ID N° 58的值($p<0.05)显著不同。在图B中，值与相应的对照值(*p<0.01)、SEQ ID N° 267的值(#p<0.05)和SEQ ID N° 278的值($p<0.05)显著不同。

图15.用增加含量(0.037％至0.15％)的作为转染剂，针对核苷酸SEQ IDN° 58t的siRNA-LAT1以及针对核苷酸SEQ ID N° 267t和278t的siRNA-ASCT2在72小时的暴露时间下对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用。与相应的对照值(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.02；****p<0.001)以及用的值(#p<0.05)显著不同。

图16.用0.25％脂质体2000作为转染剂，5-氟尿嘧啶(5-FU；3和10μM)、顺铂(Cisp；3和10μM)和奥沙利铂(Oxa；1和3μM)单独或与针对核苷酸SEQ ID N° 58t的siRNA-LAT1组合在使用增加浓度的72小时暴露时间下对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用。与相应的对照值(#p<0.05，####p<0.001)和用抗肿瘤细胞毒性剂5-FU、Cisp或Oxa的相应值(*p<0.05**p<0.01，***p<0.02，****p<0.001)显著不同。

图17.用0.037％作为转染剂，5-氟尿嘧啶(5-FU；10μM)单独或与抗LAT1SEQ ID N° 58t和61t(25nM)组合在72小时的暴露时间下对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用。与相应的对照值(####p<0.001)和用抗肿瘤细胞毒性剂5-FU的相应值(**p<0.01，****p<0.001)显著不同。

图18.用作为转染剂，抗LAT1 SEQ ID N° 58t和61t(25nM)和抗ASCT2 SEQID N° 267t和278t单独或组合在72小时的暴露时间下对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用。与相应的对照值*p<0.05**p<0.01，***p<0.02，****p<0.001)显著不同。

图19.用0.17％脂质体或0.1％作为转染剂，抗LAT1 SEQ ID N°58、58t、58s1、61、61t、61s1和两种商购siRNA(分别来自QIAGEN和ThermofisherScientific的SI31011000和HSS112005)在72小时的暴露时间下对(A)LAT1 mRNA相对丰度和(B)人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用。与相应的对照值(*p<0.01)、SEQ ID N° 58的值(#p<0.05)和SEQ ID N° 61的值($p<0.05)显著不同。

图20.用0.17％脂质体或0.1％作为转染剂，抗-ASCT2 SEQ ID N°267、267t、267s1、278、278t、278s1和一种商购siRNA(来自QIAGEN的SI00097930)在72小时暴露时间下对(A)ASCT2 mRNA相对丰度和(B)人结肠癌HTC-116细胞的作用。与相应的对照值(*p<0.01)，SEQ ID N° 267的值(#p<0.05)和SEQ ID N° 268的值($p<0.05)显著不同。

图21.在用人结肠癌HTC-116细胞皮下注射的免疫缺陷小鼠中开发的异种移植肿瘤模型中LAT1和ASCT2蛋白的代表性蛋白质免疫印迹。

图22.在用人结肠癌HTC-116细胞皮下注射的免疫缺陷小鼠中开发的异种移植肿瘤模型中通过RT-PCR获得的LAT1 mRNA和ASCT2 mRNA的相对丰度(相对于GAPDH)，以及通过蛋白质免疫印迹获得的LAT1蛋白和ASCT2蛋白的相对丰度(相对于GAPDH)。

图23.在用人结肠癌HTC-116细胞皮下注射的免疫缺陷小鼠中开发并且每隔一天瘤内注射溶媒(50μL)或抗LAT1 SEQ ID N° 58t(10μg)和抗ASCT2 SEQ ID N°278t(10μg)处理的异种移植肿瘤模型中的相对肿瘤体积。由SEQ ID N° 58t和SEQ ID N°278t诱导的相对肿瘤体积的减少是统计学显著的，p值分别为0.0018和0.0051。

图24.LAT1优选的靶序列的表。

图25.ASCT2优选的靶序列的表。

图26.LAT1靶序列和siRNA的表。

图27.ASCT2靶序列和siRNA的表。

具体实施方式

材料和方法

细胞培养

将SK-HEP-1、T24、HT-1080和HCT-116细胞系维持在37℃的5％CO₂的潮湿气氛中。SK-HEP-1细胞在补充有20％胎牛血清(FBS)(英国Gibco)、100U/mL青霉素G、0.25μg/mL两性霉素B、100μg/mL链霉素(英国Gibco)、25mM碳酸氢钠(德国Merck)和25mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙醇磺酸(HEPES)(密苏里州圣路易Sigma)的RPMI-1640(密苏里州圣路易Sigma)中生长。T24和HT-1080细胞分别在补充有10％FBS(英国Gibco)、100U/mL青霉素G、0.25μg/mL两性霉素B、100μg/mL链霉素(英国Gibco)、25mM碳酸氢钠(Merck，德国)和25mM HEPES(密苏里州圣路易Sigma)的杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)-高葡萄糖(密苏里州圣路易Sigma)和DMEM-低葡萄糖(密苏里州圣路易Sigma)中生长。HCT-116细胞在补充有10％FBS(英国Gibco)、100U/mL青霉素G、0.25μg/mL两性霉素B、100μg/mL链霉素(英国Gibco)、25mM碳酸氢钠(德国Merck)和25mM HEPES(密苏里州圣路易Sigma)的McCoy’s 5A中生长。对于所有细胞系，每2天更换培养基，并且在初始接种后3-4天细胞汇合。对于传代培养，将细胞用0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(密苏里州圣路易Sigma)解离，以1:15或1:20分开，在21cm²生长区(德国Sarstedt)中传代培养。

LAT1和ASCT2蛋白表达

将细胞用冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗两次，并用100μL RIPA裂解缓冲液(154mM氯化钠，65.2mM Trizma碱，1mM EDTA，1％NP-40(IGEPAL)，6mM脱氧胆酸钠)孵育，所述RIPA裂解缓冲液中含有蛋白酶抑制剂：1mMPMSF，1μg/mL亮抑酶肽和1μg/mL抑肽酶；和磷酸酶抑制剂：1mM Na₃VO₄和1mM NaF。将细胞刮下并进行短暂超声处理。使等量的总蛋白质(30μg)在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并电转移到含有20％甲醇的Tris-甘氨酸转移缓冲液中硝酸纤维素膜上。将印迹转移片在5％脱脂奶粉的Tris缓冲盐水溶液(TBS)中封闭60分钟，然后在4℃下用以下抗体孵育过夜：兔抗-LAT1(1:1000；Cell Signaling)；兔抗ASCT2(1:1000；Cell Signaling)；或小鼠单克隆抗GAPDH(1:20,000；Santa Cruz BiotechnologyInc.)，上述抗体在2.5％脱脂奶粉的TBS-吐温20(0.1％vol/vol)溶液中稀释。随后洗涤免疫印迹并与荧光标记的山羊抗兔二抗(1:20,000；IRDye^Tm 800，Rockland)或荧光标记的山羊抗小鼠二抗(1:20,000；AlexaFluor 680，Molecular Probes)在室温(RT)避光下孵育60分钟。洗涤膜并使膜通过Odyssey红外成像系统(LI-COR Biosciences)在700nm和800nm下扫描成像。

LAT1和ASCT2基因表达

使用SV总RNA分离系统(Promega，USA)根据制造商的说明分离和纯化总RNA。在NanoDrop ND1000分光光度计(Thermo Scientific，USA)中验证RNA质量和浓度，并通过琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性和基因组DNA污染。根据说明书，使用用于RT-qPCR的MaximaScientific第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific，USA)将总RNA(1μg)转化为cDNA。使用以下方案：第1步，25℃下10分钟；第2步，50℃下15分钟；第3步，85℃下5分钟。将cDNA用于在StepOnePlus仪器(Applied Biosystems，USA)中使用Maxima SYBR Green qPCRMaster Mix(Thermo Scientific，USA)进行qPCR分析。使用针对LAT1和ASCT2以及内源对照基因GAPDH进行QuantiTect Primer Assay(德国Quiagen)。在96孔PCR板(德国Sarstedt)中如下进行qPCR反应：95℃下10分钟进行1个循环，然后95℃下15秒和60℃下60秒进行40个PCR循环。在qPCR后立即作出解链曲线，以证明扩增的特异性。始终不评估每个靶基因的模板对照。通过StepOnePlus 2.3软件自动产生定量循环(Cq)值，并且靶基因的比例表示为与内源对照基因GAPDH相比。实时PCR效率在90％到110％之间。

LAT1活性

将细胞接种在24孔板(德国Sarstedt)中并生长直至汇合。在实验当天，吸出细胞培养基，并将细胞在Hanks'培养基(NaCl 140mM，KCl 5mM，MgSO₄·7H₂O 0.8mM，K₂HPO₄0.33mM，KH₂PO₄ 0.44mM，MgCl₂·6H₂O 1mM，CaCl₂ 0.025mM，Tris-HCl 9.75mM，pH 7.4)中将细胞预孵育15分钟。在不存在和存在3mM未标记的L-亮氨酸的情况下通过添加具有0.25μM[¹⁴C]-L-亮氨酸的Hanks培养基来启动摄取。在预孵育和孵育期间，使细胞连续摇动并保持在37℃下。通过由连接到巴斯德吸管的真空泵快速除去摄取溶液1分钟后，终止摄取，然后用Hanks'培养基快速洗涤。随后，将细胞溶解于0.1％vol/vol的Triton X-100(溶于5mMTris-HCl，pH7.4)中，并通过液体闪烁计数测量放射性。

ASCT2活性

将细胞接种在24孔板(德国Sarstedt)中并生长直至汇合。在实验当天，吸出细胞培养基，并将细胞在Hanks'培养基(ChCl 140mM，KCl 5mM，MgSO₄·7H₂O 0.8mM，K₂HPO₄0.33mM，KH₂PO₄ 0.44mM，MgCl₂·6H₂O 1mM，CaCl₂ 0.025mM，Tris-HCl 9.75mM，pH 7.4)中将细胞预孵育15分钟。在不存在和存在3mM未标记的L-丙氨酸的情况下通过添加具有0.25μM[¹⁴C]-L-丙氨酸的Hanks培养基来启动摄取。在预孵育和孵育期间，使细胞连续摇动并保持在37℃下。通过由连接到巴斯德吸管的真空泵快速除去摄取溶液1分钟后，终止摄取，然后用Hanks'培养基快速洗涤。随后，将细胞溶解于0.1％vol/vol的Triton X-100(溶于5mMTris-HCl，pH7.4)中，并通过液体闪烁计数测量放射性。

LAT1基因沉默

将细胞接种于24孔(德国Sarstedt)或6孔板(德国Sarstedt)或黑壁透明底的96孔板(美国BD Biosciences)中，并在正常生长条件下孵育24小时。将抗LAT1的siRNA和转染剂稀释至所需浓度，并根据转染剂制造商的说明进行混合。将混合物在室温下孵育20分钟以形成siRNA-复合物，之后将其添加到细胞中并在37℃，5％CO₂下孵育。孵育期后，恢复血清和抗生素，并将细胞在正常条件下进一步培养所需的时间点，直至评估LAT1活性或LAT1表达(免疫印迹和RT-qPCR)。

ASCT2基因沉默

将细胞接种于24孔(德国Sarstedt)或6孔板(德国Sarstedt)或黑壁透明底的96孔板(美国BD Biosciences)中，并在正常生长条件下孵育24小时。将抗ASCT2的siRNA和转染剂稀释至所需浓度，并根据转染剂制造商的说明进行混合。将混合物在室温下孵育20分钟以形成siRNA-复合物，之后将其添加到细胞中并在37℃，5％CO₂下孵育。孵育期后，恢复血清和抗生素，并将细胞在正常条件下进一步培养所需的时间点，直至评估ASCT2活性或ASCT2表达(免疫印迹和RT-qPCR)。

细胞增殖试验

使用钙黄绿素-AM(美国Thermo Fisher Scientific)测量细胞增殖。膜透性钙黄绿素-AM(一种非荧光染料)被细胞内酯酶吸收并转化为发出绿色荧光的膜非渗透性钙黄绿素。将细胞接种在黑壁透明底的96孔板中(美国BD Biosciences)，并在正常生长条件下孵育24小时。将细胞与测试物在37℃，5％CO₂下孵育。孵育期后，恢复血清和抗生素，并将细胞在正常条件下进一步培养72小时。用测试物质或溶媒处理后用Hanks'培养基洗涤细胞两次，并在37℃下将细胞在Hanks培养基中加入2μM钙黄绿素-AM 30分钟。在微孔板分光荧光计(Gemini EM，Molecular Devices)中在485nm激发波长和530nm发射波长下测量荧光。每孔进行九次连续荧光测量，以使得对孔的整个区域中进行荧光读数，然后将该读数考虑用于计算每孔的平均荧光。为了确定钙黄绿素的最小染色(钙黄绿素_最小值)，在加入钙黄绿素-AM之前用乙醇处理8个孔30分钟。细胞数百分比计算为[(钙黄绿素_样品)/(钙黄绿素_对照)]×100。

动物及肿瘤植入

人结肠癌HTC-116细胞在组织培养物中生长，每只小鼠注射10⁷个细胞到雌性NMRInu/nu小鼠的后胁腹中。一旦肿瘤发展并且肿瘤体积达到随机化标准，每隔一天开始肿瘤内注射治疗。在研究中包括作为对照的溶媒处理组。使用来自查尔斯河实验室(CharlesRiver)的雌性免疫缺陷NMRI nu/nu小鼠。交付时动物为4至6周龄，并在至少1周的隔离期后用于植入。所有动物干预均按照欧洲指令编号86/609和“实验动物护理和使用指南”，1996年第7版，实验动物研究所(ILAR)，华盛顿特区的规定进行。仅选择无异议地健康的动物进入测试程序。在实验期间，至少每天监测动物。每个笼子都标有表明动物来源、性别和交付日期的记录卡。在肿瘤植入期间或在开始剂量测定实验时对动物进行编号。

通过在随机化当天(第0天)以及随后每周两次地用卡尺进行二维测量，测定肿瘤的体积。根据以下等式计算肿瘤体积：

肿瘤体积[mm³]＝a[mm]×b²[mm²]×0.5

其中“a”是最大直径，“b”是表示为理想椭圆体的肿瘤的垂直直径。

通过第X天的相应肿瘤的绝对体积(T_x)[mm³]除以随机化当天(即在第0天)相同肿瘤的绝对体积(T₀)再乘以100来计算第X天的个体肿瘤的相对体积(RTV_x)，如下式所示：

RTV用于如下的生长表征和化合物活性评级：

计算RTV的组中位数和范围(或者几何平均值+/-SEM)，仅考虑在所讨论的那天存活的动物的肿瘤(对于中位数)。组中位数(几何平均值)RTV用于绘制肿瘤生长曲线和用于治疗评估。

根据测试组的中位数RTV和对照组的中位数RTV乘以100来计算特定日的肿瘤抑制(T/C_x)，如下式所示：

在实验期间针对特定组记录的最适/最小/最佳T/C[％]值表示相应治疗的最大抗肿瘤活性，并评定如下：

肿瘤体积二倍增/四倍增时间(DT/QT)定义为组达到初始肿瘤体积的200/400％的中位数RTV所需的时间间隔(以天计)。生长延迟定义为测试组和相应对照组的肿瘤体积二倍增和四倍增时间之间的天数差异。

非病毒递送siRNA系统

1.携带治疗性siRNA-LAT1试剂的脂质体能够穿过靶细胞的膜以递送承载物。可使用大量脂质合成用于递送siRNA的脂质体。可与siRNA-LAT1复合的中性脂质包括DOPE(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、卵PC(磷脂酰胆碱)、DOPC(1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱)和DPPE(1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺)。

2.可与siRNA-LAT1复合的阳离子脂质包括DOTAP(1,2-二醇-3-三甲基铵丙烷)，CDAN(N(1)-胆固醇氧基羰基-3,7-二氮杂壬烷-1,9-二胺)/DOPE、DC-Chol(3β-[N-(N',N'-二甲基氨基乙烷)氨基甲酰基]胆固醇)/DOPE、DOTAP/DOPE、阳离子脂质RPR209120(2-(3-[双-(3-氨基-丙基))-氨基]-丙氨基)-N-双十四烷基氨基甲酰基甲基乙酰胺)。半乳糖基化(Gal-C4-Chol/DOPE)脂质体/siRNA-LAT1复合物也可以诱导基因沉默。

3.阳离子聚合物也可用于siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2递送。这些物质与阴离子siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2结合形成可以通过复合物的阳离子部分与带负电的细胞表面相互作用的siRNA-LAT1-聚合物复合物或siRNA-ASCT2-聚合物复合物。在可用的聚合物中，聚乙烯亚胺(PEI)具有与带负电荷的siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2强烈结合的能力。已知可生物降解的聚合物如聚(L-赖氨酸)(PLL)具有比PEI更低的毒性和更高的生物相容性。PLL的衍生物聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸]比原始的PLL聚合物表现出更高的转染效率和更低的免疫原性和细胞毒性，并且可以与siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2一起使用。

4.阳离子化明胶微球可通过在油包水乳液状态下化学交联明胶来制备。为了将siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2表达质粒DNA包裹在阳离子化明胶微球中，可以将含有siRNA-LAT1表达质粒DNA的PBS滴到冷冻干燥的阳离子化明胶微球上，然后在4℃下保持24小时。

5.可以基于三聚磷酸酯(TPP)与壳聚糖的改性离子凝胶化来制备纳米颗粒。可以使用两种不同类型的壳聚糖(壳聚糖盐酸盐和谷氨酸盐)，其中每种具有两种不同分子量。在室温下恒磁搅拌下将TPP水溶液加入壳聚糖溶液中，可以自发地获得纳米颗粒。然后可以在室温下孵育颗粒，然后使用或用于进一步分析。通过离心来收集纳米颗粒。弃去上清液，将纳米颗粒重悬于过滤的蒸馏水中。对于siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2与壳聚糖-TPP纳米颗粒的结合(壳聚糖-TPP-siRNA-LAT1或壳聚糖-TPP-siRNA-ASCT2)，将siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2的双蒸水溶液添加到TPP溶液中，然后将其在室温下恒磁搅拌下滴加到壳聚糖溶液中。然后在室温下孵育颗粒，然后使用或用于进一步分析。

6.将壳聚糖(114kDa)溶解在乙酸钠缓冲液中，得到0.2至1mg/ml的工作溶液范围。在搅拌下将20μL siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2(20至250μm范围)添加到1ml过滤的壳聚糖中并放置1小时。为了计算特定的N:P比(定义为壳聚糖氨基/RNA磷酸基团的摩尔比)，对于RNA，使用的每个磷酸基分子质量为325Da，对于壳聚糖，质荷比为167.88(84％脱乙酰化)。

7.可以将siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2包封在稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)中并通过静脉内注射给药。SNALP制剂含有脂质3-N-[(ω-甲氧基聚(乙二醇)₂₀₀₀)氨基甲酰基]-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙胺(PEG-DMA)、1,2-亚油醇基氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙酮(DLinDMA)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和胆固醇。

8.可以将siRNA-LAT1或siRNA-ASCT2包封在注射素体内注射SiRNa递送试剂(法国土伦BioCellChallenge SAS)中并通过静脉内注射给药。注射制剂含有以下的混合物：10μgsiRNA在10μL含葡萄糖缓冲液、40μL含无菌无RNA酶水、10μL注射素试剂中。混合物应通过上下吸移混合，并在室温下孵育15分钟，然后注射。

实施例1

人癌细胞中LAT1和ASCT2的免疫印迹

通过使用针对LAT1和ASCT2产生的抗体的免疫印迹来研究LAT1蛋白和ASCT2的存在。如图1所示，针对LAT1和ASCT2产生的抗体识别出所有癌细胞系中LAT1和ASCT2的存在。

实施例2

LAT1和ASCT2基因在人癌细胞中的表达

通过使用针对ASCT2的引物的实时PCR来研究LAT1和ASCT2 mRNA的存在。如图2所示，在所有癌细胞系中发现了相对于管家基因GADPH的LAT1和ASCT2基因的表达。

实施例3

[¹⁴C]-L-亮氨酸和[¹⁴C]-L-丙氨酸摄取

如图3A至3D所示，通过3mM未标记的L-亮氨酸，在初始摄取速率(1分钟)下上皮癌细胞中的钠依赖性[¹⁴C]-L-亮氨酸(0.25μM)摄取显著(P<0.001)减少。如图3E至3H所示，通过3mM未标记的L-丙氨酸，在初始摄取速率(1分钟)下上皮癌细胞中的钠依赖性[¹⁴C]-L-丙氨酸(0.25μM)摄取显著(P<0.001)减少。

实施例4

LAT1和ASCT2基因在人癌细胞中的表达

如图4A所示，用针对核苷酸序列N° 6、N° 22、N° 34、N° 58和N° 61的siRNA-LAT1(例如，分别包括SEQ ID NO:110、126、138、162和165或由其组成的siRNA)处理细胞6小时使得在24小时时肝癌SK-HEP-1细胞中LAT1mRNA相对丰度降低。针对核苷酸SEQ N° 58的siRNA-LAT1的作用显著高于针对核苷酸SEQ N° 34的siRNA-LAT1(p<0.05)。如图4B所示，用针对核苷酸序列N° 225、N° 237、N° 267和N° 278的siRNA-ASCT2(例如，分别包括SEQ IDNO:314、326、356和367或由其组成的siRNA)处理细胞6小时使得在24小时时肝癌SK-HEP-1细胞中ASCT2 mRNA相对丰度降低。针对核苷酸SEQ N° 278的siRNA-ASCT2的作用显著高于(p<0.05)针对核苷酸SEQ N° 267的siRNA-ASCT2。

实施例5

[¹⁴C]-L-亮氨酸和[¹⁴C]-L-丙氨酸摄取

如图5A和5C，用针对核苷酸序列N° 6、N° 22、N° 34、N° 58和N° 61的siRNA-LAT1(例如，分别包括SEQ ID NO:110、126、138、162和165或由其组成的siRNA)处理细胞6小时使得在24小时和48小时时肝癌SK-HEP-1细胞中在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-亮氨酸(0.25μM)摄取降低。针对核苷酸SEQ N° 58的siRNA-LAT1的作用显著高于(p<0.05)针对核苷酸SEQ N° 34的siRNA-LAT1。如图5B和5D所示，用针对核苷酸序列N° 225、N° 237、N° 267和N° 278的siRNA-ASCT2(例如，分别包括SEQ ID NO:314、326、356和367或由其组成的siRNA)处理细胞6小时使得在24小时和48小时时肝癌SK-HEP-1细胞中在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-丙氨酸(0.25μM)摄取降低。

实施例6

siRNA-LAT1和siRNA-ASCT2的修饰

针对核苷酸序列N° 58和N° 61的siRNA-LAT1(例如分别包括SEQ ID NO:162和165或由其组成的siRNA)在图6中示出(针对核苷酸SEQ ID N° 58、58t、58s1、58s2、61、61t、61s1和61s2的5'DNA有义链、5'有义siRNA和3'反义siRNA-LAT1)。针对核苷酸序列N° 267和N° 278的siRNA-ASCT2(例如分别包括SEQ ID NO:356和367或由其组成的siRNA)在图7中示出(针对核苷酸SEQ ID N° 267、267t、267s1、267s2、278、278t、278s1和278s2的5'DNA有义链、5'有义siRNA和3'反义siRNA-ASCT2)。

实施例7

[¹⁴C]-L-亮氨酸和[¹⁴C]-L-丙氨酸摄取

如图8A所示，用针对如本文所述的核苷酸序列N° 58、N° 61、N° 58t、N° 61t的siRNA-LAT1和商购的SI31011000处理细胞6小时使得在48小时时纤维肉瘤HT-1080细胞中在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-亮氨酸(0.25μM)摄取降低。如图8B所示，用针对核苷酸序列N° 267、N° 278、N° 267t和N° 278t的siRNA-ASCT2(例如，分别为包括SEQ ID NO:356、367或由其组成的siRNA，或包括作为有义链的SEQ ID NO:399和作为反义链的SEQ IDNO:400或由其组成的siRNA，或包括作为有义链的SEQ ID NO:405和作为反义链的SEQ IDNO:406或由其组成的siRNA)和商购的SI00097930处理细胞6小时使得在48小时时纤维肉瘤HT-1080细胞中在初始摄取速率(1分钟)下的[¹⁴C]-L-丙氨酸(0.25μM)摄取降低。针对核苷酸SEQ N° 278t的siRNA-ASCT2的作用显著高于针对核苷酸SEQ N° 267t的siRNA-ASCT2。

实施例8

LAT1和ASCT2基因在人癌细胞中的表达

如图9A和9C所示，用针对核苷酸序列N° 58、N° 61、N° 58t、N° 61t的siRNA-LAT1(例如，分别为包括SEQ ID NO:162、165或由其组成的siRNA，或包括作为有义链的SEQ IDNO:387和作为反义链的SEQ ID NO:388或由其组成的siRNA，或包括作为有义链的SEQ IDNO:393和作为反义链的SEQ ID NO:394或由其组成的siRNA)处理细胞6小时使得在24小时或48小时时人结肠癌HTC-116细胞中LAT1 mRNA相对丰度降低。如图9B和9C所示，用针对核苷酸序列N° 267、N° 278、N° 267t和N° 278t的siRNA-ASCT2(例如，分别为包括SEQ ID NO:356、367或由其组成的siRNA，或包括作为有义链的SEQ ID NO:399和作为反义链的SEQ IDNO:400或由其组成的siRNA，或包括作为有义链的SEQ ID NO:405和作为反义链的SEQ IDNO:406或由其组成的siRNA)处理细胞6小时使得在24小时或48小时时人结肠癌HTC-116细胞中ASCT2 mRNA相对丰度降低。

实施例9

LAT1基因在人癌细胞中的表达

如图10A和10B所示，当用0.5％脂质体脂质体或作为转染剂时，用针对核苷酸序列58t的siRNA-LAT1(例如，包括作为有义链的SEQ ID NO:387和作为反义链的SEQ ID NO:388或由其组成的siRNA)处理细胞6小时使得在72小时时人结肠癌HTC-116细胞中ASCT2 mRNA相对丰度以浓度依赖性的方式降低。

实施例10

人结肠癌HTC-116细胞、转染剂和阴性对照的细胞增殖

如图11A所示，用0.5％脂质体处理人结肠癌HTC-116细胞6小时，在72小时时不影响细胞增殖。与此相反，如图11B所示，用处理人结肠癌HTC-116细胞，在72小时时会以0.1％、0.113和0.115％的统计学显著方式来影响细胞增殖。注射素是基于脂质的siRNA转染剂。制造商的说明推荐每μL的试剂使用1μg siRNA(比为1:1)，其中注射素试剂的体积对应于总复合物混合物的20％。对于体内测定，siRNA:复合物完全按照制造商的建议来制备。对于体外测定，使所使用的siRNA浓度缩减，因此在总siRNA:复合物中维持20％是不可行的。基于这样的理由，使用不同的在复合物混合物中的百分比评估siRNA复合效果和siRNA:转染效率。siRNA: 复合物的电泳显示当siRNA:比为1:1且在复合物混合物中的百分比大于0.9％时，siRNA完全复合(图12A)。但是，当siRNA:比维持1:1，而在复合物混合物中的量等于或小于0.2％时，siRNA复合无效(图12B)。该数据表明，当复合物中的百分比低于0.2％时，推荐的每μL的使用1μg siRNA的比不再有效。因此，需要增加每μg siRNA使用的量以获得更有效的siRNA:复合物。相似地，复合物混合物中的量的增加增强了siRNA序列对细胞增殖的影响(图15)，证明随着siRNA转染混合物中的量增高，siRNA:复合物的转染效率增强。如图13所示，使用(0.075和0.1％)或脂质体2000(0.25％)作为转染剂，阴性对照siRNA商购(来自QIAGEN)序列NC-SI03650318和NC-SI03650325在72小时的暴露时间时没有显著影响人结肠癌HTC-116细胞的增殖。

实施例11

人结肠癌HTC-116细胞的细胞增殖

如图14A所示，用0.1％作为转染剂，用如本文所述的针对核苷酸序列N°6、N° 22、N° 34、N° 58、N° 58t、N° 58s1、N° 58s2、N° 61、N° 61t、N° 61s1、N° 61s2的siRNA-LAT1以及三种商购的siRNA(分别来自QIAGEN、Thermofisher Scientific和Sigma-Aldrich的SI31011000、HSS112005和SASI_Hs01_00103513)处理细胞6小时使得在72小时曝光时间时细胞的增殖降低。针对核苷酸SEQ N° 58的siRNA-LAT1的作用显著高于(p<0.05)针对核苷酸SEQ N° 34的siRNA-LAT1，针对核苷酸SEQ N° 58s1和58s2的siRNA-LAT1的作用显著高于(p<0.05)针对核苷酸SEQ N° 58的siRNA-LAT1。如图14B所示，用0.1％作为转染剂，用如本文所述的针对核苷酸序列N° 267、N° 267t、N° 267s1、N° 267s2、N° 278、N° 278t、N° 278s1、N° 278s2的siRNA-ASCT2以及一种商购的siRNA(来自QIAGEN的SI00097930)处理细胞6小时使得在72小时曝光时间时细胞的增殖降低。针对核苷酸SEQ N°267t和N° 267s2的siRNA-ASCT2的作用显著高于(p<0.05)针对核苷酸SEQ N° 278s1的siRNA-ASCT2，针对核苷酸SEQ N° 278s1和N° 278s2的siRNA-ASCT2的作用显著高于(p<0.05)针对核苷酸SEQ N° 278的siRNA-ASCT2

如图15A所示，用针对核苷酸序列N° 58的siRNA-LAT1(例如，包括作为有义链的SEQ ID NO:387和作为反义链的SEQ ID NO:388或由其组成的siRNA)处理细胞6小时以及分别如图15B和15C所示的用针对核苷酸序列N° 267t和N° 278t的siRNA-ASCT2(例如，分别为包括作为有义链的SEQ ID NO:399和作为反义链的SEQ ID NO:400或由其组成的siRNA，或包括作为有义链的SEQ ID NO:405和作为反义链的SEQ ID NO:406或由其组成的siRNA)处理细胞6小时，使得在72小时暴露时间时细胞增殖降低，这种降低随着siRNA:复合物中浓度变高而增大。这在针对核苷酸序列N° 58t的siRNA-LAT1和针对核苷酸序列N° 278t的siRNA-ASCT2的情况下尤其明显。

实施例12

在细胞毒性抗肿瘤剂存在下人结肠癌HTC-116细胞的细胞增殖

如图16所示，在72小时暴露时间时，如本文所述的针对核苷酸序列N° 58t的siRNA-LAT1与细胞毒性抗肿瘤剂5-氟尿嘧啶(5-FU；3和10μM)、顺铂(Cisp；3和10μM)和奥沙利铂(Oxa；1和3μM)组合使得以浓度依赖性方式地比细胞毒性抗肿瘤剂5-氟尿嘧啶(5-FU；3和10μM)、顺铂(Cisp；3和10μM)和奥沙利铂(Oxa；1和3μM)单独的对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用增强。如图17A所示，在72小时暴露时间，单独的细胞毒性抗肿瘤剂5-氟尿嘧啶(5-FU；10μM)对人结肠癌HTC-116细胞增殖的作用通过如本文所述的针对核苷酸序列N° 58t的siRNA-LAT1而增强，但不通过如本文所述的针对核苷酸序列N° 61t的siRNA-LAT1而增强。类似地，如图17B所示，通过如本文所述的针对核苷酸序列N° 278t的siRNA-ASCT2增强由细胞毒性抗肿瘤剂5-氟尿嘧啶(5-FU；10μM)产生的作用比通过如本文所述的针对核苷酸序列N° 267t的siRNA-ASCT2增强这种作用更显著。

实施例13

在抗LAT1和抗ASCT2 siRNA存在下人结肠癌HTC-116细胞的细胞增殖

如图18A所示，在72小时暴露时间时，在非有效条件(0.037％)下，如本文所述的针对核苷酸序列N° 58t的siRNA-LAT1对人结肠癌HTC-116细胞的增殖的显著降低被如本文所述的针对核苷酸序列N° 278t的siRNA-ASCT2所增强。类似地，如图18B所示，在72小时暴露时间时，在非有效条件(0.037％)下，如本文所述的针对核苷酸序列N°58t的siRNA-LAT1对人结肠癌HTC-116细胞的增殖的显著降低被如本文所述的针对核苷酸序列N° 267t的siRNA-ASCT2所增强。

实施例14

在抗LAT1和抗ASCT2 siRNA存在下人结肠癌HTC-116细胞的LAT1和ASCT2基因表达和细胞增殖

如图19A所示，用如本文所述的针对核苷酸序列N° 58、N° 58t、N° 58s1、N° 61、N°61t、N° 61s1的siRNA-LAT1和两种商购siRNA(分别来自QIAGEN和ThermofisherScientific的SI31011000和HSS112005)处理细胞6小时使得人结肠癌HTC-116细胞中的LAT1 mRNA相对丰度显著降低，尽管针对核苷酸序列N° 58t、N° 58s1的siRNA-LAT1的作用更明显。如图19B所示，用如本文所述的针对核苷酸序列N° 58、N° 58t、N° 58s1、N° 61、N°61t、N° 61s1的siRNA-LAT1和两种商购siRNA(分别来自QIAGEN和ThermofisherScientific的SI31011000和HSS112005)处理细胞6小时使得在72小时时人结肠癌HTC-116细胞的增殖显著降低，尽管针对核苷酸序列N° 58、N° 58t、N° 58s1的siRNA-LAT1的作用更明显。

如图20A所示，用如本文所述的针对核苷酸序列N° 267、N° 267t、N° 2678s1、N°278、N° 278t、N° 278s1的siRNA-ASCT2和一种商购siRNA(来自QIAGEN的SI00097930)处理细胞6小时使得人结肠癌HTC-116细胞中的ASCT2 mRNA相对丰度显著降低，尽管针对核苷酸序列N° 267t、N° 278t的siRNA-LAT1作用更明显。如图20B所示，用如本文所述的针对核苷酸序列N° 267、N° 267t、N° 2678s1、N° 278、N° 278t、N° 278s1的siRNA-ASCT2和一种商购siRNA(来自QIAGEN的SI00097930)处理细胞6小时使得在72小时时人结肠癌HTC-116细胞的增殖显著降低，尽管用针对核苷酸序列N° 278t的siRNA-ASCT2起的作用更明显。

实施例15

在异种移植肿瘤模型中进行LAT1和ASCT2免疫印迹

通过使用针对LAT1和ASCT2产生的抗体的免疫印迹来研究LAT1蛋白和ASCT2的存在。如图21所示，针对LAT1和ASCT2产生的抗体识别出来源自人结肠癌HTC-116细胞的两种肿瘤(T1和T2)中LAT1和ASCT2的存在。

实施例16

LAT1和ASCT2基因在人癌细胞中的表达

通过使用针对LAT1和ASCT2的引物的实时PCR来研究LAT1和ASCT2 mRNA的存在。如图22所示，在来源自人结肠癌HTC-116细胞的两种肿瘤(T1和T2)中发现了相对于管家基因GADPH的LAT1和ASCT2基因表达。

实施例17

肿瘤生长

如图23所示，在用人结肠癌HTC-116细胞皮下注射的免疫缺陷小鼠中开发并每隔一天瘤内注射溶媒或如本文所述的针对核苷酸序列N° 58t的siRNA-LAT1(10μg)和针对核苷酸序列N° 278t的siRNA-ASCT2(10μg)处理异种移植肿瘤模型中的相对肿瘤体积。核苷酸序列N° 58t的siRNA-LAT1(10μg)和针对核苷酸序列N° 278t的siRNA-ASCT2(10μg)导致的相对肿瘤提及的减少是统计学显著的，p值分别为0.0018和0.0051。

结论

用siRNA-LAT1和/或siRNA-ASCT2处理表达LAT1和/或ASCT2转运体的癌细胞导致LAT1和/或ASCT2蛋白的降低以及[¹⁴C]-L-亮氨酸摄取降低和[¹⁴C]-L-丙氨酸摄取降低，这伴随着细胞增殖的降低。由siRNA-LAT1和/或siRNA-ASCT2诱导的癌细胞的细胞活力和增殖的降低伴随细胞凋亡和肿瘤生长及转移潜力的降低，正如在人结肠癌HTC-116细胞的裸鼠皮下肿瘤中所证明。

本发明的其他方面对于本领域技术人员来说是显而易见的，或者可以从本发明的实践中获知。借助于所附权利要求中特别指出的手段和组合，可以实现和获得本发明的目的和优点。

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Claims

1.siNA(短干扰核酸)分子，其中，所述分子靶向选自SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:297或其变体的至少一个序列或与选自SEQ ID NO:1至SEQ IDNO:104和SEQ ID NO:209至SEQ ID NO:297或其变体的序列互补的至少一个序列，所述分子用于作为药物。

2.根据权利要求1所述的siNA分子，其特征在于，所述siNA特异性地靶向选自SEQ IDNo 4、6、10、13、22、34、58、61、81、83、87和95至104或其变体中的至少一个序列，并且其中，所述分子降低LAT1基因的表达。

3.根据权利要求1所述的siNA分子，其特征在于，所述siNA特异性地靶向选自SEQ IDNO:209、216、225、226、228、235至238、245、260、264、267、271、272、278、279和281至297或其变体中的至少一个序列，并且其中，所述分子降低ASCT2基因的表达。

4.根据前述权利要求中任一项所述的siNA分子，其特征在于，所述分子的长度为19至25个碱基对。

5.根据前述权利要求中任一项所述的siNA分子，其特征在于，所述siNA选自dsRNA、siRNA或shRNA。

6.根据权利要求5所述的siNA分子，其特征在于，所述siNA是siRNA。

7.根据前述权利要求中任一项所述的siNA分子，其特征在于，所述siNA包含5'和/或3'突出端。

8.根据前述权利要求中任一项所述的siNA分子，其特征在于，所述siNA包含至少一种化学修饰。

9.根据前述权利要求中任一项所述的siNA分子，其特征在于，所述siNA分子包含有义链，优选包含有义链和反义链，其中，所述有义链包含选自SEQ ID NO:105至208和298至386的序列或其变体。

10.根据权利要求9所述的siNA分子，其特征在于，优选地，所述有义链包含选自108、110、114、117、126、138、162、165、185、187、191和199至208或其变体中的至少一个序列，其中优选地，所述分子降低LAT1基因的表达。

11.根据权利要求1至8中任一项所述的siNA分子，其特征在于，优选地，所述有义链包含选自298、305、314、315、317、324至327、334、349、353、356、360、361、367、368和370至386或其变体的至少一个序列，其中优选地，所述分子降低ASCT2基因的表达。

12.根据前述权利要求中任一项所述的siNA分子，其特征在于，所述有义链包含选自SEQ ID NO:387、389、391、393、395、397、399、401、403、405、407和409或其变体的序列，所述反义链包含选自SEQ ID NO:388、390、392、394、306、398、400、402、404、406、408和410或其变体的序列。

13.一种药物组合物，其包含至少一个根据前述权利要求中任一项所述的siNA和药学上可接受的载体。

14.根据前述权利要求中任一项所述的siNA分子，其用于治疗癌症。

15.根据权利要求14所述的siNA分子，其特征在于，所述癌症选自膀胱癌、血液癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、乳腺癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌和子宫癌。

16.一种治疗癌症的方法，所述方法包括将根据权利要求1至12中任一项所述的siNA或根据权利要求13所述的药物组合物给药至有需要的患者。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述癌症选自膀胱癌、血液癌、脑癌、结肠癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、淋巴结癌、乳腺癌、转移癌、肌肉癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌和子宫癌。

18.根据权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给药抗癌剂。

19.一种治疗癌症的方法，包括将根据权利要求1至12中任一项所述的siNA与一种或多种抗癌剂的组合给药至有需要的患者，优选地其中，所述抗癌剂包含抗肿瘤剂。

20.一种减少细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞与根据权利要求1至12中任一项所述的siNA接触。

21.一种核酸构建体或载体，其包含编码根据权利要求1至12中任一项所述的siNA的核酸序列。

22.一种细胞，其包含根据权利要求21所述的核酸构建体或载体。