CN114107203A - 一种dc体外诱导扩增体系及诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法 - Google Patents
一种dc体外诱导扩增体系及诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及细胞诱导分化技术领域，尤其涉及一种DC体外诱导扩增体系及诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法。本发明DC体外诱导扩增体系包括I型干细胞培养基和II型干细胞培养基，I型干细胞培养基含有IL‑4、GM‑CSF和FLT‑3，II型干细胞培养基含有毛地黄黄酮、GM‑CSF和TNF‑α。I型干细胞培养基中GM‑CSF和IL‑4等因子的组合可在诱导分化的初期促进造血干细胞向淋巴系祖细胞分化；含有毛地黄黄酮的II型干细胞培养基可在淋巴系祖细胞向DC分化阶段进一步激活JAK‑STAT信号通道活性，提高造血干细胞向DC诱导分化的效率。本发明诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法使用DC体外诱导扩增体系，即含不同成分的培养基组合使得DC定向分化操作更简便安全和高效。
Description
技术领域
本发明涉及细胞诱导分化技术领域，尤其涉及一种DC体外诱导扩增体系及诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法。
背景技术
免疫系统，包括固有免疫和适应性免疫，是人体重要的保护屏障。1992年，美国FDA通过了生物免疫治疗的议题，免疫细胞治疗是重要组成部分。自此，生物免疫治疗在世界范围内被广泛研究并陆续应用于临床。在2018年，诺贝尔生理或医学奖即授予免疫治疗方面贡献突出的科学家，生物免疫治疗的临床意义获得广泛肯定。作为生物免疫治疗重要组成的免疫细胞治疗，也从早期的CIK逐渐发展到TCR-T和CAR-T等，构成了功能和效果丰富的细胞治疗选项。
DC（Dendritic cell），树突状细胞，是抗原呈递细胞(APC)，在免疫应答的启动、调控中起着重要的作用。临床上，DC一直是重要的细胞资源，具有提高免疫细胞识别和靶向的效果，而利用DC的生物学特性负载肿瘤抗原的特性，把DC制备为肿瘤治疗性疫苗已成为重要的研究方向；2019年，Meir W.等报道了DC可提高CAR-T治疗效果，进一步揭示了DC在不同类型免疫细胞协同作用方面也有重要作用。随着基础科研和临床研究的深入，DC的医学价值不断被挖掘。
DC来自于HSC（hematopoietic stem cell，造血干细胞）的分化。造血干细胞具有自我更新能力并能最终分化为各种血液成分细胞，包括髓系的红细胞，血小板，淋巴系的T细胞，B细胞，NK和DC等。由于不同类型免疫细胞之间的紧密关联和协同作用，DC的抗原呈递作用被越发重视，美国MD Anderson癌症中心，比利时安特卫普大学，法国里尔大学等医学机构分别在2019年和2018年开展了基于DC的实体肿瘤治疗的临床试验。对于其他类型的实体肿瘤，如B细胞淋巴瘤，黑色素瘤等，DC同样显示出辅助免疫治疗的作用。因此，如何高效获得数量充足的DC，对于未来的免疫治疗具有实质性意义。
HSC在体外诱导分化为DC是目前获得大量DC的主要途径，目前，普遍采取细胞因子组合诱导，主要有IL-3，GM-CSF，SCF等。细胞因子组合诱导具有稳定和简单的优点，但诱导过程耗时较长，需要12至15天，对应于紧急的临床使用，时间上有较大制约。
为了提高体外诱导DC的效率，科研人员进行了其他技术路径的探索，钙离子载体离子毒素（Ionomycin）可明显提高DC的体外诱导效率，但离子毒素对人体有毒副作用，对实验人员构成安全风险，而诱导后的离子毒素残余，也为临床使用带来不确定性因素。因此，开发安全而高效的DC体外诱导扩增体系，成为本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种DC体外诱导扩增体系，该DC体外诱导扩增体系安全且高效。
本发明的目的之二在于提供一种诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法，该方法制备过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性，为临床应用提供了更可靠的支持。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种DC体外诱导扩增体系，包括：I型干细胞培养基和II型干细胞培养基；
所述I型干细胞培养基为含有人白细胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和FMS样酪氨酸激酶3(FLT-3)的细胞诱导培养基；
所述II型干细胞培养基为含有毛地黄黄酮、GM-CSF和肿瘤坏死因子-α（tumornecrosis factor-α，TNF-α）的细胞诱导培养基。
毛地黄黄酮（luteolin）是一种天然的植物酮类化合物，存在于毛地黄等多种植物中，并在多种肿瘤中显示出抗肿瘤发生的特性，在神经系统方面，毛地黄黄酮可减少细菌毒素导致的大脑内部炎症，适当剂量的毛地黄黄酮具有治疗老年痴呆和克雅氏病等多种大脑疾病的潜力。
本发明DC体外诱导扩增体系包括I型干细胞培养基和II型干细胞培养基，I型干细胞培养基为含有IL-4、GM-CSF和FLT-3的细胞诱导培养基，II型干细胞培养基为含有毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α的细胞诱导培养基。I型干细胞培养基中GM-CSF和IL-4等因子的组合可在诱导分化的初期促进造血干细胞向淋巴系祖细胞分化。JAK-STAT信号通道广泛参与了多种细胞因子及其生理作用过程，尤其在造血干细胞向DC分化的过程中，JAK-STAT信号通道具有举足轻重的作用。本发明采用毛地黄黄酮作为JAK-STAT的激活剂，含有毛地黄黄酮的II型干细胞培养基可在淋巴系祖细胞向DC分化阶段进一步激活JAK-STAT信号通道活性，可降低其它细胞因子的使用量，促进了造血干细胞向DC分化的效果。
优选的，IL-4、GM-CSF和FLT-3在所述I型干细胞培养基中的浓度分别依次为45~65ng/mL、90~120 ng/mL和20~50 ng/mL；
所述毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α在所述II型干细胞培养基中的浓度分别依次为10~30 μmol/L、20~75 ng/mL和15~45 ng/mL。
优选的，IL-4、GM-CSF和FLT-3在所述I型干细胞培养基中的浓度分别依次为60ng/mL、110 ng/mL和30 ng/mL。
优选的，所述毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α在所述II型干细胞培养基中的浓度分别依次为15 μmol/L、50 ng/mL和30 ng/mL。
本发明在细胞因子诱导组合的基础上加入毛地黄黄酮，提高了造血干细胞向DC诱导分化的效率，同时减少了细胞因子的使用量，兼顾了分化的效果，能够降低成本，对临床使用有积极的意义。。
优选的，所述细胞诱导培养基为IMDM培养基、KBM 581（Corning）培养基、1640培养基和/或DXF（PromoCell）培养基。
本发明中，细胞诱导培养基优选为IMDM培养基（GIBCO公司）。
本发明中，I型干细胞培养基的制备方法如下：
将IL-4、GM-CSF和FLT-3按比例添加到细胞诱导培养基中，得到I型干细胞培养基。
优选的，所述II型干细胞培养基的制备方法如下：
将毛地黄黄酮溶于细胞保护剂中得到毛地黄黄酮储存溶液，然后将所述毛地黄黄酮储存溶液、GM-CSF和TNF-α添加到细胞诱导培养基中得到所述II型干细胞培养基。
本发明中，毛地黄黄酮的纯度≥99%，GC；毛地黄黄酮储存溶液浓度为10~20 mmol/L，该浓度为储存浓度，工作浓度跟储存浓度一致，须放置于4℃遮光保存。
优选的，所述细胞保护剂为含有二甲基亚砜（DMSO）和低分子右旋糖酐（Dextran）的注射用水溶液，DMSO和所述低分子右旋糖酐在所述细胞保护剂中体积百分比分别依次为50%~55%和2%~10%。
更优选的，细胞保护剂为含有体积百分比为55%二甲基亚砜（DMSO）和体积百分比为5%低分子右旋糖酐（Dextran）的注射用水溶液。
本发明毛地黄黄酮储存溶液同时兼顾了试剂安全性和稳定性，将毛地黄黄酮溶解于含有体积百分比为55% DMSO和体积百分比为5% Dextran的注射用水溶液的细胞保护剂。DMSO是生物医学常用的有机溶剂，但高浓度DMSO对细胞有一定的毒性作用，而低分子右旋糖酐对细胞有保护作用，使毛地黄黄酮的DMSO水溶液毒性和溶解度都得以平衡，使用该配比的毛地黄黄酮储存液用于细胞的诱导培养，一方面降低了二甲基亚砜的细胞毒性作用，同时也确保了毛地黄黄酮在细胞诱导过程中效果的发挥，显著提高了造血干细胞向DC定向分化的效率。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法，采用上述技术方案所述DC体外诱导扩增体系，包括以下步骤：
将造血干细胞使用所述I型干细胞培养基进行第一阶段培养后，再使用所述II型干细胞培养基进行第二阶段培养，得到树突状细胞。
本发明诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法在造血干细胞向DC定向分化培养过程中，通过不同类型的诱导培养基应用于不同的培养阶段，先通过I型干细胞培养基诱导造血干细胞向淋巴系祖细胞分化，再加入含有毛地黄黄酮的细胞诱导培养基继续培养，通过这两种细胞诱导培养基的组合，应用于不同诱导培养阶段，达到了提高DC诱导分化效率的结果。
本发明诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法操作简便，安全性高，能够有效提高造血干细胞向DC定向分化的效率，获得纯度更高的DC，且成本低廉。
更优选的，以造血干细胞为标本细胞，在造血干细胞中加入I型干细胞培养基进行第一阶段培养；然后离心，去上清，更换含有15 μmol/L毛地黄黄酮的II型干细胞培养基进行第二阶段培养，最后显著提高了DC的分化效率。本发明先使用不含毛地黄黄酮的细胞诱导培养基培养后，再更换含有15 μmol/L毛地黄黄酮的II型细胞诱导培养基继续培养，通过这两种成分和作用机理不同的培养基的先后培养顺序组合，能显著提高造血干细胞向DC诱导分化的效率，可制备纯度更高的DC。该诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法过程简单、可靠且重复性好，污染可能性低，兼顾了制备成本的经济性和操作安全性。
本发明中，第一阶段培养和第二阶段培养的总时间优选为1~9天。
优选的，所述第一阶段培养的时间为1～4天；
所述第二阶段培养的时间为1~5天。
优选的，第一阶段培养的时间为96小时，温度为37℃，二氧化碳浓度为5%；第二阶段培养的时间为120小时，温度为37℃，二氧化碳浓度为5%。
优选的，所述造血干细胞为富含CD34+造血干细胞。
本发明中，造血干细胞可通过如下步骤得到：采集新鲜的人外周血，通过淋巴细胞分离液（ficoll）分离富含CD34+的单个核细胞层，加入细胞冻存保护液，冷冻于液氮中保存；诱导分化前，取造血干细胞复温解冻，加生理盐水重悬洗涤再离心收集，然后通过磁珠分选，得到用于诱导的造血干细胞。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明DC体外诱导扩增体系包括I型干细胞培养基和II型干细胞培养基，I型干细胞培养基为含有IL-4、GM-CSF和FLT-3的细胞诱导培养基，II型干细胞培养基为含有毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α的细胞诱导培养基。I型干细胞培养基中GM-CSF和IL-4等因子的组合可在诱导分化的初期促进造血干细胞向淋巴系祖细胞分化；含有毛地黄黄酮的II型干细胞培养基可在淋巴系祖细胞向DC分化阶段进一步激活JAK-STAT信号通道活性，提高造血干细胞向DC诱导分化的效率。
本发明诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法使用含不同成分的培养基组合，即不含毛地黄黄酮的I型干细胞培养基和含有毛地黄黄酮的II型干细胞培养基，这两种特定培养基的组合使得DC定向分化操作更简便安全和高效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是本发明实施例1中处理组和对照组造血干细胞在接种后诱导分化第1、4、9天的细胞总数量的结果图；
图2是本发明实施例1中处理组和对照组造血干细胞在接种后诱导分化第1、4、9天的细胞数量增殖比例的结果图；
图3是本发明实施例1中处理组和对照组造血干细胞在接种后诱导分化第1、4、9天的CD1a+表面抗原表达情况的结果图；
图4是本发明实施例1中处理组和对照组造血干细胞在接种后诱导分化第1、4、9天的CD1a+细胞总数量变化的结果图；
图5是本发明实施例1中处理组和对照组造血干细胞在接种后诱导分化第9天与第4天的CD1a+细胞数量增殖情况对比结果图。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
本发明实施例中，细胞保护剂为含有体积百分比为55% DMSO和体积百分比为5%Dextran的注射用水溶液；
I型干细胞培养基通过在GIBCO公司的IMDM培养基中分别添加IL-4（终浓度60 ng/mL）、GM-CSF（终浓度110 ng/mL）和FLT-3（终浓度30 ng/mL）制得，不含毛地黄黄酮成分。
II型干细胞培养基通过在GIBCO 公司的IMDM培养基分别添加毛地黄黄酮（终浓度15 μmol/L）、GM-CSF（终浓度50 ng/mL）和TNF-α（终浓度30 ng/mL）制得。
I型干细胞培养基和II型干细胞培养基的组分种类和含量见表1。
表1 I型干细胞培养基和II型干细胞培养基的组分种类和含量
实施例1
外周血采自健康成人，检测梅毒、HIV、巨细胞病毒、乙型肝炎、丙型肝炎、支原体、衣原体、G-DPD等均为阴性。外周血标本采集后运输阶段温度保持在4～8℃，24小时内运回实验室。按以下方法进行DC定向分化操作：
（1）毛地黄黄酮储存溶液及特定培养基的配制
毛地黄黄酮（≥99%，GC），溶解于细胞保护剂中，配制成浓度为10 mmol/L毛地黄黄酮储存溶液；然后把毛地黄黄酮储存溶液添加到细胞诱导培养基中，得到含有毛地黄黄酮的II型干细胞培养基；毛地黄黄酮在细胞诱导培养基中的终浓度为15 μmol/L。
处理组的培养基组合为：第一阶段使用不含任何毛地黄黄酮成分的细胞诱导培养基（I型细胞诱导培养基），第二阶段使用含有毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α的细胞诱导培养基（II型干细胞培养基）。
对照组①（Control ①组）使用的培养基组合为：第一阶段使用不含任何毛地黄黄酮成分的细胞诱导培养基（I型干细胞培养基），第二阶段使用含有GM-CSF（终浓度50 ng/mL）和TNF-α（终浓度30 ng/mL）的细胞诱导培养基，其中GM-CSF和TNF-α的终浓度与处理组一致。
对照组②（Control ②组）使用的培养基组合为：第一阶段使用不含任何毛地黄黄酮成分的细胞诱导培养基（I型细胞诱导培养基），第二阶段使用含有GM-CSF（终浓度110ng/mL）和TNF-α（终浓度60 ng/mL）的诱导培养基。其GM-CSF和TNF-α的终浓度比处理组高，用于对比纯粹的高浓度细胞因子组合与毛地黄黄酮及低浓度细胞因子组合的效果差异。
（2）造血干细胞的准备
在24小时内的人体外周血从采集运输到实验室，健康人体外周血中获取富含CD34+造血干细胞的单个核细胞层，冷冻于液氮中保存；诱导分化前解冻复苏，并通过磁珠分选操作，获得CD34+造血干细胞然后接种于6孔板中，然后加入I型细胞诱导培养基，具体过程如下：
①采集新鲜的外周血，24小时内运输回实验室，经过离心后去除红细胞和血浆，采集富含单个核细胞的中间层，然后冷冻保存于液氮中。
②造血干细胞解冻复苏，转移至离心管，加入3倍左右体积生理盐水，洗涤1次，离心力200 g，离心8分钟，收集细胞沉淀，并通过磁珠分选操作，得到造血干细胞。
（3）第一阶段诱导培养
将步骤（2）分离得到的造血干细胞接种在6孔培养板上，将细胞分为三组：处理组、对照组①和对照组②，均加入不含毛地黄黄酮的I型细胞诱导培养基，并放置在37℃，二氧化碳浓度为5%的条件下培养96小时。
（4）第二阶段诱导培养
将步骤（3）培养后的处理组细胞取出，离心去上清，在处理组中加入含毛地黄黄酮的II型细胞诱导培养基，而对照组①和对照组②分别加入步骤（1）中对应的细胞诱导培养基，继续放置在37℃，二氧化碳浓度为5%的条件下培养120小时。
（5）DC的鉴定
DC的鉴定通过以下方法：
①DC的形态学分析及细胞计数：将培养的细胞在倒置显微镜观察细胞状态并拍照；
②流式细胞仪的表型测定：分别取培养后第4天，9天的细胞，进行CD1a+检测；
（6）干细胞鉴定结果及细胞活性分析
①倒置显微镜下观察接种后第1天的造血干细胞分化状况：倒置显微镜下观察接种后第1天的造血干细胞，呈分散状，数量充足，形态一致，胞体呈透亮圆状态。通过磁珠分选获得的造血干细胞纯度高达99.2%，因此样本在第1天不需要进行CD1a+检测。
细胞计数结果，对照组①、对照组②和处理组造血干/祖细胞数量分别为：2.0×106个/mL、2.1×106个/mL和1.98×106个/mL（图1）；
②倒置显微镜下观察接种后第4天的造血干细胞分化状况：与第1天相比，细胞数量有所增加，部分细胞形态出现分化，较大部分为散状的造血干/祖细胞（≥70%），其他部分开始分化，细胞体积增大，树突状突起依稀可见，排列松散。
细胞计数结果，Control①组、Control②组和处理组的造血干/祖细胞数量分别为：3.04×106个/mL、3.39×106个/mL和3.09×106个/mL（图1），对比于第1天，细胞总数量比值分别为：152%、159%、156%（图2）。
流式细胞仪检测结果：在CD1a+细胞比例方面，Control①组、Control②组和处理组的数值分别为：3.63%、3.54%和3.66%（图3），CD1a+细胞总数、CD1a+细胞增殖倍数结果分析见图4、图5；
经过4天培养后，细胞计数结果显示：处理组与Control①组、Control②组的细胞总数量和CD1a+细胞总数、CD1a+细胞增殖倍数没有统计学差异。
③倒置显微镜下观察接种后第9天的造血干细胞分化状况：与第4天相比，细胞数量增幅显著，形态也明显分化，处理组样本中，分散状的造血干/祖细胞已≤10%，绝大部分已分化为DC，细胞表面树突状结构明显增多，细胞表面积增大，具有典型的DC细胞形态。而Control①组、Control②组中，分散状的造血干/祖细胞比处理组多。
细胞计数结果：Control①组、Control②组和处理组的造血干/祖细胞数量分别为8.24×106个/mL、9.07×106个/mL和8.22×106个/mL（图1），分别相当于第1天各样本原始细胞数量的：412%、432%和415%（图2）。
流式细胞仪检测结果：在CD1a+细胞比例方面，Control①组、Control②组和处理组（15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）的数值分别为：30.05%、32.73%、45.12%（图3）。因此，Control①组、Control②组和处理组所获得的CD1a+细胞总数分别为2.48×106个，2.97×106个和3.71×106个；相对于第四天，Control①组、Control②组和处理组的CD1a+细胞总数增殖比例分别为，22.55倍，24.75倍和33.73倍。
CD1a+细胞总数、CD1a+细胞增殖倍数结果分析见图4、图5。
经过9天培养后，细胞计数结果显示：处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）细胞数量比第4天时有明显上升，细胞总量方面跟Control②组接近；在流式结果方面，处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）远高于Control组。
综上所述，加入第二阶段使用含有15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时的处理组，在造血干细胞向DC定诱导扩增过程中，在细胞增殖数量与control组接近情况下，CD1a+细胞比例比Control①组和Control②组分别高50.15%和37.86%，CD1a+细胞增殖倍数比Control①组和Control②组分别高49.58%和36.28%，因此，含有毛地黄黄酮的培养基组合体系极大地提高造血干细胞向DC的分化效率，从而增加了DC的生成量，并且降低了成本，操作过程简单、安全。
实施例2
参照实施例1的方法进行造血干细胞向DC诱导培养：
（1）接种后第1天：
Control①组、Control②组和处理组的起始细胞量（显微镜细胞计数）分别为：2.46×106个/mL、2.28×106个/mL和2.51×106个/mL。
（2）接种后第4天：
显微镜细胞计数结果：Control①组、Control②组和处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）的细胞量分别为：3.29×106个/mL、3.19×106个/mL和3.43×106个/mL；对比于初始细胞数量，各样本增长比例分别为：134%、140%和137%；
流式细胞仪检测结果：在CD1a+细胞比例方面，Control①组、Control②组和处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）的数值分别为：4.05%、3.98%和4.08%。
（3）接种后第9天：
显微镜细胞计数结果：Control①组、Control②组和处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）的细胞总量（显微镜细胞计数）分别为：9.69×106个/mL、9.21×106个/mL和10.56×106个/mL，对比于初始细胞数量，各样本增长比例分别为：394%、404%和421%；
流式细胞仪检测结果：在CD1a+细胞比例方面，Control①组、Control②组和处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）的数值分别为：31.78%、35.16%和43.32%。Control①组、Control②组和处理组所获得的CD1a+细胞总数分别为3.08×106个，3.24×106个和4.57×106个；相对于第四天，Control①组、Control②组和处理组的CD1a+细胞总数增殖比例分别为，23.11倍，25.51倍和32.69倍。
根据第9天的细胞计数和流式结果，在细胞增殖方面，Control①组Control②组接近，处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）略高于Control组，而CD1a+细胞比例上，处理组均显著高于Control组。
综上所述，处理组（第二阶段15 μmol/L毛地黄黄酮培养120小时）在细胞总数量与control组接近情况下，CD1a+细胞比例明显高于Control组，分别比Control①组和Control②组分别高36.31%和23.21%；CD1a+细胞增殖倍数比Control①组和Control②组分别高41.45%和28.14%。从而达到提高造血干细胞向DC分化效率的目的，极大地增加了DC的生成量，结论与实施例1相同。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种DC体外诱导扩增体系，其特征在于，包括：I型干细胞培养基和II型干细胞培养基；
所述I型干细胞培养基为含有IL-4、GM-CSF和FLT-3的细胞诱导培养基；
所述II型干细胞培养基为含有毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α的细胞诱导培养基。
2.根据权利要求1所述的DC体外诱导扩增体系，其特征在于，IL-4、GM-CSF和FLT-3在所述I型干细胞培养基中的浓度分别依次为45~65 ng/mL、90~120 ng/mL和20~50 ng/mL；
所述毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α在所述II型干细胞培养基中的浓度分别依次为10~30μmol/L、20~75 ng/mL和15~45 ng/mL。
3.根据权利要求2所述的DC体外诱导扩增体系，其特征在于，IL-4、GM-CSF和FLT-3在所述I型干细胞培养基中的浓度分别依次为60 ng/mL、110 ng/mL和30 ng/mL。
4.根据权利要求2所述的DC体外诱导扩增体系，其特征在于，所述毛地黄黄酮、GM-CSF和TNF-α在所述II型干细胞培养基中的浓度分别依次为15 μmol/L、50 ng/mL和30 ng/mL。
5.根据权利要求1所述的DC体外诱导扩增体系，其特征在于，所述细胞诱导培养基为IMDM培养基、KBM 581培养基、1640培养基和/或DXF培养基。
6.根据权利要求1所述的DC体外诱导扩增体系，其特征在于，所述II型干细胞培养基的制备方法如下：
将毛地黄黄酮溶于细胞保护剂中得到毛地黄黄酮储存溶液，然后将所述毛地黄黄酮储存溶液、GM-CSF和TNF-a添加到细胞诱导培养基中得到所述II型干细胞培养基。
7.根据权利要求6所述的DC体外诱导扩增体系，其特征在于，所述细胞保护剂为含有DMSO和低分子右旋糖酐的注射用水溶液，DMSO和所述低分子右旋糖酐在所述细胞保护剂中体积百分比分别依次为50%~55%和2%~10%。
8.一种诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法，其特征在于，采用权利要求1至7任意一项所述DC体外诱导扩增体系，包括以下步骤：
将造血干细胞使用所述I型干细胞培养基进行第一阶段培养后，再使用所述II型干细胞培养基进行第二阶段培养，得到树突状细胞。
9.根据权利要求8所述的诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法，其特征在于，所述第一阶段培养的时间为1～4天；
所述第二阶段培养的时间为1~5天。
10.根据权利要求8所述的诱导造血干细胞分化为树突状细胞的方法，其特征在于，所述造血干细胞为富含CD34+造血干细胞。
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|---|---|
| CN (1) | CN114107203A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006022330A1 (ja) * | 2004-08-27 | 2006-03-02 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | 霊長類動物胚性幹細胞から樹状細胞の製造方法 |
| JP2007238559A (ja) * | 2006-03-10 | 2007-09-20 | Nagoya City Univ | 未成熟樹状細胞活性化剤及びその使用 |
| CN102307989A (zh) * | 2008-11-14 | 2012-01-04 | 生物载体株式会社 | 用于产生树突细胞的方法 |
| WO2013126565A1 (en) * | 2012-02-24 | 2013-08-29 | Lunyak Victoria V | Downregulation of sine/alu retrotransposon transcription to induce or restore proliferative capacity and/or pluripotency to a stem cell |
| CN106244548A (zh) * | 2015-06-09 | 2016-12-21 | 成都中医药大学 | 木犀草素在诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化中的用途 |
| EP3385373A1 (en) * | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Centro de Neurociências e Biologia Celular | Compositions for reprogramming cells into dendritic cells or antigen presenting cells, methods and uses thereof |
-
2021
- 2021-12-01 CN CN202111454055.6A patent/CN114107203A/zh active Pending
Patent Citations (6)
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