CN110982910A - 一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用 - Google Patents

一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用。所述circRNA为circSETD2，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明针对circSETD2设计特异性扩增引物，经PCR扩增及RNase R酶消化验证所述的circSETD2的真实存在。利用荧光定量PCR检测到circSETD2在猪睾丸支持细胞以及在输精管、附睾头中高表达。在75d和270d“梅山”公猪睾丸中表达量极显著高于同日龄“杜洛克”公猪睾丸中表达量(p<0.01)。本发明公开的circSETD2有望作为与公猪繁殖相关的分子标志物，在种公猪的选择评定及遗传改良中具有较大的应用价值。

Description

一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用
技术领域
本发明属于家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种与公猪繁殖性状相关的circRNA 及应用。
背景技术
睾丸的发育影响精子的产生及各种雄性激素的分泌，进而影响公猪的繁殖性能，而公猪的初情期和性成熟期与睾丸发育密切相关，因此探究公猪的睾丸发育调控对种公猪的选育具有指导性作用(姜勋平；1998)。梅山公猪繁殖性能高，性成熟较早，与其他品系母猪杂交后代育肥效果较好，体格大，瘦肉率多，胴体重及饲料利用率高，适用于多品种猪群杂交的育肥改良(甘丽娜；2017)。杜洛克公猪瘦肉率高，增重快，性成熟较晚，一般为7～ 8月龄。二者在性成熟早晚的差异为种公猪的繁殖研究提供了良好模型。研究发现不同品种公猪睾丸中某些RNA分子存在差异性表达，其可能与公猪性成熟早晚有关。如120日龄达性成熟的二花脸公猪睾丸生长激素受体(GHR)表达量与240日龄达性成熟的大白公猪相比差异显著(p<0.05)，其通过特异性结合生长激素(GH)调节公猪繁殖性能(李发弟；2006)。因此研究不同猪种睾丸中某些RNA分子的表达模式，具有重要的现实意义。
环状RNA(circRNA)是由RNA 3’端与5’端共价连接形成的闭合环状非编码RNA分子，分布广泛、保守性强、结构稳定。随着高通量分子测序的快速发展，在动植物体真核细胞内发现大量的circRNA。研究表明circRNA参与基因的表达(Li et al；2015)、细胞的增殖分化(Li et al；2017)、癌症的发生及转移(Dai et al；2017)等过程。circRNA具有时间及组织表达特异性，研究发现circRNA在猪妊娠中期脑皮质层中表达量显著增高，与猪胚胎脑部发育有关(Morten et al；2015)。睾丸性别决定基因SRY的环状结构-circSRY 通过吸附miR-138调节下游靶基因的表达(Hansen et al；2013)。目前circRNA在公猪繁殖方面研究还较少，因此寻找影响公猪繁殖性能的circRNAs成为当前公猪繁殖与遗传育种研究的新方向。
公猪的繁殖过程涉及基因表达、表观遗传修饰(如DNA甲基化，组蛋白修饰等)等过程。研究表明组蛋白甲基转移酶SETD2调控精子发生、成熟等过程，敲除SETD2后组蛋白甲基转移酶缺失，精子发生基因ACRBP、PRM1表达量下降，造成精子发生异常、顶体畸形及不育(Zuo et al；2018)。研究发现SETD2基因能够表达一种环状RNA，因此鉴定和检测此环状RNA在公猪睾丸中的表达情况，分析其在公猪繁殖中的作用，将为种公猪的选择评定与遗传育种改良提供新的思路。
发明内容
本发明的目的在于提供一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用。所述的circRNA 为猪circSETD2，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了一种特异性扩增circSETD2环化位点的引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO:3所示。
本发明所述的circRNA可在动物细胞和组织表达量检测中的应用。尤其用于公猪的选择评定及遗传育种改良。
本发明提供了一种纯化circRNA及对其环状结构鉴定的方法。具体步骤如下：(1)以 RNase R酶消化公猪睾丸支持细胞环状RNA。(2)以β-actin为对照，以cDNA、gDNA为模板，利用Divergent Primer和Convergent Primer进行扩增(图4)。(3)以β-actin 为内参基因，利用qRT-PCR检测circRNA对RNase R酶的耐受性(图5)。
本发明的circRNA Divergent/Convergent引物如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；其中β-actin Divergent/Convergent引物如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
本发明提供了一种有效检测circRNA在动物细胞或组织中相对表达量的方法，即以 circRNA特异引物进行实时定量PCR的方法。
本发明还涉及到一种β-actin内参基因，扩增该基因的引物序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
本发明提供了一种对circRNA细胞定位的方法。具体步骤如下：
(1)分离、提取睾丸支持细胞的细胞核与细胞质RNA。
(2)分别以细胞核与细胞质cDNA为模板，以18s RNA为细胞核内参基因(引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示)。
(3)本发明以GAPDH基因为细胞质内参基因(其引物序列如SEQ ID NO：12和SEQ IDNO：13所示)。利用qRT-PCR方法检测circRNA在细胞核、细胞质的相对表达量(见图7)。
本发明的circRNA在75d和270d“梅山”公猪睾丸中的表达量极显著高于同日龄的“杜洛克”公猪睾丸中的表达量(p<0.01)(见图9)。
更详细的技术方案见《具体实施方式》。
附图说明
图1：circSETD2 Divergent/Convergent引物的设计。
图2：circSETD2反向剪接位点测序图，箭头处为环化位点；
图3：通过RNase R酶消化对circSETD2的鉴定，从左到右依次为睾丸组织总RNA、SETD2 mRNA及circSETD2 PCR产物的电泳图。其中，SETD2产物为211bp，circSETD2产物为305bp。
图4：以β-actin为对照，Divergent/Convergent primer对gDNA、睾丸cDNA扩增。附图标记说明：M泳道为DL 2000DNA Marker；NO RT泳道为睾丸RNA；cDNA及gDNA泳道为RNaseR消化后的cDNA及gDNA；β-actin Convergent primer产物为167bp；circSETD2 DivergentPrimer产物为305bp；circSETD2 Convergent Primer产物为357bp。
图5：利用qRT-PCR方法检测circSETD2对RNase R酶的耐受性结果。
图6：利用qRT-PCR方法检测circSETD2在猪肾细胞、睾丸支持细胞及睾丸间质细胞的相对表达量。
图7：利用qRT-PCR方法检测circSETD2在猪睾丸支持细胞的细胞核和细胞质中的相对表达量。
图8：利用qRT-PCR方法检测circSETD2在“梅山”公猪各组织中的相对表达量。
图9：qRT-PCR检测circSETD2在“杜洛克”、“梅山”公猪睾丸中的相对表达量。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明做进一步的阐述。以下具体实施例仅限于解释本发明，但并不限制本发明的范围。实施例中未说明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。
对序列表的说明：
SEQ ID NO：1是猪circSETD2的线性核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是特异性扩增circSETD2环化位点的引物对的上游引物序列。
SEQ ID NO：3是特异性扩增circSETD2环化位点的引物对的下游引物序列。
SEQ ID NO：4是circSETD2 Convergent引物对的上游引物序列。
SEQ ID NO：5是circSETD2 Convergent引物对的下游引物序列。
SEQ ID NO：6是β-actin Divergent引物对的上游引物序列。
SEQ ID NO：7是β-actin Divergent引物对的下游引物序列。
SEQ ID NO：8是β-actin Convergent引物对的上游引物序列。
SEQ ID NO：9是β-actin Convergent引物对的下游引物序列。
SEQ ID NO：10是细胞核内参基因的18s rRNA引物对的上游引物序列。
SEQ ID NO：11是细胞核内参基因的18s rRNA引物对的下游引物序列。
SEQ ID NO：12是细胞质内参基因GAPDH引物对的上游引物序列。
SEQ ID NO：13是细胞质内参基因GAPDH引物对的下游引物对序列。
实施例1猪circSETD2的鉴定
1.1猪circSETD2引物的设计：
登录circBase数据库，下载人hsa_circ_0065148线性核苷酸序列，在NCBI数据库寻找并下载与猪同源性较高的核苷酸序列，将此序列的3’端100-200bp片段移到5’端 100-200bp最前端形成新序列，针对新序列设计跨反向剪接位点(back-splice site)的circSETD2的Divergent引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。将剩余的线性核苷酸序列按常规方法设计引物，即circSETD2的Convergent引物，引物序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示(图1)。
1.2猪睾丸支持细胞(Sertoli cell)全基因组DNA的提取：
细胞复苏：
(1)在超净台中进行，超净台需提前消毒和20min以上的紫外线照射杀菌。
(2)从液氮取出细胞冻存管置于37℃水浴锅迅速融化，于离心机中1500rpm，离心5min。
(3)吸取上清液于T25细胞培养瓶中，加入2-4mL含10％胎牛血清的培养液，于37℃5％CO2培养箱中培养。
选择汇合度在90％以上的睾丸支持细胞，用Simgen公司生产的组织/培养细胞DNA提取试剂盒(Cat.No.3101050)进行提取。
具体步骤如下：
(1)弃掉细胞培养液，用1-2ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次。
(2)加入0.5-1ml胰酶消化细胞，加入180ul PBS缓冲液使细胞悬浮并移至2.0ml离心管中，300×g离心5min，弃上清。
(3)加入20ul蛋白酶K和200ul Buffer SL，漩涡15s，56℃水浴10min，低速离心数秒使溶液沉降到管底。
(4)加200ul无水乙醇，漩涡振荡15s。
(5)移上清液于核酸纯化柱中，在12000rpm下离心30s，弃滤液。
(6)加入500ul Buffer WA，再12000rpm下离心30s，弃滤液。
(7)加入600ul Buffer WB，再12000rpm下离心30s，弃滤液。
(8)再14000rpm下离心1min，加100-200ul 56℃温育的Buffer TE，静置1min，在12000rpm下离心30s，洗脱DNA放于-20℃备用。
1.3组织及细胞RNA提取(常规TRIZOL法)：
按照每100-500ng组织或T25细胞瓶加入1ml TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)，反复吹打，将匀浆样品移至1.5ml离心管中(离心管内均无RNA酶)，室温下置5min使核酸蛋白复合物完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置3min。于4℃，12000×g离心15min，样品分三层，RNA主要在最上层水相中，吸取600ul上清移至1.5ml 离心管，加500ul异丙醇，颠倒混匀，冰浴10min。然后在2-8℃，12000×g下离心10min，弃上清。加入1ml 75％浓度的乙醇，振荡混匀，于4℃，7500×g下离心5min，弃上清。室温晾5-10min干燥RNA，加20ul无RNA酶水，混匀，吸取1ul于Thermo NANO Drop2000紫外分光光度计下测量浓度及纯度，取质量合格的RNA放于-80℃下保存。
1.4circRNA的富集纯化：
利用核糖核酸外切酶RNase R(Lucigen，Cat.No.RNR07250)消化线性RNA，富集纯化circRNA。取1ugRNA加入3-4U RNase R(20U/ul)，2ul 10×RNase R Reaction Buffer，加水补至20ul，37℃孵育10-15min。
1.5RNA反转录：
按照Vazyme反转录试剂盒(R223-01)说明书介绍的操作方法进行RNA反转录，具体步骤如下：(1)基因组DNA去除：1ug RNA，4ul 4×gDNA wiper Mix，RNase free ddH2O 至16ul，混匀，于42℃2min。(2)反转录反应：在步骤(1)的反应液中加5×HiScript II qRTSuperMix II 4ul,混匀，50℃15min，85℃5s。
1.6PCR扩增及qRT-PCR：
PCR扩增体系：1μL模板，上、下游引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)各 10μM，2×ESTaq MasterMix 5μL(购自康为生物公司)，加ddH2O至10μl。95℃预变性 5min；35个循环(95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸20s)；72℃10min，产物在1.5％琼脂糖凝胶(含染料)中电泳，将目的片段回收纯化并测序。qRT-PCR反应体系：SYBR Green I real-time PCR Mix(TOYOBO)5μL，上、下游引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)0.15μL，200ng cDNA，加水至10μL。反应程序：95℃预变性2min；40个循环(95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸15s)。生物学及技术性重复各3个，利用2-△△Ct法计算基因相对表达量，其中△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参)-(Ct目的基因-Ct内参)最大值，T检验进行显著性分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
1.7结果：
如图2所示，以跨反向剪接位点的特异性引物扩增circSETD2，经一代测序比对确定其环化位点(箭头处)。如图3所示，总RNA经RNase R酶消化后电泳无条带，PCR检测SETD2mRNA在RNase R(+)组条带较弱；而circSETD2在RNase R(-)和RNase R(+)组中均有条带，表明circSETD2结构较稳定且耐消化。如图4所示，以β-actin为对照，使用 Divergent/Convergent引物对No RT对照组、猪睾丸支持细胞cDNA及基因组gDNA扩增， cDNA组Divergent/Convergent primer均有条带，gDNA组只有Convergent引物有条带，说明此circRNA是客观存在的。如图5所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测到RNase R酶消化猪睾丸支持细胞RNA后circSETD2表达量无显著性变化(p>0.05)，而线性SETD2 mRNA表达量极显著性下降(p<0.01)，进一步证实了circSETD2的环状结构。
实施例2.circSETD2在猪细胞中的差异表达及定位
2.1circSETD2在猪细胞中的差异表达：
如图6所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测circSETD2在猪肾细胞、睾丸支持细胞及睾丸间质细胞的相对表达量。结果表明circSETD2在睾丸支持细胞、睾丸间质细胞的表达量均显著高于在猪肾细胞中的表达量(p<0.05)，其中在猪睾丸支持细胞中表达量最高。
2.2猪睾丸支持细胞核、质RNA的分离：
选取6孔板中汇合度在90％以上的睾丸支持细胞，弃掉培养液，用PBS清洗2次。加入 1ml冰TD溶液吹打制备细胞悬液，移至1.5ml离心管中(离心管均无RNA酶)，最大转速离心30s，弃上清。加入100ul冰TD溶液吹打10次，加入100ul VRC/1％NP-40/TD，振荡5s，冰浴5min，最大转速离心30s，样品分层，移上层细胞质成分于新离心管中并加1ml TRIZOL 待提取RNA；在下层成分中加200ul 0.5％NP-40/TD吹打数次，振荡5s，冰浴5min，最大转速离心30s，弃上清。加入200ul 0.5％NP-40/TD吹打数次使悬浮，再加1ml TRIZOL吹打即可提取RNA。RNA提取步骤见实施例1.3所示。
溶液配制：氧钒核糖核苷复合物VRC/1％乙基苯基聚乙二醇NP-40/TD：2.4ml 1％NP-40/TD+125ul VRC；
TD溶液(2L):NaCl 16.0g，KCl 0.76g，Na2HPO4 0.20g，Tris-HCL 6g，加水至2L， pH7.4-7.5。
2.3circSETD2在猪睾丸支持细胞的分布：
如图7所示，以18s RNA为细胞核内参基因(引物序列见SEQ ID NO：10和SEQ IDNO： 11)、GAPDH为细胞质内参基因(引物序列见SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)，qRT-PCR检测circSETD2在猪睾丸支持细胞核、质中的表达量。结果显示circSETD2在睾丸支持细胞的细胞质中表达量最高，SETD2 mRNA在睾丸支持细胞的细胞核中表达量最高，circSETD2可能作为miRNA的分子海绵发挥作用。
实施例3.circSETD2组织表达谱及在“梅山”公猪、“杜洛克”公猪睾丸中的差异表达 3.1公猪组织RNA提取、反转录以及qRT-PCR：
具体步骤见实施例1的1.3；1.5；1.6。公猪组织包括淋巴、肝、胃、精囊腺、前列腺、背最长肌、睾丸、附睾头、输精管、肠、尿道球腺、脂肪、附睾体、附睾尾等。
3.2circSETD2组织表达谱：
如图8所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测到circSETD2在公猪各组织中均有表达，其中在输精管、附睾头及睾丸中表达量较高，表明circSETD2可能与精子的发生或成熟过程有关。
3.3circSETD2在“梅山”公猪、“杜洛克”公猪睾丸中的差异表达
如图9所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测circSETD2在20d、75d及270d 杜洛克公猪及“梅山”公猪睾丸中的相对表达量，结果显示circSETD2在75d“梅山”公猪 (达到初情期)睾丸中表达量极显著高于75d“杜洛克”公猪(未达到初情期)睾丸中的表达量(p<0.01)，同时，在270d“梅山”公猪睾丸中的表达量也极显著高于270d杜洛克公猪睾丸中表达量(p<0.001)。circSETD2在75d和270d“梅山”公猪睾丸中高表达表明其可能与“梅山”猪性成熟早和高繁殖力等特性相关，因此，circSETD2有望可以作为检测公猪繁殖性能的分子标志物，在种公猪的选择评定及遗传育种改良等领域具有较大的应用价值。
以上实施例仅限于对本发明解释说明，此外本领域的技术人员在不脱离本发明的范围内，可以对此发明做些许变动和修饰，但这些变动和修饰也将落入本发明的权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用
<141> 2019-12-15
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 670
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> gene
<222> (1)..(670)
<400> 1
atatgataca ccaacttcta aaaagaaagt acgaattaaa gatcgcaata aactttctac 60
ggaggagcgt cggaagctgt ttgagcaaga ggtagctcag cgggaggctc agaaacagca 120
acagcagatg cagaacctgg gaatgacgtc tccactgccc tatgactctc ttggctacaa 180
tgcccctcat catccctttg ctggctaccc accaggttat cccatgcagg cctatgtgga 240
tcccagcaat cctaatgctg gaaaggtgct ccttcccaca cccagcatgg atcctgtgtg 300
ttctcctgct ccttatgatc attctcagcc cttggtggga cattctacag aggcccttgc 360
tgctcctcca cccgtgccgg tggtgccaca tgtggcagcc cctgtggaag tttccagttc 420
acagtatgtg gcccaaagtg atggtgtggt acaccaagac tccagtgtca acgtcttgcc 480
ggtgccagcc ccaggcccag tccagggaca gaattatggt gtttgggatt caaaccaaca 540
gtccgtcagt gtacagcagc agtattctcc tgcacaatct caagcaacca tatattatca 600
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<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 4
tcttggctac aatgcccctc 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(23)
<400> 5
caaacaccat aattctgtcc ctg 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 6
accaccatgt acccaggca 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 7
ccgtgttggc gtagaggtc 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 8
tgcggcatcc acgaaacta 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(19)
<400> 9
atcttcatcg tgctgggcg 19
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 10
cgacgtgact gctcggtg 18
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(18)
<400> 11
gacaactcga ccgagggc 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 12
ggtgaaggtc ggagtgaacg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 猪(Sus scrofa)
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(20)
<400> 13
ctcgctcctg gaagatggtg 20

Claims (8)

1.一种与公猪繁殖相关的circRNA，其特征在于，所述的circRNA为circSETD2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种特异性扩增circSETD2的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
3.权利要求1所述的circRNA在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
4.权利要求1所述的circRNA在公猪繁殖性能检测中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在细胞和组织表达量检测中的应用。
6.权利要求2所述的引物对在公猪繁殖性能检测中的应用。
7.权利要求1所述的circRNA在公猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
8.权利要求2所述的引物对在公猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
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