CN113846056A - 一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法 - Google Patents

一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113846056A
CN113846056A CN202111249619.2A CN202111249619A CN113846056A CN 113846056 A CN113846056 A CN 113846056A CN 202111249619 A CN202111249619 A CN 202111249619A CN 113846056 A CN113846056 A CN 113846056A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mesenchymal stem
stem cells
culture medium
culturing
luteolin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111249619.2A
Other languages
English (en)
Inventor
李一佳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Zechong Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shanghai Zechong Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Zechong Biotechnology Co ltd filed Critical Shanghai Zechong Biotechnology Co ltd
Priority to CN202111249619.2A priority Critical patent/CN113846056A/zh
Publication of CN113846056A publication Critical patent/CN113846056A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/05—Inorganic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/70—Undefined extracts
    • C12N2500/76—Undefined extracts from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere

Abstract

本发明公开了一种用于培养间充质干细胞的培养基，包括以下组分原料：血清5‑50μl/ml、miR‑705antagomir8‑16ng/mL、抗坏血酸30‑60mg/L、金银花粉2‑5ng/mL、木犀草素15‑30μg/mL、表皮生长因子8‑20ng/mL、青霉素40‑60U/mL、链霉素70‑80μg/mL、维生素C 25‑100μg/mL和细胞基础培养基。本发明还公开了一种用于培养间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：步骤一、准备培养箱；步骤二、获得骨髓间充质干细胞；步骤三、骨髓间充质干细胞的培养。本发明针对间充质干细胞衰老过程中的microRNA异常表达，采用特异性的microRNA抑制剂antagomir，不需要转染试剂和载体，直接进入细胞，从而安全高效的调控细胞表达，下调miR‑705，从而延缓长期体外传代扩增所致的间充质干细胞衰老和功能下降，为BMSC临床应用建立基础。

Description

一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法
技术领域
本发明属于培养基技术领域，具体涉及一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法。
背景技术
培养基，是指供给微生物、植物或动物(或组织)生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微量元素)、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。培养基种类很多，根据配制原料的来源可分为自然培养基、合成培养基、半合成培养基；根据物理状态可分为固体培养基、液体培养基、半固体培养基；根据培养功能可分为基础培养基、选择培养基、加富培养基、鉴别培养基等；根据使用范围可分为细菌培养基、放线菌培养基、酵母菌培养基、真菌培养基等。培养基配成后一般需测试并调节pH，还须进行灭菌，通常有高温灭菌和过滤灭菌。培养基由于富含营养物质，易被污染或变质。配好后不宜久置，最好现配现用。
目前现有的用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法还存在一些问题：一、间充质干细胞衰老过程中的microRNA异常表达，造成BMSC功能下降；二、不方便激活间充质干细胞的活力潜能，细胞的活性和分泌能力较低，影响细胞增殖速度，为此我们提出一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于培养间充质干细胞的培养基，包括以下组分原料：血清5-50μl/ml、miR-705antagomir8-16ng/mL、抗坏血酸30-60mg/L、金银花粉2-5ng/mL、木犀草素15-30μg/mL、表皮生长因子8-20ng/mL、青霉素40-60U/mL、链霉素70-80μg/mL、维生素C25-100μg/mL和细胞基础培养基。
优选的，包括以下组分原料：血清20μl/ml、miR-705antagomir12ng/mL、抗坏血酸40mg/L、金银花粉3ng/mL、木犀草素20μg/mL、表皮生长因子12ng/mL、青霉素50U/mL、链霉素75μg/mL、维生素C 50μg/mL和细胞基础培养基。
优选的，所述细胞基础培养基是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640、IMEM中的一种或几种组合，所述血清为胎牛血清、人体血清中的任意一种。
优选的，所述用于培养间充质干细胞的培养基的制备方法包括以下步骤：
S1.原料准备：按原组成准备原料，血清5-50μl/ml、miR-705antagomir8-16ng/mL、抗坏血酸30-60mg/L、金银花粉2-5ng/mL、木犀草素15-30μg/mL、表皮生长因子8-20ng/mL、青霉素40-60U/mL、链霉素70-80μg/mL、维生素C 25-100μg/mL和细胞基础培养基；
S2.原料初步混合：取400mL纯化水加热至45-65℃，然后向其中加入细胞基础培养基、血清、miR-705antagomir和维生素C，搅拌混合均匀，得第一混合物；
S3.原料再次混合：将步骤S2所得第一混合物降温至30-40℃，向其中加入金银花粉、木犀草素、青霉素和链霉素，混合搅拌均匀，得第二混合物；
S4.制备初品培养基：将步骤S3制得的第二混合物降温至20-30℃，然后加入表皮生长因子，混合搅拌均匀，加入纯化水，配制成1L的初品培养基；
S5.平衡酸碱度：将步骤S4得到的初品培养基在含4-6％CO2的细胞培养箱中平衡至pH值为7.4，即得用于培养间充质干细胞的培养基；
S6.灭菌：将得到的用于培养间充质干细胞的培养基放入高压灭菌柜中，在0.1-0.3MPa压强下灭菌1-3小时。
优选的，所述步骤S2中搅拌混合均匀的转速为200-400r/min，搅拌时间为30-40min；所述步骤S3中搅拌混合均匀的转速为100-200r/min，搅拌时间为20-30min；所述步骤S4中搅拌混合均匀的转速为80-120r/min，搅拌时间为10-20min。
优选的，所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
优选的，所述木犀草素的制备过程包括以下步骤：
S101.原料清理：取花生壳，将所用花生壳用水进行淋洗处理、去除所带有的泥土杂质，然后干燥；
S102.制备浸膏：将上述洗涤过的花生壳不经粉碎，直接加入一定量的乙醇进行1-3h的黄酮类物质的回流提取，然后提取上清液进行浓缩，获得浸膏；
S103.制备黄酮类物质的有机溶剂溶液：向所述的浸膏中加入一定量的有机溶剂，超声溶解，得到黄酮类物质的有机溶剂溶液，通过过滤去除不溶物；
S104.制备木犀草素：将所述的溶液进行回收有机溶剂处理，得到木犀草素粗品，进一步用乙醇溶剂进行重结晶，获得木犀草素成品。
优选的，所述S101中的干燥选用自然晾干或烘箱烘干；所述S102中的乙醇，选用无水乙醇或者95％的乙醇；所述S103中一定量的有机溶剂选用的是浸膏重量的4-6倍乙酸丁酯或者正丁醇。
本发明还提供了一种用于培养间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、准备培养箱：将用于培养间充质干细胞的培养基加入培养箱内；
步骤二、获得骨髓间充质干细胞：将骨髓单细胞悬液经密度梯度离心，收集含单个核细胞的上清液，将上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞；
步骤三、骨髓间充质干细胞的培养：将骨髓间充质干细胞在37℃下放入培养箱中培养，2-4天后通过全量换液去除非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，当细胞达到70％-80％融合时，用12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。
优选的，所述步骤二中免疫磁珠分离的抗体为CD45抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明针对间充质干细胞衰老过程中的microRNA异常表达，采用特异性的microRNA抑制剂antagomir，不需要转染试剂和载体，直接进入细胞，从而安全高效的调控细胞表达，下调miR-705，从而延缓长期体外传代扩增所致的间充质干细胞衰老和功能下降，为BMSC临床应用建立基础。
(2)本发明的配方能够激活间充质干细胞的活力潜能，提高了细胞的活性和分泌能力，并且能够选择性的促进间充质干细胞体外培养中的生长和分化，并为其达到最理想营养平衡状态提供数量上和质量上的保证，显著提高了细胞增殖速度。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明中木犀草素的制备流程图；
图3为本发明中培养方法的流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
请参阅图1-图2，本发明提供一种技术方案：一种用于培养间充质干细胞的培养基，包括以下组分原料：血清5μl/ml、miR-705antagomir8ng/mL、抗坏血酸30mg/L、金银花粉2ng/mL、木犀草素15μg/mL、表皮生长因子8ng/mL、青霉素40U/mL、链霉素70μg/mL、维生素C25μg/mL和细胞基础培养基。
本实施例中，优选的，所述细胞基础培养基是DMEM，所述血清为胎牛血清。
本实施例中，优选的，所述用于培养间充质干细胞的培养基的制备方法包括以下步骤：
S1.原料准备：按原组成准备原料，血清5μl/ml、miR-705antagomir8ng/mL、抗坏血酸30mg/L、金银花粉2ng/mL、木犀草素15μg/mL、表皮生长因子8ng/mL、青霉素40U/mL、链霉素70μg/mL、维生素C25μg/mL和细胞基础培养基；
S2.原料初步混合：取400mL纯化水加热至45℃，然后向其中加入细胞基础培养基、血清、miR-705antagomir和维生素C，搅拌混合均匀，得第一混合物；
S3.原料再次混合：将步骤S2所得第一混合物降温至30℃，向其中加入金银花粉、木犀草素、青霉素和链霉素，混合搅拌均匀，得第二混合物；
S4.制备初品培养基：将步骤S3制得的第二混合物降温至20℃，然后加入表皮生长因子，混合搅拌均匀，加入纯化水，配制成1L的初品培养基；
S5.平衡酸碱度：将步骤S4得到的初品培养基在含4％CO2的细胞培养箱中平衡至pH值为7.4，即得用于培养间充质干细胞的培养基；
S6.灭菌：将得到的用于培养间充质干细胞的培养基放入高压灭菌柜中，在0.1MPa压强下灭菌1小时。
本实施例中，优选的，所述步骤S2中搅拌混合均匀的转速为200r/min，搅拌时间为30min；所述步骤S3中搅拌混合均匀的转速为100r/min，搅拌时间为20min；所述步骤S4中搅拌混合均匀的转速为80r/min，搅拌时间为10min。
本实施例中，优选的，所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
本实施例中，优选的，所述木犀草素的制备过程包括以下步骤：
S101.原料清理：取花生壳，将所用花生壳用水进行淋洗处理、去除所带有的泥土杂质，然后干燥；
S102.制备浸膏：将上述洗涤过的花生壳不经粉碎，直接加入一定量的乙醇进行1h的黄酮类物质的回流提取，然后提取上清液进行浓缩，获得浸膏；
S103.制备黄酮类物质的有机溶剂溶液：向所述的浸膏中加入一定量的有机溶剂，超声溶解，得到黄酮类物质的有机溶剂溶液，通过过滤去除不溶物；
S104.制备木犀草素：将所述的溶液进行回收有机溶剂处理，得到木犀草素粗品，进一步用乙醇溶剂进行重结晶，获得木犀草素成品。
本实施例中，优选的，所述S101中的干燥选用自然晾干；所述S102中的乙醇，选用无水乙醇；所述S103中一定量的有机溶剂选用的是浸膏重量的4倍乙酸丁酯。
请参阅图3，本发明提供一种技术方案：一种用于培养间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、准备培养箱：将用于培养间充质干细胞的培养基加入培养箱内；
步骤二、获得骨髓间充质干细胞：将骨髓单细胞悬液经密度梯度离心，收集含单个核细胞的上清液，将上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞；
步骤三、骨髓间充质干细胞的培养：将骨髓间充质干细胞在37℃下放入培养箱中培养，2天后通过全量换液去除非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，当细胞达到70％融合时，用12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。
本实施例中，优选的，所述步骤二中免疫磁珠分离的抗体为CD45抗体。
实施例2
请参阅图1-图2，本发明提供一种技术方案：一种用于培养间充质干细胞的培养基，包括以下组分原料：血清50μl/ml、miR-705antagomir16ng/mL、抗坏血酸60mg/L、金银花粉5ng/mL、木犀草素30μg/mL、表皮生长因子20ng/mL、青霉素60U/mL、链霉素80μg/mL、维生素C 100μg/mL和细胞基础培养基。
本实施例中，优选的，所述细胞基础培养基是α-MEM，所述血清为人体血清。
本实施例中，优选的，所述用于培养间充质干细胞的培养基的制备方法包括以下步骤：
S1.原料准备：按原组成准备原料，血清50μl/ml、miR-705antagomir8-16ng/mL、抗坏血酸60mg/L、金银花粉5ng/mL、木犀草素30μg/mL、表皮生长因子20ng/mL、青霉素60U/mL、链霉素80μg/mL、维生素C100μg/mL和细胞基础培养基；
S2.原料初步混合：取400mL纯化水加热至65℃，然后向其中加入细胞基础培养基、血清、miR-705antagomir和维生素C，搅拌混合均匀，得第一混合物；
S3.原料再次混合：将步骤S2所得第一混合物降温至40℃，向其中加入金银花粉、木犀草素、青霉素和链霉素，混合搅拌均匀，得第二混合物；
S4.制备初品培养基：将步骤S3制得的第二混合物降温至30℃，然后加入表皮生长因子，混合搅拌均匀，加入纯化水，配制成1L的初品培养基；
S5.平衡酸碱度：将步骤S4得到的初品培养基在含6％CO2的细胞培养箱中平衡至pH值为7.4，即得用于培养间充质干细胞的培养基；
S6.灭菌：将得到的用于培养间充质干细胞的培养基放入高压灭菌柜中，在0.3MPa压强下灭菌1-3小时。
本实施例中，优选的，所述步骤S2中搅拌混合均匀的转速为400r/min，搅拌时间为40min；所述步骤S3中搅拌混合均匀的转速为200r/min，搅拌时间为30min；所述步骤S4中搅拌混合均匀的转速为120r/min，搅拌时间为20min。
本实施例中，优选的，所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
本实施例中，优选的，所述木犀草素的制备过程包括以下步骤：
S101.原料清理：取花生壳，将所用花生壳用水进行淋洗处理、去除所带有的泥土杂质，然后干燥；
S102.制备浸膏：将上述洗涤过的花生壳不经粉碎，直接加入一定量的乙醇进行3h的黄酮类物质的回流提取，然后提取上清液进行浓缩，获得浸膏；
S103.制备黄酮类物质的有机溶剂溶液：向所述的浸膏中加入一定量的有机溶剂，超声溶解，得到黄酮类物质的有机溶剂溶液，通过过滤去除不溶物；
S104.制备木犀草素：将所述的溶液进行回收有机溶剂处理，得到木犀草素粗品，进一步用乙醇溶剂进行重结晶，获得木犀草素成品。
本实施例中，优选的，所述S101中的干燥选用自然晾干或烘箱烘干；所述S102中的乙醇，选用95％的乙醇；所述S103中一定量的有机溶剂选用的是浸膏重量的6倍乙酸丁酯。
请参阅图3，本发明提供一种技术方案：一种用于培养间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、准备培养箱：将用于培养间充质干细胞的培养基加入培养箱内；
步骤二、获得骨髓间充质干细胞：将骨髓单细胞悬液经密度梯度离心，收集含单个核细胞的上清液，将上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞；
步骤三、骨髓间充质干细胞的培养：将骨髓间充质干细胞在37℃下放入培养箱中培养，4天后通过全量换液去除非贴壁细胞，以后每4天换液一次，当细胞达到80％融合时，用12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。
本实施例中，优选的，所述步骤二中免疫磁珠分离的抗体为CD45抗体。
实施例3
请参阅图1-图2，本发明提供一种技术方案：一种用于培养间充质干细胞的培养基，包括以下组分原料：血清20μl/ml、miR-705antagomir12ng/mL、抗坏血酸40mg/L、金银花粉3ng/mL、木犀草素20μg/mL、表皮生长因子12ng/mL、青霉素50U/mL、链霉素75μg/mL、维生素C 50μg/mL和细胞基础培养基。
本实施例中，优选的，所述细胞基础培养基是DMEM/F12，所述血清为胎牛血清。
本实施例中，优选的，所述用于培养间充质干细胞的培养基的制备方法包括以下步骤：
S1.原料准备：按原组成准备原料，血清20μl/ml、miR-705antagomir12ng/mL、抗坏血酸40mg/L、金银花粉3ng/mL、木犀草素20μg/mL、表皮生长因子12ng/mL、青霉素50U/mL、链霉素75μg/mL、维生素C 50μg/mL和细胞基础培养基；
S2.原料初步混合：取400mL纯化水加热至55℃，然后向其中加入细胞基础培养基、血清、miR-705antagomir和维生素C，搅拌混合均匀，得第一混合物；
S3.原料再次混合：将步骤S2所得第一混合物降温至35℃，向其中加入金银花粉、木犀草素、青霉素和链霉素，混合搅拌均匀，得第二混合物；
S4.制备初品培养基：将步骤S3制得的第二混合物降温至25℃，然后加入表皮生长因子，混合搅拌均匀，加入纯化水，配制成1L的初品培养基；
S5.平衡酸碱度：将步骤S4得到的初品培养基在含5％CO2的细胞培养箱中平衡至pH值为7.4，即得用于培养间充质干细胞的培养基；
S6.灭菌：将得到的用于培养间充质干细胞的培养基放入高压灭菌柜中，在0.2MPa压强下灭菌2小时。
本实施例中，优选的，所述步骤S2中搅拌混合均匀的转速为300r/min，搅拌时间为35min；所述步骤S3中搅拌混合均匀的转速为150r/min，搅拌时间为25min；所述步骤S4中搅拌混合均匀的转速为100r/min，搅拌时间为15min。
本实施例中，优选的，所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
本实施例中，优选的，所述木犀草素的制备过程包括以下步骤：
S101.原料清理：取花生壳，将所用花生壳用水进行淋洗处理、去除所带有的泥土杂质，然后干燥；
S102.制备浸膏：将上述洗涤过的花生壳不经粉碎，直接加入一定量的乙醇进行2h的黄酮类物质的回流提取，然后提取上清液进行浓缩，获得浸膏；
S103.制备黄酮类物质的有机溶剂溶液：向所述的浸膏中加入一定量的有机溶剂，超声溶解，得到黄酮类物质的有机溶剂溶液，通过过滤去除不溶物；
S104.制备木犀草素：将所述的溶液进行回收有机溶剂处理，得到木犀草素粗品，进一步用乙醇溶剂进行重结晶，获得木犀草素成品。
本实施例中，优选的，所述S101中的干燥选用自然晾干或烘箱烘干；所述S102中的乙醇，选用无水乙醇；所述S103中一定量的有机溶剂选用的是浸膏重量的5倍乙酸丁酯。
请参阅图3，本发明提供一种技术方案：一种用于培养间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、准备培养箱：将用于培养间充质干细胞的培养基加入培养箱内；
步骤二、获得骨髓间充质干细胞：将骨髓单细胞悬液经密度梯度离心，收集含单个核细胞的上清液，将上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞；
步骤三、骨髓间充质干细胞的培养：将骨髓间充质干细胞在37℃下放入培养箱中培养，3天后通过全量换液去除非贴壁细胞，以后每3天换液一次，当细胞达到75％融合时，用12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。
本实施例中，优选的，所述步骤二中免疫磁珠分离的抗体为CD45抗体。
选取传统的工艺制备的培养基和本发明中制备的培养基进行以下实验，实验内容和结果如下表
Figure BDA0003322038870000111
Figure BDA0003322038870000121
通过各项实验可以发现，实施例1、实施例2和实施例3中制备的培养基的抗衰老功能、细胞活性、分泌能力和增殖速度皆得到提高，且实施例3为最佳实施例。
本发明的原理及优点：
本发明针对间充质干细胞衰老过程中的microRNA异常表达，采用特异性的microRNA抑制剂antagomir，不需要转染试剂和载体，直接进入细胞，从而安全高效的调控细胞表达，下调miR-705，从而延缓长期体外传代扩增所致的间充质干细胞衰老和功能下降，为BMSC临床应用建立基础；
本发明的配方能够激活间充质干细胞的活力潜能，提高了细胞的活性和分泌能力，并且能够选择性的促进间充质干细胞体外培养中的生长和分化，并为其达到最理想营养平衡状态提供数量上和质量上的保证，显著提高了细胞增殖速度。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于，包括以下组分原料：血清5-50μl/ml、miR-705antagomir8-16ng/mL、抗坏血酸30-60mg/L、金银花粉2-5ng/mL、木犀草素15-30μg/mL、表皮生长因子8-20ng/mL、青霉素40-60U/mL、链霉素70-80μg/mL、维生素C 25-100μg/mL和细胞基础培养基。
2.根据权利要求1所述的一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于，包括以下组分原料：血清20μl/ml、miR-705antagomir12ng/mL、抗坏血酸40mg/L、金银花粉3ng/mL、木犀草素20μg/mL、表皮生长因子12ng/mL、青霉素50U/mL、链霉素75μg/mL、维生素C 50μg/mL和细胞基础培养基。
3.根据权利要求1所述的一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述细胞基础培养基是DMEM、α-MEM、F12、DMEM/F12、RPMI1640、IMEM中的一种或几种组合，所述血清为胎牛血清、人体血清中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述用于培养间充质干细胞的培养基的制备方法包括以下步骤：
S1.原料准备：按原组成准备原料，血清5-50μl/ml、miR-705antagomir8-16ng/mL、抗坏血酸30-60mg/L、金银花粉2-5ng/mL、木犀草素15-30μg/mL、表皮生长因子8-20ng/mL、青霉素40-60U/mL、链霉素70-80μg/mL、维生素C 25-100μg/mL和细胞基础培养基；
S2.原料初步混合：取400mL纯化水加热至45-65℃，然后向其中加入细胞基础培养基、血清、miR-705antagomir和维生素C，搅拌混合均匀，得第一混合物；
S3.原料再次混合：将步骤S2所得第一混合物降温至30-40℃，向其中加入金银花粉、木犀草素、青霉素和链霉素，混合搅拌均匀，得第二混合物；
S4.制备初品培养基：将步骤S3制得的第二混合物降温至20-30℃，然后加入表皮生长因子，混合搅拌均匀，加入纯化水，配制成1L的初品培养基；
S5.平衡酸碱度：将步骤S4得到的初品培养基在含4-6％CO2的细胞培养箱中平衡至pH值为7.4，即得用于培养间充质干细胞的培养基；
S6.灭菌：将得到的用于培养间充质干细胞的培养基放入高压灭菌柜中，在0.1-0.3MPa压强下灭菌1-3小时。
5.根据权利要求1所述的一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述步骤S2中搅拌混合均匀的转速为200-400r/min，搅拌时间为30-40min；所述步骤S3中搅拌混合均匀的转速为100-200r/min，搅拌时间为20-30min；所述步骤S4中搅拌混合均匀的转速为80-120r/min，搅拌时间为10-20min。
6.根据权利要求1所述的一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
7.根据权利要求1所述的一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述木犀草素的制备过程包括以下步骤：
S101.原料清理：取花生壳，将所用花生壳用水进行淋洗处理、去除所带有的泥土杂质，然后干燥；
S102.制备浸膏：将上述洗涤过的花生壳不经粉碎，直接加入一定量的乙醇进行1-3h的黄酮类物质的回流提取，然后提取上清液进行浓缩，获得浸膏；
S103.制备黄酮类物质的有机溶剂溶液：向所述的浸膏中加入一定量的有机溶剂，超声溶解，得到黄酮类物质的有机溶剂溶液，通过过滤去除不溶物；
S104.制备木犀草素：将所述的溶液进行回收有机溶剂处理，得到木犀草素粗品，进一步用乙醇溶剂进行重结晶，获得木犀草素成品。
8.根据权利要求1所述的一种用于培养间充质干细胞的培养基，其特征在于：所述S101中的干燥选用自然晾干或烘箱烘干；所述S102中的乙醇，选用无水乙醇或者95％的乙醇；所述S103中一定量的有机溶剂选用的是浸膏重量的4-6倍乙酸丁酯或者正丁醇。
9.一种用于培养间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、准备培养箱：将用于培养间充质干细胞的培养基加入培养箱内；
步骤二、获得骨髓间充质干细胞：将骨髓单细胞悬液经密度梯度离心，收集含单个核细胞的上清液，将上清液离心重悬后经免疫磁珠分离，获得骨髓间充质干细胞；
步骤三、骨髓间充质干细胞的培养：将骨髓间充质干细胞在37℃下放入培养箱中培养，2-4天后通过全量换液去除非贴壁细胞，以后每3-4天换液一次，当细胞达到70％-80％融合时，用12.5mg/ml胰酶消化，按1∶3传代，并记为第一代P1，重复上述操作进行传代培养过程，将部分P1、P2细胞冻存于含900μl/ml血清和100μl/ml二甲基亚枫的冻存液中，并保存于液氮罐中以备后用，将传至P3及以上的细胞用于后续实验。
10.根据权利要求9所述的一种用于培养间充质干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤二中免疫磁珠分离的抗体为CD45抗体。
CN202111249619.2A 2021-10-26 2021-10-26 一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法 Pending CN113846056A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111249619.2A CN113846056A (zh) 2021-10-26 2021-10-26 一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111249619.2A CN113846056A (zh) 2021-10-26 2021-10-26 一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113846056A true CN113846056A (zh) 2021-12-28

Family

ID=78983089

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111249619.2A Pending CN113846056A (zh) 2021-10-26 2021-10-26 一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113846056A (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106244548A (zh) * 2015-06-09 2016-12-21 成都中医药大学 木犀草素在诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化中的用途
CN108611320A (zh) * 2018-05-17 2018-10-02 广东芙金干细胞再生医学有限公司 一种抗衰老的干细胞培养基及间充质干细胞培养方法
CN108794443A (zh) * 2017-10-13 2018-11-13 昌邑市银江生物科技有限公司 一种制备高纯度木犀草素的方法
CN111662866A (zh) * 2020-06-04 2020-09-15 广州同康生物科技有限公司 一种人羊膜间充质干细胞培养基
CN111944753A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 海南济民博鳌国际医院有限公司 一种用于间充质干细胞的培养基及培养方法
CN112458050A (zh) * 2021-01-22 2021-03-09 宫泽静 一种间充质干细胞培养基及其制备方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106244548A (zh) * 2015-06-09 2016-12-21 成都中医药大学 木犀草素在诱导间充质干细胞向神经细胞定向分化中的用途
CN108794443A (zh) * 2017-10-13 2018-11-13 昌邑市银江生物科技有限公司 一种制备高纯度木犀草素的方法
CN108611320A (zh) * 2018-05-17 2018-10-02 广东芙金干细胞再生医学有限公司 一种抗衰老的干细胞培养基及间充质干细胞培养方法
CN111662866A (zh) * 2020-06-04 2020-09-15 广州同康生物科技有限公司 一种人羊膜间充质干细胞培养基
CN111944753A (zh) * 2020-08-31 2020-11-17 海南济民博鳌国际医院有限公司 一种用于间充质干细胞的培养基及培养方法
CN112458050A (zh) * 2021-01-22 2021-03-09 宫泽静 一种间充质干细胞培养基及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BYUNG-KWAN SEO等: "Dual effect of WIN-34B on osteogenesis and osteoclastogenesis in cytokine-induced mesenchymal stem cells and bone marrow cells" *
JUNG HWAN OH等: "Effect and Comparison of Luteolin and Its Derivative Sodium Luteolin-49-sulfonate on Adipogenic Differentiation of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells through AMPKMediated PPARγ Signaling" *
郑杰: "中药对骨髓间充质干细胞免疫调节作用干预的实验研究" *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103667187B (zh) 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法
CN110564682B (zh) 一种大规模生产人脂肪间充质干细胞外泌体的方法
CN101914495A (zh) 用于体外大量扩增毛囊干细胞的培养方法
CN107653225A (zh) 一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法
CN107535671B (zh) 提高瘤胃蛋白利用率的微生物发酵黄酒糟饲料及制备方法
CN103923900B (zh) 一种黄酒用双功能酶交联酶聚集体的制备与应用
CN106318906A (zh) 一种大规模培养人脐带间充质干细胞的方法
CN110093281B (zh) 桑黄液体深层发酵培养工艺
CN114107403B (zh) 一种微生物群落发酵石榴皮联产鞣花酸和生物饲料的方法
CN109234230B (zh) 一种皮肤间充质干细胞的原代分离方法
CN105011270A (zh) 一种番荔枝酵素饮料的方法
US20090098619A1 (en) Method of producing liquid and powered mushroom beta-glucan
CN101657536A (zh) 软骨细胞制备方法
RU2012107674A (ru) Биотрансплантат для восстановления объема костной ткани при дегенеративных заболеваниях и травматических повреждениях костей и способ его получения
CN113846056A (zh) 一种用于培养间充质干细胞的培养基及培养方法
CN110373384A (zh) 一种无血清脂肪干细胞培养基及脂肪干细胞的培养方法
CN104045723A (zh) 一种利用生物技术提取茶多糖的方法
CN109010382A (zh) 一种兽用发酵蛹虫草菌口服液的制备方法
Osuna et al. Immobilization of Galphimia glauca plant cell suspensions for the production of enhanced amounts of Galphimine-B
CN101451122B (zh) 褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法
CN114276986A (zh) 一种分离纯化水牛原代成肌细胞的方法及其应用
CN102115772B (zh) 微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法
CN112458049A (zh) 一种低成本体外培养猪肌肉干细胞的方法
CN111690598A (zh) 一种源于竹蛏寡肽及其制备方法和应用
CN115612643B (zh) 一种长双歧杆菌的高活菌数有氧发酵方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination