CN111662866A - 一种人羊膜间充质干细胞培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞培养基。本发明提供的人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI‑1640基础培养基，细胞生长因子，Ultroser G血清替代物，L‑谷氨酰胺及金银花粉。本发明提供的人羊膜间充质干细胞培养基，可以促进细胞分裂，在一定时间内，培养更多的细胞，且不加入血清，减少了血清对细胞的毒性作用及血清源性污染。
Description
技术领域
本发明属于干细胞培养领域，具体涉及一种人羊膜间充质干细胞培养基。
背景技术
干细胞，即为起源细胞。简单来讲，它是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞。干细胞在形态上具有共性，通常呈圆形或椭圆形，细胞体积小，核相对较大，细胞核多为常染色质，具有较高的端粒酶活性。
而人的羊膜位于胎盘的最内侧，主要由于外胚层的上皮细胞和位于中胚层的间充质细胞构成，其不含血管，细胞成分相对简单，在胎儿娩出后即成为废弃物，而人羊膜间充质干细胞有着丰富、无需有创操作、取材几乎不受限制，分离培养方法简便、有向3个胚层的组织细胞分化的潜能，免疫原性低等多种优点，有望成为一种更加理想的间充质干细胞以用于临床研究及应用。因此，培养更多的人羊膜间充质干细胞是十分有必要的。
然而，目前细胞培养多选择的是血清培养基，虽然血清中含有丰富全面的细胞生长必需的营养，可以提供维持细胞指数生长的激素，生长因子以及一些低分子量营养物，然而，这种培养基中的血清有时含有细胞生长抑制因子和毒性因子，存在潜在毒性，且血清获取成本高，价格较贵。
基于此，中国专利CN101914490B公开了一种人羊膜间充质干细胞无血清培养基及其培养方法，该培养基不含动物血清，是在基础培养基中添加人血清白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素和亚硒酸钠形成的，虽然不受伦理限制及异种免疫原性，但是这种培养基中添加了多种蛋白，容易对细胞产生毒性，降低细胞数量，且加入的蛋白质种类多，增加了培养基的制作成本高。
综上所述，现有技术中的培养基普遍具有细胞培养数量少，成本高，容易对细胞产生毒性作用的缺点。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺点，本发明提供了一种人羊膜间充质干细胞培养基。本发明提供的人羊膜间充质干细胞培养基，可以促进细胞分裂，在一定时间内，培养更多的细胞，且不加入血清，减少了血清对细胞的毒性作用及血清源性污染。
为了达到上述目的，本发明的采用的技术方案为：
一种人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞生长因子，Ultroser G血清替代物，L-谷氨酰胺及金银花粉；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为20～30g/L，所述细胞生长因子的加入量为1～3μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为40～60mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为3～5μg/L，所述金银花粉的加入量为2～4μg/L。
优选地，所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为25g/L，所述细胞生长因子的加入量为2μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为50mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为4μg/L，所述金银花粉的加入量为3μg/L。
优选地，所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比1～3：2～5：9～11组成。
优选地，所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比2：3：10组成。
优选地，所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
本发明还提供了所述人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：
S1、取400mL纯化水加热至50～60℃，然后向其中加入高级RPMI-1640基础培养基及L-谷氨酰胺，搅拌混合均匀，得混合物I；
S2、将步骤S1所得混合物I降温至35～45℃，向其中加入Ultroser G血清替代物及金银花粉，混合搅拌均匀，得混合物II；
S3、将步骤S2制得的混合物II降温至25～30℃，然后加入细胞生长因子，混合均匀，加入纯化水，配制成1L的培养基，即得。
优选地，步骤S1所述搅拌混合均匀的条件为在150～250rpm的转速下搅拌20～30min。
优选地，步骤S2所述混合搅拌均匀的条件为在300～400rpm的转速下搅拌30～40min。
优选地，步骤S3所述混合均匀的条件为在250～350rpm的转速下搅拌30～40min。
本发明中，向基础培养基中加入了按一定比例组成的细胞生长因子，可以促进细胞的生长，有助于增强细胞的增殖能力，增加了单位时间内，细胞的培养数量；而且，本发明还加入了一定量的L-谷氨酰胺，可以促进细胞的新陈代谢；用Ultroser G血清替代物代替血清，同样可以为细胞培养提供各种营养，又避免了血清带来的毒性作用。
另外，本发明还意外的发现，在培养基中添加适量的金银花粉，不仅可以很好的抑制细胞培养过程中细菌的生长，金银花粉还可以与L-谷氨酰胺协同作用，促进细胞分裂，提高细胞数量。
与现有技术相比，本发明提供的人羊膜间充质干细胞培养基具有以下优点：
(1)本发明提供的人羊膜间充质干细胞培养基，添加了按一定比例组成的细胞生长因子，辅以金银花粉与L-谷氨酰胺，有助于增强细胞的增殖能力，提高细胞培养数量；
(2)本发明提供的人羊膜间充质干细胞培养基，用适量的Ultroser G血清替代物代替血清，为细胞提供培养过程中需要的各种营养成分，又避免了血清带来的毒性作用；
(3)本发明提供的人羊膜间充质干细胞培养基，添加的成分少，大大降低了培养基的制备成本，有利于更广泛的推广应用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。
所述高级RPMI-1640基础培养基不含L-谷氨酰胺及碳酸氢钠，可购自上海逸研生物科技有限公司；所述Ultroser G血清替代物是一种无血清添加剂，可以直接替代现有技术中的胎牛血清FBS，该替代物中含有粘附因子、结合蛋白、维生素、激素等多种细胞培养所需的必要成分，可购自美国PALL公司；本发明所用其他试剂均为常用试剂，均可在常规试剂生产销售公司购买。
实施例1一种人羊膜间充质干细胞培养基
所述人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞生长因子，Ultroser G血清替代物，L-谷氨酰胺及金银花粉；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为20g/L，所述细胞生长因子的加入量为1μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为40mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为3μg/L，所述金银花粉的加入量为2μg/L；所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比1：2：9组成；所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
所述人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：
S1、取400mL纯化水加热至50℃，然后向其中加入高级RPMI-1640基础培养基及L-谷氨酰胺，于150rpm的转速下搅拌20min，至混合均匀，得混合物I；
S2、将步骤S1所得混合物I降温至35℃，向其中加入Ultroser G血清替代物及金银花粉，于300rpm的转速下混合搅拌30min，至混合均匀，得混合物II；
S3、将步骤S2制得的混合物II降温至25℃，然后加入细胞生长因子，于250rpm的转速下搅拌30min，混合均匀，加入纯化水，配制成1L的培养基，即得。
实施例2一种人羊膜间充质干细胞培养基
所述人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞促分裂因子，Ultroser G血清替代物，L-谷氨酰胺及金银花粉；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为30g/L，所述细胞生长因子的加入量为3μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为60mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为5μg/L，所述金银花粉的加入量为4μg/L；所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比3：5：11组成；所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
所述人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：
S1、取400mL纯化水加热至60℃，然后向其中加入高级RPMI-1640基础培养基及L-谷氨酰胺，于250rpm的转速下搅拌30min，至混合均匀，得混合物I；
S2、将步骤S1所得混合物I降温至45℃，向其中加入Ultroser G血清替代物及金银花粉，于300rpm的转速下搅拌40min，至混合均匀，得混合物II；
S3、将步骤S2制得的混合物II降温至30℃，然后加入细胞生长因子，于350rpm的转速下搅拌40min，至混合均匀，加入纯化水，配制成1L的培养基，即得。
实施例3一种人羊膜间充质干细胞培养基
所述人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞促分裂因子，Ultroser G血清替代物，L-谷氨酰胺及金银花粉；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为25g/L，所述细胞生长因子的加入量为2μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为50mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为4μg/L，所述金银花粉的加入量为3μg/L；所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比2：3：10组成；所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
所述人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，包括如下步骤：
S1、取400mL纯化水加热至55℃，然后向其中加入高级RPMI-1640基础培养基及L-谷氨酰胺，于200rpm的转速下搅拌25min，至混合均匀，得混合物I；
S2、将步骤S1所得混合物I降温至40℃，向其中加入Ultroser G血清替代物及金银花粉，于250rpm的转速下混合搅拌35min，至混合均匀，得混合物II；
S3、将步骤S2制得的混合物II降温至28℃，然后加入细胞生长因子，于300rpm的转速下搅拌35min，混合均匀，加入纯化水，配制成1L的培养基，即得。
对比例1一种人羊膜间充质干细胞培养基
所述人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞促分裂因子，Ultroser G血清替代物，L-谷氨酰胺及金银花粉；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为25g/L，所述细胞生长因子的加入量为2μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为50mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为4μg/L，所述金银花粉的加入量为3μg/L；所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比1：1：1组成；所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
所述人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例1中的细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比1：1：1组成。
对比例2一种人羊膜间充质干细胞培养基
所述人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞促分裂因子，Ultroser G血清替代物及L-谷氨酰胺；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为25g/L，所述细胞生长因子的加入量为2μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为50mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为4μg/L；所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比2：3：10组成；所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
所述人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例2中不包含金银花粉。
对比例3一种人羊膜间充质干细胞培养基
所述人羊膜间充质干细胞培养基，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞促分裂因子，Ultroser G血清替代物及金银花粉；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为25g/L，所述细胞生长因子的加入量为2μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为50mg/L，所述金银花粉的加入量为3μg/L；所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比2：3：10组成；所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
所述人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法与实施例3类似；
与实施例3的区别在于，对比例3中不包含L-谷氨酰胺。
试验例1细胞培养数量对比
1.试验样品：实施例1-3组，对比例1-3组制得的人羊膜间充质干细胞培养基；
2.试验方法：将人类羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎，加入质量浓度为0.1～0.3％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，然后将羊膜组织剪碎至1mm2后，转移至125mL储液瓶中，加入20mL质量浓度为0.5％的I型胶原酶及高糖DMEM基础培养基，至I型胶原酶终浓度为0.075～0.2％进行消化，消化在恒温摇床中进行，消化温度为37℃，转速为250～300r/min，消化至组织块融化，用PBS缓冲液稀释消化后的组织液，离心分离，取沉淀物，沉淀物用PBS溶液重悬，过滤后离心分离，弃去上清液，获得人羊膜间充质干细胞，等分成六份，分别重悬于实施例1-3组及对比例1-3组制得的培养基中，并分别移入培养皿中，于37℃，5％CO2的温箱，100％湿度条件下进行培养。隔天更换培养液，待细胞铺满约90％培养皿底部面积后，停止培养，记录时间。
3.试验结果：具体试验结果见表1。
表1不同培养基细胞培养数量对比结果
由此可知，本发明实施例1-3组制得的脂肪干细胞无血清培养基可以显著加快细胞培养速度，尤其实施例3组的培养基，培养52h即可使细胞铺满约90％培养皿底部面积，故实施例3为本发明的最佳实施例；而对比例1-3组，由于改变了细胞生长因子中各组分的比例，去掉了金银花粉或L-谷氨酰胺，进而破坏了各组分之间的相互作用，使得培养速度大大降低。
试验例2培养基灭菌效果试验
1.试验样品：实施例1-3组及对比例2组制得的人羊膜间充质干细胞培养基；
2.试验方法：分别将实施例1-3组及对比例2组制得的人羊膜间充质干细胞培养基置于121℃湿热灭菌20min，然后将灭菌后的培养基置于37℃的恒温箱中培养，记录培养基开始变浑浊的时间。
3.试验结果：具体试验结果见表2。
表2不同培养基灭菌效果试验对比
| 培养基 | 实施例1组 | 实施例2组 | 实施例3组 | 对比例2组 |
| 时间/h | 72 | 73 | 76 | 60 |
由表2可知，本发明实施例1-3组制得的培养基灭菌效果极好，灭菌后可以保持60小时不被细菌感染，尤其是实施例3组，出现浑浊的时间为76h，比对比例2组出现浑浊时间晚16h，故实施例3为本发明的最佳实施例，而对比例2组由于去掉了金银花粉，导致培养基的灭菌效果大大降低。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (9)
1.一种人羊膜间充质干细胞培养基，其特征在于，包括高级RPMI-1640基础培养基，细胞生长因子，Ultroser G血清替代物，L-谷氨酰胺及金银花粉；所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为20～30g/L，所述细胞生长因子的加入量为1～3μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为40～60mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为3～5μg/L，所述金银花粉的加入量为2～4μg/L。
2.如权利要求1所述的人羊膜间充质干细胞培养基，其特征在于，所述高级RPMI-1640基础培养基的加入量为25g/L，所述细胞生长因子的加入量为2μg/L，所述Ultroser G血清替代物的加入量为50mg/L，所述L-谷氨酰胺的加入量为4μg/L，所述金银花粉的加入量为3μg/L。
3.如权利要求1或2所述的人羊膜间充质干细胞培养基，其特征在于，所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比1～3：2～5：9～11组成。
4.如权利要求3所述的人羊膜间充质干细胞培养基，其特征在于，所述细胞生长因子由PDGF、VEGF及EGF按质量比2：3：10组成。
5.如权利要求1或2所述的人羊膜间充质干细胞培养基，其特征在于，所述金银花粉的制备过程为：取干燥的金银花，称量1g，用研磨器磨碎，然后过300目筛，即得。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取400mL纯化水加热至50～60℃，然后向其中加入高级RPMI-1640基础培养基及L-谷氨酰胺，搅拌混合均匀，得混合物I；
S2、将步骤S1所得混合物I降温至35～45℃，向其中加入Ultroser G血清替代物及金银花粉，混合搅拌均匀，得混合物II；
S3、将步骤S2制得的混合物II降温至25～30℃，然后加入细胞生长因子，混合均匀，加入纯化水，配制成1L的培养基，即得。
7.如权利要求6所述的人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，步骤S1所述搅拌混合均匀的条件为在150～250rpm的转速下搅拌20～30min。
8.如权利要求6所述的人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，步骤S2所述混合搅拌均匀的条件为在300～400rpm的转速下搅拌30～40min。
9.如权利要求6所述的人羊膜间充质干细胞培养基的制备方法，其特征在于，步骤S3所述混合均匀的条件为在250～350rpm的转速下搅拌30～40min。
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