JP2014507389A - 羊膜由来接着細胞を使用する脊髄損傷及び外傷性脳損傷の治療 - Google Patents

羊膜由来接着細胞を使用する脊髄損傷及び外傷性脳損傷の治療 Download PDF

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Abstract

本明細書において「羊膜由来接着細胞」("AMDAC")と称される、羊膜由来の細胞、及びそのような細胞の集団を使用し、脊髄損傷又は外傷性脳損傷を治療する方法が、本明細書に提供される。
【選択図】なし

Description

本出願は、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、2010年12月17日に出願された米国特許仮出願第61/424,596号の優先権を主張するものである。
(1. 分野)
本明細書において「羊膜由来接着細胞」("AMDAC")と称される、羊膜由来の細胞、及びそのような細胞の集団を使用し、脊髄損傷又は外傷性脳損傷を治療する方法が、本明細書に提供される。
(2. 背景)
中枢神経系(CNS)の損傷は、医学的に重大な問題を示す。米国において生存者のおよそ300,000名が、脊髄損傷(SCI)に罹患しており、且つ毎年およそ10,000〜14,000例が新たにSCI症例と診断されている。SCIは通常、脊柱への外傷の結果、例えば位置がずれた骨又は椎間板(disc)が脊髄を圧迫することの結果である。SCIは、例えば脊髄への血流喪失から、明らかな椎骨骨折を伴わずに起こり得、且つ脊椎骨折は、脊髄損傷を伴わずに起こり得る。
外傷性脳損傷(TBI)は、世界中で若年成人における身体障害及び死亡の主要な原因の一つである。軍隊の状況において、例えば、脳障害は、例えば直接の衝撃、銃弾及び爆弾の破片などの物体の貫通、並びに爆発により引き起こされた爆風から生じる。
(3. 概要)
羊膜由来接着細胞("AMDAC")の1以上の投与量を、CNS損傷を有する個体に投与することを含む、CNSへの損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷を有する個体の治療方法が、本明細書に提供される。
一態様において、治療有効量のAMDAC又はAMDACにより馴化された培地を個体に投与することを含む、脊髄損傷(SCI)の症状又はそれに関連した病態若しくは症候群を有するか又は経験している個体を治療する方法が、本明細書において提供され、ここで該治療有効量は、該脊髄損傷の1以上の症状の検出可能な改善、又は1以上の症状の進行の縮小を引き起こすのに十分な量である。
いくつかの実施態様において、AMDAC、又はAMDACにより馴化された培養培地の治療有効量は、損傷の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50日以内若しくはそれ以降に、又はCNS損傷後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年間以内若しくはそれ以降に、個体に投与される。
具体的実施態様において、該CNS損傷は、脊髄損傷(SCI)である。いくつかの実施態様において、脊髄損傷は、直接の外傷により引き起こされる。いくつかの実施態様において、脊髄損傷は、骨片又は椎間板物質による圧迫により引き起こされる。いくつかの実施態様において、脊髄損傷は、頸椎、胸椎、腰椎、又は仙椎の1以上においてである。いくつかの実施態様において、脊髄損傷は、頸髄、胸髄、腰仙椎、円錐(conus)、後頭部の1以上、又は馬尾神経の1以上に対してである。
いくつかの実施態様において、CNS損傷に関連した疾患、障害又は病態を治療する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施態様において、CNS損傷に関連した疾患、障害又は病態は、脊髄損傷から生じる脊髄ショックである。いくつかの実施態様において、CNS損傷に関連した疾患、障害又は病態は、脊髄損傷から生じる神経原性ショックである。いくつかの実施態様において、CNS損傷に関連した疾患、障害又は病態は、脊髄損傷から生じる自律神経反射異常である。いくつかの実施態様において、CNS損傷に関連した疾患、障害又は病態は、脊髄損傷から生じる浮腫である。いくつかの実施態様において、CNS損傷に関連した疾患、障害又は病態は、脊髄中心症候群、ブラウン・セカール症候群、脊髄前部症候群、脊髄円錐症候群、及び馬尾症候群からなる群から選択される。
いくつかの実施態様において、投与されるAMDAC、又はAMDACにより馴化された培地の治療有効量は、以下の脊髄損傷の症状の1以上の検出可能な改善又は進行の縮小を引き起こすのに十分な量である：脊髄の頸髄分節、胸髄分節、腰髄分節又は仙髄分節における運動機能、感覚機能、又は運動感覚機能の喪失又は障害。いくつかの実施態様において、脊髄損傷の1つ又は複数の症状は、腕、胴体、脚又は骨盤器官の運動機能、感覚機能、又は運動感覚機能の喪失又は障害を含む。いくつかの実施態様において、脊髄損傷の1つ又は複数の症状は、皮膚分節C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4又はL5の1以上の無感覚を含む。
本明細書に提供されるSCIの治療のいくつかの実施態様において、本方法は更に、該個体へ第二の治療薬を投与することを含む。いくつかの実施態様において、該第二の治療薬は、コルチコステロイド、神経保護薬、免疫調節薬又は免疫抑制薬、又は抗凝血薬である。
本明細書に提供される治療方法の別の具体的実施態様において、CNS損傷に関連した疾患、障害又は病態は、外傷性脳損傷である。いくつかの実施態様において、外傷性脳損傷は、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、脳幹、又は小脳の損傷である。いくつかの実施態様において、外傷性脳損傷は、軽度の外傷性脳損傷である。いくつかの実施態様において、外傷性脳損傷は、中程度から重度の外傷性脳損傷である。
いくつかの実施態様において、投与されるAMDAC、又はAMDACにより馴化された培地の治療有効量は、以下の軽度外傷性脳損傷の症状の1以上の検出可能な改善又は進行の縮小を引き起こすのに十分な量である：頭痛、記憶障害、注意欠陥、気分動揺及び欲求不満、疲労、視力障害、記憶喪失、注意不足／集中力不足、睡眠障害、眩暈／平衡感覚障害、短気、情緒障害、意気消沈、発作、悪心、嗅覚喪失、光及び音への過敏、気分変動、迷い又は混乱(getting lost or confused)、又は思考緩徐。
いくつかの実施態様において、投与されるAMDAC、又はAMDACにより馴化された培地の治療有効量は、以下の中等度から重度の外傷性脳損傷の症状の1以上の検出可能な改善又は進行の縮小を引き起こすのに十分な量である：注意困難、集中困難、散漫性、記憶困難、処理速度の緩慢化、混乱、固執、衝動、言語処理の困難、発語及び言語の困難、話し言葉の理解不能(受容失語症)、会話及び理解の困難(表現性失語症)、不明瞭言語、非常に速い又は非常に遅い発語、難読症、難書症、触覚・温度・運動・四肢の位置・微細な識別の解釈の困難、心理学的に意味のあるデータへの知覚印象の統合又はパターン化の困難、部分的又は完全な視力喪失、眼筋虚弱及び二重視力(複視)、かすみ目、距離判断の問題、眼球固視微動(眼振)、光への不耐(羞明)、聴力低下又は喪失、耳鳴り(耳鳴)、音への敏感さの増大、嗅覚喪失又は減退(嗅覚消失)、味覚喪失又は減退、発作、てんかんに関連した痙攣、身体麻痺／痙直、慢性疼痛、腸及び／又は膀胱の制御喪失、睡眠障害、体力低下、食欲の変化、体温調節不能、月経困難、社会的感情の困難、依存行動、情動能(emotional ability)喪失、意欲喪失、短気、攻撃性、抑鬱、脱抑制、又は認識欠如。
本明細書に提供されるTBI治療のいくつかの実施態様において、本方法は、第二の治療薬を該個体へ投与することを更に含む。いくつかの実施態様において、該第二の治療薬は、抗痙攣薬、抗欝薬、アマンタジン、メチルフェニデート、ブロモクリプチン、カルバマゼピン(carbamamazapine)又はアミトリプチリンである。
本明細書に提供されるCNS損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷の治療のいくつかの実施態様において、AMDAC、又はAMDACにより馴化された培養培地の治療有効量は、静脈内、動脈内、腹腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、滑液嚢内、眼球内、硝子体内、大脳内、脳室内、髄腔内、骨内注入、膀胱内、経真皮、槽内、硬膜外、腰椎穿刺、大槽又は皮下投与からなる群から選択される経路により、個体へ投与される。いくつかの実施態様において、AMDAC、又はAMDACにより馴化された培養培地の治療有効量は、損傷部位へ直接個体に投与される。
具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、非虚血性事象から生じるか又はそれにより引き起こされる。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、血腫ではないか、又は血腫から生じない。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、頭蓋への外部からの力により引き起こされた血腫ではない。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、TBIに罹患している個体の脳の内部又は周囲の血流の途絶によっては引き起こされない。
特定の実施態様において、CNS損傷に関連した又はその一部であるT細胞(例えば、CD4+ Tリンパ球又は白血球)を、AMDAC、例えば本明細書に記載のAMDACと接触させることを含む、個体におけるCNS損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷に対する前炎症反応を阻害する方法が、本明細書に提供される。具体的実施態様において、該炎症反応は、Th1反応又はTh17反応である。具体的実施態様において、該接触は、Th1細胞成熟を検出可能に低下する。本方法の具体的実施態様において、該接触は、該T細胞により、インターロイキン-1β(IL-1β)、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子α(TNFα)及び／又はインターフェロンγ(IFNγ)の1種以上の生成を検出可能に低下する。本方法の別の具体的実施態様において、該接触は、制御性T細胞(Treg)表現型を強化又はアップレギュレートする。別の具体的実施態様において、該接触は、Th1及び／又はTh17免疫反応を促進するマーカー(例えば、CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)の樹状細胞(DC)及び／又はマクロファージ発現をダウンレギュレートする。具体的実施態様において、該T細胞はまた、IL-10、例えば外因性IL-10、又は該T細胞により生成されないIL-10、例えば組換えIL-10と接触される。別の実施態様において、マクロファージを、有効量のAMDACと接触させることを含む、マクロファージ由来の前炎症サイトカインの生成を減少する方法が、本明細書において提供される。別の実施態様において、免疫系細胞を、有効量のAMDACと接触させることを含む、例えばマクロファージ由来の、寛容細胞及び／又はサイトカインをアップレギュレートする方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、該接触は、活性化されたマクロファージに、該AMDACと接触されない活性化されたマクロファージよりも、検出可能により多くのIL-10を産生させる。別の実施態様において、免疫系細胞を有効量のAMDACと接触させることを含む、抗炎症T細胞をアップレギュレート、又は数を増加する方法が、本明細書において提供される。
一実施態様において、有効量のAMDACを個体に投与することを含む、個体におけるCNS損傷に関連したTh1反応を阻害する方法が、本明細書において提供され、ここで該有効量は、個体において該CNS損傷に関連したTh1反応の検出可能な減少を生じる量である。別の実施態様において、個体へ有効量のAMDACを投与することを含む、個体においてCNS損傷に関連したTh17反応を阻害する方法が、本明細書に提供され、ここで該有効量は、個体においてTh17反応の検出可能な減少を生じる量である。これらの方法の具体的実施態様において、該投与は、該個体におけるT細胞又は抗原提示細胞(例えば、DC、マクロファージ又は単球)による、リンホトキシン-1α(LT-1α)、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの1種以上の産生を、検出可能に低下する。本方法の別の具体的実施態様において、該接触は、制御性T細胞(Treg)を強化又はアップレギュレートする。別の実施態様において、該接触は、Th1又はTh17反応を促進するマーカー(例えば、CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)の、該個体における樹状細胞(DC)及び／又はマクロファージによる産生を調節する(例えば、減少する)。別の具体的実施態様において、本方法は加えて、IL-10の該個体への投与を含む。
別の態様において、抗炎症サイトカインの1種以上を発現するように遺伝子操作されている、本明細書に記載のAMDACが、本明細書において提供される。具体的実施態様において、該抗炎症サイトカインは、IL-10を含む。
本明細書記載のAMDACは、細胞マーカー及び遺伝子マーカーの異なる組合せにより同定されてよい。具体的実施態様において、例えば、AMDACは、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)により決定可能なOCT-4-である。別の実施態様において、AMDACは、フローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+である。また別の実施態様において、AMDACは、各々、RT-PCR及びフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-及びCD49f+である。更に別の実施態様において、AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+、CD105+、及びCD200+である。別の実施態様において、AMDACは、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-であり、並びに免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1(血管内皮増殖因子受容体1)及び／又はCD309(血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2)/KDRとしても公知)について陽性である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、フローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+及び／若しくはCD117-であり、並びに/又はRT-PCRにより決定可能なHLA-G-である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-及びHLA-G-であり、並びにフローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、上記AMDACのいくつかは加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-C モチーフ)受容体4)の1以上である。別の具体的実施態様において、上記AMDACのいくつかは加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。
別の具体的実施態様において、該AMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能なGFAP+である(例えば、下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、該AMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能なβ-チューブリンIII(Tuj1)+である(例えば、下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、該AMDACは、OCT-4-、GFAP+、及びβ-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、CD200+、CD105+、CD90+、及びCD73+である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、CD117-であり、且つCD117に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、CD146-であり、且つCD146に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、OCT-4-であり、且つRT-PCR及び／又は免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能なVEGFによる誘導後、CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能な神経原性である(例えば、下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、インビトロ軟骨形成能アッセイにより決定可能な非軟骨形成性である(例えば、下記5.12.3節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、骨形成性表現型アッセイにより決定可能な非骨形成性である(例えば、下記5.12.2節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、100nMデキサメタゾン、10mMβ-グリセロールリン酸、50μM L-アスコルビン酸-2-ホスフェートを補充した、pH7.4のDMEM(高グルコース)において最大6週間(例えば、2週間、4週間、又は6週間)培養された後、非骨形成性であり、ここで骨形成性は、von Kossa染色；アリザリンレッド染色を用いるか；又は、例えばRT-PCRにより、オステオポンチン、オステオカルシン、オステオネクチン、及び／又は骨シアロタンパク質の存在を検出することにより、評価される。
別の具体的実施態様において、任意の上記AMDACは加えて：(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)の1以上を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なような、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、又はVE-カドヘリンの1以上の発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能なような、SOX2の発現を欠き；(d)
Figure 2014507389
 の1以上のmRNAを発現し；(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9 タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を生成し；(f)血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターロイキン-8(IL-8)、単球走化性タンパク質-3(MCP-3)、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1の１以上を、AMDACが成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、又はmiR-296の１以上を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16の１以上を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及び／又はmiR-16を1以上発現し；或いは、(j)21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8又はVEGFの１以上を増加したレベルで発現する。より具体的実施態様において、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、並びに免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、CD117-、及びCD200+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、並びに免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つここで該AMDACは加えて：(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、及びVEGFR2/KDR(CD309)を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なような、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及びVE-カドヘリンの発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能なような、SOX2の発現を欠き；(d)RT-PCRにより決定可能な、
Figure 2014507389
 のmRNAを発現し；(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9 タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、及び／又はミオシン重鎖、非筋A型を生成し；(f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、及びガレクチン-1を、該細胞が成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及びmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を発現し；或いは、(j)21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8及び／又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8及び／又はVEGFを増加したレベルで発現する。
他の実施態様において、例えば、羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、且つ30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、例えば胚性癌腫由来幹細胞株(例えば、NTERA-2、例えばATCC寄託番号CRL-1973でアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手可能)などの適切な対照細胞株と比べ、OCT-4-である。具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+(血管内皮増殖因子受容体1)及び／又はVEGFR2/KDR+(血管内皮増殖因子受容体2、キナーゼ挿入ドメイン受容体としても公知)である。別の具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+(インテグリン-α6+)である。具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、OCT-4-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。
別の実施態様において、該OCT-4-細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD29+、CD73+、ABC-p+、及びCD38-の1以上である。
別の具体的実施態様において、該OCT-4-羊膜由来接着細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(アンジオテンシン-I-変換酵素、ACE)、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、CXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上である。より具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。別のより具体的実施態様において、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり；免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；且つ、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及び／又はTie-2-の1以上、又は全てである。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、OCT-4の、例えば、20〜30サイクルなど、20サイクルより多くのPCR-増幅されたmRNAを、同等数のNTERA-2細胞よりも、少なくとも2log少なく発現する。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-(CD144-)である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD105+及びCD200+について陽性である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば、1〜100ng/mL VEGF(血管内皮増殖因子)へ4〜21日間曝露した後、免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により検出されるように、CD34を発現しない。
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、且つRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-及びSOX-2-である。また別の実施態様において、該細胞は、フローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、及びCD117-である。具体的実施態様において、OCT-4-、SOX-2-羊膜由来接着細胞は加えて、フローサイトメトリーにより決定可能な、HLA-G-又はCD271-である。より具体的実施態様において、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-及びSOX-2-であり；且つ、フローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、CD117-、CD271-及びHLA-G-である。
任意の上記AMDACの別の実施態様において、及びこれに加えて、該細胞は、組織培養プラスチックに接着し、且つVEGFR2/KDR+(CD309)について陽性である。
本明細書に明らかにされた羊膜由来接着細胞は、別の実施態様において、組織培養プラスチックに接着し、例えば、20〜30サイクルなど、20サイクルよりも多いRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-の1以上である。具体的実施態様において、該細胞は、例えば、20〜30サイクルなど、20サイクルよりも多いRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、例えば、1〜100ng/mL VEGFへ4〜21日間曝露した後、免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により検出されるように、CD34を発現しない。
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、OCT-4-、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、又はCXCR4-の1以上である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。別の具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；且つ、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及び／又はTie-2+の1以上である。別の具体的実施態様において、該細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及びTie-2+である。
別の実施態様において、本明細書で明らかにされた羊膜由来接着細胞は、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、
Figure 2014507389
 の1以上のmRNAを発現しない。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、フローサイトメトリーにより決定可能なような、インバリアント鎖、HLA-DR-DP-DQ、CD6、又はCD271の1以上を構成的に発現せず、すなわち羊膜由来接着細胞は、一般に通常の非刺激条件下で、これらのマーカーを発現しない。
具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCR及び／又はテロメア反復配列増幅プロトコール(TRAP)アッセイにより測定されるように、テロメラーゼ-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCRにより測定されたように、NANOG-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、NANOGのmRNAを発現しない。具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、(性決定領域Y)-box2(SOX2)-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2のmRNAを発現しない。
羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞の集団が、本明細書において更に提供され、ここで該細胞集団は、本明細書に明らかにされた治療方法において治療効果がある。そのような細胞集団は、本明細書に明らかにされたマーカーの任意の組合せにより説明される、羊膜由来接着細胞のいずれかを含むことができる。具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、そのような羊膜由来接着細胞である。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％又はそれよりも多くは、OCT-4+ではない。
特定の実施態様において、本明細書に提供される治療方法は加えて、第二の細胞型を該個体へ投与することを含む。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞の単離された集団は加えて、第二の細胞型、例えば、幹細胞又は前駆細胞を含む。具体的実施態様において、本明細書に明らかにされたAMDACは、該集団中の細胞の少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％又は少なくとも98％を占める。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞及び第二の細胞型を含む細胞集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％又はそれ以上は、OCT-4+ではない。具体的実施態様において、第二の細胞型は、胎盤血、臍帯血、粗骨髄又は他の組織の中に含まれるか又はそれらから単離されている。より具体的実施態様において、該第二の細胞型は、胚性幹細胞、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞(例えば、臍帯マトリクス又はワルトン膠質由来の幹細胞)、骨髄由来の間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、造血幹細胞又は前駆細胞、例えば、CD34+細胞、体性幹細胞、脂肪幹細胞、誘導多能性幹細胞などである。別のより具体的実施態様において、該第二の細胞型は、該集団中の細胞の少なくとも 10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％を占める。
別の具体的実施態様において、上記AMDACのいずれか、又は第二の細胞型は、培養において増殖するか、又は増殖されている。別の具体的実施態様において、上記細胞のいずれかは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20回又はそれ以上継代されている、そのような細胞の培養物に由来している。別の具体的実施態様において、上記細胞のいずれかは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、若しくは少なくとも50回、又はそれ以上倍加されている、そのような細胞の培養物に由来している。
他の実施態様において、本明細書に明らかにされた治療方法は、組成物、例えば医薬組成物中で、罹患した個体へ、AMDACを投与することを含む。具体的実施態様において、該組成物は、マトリクス又はスキャフォールドであり、例えば、例として恒久性若しくは分解性の脱細胞化された組織マトリクス若しくはスキャフォールドなどの天然の組織マトリクス又はスキャフォールド；或いは、合成マトリクス又はスキャフォールドである。より具体的実施態様において、該マトリクス又はスキャフォールドは、ビーズ、チューブの形状又は他の三次元の形状に成形される。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、脱細胞化された組織マトリクスである。別の具体的実施態様において、該組成物は、生理的に許容し得る溶液、例えば食塩水、培養培地などの中に、本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞の1個以上を、又は羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団を含む。
本明細書に提供される治療方法の別の具体的実施態様において、該細胞は、注射により該個体へ投与される。別の具体的実施態様において、該細胞は、静脈内注入により該個体へ投与される。治療方法の別の具体的実施態様において、該細胞は、前述のような羊膜由来接着細胞を含む、マトリクス又はスキャフォールドの個体への埋め込みにより、該個体へ投与される。
本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞及び細胞集団は、例えば、米国特許第7,255,879号又は米国特許出願公開第2007/0275362号に説明された、単離された胎盤幹細胞又は細胞集団ではない。本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞はまた、内皮前駆細胞、羊膜上皮細胞、栄養芽細胞、栄養膜細胞層、胚性生殖細胞、胚性幹細胞、胚の内部細胞塊から得られる細胞、又は胚の生殖隆起から得られる細胞でもない。
本明細書で使用されるように、「約」という用語は、例えば、記述された数字又は値の10％以内を意味する。
本明細書で使用されるように、「幹細胞」という用語は、例えば、最大約40集団倍加まで、大規模に増殖することができるが、しかし必ずしも無限ではなく、且つ複数の細胞型に分化することができる、例えばインビトロにおいて分化することができる、いずれか所定の細胞集団の機能特性を定義している。
本明細書で使用されるように、「前駆細胞」という用語は、例えば、最大約40集団倍加まで、大規模に増殖することができるが、しかし必ずしも無限ではなく、且つ幹細胞のそれと比べ、一般により限定されている、細胞型の限定されたセットに分化することができる、例えば、インビトロにおいて、分化することができる、いずれか所定の細胞集団の機能特性を定義している。
本明細書で使用されるように、「由来した」という用語は、単離されているか、又は別の形で純化されていることを意味する。例えば、羊膜由来接着細胞は、羊膜から単離されている。「由来した」という用語は、組織、例えば、羊膜から直接単離された細胞から培養される細胞、及び初代単離株から培養又は拡大された細胞を包含する。
本明細書で使用されるように、「免疫局在化」は、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、磁気細胞選別、インサイチュハイブリダイゼーション、免疫組織化学などにおいて、免疫タンパク質、例えば、抗体又はその断片を用いる、化合物、例えば、細胞マーカーの検出を意味する。
本明細書で使用されるように、「単離された細胞」という用語は、該細胞が由来する組織、例えば羊膜の他の細胞から実質的に分離されている細胞を意味する。該幹細胞が天然に関連している細胞の少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも約99％が、例えば、該細胞の回収及び／又は培養時に、該細胞から取り除かれる場合、該細胞は「単離され」ている。
本明細書で使用されるように、「単離された細胞集団」という用語は、該細胞集団が由来する組織、例えば、羊膜又は胎盤の他の細胞から実質的に分離されている細胞の集団を意味する。該細胞集団、又は該細胞集団が由来する細胞が天然に関連している細胞の少なくとも約20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は少なくとも99％が、例えば、羊膜由来接着細胞の回収及び／又は培養時に、該細胞から取り除かれる場合、該細胞集団は「単離され」ている。
本明細書で使用されるように、細胞は、例えば、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより；又は、RT-PCRにより、特定のマーカーがバックグラウンドを上回り検出可能である場合、そのマーカーについて「陽性」である。例えば、CD105は、バックグラウンドよりも(例えばアイソタイプ対照と比べて)検出可能に多い量で細胞上で検出可能である場合、該細胞は、例えばCD105について陽性と説明される。例えば、抗体-媒介性検出の文脈において、特定の細胞表面マーカーが存在することの指標としての「陽性」は、該マーカーが、そのマーカーに対し特異的な抗体、例えば蛍光標識抗体を用い、検出可能であることを意味し；「陽性」はまた、細胞が、バックグラウンドを上回り検出可能である、例えば血球計測器においてシグナルを発生する量で、そのマーカーを有することも意味する。例えば、細胞が、CD105に特異的な抗体により検出可能に標識され、且つ該抗体からのシグナルが対照(例えば、バックグラウンド)よりも検出可能に高い場合に、該細胞は「CD105+」である。対照的に、同じ文脈で「陰性」とは、細胞表面マーカーが、該マーカーに特異的な抗体を用い、バックグラウンドと比べ、検出可能でないことを意味する。例えば、細胞が、CD34に特異的な抗体で検出可能に標識されない場合、該細胞は「CD34-」である。本明細書において別に注記しない限りは、分化抗原分類("CD")マーカーは、抗体を用いて検出される。例えば、OCT-4のmRNAが、例えば30サイクルのRT-PCRを用い検出可能である場合に、OCT-4は存在し、且つ細胞はOCT-4+であると決定することができる。
(4. 図面の簡単な説明)
図1は、羊膜由来接着細胞及びNTERA-2細胞による幹細胞-関連遺伝子の発現を示す。
図2は、羊膜由来接着細胞(AMDAC)の細胞表面上のTEM-7の発現を示す。
図3A-3Dは、羊膜由来接着細胞による選択された血管新生タンパク質の分泌を示す。図3A：組織メタロプロテアーゼ阻害因子-1(TIMP-1)、TIMP-2、トロンボポエチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、及びVEGF-Dの継代数6のAMDAC(n＝3)による分泌。図3B：アンギオゲニン、上皮細胞増殖因子(EGF)、上皮好中球-活性化ペプチド78(ENA-78)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、及び増殖-調節癌遺伝子α(GRO)の継代数6のAMDAC(n＝3)による分泌。図3C：インターフェロンガンマ(IFN-γ)、インスリン-様増殖因子-1(IGF-1)、インターロイキン-6(IL-6)、IL-8、及びレプチンの継代数6のAMDAC(n＝3)による分泌。図3D：単球走化性タンパク質-1(MCP-1)、血小板由来増殖因子(PDGF)-BB、胎盤増殖因子(PlGF)、ランテス、及びトランスフォーミング増殖因子-ベータ(TGF-β)の継代数6のAMDAC(n＝3)による分泌。
図4は、インビトロにおいて、T細胞増殖を阻害するAMDACの能力を明らかにしている。NHDF：新生児皮膚線維芽細胞。AMDAC、NHDFの左側のバー：AMDAC又はNHDFが存在しない場合と比較した、CD4+ T細胞抑制。AMDAC、NHDFの右側のバー：AMDAC又はNHDFが存在しない場合と比較した、CD8+ T細胞抑制。Y軸：AMDAC又はNHDFの非存在時のT細胞増殖と比較した、AMDAC又はNHDFが原因の抑制率。
図5は、AMDACによる馴化培地が、T細胞によるTNF-α産生の抑制を誘導することを明らかにしている。Y軸：AMDAC又はNHDFの非存在時のTNF-α産生と比較した、AMDAC又はNHDF存在下でのバルクT細胞によるTNF-α産生の抑制率。
図6は、Th1 T細胞のAMDACによる抑制を示す。Pan Tベース：AMDAC非存在下での、Th1 T細胞の割合。100K、75K、50K、25K：各々、AMDACの100,000、75,000、50,000、及び25,000個が存在する場合の、Th1 T細胞の割合。
図7は、Th17 T細胞のAMDACによる投与量依存的様式での抑制を示す。100K、80K、60K、40K：各々、AMDACの100,000、80,000、60,000、及び40,000個と共培養した後に残存するTh17 T細胞(AMDAC非存在)の割合。
図8は、AMDACによるFoxP3 Treg細胞の増加を示す。ベースライン：AMDACの非存在下での総T細胞中のFoxP3 Treg細胞の割合。100K、75K、50K、25K：各々、AMDACの100,000、75,000、50,000、及び25,000個の存在下での、FoxP3 Treg細胞の割合。
図9A-9Cは、CD86及びHLA-DR発現により評価した、DC集団のフローサイトメトリー結果を示す。全て：SSC：側方散乱光。細胞型：樹状細胞(DC)のみ、又はDC＋AMDAC。LPS＋IFN-γ：細菌性リポ多糖体及びインターフェロンγにより刺激した細胞(+)又は刺激していない細胞(-)。図9A：抗-CD86-フィコエリトリン(PE)により標識したDC。図9B：抗-HLA-DR-PerCP Cy5.5により標識したDC。図9C：抗-IL-12-PE(Y-軸)及び抗-CD11c-FITCにより標識したDC。
図10は、腫瘍壊死因子-アルファ(TNF-α)及びインターロイキン-12(細菌性リポ多糖体(LPS)-刺激した樹状細胞(DC)によるIL-12)の産生の抑制を示す。各条件に関して(IL-12又はTNF-α産生)、左列は、LPS及びインターフェロン-ガンマ(IFN-γ)存在下でのDCによるサイトカイン産生であり、右列は、LPS、IFN-γ、及びAMDACの存在下でのDCによるサイトカイン産生である。「□-」は、DCが、LPS又はIFN-γのいずれによっても刺激されなかった状態を示している。各条件の右側の数値は、各条件においてDCにより産生されたIL-12又はTNF-αのピコグラム数を示している。
図11は、ナチュラルキラー(NK)細胞増殖のAMDAC-媒介性抑制を示している。X軸：AMDACを含む(左側バー)又は含まない(右側バー)でのNK細胞前駆体の培養日数。Y軸：示された各培養日数でのNK細胞の数。
図12は、NK細胞の細胞傷害性のAMDAC抑制を示す。X軸：標的としてのNK細胞及びK562細胞(ヒト不死化骨髄性白血病細胞株)と共培養した1ウェル当たりのAMDACの数。Y軸：NK細胞傷害率(％)（1−試料中のK562細胞の総数÷NK細胞を含まない対照中のK562細胞の総数）×100として計算した。
(5. 詳細な説明)
(5.1 CNS損傷の治療方法)
羊膜由来接着細胞("AMDAC")の1以上の投与量を、CNS損傷を有する個体へ投与することを含む、CNSへの損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷を有する個体を治療する方法が、本明細書で提供される。そのような個体を治療する方法、及びAMDACを単独で又は他の療法と組合せて投与する方法が、以下に詳細に考察される。
(5.1.1 脊髄損傷(SCI)の治療)
治療有効量のAMDAC又はAMDACにより馴化された培地を個体へ投与することを含む、脊髄損傷(SCI)の症状又はこれに関連した病態若しくは症候群を有するか又は経験している個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、該脊髄損傷の1以上の症状の検出可能な改善、又は1以上の症状の進行の縮小を引き起こすのに十分な量である。本明細書において使用される「1以上の症状」は、治癒プロセスと相関している損傷部位内の炎症の程度、免疫反応、遺伝子発現、損傷部位での瘢痕化の質及び程度、患者の運動感覚機能の改善などの、客観的に測定可能なパラメータ、並びに、患者の幸福(well-being)、運動感覚機能の改善の患者の認知、SCIに関連した疼痛若しくは不快の軽減の認知などの、主観的に測定可能なパラメータを含む。
脊髄損傷は、その正常な運動機能、感覚機能、又は自律神経機能において、一時的又は恒久的のいずれかの変化を生じる脊髄への損傷である。SCIは、四肢麻痺(これまで四肢不全麻痺として知られている)及び対麻痺として公知の病態を含む。従って本明細書に提供されるSCIの治療の方法のいくつかの実施態様において、脊髄損傷の症状、又はこれに関連した病態若しくは症候群を有するか又は経験している個体は、四肢麻痺又は対麻痺である。
四肢麻痺は、脊柱管内の神経要素の損傷に起因した、脊髄の頸髄分節中の運動及び／若しくは感覚機能の障害又は喪失により特徴付けられる、頸部領域中の脊髄への損傷を指す。四肢麻痺は、腕に加え、胴体、脚及び骨盤器官の機能の障害を生じる。これは、上腕神経叢の病変又は神経腔の外側の末梢神経の損傷は含まない。
対麻痺は、脊柱管内の神経要素の損傷に続発する、脊髄の胸髄、腰髄又は仙髄(頸髄ではない)分節における運動及び／又は感覚機能の障害又は喪失を指す。対麻痺により、腕機能は温存される(spare)が、損傷のレベルに応じて、胴体、脚及び骨盤器官が関与し得る。この用語は、馬尾及び脊髄円錐の損傷を指すが、腰仙骨神経叢病変又は神経腔の外側の末梢神経の損傷は指さない。
SCIの一般的な原因は、自動車事故、落下、暴力、スポーツ損傷、血管障害、腫瘍、感染症病態、脊椎症、医原性(latrogenic)損傷(特に脊髄注射及び硬膜外カテーテル留置後)、骨粗鬆症に続発する脊椎骨折、及び発育障害を含むが、これらに限定されるものではない。
特定の実施態様において、脊髄損傷は、例えば、鈍器外傷、圧迫、位置ずれなどから生じ得る。特定の実施態様において、該脊髄は、完全に重症である。特定の他の実施態様において、該脊髄は、損傷され、例えば部分的に重症であるが、完全には重症ではない。他の実施態様において、該脊髄は、例えば、脊柱の骨構造への損傷、1以上の椎骨の他の椎骨に対する位置ずれ、炎症又は隣接組織の膨潤などにより、圧迫される。
一実施態様において、脊髄損傷は1以上の頸椎で起こる。別の実施態様において、脊髄損傷は1以上の胸椎で起こる。別の実施態様において、脊髄損傷は1以上の腰椎で起こる。別の実施態様において、脊髄損傷は1以上の仙椎で起こる。特定の実施態様において、脊髄損傷は、椎骨C1、C2、C3、C4、C5、C6若しくはC7；又は、椎骨T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11若しくはT12；又は、椎骨L1、L2、L3、L4若しくはL5で起こる。特定の他の実施態様において、脊髄損傷は、脊柱のC1からC2の間；C2からC3の間；C3からC4の間；C4からC5の間；C5からC6の間；C6からC7の間；C7からT1の間；T1からT2の間；T2からT3の間；T3からT4の間；T4からT5の間；T5からT6の間；T6からT7の間；T7からT8の間；T8からT9の間；T9からT10の間；T10からT11の間；T11からT12の間；T12からL1の間；L1からL2の間；L2からL3の間；L3からL4の間；又は、L4からL5の間に存在する脊髄根に起こる。特定の実施態様において、損傷は頸髄に起こる。他の実施態様において、損傷は胸髄に起こる。他の実施態様において、脊髄損傷は腰仙髄に起こる。特定の他の実施態様において、脊髄損傷は円錐に起こる。特定の他の実施態様において、CNS損傷は馬尾神経の1以上に起こる。別の実施態様において、脊髄損傷は後頭部に起こる。
特定の実施態様において、脊髄損傷の症状は、1以上の皮膚分節(すなわち、所定の脊髄レベルにより支配された皮膚の1区画)の無感覚である。具体的実施態様において、脊髄損傷の症状は、皮膚分節C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4、又はL5の1以上の無感覚である。
脊髄ショックは、全ての感覚運動機能の喪失に関連した、損傷レベルの下側の脊髄機能の一時的生理的(解剖学的よりもむしろ)反射低下の病態である。カテコールアミンの放出に起因した最初の血圧の上昇、それに続く低血圧症が注目される。腸管及び膀胱を含む弛緩麻痺が認められ、時には持続性プリアピズムが発症する。これらの症状は、損傷のレベルの下側の反射弓が再び機能し始めるまで(例えば、球海綿体反射、筋伸展反射[MSR])、数時間から数日間続く傾向がある。従って、本方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、感覚運動機能の一部又は全ての喪失、高血圧症、低血圧症、弛緩性麻痺(例えば腸管及び膀胱の)、並びに持続性プリアピズムを含む、SCIから生じる脊髄ショックの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
神経原性ショックは、低血圧症、徐脈、及び低体温症の三つ組みにより症状発現される。ショックは、T1-L2から及び無競争(unopposed)迷走神経緊張までの交感神経性アウトフローの破壊に続発して、T6の上側の損傷がより一般的に起こる傾向があり、これは随伴する血管拡張による血管抵抗の減少に繋がる。神経原性ショックは、頻拍を随伴する傾向がある脊髄ショック及び乏血性ショックとは区別される。従ってSCI治療方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、低血圧症、徐脈、低体温症、血管抵抗の減少、及び血管拡張を含む、SCIから生じる神経原性ショックの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
自律神経反射異常(AD)は、内臓交感神経性アウトフロー(T5-T6)の上側の、SCI患者において生じる大規模な不均衡な反射交感神経放電の症候群である。ADは、反射が回復する脊髄ショック相の後で起こる。主要な内臓アウトフローの上側が損傷した個体は、ADを発症し得る。この損傷の下側で、無傷の末梢感覚神経は、脊髄視床及び後柱中を登るインパルスを伝達し、脊髄の中間外側灰白質に位置する交感神経ニューロンを刺激する。大脳の血管運動中枢からのSCIの上側の阻害性アウトフロー(inhibitory outflow)は増加するが、これはSCIのブロックの下側を通過することはできない。この巨大な交感神経性アウトフローは、様々な神経伝達物質(ノルエピネフリン、ドパミン-b-水酸化酵素、ドパミン)の放出を引き起こし、立毛、皮膚蒼白、及び動脈血管系における重度の血管収縮を引き起こす。その結果、血圧の突然の上昇及び損傷レベルの上側の血管拡張が起こる。患者は通常、疼痛感受性頭蓋内血管の血管拡張により引き起こされた頭痛を有する。従ってSCI治療方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、立毛、皮膚蒼白、動脈血管系における重度の血管収縮、血圧上昇、及び損傷レベルの上側の血管拡張を含む、SCIから生じる自律神経反射異常の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
SCI治療方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIから生じる浮腫の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。本方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、直接外傷からの破壊により引き起こされたSCIの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。本方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、骨片による圧迫により引き起こされたSCIの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。本方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、椎間板物質の圧迫により引き起こされたSCIの1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
本明細書に提供されるSCI治療方法はまた、限定するものではないが、脊髄中心症候群、ブラウン・セカール症候群、脊髄前部症候群、脊髄円錐症候群、及び馬尾症候群を含む、SCIの他の分類の症状を、又は該分類に関連した病態若しくは症候群を有する又は経験している個体の治療を提供する。
脊髄中心症候群は、頸部領域の損傷に関連することが多く、且つ下肢よりも上肢のより大きい衰弱に繋がり、仙骨感覚温存を伴う。従ってSCI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、仙骨感覚温存を伴い、下肢よりも上肢におけるより大きい衰弱を含む、脊髄中心症候群の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
ブラウン・セカール症候群は、脊髄の半側切断病変に関連することが多く、痛覚及び温度覚の対側喪失を伴う、比較的大きい同側の固有覚喪失及び運動喪失を引き起こす。従ってSCI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、痛覚及び温度覚の対側喪失を伴う、同側の固有覚喪失及び運動喪失を含む、ブラウン・セカール症候群の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
脊髄前部症候群は、運動機能並びに痛覚及び温度覚の可変性の喪失を引き起こす病変に関連することが多く；固有覚は保存される。従ってSCI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、運動機能並びに痛覚及び温度覚の可変性の喪失を含む、脊髄前部症候群の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
脊髄円錐症候群は、仙髄及び腰神経根の損傷に関連し、反射消失した膀胱、腸管、及び下肢に繋がる一方で、仙髄分節は時には保存された反射を示すことがある(例えば、球海綿体反射及び排尿反射)。従ってSCI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、反射消失した膀胱、腸管、及び下肢を含む、脊髄円錐症候群の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
馬尾症候群は、脊柱管内の腰仙骨神経根の損傷に起因し、反射消失した膀胱、腸管、及び下肢に繋がる。従ってSCI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、反射消失した膀胱、腸管、及び下肢を含む、馬尾症候群の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。
特定の実施態様において、SCIの1以上の症状、病態又は症候群の改善、重症度の軽減、又は進行の縮小を検出する特定の技術は、本明細書に提供されるSCI治療方法においては重要ではない。特定の実施態様において、該SCIの1以上の症状、病態、又は症候群の改善又は進行の縮小の評価は、当該技術分野の実践者の判断に従い決定される。特定の実施態様において、該SCIの1以上の症状、病態、又は症候群の改善又は進行の縮小の評価は、対象の主観的経験と組合せて、当該技術分野の実践者の判断に従い決定される。
いくつかの実施態様において、該脊髄損傷の1以上の症状の改善、又は1以上の症状の進行の縮小は、「脊髄損傷の神経学的及び機能的分類に関する国際標準(International Standards for Neurological and Functional Classification of Spinal Cord Injury)」に従い検出される。「脊髄損傷の神経学的及び機能的分類に関する国際標準」は、米国脊髄損傷協会(ASIA)により公表され、これは神経学的機能の全身の運動及び感覚試験を基にした脊髄損傷のレベル及び程度を説明する広く受け入れられているシステムである。International Standards For Neurological Classification Of Spinal Cord Injury、J Spinal Cord Med. 26 Suppl 1:S50-6 (2003)を参照し、その開示が全体として参照により本明細書に組み入れられる。
特定の実施態様において、該脊髄損傷の1以上の症状の改善、又は1以上の症状の進行の縮小は、下記のカテゴリーを用いる、ASIA障害スケール(フランケル分類からの改変)に従い検出される：
A−完全：感覚又は運動機能が、仙髄分節S4-S5.4において残存しない。「完全」とは、最下位の仙髄分節に感覚及び運動機能が存在しないことをいう。
B−不全：神経学的レベルより下位に感覚機能は残存するが、運動機能は残存せず、仙髄分節S4-S5を通じて広がる。「不全」とは、最下位の仙髄分節を含む、損傷のレベルより下位の感覚又は運動機能の残存をいう。
C−不全：神経学的レベルより下位に運動機能は残存しているが、神経学的レベルより下位の主要筋群のほとんどが筋力3未満である。
D−不全：神経学的レベルより下位に運動機能は残存しているが、神経学的レベルより下位の主要筋群のほとんどが筋力3以上である。
E−正常：感覚及び運動機能は正常。
従って本明細書に提供されるSCI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、ASIA障害スケール(AIS)に従い障害の軽減を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、この低下は、障害の1、2、3、4又は5グレードの低下であり、ここで1グレードは、単一のカテゴリーの改善、例えばカテゴリーDからカテゴリーEへの障害の軽減に相当している。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、AISに従いASIA AからASIA B、ASIA C、ASIA D又はASIA Eへと個体分類を変換するのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、AISに従いASIA BからASIA C、ASIA D又はASIA Eへと個体分類を変換するのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、AISに従いASIA CからASIA D又はASIA Eへと個体分類を変換するのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、AISに従いASIA DからASIA Eへと個体分類を変換するのに十分な量である。
いくつかの実施態様において、該脊髄損傷の1以上の症状の改善、又は1以上の症状の進行の縮小は、患者の筋力を測定することにより検出される。いくつかの実施態様において、筋力は、下記の医学研究協議会(MRC)スケール0-5を用い等級化することができる：
5−正常筋力
4+−抵抗に対し最大を下回る動き
4−抵抗に対し適度な動き
4-−抵抗に対しわずかな動き
3−重力に対し動くが抵抗に対し動かない
2−重力を取り除いて動く
1−ぴくぴく動く(Flicker of movement)
0−動かず。
下記の主要筋群を、SCI患者において試験し、相当する損傷レベルを示した：
C5−肘屈筋群(上腕二頭筋)
C6−手首伸筋群(長橈側手根伸筋及び短指伸筋)
C7−肘伸筋群(三頭筋)
C8−中指までの指屈筋(深指屈筋)
T1−小指の外転筋(小指外転筋)
L2−股屈筋(腸腰筋)
L3−膝伸筋(大腿四頭筋)
L4−足背屈筋(前脛骨筋)
L5−長趾伸筋(長母指伸筋)
S1−足底屈筋(腓腹筋又はひらめ筋)。
従って本明細書に提供されるSCI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、MRCスケールに従い筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。例えばいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として動かない筋肉を、ぴくぴく動き、重力を取り除いて動く、重力に対し動くが抵抗に対し動かない、抵抗に対しわずかな動き、抵抗に対し適度な動き、抵抗に対し最大を下回る動き、又は正常筋力を有するようにするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果としてぴくぴく動くのみを有する筋肉を、重力を取り除いて動く、重力に対し動くが抵抗に対し動かない、抵抗に対しわずかな動き、抵抗に対し適度な動き、抵抗に対し最大を下回る動き、又は正常筋力を有するようにするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として重力を取り除いて動くのみを有する筋肉を、重力に対し動くが抵抗に対し動かない、抵抗に対しわずかな動き、抵抗に対し適度な動き、抵抗に対し最大を下回る動き、又は正常筋力を有するようにするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として重力に対し動くが抵抗に対し動かないのみを有する筋肉を、抵抗に対しわずかな動き、抵抗に対し適度な動き、抵抗に対し最大を下回る動き、又は正常筋力を有するようにするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として抵抗に対しわずかな動きのみの筋肉を、抵抗に対し適度な動き、抵抗に対し最大を下回る動き、又は正常筋力を有するようにするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として抵抗に対し適度な動きのみを有する筋肉を、抵抗に対し最大を下回る動き、又は正常筋力を有するようにするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として抵抗に対し最大を下回る動きのみを有する筋肉を、正常筋力を有するようにするのに十分な量である。
いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の二頭筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の上腕筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の長橈側手根伸筋又は短指伸筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の三頭筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の深指屈筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の小指外転筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の腸腰筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の大腿四頭筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の前脛骨筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の長母指伸筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の腓腹筋又はひらめ筋の筋力の1、2、3、4又は5ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。
いくつかの実施態様において、該脊髄損傷の1以上の症状の改善、又はその1以上の症状の進行の縮小が、知覚試験により検出される。知覚試験は、下記のレベルで実行することができる：
C2−後頭隆起
C3−鎖骨上窩
C4−肩鎖関節の表面
C5−肘前窩の側面
C6−母指
C7−中指
C8−小指
T1−肘前窩の内側
T2−腋窩の尖端
T3−第3肋間腔(IS)
T4−乳頭線の第4 IS
T5−第5 IS(T4とT6の中間)
T6−剣状突起レベルの第6 IS
T7−第7 IS (T6とT8の中間)
T8−第8 IS (T6とT10の中間)
T9−第9 IS (T8とT10の中間)
T10−第10 IS又は臍点
T11−第11 IS (T10とT12の中間)
T12−鼠径靱帯の中央
L1−T12とL2の間の距離の半分
L2−中前部大腿
L3−中央大腿顆
L4−中央踝
L5−第3中足指節関節での足背
S1−側方踵
S2−正中線膝窩
S3−坐骨結節
S4-5−肛門周囲領域(レベル1とみなす)。
知覚スコア化は、軽い接触及び針刺しに関するもので、下記である：
0−なし
1−正常ではないか又は知覚過敏
2−正常。
スコア0は、患者が、鋭い針と鈍い刃(dull edge)とを区別できない場合に、与えられる。従って本明細書に提供される治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4、L5、S1、S2、S3、S4及びS5の1以上に対応する知覚スコア化において1又は2ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。
いくつかの実施態様において、該脊髄損傷の1以上の症状の改善、又は1以上の症状の進行の縮小は、患者の日常生活の機能をモニタリングすることにより検出される。本明細書に提供されるSCI治療方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、患者の日常生活活動における機能改善に作用するのに十分な量である。いくつかの実施態様において、機能自立度評価尺度(Functional Independence Measure)(FIM)を使用し、患者の機能改善を評価する。FIMは、機能性の6つの領域に焦点を当てている：セルフケア、括約筋管理、移乗、移動、意思の疎通、及び社会的認知。合計18項目について、各領域内の、2以上の具体的活動/項目を評価する。例えば、6つの活動項目(食事、整容、入浴、上半身更衣、下半身更衣、及びトイレ動作)は、セルフケア領域を構成する。これら18項目の各々は、7ポイントスケールを使用し、機能の独立に関して評価する：
自立(介助は不要)：
7＝完全自立：活動は典型的には、修正(modification)、補装具又は補助を伴わず、且つ妥当な時間内で、安全に行われる。
6＝修正自立：活動は、補装具及び／又は妥当な時間より長い時間が必要で有り、及び／又は安全には行われない。
依存(監視又は身体介助が必要)：
5＝要監視又は準備：身体介助は不要であるが、合図、誘導又は準備が必要。
4＝最小接触介助：対象は、接触以上を必要とせず、活動に必要とされる労作の75％以上を自立。
3＝中等度介助：対象は、接触以上を必要とし、活動に必要とされる労作の50±75％を自立。
2＝最大介助：対象は、活動に必要とされる労作の25±50％を自立。
1＝全介助：対象は、活動に必要とされる労作の0±25％を自立。
従ってFIM総スコア(全ての項目にわたり合計)は、安全性の問題並びに他人及び技術装置への依存に関して、身体障害の代価を概算する。領域スコア及び項目スコアのプロファイルは、SCIにより最も影響を受ける日常生活の具体的局面を特定する。本明細書に提供されるSCI治療方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、FIMスケールに従い患者の機能性の1、2、3、4、5又は6ポイントの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として全介助を必要とする対象を、中等度介助のみ、最小の接触介助のみ、監視又は準備のみ、若しくは修正自立又は完全自立とするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として中等度介助を必要とする対象を、最小の接触介助のみ、監視又は準備のみ、若しくは修正自立又は完全自立とするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として最小の接触介助を必要とする対象を、監視又は準備のみ、若しくは修正自立又は完全自立とするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として監視又は準備を必要とする対象を、修正自立又は完全自立とするのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、SCIの結果として修正自立を有する対象を、完全自立とするのに十分な量である。
SCIの症状を有するか又は経験している個体は、損傷の進行時任意の時点で、複数のAMDAC、及び任意に1種以上の治療薬により治療することができる。例えば、該個体は、損傷の直後に、又は損傷の1、2、3、4、5、6日以内に、又は損傷の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、13、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50日以内若しくはそれ以降で、又は損傷後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年以内若しくはそれ以降で治療することができる。該個体は、損傷の臨床経過時に1回又は複数回治療することができる。本治療方法の具体的実施態様において、該AMDACは、脊髄損傷の1以上の症状の出現の21日以内に該個体に投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、脊髄損傷の1以上の症状の出現の14日以内に該個体に投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、脊髄損傷の1以上の症状の出現の7日以内に該個体に投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、脊髄損傷の1以上の症状の出現の48時間以内に該個体に投与される。別の具体的実施態様において、該AMDACは、脊髄損傷の1以上の症状の出現の24時間以内に該個体に投与される。別の具体的実施態様において、該AMDACは、脊髄損傷の1以上の症状の出現の12時間以内に該個体に投与される。別の具体的実施態様において、該AMDACは、脊髄損傷の1以上の症状の出現の3時間以内に該個体に投与される。
本発明の特定の実施態様において、該個体は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは非ヒト霊長類である。特定の実施態様において、該個体はヒト患者である。該個体は、雄又は雌対象であることができる。特定の実施態様において、該対象は、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット又はマウスなどの非ヒト動物である。
SCI治療に有用なAMDACは、本明細書に明らかにされたAMDACのいずれかであることができる。具体的実施態様において、AMDACはOCT-4-(OCT-4について陰性、POU5F1又はオクタマー結合タンパク質4としても公知)である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びVEGFR1/Flt-1+(血管内皮増殖因子受容体1)及び／又はVEGFR2/KDR+(血管内皮増殖因子受容体2、キナーゼ挿入ドメイン受容体としても公知)である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びCD49f+(インテグリン-α6+)である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びHLA-G-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びCD90+、CD105+、又はCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-であるが、SOX2を発現しない。別の具体的実施態様において、AMDACは、GFAP+である。別の具体的実施態様において、AMDACは、β-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、GFAP+、及びβ-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、OCT-4-、CD200+、CD105+、及びCD49f+である。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、CD200+、CD105+、CD90+、及びCD73+である。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、CD117-であり、且つCD117に対する抗体を用いて選択されない。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、CD146-であり、且つCD146に対する抗体を用いて選択されない。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、OCT-4-であり、且つVEGFによる誘導後CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能な神経原性である(例えば下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、インビトロ軟骨形成能アッセイにより決定可能な非軟骨形成性である(例えば下記5.12.3節参照)。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、骨形成性表現型アッセイにより決定可能な非-骨形成性である(例えば下記5.12.2節参照)。
具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、RT-PCR及び／又はTRAPアッセイにより測定されるように、テロメラーゼ-である。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、RT-PCRにより測定されるように、NANOG-である。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、NANOGのmRNAを発現しない。具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、(性決定領域Y)-box2(SOX2)-である。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、骨形成性表現型アッセイ(例えば下記5.12.2節参照)により測定されるように、骨形成性ではない。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、軟骨形成能アッセイ(例えば下記5.12.3節参照)により測定されるように、軟骨形成性ではない。別の具体的実施態様において、SCIの治療において有用であるAMDACは、骨形成性表現型アッセイ(例えば下記5.12.2節参照)により測定されるように、骨形成性ではなく、且つ軟骨形成能アッセイ(例えば下記5.12.3節参照)により測定されるように、軟骨形成性ではない。
一実施態様において、個体には、投与量約3億個のAMDACが投与される。しかし投与量は、個体の身体特徴、例えば体重により変動することができ、且つ1回の投薬につき100万個〜100億個のAMDAC、好ましくは1回の投薬につき1000万個〜10億個、又は1回の投薬につき1億個〜5億個のAMDACの範囲であることができる。投与は、好ましくは静脈内であるが、生存細胞の投与に関する医学的に許容し得る任意の経路、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、滑液嚢内、眼球内、硝子体内(例えば眼球の関与が存在する場合)、大脳内、脳室内(例えば神経又は脳の関与が存在する場合)、髄腔内、骨内注入、膀胱内、経真皮、槽内、硬膜外、又は皮下投与によることができる。具体的実施態様において、投与は、脊髄損傷部位への直接のボーラス注射又は注入により、例えば腰椎穿刺による。
一実施態様において、AMDACは、細胞バンク由来である。一実施態様において、AMDACの投与量は、ボーラス注射又はカテーテルによる投与に適した、血液バッグ又は類似のバッグ内に含まれる。
AMDAC又はAMDACにより馴化された培地は、単回投与量又は反復投与量で投与することができる。AMDACが反復投与量で投与される場合、これらの投与量は、SCIの1以上の急性症状を緩和するようにデザインされた治療レジメンの一部であることができるか、又はSCIの重症度を軽減するようにデザインされた長期治療レジメンの一部であることができる。
本明細書に提供されるSCIを治療する方法は、SCI治療の過程において使用される1以上の療法又は治療と一緒に、治療有効量のAMDACの投与によりSCIを治療することを更に包含している。これらの1以上の追加療法は、AMDACの投与前、投与時、又は投与後に使用することができる。いくつかの実施態様において、1以上の追加療法は、治療的脊椎牽引の適用を含む。治療的脊椎牽引は、手作業によるか又は機械的に発生させた力を使用し、脊柱の縦軸に沿って力を加え(通常重り)、脊椎を伸展し且つ動かす。首又は頸髄分節が骨折している場合、牽引は、脊柱をまっすぐにし、且つその圧迫を解く。
他の実施態様において、1以上の追加療法は、例えば脊柱を適切に並べ、又は椎骨を強化するための隣接椎骨を融合し、骨の再生を促進し、及び将来の更なる脊髄損傷の可能性を低下するための、ロッド及びスクリューの挿入による、脊椎の手術による安定化を含む。他の実施態様において、1以上の追加療法は、リハビリテーション(例えば、繰り返しの自発的運動トレーニング、筋力トレーニングなど)であり、これは新たな局所的CNS接合の形成を促進し得る。他の実施態様において、1以上の追加療法は、特定の神経又は筋肉の機能的電気刺激(FES)を含み、例えば、横隔神経のFESは、呼吸を補助し；仙骨神経根のFESは、膀胱及び腸管の機能を促進し；四肢筋肉のFESは、腕又は手の機能を改善することに加え、起立又は歩行を改善する。
該脊髄損傷の1以上の症状、病態、若しくは症候群の検出可能な改善、又は1以上の症状、病態、若しくは症候群の進行の縮小を引き起こすのに十分な複数のAMDAC及び1以上の治療薬を個体に投与することを含む、SCIの症状を有するか又は経験している個体の治療方法も、本明細書に提供される。一実施態様において、該治療薬はコルチコステロイドである。他の実施態様において、該治療薬は、ヘパリンなどの抗凝血薬である。他の実施態様において、該治療薬は、神経保護薬である。いくつかの実施態様において、該神経保護薬は、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム(MPSS)、GM-1(Sygen)、Gacylidine(GK-11)、甲状腺勅激ホルモン放出ホルモン、モノサイクリン(ミノサイクリン)、リチウム又はエリスロポエチン(EPO)である。
他の実施態様において、該治療薬は、Rhoアンタゴニスト、例えばCethrinr、イノシン、ロリプラム、ATI-355(NOGO)、コンドロイチナーゼ、ファムプリジン(fampridine)(4-アミノピリデイン)、又はガバペンチンである。別の実施態様において、該治療薬は、免疫調節薬又は免疫抑制薬、例えばシクロスポリンAである。他の実施態様において、該治療薬は、AMDACと共投与される第二の細胞集団である。いくつかの実施態様において、第二の細胞集団は、自己マクロファージ、骨髄間質細胞、鼻の嗅神経鞘細胞、胚性嗅神経皮層細胞、又はシュワン細胞の集団である。
(5.1.2 外傷性脳損傷(TBI)の治療)
また治療有効量のAMDAC又はAMDACにより馴化された培地を個体へ投与することを含む、外傷性脳損傷(TBI)の症状を有するか又は経験している個体を治療する方法が、本明細書に提供され、ここで該治療有効量は、該外傷性脳損傷の1以上の症状の検出可能な改善、又は1以上の症状の進行の縮小を引き起こすのに十分な量である。本明細書において使用される「1以上の症状」とは、治癒プロセスと相関している損傷部位内の炎症の程度、免疫反応、遺伝子発現、損傷部位での瘢痕化の質及び程度、患者の運動機能、感覚機能及び認知機能の改善などの、客観的に測定可能なパラメータ、並びに、患者の幸福、運動機能、感覚機能および認知機能の改善の患者の認知、TBIに関連した疼痛若しくは不快の軽減の認知などの、主観的に測定可能なパラメータを含む。
TBIは、頭蓋及び頭蓋内部へ加えられた外部の機械的力からの脳への非変性性で非先天性の傷害であり、意識の関連した低下した又は変更された状態を伴う、恐らく認知、身体的及び心理社会的な機能の永久又は一過性の障害に繋がるであろう。TBIは、脳震盪から昏睡及び死亡まで臨床上症状発現し得る。
TBI治療方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、原発性TBI、すなわち外傷の瞬間に起こる外傷性脳損傷の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、原発性TBIは、例えば頭蓋骨の骨折、裂傷、打撲傷、又は貫通性創傷などの、限局性損傷である。いくつかの実施態様において、原発性TBIは、びまん性、例えばびまん性軸索損傷である。
TBI治療方法のいくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、外傷の直後発生し且つある期間継続する作用を生じる、原発性TBIの結果生じる続発性損傷の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量である。TBIの続発型は、原発性損傷の作用由来の更なる細胞損傷が原因である。続発性損傷は、脳への最初の外傷後数時間又は数日間にわたり出現することがある。
本明細書に提供されるTBI治療方法はまた、脳に対し特定領域に負わせられたTBI損傷の治療も包含している。いくつかの実施態様において、本明細書に提供されるTBI治療方法は、前頭葉(前額部に位置する)、頭頂葉(頭部の背面及び頂上近傍に位置する)、後頭葉(頭部の背面、最も後方に位置する)、側頭葉(耳の上の頭部側面に位置する)、脳幹(脳内の深部に位置する)、又は小脳(頭蓋底に位置する)への損傷を治療するために有用である。
本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、様々な身体部分の単純な動作の喪失(麻痺)、コーヒーを入れるなど多段階の作業を完遂するために必要な複雑な動作の順序の計画の不能(順序付け)、他者との交流の自発性の喪失、思考の自由度の喪失、一つの考えの持続(固執)、作業への集中の不能(アテンディング(attending))、気分変動(情緒不安定)、社会的行動の変化、人格の変化、問題解決の困難、又は言語表現の不能(ブロカ失語症)を含む、前頭葉への損傷の1以上の症状の改善を引き起こすのに十分な量である。
本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、一度に2つ以上の対象への関心を払うことの不能、物体の名前を呼ぶことの不能(健忘性失語症)、筆記のために単語を探すことの不能(失書症)、読みの問題(失読症)、物体を描写することの困難、左右を識別することの困難、数学を行うことについての困難(計算力障害)、セルフケアの困難に繋がるある身体部分及び／又は周囲の空間の認識の欠如(失行症)、視覚的注意を集中することの不能、又は眼と手の協調の困難を含む、頭頂葉への損傷の1以上の症状の改善を引き起こすのに十分な量である。
本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、視力欠損(視野狭窄)、環境中に物体を配置することの困難、色を確定することの困難(色覚失認症)、幻覚の発生、錯視(物体の不正確な目視)、失読(単語を認識することの不能)、描画された物体を認識することの困難、物体の動きを認識することの不能(運動失認症)、又は読み書きの困難を含む、後頭葉への損傷の1以上の症状の改善を引き起こすのに十分な量である。
本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、顔の認識の困難(相貌失認)、話し言葉の理解困難(ウェルニッケ失語症)、対象が見たり聞いたりするものに対する選択的注意の混乱、物体の識別及び言語化の困難、短期記憶障害、長期記憶との干渉、性交渉への関心の増減、物体を類別することの不能(カテゴリー化)、執拗な会話(右葉損傷の指標)、又は攻撃的行動の増加を含む、側頭葉への損傷の1以上の症状の改善を引き起こすのに十分な量である。
本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、呼吸の肺活量の減少(会話に重要)、食品及び水の嚥下の困難(嚥下障害)、環境の組織化／認知の困難、平衡運動の問題、眩暈及び悪心(めまい)、又は睡眠困難(不眠症、睡眠時無呼吸)を含む、脳幹への損傷の1以上の症状の改善を引き起こすのに十分な量である。
本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、限定するものではないが、細かい動作の協調能の喪失、歩行能の喪失、物体に手を伸ばし掴むことの不能、振戦、眩暈(めまい)、不明瞭言語(断節言語)、又は素早い動作の不能を含む、頭蓋底への損傷の1以上の症状の改善を引き起こすのに十分な量である。
本明細書に提供されるTBI治療方法はまた、軽度から重度までの範囲に及ぶTBI損傷の治療も包含している。外傷性脳損傷(TBI)は、意識喪失及び／又は混乱及び見当識障害が30分間よりも短い場合に軽度と分類することができる。従っていくつかの実施態様において、本発明は、TBIに罹患した個体へのAMDACの有効量の投与を提供し、ここで該有効量は、例えば、限定するものではないが、頭痛、記憶障害、注意欠陥、気分動揺及び欲求不満、疲労、視力障害、記憶喪失、注意不足／集中力不足、睡眠障害、眩暈／平衡感覚障害、短気、情緒障害、意気消沈、発作、悪心、嗅覚喪失、光及び音への過敏、気分変動、迷い又は混乱、又は思考緩徐などの認識問題を含む、軽度TBIの1以上の症状の検出可能な改善、重症度の軽減、又は進行の縮小を引き起こすのに十分なAMDACの量である。
具体的実施態様において、該有効量は、脳震盪を治療するのに、例えば、限定するものではないが、混乱又は放心状態(feeling dazed)、不器用、不明瞭言語、悪心又は吐気、頭痛、平衡感覚障害又は眩暈、かすみ目、光への過敏、雑音への過敏、不活発、耳鳴り、行動又は人格の変化、集中困難、又は記憶喪失を含む、脳震盪の1以上の症状の検出可能な改善、重症度の軽減、又は進行の縮小を引き起こすのに十分なAMDACの量である。いくつかの実施態様において、脳震盪は、意識喪失のない、数分間未満続く脳震盪症状を特徴とする、グレード1(軽度)脳震盪である。いくつかの実施態様において、脳震盪は、意識喪失のない、及び15分間よりも長く続く脳震盪症状を特徴とする、グレード2(中等度)脳震盪である。いくつかの実施態様において、脳震盪は、少なくとも数秒間の意識喪失を特徴とする、グレード3(重度)脳震盪である。
いくつかの実施態様において、本発明は、TBIに罹患した個体へのAMDACの有効量の投与を提供し、ここで該有効量は、例えば、限定するものではないが、注意困難、集中困難、散漫性、記憶困難、処理速度の緩慢化、混乱、固執、衝動、言語処理の困難、発語及び言語の困難、話し言葉の理解不能(受容失語症)、会話及び理解の困難(表現性失語症)、不明瞭言語、非常に速い又は非常に遅い発語、難読症、難書症などの認知障害；触覚・温度・運動・四肢の位置・微細な識別の解釈の困難などの感覚障害；心理学的に意味のあるデータへの知覚印象の統合又はパターン化の困難などの、知覚障害；部分的又は完全な視力喪失、眼筋虚弱及び二重視力(複視)、かすみ目、距離判断の問題、眼球固視微動(眼振)、光への不耐(羞明)を含む、視覚障害；聴力低下又は喪失、耳鳴り(耳鳴)、音への敏感さの増大を含む、聴力障害；嗅覚喪失又は減退(嗅覚消失)を含む、嗅覚器官障害；味覚喪失又は減退；いくつかの型があり且つ意識、知覚認知、又は運動動作の破壊に関与するてんかんに関連した痙攣を含む、発作；身体麻痺／痙直を含む身体変化；慢性疼痛、腸及び膀胱の制御喪失、睡眠障害、体力低下、食欲の変化、体温調節不能、及び月経困難；依存行動、情動能喪失、意欲喪失、短気、攻撃性、抑鬱、脱抑制、又は認識の拒否／欠如を含む、社会的感情の困難を含む、中等度から重度のTBIの1以上の症状の検出可能な改善、重症度の軽減、又は進行の縮小を引き起こすのに十分なAMDACの量である。
一実施態様において、本発明は、TBIに罹患した個体へのAMDACの有効量の投与を提供し、ここで該有効量は、例えば、先に列記したTBIの1以上の症状の検出可能な改善、重症度の軽減、又は進行の縮小を引き起こすのに十分なAMDACの量である。特定の実施態様において、TBIの1以上の症状、病態又は症候群の改善、重症度の軽減、又は進行の縮小を検出する特定の技術は、本明細書に提供されるTBI治療方法においては重要ではない。特定の実施態様において、該SCIの1以上の症状の改善又は進行の縮小の評価は、当該技術分野の実践者の判断に従い決定される。特定の実施態様において、該TBIの1以上の症状の改善又は進行の縮小の評価は、対象の主観的経験と組合せて、当該技術分野の実践者の判断に従い決定される。
いくつかの実施態様において、該TBIの1以上の症状の改善、又は1以上の症状の進行の縮小は、グラスゴー・コーマ・スケール(GCS)に従い検出される。GCSは、下記のように、損傷の48時間以内のTBIの重症度を規定している：
開眼：
自発的に開眼＝4
呼びかけると開眼＝3
痛み刺激で開眼＝2
反応なし＝1
運動反応：
命令に従い動作＝6
痛みに対し局所的に動作＝5
痛みに対し引っ込める動作＝4
痛みに対し屈曲姿勢(除皮質姿勢)＝3
痛みに対し伸展姿勢(除脳姿勢)＝2
反応なし＝1
言語反応：
人物、場所、及び日時に対する見当識あり＝5
会話するが、見当識混乱＝4
不適切な単語の発語＝3
意味のない発声＝2
反応なし＝1。
GCSスコアに従うTBI重症度(48時間以内)は、下記である：
植物状態のTBI＝3未満(睡眠覚醒サイクル；覚醒するが、周囲と干渉せず；痛みに対し局所的反応なし：により特徴付けられる)
重度TBI＝3〜8(昏睡：意識不明状態；意味のない反応、自発的活動なし：により特徴付けられる)
中等度TBI＝9〜12(30分以上の意識喪失；消散する又はしない身体障害又は認識障害；リハビリテーションから恩恵を受ける患者：により特徴付けられる)
軽度TBI＝13〜15(精神状態の短い変化(混乱、見当識混乱又は記憶喪失)、又は30分未満の意識喪失：により特徴付けられる)。
従って本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、患者のGCSスコアの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12ポイント又はそれ以上の増大を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、GCSに従い、開眼に関して1、2、又は3ポイントの増大を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、GCSに従い、運動反応に関して1、2、3、4又は5ポイントの増大を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、GCSに従い、言語反応に関して1、2、3、又は4ポイントの増大を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、植物状態TBIに相当するレベルから、重度、中等度又は軽度TBIに相当するレベルへ、外傷性損傷の重症度を軽減するのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、重度TBIに相当するレベルから、中等度又は軽度TBIに相当するレベルへ、外傷性損傷の重症度を軽減するのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、中等度TBIに相当するレベルから、軽度TBIに相当するレベルへ、外傷性損傷の重症度を軽減するのに十分な量である。
いくつかの実施態様において、該TBIの1以上の症状の改善、又は1以上の症状の進行の縮小は、Ranchos Los Amigosスケールに従い検出される。Ranchos Los Amigosスケールは、下記のスケールで、認識、認知、行動及び周囲との相互作用のレベルを測定する：
レベルI：反応なし
レベルII：全身の反応
レベルIII：局所的反応
レベルIV：混乱し、興奮
レベルV：混乱し、不適切な反応
レベルVI：混乱しているが、適切な反応
レベルVII：無意識の適切な反応
レベルVIII：合目的の適切な反応。
従って本明細書に提供されるTBI治療方法の具体的実施態様において、AMDACの治療有効量は、Rancho Los Amigosスケールに従う患者のスコアの1、2、3、4、5、6又は7レベルの増加を引き起こすのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の認識、認知、行動及び周囲との相互作用を、反応なしのレベルから、全身の反応、局所的反応、混乱し興奮、混乱した不適切な反応、混乱しているが適切な反応、無意識の適切な反応、又は合目的の適切な反応のレベルまで上げるのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の認識、認知、行動及び周囲との相互作用を、全身の反応のレベルから、局所的反応、混乱し興奮、混乱した不適切な反応、混乱しているが適切な反応、無意識の適切な反応、又は合目的の適切な反応のレベルまで上げるのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の認識、認知、行動及び周囲との相互作用を、局所的反応のレベルから、混乱し興奮、混乱した不適切な反応、混乱しているが適切な反応、無意識の適切な反応、又は合目的の適切な反応のレベルまで上げるのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の認識、認知、行動及び周囲との相互作用を、混乱し興奮のレベルから、混乱した不適切な反応、混乱しているが適切な反応、無意識の適切な反応、又は合目的の適切な反応のレベルまで上げるのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の認識、認知、行動及び周囲との相互作用を、混乱した不適切な反応のレベルから、混乱しているが適切な反応、無意識の適切な反応、又は合目的の適切な反応のレベルまで上げるのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の認識、認知、行動及び周囲との相互作用を、混乱しているが適切な反応のレベルから、無意識の適切な反応、又は合目的の適切な反応のレベルまで上げるのに十分な量である。いくつかの実施態様において、AMDACの治療有効量は、対象の認識、認知、行動及び周囲との相互作用を、無意識の適切な反応のレベルから、合目的の適切な反応のレベルまで上げるのに十分な量である。
TBIの症状を有するか又は経験している個体は、該損傷の進行の任意の時点で、複数のAMDAC、及び任意に1種以上の治療薬により治療することができる。例えば、該個体は、損傷の直後に、又は損傷の1、2、3、4、5、6日以内に、又は損傷の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50日以内若しくはそれ以降、又は損傷後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10年以内若しくはそれ以降に治療することができる。該個体は、損傷の臨床経過時に1回又は複数回治療することができる。本治療方法の具体的実施態様において、該AMDACは、外傷性脳損傷の1以上の症状の出現の21日以内に該個体に投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、外傷性脳損傷の1以上の症状の出現の14日以内に該個体に投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、外傷性脳損傷の1以上の症状の出現の7日以内に該個体に投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、外傷性脳損傷の1以上の症状の出現の48時間以内に該個体に投与される。別の具体的実施態様において、該AMDACは、外傷性脳損傷の1以上の症状の出現の24時間以内に該個体に投与される。別の具体的実施態様において、該AMDACは、外傷性脳損傷の1以上の症状の出現の12時間以内に該個体に投与される。別の具体的実施態様において、該AMDACは、外傷性脳損傷の1以上の症状の出現の3時間以内に該個体に投与される。
本発明の特定の実施態様において、該個体は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは非ヒト霊長類である。特定の実施態様において、該個体はヒト患者である。該個体は、雄又は雌対象であることができる。特定の実施態様において、該対象は、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット又はマウスなどの非ヒト動物である。
TBI治療に有用なAMDACは、本明細書に明らかにされたAMDACのいずれかであることができる。具体的実施態様において、AMDACはOCT-4-(OCT-4について陰性、POU5F1又はオクタマー結合タンパク質4としても公知)である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びVEGFR1/Flt-1+(血管内皮増殖因子受容体1)及び／又はVEGFR2/KDR+(血管内皮増殖因子受容体2、キナーゼ挿入ドメイン受容体としても公知)である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びCD49f+(インテグリン-α6+)である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びHLA-G-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-及びCD90+、CD105+、又はCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-であるが、SOX2を発現しない。別の具体的実施態様において、AMDACは、GFAP+である。別の具体的実施態様において、AMDACは、β-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、GFAP+、及びβ-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、OCT-4-、CD200+、CD105+、及びCD49f+である。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、CD200+、CD105+、CD90+、及びCD73+である。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、CD117-であり、且つCD117に対する抗体を用いて選択されない。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、CD146-であり、且つCD146に対する抗体を用いて選択されない。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、OCT-4-であり、且つVEGFによる誘導後CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能な神経原性である(例えば下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、インビトロ軟骨形成能アッセイにより決定可能な非軟骨形成性である(例えば下記5.12.3節参照)。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、骨形成性表現型アッセイにより決定可能な非-骨形成性である(例えば下記5.12.2節参照)。
具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、RT-PCR及び／又はTRAPアッセイにより測定されるように、テロメラーゼ-である。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、RT-PCRにより測定されるように、NANOG-である。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、NANOGのmRNAを発現しない。具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、(性決定領域Y)-box2(SOX2)-である。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、骨形成性表現型アッセイ(例えば下記5.12.2節参照)により測定されるように、骨形成性ではない。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、軟骨形成能アッセイ(例えば下記5.12.3節参照)により測定されるように、軟骨形成性ではない。別の具体的実施態様において、TBIの治療において有用であるAMDACは、骨形成性表現型アッセイ(例えば下記5.12.2節参照)により測定されるように、骨形成性ではなく、且つ軟骨形成能アッセイ(例えば下記5.12.3節参照)により測定されるように、軟骨形成性ではない。
一実施態様において、個体には、投与量約3億個のAMDACが投与される。しかし投与量は、個体の身体特徴、例えば体重により変動することができ、且つ1回の投薬につき100万個〜100億個のAMDAC、好ましくは1回の投薬につき1000万個〜10億個、又は1回の投薬につき1億個〜5億個のAMDACの範囲であることができる。投与は、好ましくは静脈内であるが、生存細胞の投与に関する医学的に許容し得る任意の経路、例えば静脈内、動脈内、腹腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、滑液嚢内、眼球内、硝子体内(例えば眼球の関与が存在する場合)、大脳内、脳室内(例えば神経又は脳の関与が存在する場合)、髄腔内、骨内注入、膀胱内、経真皮、槽内、硬膜外、又は皮下投与によることができる。具体的実施態様において、投与は、外傷性脳損傷部位への直接のボーラス注射又は注入により、例えば大槽を介してである。
AMDAC又はAMDACにより馴化された培地は、単回投与量又は反復投与量で投与することができる。AMDACが反復投与量で投与される場合、これらの投与量は、TBIの1以上の急性症状を緩和するようにデザインされた治療レジメンの一部であることができるか、又はTBIの重症度を軽減するようにデザインされた長期治療レジメンの一部であることができる。
本明細書に提供されるTBIを治療する方法は、TBI治療の過程において使用される1以上の療法又は治療と一緒に、治療有効量のAMDACの投与によりTBIを治療することを更に包含している。これらの1以上の追加療法は、AMDACの投与前、投与時、又は投与後に使用することができる。いくつかの実施態様において、1以上の追加療法は、外科的治療を含む。いくつかの実施態様において、ボルト又はICP(頭蓋内圧)モニタリング装置を、頭蓋内に配置し、脳室(brain cavity)内の圧力をモニタリングすることができる。いくつかの実施態様において、頭蓋腔(skull cavity)内に出血が存在する場合、これは外科的に除去するか又は排出することができ、且つAMDACの投与前、投与時又は投与後に、出血している血管又は組織を外科的に修復してよい。重篤な症例において、過度な膨潤及び損傷した脳組織が存在する場合、AMDACの投与前、投与時又は投与後に、一部は外科的に除去し、生存脳組織のための空間(room)を形成することができる。いくつかの実施態様において、1以上の追加療法は、呼吸を支援し且つ頭部の圧力低下を維持することを補助する人工呼吸器の使用を含む。
該外傷性脳損傷の1以上の症状の検出可能な改善、又は1以上の症状の進行の縮小を引き起こすのに十分な複数のAMDAC及び1以上の治療薬を個体に投与することを含む、TBIの症状を有するか又は経験している個体の治療方法も、本明細書に提供される。例えば、AMDACは、興奮及び続発性損傷を最小化するために、対象を鎮静し薬剤誘発性昏睡とする医薬品と組合せて投与することができる。いくつかの実施態様において、発作予防薬を、治療過程の早期に且つ個体が発作を起こした場合はその後に投与することができる。いくつかの実施態様において、痙性を管理するための医薬品は、患者が機能を回復するので使用することができる。加えて、医薬品を使用し、注意及び集中を改善するか(例えば、アマンタジン及びメチルフェニデート、ブロモクリプチン及び抗欝薬)、又は攻撃的行動を制御することができる(例えば、カルバマゼピン及びアミトリプチリン)。
具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、非虚血性事象により生じるか、又はこれが原因である。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、血腫ではないか、又は血腫から生じない。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、頭蓋への外部の力により生じた血腫ではない。別の具体的実施態様において、本明細書記載の方法に従い治療されるTBIは、TBIに罹患した個体の脳内又は脳周辺の血流の途絶により引き起こされない。
(5.2 CNS損傷により引き起こされた又は関連した炎症反応を抑制するための羊膜由来接着細胞の使用)
別の態様において、CNS損傷により引き起こされた又は関連した炎症反応を抑制することを含む、CNS損傷を有する個体を治療する方法が、本明細書に提供される。免疫細胞を複数の本明細書記載の羊膜由来接着細胞(AMDAC)と接触させることにより、1個の免疫細胞又は複数の免疫細胞の活性、例えば増殖を調節する、例えば抑制する方法が、本明細書に提供される。羊膜由来接着細胞-媒介性免疫調節、例えば免疫抑制は、例えば、炎症がCNS損傷の初期及び慢性期いずれか又は両方において役割を果たすCNS損傷に有利であろう。
一実施態様において、複数の個体の免疫細胞を複数の羊膜由来接着細胞と、該羊膜由来接着細胞が該免疫反応を検出可能に抑制するのに十分な時間接触させることを含む、個体へのCNS損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷により引き起こされた又は関連した個体における免疫反応を抑制する方法が、本明細書に提供され、ここで該羊膜由来接着細胞は、例えば、混合リンパ球反応(MLR)アッセイ又は退行(regression)アッセイにおいてT細胞増殖を検出可能に抑制する。
羊膜由来接着細胞は、例えば本明細書において別所に記載された羊膜由来接着細胞である(5.4節参照)。免疫抑制に使用される羊膜由来接着細胞は、単独の胎盤の羊膜又は複数の胎盤の羊膜に由来するか又はそれらから入手することができる。免疫抑制に使用される羊膜由来接着細胞はまた、単独の種、例えば意図されたレシピエントの種又はその機能が低下又は抑制される免疫細胞の種に由来することができるか、或いは複数の種に由来することができる。
本方法及び本明細書に明らかにされた方法の文脈での「免疫細胞」は、免疫系の任意の細胞、特にT細胞及びナチュラルキラー(NK)細胞を意味する。従って本方法の様々な実施態様において、羊膜由来接着細胞は、複数の免疫細胞と接触され、ここで該複数の免疫細胞は、複数のT細胞(例えば、複数のCD3+ T細胞、CD4+ T細胞及び／若しくはCD8+ T細胞)並びに／又はナチュラルキラー細胞であるか又はこれらを含む。本方法の文脈での「免疫反応」は、免疫細胞により正常に認識される刺激に対する免疫細胞による任意の反応、例えば抗原の存在に対する反応であることができる。様々な実施態様において、免疫反応は、CNS損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷に対する反応におけるT細胞(例えば、CD3+T細胞、CD4+T細胞及び／又はCD8+T細胞)の増殖であることができる。免疫反応はまた、NK細胞の任意の活性、樹状細胞の成熟などであることができる。免疫反応はまた、免疫細胞の1以上のクラスの活性の局所的、組織-若しくは臓器-特異的、又は全身作用であることができ、例えば免疫反応は、炎症、炎症-関連瘢痕組織の形成などであることができる。
本文脈において「接触させる」は、羊膜由来接着細胞と免疫細胞を、1つの容器(例えば、培養皿、フラスコ、バイアルなど)又はインビボにおいて、例えば同じ個体(例えば哺乳動物、例えばヒト)において一緒にさせることを包含している。好ましい実施態様において、接触させるのは、免疫細胞の免疫機能の変化が検出可能であるのに十分な時間、及び羊膜由来接着細胞と免疫細胞の十分な数である。より好ましくは様々な実施態様において、該接触は、免疫機能(例えば、抗原に反応したT細胞増殖)を、羊膜由来接着細胞非存在下での免疫機能と比べ、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％又は95％抑制するのに十分なものである。インビボ状況におけるそのような抑制は、インビトロアッセイ(下記参照)により決定することができ；すなわち、インビトロアッセイにおける抑制の程度は、レシピエント個体内の特定数の羊膜由来接着細胞及び多くの免疫細胞について該個体における抑制の程度に外挿することができる。
特定の実施態様において、インビトロにおける複数の免疫細胞の1以上の型の免疫反応、又は活性を調節するための羊膜由来接着細胞の使用方法が、本明細書に提供される。羊膜由来接着細胞と複数の免疫細胞を接触させることは、複数の羊膜由来接着細胞の少なくとも一部が、複数の免疫細胞の少なくとも一部と相互作用するように、羊膜由来接着細胞と免疫細胞を同じ物理的空間内で一緒にすること；共通培地の入った個別の物理的空間に羊膜由来接着細胞と免疫細胞を維持することを含むか；又は、羊膜由来接着細胞又は免疫細胞の1つ又は培養物由来の培地を、他の細胞型と接触させることを含むことができる(例えば、羊膜由来接着細胞の培養物から培養培地を入手し、且つ該培地中に単離された免疫細胞を再懸濁する)。具体例において、接触は、混合リンパ球反応(MLR)において行われる。別の具体例において、接触は、退行アッセイ又はビートT細胞反応(beat T cell reaction)(BTR)アッセイにおいて行われる。
そのような接触は、例えば、特定の複数の羊膜由来接着細胞が免疫調節性、例えば免疫抑制性である程度を決定するためにデザインされた実験的設定で行うことができる。そのような実験的設定は、例えば混合リンパ球反応(MLR)又は退行アッセイであることができる。MLR及び退行アッセイを行う手順は、当該技術分野において周知である。例えばSchwarzの文献、「混合リンパ球反応：寛容に関するインビトロ試験(The Mixed Lymphocyte Reaction : An In Vitro Test for Tolerance)」、J. Exp. Med. 127(5):879-890 (1968)；Lacerdaらの文献、「異種移植したC.B-17 Scid/Scidマウスにおける自家EBV-誘導したBリンパ液増殖へ優先的に回復し、かつそれへの選択的回帰を誘導したヒトエプスタイン・バーウイルス(EBV)-特異的細胞傷害性Tリンパ球(Human Epstein Barr Virus (EBV)-Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted C.B-17 Scid/Scid Mice)」、J. Exp. Med. 183:1215-1228 (1996)を参照されたい。好ましい実施態様において、多数の羊膜由来接着細胞が複数の免疫細胞(例えばリンパ球、例えばCD3+、CD4+及び／又はCD8+ Tリンパ球)と接触されるMLRが実行される。
MLRを使用し、複数の羊膜由来接着細胞の免疫抑制能力を決定することができる。例えば複数の羊膜由来接着細胞は、CD4+又はCD8+T細胞、樹状細胞(DC)及び羊膜由来接着細胞を比約10：1：2で一緒にすることを含む、MLRにおいて試験することができ、ここでT細胞は、例えば娘細胞へ分配されるCFSEなどの色素で染色され、且つここでT細胞は約6日間増殖させることができる。羊膜由来接着細胞の存在下での6日目のT細胞増殖が、DC存在下且つ羊膜由来接着細胞非存在下でのT細胞増殖と比べ、検出可能に低下する場合に、複数の羊膜由来接着細胞は、免疫抑制性である。そのようなMLRにおいて、羊膜由来接着細胞は、解凍されるか又は培養物から収集されるかのいずれかである。羊膜由来接着細胞約20,000個を、培地(RPMI1640、1mM HEPES緩衝液、抗生物質、及び5％プールしたヒト血清)100μL中に再懸濁し、且つ2時間ウェルの底へ接着させる。CD4+及び／又はCD8+T細胞は、全末梢血単核細胞Miltenyi磁気ビーズから単離される。これらの細胞を、CFSE染色し、且つ全部で100,000個のT細胞(CD4+T細胞のみ、CD8+T細胞のみ、又は等量のCD4+及びCD8+T細胞)を、各ウェルに添加する。ウェルの容積は200μLとし、且つMLRを進行させる。
従って一実施態様において、複数の免疫細胞を複数の羊膜由来接着細胞と、該羊膜由来接着細胞が混合リンパ球反応(MLR)アッセイ又は退行アッセイにおいてT細胞増殖を検出可能に抑制するのに十分な時間、接触させることを含む、免疫反応を抑制する方法が、本明細書に提供される。一実施態様において、MLRにおいて使用した該羊膜由来接着細胞は、羊膜由来接着細胞の多きい集団からの羊膜由来接着細胞の試料又はアリコートを表す。
異なる胎盤、又は同じ胎盤内の異なる組織から得られた羊膜由来接着細胞の集団は、免疫細胞の活性を調節するそれらの能力が異なり、例えばT細胞活性若しくは増殖又はNK細胞活性を抑制する能力が異なり得る。従って使用前に、免疫抑制に関する羊膜由来接着細胞の特定の集団の能力を決定することが望ましい。そのような能力は、例えば、MLR又は退行アッセイにおいて羊膜由来接着細胞集団の試料を試験することにより、決定することができる。一実施態様において、試料でMLRが実行され、且つ羊膜由来接着細胞が原因となる該アッセイにおける免疫抑制の程度が決定される。この免疫抑制の程度は次に、試料採取される羊膜由来接着細胞集団に帰することができる。従ってMLRを、特定集団の羊膜由来接着細胞の免疫機能を抑制する絶対能力及び相対能力を決定する方法として使用することができる。MLRのパラメータは、より多くのデータを提供するために、又は羊膜由来接着細胞試料の免疫抑制能力を最良に決定するために変動することができる。例えば、羊膜由来接着細胞による免疫抑制は、該アッセイ中に存在する羊膜由来接着細胞の数におおまかに比例して増加するように見えるので、MLRは、一実施態様において2つ以上の羊膜由来接着細胞の数、例えば1反応につき1×103、3×103、1×104及び／又は3×104個の羊膜由来接着細胞で行うことができる。また該アッセイ中のT細胞数に対する羊膜由来接着細胞数は、変動することができる。例えば、比較的多数の羊膜由来接着細胞又はT細胞の使用にも拘わらず、該アッセイ中の羊膜由来接着細胞及びT細胞は、例えば約100：1〜約1：100、好ましくは約1：5の比で存在することができる。
退行アッセイ又はBTRアッセイは、類似の様式で使用することができる。
従って、インビボにおける複数の免疫細胞の1以上の型の免疫反応、又は活性、例えばCNS損傷（例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷）により引き起こされた又は関連した免疫反応を調節するための羊膜由来接着細胞の使用方法が、本明細書で提供される。羊膜由来接着細胞と免疫細胞は、例えば複数の羊膜由来接着細胞のレシピエントである個体において、接触させられる。接触が個体において行われる場合、一実施態様において、この接触は、外因性羊膜由来接着細胞(すなわち、該個体由来又は該個体に関連した羊膜由来ではない羊膜由来接着細胞)と該個体に対して内因性の複数の免疫細胞の間である。具体的実施態様において、個体内の免疫細胞は、CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、及び／又はNK細胞である。
本羊膜由来接着細胞は、個体において公知の又は予想される免疫細胞、例えばT細胞の数に関して、約10：1〜約1：10、好ましくは約1：5の比で、個体へ投与することができる。しかし複数の羊膜由来接着細胞を、非限定的例で約10,000：1、約1,000：1、約100：1、約10：1、約1：1、約1：10、約1：100、約1：1,000又は約1：10,000の比で、個体へ投与することができる。一般に、レシピエント1kg当たり約1×105〜約1×108個の羊膜由来接着細胞、好ましくはレシピエント1kg当たり約1×106〜約1×107個の羊膜由来接着細胞を、免疫抑制をもたらすために投与することができる。様々な実施態様において、個体又は対象へ投与される複数の羊膜由来接着細胞は、少なくとも、約、又は多くとも1×105、3×105、1×106、3×106、1×107、3×107、1×108、3×108、1×109、3×109個の羊膜由来接着細胞、又はそれ以上を含む。
本羊膜由来接着細胞はまた、1以上の第二の幹細胞型、例えば骨髄由来の間葉系幹細胞と共に投与することができる。そのような第二の幹細胞は、羊膜由来接着細胞と、例えば約1：10〜約10：1の比で、個体へ投与することができる。
インビボにおける羊膜由来接着細胞と免疫細胞の接触又は隣接を促進するために、羊膜由来接着細胞を、羊膜由来接着細胞と免疫細胞を互いに接触させるのに十分な任意の経路により、個体に投与することができる。例えば、羊膜由来接着細胞は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、眼球内、非経口、髄腔内、又は直接臓器へ、例えば膵臓へにより、個体へ投与することができる。インビボ投与に関して、羊膜由来接着細胞は、下記5.8.1節に説明したように、医薬組成物として製剤することができる。
この免疫抑制の方法は加えて、特にインビボ状況において、1以上の免疫抑制薬の添加を含むことができる。一実施態様において、複数の羊膜由来接着細胞を、個体中インビボにおいて複数の免疫細胞と接触させ、且つ免疫抑制薬を含有する組成物を該個体へ投与する。免疫抑制薬は、当該技術分野において周知であり、且つ例えば抗-T細胞受容体抗体(モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体、又はそれらの抗体断片若しくは誘導体)、抗-IL-2受容体抗体(例えば、バシリキシマブ(SIMULECT(登録商標))又はダクリツマブ(ZENAPAX)(登録商標))、抗T細胞受容体抗体(例えば、Muromonab-CD3)、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シロリムス、カルシニューリン阻害剤などを含む。具体的実施態様において、免疫抑制薬は、マクロファージ炎症タンパク質(MIP)-1α又はMIP-1βに対する中和抗体である。好ましくは抗-MIP-1α又はMIP-1β抗体は、該個体におけるMIP-1α及び／又はMIP-1βの量の検出可能な減少を引き起こすのに十分な量で投与される。
羊膜由来接着細胞は、T細胞増殖の抑制に加え、CNS損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷の治療において有益であり得る、免疫系細胞に対する他の抗炎症作用を有する。例えば、羊膜由来接着細胞は、例えばインビトロ又はインビボ、個体へ投与される場合のように、Th1及び／又はTh17 T細胞サブセットにより媒介された免疫反応を低下する。別の態様において、T細胞(例えば、CD4+ Tリンパ球又は白血球)を羊膜由来接着細胞、すなわち本明細書記載の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて、例えばTh1反応又はTh17反応などの、前炎症反応を阻害する方法が、本明細書に提供される。具体的実施態様において、該接触は、Th1細胞成熟を検出可能に低下する。本方法の具体的実施態様において、該接触は、該T細胞によるか又は抗原提示細胞(antigen-producing cell)による、リンホトキシン-1α(LT-1α)、インターロイキン-1β(IL-1β)、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、腫瘍壊死因子アルファ(TNFα)及び／又はインターフェロンガンマ(IFNγ)の1以上の生成を検出可能に減少する。本方法の別の具体的実施態様において、該接触は、制御性T細胞(Treg)表現型を強化又はアップレギュレートし、並びに／又はTh1及び／若しくはTh17反応を促進する生体分子(例えば、CD80、CD83、CD86、ICAM-1、HLA-II)の樹状細胞(DC)及び／若しくはマクロファージにおける発現を低下する。具体的実施態様において、該T細胞はまた、IL-10、例えば外因性IL-10、又は該T細胞により生成されないIL-10、例えば組換えIL-10と接触される。
別の実施態様において、マクロファージを、有効量の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、マクロファージからの前炎症サイトカインの生成を減少する方法が、本明細書に提供される。別の実施態様において、免疫系細胞を、有効量の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、寛容原性細胞の数を増加し、免疫細胞の寛容原性機能を促進し、及び／又は例えばマクロファージ由来の寛容原性サイトカインをアップレギュレートする方法が、本明細書に提供される。具体的実施態様において、該接触は、活性化されたマクロファージが、該羊膜由来接着細胞と接触せずに活性化されたマクロファージよりも、より多くのIL-10を検出可能に生成することを引き起こす。別の実施態様において、免疫系細胞を、有効量の羊膜由来接着細胞と接触させることを含む、抗炎症性T細胞の数をアップレギュレートするか、又は増加する方法が、本明細書に提供される。
一実施態様において、羊膜由来接着細胞の有効量を個体へ投与することを含む、CNS損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷の症状を有するか又は経験している個体において、Th1反応を阻害する方法が、本明細書に提供され、ここで該有効量は、該個体においてTh1反応の検出可能な減少を生じる量である。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の有効量を個体へ投与することを含む、CNS損傷、例えば脊髄損傷又は外傷性脳損傷の症状を有するか又は経験している個体において、Th17反応を阻害する方法が、本明細書に提供され、ここで該有効量は、該個体においてTh17反応の検出可能な減少を生じる量である。これらの方法の具体的実施態様において、該投与は、該個体内のT細胞又は抗原提示細胞により、IL-1β、IL-12、IL-17、IL-21、IL-23、TNFα及び／又はIFNγの1以上の生成を検出可能に減少する。本方法の別の具体的実施態様において、該接触は、制御性T細胞(Treg)表現型を増強又はアップレギュレートするか、又はTh1若しくはTh17反応を促進するマーカーの該個体の樹状細胞(DC)及び／若しくはマクロファージにおける生成を調節する。別の具体的実施態様において、本方法は、加えてIL-10を該個体へ投与することを含む。
別の態様において、1以上の抗炎症サイトカインを発現するように遺伝子操作された本明細書に記載の羊膜由来接着細胞が、本明細書に提供される。具体的実施態様において、該抗炎症サイトカインは、IL-10を含む。
(5.3 羊膜由来接着細胞)
一般に、羊膜由来接着細胞は、外見が線維芽細胞又は間葉系細胞に一見似ており、全般的に線維芽細胞様の形状を有する。そのような細胞は、細胞培養表面、例えば組織培養プラスチックに接着する。本明細書に開示されたAMDACのいずれか特定の実施態様において、該細胞はヒト細胞である。
本明細書に提供されるAMDACは、それらを他の羊膜由来の細胞、又は胎盤由来の細胞から識別する細胞マーカーを示す。本明細書記載のAMDACの実施態様の各々の特定の実施態様において、AMDACは単離されている。
一実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-(オクタマー結合タンパク質4)である。別の具体的実施態様において、OCT-4-羊膜由来接着細胞は、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能なCD49f+である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、RT-PCRにより決定可能なHLA-G-である。別の具体的実施態様において、OCT-4-細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+(血管内皮増殖因子受容体1)及び／又はVEGFR2/KDR+(血管内皮増殖因子受容体2)である。具体的実施態様において、OCT-4-羊膜由来接着細胞は、OCT-4について、例えば20サイクルで、PCR-増幅されたmRNAを、同等数のNTERA-2細胞及びRNA増幅サイクルよりも、少なくとも2log少なく発現する。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つ加えて例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、OCT-4-細胞は、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。従って具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能なGFAP+である(例えば、下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、AMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能な、β-チューブリンIII(Tuj1)+である(例えば、下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、該AMDACは、OCT-4-、GFAP+、及びβ-チューブリンIII(Tuj1)+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、OCT-4-、CD200+、CD105+、及びCD49f+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、CD200+、CD105+、CD90+、及びCD73+である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDAC及び／又はAMDAC細胞集団は、CD117-であり、且つCD117に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDAC及び／又はAMDAC細胞集団は、CD146-であり、且つCD146に対する抗体を用いては選択されない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCR及び／又は免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、OCT-4-であり、且つRT-PCR及び／又は免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、VEGFによる誘導後、CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、短期神経分化アッセイにより決定可能な神経原性である(例えば、下記5.12.1節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、インビトロ軟骨形成能アッセイにより決定可能な非軟骨形成性である(例えば、下記5.12.3節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、骨形成性表現型アッセイにより決定可能な非骨形成性である(例えば、下記5.12.2節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、100nMデキサメタゾン、10mMβ-グリセロールリン酸、50μM L-アスコルビン酸-2-ホスフェートを補充した、pH7.4のDMEM(高グルコース)において最大6週間(例えば、2週間、4週間、又は6週間)培養された後、非骨形成性であり、ここで骨形成性は、von Kossa染色；アリザリンレッド染色を用いるか；又は、例えばRT-PCRにより、オステオポンチン、オステオカルシン、オステオネクチン、及び／又は骨シアロタンパク質の存在を検出することにより、評価される。
別の実施態様において、該OCT-4-細胞は、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD29+、CD73+、ABC-p+、及びCD38-の1以上である。
別の具体的実施態様において、例えば、OCT-4- AMDACは加えて、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-(アンジオテンシン-I-変換酵素、ACE)、CD146-(メラノーマ細胞接着分子)、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上であるか、又はRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-であることができる。より具体的実施態様において、該細胞は、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-であり、且つRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-である。別の実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、及び／又はCD133-の1以上である。具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり；免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；且つ、例えば免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、及び／又はCD133-の1以上又は全てである。
別の具体的実施態様において、該AMDACは加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-である。別の具体的実施態様において、該OCT-4-細胞は、単独で又は他のマーカーと組合せてのいずれかで、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD105+及びCD200+に陽性である。別の具体的実施態様において、該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出される、CD34を発現しない。より具体的実施態様において、該細胞は、25〜75ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、又は50ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出される、CD34を発現しない。更により具体的実施態様において、該細胞は、1、2.5、5、10、25、50、75又は100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出される、CD34を発現しない。またより具体的実施態様において、該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに7〜14日間、例えば7日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出される、CD34を発現しない。
具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、及び／又はCD200+の1以上である。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、及びCD200+である。別の具体的実施態様において、該細胞は、例えば1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝した後、免疫局在化(例えばフローサイトメトリー)により検出される、CD34を発現しない。
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、OCT-4-、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-の1以上である。より具体的実施態様において、該細胞は、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である。別の具体的実施態様において、該細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり；並びに、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及び／又はTie-2-の1以上である。別の具体的実施態様において、該細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、及びTie-2-である。
別の実施態様において、OCT-4-羊膜由来接着細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び／又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1以上、又は全てであるか；或いは、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上又は全てであるか、若しくはRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
特定の実施態様において、単離された組織培養プラスチック-接着性羊膜由来接着細胞は、CD49f+である。具体的実施態様において、該CD49f+細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD90+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び／又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1以上又は全てであるか；或いは、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD117-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、HLA-G-、OCT-4-、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上又は全てであるか、又はRT-PCRにより決定可能なSOX2-である。
特定の他の実施態様において、単離された組織培養プラスチック-接着性羊膜由来接着細胞は、HLA-G-、CD90+、及びCD117-である。具体的実施態様において、該HLA-G-、CD90+、及びCD117-細胞は加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD49f+、CD54+、CD98+、CD105+、CD200+、Tie-2+、TEM-7+、VEGFR1/Flt-1+、及び／又はVEGFR2/KDR+(CD309+)の1以上又は全てであるか；或いは、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31-、CD34-、CD38-、CD45-、CD133-、CD143-、CD144-、CD146-、CD271-、CXCR4-、OCT-4-、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上又は全てであるか、又はRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
別の実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞は、例えば、標準培養条件下、30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、アンジオポエチン4(ANGPT4)、アンジオポエチン-様3(ANGPTL3)、カドヘリン5、タイプ2(CDH5)、骨γ-カルボキシグルタミン酸(gla)タンパク質(BGLAP)、CD31、CD34、ケモカイン(C-X-Cモチーフ)リガンド10(CXCL10)、ディスタル-レス(distal-less)ホメオボックス5(DLX5)、フィブリノゲンα鎖(FGA)、線維芽細胞増殖因子4(FGF4)、FMS-様チロシンキナーゼ3(FLT3)、HLA-G、インターフェロンγ(IFNG)、白血球細胞由来ケモタキシン1(LECT1)、レプチン(LEP)、マトリクスメタロプロテアーゼ13(MMP-13)、NANOG、ネスチン、プラスミノーゲン(PLG)、POU5F1(OCT-4)、プロラクチン(PRL)、プロキネチシン1(PROK1)、(性決定領域Y)-box2(SOX2)、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)、テノモジュリン(TNMD)、及び／又は細胞外リンクドメイン含有1(XLKD1)のmRNAを構成的に発現しない。
他の実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞又は羊膜由来接着細胞の集団は、 (ARNT2)、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュートロフィン-3(NT-3)、NT-5、低酸素-誘導因子1α(HIF1A)、低酸素-誘導タンパク質2(HIG2)、ヘムオキシゲナーゼ(脱環化)1(HMOX1)、細胞外スーパオキシドジスムターゼ[Cu-Zn](SOD3)、カタラーゼ(CAT)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFB1)、トランスフォーミング増殖因子β1受容体(TGFB1R)、及び肝細胞増殖因子受容体(HGFR/c-met)のmRNAを発現する。
別の態様において、本明細書記載の羊膜由来接着細胞を含む、単離された細胞の集団、例えば、羊膜細胞又は胎盤細胞の単離された集団、或いはAMDACの実質的に単離された集団が、提供される。該細胞の集団は、均質な集団であり、例えば、少なくとも約90％、95％、98％又は99％が羊膜由来接着細胞である細胞集団であることができる。該細胞集団は、不均質であり、例えば、その集団の細胞の多くとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％又は80％が羊膜由来接着細胞である細胞集団であることができる。しかし単離された細胞の集団は、組織、すなわち羊膜の膜(amniotic membrane)ではない。
一実施態様において、AMDACを含む単離された細胞集団、例えば、AMDACについて実質的に均質である細胞集団、又はAMDACに関して不均質である細胞集団が、本明細書において提供され、ここで該AMDACは、組織培養プラスチックに接着し、且つ該AMDACは、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-である。具体的実施態様において、AMDACは、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリー又はRT-PCRにより決定可能な、CD49f+又はHLA-G-である。別の具体的実施態様において、該細胞集団中の該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり、ここで該単離された細胞集団は、羊膜又は羊膜の膜又は他の組織ではない。より具体的実施態様において、該細胞集団中のAMDACは、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-、及び／又はHLA-G-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+である。別の具体的実施態様において、該AMDACは、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、該AMDACは、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。更により具体的実施態様において、該集団は、AMDACを含み、ここで該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。
別の具体的実施態様において、該細胞集団中の該AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、又はCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、例えばRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つ加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、該細胞集団中のAMDACは、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。別の具体的実施態様において、AMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2を発現しない。従ってより具体的実施態様において、AMDACは、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、OCT-4-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2-である。更により具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-又はHLA-G-であり、且つ加えてCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。より具体的実施態様において、AMDACは、OCT-4-、HLA-G-、CD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である。
別の実施態様において、該細胞集団中の羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり、且つ加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-の1以上であるか、又はRT-PCRにより決定可能な、HLA-G-であり、ここで該単離された細胞集団は、羊膜ではない。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む、単離された細胞集団が、本明細書において提供され、ここで該細胞は、組織培養プラスチックに接着し、ここで該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及び／又はVEGFR2/KDR+であり、ここで該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出される、CD34を発現せず、且つここで該単離された細胞集団は、羊膜ではない。
上記実施態様のいずれかの具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、先に説明された細胞マーカーの任意の組合せにより説明される又は特徴付けられる該羊膜由来接着細胞である。
別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む上記細胞集団のいずれも、例えばI型及びIV型コラーゲンなどの、細胞外マトリクスタンパク質、又は、例えば血管内皮増殖因子(VEGF)、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)若しくは塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)などの、血管新生因子の存在下で、例えば胎盤コラーゲン、例えば、MATRIGEL(商標)などの基材中又は上において、少なくとも4日間及び最大14日間培養した場合、新芽又は管様構造を形成する。
特定の実施態様において、ACTA2(アクチン、α2、平滑筋、大動脈)、ACTC1(アクチン、α心筋1)、ADAMTS1(トロンボスポンジン1型モチーフを持つADAM型メタロペプチダーゼ、1)、AMOT(アンジオモチン)、ANG(アンギオゲニン)、ANGPT1(アンジオポエチン1)、ANGPT2、ANGPTL1(アンジオポエチン-様1)、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1(脳-特異的血管新生阻害因子1)、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1(癌胎児性抗原-関連細胞接着分子1)、CHGA(クロモグラニンA)、COL15A1(コラーゲン、XV型、α1)、COL18A1(コラーゲン、XVIII型、α1)、COL4A1(コラーゲン、IV型、α1)、COL4A2(コラーゲン、IV型、α2)、COL4A3(コラーゲン、IV型、α3)、コネキシン-43、CSF3(コロニー刺激因子3(顆粒球)、CTGF(結合組織増殖因子)、CXCL12(ケモカイン(CXCモチーフ)リガンド12(間質細胞由来因子1))、CXCL2、DNMT3B(DNA(シトシン-5-)-メチル基転移酵素3β)、ECGF1(チミジンホスホリラーゼ)、EDG1(内皮細胞分化遺伝子1)、EDIL3(EGF-様反復配列及びジスコイジンI-様ドメイン3)、ENPP2(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ2)、EPHB2(EPH受容体B2)、FBLN5(FIBULIN 5)、F2(凝固因子II(トロンビン))、FGF1(酸性線維芽細胞増殖因子)、FGF2(塩基性線維芽細胞増殖因子)、FIGF(c-fos誘導した増殖因子(血管内皮増殖因子D))、FLT4(fms-関連チロシンキナーゼ4)、FN1(フィブロネクチン1)、FST(フォリスタチン)、FOXC2(フォークヘッドボックスC2(MFH-1、間葉系フォークヘッド1))、フォリスタチン、ガレクチン-1、GRN(グラニュリン)、HGF(肝細胞増殖因子)、HEY1(YRPWモチーフ1が関係したヘアリー／エンハンサー-オブ-スプリット)、HSPG2(ヘパラン硫酸プロテオグリカン2)、IFNB1(インターフェロン、β1、線維芽細胞)、IL8(インターロイキン8)、IL12A、ITGA4(インテグリン、α4；CD49d)、ITGAV(インテグリン、αV)、ITGB3(インテグリン、β3)、KLF4(クルッペル-様因子4)、MDK(ミッドカイン)、MMP2(マトリクスメタロプロテアーゼ2)、MYOZ2(ミオゼニン2)、NRP2(ニューロピリン2)、PDGFB(血小板由来増殖因子β)、PF4(血小板因子4)、PGK1(ホスホグリセリン酸キナーゼ1)、PROX1(プロスペロホメオボックス1)、PTN(プレイオトロフィン)、SEMA3F(セモフォリン3F)、セルピンB5(セルピンペプチダーゼ阻害因子、クレイドB(オボアルブミン)、メンバー5)、セルピンC1、セルピンF1、TIMP2(メタロプロテイナーゼ組織インヒビター2)、TIMP3、TGFA(トランスフォーミング増殖因子、α)、TGFB1、THBS1(トロンボスポンジン1)、THBS2、TIE1(免疫グロブリン-様及びEGF-様ドメインを持つチロシンキナーゼ1)、TNF(腫瘍壊死因子)、TNNC1(トロポニンC、1型)、TNNT2、TNFSF15(腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー15)、VASH1(バソヒビン1)、VEGF(血管内皮増殖因子)、VEGFB、VEGFC、及び／又はVEGFR1/FLT1(血管内皮増殖因子受容体1)の1以上又は全てのRNAを発現する細胞、又は細胞集団が本明細書に提供され、ここで該単離された細胞集団中の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％又は98％は、前述のものの1以上又は全てのRNAを発現する羊膜由来接着細胞である。
ヒト細胞が使用される場合、全体を通した遺伝子の称号は、ヒト配列をいい、当業者に周知であるように、代表的配列は、文献又はGenBankにおいて認めることができる。これらの配列に対するプローブは、公共で入手可能な配列、又は、例えば特異的TAQMAN(登録商標)プローブ若しくはTAQMAN(登録商標)血管新生アレイ(Applied Biosystems社、パーツ番号4378710)など、商業的供給業者を通じて入手可能な配列により決定することができる。
特定の実施態様において、CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM17前駆体(Aジスインテグリン及びメタロプロテイナーゼドメイン17)(TNF-α変換酵素)(TNF-αコンベルターゼ)、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA(α-フィラミン)(フィラミン1)(内皮アクチン-結合タンパク質)(ABP-280)(非筋型フィラミン)、α-アクチニン1(α-アクチニン細胞骨格アイソフォーム)(非筋型α-アクチニン1)(F-アクチン架橋型タンパク質)、低密度リポタンパク受容体-関連タンパク質2前駆体(メガリン)(糖タンパク質330)(gp330)、マクロファージ捕捉受容体I型及びII型(マクロファージアセチル化LDL受容体I型及びII型)、IIB型アクチビン受容体前駆体(ACTR-IIB)、Wnt-9タンパク質、グリア細胞線維性酸性タンパク質、星状膠細胞(GFAP)、ミオシン-結合タンパク質C、心筋型(心筋MyBP-C)(C-タンパク質、心筋アイソフォーム)、ミオシン重鎖、非筋A型(細胞性ミオシン重鎖、A型)(非筋型ミオシン重鎖-A)(NMMHC-A)、VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miRNAクラスター17-92のメンバー、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及び／又はmiR-16を発現する細胞、又は細胞集団が本明細書に提供され、ここで該単離された細胞集団の細胞の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％若しくは98％は、これらを発現する羊膜由来接着細胞である。
一実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞が、本明細書において提供され、ここで該細胞は、組織培養プラスチックに接着性であり、該細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つここで該細胞は：(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)の1以上を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、又はVE-カドヘリンの発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠き；(d)ACTA2、ADAMTS1、AMOT、ANG、ANGPT1、ANGPT2、ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、BAI1、c-myc、CD44、CD140a、CD140b、CD200、CD202b、CD304、CD309、CEACAM1、CHGA、COL15A1、COL18A1、COL4A1、COL4A2、COL4A3、コネキシン-3、CSF3、CTGF、CXCL12、CXCL2、DNMT3B、ECGF1、EDG1、EDIL3、ENPP2、EPHB2、FBLN5、F2、FGF1、FGF2、FIGF、FLT4、FN1、FST、FOXC2、ガレクチン-1、GRN、HGF、HEY1、HSPG2、IFNB1、IL8、IL12A、ITGA4、ITGAV、ITGB3、KLF-4、MDK、MMP2、MYOZ2、NRP2、PDGFB、PF4、PGK1、PROX1、PTN、SEMA3F、セルピンB5、セルピンC1、セルピンF1、TGFA、TGFB1、THBS1、THBS2、TIE1、TIMP2、TIMP3、TNF、TNNC1、TNNT2、TNFSF15、VASH1、VEGF、VEGFB、VEGFC、又はVEGFR1/FLT1のmRNAを発現し；(e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を発現し；(f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1を、該細胞が成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、又はmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を発現し；並びに／又は、(j)21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8又はVEGFを増加したレベルで発現する。具体的実施態様において、単離された羊膜由来接着細胞は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つ(a)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD90、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、及びVEGFR2/KDR(CD309)を発現し；(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なような、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及びVE-カドヘリンの発現を欠き；(c)RT-PCRにより決定可能なような、SOX2の発現を欠き；(d)
Figure 2014507389
 のmRNAを発現し；(e)CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、及び／又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を発現し；(f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、及び／又はガレクチン-1を、例えば該細胞が成長している培養培地へ分泌し；(g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及びmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現し；(h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現し；(i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を発現し；並びに／又は、(i)21％O2下で該細胞が培養された場合のCD202b、IL-8及び／又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8及びVEGFを増加したレベルで発現する。先に列記した特徴の1以上を有する、AMDACを含む細胞の集団、例えばAMDACの集団が更に、本明細書において提供される。
別の実施態様において、前記羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団のいずれかは、例えば胎盤コラーゲン若しくはMATRIGEL(商標)などの基材上で、細胞外マトリクスタンパク質、例えばI型又はIV型コラーゲン及び／又は、1以上の血管新生因子、例えばVEGF、EGF、PDGF、若しくはbFGFの存在下で培養した場合、アセチル化された低密度リポタンパク(LDL)を取り込む。
別の実施態様において、AMDACは、細胞集団内に含まれる。そのような実施態様の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、組織培養プラスチックに接着し、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である。具体的実施態様において、該細胞集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である、羊膜由来細胞である。別の具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％又は99％は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である、羊膜由来細胞である。別の具体的実施態様において、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である該細胞は、1〜100ng/mLのVEGFに4〜21日間曝された後、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD34を発現しない。別の具体的実施態様において、該細胞はまたVE-カドヘリン-である。
具体的実施態様において、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、又はVE-カドヘリン-である該羊膜由来細胞は、該細胞集団を血管内皮増殖因子(VEGF)の存在下で培養した場合、新芽又は管様構造を形成する。
本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、初代培養下、又は幹細胞の培養に適した培地での増殖時に、上記特徴、例えば細胞表面マーカー及び／又は遺伝子発現プロファイルの組合せを示す。そのような培地は、例えば、1〜100％DMEM-LG(Gibco社)、1〜100％MCDB-201(Sigma社)、1〜10％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、0.1〜5×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS、Sigma社)、0.1〜5×リノレン酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA、Sigma社)、10-5〜10-15Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-2〜10-10Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、1〜50ng/mL上皮細胞増殖因子(EGF)(R&D Systems社)、1〜50ng/mL血小板由来増殖因子(PDGF-BB)(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含有する培地を含む。具体的実施態様において、該培地は、60％DMEM-LG(Gibco社)、40％MCDB-201(Sigma社)、2％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、1×リノレン酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、上皮細胞増殖因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来増殖因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含有する。他の好適な培地は、以下に説明する。
本明細書に提供される単離された羊膜由来接着細胞の集団は、例えば容器内に、約、少なくとも約、又は多くとも約1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多い羊膜由来接着細胞を含むことができる。様々な実施態様において、本明細書に提供された単離された細胞集団中の細胞の少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、又は99％は、羊膜由来接着細胞である。すなわち、単離された羊膜由来接着細胞の集団は、例えば、1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％もの非AMDAC細胞を含むことができる。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％またはそれよりも多くは、OCT-4+ではない。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、基材上で培養することができる。様々な実施態様において、該基材は、羊膜由来接着細胞の培養及び／又は選択を達成することができる任意の表面であることができる。典型的には、該基材は、プラスチック、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートプラスチックである。組織培養プラスチックは、例えば、CELLSTART(商標)、MESENCULT(商標)ACF-基材、オルニチン、若しくはポリリジンなどの、生体分子又は合成模倣物質、又は例えば、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチンなどの、細胞外マトリクスタンパク質により処理、コーティング、又はインプリンティングすることができる。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞、及びそのような細胞の集団は、1以上の胎盤から単離することができる。単離された羊膜由来細胞は、培養及び拡大し、そのような細胞の集団を作製することができる。羊膜由来接着細胞を含む細胞の集団も、培養及び拡大し、羊膜由来接着細胞の集団を作製することができる。
特定の実施態様において、上記マーカー及び／又は遺伝子発現特徴のいずれかを示すAMDACは、少なくとも 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20回、又はそれよりも多く継代したものである。特定の他の実施態様において、上記マーカー及び／又は遺伝子発現特徴のいずれかを示すAMDACは、培養において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49回又は少なくとも50回、又はそれよりも多く倍加されている。
具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCR及び／又はTRAPアッセイにより測定されるように、テロメラーゼ-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、RT-PCRにより測定されるように、NANOG-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、NANOGのmRNAを発現しない。具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、(性決定領域Y)-box2(SOX2)-である。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、例えば30サイクルのRT-PCRにより決定可能な、SOX2のmRNAを発現しない。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、骨形成性表現型アッセイにより測定されるように、骨形成性ではない(例えば、下記5.12.2節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、軟骨形成能アッセイにより測定されるように、軟骨形成性ではない(例えば、下記5.12.3節参照)。別の具体的実施態様において、本明細書記載のAMDACは、骨形成性表現型アッセイにより測定されるように、骨形成性ではなく(例えば、下記5.12.2節参照)、且つ軟骨形成能アッセイにより測定されるように、軟骨形成性ではない(例えば、下記5.12.3節参照)。
AMDACは、表1に明らかにするように、RT-PCRにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
Figure 2014507389
Figure 2014507389
Figure 2014507389
AMDACは、表2に明らかにするように、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
Figure 2014507389
AMDACは、表3に明らかにするように、免疫局在化、例えば免疫蛍光測定及び／又は免疫組織化学により決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
Figure 2014507389
AMDACは、表4に明らかにするように、免疫局在化、例えば膜プロテオミクスにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
Figure 2014507389
AMDACは、表5に明らかにするように、セクレトーム分析、例えばELISAにより決定可能なような、本明細書記載の特徴の1以上を示すことができる。例えば、AMDACは、下記5.6節に説明したように、単離及び培養された場合、そのような特徴の1以上を示すことができる。
Figure 2014507389
(5.4 他の細胞型を含む羊膜由来接着細胞の集団)
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、例えば羊膜由来接着細胞ではない胎盤細胞、又は、例えば胎盤細胞ではない細胞などの第二の細胞型を含むことができる。例えば、羊膜由来接着細胞の単離された集団は、第二の細胞型の集団を含むことができ、例えば該集団と組合せることができ、ここで、該第二の細胞型は、例えば、胚性幹細胞、血液細胞(例えば、胎盤血、胎盤血細胞、臍帯血、臍帯血細胞、末梢血、末梢血細胞、胎盤血、臍帯血、又は末梢血由来の有核細胞など)、血液から単離された幹細胞(例えば、胎盤血、臍帯血又は末梢血から単離された幹細胞)、胎盤幹細胞(例えば、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,468,276号、及び米国特許出願公開第2007/0275362号に記載の、胎盤幹細胞)、胎盤灌流液由来の有核細胞、例えば胎盤灌流液からの全有核細胞、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,638,141号に説明され特許請求された細胞、臍帯幹細胞、血液由来有核細胞の集団、骨髄由来の間葉系間質細胞、骨髄由来の間葉系幹細胞、骨髄由来の造血幹細胞、粗骨髄、成体(体性)幹細胞、組織に含まれる幹細胞の集団、培養細胞、例えば培養幹細胞、完全に分化した細胞の集団(例えば、軟骨細胞、線維芽細胞、羊膜細胞、骨芽細胞、筋細胞、心筋細胞など)、周皮細胞などである。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団は、胎盤幹細胞又は臍帯からの幹細胞を含む。第二の細胞型が血液又は血液細胞である特定の実施態様において、赤血球は、細胞の集団から除去されている。
具体的実施態様において、第二の細胞型は造血幹細胞である。そのような造血幹細胞は、例えば、未処理の胎盤血、臍帯血又は末梢血内；胎盤血、臍帯血又は末梢血からの全有核細胞内；胎盤血、臍帯血又は末梢血からの単離されたCD34+細胞の集団内；未処理の骨髄内；骨髄からの全有核細胞内；骨髄から単離されたCD34+細胞の集団内などに含まれることができる。
別の実施態様において、第二の細胞型は、胚性幹細胞に関連した多能性マーカー及び機能マーカーを発現するために、培養において操作された非胚細胞型である。
前記羊膜由来接着細胞の単離された集団の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞及び第二の細胞型のいずれか又は両方は、該細胞の意図されたレシピエントに対し、自家であるか、又は同種である。
羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞以外の複数の幹細胞を含有する組成物が、本明細書において更に提供される。具体的実施態様において、該組成物は、胎盤から得られる幹細胞、すなわち胎盤幹細胞、例えばそれらの各開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,045,148号；第7,255,879号；及び、第7,311,905号、並びに米国特許出願公開第2007/0275362号に記載された胎盤幹細胞を含有する。具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+及びCD105+である。より具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD10+、CD105+及びCD200+である。より具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD45-、CD10+、CD90+、CD105+及びCD200+である。より具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、CD34-、CD45-、CD80-、CD86-、CD10+、CD90+、CD105+及びCD200+である。他の具体的実施態様において、該胎盤幹細胞は、CD200+及びHLA-G+であり；CD73+、CD105+、及びCD200+であり；CD200+及びOCT-4+であり；CD73+、CD105+及びHLA-G+であり；CD73+及びCD105+であり、並びに該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、該集団中の1以上の胚様体の形成を促進するか；又は、OCT-4+であり、並びに該幹細胞を含む胎盤細胞の集団が胚様体の形成を可能にする条件下で培養される場合、該集団中の1以上の胚様体の形成を促進するか；又は、それらの任意の組合せである。より具体的実施態様において、該CD200+、HLA-G+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+及びCD105+である。別のより具体的実施態様において、該CD73+、CD105+、及びCD200+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、及びHLA-G+である。別のより具体的実施態様において、該CD200+、OCT-4+幹細胞は、CD34-、CD38-、CD45-、CD73+、CD105+及びHLA-G+である。別のより具体的実施態様において、該CD73+、CD105+及びHLA-G+幹細胞は、CD34-、CD45-、OCT-4+及びCD200+である。別のより具体的実施態様において、該CD73+及びCD105+幹細胞は、OCT-4+、CD34-、CD38-及びCD45-である。別のより具体的実施態様において、該OCT-4+幹細胞は、CD73+、CD105+、CD200+、CD34-、CD38-、及びCD45-である。別のより具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、母親起源である(すなわち、母親遺伝子型を有する)。別のより具体的実施態様において、胎盤幹細胞は、胎児起源である(すなわち、胎児遺伝子型を有する)。
別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞、及び胚性幹細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞及び間葉系間質細胞若しくは幹細胞、例えば骨髄由来の間葉系間質細胞若しくは幹細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、骨髄由来の造血幹細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞及び造血前駆細胞、例えば骨髄、胎児血液、臍帯血、胎盤血、及び／又は末梢血からの造血前駆細胞を含有する。別の具体的実施態様において、該組成物は、羊膜由来接着細胞及び体性幹細胞を含有する。より具体的実施態様において、該体性幹細胞は、神経幹細胞、肝性幹細胞、膵性幹細胞、内皮幹細胞、心筋幹細胞、又は筋幹細胞である。
別の具体的実施態様において、第二の細胞型は、該集団中の細胞の約、少なくとも、又は多くとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、又は50％を構成する。他の具体的実施態様において、該組成物中のAMDACは、該組成物中の細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％又は90％を構成する。他の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、該集団中の細胞の約、少なくとも、又は多くとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、又は45％を構成する。他の具体的実施態様において、該集団中の細胞の少なくとも25％、35％、45％、50％、60％、75％、85％又はそれよりも多くは、OCT-4+ではない。
羊膜由来接着細胞の単離された集団中の細胞は、別の型の複数の細胞と、例えば、幹細胞の集団と、各々の集団内の全有核細胞の数と比べて、約100,000,000：1、50,000,000：1、20,000,000：1、10,000,000：1、5,000,000：1、2,000,000：1、1,000,000：1、500,000：1、200,000：1、100,000：1、50,000：1、20,000：1、10,000：1、5,000：1、2,000：1、1,000：1、500：1、200：1、100：1、50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1；1：2；1：5；1：10；1：100；1：200；1：500；1：1,000；1：2,000；1：5,000；1：10,000；1：20,000；1：50,000；1：100,000；1：500,000；1：1,000,000；1：2,000,000；1：5,000,000；1：10,000,000；1：20,000,000；1：50,000,000；又は約1：100,000,000の比で、一緒にすることができる。単離された羊膜由来接着細胞集団内の細胞を、更に複数の細胞型の複数の細胞と組合せることもできる。
(5.5 培養下の成長)
任意の哺乳動物細胞に関して、本明細書記載の羊膜由来接着細胞の成長は、成長用に選択される特定の培地に一部左右される。最適な条件下では、羊膜由来接着細胞は、典型的にはおよそ24時間で数が2倍になる。培養中、本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、培養液中の基材、例えば組織培養容器(例えば、組織培養皿プラスチック、フィブロネクチンコーティングしたプラスチックなど)の表面に接着し、単層を形成する。典型的には、該細胞は、羊膜の消化後、2〜7日以内に培養物中に樹立する。これらは、1日当たりおよそ0.4〜1.2倍の集団倍加で増殖し、且つ少なくとも30〜50回集団倍加させることができる。これらの細胞は、コンフルエンス以下で且つ拡大する間に、間葉系細胞/線維芽細胞-様表現型を示し、コンフルエンス時には、立方体/丸石-様外観を示し、且つ培養液中の増殖は、強力に接触阻害される。羊膜由来接着細胞の集団は、培養液中の拡大時に胚様体を形成することができる。
(5.6 羊膜由来接着細胞を得る方法)
羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、例えば、羊膜組織の特定の消化方法を介して、任意にそれに続けて得られた細胞又は細胞集団を、羊膜由来接着細胞の特徴的マーカー、又はマーカーの組合せの存在又は非存在について評価することにより、或いは羊膜細胞を入手し、且つ羊膜由来接着細胞の特徴的なマーカーを基に選択することにより、作製することができ、例えば他の細胞又は細胞集団から単離することができる。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞、及び単離された羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、例えば、羊膜組織の消化、それに続く接着細胞の選択により作製することができる。一実施態様において、例えば、単離された羊膜由来接着細胞、又は単離された羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、(1)羊膜組織を、第一の酵素で消化し、細胞を、羊膜の間葉系層の細胞からの羊膜上皮層から解離する工程；(2)引き続き、羊膜の間葉系層を、第二の酵素で消化し、単-細胞懸濁液を形成する工程；(3)該単-細胞懸濁液中の細胞を、組織培養表面、例えば組織培養プラスチック上で培養する工程；並びに、(4)培地の交換後、該表面に接着する細胞を選択し、これにより羊膜由来接着細胞を含む単離された細胞集団を作製する工程：により作製することができる。具体的実施態様において、該第一の酵素はトリプシンである。より具体的実施態様において、該トリプシンは、消化されるべき羊膜組織1gにつき溶液5〜20ml、例えば10ml中濃度0.25％トリプシン(w/v)で使用される。別のより具体的実施態様において、該トリプシンによる消化は、37℃で約15分間進行され、且つ最大3回繰り返される。別の具体的実施態様において、該第二の酵素はコラゲナーゼである。より具体的実施態様において、該コラゲナーゼは、消化されるべき羊膜組織1gにつき5ml中濃度50〜500U/Lで使用される。別のより具体的実施態様において、該コラゲナーゼによる消化は、37℃で約45〜60分間進行される。別の具体的実施態様において、コラゲナーゼによる消化後形成された単-細胞懸濁液は、工程(2)と工程(3)の間で、例えば、75μM〜150μMフィルターを通して濾過される。別の具体的実施態様において、該第一の酵素はトリプシンであり、且つ該第二の酵素はコラゲナーゼである。
羊膜由来接着細胞を含有する単離された細胞集団は、別の実施態様において、羊膜由来接着細胞の1以上の特徴を示す、羊膜からの細胞、例えば、本明細書別所記載の羊膜組織の消化により得られた細胞を選択することにより得ることができる。一実施態様において、例えば、細胞集団は、(a)RT-PCRにより決定可能な、OCT-4について陰性、及び(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定又は選択可能なように、VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200の1以上について陽性である、羊膜細胞を同定する工程；並びに、該細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程を含む方法により、作製される。具体的実施態様において、該羊膜細胞は加えて、VE-カドヘリン-である。具体的実施態様において、細胞集団は、(a)RT-PCRにより決定可能な、OCT-4について陰性、及び、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリンについて陰性であり、並びに(b)免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR2/KDR、CD9、CD54、CD105、CD200の各々について陽性である、胎盤細胞を選択する工程；並びに、該細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程により、作製される。特定の実施態様において、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーによる選択は、RT-PCRによる選択の前に実行される。別の具体的実施態様において、該選択は、1〜100ng/mL VEGFの存在下で、4〜21日間の培養後に、細胞マーカーCD34を発現していない細胞を選択する工程を含む。
別の実施態様において、例えば、細胞集団は、組織培養プラスチックに接着し、並びにRT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+及びVEGFR2/KDR+である羊膜細胞を選択する工程、並びに該細胞を他の細胞から単離し、細胞集団を形成する工程を含む方法により、作製される。具体的実施態様において、細胞集団は、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VEGFR1/Flt-1+、VEGFR2/KDR+、及びHLA-G-である羊膜細胞を選択する工程を含む方法により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞集団は、加えて、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及び／又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上、又は全てである羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をこれらの特徴の1以上を示さない細胞から単離する工程により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞集団は、加えて免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、VE-カドヘリン-である羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をVE-カドヘリン+である細胞から単離する工程により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞集団は、加えて免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより決定可能な、CD105+及びCD200+である羊膜細胞を選択する工程、並びに、該細胞をCD105-又はCD200-である細胞から単離する工程により、作製される。別の具体的実施態様において、該細胞は、1〜100ng/mL VEGFに、4〜21日間曝した後に、免疫局在化、例えばフローサイトメトリーにより検出されるように、CD34を発現しない。
細胞の選択において、羊膜由来接着細胞に特異的な特徴について、細胞の全集団を試験することは必要ない。代わりに、細胞集団の1以上の細胞アリコート(例えば約0.5％〜2％)を、そのような特徴について試験すればよく、それらの結果を、該集団中の残りの細胞に帰することができる。
選択された細胞は、細胞試料(例えば約104〜約105個細胞)を、基材、例えばMATRIGEL(商標)上で、4〜14日間、例えば7日間、VEGF(例えば約50ng/mL)の存在下で培養し、且つ新芽及び／又は細胞ネットワークの外観について細胞を目視により検証することにより、本明細書に提供される羊膜由来接着細胞であることを確認することができる。
羊膜由来接着細胞を、細胞選択の技術分野で公知の任意の方法によって、上記マーカーにより選択することができる。例えば、該接着細胞を、例えば免疫局在化、例えばフローサイトメトリー又はFACSにおいて、1つ以上の細胞表面マーカーに対する1つ又は複数の抗体を用いて選択することができる。抗体の磁気ビーズとの複合体を用いて、選択を達成することができる。特定のマーカーに特異的である抗体は当該技術分野で公知であり、且つ、例えばCD9に対する抗体(Abcam社)；CD54に対する抗体(Abcam社)；CD105に対する抗体(Abcam社；BioDesign International社、サコ、MEなど)；CD200に対する抗体(Abcam社)、サイトケラチンに対する抗体(SigmaAldrich社)などが商業的に入手可能である。他のマーカーに対する抗体も市販されており、例えば、CD34、CD38、及びCD45に対する抗体が、例えば、StemCell Technologies社又はBioDesign International社から入手可能である。RT-PCRに適したOCT-4配列に対するプライマーは、例えば、Millipore社若しくはInvitrogen社から、商業的に入手するか、又はGenBank寄託番号DQ486513のヒト配列から容易に誘導することができる。
羊膜由来接着細胞を得るために、胎盤及び胎盤由来の羊膜組織を入手し、且つそのような組織を処理する詳細な方法は、以下に提示される。
(5.6.1 細胞回収組成物)
一般に、細胞は、生理的に許容し得る溶液、例えば細胞回収組成物を使用し、哺乳動物胎盤、例えばヒト胎盤由来の羊膜から得ることができる。いくつかの実施態様において、該細胞回収組成物は、アポトーシスを防止又は抑制し、細胞死、溶解、分解などを予防又は抑制する。細胞回収組成物は、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、関連の米国特許出願公開第2007/0190042号、表題「胎盤幹細胞回収及び組織保存のための改善された培地(Improved Medium for Collecting Placental Stem Cell and Preserving Organs)」に説明されている。
細胞回収組成物は、緩衝成分、例えば4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)を添加又は無添加の、例えば、食塩水(例えばリン酸-緩衝食塩水、クレブス溶液、改変クレブス溶液、イーグル溶液、0.9％NaClなど)、培養培地(例えば、DMEM、H.DMEMなど)などの、羊膜由来接着細胞の回収及び／又は培養に適した任意の生理的に許容し得る溶液を含有することができる。
細胞回収組成物は、回収の時点から培養の時点まで、細胞、例えば羊膜由来接着細胞を保存する、すなわち、該細胞の死を防止するか、又は該細胞の死を遅延させるか、死滅する細胞集団内の細胞の数を減少させるなどの傾向がある1種以上の成分を含むことができる。そのような成分は、例えば、アポトーシス阻害剤(例えば、カスパーゼ阻害剤若しくはJNK阻害剤)；血管拡張剤(例えば、硫酸マグネシウム、抗高血圧薬、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、副腎皮質刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、ニトロプルシドナトリウム、ヒドララジン、アデノシン三リン酸、アデノシン、インドメタシン若しくは硫酸マグネシウム、ホスホジエステラーゼ阻害剤など)；壊死阻害剤(例えば、2-(1H-インドール-3-イル)-3-ペンチルアミノ-マレイミド、ピロリジンジチオカルバメート、若しくはクロナゼパム)；TNF-α阻害剤；及び／又は、酸素運搬ペルフルオロカーボン(例えば、ペルフルオロオクチルブロミド、ペルフルオロデシルブロミドなど)であることができる。
細胞回収組成物は、1種以上の組織分解酵素、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、中性プロテアーゼ、RNアーゼ、又はDNアーゼなどを含むことができる。そのような酵素としては、コラゲナーゼ(例えば、コラゲナーゼI、II、III、又はIV、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)由来のコラゲナーゼなど)；ディスパーゼ、サーモリシン、エラスターゼ、トリプシン、LIBERASE(商標)、ヒアルロニダーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。組織消化酵素を含有する細胞回収組成物の使用は、以下により詳細に考察する。
細胞回収組成物は、殺菌有効量又は静菌有効量の抗生物質を含むことができる。特定の非限定的な実施態様において、抗生物質は、マクロライド(例えば、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファレキシン、セフラジン、セフロキシム、セフプロジル、セファクロール、セフィキシム、若しくはセファドロキシル)、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン(例えば、ペニシリンV)、又はキノロン(例えば、オフロキサシン、シプロフロキサシン、若しくはノルフロキサシン)、テトラサイクリン、ストレプトマイシンなどである。特定の実施態様において、抗生物質は、グラム陽性細菌及び／又はグラム陰性細菌、例えば、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)などに対して活性がある。
細胞回収組成物は、以下の化合物のうちの1以上を含むこともできる：アデノシン(約1mM〜約50mM)；D-グルコース(約20mM〜約100mM)；マグネシウムイオン(約1mM〜約50mM)；一実施態様において、内皮の完全性及び細胞の生存能力を維持するのに十分な量で存在する、分子量20,000ダルトン超の高分子(例えば、合成若しくは天然のコロイド、約25g/l〜約100g/l、若しくは約40g/l〜約60g/lで存在するデキストラン若しくはポリエチレングリコールなどの多糖)；酸化防止剤(例えば、約25μM〜約100μMで存在するブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、グルタチオン、ビタミンC、若しくはビタミンE)；還元剤(例えば、約0.1mM〜約5mMで存在するN-アセチルシステイン)；細胞内へのカルシウムの侵入を防止する薬剤(例えば、約2μM〜約25μMで存在するベラパミル)；ニトログリセリン(例えば、約0.05g/L〜約0.2g/L)；一実施態様において、残留血液の凝固の防止を助けるのに十分な量で存在する抗凝血剤(例えば、約1000ユニット/l〜約100,000ユニット/lの濃度で存在するヘパリン若しくはヒルジン)；又はアミロライド含有化合物(例えば、約1.0μM〜約5μMで存在するアミロライド、エチルイソプロピルアミロライド、ヘキサメチレンアミロライド、ジメチルアミロライド、若しくはイソブチルアミロライド)。
本明細書記載の羊膜由来接着細胞はまた、例えば、以下に記載のように消化時及び消化後に、単純な生理的に許容し得る緩衝液、例えばリン酸-緩衝食塩水、0.9％NaCl溶液、細胞培養培地などに、回収することもできる。
(5.6.2 胎盤の回収及び取り扱い)
一般に、ヒトの胎盤を、出産後その娩出後すぐに、又は例えば帝王切開後に、回収する。好ましい実施態様において、インフォームドコンセント後、及び患者の全病歴を取得して、該胎盤と関連付けた後、胎盤を患者から回収する。好ましくは、この病歴は分娩後も続く。そのような病歴を用いて、胎盤又はそれから採取される細胞の後続的使用を調整することができる。例えば、ヒト胎盤細胞、例えば羊膜由来接着細胞は、その病歴を考慮して、該胎盤と関連する幼児のための、又は近親者のための、又はその幼児の親、兄弟姉妹、若しくは他の血縁者のための個人医療に用いることができる。
羊膜由来接着細胞の回収前に、臍帯血及び胎盤血を除去する。特定の実施態様において、分娩後、胎盤内の臍帯血を回収する。胎盤は、従来の臍帯血の回収プロセスに供することができる。典型的には、針又はカニューレを用い、重力の助けを借りて、胎盤を放血させる。針又はカニューレを、通常、臍帯静脈内に留置し、胎盤を穏やかにマッサージして、胎盤からの臍帯血の排出を助けることができる。そのような臍帯血の回収は、商業的に、例えば、LifeBank USA社(シダーノールズ、NJ)、ViaCord、Cord Blood Registry and Cryocellにより行なわれてもよい。好ましくは、臍帯血を回収する間の組織破壊を最小限に抑えるために、胎盤を、それ以上操作することなく、重力排出させる。
典型的には、臍帯血の回収、及び例えば、組織解離による細胞の回収のために、胎盤を、分娩室又は出産室から別の場所、例えば、実験室まで輸送する。例えば、胎盤を、近位臍帯をクランプしたまま、滅菌されたジップロック式プラスチックバッグの中に入れ、その後、このプラスチックバッグを断熱容器内に入れることによって、胎盤を(胎盤の温度を20〜28℃に維持する)滅菌された断熱輸送装置に入れて輸送することが好ましい。別の実施態様において、米国特許第7,147,626号に実質的に記載されているように、胎盤を臍帯血回収キットに入れて輸送する。好ましくは、胎盤を、分娩から4〜24時間後に、実験室に移送する。特定の実施態様において、臍帯血の回収前に、盤状胎盤(placental disc)への挿入部から好ましくは4〜5cm(センチメートル)以内のところで、近位臍帯をクランプする。他の実施態様において、臍帯血の回収後、しかし、それ以上の胎盤の処理前に、近位臍帯をクランプする。
胎盤は、細胞回収前に、滅菌条件下、且つ例えば4〜25℃(摂氏)の温度、例えば室温で保存することができる。胎盤を灌流して残留臍帯血を除去する前に、胎盤は、例えば0〜24時間の期間、最長48時間、又は48時間よりも長い時間、保存してもよい。一実施態様において、胎盤は、盤出後約0時間〜約2時間に回収される。胎盤は、例えば4〜25℃(摂氏)の温度で、抗凝血剤溶液に入れて保存することができる。好適な抗凝血剤溶液は当該技術分野で周知である。例えば、クエン酸ナトリウム、ヘパリン又はワルファリンナトリウムの溶液を用いることができる。好ましい実施態様において、抗凝血剤溶液は、ヘパリン溶液(例えば、1:1000溶液中で1％w/w)を含む。放血された胎盤は、細胞を回収する前に、36時間を超えない時間、保存することが好ましい。
胎盤の回収及び取り扱いに関する追加情報に関しては、例えば、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許第7,638,141号を参照されたい。
(5.6.3 羊膜組織の物理的破壊及び酵素的消化)
一実施態様において、羊膜は、例えば指を使用するなどし、例えば大まかに解体することにより、胎盤の残りから分離する。羊膜を、例えば部分又は組織切片に解体し、その後酵素的に消化し、且つ接着細胞を回収する。羊膜由来接着細胞は、全羊膜から、又は羊膜の小切片から、例えば面積約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900又は約1000平方ミリメートルである羊膜の切片から、得ることができる。
羊膜由来接着細胞は、一般に、盤出後約最初の3日間以内の任意の時点で、胎盤の羊膜又はそれらの一部から回収することができるが、好ましくは盤出後約0時間〜48時間、又は盤出後約8時間〜約18時間である。
AMDACは、例えば、トリプシンで消化し、引き続きコラゲナーゼで消化することを含む、特異的2工程単離法を用い、単離することができる。例えば、トリプシンにより、羊膜の膜又はその一部を消化し、その結果上皮細胞を該羊膜の膜から放す工程；羊膜の膜又はその一部を該上皮細胞から除去する工程；更に、羊膜の膜又はその一部をコラゲナーゼにより消化する工程を含む、羊膜由来接着細胞を単離する方法が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、羊膜の膜又はその一部のトリプシンによる消化は、少なくとも1回繰り返される。別の具体的実施態様において、羊膜の膜又はその一部のコラゲナーゼによる消化は、少なくとも1回繰り返される。別の具体的実施態様において、トリプシンは、約0.1％〜1.0％(最終濃度)である。より具体的実施態様において、トリプシンは、約0.25％(最終濃度)である。別の具体的実施態様において、コラゲナーゼは、約50U/mL〜約1000U/mL(最終濃度)である。より具体的実施態様において、コラゲナーゼは、約125U/mL(最終濃度)である。
一実施態様において、例えば、羊膜由来接着細胞は、下記のように得ることができる。羊膜の膜は、例えば鈍的切開により、胎盤から単離され、次にサイズがおよそ0.1インチ×0.1インチ〜約5インチ×5インチ、例えば2インチ×2インチの切片に切断される。上皮単層は、トリプシン処理により、例えば下記の三重トリプシン処理により、羊膜の膜の胎児側から取り除かれる。羊膜の膜の切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)トリプシン-EDTA溶液(0.25％)の入った容器に配置する。トリプシン溶液の容量は、約5mL/g羊膜の膜〜約50mL/g羊膜の膜の範囲であることができる。容器は、温度を一定に保ちながら、約5分間〜約30分間、例えば15分間攪拌する。その後、羊膜切片を手作業で除去するか、又は濾過によるなど、任意の適切な方法によりトリプシン溶液から、羊膜の膜の切片を分離する。トリプシン処理工程は、少なくとも1回以上繰り返すことができる。一実施態様において、トリプシン処理工程は、2回(三重トリプシン処理について)又は3回(四重トリプシン処理について)繰り返される。
一実施態様において、最終トリプシン処理の完了時に、羊膜の膜の切片を、リン酸塩-緩衝食塩水(PBS)/10％ウシ胎仔血清(FBS)、PBS/5％FBS又はPBS/3％FBSなどの、温めた(例えば約20℃〜約37℃)トリプシン中和溶液(例えば、容量約5mL/g羊膜の膜〜約50mL/g羊膜の膜)に配置し、且つ約5秒〜約30分間、例えば、5、10、又は15分間攪拌する。その後羊膜切片を手作業で除去するか、又は濾過によるなど、任意の好適な方法により、羊膜の膜の切片をトリプシン中和溶液から分離する。その後羊膜の膜の切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)PBS(pH7.2)溶液(例えば、容量約5mL/g羊膜の膜〜約50mL/g羊膜の膜)に配置し、且つ約5秒〜約30分間、例えば、5、10、又は15分間攪拌する。次に羊膜の膜の切片を、上記のようにPBSから分離する。
その後羊膜の膜の切片を、温めた(例えば約20℃〜約37℃)消化溶液に配置する。消化溶液の容量は、約5mL/g羊膜〜約50mL/g羊膜の範囲である。消化溶液は、DMEMなどの好適な培養培地中に、消化酵素を含む。典型的消化溶液は、I型コラゲナーゼ(約50U/mL〜約500U/mL)を含む。本プロセスのこの工程の消化溶液は、一般にトリプシンを含まない。一般に、羊膜消化が実質的に完了するまで、例えば、羊膜の膜の溶解が完了したことが示され、均質な懸濁液を生じるまで(およそ10分間〜約90分間)、37℃で攪拌する。その後温かいPBS/5％FBSを、約1mL/g羊膜組織〜約50mL/g羊膜組織の比で添加し、約2分間〜約5分間攪拌する。次に細胞懸濁液を、例えば40μm〜100μmフィルターを用い濾過し、あらゆる未消化の組織を除去する。細胞を、温PBS(約1mL〜約500mL)中に懸濁させ、次に200×g〜約400×gで約5分間〜約30分間、例えば300×gで約15分間、20℃で遠心分離する。遠心分離後、上清を除去し、細胞を、好適な培養培地中に再懸濁させる。この細胞懸濁液を濾過し(40μm〜70μmフィルター)、あらゆる残存している未消化の組織を除去し、単細胞懸濁液を生じる。この実施態様において、残存する未消化の羊膜は廃棄することができる。
この実施態様において、懸濁液中の細胞を、本明細書別所記載のように収集及び培養し、単離された羊膜由来接着細胞、及びそのような細胞の集団を作製する。例えば一実施態様において、懸濁液中の細胞を培養し、羊膜由来接着細胞を、該培養液中の非接着細胞から分離し、羊膜由来接着細胞の濃縮された集団を作製することができる。より具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞の濃縮された集団中の細胞の少なくとも50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％又は99％は、該羊膜由来接着細胞である。
本明細書の任意の消化プロトコールにおいて、消化により得られた細胞懸濁液は、例えば、約50μm〜約150μm、例えば約75μm〜約125μmの有孔フィルターを通して濾過することができる。より具体的実施態様において、細胞懸濁液は、2個以上のフィルター、例えば125μmフィルターと75μmフィルターを通して濾過することができる。
本明細書記載の任意の方法と組合せて、AMDACは、上記5.3節に記載のように、AMDACの1以上の特徴を発現する細胞を選択することにより、消化時に放出された細胞から単離することができる。
一実施態様において、AMDACは、第一の酵素及び第二の酵素を順に用いて単離することができ、ここで本方法において使用される第一の酵素はコラゲナーゼではなく、且つ本方法において使用される第二の酵素はトリプシンではない。
別の実施態様において、AMDACを単離するために使用する消化工程は、コラゲナーゼ、ジスパーゼ又はヒアルロニダーゼのいずれか2種以上の組合せを使用しない。
別の実施態様において、AMDACは、細胞が移植片からの成長、複製、又は遊走により検出され得るように、移植片培養を介しては、単離されない。
別の実施態様において、デオキシリボヌクレアーゼ(DNアーゼ)は、AMDACの単離時は使用されない。例えば、DNアーゼは、本単離のコラゲナーゼ消化工程後には使用されない。
(5.6.4 羊膜由来接着細胞の単離、選別及び特徴付け)
細胞ペレットを、上記の新鮮な細胞回収組成物、又は細胞維持に適した培地、例えばダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)；イスコフの改変ダルベッコ培地(IMDM)、例えば2U/mLヘパリン及び2mM EDTAを含有するIMDM無血清培地(GibcoBRL社、NY)；緩衝液(例えばPBS、HBSS)のFBS(例えば2％v/v)との混合液；などの中に再懸濁させる。
フィブロネクチンなどの、追加の細胞外マトリクスコーティングを含む又は含まない、例えば組織培養プラスチックなどの、表面上で培養された羊膜由来接着細胞を、継代するか、又は示差接着により単離することができる。例えば、上記5.6.3節に記載のように得られた細胞懸濁液を、例えば3〜7日間、組織培養プラスチック上の培養培地中で培養することができる。培養時に、懸濁液中の複数の細胞は、培養表面に接着し、且つ非接着細胞は、培地の交換時に除去される。
羊膜から回収された細胞の数と種類を、免疫局在化、例えばフローサイトメトリー、細胞選別、免疫細胞化学(例えば、組織特異的抗体若しくは細胞マーカー特異的抗体による染色)、蛍光活性化細胞選別(FACS)、磁気活性化細胞選別(MACS)などの標準的な細胞検出技術を用いて形態及び細胞表面マーカーの変化を測定することにより、光学顕微鏡若しくは共焦点顕微鏡法を用いて細胞の形態を調べることにより、並びに／又はPCR及び遺伝子発現プロファイリングなどの当該技術分野で周知の技術を用いて遺伝子発現の変化を測定することにより、モニタリングすることができる。これらの技術を、同様に、1種以上の特定のマーカーが陽性である細胞を同定するためにも用いることができる。例えば、1以上のCD34に対する抗体を用いて、上記の技術を用いて、細胞が検出可能な量のCD34を含むかどうかを決定することができ；もしそうであるならば、細胞はCD34+である。
羊膜由来接着細胞は、フィコール分離、例えばフィコール勾配遠心分離により単離することができる。そのような遠心分離は、遠心分離速度などに関して、標準プロトコールに従うことができる。一実施態様において、例えば、羊膜の消化後に回収された細胞は、5000×gで15分間、室温での遠心分離により、フィコール勾配を用い分離され、且つ関心対象の細胞層は更なる処理のために回収される。
羊膜由来の細胞、例えば、フィコール分離、示差的接着、又は両方の組合せによって単離された細胞を、蛍光活性化細胞選別機(FACS)を用いて選別することができる。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、粒子の蛍光特性に基づいて、細胞を含む粒子を分離する周知の方法である(Kamarchの文献(1987, Methods Enzymol, 151：150-165))。個々の粒子中の蛍光部分のレーザーによる励起によって、わずかな電荷が生じ、混合物からの陽性粒子及び陰性粒子の電磁分離が可能になる。一実施態様において、細胞表面マーカー特異的抗体又はリガンドを個別の蛍光標識で標識する。細胞をセルソーターに通して処理し、使用された抗体に結合するそれらの能力に基づく細胞の分離を可能にする。FACSで選別された粒子を96ウェル又は384ウェルプレートの個々のウェルに直接に堆積させて、分離及びクローニングをしやすくすることができる。
1つの選別スキームでは、胎盤由来の細胞、例えば羊膜由来接着細胞を、マーカーCD49f、VEGFR2/KDR、及び／又はFlt-1/VEGFR1の発現に基づいて選別する。好ましくは、該細胞は、例えば細胞試料中のRT-PCRによるOCT-4の発現の決定により、OCT-4-であると同定され、ここで該試料中の細胞が30サイクル後にOCT-4のmRNAの検出可能な生成を示すことができない場合に、該細胞はOCT-4-である。例えば、VEGFR2/KDR+及びVEGFR1/Flt-1+である羊膜由来の細胞は、VEGFR2/KDR-、及びVEGFR1/Flt-1+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上である細胞から選別することができる。具体的実施態様において、CD49f+、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及び／又はVE-カドヘリン-の1以上である羊膜由来の組織培養プラスチック-接着細胞、又はVEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である細胞は、そのようなマーカーの1以上を発現しない細胞から選別され、且つ選択される。別の具体的実施態様において、加えてCD31+、CD34+、CD45+、CD133-、及び／又はTie-2+の1以上、又は全てである、CD49f+、VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+細胞は、そのような特徴の1以上、又はいずれも示さない細胞から選別される。別の具体的実施態様において、加えてCD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及び／又はCXCR4-の1以上、又は全てである、VEGFR2/KDR+、VEGFR1/Flt-1+細胞は、そのような特徴の1以上、又はいずれも示さない細胞から選別される。
羊膜由来接着細胞の選択は、例えば、遠心分離又はフローサイトメトリーを使用する分離により、消化から生じた細胞懸濁液について、又は消化液から回収された単離された細胞について実行することができる。発現されたマーカーによる選択は、単独で、或いは例えば培養液中のそれらの接着特性を基に細胞を選択する手順と結びつけて、遂行することができる。例えば、接着選択は、マーカー発現を基に選別する前又は後に遂行することができる。
胎盤細胞の抗体-媒介検出及び選別に関して、特定のマーカーに特異的な任意の抗体を、細胞の検出及び選別(例えば蛍光活性化細胞選別)に適した発蛍光団又は他の標識と組合せて使用することができる。特異的マーカーへの抗体/発蛍光団組合せは、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)に複合されたCD105に対するモノクローナル抗体(R&D Systems社、ミネアポリス、MNから入手可能)；フィコエリトリン(PE)に複合されたCD200に対するモノクローナル抗体(BD Biosciences Pharmingen)；VEGFR2/KDR-ビオチン(CD309、Abcam社)などを含むが、これらに限定されるものではない。本明細書に明らかにされた任意のマーカーに対する抗体は、抗体の検出を促進する抗体の標準標識により標識することができ、これは例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン/ビオチン、アビジン/ビオチン、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリトリン(PE)、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み、並びに好適な放射性物質の例は、125I、131I、35S、又は3Hを含む。
羊膜由来接着細胞は、単独のマーカーに対する抗体により標識し、且つ単独マーカーを基に検出及び選別することができるか、又は複数の異なるマーカーに対する複数の抗体で同時に標識し、且つ複数のマーカーを基に選別することができる。
別の実施態様において、磁気ビーズを用いて細胞を分離する、例えば、本明細書記載の羊膜由来接着細胞を他の羊膜細胞から分離することができる。磁気ビーズ(直径0.5〜100μm)に結合するそれらの能力に基づいて粒子を分離する方法である、磁気活性化細胞選別(MACS)技術を用いて、該細胞を選別してもよい。特定の細胞表面分子又はハプテンを特異的に認識する抗体の共有結合的付加を含む、種々の有用な修飾を磁気ミクロスフェアに対して行なうことができる。その後、該ビーズを細胞と混合し、結合させておく。その後、細胞を磁場に通して、特異的細胞表面マーカーを有する細胞を分離する。一実施態様において、その後、これらの細胞を単離し、更なる細胞表面マーカーに対する抗体と結合した磁気ビーズと再び混合することができる。該細胞を再び磁場に通して、両方の抗体に結合した細胞を単離する。その後、そのような細胞を希釈して、別々の皿、例えば、クローン単離用のマイクロタイターディッシュに入れることができる。
羊膜由来接着細胞を、(生存を評価するための)トリパンブルー排出アッセイ、フルオレセインジアセテート取込みアッセイ、ヨウ化プロピジウム取込みアッセイ；及び、(増殖を評価するための)チミジン取込みアッセイ、MTT細胞増殖アッセイなどの、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて、生存能力、増殖能力、及び寿命について評価することができる。寿命は、延長された培養下での集団倍加の最大数を決定することなどの、当該技術分野で周知の方法によって測定してもよい。
(5.7 羊膜由来接着細胞の培養)
(5.7.1 培養培地)
単離された羊膜由来接着細胞、そのような細胞の集団を用いて、細胞培養物をイニシエートするか、又はそれを播種することができる。一般に、細胞を、コーティングされていないか、或いはラミニン、コラーゲン(例えば、天然物若しくは変性物)、ゼラチン、フィブロネクチン、オルニチン、ビトロネクチン、及び細胞外膜タンパク質(例えば、MATRIGEL（商標）(BD DiscoveryLabware社、ベッドフォード、MA))などの細胞外マトリクス若しくは生体分子でコーティングされているかのいずれかの滅菌組織培養容器に移す。
AMDACは、例えば、幹細胞の培養に適している培地において樹立することができる。樹立培地は、例えば、EGM-2培地(Lonza社)、DMEM＋10％FBS、又は60％DMEM-LG(Gibco社)、40％MCDB-201(Sigma社)、2％ウシ胎仔血清(FCS)(Hyclone Laboratories社)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)、1×リノール酸-ウシ-血清-アルブミン(LA-BSA)、10-9Mデキサメタゾン(Sigma社)、10-4Mアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)、上皮細胞増殖因子(EGF)10ng/ml(R&D Systems社)、血小板由来増殖因子(PDGF-BB)10ng/ml(R&D Systems社)、及び100Uペニシリン/1000Uストレプトマイシンを含む培地(本明細書において「標準培地」と称す)を含む。
羊膜由来接着細胞は、細胞、例えば接着性胎盤幹細胞の培養に許容し得るものとして当該技術分野で認識されている任意の培地中及び任意の条件下で培養することができる。該培養培地は血清を含むことが好ましい。様々な実施態様において、AMDACの培養又は継代培養のための培地としては、STEMPRO(登録商標)(Invitrogen社)、MSCM-sf(ScienCell社、カールスバッド、CA)、MESENCULT(登録商標)-ACF培地(StemCell Technologies社、バンクーバー、カナダ)、標準培地、EGF非含有標準培地、PDGF非含有標準培地、DMEM＋10％FBS、EGM-2(Lonza社)、EGM-2MV(Lonza社)、2％、10％及び20％ES培地、ES-SSR培地、又はα-MEM-20％FBSを含む。羊膜由来接着細胞の培養に許容し得る培地は、例えば、DMEM、IMDM、DMEM(高グルコース又は低グルコース)、イーグルの基本培地、ハムのF10培地(F10)、ハムのF-12培地(F12)、イスコフの改変ダルベッコ培地、間葉系幹細胞成長培地(MSCGM、Lonza社)、ADVANCESTEM(商標)培地(Hyclone社)、KNOCKOUT(商標)DMEM(Invitrogen社)、ライボヴィッツのL-15培地、MCDB、DMEM／F12、RPMI1640、改良DMEM(Gibco社)、DMEM／MCDB201(Sigma社)、及びCELL-GROFREEなどが挙げられる。様々な実施態様において、例えば、ITS(インスリン-トランスフェリン-セレン)、LA＋BSA(リノール酸-ウシ血清アルブミン)、デキストロース、L-アスコルビン酸、PDGF、EGF、IGF-1、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むDMEM-LG(ダルベッコの改変必須培地、低グルコース)／MCDB 201(ニワトリ線維芽細胞基本培地)；約2〜約20％、例えば約10％ウシ胎仔血清(FBS；例えば、限定ウシ胎仔血清、Hyclone社、ローガン、UT)を含むDMEM-HG(高グルコース)；約2〜約20％、例えば約15％FBSを含むDMEM-HG；約2〜約20％、例えば約10％FBS、約2〜約20％、例えば約10％ウマ血清、及びヒドロコルチゾンを含むIMDM(イスコフの改変ダルベッコ培地)；約2〜約20％、例えば約10％FBS、EGF、及びヘパリンを含むM199；約2〜約20％、例えば約10％FBS、GlutaMax(商標)、及びゲンタマイシンを含むα-MEM(最小必須培地)；10％FBS、GlutaMax(商標)、及びゲンタマイシンを含むDMEM；約2〜約20％、例えば約15％(v/v)ウシ胎仔血清(例えば、限定ウシ胎仔血清、Hyclone社、ローガン、UT)、抗生物質／抗真菌剤(例えばペニシリン約100ユニット/mL、ストレプトマイシン100μg/mL、及び／又はアンホテリシンBの0.25μg/mL(Invitrogen社、カールスバッド、CA))、及び0.001％(v/v)β-メルカプトエタノール(Sigma社、セントルイス、MO)を含有するDMEM-LG；2〜20％FBS、非必須アミノ酸(Invitrogen社)、β-メルカプトエタノールを補充した、KNOCKOUT(商標)-DMEM基本培地；KNOCKOUT(商標)血清代替品を補充した、KNOCKOUT(商標)基本培地；2〜20％FBSを含有するα-MEM；EGF、VEGF、bFGF、R3-IGF-1、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、アスコルビン酸、FBS、ゲンタマイシンを補充したEBM2(商標)基本培地などが挙げられる。
培養培地には、例えば、血清(例えば、FCS又はFBS、例えば約2〜20％(v/v)；ウマ科(ウマ)血清(ES)；ヒト血清(HS))；β-メルカプトエタノール(BME)、好ましくは、約0.001％(v/v)；1種以上の増殖因子、例えば、血小板由来増殖因子(PDGF)、上皮増殖因子(EGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、インスリン様増殖因子-1(IGF-1)、白血病抑制因子(LIF)、血管内皮増殖因子(VEGF)、及びエリスロポエチン(EPO)；L-バリンを含むアミノ酸；並びに例えば、単独の又は組合せた、ペニシリンG、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンB、ゲンタマイシン、及びナイスタチンなどの、微生物汚染を防除するための1種以上の抗生物質及び／又は抗真菌剤を含む1種以上の成分を補充することができる。
羊膜由来接着細胞(AMDAC)は、例えば、組織培養皿又はマルチウェルプレートにおいて、標準の組織培養条件で培養することができる。細胞はまた、ハンギングドロップ法を用いて、培養することができる。この方法において、細胞は、培地約5mL中に、約1×104個細胞/mLで懸濁され、且つ該培地の1滴以上が、組織培養容器、例えば100mLのペトリ皿の蓋の内側に垂らされる。この液滴は、例えば、単独の液滴、又は例えばマルチチャネルピペットからの複数の液滴であることができる。蓋を慎重に裏返し、且つ例えば、皿の大気中の含水量を維持するのに十分な量の滅菌PBSなどの液体量を含む皿の底面上に配置し、且つ細胞を培養する。AMDACはまた、T-フラスコ、Corning社HYPERFLASK(登録商標)、Cell Factories(Nunc)、1-、2-、4-、10-又は40-トレー細胞スタックなどの、標準又はハイボリューム又はハイスループット培養システムにおいても培養することができる。
一実施態様において、羊膜由来接着細胞は、該細胞の未分化表現型を維持するように作用する化合物の存在下で培養される。具体的実施態様において、該化合物は、置換3,4-ジヒドロピリジモル[4,5-d]ピリミジンである。より具体的な実施態様において、該化合物は下記化学構造を有する化合物である：
Figure 2014507389
 。
本化合物は、羊膜由来接着細胞、又はそのような細胞の集団と、例えば、約1μM〜約10μMの濃度で、接触することができる。
(5.7.2 羊膜由来接着細胞の拡大及び増殖)
一旦単離された羊膜由来接着細胞、又は単離されたそのような細胞の集団(例えば、該細胞又は細胞集団が通常インビボで関連している羊膜細胞の少なくとも50％から分離されている、羊膜由来接着細胞又はそのような細胞の集団)、該細胞は、インビトロで増殖させ、拡大することができる。例えば、接着細胞又は羊膜由来接着細胞の集団を、組織培養容器、例えば、皿、フラスコ、マルチウェルプレートなどの中で、40〜70％コンフルエンスになるまで、すなわち、該細胞及びその子孫が、組織培養容器の培養表面積の40〜70％を占めるまで、該細胞が増殖するのに十分な時間、培養することができる。
羊膜由来接着細胞は、細胞成長を可能にする密度で培養容器中に播種することができる。例えば、該細胞を、低密度(例えば約400〜約6,000個細胞/cm2)から高密度(例えば約20,000個細胞/cm2以上)で播種してもよい。好ましい実施態様において、該細胞を、大気中、約0％〜約5容積％のCO2の存在下で培養する。いくつかの好ましい実施態様において、該細胞を、大気中約0.1％〜約25％のO2、好ましくは、大気中約5％〜約20％のO2で培養する。該細胞を、約25℃〜約40℃、好ましくは約37℃で培養することが好ましい。
該細胞をインキュベーター内で培養することが好ましい。培養時に、培養培地は、静止状態とするか、又は例えば、バイオリアクターを用いて培養時に撹拌することができる。羊膜由来接着細胞を(例えば、グルタチオン、アスコルビン酸、カタラーゼ、トコフェロール、N-アセチルシステインなどの添加により)低酸化ストレス下で成長させることが好ましい。
該細胞はコンフルエンスまで成長することができるが、細胞はコンフルエンスまで成長しないことが好ましい。例えば、一旦40％〜70％のコンフルエンスが得られれば、細胞を継代してもよい。例えば、該細胞を、当該技術分野で周知の技術を用いて酵素的に処理し、例えばトリプシン処理し、それらを組織培養表面から分離することができる。該細胞をピペッティングで取り除き、該細胞を計数した後、約20,000〜100,000個の細胞、好ましくは約50,000個の細胞、又は約400〜約6,000個細胞/cm2の細胞を、新鮮な培養培地を含む新しい培養容器に継代することができる。典型的には、新しい培地は、該細胞が取り除かれた培地と同じ種類である。羊膜由来接着細胞は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19若しくは20回、又はそれよりも多く継代することができる。AMDACは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49若しくは少なくとも50回、又はそれよりも多く、培養物において倍加することができる。
(5.8 羊膜由来接着細胞を含有する組成物)
(5.8.1 羊膜由来接着細胞を含有する医薬組成物)
特定の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、医薬組成物内に含まれるか、又は医薬組成物の成分である。該細胞は、個体に容易に投与することができる形態、例えば医療用途に好適な容器中に含まれる羊膜由来接着細胞で調製することができる。そのような容器は、例えば、注射器、滅菌プラスチックバッグ、バイアル、フラスコ、瓶、又は羊膜由来接着細胞集団を容易に分注することができる他の容器であることができる。例えば、該容器は、血液バッグ又はレシピエントへの液体の静脈内投与に好適な他のプラスチック製の医療用に許容し得るバッグであることができる。容器は、特定の実施態様において、該細胞を凍結保存することができるものである。本明細書で提供される該組成物、例えば医薬組成物中の細胞は、単一のドナー、又は複数のドナーに由来する羊膜由来接着細胞を含むことができる。該細胞は、意図されるレシピエントと完全にHLAが一致するものであることができるか、又は一部若しくは完全にHLAが一致しないものであることができる。
従って、一実施態様において、本明細書に提供される組成物中の羊膜由来接着細胞は、容器中に羊膜由来接着細胞を含む組成物の形態で、それを必要とする個体に投与される。別の具体的実施態様において、容器は、バッグ、フラスコ、バイアル、又は瓶である。より具体的実施態様において、該バッグは、滅菌プラスチックバッグである。より具体的実施態様において、該バッグは、該接着細胞の静脈内投与、例えば静脈内注入、ボーラス注射などに好適であるか、これを可能にするか、又はこれを容易にする。該バッグは、投与の前又は投与の間に、該細胞と1種以上の他の溶液、例えば、薬物との混合を可能にするために相互接続されている複数の管腔又は区画を含むことができる。別の具体的実施態様において、凍結保存前に、羊膜由来接着細胞を含む溶液は、該細胞の凍結保存を容易にする1種以上の化合物を含む。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、生理的に許容し得る水溶液に含まれている。より具体的実施態様において、該生理的に許容し得る水溶液は、0.9％NaCl溶液である。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、該細胞のレシピエントとHLAが一致する細胞を含む。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、該細胞のレシピエントと少なくとも一部HLAが一致しない細胞を含む。別の具体的実施態様において、該羊膜由来接着細胞は、複数のドナーに由来する。様々な具体的実施態様において、該容器は、約、少なくとも、又は多くとも1×106個の該細胞、5×106個の該細胞、1×107個の該幹細胞、5×107個の該細胞、1×108個の該細胞、5×108個の該細胞、1×109個の該細胞、5×109個の該細胞、1×1010個、又は1×1011個の該細胞を含む。前述の凍結保存された集団のいずれか他の具体的実施態様において、該細胞は、約、少なくとも、又は多くとも5回、多くとも10回、多くとも15回、又は多くとも20回継代されている。前述の凍結保存された細胞のいずれか別の具体的実施態様において、該細胞は、該容器内で拡大されている。具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞の単一の単位投与量は、様々な実施態様において、約、少なくとも、又は多くとも1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多い羊膜由来接着細胞を含むことができる。
特定の実施態様において、本明細書に提供される医薬組成物は、50％以上の生存細胞を含む羊膜由来接着細胞の集団を含む(すなわち、該集団内の細胞の少なくとも50％は機能的であるか、又は生存している)。好ましくは、該集団内の細胞の少なくとも60％が生存している。より好ましくは、該医薬組成物中の該集団内の細胞の少なくとも70％、80％、90％、95％、又は99％が生存している。
(5.8.2 羊膜由来接着細胞を含むマトリクス)
マトリクス、ヒドロゲル、スキャフォールドなどを含む組成物が本明細書で更に提供される。そのような組成物は、液体懸濁液中のそのような細胞の代わりに、又は細胞に加えて使用することができる。
該マトリクスは、例えば、恒久的又は分解性の脱細胞性組織、例えば脱細胞化された羊膜の膜、又は合成マトリクスである。該マトリクスは、三次元スキャフォールドであることができる。より具体的実施態様において、該マトリクスは、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、フィブロネクチン、ペクチン、オルニチン、又はビトロネクチンを含む。別のより具体的実施態様において、マトリクスは、羊膜の膜又は羊膜の膜由来の生体材料である。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、細胞外膜タンパク質を含む。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、合成化合物を含む。別のより具体的実施態様において、該マトリクスは、生体活性化合物を含む。別のより具体的実施態様において、該生体活性化合物は、増殖因子、サイトカイン、抗体、又は5,000ダルトン未満の有機分子である。
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を、天然マトリクス、例えば、羊膜の膜材料などの胎盤生体材料に播種することができる。そのような羊膜の膜材料は、例えば、哺乳動物の胎盤から直接解剖された羊膜の膜；固定又は熱処理された羊膜の膜、実質的に乾燥している(すなわち、＜20％H2Oの)羊膜の膜、絨毛膜、実質的に乾燥している絨毛膜、実質的に乾燥している羊膜の膜と絨毛膜などであることができる。その上に本明細書に提供される羊膜由来接着細胞を播種することができる好ましい胎盤生体材料は、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、Haririの米国特許出願公開第2004/0048796号に記載されている。
別の具体的実施態様において、該マトリクスは、細胞外マトリクスを含む組成物である。より具体的実施態様において、該組成物は、MATRIGEL(商標)(BD Biosciences社)である。
本明細書記載の単離された羊膜由来接着細胞を、例えば、注射に好適なヒドロゲル溶液に懸濁することができる。ヒドロゲルは、例えば、共有結合、イオン結合、又は水素結合によって架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する3次元開放格子構造を作製する有機ポリマー(天然物又は合成物)である。そのような組成物のための好適なヒドロゲルは、RAD16などの自己集合ペプチドを含む。一実施態様において、該細胞を含むヒドロゲル溶液を、例えば、鋳型中で硬化させて、その中に分散した細胞を有する埋め込み用のマトリクスを形成させることができる。そのようなマトリクス中の羊膜由来接着細胞を、該細胞が埋め込み前に有糸分裂で拡大されるように培養することもできる。ヒドロゲル形成材料としては、イオンによって架橋される、アルギネート及びその塩などの多糖類、ペプチド、ポリホスファジン、並びにポリアクリレート、又はそれぞれ、温度若しくはpHによって架橋される、ポリエチレンオキシド-ポリプロピレングリコールブロックコポリマーなどのブロックポリマーが挙げられる。いくつかの実施態様において、ヒドロゲル又はマトリクスは生体分解性である。
特定の実施態様において、本明細書に提供される細胞を含有する組成物は、インサイチュで重合可能なゲルを含む(例えば、米国特許出願公開第2002/0022676号；Ansethらの文献(J. Control Release, 78(1-3): 199-209(2002))；Wangらの文献(Biomaterials, 24(22): 3969-80(2003))を参照されたい)。いくつかの実施態様において、該ポリマーは、荷電側基、又はその一価イオン塩を有する水、緩衝塩溶液、又は水性アルコール溶液などの水溶液に少なくとも一部溶ける。カチオンと反応させることができる酸性側基を有するポリマーの例は、ポリ(ホスファゼン)、ポリ(アクリル酸)、ポリ(メタクリル酸)、アクリル酸とメタクリル酸のコポリマー、ポリ(酢酸ビニル)、及びスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸又はメタクリル酸とビニルエーテルモノマー又はビニルエーテルポリマーの反応によって形成される酸性側基を有するコポリマーを用いることもできる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化(好ましくは、フッ素化)アルコール基、フェノール性OH基、及び酸性OH基である。
具体的実施態様において、マトリクスは、例えば、PGA、PLA、PCLコポリマー若しくはブレンド、又はヒアルロン酸などの生体吸収性材料で製造されたマルチフィラメント糸で構成されるフェルトである。この糸は、クリンピング、カッティング、カーディング及びニードリングからなる、標準の織物処理技術を用いフェルトにされる。別の好ましい実施態様において、本発明の細胞は、複合構造であることができる、発泡体スキャフォールド上に播種される。加えて、3次元フレームワークを、修復、交換又は増強すべき体内の特定の構造物などの、有用な形状に成形することができる。他の使用することができるスキャフォールドの例としては、不織マット、多孔性発泡体、又は自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、グリコール酸と乳酸の吸収性合成コポリマー(例えば、PGA／PLA)(VICRYL、Ethicon社、ソマービル、NJ)から構成される繊維を用いて形成させることができる。フリーズドライ、又は凍結乾燥などのプロセスによって形成される、例えば、ポリ(ε-カプロラクトン)／ポリ(グリコール酸)(PCL／PGA)コポリマーから構成される発泡体(例えば、米国特許第6,355,699号参照)をスキャフォールドとして用いることもできる。
本明細書記載の羊膜由来接着細胞を、3次元フレームワーク又はスキャフォールドに播種し、インビボにおいて埋め込むことができる。そのようなフレームワークを、組織形成、例えば骨形成又は脈管形成などを刺激する、任意の1種以上の増殖因子、細胞、薬物又は他の成分と組合せて埋め込むことができる。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、別の実施態様において、複合構造物であり得る発泡体スキャフォールドに播種することができる。そのような発泡体スキャフォールドを、有用な形状、例えば、修復、交換又は増強すべき体内の特定の構造物の一部の形状に成形することができる。いくつかの実施態様において、フレームワークを、例えば、0.1M酢酸で処理し、その後、細胞接着を強化するために、細胞の接種前に、ポリリジン、PBS、及び／又はコラーゲン中でインキュベートする。例えば、マトリクスのプラズマ-コーティング、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸)、細胞マトリクス、並びに／又は限定するものではないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどのような他の材料の添加によって、マトリクスの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができる。
いくつかの実施態様において、マトリクスは、それを非血栓形成性にする材料を含むか、又は該材料で処理される。これらの処理及び材料は、内皮成長、移動、及び細胞外マトリクス沈着を促進し、且つ持続させることもできる。これらの材料及び処理の例としては、天然材料、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、例えば、EPTFE、並びにセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社、バークレー、CA)が挙げられるが、これらに限定されない。マトリクスは、ヘパリンなどの抗血栓剤を含むこともでき；本明細書に提供される接着細胞の播種の前に、スキャフォールドを、表面電荷を変化させるように処理する(例えば、プラズマでコーティングする)こともできる。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の接種前に、フレームワークを処理し、細胞接着を増強することができる。例えば、本発明の細胞の接種前に、ナイロンマトリクスを、0.1モル酢酸で処理し、ポリリジン、PBS、及び／又はコラーゲン中でインキュベーションし、ナイロンをコーティングする。ポリスチレンは、硫酸を用い、同様に処理することができる。
加えて、例えば、フレームワークのプラズマ-コーティング、又は1種以上のタンパク質(例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維)、糖タンパク質、グリコサミノグリカン(例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン-4-硫酸、コンドロイチン-6-硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸)、細胞マトリクス、並びに／又は限定するものではないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロース、及び植物ゴムなどのような他の材料の添加によって、三次元フレームワークの外部表面を修飾し、細胞の接着又は成長、及び組織の分化を改善することができる。
いくつかの実施態様において、マトリクスは、それを非血栓形成性にする材料、例えば、天然材料、例えば、ラミニン及びIV型コラーゲンなどの基底膜タンパク質、合成材料、例えば、ePTFE又はセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン、例えば、PURSPAN(商標)(The Polymer Technology Group社、バークレー、CA)などを含むか、又は該材料で処理される。そのような材料は、スキャフォールドを非血栓形成性にするために例えばヘパリンにより、並びにプラズマでコーティングなど、材料の表面電荷を変化させる処理を更に施すことができる。
羊膜由来接着細胞を含有する治療用細胞組成物はまた、マトリクス-細胞複合体の形状で提供することができる。マトリクスは、生体吸収性であるかどうかにかかわらず、生体適合性スキャフォールド、格子、自己集合構造などの、液体、ゲル又は固形物を含むことができる。そのようなマトリクスは、治療用細胞処理、外科的修復、組織工学、及び創傷治癒の分野において公知である。特定の実施態様において、該細胞は、マトリクスに接着する。他の実施態様において、該細胞は、マトリクス空間内に捕捉されるか又は含まれる。その中で細胞がマトリクスと密接に関連して成長し、且つ治療に使用される場合、レシピエントの細胞の内方成長を刺激し且つ支援するそのようなマトリクス-細胞複合体が、最も好ましい。該マトリクス-細胞組成物は、限定するものではないが、埋め込み、注射、外科的接着、他の組織との移植、注入などを含む、任意の当該技術分野において公知の方法により、個体の体内に導入することができる。いくつかの実施態様において、マトリクスは、インビボ、又はインサイチュにおいて形成される。例えば、インサイチュで重合可能なゲルを、本発明に従い使用することができる。そのようなゲルの例は、当該技術分野において公知である。
いくつかの実施態様において、本明細書に提供される細胞は、スキャフォールドなどの三次元マトリクス上に播種され、且つインビボで埋め込まれ、そこで播種された細胞は、フレームワーク上若しくは中で増殖するか、又は他の細胞と共同して若しくは共同せずにインビボにおいて組織の交換を確立することを補助する。三次元フレームワーク上での羊膜由来接着細胞又はそれらの共培養物の成長は、インビボにおいて、例えば、損傷した若しくは罹患した組織の修復のために、利用することができる、三次元組織又はそれらの基礎の形成を生じることが好ましい。例としては、三次元スキャフォールドは、例えば血管修復において使用するために；又は、循環系若しくは冠血管構造の態様で、管状構造を形成するために使用することができる。本発明の一態様に従い、羊膜由来接着細胞又はその共培養物を、接種し、スキャフォールド、発泡体又はヒドロゲルなどの、三次元フレームワーク又はマトリクス上に播種する。フレームワークは、概して平たい、一般に円筒状又は管状などの様々な形状に形作ることができるか、又は考慮される補正構造(corrective structure)のために必要であるか若しくは望ましい完全に自由な形状であることができる。いくつかの実施態様において、羊膜由来接着細胞は、三次元構造上で成長するのに対し、他の実施態様においては、該細胞は、単に生存するか、又は死滅さえするが、レシピエントにおける新たな組織の内方成長又は血管新生を刺激若しくは促進する。
本発明の細胞は、培養時は自由に成長させ、培養物から除去し、且つ三次元フレームワーク上に接種することができる。三次元フレームワークの、例えば約106〜5×107個細胞/mLの濃度の細胞による接種は、好ましくは比較的短い期間での、三次元支持体の樹立を生じる。更にいくつかの適用において、望ましい結果に応じて、より多い又はより少ない数の細胞を使用することが好ましい。
具体的実施態様において、マトリクスは、その幅が、それが最終的に挿入される管状臓器の内周とほぼ等しい小片(例えば、長方形の形状)に切断することができる。羊膜由来接着細胞は、スキャフォールド上に接種され、且つ液体培地中で浮遊又は懸濁することによりインキュベーションされる。適切なコンフルエンス段階で、該スキャフォールドを、長い端を一緒に合わせることにより、チューブに巻き上げる。その後継ぎ目を、適当な直径の好適な材料の糸を用い、2つの端を一緒に縫合することにより閉鎖することができる。細胞が管腔を閉塞しないように、該管状フレームワークの開放端の一方に、ノズルを取り付けることができる。液体培地を、インキュベーションチャンバーに接続された供給チャンバーからノズルを通して強制的に流し、管状フレームワークの内部を通る流れを作り出すことができる。他方の開放端を、回収チャンバーに繋がる流出口に取り付け、回収チャンバーから供給チャンバーを通って培地は再循環することができる。インキュベーションが完了したら、チューブを、ノズル及び流出口から取り外す。例えば、国際出願WO 94/25584を参照されたい。
一般に、下記の方法のいずれかを用い、本発明のチューブへと2つの三次元フレームワークを一緒にすることができる。2つ以上の平らなフレームワークを、他方の表面に乗せ、且つ一緒に縫合する。得られる2層シートを次に、前述のように巻き上げ、一緒に合わせ、縫合する。特定の実施態様において、内側層として働く1つの管状スキャフォールドに、羊膜由来接着細胞を接種し、インキュベーションすることができる。第二のスキャフォールドを、該管状フレームワークの外周よりもわずかに大きい幅を持つ平坦な小片として成長させることができる。適切な成長に到達した後、該平坦なフレームワークで管状スキャフォールドの外側を包み、引き続き平坦なフレームワークの2つの端の継ぎ目を閉鎖し、平坦なフレームワークを内側チューブに縫合する。別の実施態様において、わずかに異なる直径の2つ以上の管状メッシュを、個別に成長させる。より小さい直径を持つフレームワークを、より大きいものの内側に挿入し、縫合する。これらの各方法について、この二重層のチューブに該方法を再度適用することにより、より多くの層を追加することができる。該スキャフォールドは、羊膜由来接着細胞の任意の成長段階で一緒にすることができ、且つ一緒にしたスキャフォールドのインキュベーションを、望ましい場合は継続することができる。
上記と組合せて、本明細書に提供される細胞及び治療用組成物は、埋め込み可能な装置と組合せて使用することができる。例えば羊膜由来接着細胞を、例えば、ステント、人工弁、心室補助装置、Guglielmi取り外し可能なコイルなどと共に施すことができる。これらの装置はそのような治療を必要とする個体に提供される主要な治療を構成しているので、該細胞などは、埋め込まれた装置の領域での適切な治癒を補助するか、刺激するか、又は促進する補助的又は二次的治療として使用することができる。本発明の細胞及び治療組成物を使用し、特定の埋め込み可能な装置をインビボにおいて使用した際の問題点を最小化するために、装置を前処理することができる。コーティングされた装置を含む、そのような前処理された装置は、それらを受け取る患者による忍容性がより優れ、局所又は全身の感染症、又は例えば血管の再狭窄若しくは更なる閉塞のリスクを減らす。
(5.8.3 羊膜由来接着細胞により馴化された培地)
羊膜由来接着細胞により馴化されている培地、すなわち、接着細胞により分泌又は排出された1以上の生体分子を含有する培地が、更に本明細書において提供される。様々な実施態様において、馴化培地は、その中で該細胞が少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14日間若しくはそれ以上成長している培地、又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、若しくは20若しくはそれ以上集団倍加している培地を含む。他の実施態様において、馴化培地は、その中で羊膜由来接着細胞が少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％コンフルエンス、又は最大100％コンフルエンスまで成長している培地を含む。そのような馴化培地を使用し、例えば幹細胞、例えば胎盤幹細胞、胚性幹細胞、胚性生殖細胞、成体幹細胞などの細胞の集団の培養を支援することができる。別の実施態様において、馴化培地は、その中で羊膜由来接着細胞、及び羊膜由来接着細胞でない細胞が一緒に培養されている培地を含む。
馴化培地は、本明細書に提供された接着細胞を含むことができる。従って、羊膜由来接着細胞を含む細胞培養物が、本明細書において提供される。具体的実施態様において、馴化培地は、複数の羊膜由来接着細胞、例えば羊膜由来接着細胞の集団を含む。
馴化培地は、当該技術分野において公知の方法を使用し細胞培養物から回収され、且つ濾過及び／又は滅菌され、例えば馴化培地は、小さい細孔のフィルター(例えば0.22μMフィルター)を通り濾過される可能性のある夾雑物の活性を中和し、夾雑物を除去するよう、滅菌することができる。いくつかの実施態様において、馴化培地は、本明細書に提供される治療方法において、回収及び滅菌／濾過後直ちに使用することができる。他の実施態様において、馴化培地は、本明細書に提供される治療方法において、凍結し、及び後続の使用のために貯蔵することができる。
(5.9 羊膜由来接着細胞の保存)
羊膜由来接着細胞を、例えば、回収時若しくは本明細書記載の組成物の製造前に、例えば、本明細書記載の方法を用い、保存することができ、すなわち、長期保存を可能にする条件下、又は例えば、アポトーシス若しくは壊死による細胞死を阻害する条件下に置くことができる。
羊膜由来接着細胞を、例えば、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれている、米国特許出願公開第2007/0190042号に記載されている、アポトーシス阻害剤、壊死阻害剤、及び／又は酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む組成物を用いて保存することができる。一実施態様において、そのような細胞、又はそのような細胞の集団を、アポトーシスの阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む細胞回収組成物と接触させることを含む、該細胞又は細胞集団を保存する方法が、本明細書に提供され、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞集団と比較したとき、該細胞集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。具体的実施態様において、該アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である。別の具体的実施態様において、該アポトーシスの阻害剤はJNK阻害剤である。より具体的実施態様において、該JNK阻害剤は、羊膜由来接着細胞の分化又は増殖を調節しない。別の実施態様において、該細胞回収組成物は、分離相中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、該細胞回収組成物は、エマルジョン中に該アポトーシスの阻害剤及び該酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。別の実施態様において、細胞回収組成物は加えて、乳化剤、例えば、レシチンを含む。別の実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該細胞と接触させるときに、約0℃〜約25℃である。別のより具体的実施態様において、該アポトーシス阻害剤及び該ペルフルオロカーボンは、該細胞と接触させるときに、約2℃〜10℃、又は約2℃〜約5℃である。別のより具体的実施態様において、該接触させることは、該細胞集団の輸送の間に行なわれる。別のより具体的実施態様において、該接触させることは、該細胞集団の凍結及び解凍の間に行なわれる。
羊膜由来接着細胞の集団を、該細胞の集団をアポトーシスの阻害剤及び臓器保存化合物と接触させることを含む方法によって保存することができ、ここで、該アポトーシスの阻害剤は、該アポトーシスの阻害剤と接触していない細胞集団と比較したとき、該細胞集団のアポトーシスを低下させるか又は防止するのに十分な量及び時間で存在する。具体的実施態様において、臓器保存化合物は、UW溶液(米国特許第4,798,824号に記載されており；ViaSpanとしても知られているもの；Southardらの文献(Transplantation 49(2)：251-257(1990))も参照されたい)、又はSternらの米国特許第5,552,267号に記載されている溶液である。別の実施態様において、該臓器保存化合物は、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトビオン酸、ラフィノース、又はそれらの組合せである。別の実施態様において、細胞回収組成物は加えて、2相状態にあるか又はエマルジョンとしてかのいずれかの酸素運搬ペルフルオロカーボンを含む。
本方法の別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を、組織破壊プロセスの間に、例えば、羊膜組織の酵素的消化の間に、アポトーシス阻害剤及び酸素運搬ペルフルオロカーボン、臓器保存化合物、又はそれらの組合せを含む細胞回収組成物と接触させる。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞を、組織破壊、例えば、羊膜組織の酵素的消化による回収の後に、該細胞回収化合物と接触させる。
典型的には、羊膜由来接着細胞の回収、濃縮、及び単離時に、低酸素ストレス及び機械的ストレスによる細胞ストレスを最小限に抑えるか、又はそれらを排除することが好ましい。本方法の別の実施態様において、それゆえ、羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞を含む細胞集団は、回収、濃縮、又は単離時に、該保存時に6時間未満の間、低酸素状態に曝され、ここで、低酸素状態は、例えば、通常の大気酸素濃度を下回る；正常な血中酸素濃度を下回る；などの酸素濃度である。より具体的実施態様において、該細胞又は該細胞の集団は、該保存時に2時間未満の間、該低酸素状態に曝される。別のより具体的実施態様において、該細胞又は該細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、1時間未満、若しくは30分未満の間、該低酸素状態に曝されるか、又は低酸素状態に曝されない。別の具体的実施態様において、該細胞の集団は、回収、濃縮、又は単離時に、剪断ストレスに曝されない。
羊膜由来接着細胞を、一般に、又は本明細書に明らかにされた具体的方法により、例えば、小型の容器、例えばアンプル中の凍結保存培地に入れて凍結保存することができる。好適な凍結保存培地としては、例えば、成長培地、又は細胞凍結培地、例えば、市販の細胞凍結培地、例えば、SigmaAldrich社カタログ番号C2695、C2639(細胞凍結培地-無血清1×、DMSO非含有)、若しくはC6039(細胞凍結培地-グリセロール1×含有最小必須培地、グリセロール、ウシ胎仔血清及びウシ血清)により確定される細胞凍結培地、Lonza ProFreeze(商標)2×培地、メチルセルロース、デキストラン、ヒト血清アルブミン、ウシ(bovine)胎仔血清、ウシ(calf)胎仔血清、又はPlasmalyteをはじめとする培養培地が挙げられるが、これらに限定されない。凍結保存培地は、任意にウシ胎仔血清又はヒト血清を含む、例えば約1％〜約20％、例えば約5％〜10％(v/v)の濃度のDMSO(ジメチルスルホキシド)又はグリセロールを含むことが好ましい。凍結保存培地は、例えば、グリセロールを含むか又は含まずに、例えばメチルセルロースなどの追加の物質を含んでいてもよい。単離された羊膜由来接着細胞を、凍結保存時に、約1℃／分で冷却することが好ましい。好ましい凍結保存温度は、約-80℃〜約-180℃、好ましくは約-125℃〜約-140℃である。凍結保存された細胞を液体窒素の蒸気相に移した後、使用のために解凍することができる。いくつかの実施態様において、例えば、一旦アンプルが約-80℃に達したら、それを液体窒素保存領域に移す。凍結保存は、制御された速度のフリーザーを用いて行うこともできる。凍結保存された細胞は、約25℃〜約40℃、好ましくは約37℃の温度で解凍することが好ましい。
(5.10 改変された羊膜由来接着細胞)
(5.10.1 遺伝子改変された羊膜由来接着細胞)
別の態様において、本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、例えば関心対象の核酸若しくはポリペプチドを生成するように、又は例えば、関心対象の核酸若しくはポリペプチドを生成する骨形成性細胞、筋原性細胞、周皮細胞、若しくは血管新生細胞などの分化された細胞を生成するように、遺伝子改変されることができる。遺伝子改変は、例えば、限定するものではないが、例えば、パピローマウイルスベクター、SV40ベクター、アデノウイルスベクターなどの非組込み複製ベクター；例えば、レトロウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクターなどの組込みウイルスベクター；又は、複製欠損ウイルスベクターを含む、ウイルス-ベースのベクターを用い、達成することができる。DNAを細胞へ導入する他の方法は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、粒子銃、直接DNA注入などを含む。
本明細書に提供される接着細胞は、例えば、プロモーター配列若しくはエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、配列内リボソーム進入部位などの、1以上の好適な発現制御エレメントにより制御された又はそれとの機能的に関連して制御されたDNAにより形質転換又はトランスフェクトされ得る。そのようなDNAは、選択マーカーを組込んでいることが好ましい。外来DNAの導入後、操作された接着細胞を、例えば、強化培地において成長させ、その後選択培地に交換することができる。一実施態様において、羊膜由来接着細胞を操作するために使用したDNAは、例えば、サイトカイン、増殖因子、分化物質、又は治療的ポリペプチドなどの、関心対象のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む。
接着細胞を操作するために使用するDNAは、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞におけるヌクレオチド配列の発現を駆動するために、当該技術分野において公知の任意のプロモーターを含むことができる。例えばプロモーターとしては、CMVプロモーター/エンハンサー、SV40プロモーター、パピローマウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルスプロモーター、エラスチン遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。具体的実施態様において、該プロモーターは、該ヌクレオチド配列が、望ましい時のみに発現されるように、調節可能である。プロモーターは、誘導性(例えば、メタロチオネイン及びヒートショックタンパク質に関連したもの)又は構成性のいずれかであることができる。
別の具体的実施態様において、プロモーターは、組織-特異的であるか、又は組織特異性を示す。そのようなプロモーターの例としては、ミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Shaniの文献、1985、Nature 314:283)(骨格筋)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書に開示される羊膜由来接着細胞は、そのような細胞の1種以上の遺伝子を「ノックアウト」又は「ノックダウン」発現するように操作又は選択してよい。細胞に本来備わる遺伝子の発現は、例えば、相同組換えなどによる完全な遺伝子の失活による、発現の阻害により、低下することができる。一実施態様において、例えば、タンパク質の重要な領域をコードしているエキソン、又はその領域に対するエキソン5'は、例えば、正常なmRNAの標的遺伝子からの生成を妨害し且つ該遺伝子の失活を生じるneoなどの、陽性選択マーカーにより妨害される。遺伝子はまた、遺伝子の一部の欠失を作製することによるか、又は全遺伝子を欠失することにより、失活することもできる。該ゲノム内で遠く離れた標的遺伝子と相同な2つの領域を伴う構築体を用いることにより、これら2つの領域に介在する配列を欠失することができる(Mombaertsらの文献、1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88:3084)。標的遺伝子の発現を阻害するアンチセンス、モルホリノ、DNAzyme、低分子干渉RNA、ショートヘアピンRNA、及びリボザイム分子もまた、該接着細胞における標的遺伝子活性のレベルを低下するために使用することができる。例えば、主要組織適合性遺伝子複合体(HLA)の発現を阻害するアンチセンスRNA分子は、免疫反応に関して最も汎用性がある(versatile)ことが示されている。3本鎖分子を、標的遺伝子活性のレベルの低下に利用することができる。例えば、引用により本明細書中に組み込まれている、L. G. Davisら編集の文献、「分子生物学における基本的方法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)」、第2版、1994年、Appleton & Lange社、ノーウォーク、CNを参照されたい。
具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞は、関心対象のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子により遺伝子改変することができ、ここで関心対象のポリペプチドの発現は、外因性因子、例えば、ポリペプチド、小型有機分子などにより制御可能である。関心対象のポリペプチドは、治療用ポリペプチドであることができる。より具体的実施態様において、関心対象のポリペプチドは、IL-12又はインターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)である。別のより具体的実施態様において、関心対象のポリペプチドは、インターロイキン-1受容体アンタゴニストとジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)の融合物であり、且つ該外因性因子は、葉酸代謝拮抗物質、例えばメトトレキセートである。そのような構築体は、メトトレキセートとの接触時に、IL-1Ra、又はIL-1RaとDHFRの融合物を発現する羊膜由来接着細胞の操作において有用である。そのような構築体は、例えば、関節リウマチの治療において使用することができる。この実施態様において、IL-1RaとDHFRの融合物は、メトトレキセートなどの葉酸代謝拮抗物質への曝露時に、翻訳によりアップレギュレートされる。従って別の具体的実施態様において、羊膜由来接着細胞を遺伝子操作するために使用される核酸は、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むことができ、ここで該第一及び第二のポリペプチドは、外因性因子の存在下で翻訳によりアップレギュレートされる融合タンパク質として発現される。該ポリペプチドは、一時的に又は長期に(例えば、数週間又は数ヶ月にわたり)発現されることができる。そのような核酸分子は更に、操作された細胞の陽性選択を可能にするか、又は操作された細胞の可視化を可能にするポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含むことができる。別のより具体的実施態様において、該ヌクレオチド配列は、例えば適切な可視化条件下で蛍光を発するポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ(Luc)をコードしている。より具体的実施態様において、そのような核酸分子は、IL-1Ra-DHFR-IRES-Lucを含むことができ、ここでIL-1Raはインターロイキン-1受容体アンタゴニストであり、IRESは配列内リボソーム進入部位であり、及びDHFRはジヒドロ葉酸レダクターゼである。
(5.10.2 不死化羊膜由来接着細胞株)
成長促進タンパク質の産生及び／又は活性が外部因子によって調節可能であるように、哺乳動物の羊膜由来接着細胞を、成長促進遺伝子、すなわち、適切な条件下で、トランスフェクトされた細胞の成長を促進するタンパク質をコードする遺伝子を含む任意の好適なベクターによるトランスフェクションによって、条件付きで不死化することができる。好ましい実施態様において、成長促進遺伝子は、限定するものではないが、v-myc、N-myc、c-myc、p53、SV40ラージT抗原、ポリオーマラージT抗原、E1aアデノウイルス、又はヒトパピローマウイルスのE7タンパク質などのオンコジーンである。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、Narushima、M.らによりヒト膵β-細胞株について例示されたようなcre-lox組換え(Nature Biotechnology, 2005, 23(10:1274-1282))を用い不死化することができる。
成長促進タンパク質の外部調節は、外部調節可能なプロモーター、例えば、その活性を、例えば、トランスフェクトされた細胞の温度又は該細胞と接触する培地の組成を変更することによって制御することができるプロモーターの制御下に成長促進遺伝子を配置することによって達成することができる。一実施態様において、テトラサイクリン(tet)制御遺伝子発現系を利用することができる(Gossenらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：5547-5551, 1992)；Hoshimaruらの文献(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：1518-1523, 1996)を参照されたい)。tetの非存在下で、このベクター中のtet制御性トランス活性化因子(tTA)は、tetオペレーター配列に融合したヒトサイトメガロウイルス由来の最小プロモーターであるphCMV*-1からの転写を強く活性化する。tTAは、大腸菌のトランスポゾン-10由来のtet耐性オペロンのリプレッサー(tetR)と単純ヘルペスウイルスのVP16の酸性ドメインの融合タンパク質である。tetの低い、非毒性濃度(例えば、0.01〜1.0μg/mL)は、tTAによるトランス活性化をほぼ完全に消失させる。
一実施態様において、ベクターは、選択マーカー、例えば、薬物耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を更に含む。細菌のネオマイシン耐性遺伝子(neoR)は、本方法において利用し得るそのようなマーカーの1つである。neoRを有する細胞は、成長培地への、例えば、100〜200μg/mLのG418の添加などの、当業者に公知の手段によって選択することができる。
トランスフェクションは、限定するものではないが、レトロウイルス感染を含む、当業者に公知の種々の手段のいずれかによって達成することができる。一般に、細胞培養物を、ベクターのプロデューサー細胞株から回収される馴化培地とN2補給剤含有DMEM／F12の混合物とのインキュベーションによってトランスフェクトすることができる。例えば、上記のように調製された胎盤細胞培養物を、例えば、5日後にインビトロで、1容量の馴化培地と2容量のN2補充剤含有DMEM／F12中での約20時間のインキュベーションによって感染させることができる。その後、選択マーカーを有するトランスフェクトされた細胞を、上記のように選択することができる。
トランスフェクション後、培養物を、増殖を可能にする、例えば、24時間の間に細胞の少なくとも30％を倍加させる表面上で継代する。好ましくは、該基材は、ポリオルニチン(10μg/mL)及び／若しくはラミニン(10μg/mL)でコーティングされた組織培養プラスチックからなるポリオルニチン／ラミニン基材、ポリリジン／ラミニン基材、又はフィブロネクチンで処理された表面である。その後、培養物に、3〜4日ごとに成長培地を供給し、この成長培地には、1種以上の増殖増強因子が補充されていてもよいし、補充されていなくてもよい。増殖増強因子は、培養物が50％未満のコンフルエントである場合に、成長培地に添加してもよい。
80〜95％コンフルエントになったとき、条件的に不死化された羊膜由来接着細胞株を、標準的な技術を用いて、トリプシン処理などによって継代することができる。約20回目の継代までは、いくつかの実施態様において、選択(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含む細胞の場合、G418の添加による)を維持することが有益である。細胞は、長期保存のために液体窒素で凍結することもできる。
クローン細胞株を、上記のように調製された条件的に不死化された接着細胞株から単離することができる。一般に、そのようなクローン細胞株を、標準的な技術を用いて、例えば、限定希釈によるか、又はクローニングリングを用いて単離し、拡大することができる。一般に、クローン細胞株に、上記のように栄養を与え、それを継代することができる。
クローンであってもよいが、その必要はない、条件的に不死化されたヒト羊膜由来接着細胞株は、一般に、分化を促進する培養条件下で成長促進タンパク質の産生及び／又は活性を抑制することによって、分化するように誘導することができる。例えば、成長促進タンパク質をコードする遺伝子が外部調節可能なプロモーターの制御下にある場合、条件、例えば培地の温度又は組成を変更して、成長促進遺伝子の転写を抑制することができる。上で論じられているテトラサイクリンで制御される遺伝子発現系については、成長促進遺伝子の転写を抑制するためのテトラサイクリンの添加によって、分化を達成することができる。一般に、分化を開始するのに、4〜5日間の1μg/mLのテトラサイクリンで十分である。更なる分化を促進するために、追加の薬剤を成長培地に含めてもよい。
(5.11 投与量及び投与経路)
羊膜由来接着細胞(AMDAC)のそれを必要とする個体への投与は、治療されるCNS損傷に随伴する疾患、障害又は病態に関連した任意の医学的に許容し得る経路によることができる。前述の治療方法の具体的実施態様において、該AMDACはボーラス注射により投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、静脈内に、例えば静脈内注入により投与される。具体的実施態様において、該静脈内注入は、約1〜約8時間にわたる静脈内注入である。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、局所的に、例えばCNS損傷に随伴する疾患、障害又は病態に罹患した個体の体の特定の部位に投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは頭蓋内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは筋肉内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは腹腔内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、動脈内投与される。本治療方法の別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、筋肉内、皮内、又は皮下投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは静脈内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは心室内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは胸骨内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは滑液嚢内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは眼球内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは硝子体内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは大脳内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは脳室内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは髄腔内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは骨内注入される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは膀胱内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは経真皮投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは嚢内投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは表皮投与される。
前述の治療方法の別の具体的実施態様において、該AMDACは、該個体へ一度に投与される。別の具体的実施態様において、該単離されたAMDACは、該個体へ2回以上に分けて投与される。別の具体的実施態様において、該投与は、例えば該個体1kgにつきAMDACを、約1×104〜1×105個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×105〜1×106個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×106〜1×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×107〜1×108個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×108〜1×109個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×109〜1×1010個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×1010〜1×1011個の単離されたAMDACを投与することを含む。他の具体的実施態様において、該投与は、該個体1kgにつき、約1×106〜約2×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約2×106〜約3×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約3×106〜約4×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約4×106〜約5×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約5×106〜約6×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約6×106〜約7×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約7×106〜約8×106個の単離されたAMDAC；該個体1kgにつき、約8×106〜約9×106個の単離されたAMDAC；又は、該個体1kgにつき、約9×106〜約1×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、該個体1kgにつき、約1×107〜約2×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、該個体1kgにつき、約1.3×107〜約1.5×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、該個体1kgにつき、約3×107個までの単離されたAMDACを投与することを含む。具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、約5×106〜約2×107個の単離されたAMDACを投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、該個体へ、溶液約20mL中、約150×106個の単離されたAMDACを投与することを含む。
前述の治療方法の別の具体的実施態様において、単離されたAMDACは、単回単位投与量で、個体へ投与される。具体的実施態様において、AMDACの単回単位投与量は、様々な実施態様において、約、少なくとも、又は多くとも1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010、1×1011個又はそれよりも多いAMDACを含むことができる。
具体的実施態様において、該投与は、該個体への約5×106〜約2×107個の単離されたAMDACの投与を含み、ここで該細胞は、10％デキストラン、例えばデキストラン-40、5％ヒト血清アルブミン、及び任意に免疫抑制薬を含有する溶液中に含まれる。別の具体的実施態様において、該投与は、約5×107〜3×109個の単離されたAMDACを静脈内投与することを含む。より具体的実施態様において、該投与は、約9×108個の単離されたAMDAC又は約1.8×109個の単離されたAMDACを静脈内に投与することを含む。別の具体的実施態様において、該投与は、約5×107 〜1×108個の単離されたAMDACを頭蓋内投与することを含む。より具体的実施態様において、該投与は、約9×107個の単離されたAMDACを頭蓋内投与することを含む。
AMDACにより馴化された培地のそれを必要とする個体への投与は、限定するものではないが、ボーラス注射、静脈内(例えば静脈内注入による)、局所的(例えばCNS損傷に随伴する疾患、障害又は病態に罹患した個体の体の特定の部位へ)、頭蓋内、筋肉内、腹腔内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、心室内、滑液嚢内、眼球内、硝子体内、大脳内、脳室内、髄腔内、骨内注入により、膀胱内、経真皮、嚢内、又は表皮を含む、治療されるCNS損傷に随伴する疾患、障害又は病態に関連した任意の医学的に許容し得る経路によることができる。具体的実施態様において、AMDACにより馴化された培地は、連続注入により投与される。別の具体的実施態様において、AMDACにより馴化された培地は、単回投与量として投与される。
いくつかの実施態様において、AMDACにより馴化された培地のそれを必要とする個体への投与は、体重100gにつき約0.01〜約0.02mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.05mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.1mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.15mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.2mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.25mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.3mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.35mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.4mlのAMDACにより馴化された培地、体重100gにつき約0.01〜約0.45mlのAMDACにより馴化された培地、又は体重100gにつき約0.01〜約0.5mlのAMDACにより馴化された培地の投与を含む。
(5.12 羊膜由来接着細胞の分化)
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞は、分化することができる。一実施態様において、例えば、該細胞を血管内皮増殖因子(VEGF)と接触することによるか、又は下記5.11.2節、6.3.3節、若しくは6.3.4節に記されたように、該細胞が、内皮細胞、筋原性細胞、又は周皮細胞の少なくとも1つの特徴を示すのに十分であるように、該細胞は分化されている。より具体的実施態様において、内皮細胞、筋原性細胞又は周皮細胞の該特徴は、OCT-4-、VEGFR2/KDR+、CD9+、CD54+、CD105+、CD200+、及びVE-カドヘリン-である、羊膜細胞と比べ増大している、CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神経/グリア細胞抗原2)又はα平滑筋アクチンの1以上の発現である。他のより具体的実施態様において、内皮細胞、筋原性細胞又は周皮細胞の該特徴は、OCT-4-、VEGFR2/KDR+、及びVEGFR1/Flt-1+である羊膜細胞と比べ増大している、CD9、CD31、CD54、CD102、NG2(神経/グリア細胞抗原2)又はα平滑筋アクチンの1以上の発現である。
本明細書に提供される羊膜由来接着細胞の筋原(心筋原)分化は、例えば、心筋細胞への分化を誘導する細胞培養条件下に細胞を配置することにより、達成することができる。好ましい心筋原性培地は、レチノイン酸1μM；塩基性線維芽細胞増殖因子10ng/mL；及びトランスフォーミング増殖因子β-1、2ng/mL；及び上皮細胞成長因子100ng/mLを補充したDMEM/20％CBSを含む。ノックアウト代替血清(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を、CBSの代わりに使用することができる。或いは、羊膜由来接着細胞を、1〜100ng/mL、例えば50ng/mLのカルジオトロピン-1を補充したDMEM/20％CBSにおいて、24時間培養する。別の実施態様において、羊膜由来接着細胞は、タンパク質-非含有培地において、10〜14日間培養し、5〜7日間、その後、例えば、1％臍帯血血清を補充した1％HEPES緩衝液中でヒト心筋層を均質化することにより作製したヒト心筋抽出物で刺激することができる。
分化は、例えばRT/PCRによるか、又は目視できる細胞の拍動により、心臓アクチン遺伝子の発現を明らかにすることにより、確認することができる。接着細胞がこれらの特徴の1以上を示す場合、該細胞は、心臓細胞へ分化していると考えられる。
(5.12.1 神経原性細胞への分化)
羊膜由来の血管新生細胞は、神経原性条件下で培養する場合、神経の形態及び神経のマーカーを示す細胞へと分化する。例えば、AMDACは、例えば15％v/v FBSを含有するDMEM/F12培地において、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)の例えば約20ng/ml、上皮細胞増殖因子(EGF)の例えば約20ng/mlと一緒に、例えば4日間拡大され、引き続き200mMブチル化ヒドロキシアニソール、10nM塩化カリウム、5mg/mLインスリン、10nMフォルスコリン、4nMバルプロ酸、及び2nMヒドロコルチゾンを含む、無血清DMEM/F12を含有する誘導培地において4日間培養された。これらの条件下で、AMDACは、抗体染色により評価される、ヒトネスチン、Tuj1及びGFAPの発現を示す。
(5.12.2 骨形成性細胞への非分化)
羊膜由来接着細胞は、骨形成に関する標準アッセイにおいて、骨形成性分化を示さない。例えば一実施態様において、AMDACによる骨形成性分化の欠落が、例えば骨形成性条件下でのAMDACのvon Kossa染色の欠如により示されるような、カルシウム沈着の欠如により示すことができる。例えば、AMDAC、例えば新たに調製した又は凍結保存したAMDACを、例えば成長培地中の24-ウェルプレート及び6-ウェルプレート内に約5000個細胞/cm2で、成長培地中に懸濁し、且つ一晩インキュベーションし、その後骨形成性培地において14〜35日間、例えば28日間培養する。特定の実施態様において、骨形成性培地は、トランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)を例えば1〜100ng/mL、例えば20ng/mL及びヒト組み換え骨形成タンパク質-2(BMP-2)を例えば1〜100ng/mL、例えば40ng/mL補充した、DMEM-低グルコース、10％v/vウシ胎仔血清(FBS)、10mMβグリセロリン酸、100nMデキサメタゾン、及び100μMアスコルビン酸ホスフェートを含む。その後細胞は、標準のプロトコールを使用するvon Kossa染色を用い、染色し；黒銀色の沈着物の出現は、石灰化の存在を示している。AMDACの場合、培養物は、例えば骨髄-間葉系幹細胞と比べると、実質的に、例えば完全に、沈着物を含まず、このことは、AMDACはカルシウム沈着物を生じず、従って骨形成性経路へと分化しないことを示している。
(5.12.3 軟骨形成性細胞への非分化)
羊膜由来接着細胞は同様に、軟骨形成に関する標準アッセイにおいて軟骨形成性の分化を示さない。例えば一実施態様において、例えば、細胞の軟骨形成性細胞がペレット化する軟骨形成アッセイにおける細胞ペレットのAMDACによる出現の欠如により、AMDACによる軟骨形成性の分化の欠如を示すことができる。例えばAMDAC、例えば新たに調製するか又は凍結保存した、例えば2.5×105個の細胞を、15mLコニカルチューブ内に配置し、200×gで5分間、室温で遠心分離し、球状細胞ペレットを形成する。その後回収された細胞を、軟骨形成誘導培地、例えばTGFβ-3(例えば約10ng/mL)、組み換えヒト成長/分化因子-5(rhGDF-5)(例えば約500ng/mL)、又はTGFβ-3(10ng/mL)とrhGDF-5(例えば約500ng/mL)の組合せを含有するLonza軟骨細胞培地において、3週間培養する。3週間経過した時点で、細胞を、アルシアンブルーで染色し、これは軟骨形成性細胞により生成されるムコ多糖及びグリコサミノグリカンを染める。典型的には、BM-MSC又は軟骨細胞は、これらの条件下で培養した場合、アルシアンブルーで陽性染色する細胞ペレットを出現させるが、AMDACはペレットを形成せず、アルシアンブルーによっても染まらない。
(6. 実施例)
(6.1 実施例1：羊膜の膜からの接着細胞の単離及び拡大)
本実施例は、羊膜由来接着細胞の単離及び拡大を明らかにする。
(6.1.1 単離)
羊膜由来接着細胞は、以下のように羊膜の膜から単離した。羊膜/絨毛膜を胎盤から切除し、羊膜を手作業で絨毛膜から分離した。羊膜を、滅菌PBSによりすすぎ、残留血液、血塊及び他の物質を取り除いた。滅菌ガーゼを使用し、すすぎにより取り除くことができなかった更なる血液、血塊又は他の物質を除去し、且つ羊膜を再度PBSによりすすいだ。過剰なPBSを、膜から除去し、且つ羊膜を、外科用メスにより、2インチ×2インチの切片に切断した。上皮細胞放出のために、処理容器を、滅菌ジャケット付きガラス処理容器を、37℃の循環水浴に、チューブとコネクターを用いて接続することにより設定し、且つ攪拌プレート上に設置した。トリプシン(0.25％、300mL)を、処理容器中37℃まで温め；羊膜切片を追加し、且つ羊膜/トリプシン懸濁液を、例えば、100RPM〜150RPMで、37℃で15分間攪拌した。処理容器に隣接する無菌野上に無菌レセプタクルを配置し、且つレセプタクルに滅菌75μm〜125μmスクリーン(Millipore社、ビレリカ、MA)を挿入することにより、無菌スクリーニングシステムを集成した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物を、スクリーンに移し、且つ羊膜切片を、例えば滅菌ピンセットを用いて、処理容器へ戻し；上皮細胞を含有するトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を、前述のように、再度トリプシン溶液(0.25％)300mLと一緒に攪拌した。スクリーンを、およそ100〜150mLのPBSですすぎ、このPBS溶液を廃棄した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。その後羊膜切片を、処理容器に戻し；上皮細胞を含むトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を再度、前述のように、トリプシン溶液(0.25％)300mLと攪拌した。スクリーンを、およそ100〜150mLのPBSですすぎ、このPBS溶液を廃棄した。羊膜切片を15分間攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移した。その後羊膜切片を、処理容器に戻し；上皮細胞を含むトリプシン溶液を廃棄した。羊膜切片を、PBS/5％FBS(羊膜のPBS/5％FBS溶液に対する容積比1:1)中で37℃でおよそ2〜5分間、攪拌し、トリプシンを中和した。新鮮な無菌スクリーンシステムを集成した。トリプシンの中和後、処理容器の内容物を、新たなスクリーンに移し、羊膜切片を処理容器に戻した。室温で滅菌PBS(400mL)を処理容器に添加し、処理容器の内容物をおよそ2〜5分間攪拌した。スクリーンをおよそ100〜150mLのPBSですすいだ。攪拌した後、処理容器の内容物をスクリーンに移し；処理フラスコを、PBSですすぎ、且つこのPBS溶液を廃棄した。その後処理容器を、300mLの予め温めたDMEMで満たし、且つ羊膜切片をDMEM溶液に移した。
羊膜由来接着細胞の放出のために、処理した羊膜の膜を、更に以下のようにコラゲナーゼで処理した。適量のコラゲナーゼ粉末(供給業者から受け取ったコラゲナーゼロットの活性によって変動)をDMEM中に溶解することにより、滅菌コラゲナーゼストック液(500U/mL)を調製した。この溶液を、0.22μmフィルターを通して濾過し、個別の滅菌容器に分注した。CaCl2溶液(0.5mL、600mM)を、各100mL投与量に添加し、且つこれらの投与量を凍結した。コラゲナーゼ(100mL)を、処理容器中の羊膜切片に添加し、且つこの処理容器を、30〜50分間、又は羊膜消化が目視検査により完了するまで、攪拌した。羊膜消化が完了した後、予め温めた滅菌PBS/5％FBSの100mLを処理容器に添加し、処理容器を更に2〜3分間攪拌した。攪拌した後、フラスコの内容物を、無菌60μmスクリーンに移し、液体を真空濾過により回収した。処理容器を、400mLのPBSですすぎ、且つPBS溶液を滅菌濾過した。濾過した細胞懸濁液をその後、300×gで15分間、20℃で遠心分離し、細胞ペレットを、予め温めたPBS/2％FBSに再懸濁した(合計およそ10mL)。
(6.1.2 樹立)
新たに単離された血管新生羊膜細胞を、60％DMEM-LG(Gibco社)；40％MCBD-201(Sigma社)；2％FBS(Hyclone Labs)、1×インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS)；10ng/mLリノール酸-ウシ血清アルブミン(LA-BSA)；1n-デキサメタゾン(Sigma社)；100μMアスコルビン酸2-ホスフェート(Sigma社)；10ng/mL上皮細胞増殖因子(R & D Systems社)；及び、10ng/mL血小板由来増殖因子(PDGF-BB)(R & D Systems社)を含有する成長培地に添加し、且つT-Flask内に、播種密度10,000個細胞/cm2でプレーティングした。その後培養装置を、37℃で、5％CO2、湿度＞90％でインキュベーションした。細胞の接着、成長及び形態を、毎日モニタリングした。非接着細胞及びデブリを、培地交換により除去した。培地交換は、1週間に2回行った。典型的線維芽細胞様/紡錘体形の形態を持つ接着細胞が、最初のプレーティング後数日で出現した。コンフルエンスが40％〜70％に達した時点で(最初のプレーティング後4〜11日目)、これらの細胞を、5分間、室温で(37℃)でのトリプシン処理(0.25％トリプシン-EDTA)により収集した。PBS-5％FBSによる中和後、細胞を200〜400gで、5〜15分間、室温で遠心分離し、その後成長培地中に再懸濁した。この時点で、AMDAC株は、初代継代時にうまく樹立されたとみなした。初代継代した羊膜由来接着細胞を、場合によっては、凍結保存又は拡大した(例えば培地内で成長)。
(6.1.3 培養手順)
羊膜由来接着細胞を、前述の成長培地において培養し、且つ適切な組織培養物を処理する培養装置中で、密度2000〜4000個/cm2で播種した。次に培養装置を、37℃、5％CO2、湿度＞90％でインキュベーションした。培養時に、AMDACは、接着し且つ増殖した。細胞の成長、形態、及びコンフルエンスは、毎日モニタリングした。培養が5日目以上に延びた場合は、培地交換は、新鮮な栄養素を補給するために、週2回行った。コンフルエンスが40％〜70％に達した時点で(播種後3〜7日目)、これらの細胞を、5分間、室温で(37℃)でのトリプシン処理(0.05％〜0.25％トリプシン-EDTA)により収集した。PBS-5％FBSによる中和後、細胞を200〜400gで、5〜15分間、室温で遠心分離し、その後成長培地中に再懸濁した。
この様式で、単離され且つ培養されたAMDACは、典型的にはプレーティングした1×106個細胞から、33530±15090個コロニー-形成単位(線維芽細胞)(CFU-F)を生成した。
(6.2 実施例2：羊膜由来接着細胞の表現型特徴)
(6.2.1 遺伝子及びタンパク質発現プロファイル)
本実施例は、特徴的細胞表面マーカー、mRNA、及びプロテオミクス発現を含む、羊膜由来接着細胞の表現型特徴を説明する。
(試料調製)：羊膜由来接着細胞を、実施例1記載のように得た。継代数6の細胞を、およそ70％コンフルエンスまで、上記の実施例1に説明したような成長培地において、成長させ、トリプシン処理し、PBSで洗浄した。NTERA-2細胞(アメリカンタイプカルチャーコレクション、ATCC番号CRL-1973)を、4.5g/Lグルコース、2mMグルタミン及び10％FBSを含有するDMEMにおいて成長させた。有核細胞のカウントを行い、最低2×106〜1×107個の細胞を得た。次に細胞を、QIAshredderを利用する、Qiagen RNeasyキット(Qiagen社、バレンシア、CA)を用いて溶解し、溶解液を得た。次にRNA単離を、Qiagen RNeasyキットを用いて行った。RNA量及び品質を、Nanodrop ND1000分光光度計を用いて、RNA/反応物25ng/μLと決定した。Applied Biosystems社(フォスターシティ、CA)のHigh Capacity cDNAアーカイブキットを用い、cDNA反応物を調製した。リアルタイムPCR反応を、Applied Biosystems社のTAQMAN(登録商標)ユニバーサルPCRマスターミックスを用い実行した。反応は、Applied Biosystems社7300リアルタイムPCRシステムにおいて、40サイクル、標準モードで試行した。
(試料の分析及び結果)：リアルタイムPCR法及び特異的TAQMAN(登録商標)遺伝子発現プローブ及び／又はTAQMAN(登録商標)ヒト血管新生アレイ(Applied Biosystems社)を用い、細胞を、幹細胞関連マーカー、血管新生マーカー及び心筋原性マーカーの発現について特徴付けた。結果は、関連細胞対照と比較した関心対象の遺伝子の相対発現、又は遍在性に発現されたハウスキーピング遺伝子(例えばGAPDH、18S、又はGUSB)と比較した関心対象の遺伝子の相対発現(デルタCt)のいずれかとして表した。
羊膜由来接着細胞は、様々な幹細胞関連遺伝子、血管新生遺伝子及び心筋原性遺伝子を発現し、且つNTERA-2細胞と比べ、OCT-4の発現が相対的に存在しないことを示した。表6は、選択された血管新生遺伝子、心筋原性遺伝子、及び幹細胞遺伝子の発現をまとめている。
Figure 2014507389
Figure 2014507389
Figure 2014507389
別の実験において、AMDACは加えて、アリール炭化水素受容体核移行因子2(ARNT2)、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF)、ニュートロフィン-3(NT-3)、NT-5、低酸素-誘導因子1α(HIF1A)、低酸素-誘導タンパク質2(HIG2)、ヘムオキシゲナーゼ(脱環化)1(HMOX1)、細胞外スーパオキシドジスムターゼ[Cu-Zn](SOD3)、カタラーゼ(CAT)、トランスフォーミング増殖因子β1(TGFB1)、トランスフォーミング増殖因子β1受容体(TGFB1R)、及び肝細胞増殖因子受容体(HGFR/c-met)の遺伝子を発現することがわかった。
フローサイトメトリーを、羊膜由来接着細胞の表現型マーカーを定量する方法として使用し、該細胞のアイデンティティを規定した。細胞試料を、凍結ストックから得た。解凍する前及び試薬調製時には、細胞バイアルをドライアイス上に維持した。引き続き、試料を、37℃水浴を用いて急速解凍した。予め凍結した細胞のカウントを、初回の解凍後の細胞数に左右される希釈の計算に用いた。簡単に述べると、クリオバイアルを、およそ30秒間穏やかに攪拌して37℃の水浴中で解凍した。解凍直後に、冷(2〜8℃)解凍溶液(2.5％アルブミン及び5％Gentran 40を含むPBS)およそ100〜200μLを、クリオバイアルに添加し、且つ混合した。穏やかに混合した後、クリオバイアル中の総容量を等容量の冷(2〜8℃)解凍溶液が入った15mLコニカルチューブに移した。細胞をコニカルチューブ内で、400gで5分間、室温で遠心分離し、その後上清を取り除いた。残存する容積を、ピペットにより測定し(概算)；残存容積及び細胞ペレットを、PBS中1％FBSの中に、室温で再懸濁し、細胞濃度250×103個細胞/100μL緩衝液を達成した。例えば1×106個細胞を、1％FBSの400μL中に再懸濁した。細胞懸濁液を、予めラベルを付けた5mL FACSチューブ(Becton Dickinson(BD)社、フランクリンレーク、NJ)に配置した。各一次抗体アイソタイプに関して、細胞懸濁液100μLを、1個のアイソタイプ対照チューブに入れアリコートとした。表現型分析の前に、全ての抗体の濃度を、良好なシグナル対ノイズ比、及び可能な4log動作範囲にわたるCD抗原の適正な検出を実現するように最適化した。各試料を染色するために使用した各アイソタイプ及び試料抗体の容積を決定した。アイソタイプチューブ及び試料チューブ中の抗体の量(μg)を標準化するために、各抗体の濃度を、下記式で計算した：（1／実際の抗体濃度(μg/μL)）×（2.5×105個細胞についての所望の最終的抗体量(μg)）＝添加した抗体数(μL)。アイソタイプ及び試料の両方の抗体のマスター混合物は、各チューブに適量の抗体を添加して作製した。細胞を、室温、暗所で、15〜20分間染色した。染色後、各試料中の未結合の抗体を、遠心分離(400g×5分間)により除去し、引き続き1％FBS/PBS(室温)2mLを用いて洗浄し、その後、室温で1％FBS/PBSの150μL中に再懸濁した。次に試料を、製造業者の指示に従い使用のために調製したBecton Dickinson FACSCalibur、FACSCantoI、又はBD FACSCantoIIフローサイトメトリーにおいて分析した。多重-パラメーターのフローサイトメトリーデータセット(側方散乱光(SSC)、前方散乱光(FSC)及び積分された蛍光プロファイル(FL))を、実行時(on-the-fly)計器補正パラメータを設定することなく獲得した。補正パラメータは、FACSDivaソフトウェアを製造業者の指示に従い用い取得した後、決定した。これらの計器設定を、各試料に適用した。これらの試験に使用したフルオロフォア複合体は、アロフィコシアニン(APC)、AlexaFluor 647(AF647)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フィコエリトリン(PE)、及びペリジニンクロロフィルタンパク質(PerCP)であり、これらは全てBD Biosciences社から入手した。表7に、血管新生マーカーを含む、選択された細胞-表面マーカーの発現をまとめている。
Figure 2014507389
別の実験において、AMDAC細胞を、抗-ヒトCD49f(クローンGoH3、フィコエリトリン-複合型；BD Pharmingen社、パーツ番号555736)により標識し、且つフローサイトメトリーにより分析した。AMDACのおよそ96％が、抗-CD49fで標識された(すなわち、CD49f+であった)。
別の実験において更に、AMDACは、免疫局在化によりCD49a、CD106、CD119、CD130、c-met(肝細胞増殖因子受容体；HGFR)、CXCケモカイン受容体1(CXCR1)、PDGFRA、及びPDGFRBを発現することが、免疫局在化により認められた。AMDACはまた、免疫局在化により、CD49e、CD62E、線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR3)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー12A(TNFRSF12A)、インスリン-様増殖因子1受容体(IGF-1R)、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、ケモカイン受容体1(CCR1)、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、上皮細胞増殖因子受容体(EGF-R)、インスリン受容体(CD220)、インターロイキン受容体4(IL4-R；CD124)、IL6-R(CD126)、TNF-R1a及び1b(CD120a、b)、並びにerbB2/Her2の発現を欠くことが認められた。
(6.2.2 羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための免疫組織化学(IHC)/免疫蛍光化学(IFC))
継代数6の羊膜由来接着細胞を、4-ウェルチャンバースライド上でおよそ70％コンフルエンスまで成長させ、各々4％ホルマリン溶液で30分間固定した。固定後、スライドをPBSで2回、5分間すすいだ。その後スライドを、PBS中の二次抗体としての同じ宿主由来の10％正常血清、2×カゼイン、及び0.3％ Triton X100と一緒に、加湿チャンバーにおいて、室温で、20分間インキュベーションした。過剰な血清を、吸い取って除き、スライドを、加湿チャンバー内で一次抗体(ヤギポリクローナルIgG(Santa Cruz社；サンタクルーズ、CA)と一緒にインキュベーションした。インキュベーションの時間及び温度は、使用した抗体に関する最適条件を選択することにより決定した。概して、インキュベーション時間は、37℃で1〜2時間、又は4℃で一晩であった。その後スライドを、PBSで3回、各5分間すすぎ、一次抗体の宿主に対する蛍光-複合した抗-免疫グロブリン二次抗体(ウサギ抗-ヤギ抗体(Santa Cruz社))と一緒に、加湿チャンバー内、室温で、20〜30分間インキュベーションした。その後、スライドをPBSで3回、各5分間すすぎ、核の対比染色のために、DAPI Vectashield(登録商標)(Vector Labs社)マウンティング溶液を利用し、カバースリップを据え付けた。細胞染色は、Nikon蛍光顕微鏡を利用し、視覚化した。全ての画像を、対応するアイソタイプ(ヤギIgG(Santa Cruz社))のバックグラウンドに対し規準化された、等しい露光時間で撮影した。表8は、羊膜由来接着細胞による血管新生タンパク質の発現の結果をまとめている。
Figure 2014507389
羊膜由来接着細胞は、表8に示されたタンパク質の一つである、血管新生マーカーである腫瘍内皮マーカー7(TEM-7)を発現した。図2参照。
(6.2.3 羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のための膜プロテオミクス)
(膜タンパク質精製)：継代数6の細胞を、成長培地において、およそ70％コンフルエンスまで成長させ、トリプシン処理し、PBSで洗浄した。その後細胞を、細胞溶解する前に、プロテアーゼインヒビターカクテル(P8340、Sigma Aldrich社、セントルイス、MO)を含有する溶液と一緒に15分間インキュベーションした。次に細胞を、10mM HCl溶液の添加により溶解し(従って界面活性剤の使用は回避)、400gで10分間遠心分離し、ペレットとし、核を除去した。核除去後(post-nuclear)の上清を、超遠心分離チューブに移し、T-1270ローター(Thermo Fisher Scientific社、アッシュビル、NC)を装備したWX80超遠心分離機を用い、100,000gで150分間遠心分離し、膜タンパク質ペレットを作製した。
(プロテオリポソームの生成、固定化及び消化)：膜タンパク質ペレットを、Nanoxis緩衝液(10mMトリス、300mM NaCl、pH8)を用い、数回洗浄した。膜タンパク質ペレットをNanoxis緩衝液1.5mL中に懸濁し、その後Vibra-CELL(商標)VC505超音波処理装置(Sonics & Materials社、ニュータウン、CT)を用い、氷上で20分間、チップ超音波処理した(tip-sonicated)。プロテオリポソームのサイズを、FM1-43色素(Invitrogen社、カールスバッド、CA)による染色、及び蛍光顕微鏡による目視により、決定した。プロテオリポソーム懸濁液のタンパク質濃度を、BCAアッセイ(Thermo Scientific社)により決定した。次にプロテオリポソームを、標準ピペットチップを使用し、LPI(商標)Flow CELL(Nanoxis AB社、ゴーゼンバーグ、スウェーデン)上に注入し、1時間固定させた。固定化後、連続洗浄工程を実行し、トリプシン5μg/mL(Princeton Separations社、アデルフィ、NJ)を、LPI(商標)Flow Cell上に直接注入した。このチップを、37℃で一晩インキュベーションし、トリプシン性ペプチドを、LPI(商標)チップから溶出し、その後、Sep-Pakカートリッジ(Waters社、ミルフォード、MA)を用い脱塩した。
(LTQ線形イオントラップLC/MS/MS分析)：各トリプシン性消化物試料を、軸方向脱溶媒(axial desolvation)真空支援ナノキャピラリーエレクトロスプレーイオン化(ADVANCE)源(Michrom Bioresources社)に直接インターフェイス接続された、0.2mm×150mm、3μm、200ÅMAGIC C18カラム(Michrom Bioresources社、アーバン、CA)上で、180分勾配(緩衝液A：水、0.1％ギ酸；緩衝液B：アセトニトリル、0.1％ギ酸)を使用し、分離した。ADVANCE源は、従来型nanoESIと同等の感度を達成する一方、かなり高い流量3μL/分で操作される。溶出されたペプチドを、各々のフルスキャン質量スペクトルに従い10データ-依存式MS/MSスキャンを利用したLTQ線形イオントラップ質量分析計(Thermo Fisher Scientific社、サンノゼ、CA)において分析した。各生物学的試料について、7回の反復分析のデータセットを収集した。
(バイオインフォマティクス)：各細胞株について収集した7回の反復分析のデータセットに対応する7つの生ファイルを、Sorcerer Solo(商標)ワークステーション(Sage-N Research社、サンノゼ、CA)上でSEQUESTアルゴリズムを実行することにより、IPIヒトデーターベースに対する1項目検索として、検索した。ペプチド質量許容差1.2 amuを特定し、メチオニン酸化を示差的修飾として特定し、且つカルバミドメチル化を静的修飾として特定した。Trans-Proteomic Pipeline(TPP)のスキャフォールドソフトウェアを実行し、膜プロテオミクスデータを検索し且つ解析した。タンパク質が、ペプチド確率95％、タンパク質確率95％及び1つの独自ペプチドを持つと確定された場合に、該タンパク質は分析物とみなした。膜プロテオミクスデータセット間の比較は、研究室で開発したカスタムPerlスクリプトを用いて、実行した。
(結果)：表9に示したように、羊膜由来接着細胞は、様々な血管新生マーカー及び心筋原性マーカーを発現した。
Figure 2014507389
(6.2.4 羊膜由来接着細胞の血管新生能の評価のためのセクレトームプロファイリング)
(タンパク質アレイ)：継代数6の羊膜由来接着細胞を、成長培地において同じ細胞数でプレーティングし、且つ4日後に馴化培地を回収した。細胞-馴化培地において多数の血管新生サイトカイン/増殖因子の同時定性分析を、RayBiotech社血管新生タンパク質アレイ(ノルクロス、GA)を用い実行した。簡単に述べると、タンパク質アレイを、1×Blocking緩衝液(Ray Biotech社)2mL中、室温で30分間インキュベーションし、膜をブロックした。引き続きBlocking緩衝液をデカンテーションし、膜を、試料1mL(各細胞により4日間馴化した成長培地)と一緒に、室温で1〜2時間インキュベーションした。次に試料をデカンテーションし、膜を、1×Wash緩衝液I(Ray Biotech社)2mLにより、室温で、振盪しながら、5分間3回洗浄した。その後膜を、1×Wash緩衝液II(Ray Biotech社)2mLにより、室温で、振盪しながら、5分間2回洗浄した。その後希釈したビオチン-複合抗体(Ray Biotech社)1mLを、各膜に添加し、室温で1〜2時間インキュベーションし、且つWash緩衝液により前述のように洗浄した。次に希釈したHRP-複合ストレプトアビジン(2mL)を、各膜に添加し、これらの膜を室温で2時間インキュベーションした。最後に、膜を再度洗浄し、ECL(商標)検出キット(Amersham社)により仕様に従いインキュベーションし、結果を、Kodak Gel Logic 2200 Imaging Systemを用いて視覚化し分析した。AMDACによる様々な血管新生タンパク質の分泌を、図3に示す。
(ELISA)：細胞-馴化培地における単独の血管新生サイトカイン/増殖因子の定量分析を、R&D Systems社(ミネアポリス、MN)から市販されているキットを用いて行った。簡単に述べると、ELISAアッセイを、製造業者の指示に従い行い、馴化培地中の各血管新生増殖因子の量を、1×106個細胞に規準化した。羊膜由来接着細胞(n＝6)は、細胞100万個につきVEGFおよそ4500pg、及び細胞100万個につきIL-8およそ17,200pgを示した。
Figure 2014507389
別の実験において、AMDACはまた、アンジオポエチン-1、アンジオポエチン-2、PECAM-1(CD31；血小板内皮細胞接着分子)、ラミニン、フィブロネクチン、MMP1、MMP7、MMP9、及びMMP10も分泌することが確認された。
(6.3 実施例3：羊膜由来接着細胞の分化)
(6.3.1 実施例3.1：羊膜由来接着細胞の骨形成性非分化)
本実施例は、羊膜由来接着細胞(AMDAC)は、例えば石灰化、例えば細胞により沈着したカルシウムを染色するvon Kossa染色により立証されたように、骨形成性細胞には分化しないことを明らかにする。
前記実施例1に記載のように入手した凍結保存したOCT-4- AMDACを、解凍し、洗浄し、ジメチルスルホキシド(DMSO)を除去し、成長培地中に再懸濁した。細胞を、成長培地中に24-ウェルプレート及び6-ウェルプレートに5000個細胞/cm2で播種し、一晩インキュベーションした。引き続き、培地を取り除き、DMEM-低グルコース、10％v/vウシ胎仔血清(FBS)、10mMβグリセロリン酸(Sigma社)、100nMデキサメタゾン(Sigma社)、100μMアスコルビン酸ホスフェート(Sigma社)、Fungizone(Gibco社)、50ユニット/mlペニシリン、及び50μg/mlストレプトマイシン(Gibco社)を含有する骨形成性培地と交換した。この骨形成性培地に、20ng/mlトランスフォーミング増殖因子-β1(TGF-β1)(Sigma社)、及び40ng/mlヒト組み換え骨形成タンパク質-2(BMP-2)(Sigma社)を補充した。骨形成性培地におけるAMDACの培養を、培地を3〜4日毎に交換しながら、合計28日間継続した。培養期間の最後に、細胞を回収し、洗浄し、石灰化、インジケーター又は骨形成性分化の評価のために以下に詳述するように染色した。顕微鏡下で観察した場合、細胞層は線維芽細胞形態(例えば立方状の外観はなし)で完全にコンフルエントであり、小結節は認められなかった。
対照として、皮膚線維芽細胞及び骨髄由来間葉系幹細胞(BM-MSC)を、更に骨形成性培地において培養した。成人の正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、Lonza社(ウォーカービル、MD、米国)から入手し、新生児NHDFはATCC(マナサス、VA、米国)から得た。以下の起源の異なる3つのBM-MSC株を評価し：一つ目はScienCell Laboratories社(カールスバッド、CA、米国)から、二つ目はLonza社(ウォーカービル、MD、米国)、及び三つ目は、AllCells社(エメリービル、CA、米国)から入手した、新鮮な全正常骨髄穿刺液から単離された。
細胞は、10％(v/v)中和緩衝メタノールにより固定した。固定後、細胞を脱イオン水で洗浄し、5％硝酸銀(Aldrich社)で1時間、間接UV光下でインキュベーションした。その後細胞を、脱イオン水で洗浄し、5％(w/v)チオ硫酸ナトリウム中で5分間インキュベーションした。その後細胞を再度蒸留水で洗浄し、光学顕微鏡により試験した。
骨形成性分化に関連した遺伝子骨シアロタンパク質(IBSP)及びオステオカルシン(BGLAP)の示差的発現レベルを、誘導の前及び後で、RT-PCRにより評価した。具体的には、AMDACを、骨形成分化アッセイの終了時に受け取り、その後RLT溶解緩衝液(Qiagen社)を用いて溶解した。細胞溶解液を、-80℃で貯蔵した。AMDAC細胞溶解液を解凍し、DNAse処理により、RNEasyキット(Qiagen社)を製造業者の指示に従い用い、RNAを単離した。その後RNAを、DEPC処理水で溶出し、且つRNA量を、Nanodrop ND1000分光光度計を用いて決定した。Applied Biosystems社の逆転写試薬を用い、RNAからcDNAを作製した。リアルタイムPCR反応を、Applied Biosystems社からのTaqman Universal PCRマスターミックスを用いて行った。使用したTaqman遺伝子発現アッセイは、Hs00173720骨シアロタンパク質、Hs00609452オステオカルシン、及びGAPDHであった。リアルタイムPCR反応を、ABI 7300システムにおいて、以下に示すように試行した：
Figure 2014507389
 閾値サイクル(Ct)値の解釈：
平均Ct 1-10 非常に高い発現
平均Ct 10-20 高い発現
平均Ct 20-30 中レベルの発現
平均Ct 30-35 低い発現
平均Ct 35-40 非常に低い発現
各遺伝子の発現値(Ct)は、ハウスキーピング遺伝子GAPDHの値に対し規準化した。次に各試料の規準化された発現値(dCt)を、誘導前と誘導後で比較した。倍数(fold)変化に換算して相対差を、「RQ」として報告した。ハウスキーピング遺伝子のdCtにおける特有の変動のため、3未満の誘導倍数の差は、有意であるとみなさなかった。
(結果)：Von Kossa染色の結果は、AMDACでは、von Kossa染色は検出されなかったので、AMDACは明らかに非骨形成性であることを明らかにした。対照の線維芽細胞は、最小の石灰化を示したのに対し、BM-MSCは様々な程度の石灰化を示した。
Figure 2014507389
遺伝子発現に関して、試験した全ての細胞は、オステオカルシンの中等度の基本的発現を示した(Ct 27.5〜30.9)。AMDACは、オステオカルシン発現のわずかな(＜2倍)誘導を明らかにし、これは線維芽細胞又はBM-MSCについて観察されたオステオカルシン発現の誘導と比べ、有意であるとは考えられなかった。従って、AMDACによるオステオカルシン発現の誘導は、骨形成能の指標ではなかった。骨シアロタンパク質遺伝子に関して、誘導前にAMDAC上に発現は認められず、誘導後に、非常に低い発現が観察された。対照的に、3つのBM-MSC株のうち2つは、誘導時に実質的アップレギュレーションを示した。骨シアロタンパク質の誘導に関するBM-MSCの変動は、恐らくドナー変動によるであろう。
Figure 2014507389
 ND-検出されず
NA-非誘導条件は検出しなかったので、計算できず(すなわち、Ct値は決定されず)
従って、前記結果を基に、AMDACは骨形成能を示さないことが結論付けられた。
(6.3.2 実施例3.2：羊膜由来接着細胞の軟骨形成性非分化)
本実施例は、本明細書記載の羊膜由来接着細胞は、軟骨形成経路に沿って分化しないことを明らかにする。
本明細書別所記載のOCT-4- AMDACを、対照としての皮膚線維芽細胞及びBM-MSCと一緒に、軟骨形成アッセイにおいて使用した。各試験試料について、細胞0.25×106個を、15mLコニカルチューブに入れ、200×gで室温、5分間遠心分離し、球状ペレットを形成した。ペレットを、TGFβ-3(10ng/mL)、組み換えヒト成長/分化因子-5(rhGDF-5)(500ng/mL)、又はTGFβ-3(10ng/mL)とrhGDF-5(500ng/mL))の組合せを含む、軟骨形成性誘導培地(Lonza社軟骨細胞培地(Lonza PT-3003))、又は成長培地(DMEM-低グルコース(Gibco社)＋FBS(2％v/v)(Hyclone社)＋ペニシリン及びストレプトマイシン)のいずれかにおいて、3週間培養した。培養時に、培地の完全な交換は1週間に2回行った。
培養期間の最後に、細胞ペレットを、10％ホルマリン中で24時間固定した。その後全ての試料を、段階的(graded)アルコールにより脱水し、且つパラフィンに包埋した。切片を厚さ5μmとなるよう切り出し、その後下記のプロトコールに従い染色した。組織学的切片を、光学顕微鏡を用いて試験した。
(アルシアンブルー染色)：3％酢酸溶液(pH2.5)中で使用した場合、アルシアンブルーは、硫酸基及びカルボキシル基を有する酸性ムコ多糖並びに硫酸基及び／又はカルボキシル基を有するシアロムチンを染色する。3％酢酸中の1％アルシアンブルー(Sigma-Aldrich社、#23655-1)を使用し、引き続き0.1％核ファストレッド(Sigma-Aldrich社、#22911-3)で対比染色した。簡単に述べると、切片を、脱パラフィン化し、且つ段階的アルコールにより蒸留水まで水和し、アルシアンブルーで30分間染色し、流れる水道水で2分間洗浄し、蒸留水ですすぎ、次に核ファストレッド溶液中で5分間対比染色し、流れる水道水で1分間洗浄し、段階的アルコールにより脱水し、キシレン中で透明にし、且つ最終的に残存するマウンティング培地と一緒に据え付けた。
(II型コラーゲン染色)：軟骨形成性分化条件の前及び後の細胞培養試料中のII型コラーゲンの存在を、以下に概説するように免疫組織化学により評価する。これらの細胞によるII型コラーゲンの生成は、II型コラーゲンに対し高度に特異的であり、且つI、III、IV、V、VI、IX、X、又はXI型コラーゲンとの交差反応を示さず、ペプシン-消化型II型コラーゲンとも交差反応を示さない、マウスモノクローナル、抗体5B2.5(Abcam社、カタログ番号ab3092)を用い評価した。アッセイは、二次抗体としてヤギ抗-マウスAF 594(Invitrogen社、IgG2a、カタログ番号A21135)を使用した。細胞ペレットを、10％ホルマリン中で最低4時間から一晩固定し、パラフィン中に浸潤させた。
全ての細胞試料を、PBSで洗浄し、PBS、4％ヤギ血清及び0.3％Triton-100Xを含有するタンパク質ブロック溶液に、室温で30分間曝した。次にブロック溶液中に希釈した一次抗体(1：50及び1：100)を、4℃で一晩適用した。翌朝、試料をPBSで洗浄し、且つブロック溶液中に希釈した二次抗体(ヤギ-抗-マウスAF594)(1：500)を、室温で1時間適用した。その後細胞を、PBSで洗浄し、600nM DAPI溶液を室温で10分間適用し、核を可視化した。
BM-MSC及び線維芽細胞は、軟骨形成誘導培地中に細胞ペレットを形成した。軟骨細胞は、尖端又は中心に明らかに異なる細胞集団を伴わない、巨大な細胞ペレットを形成した。対照的に、AMDACは、培養期間中に、細胞ペレットを形成することができなかった。染色結果は、AMDACは細胞ペレットを形成することができなかったので、AMDACに関して、II型コラーゲン又はアルシアンブルーのいずれについても得られなかった。従って、AMDACは非軟骨形成性であることが結論付けられた。
(6.3.3 実施例3.3：羊膜由来接着細胞の神経分化)
本実施例は、羊膜由来接着細胞は、神経細胞の特徴を持つ細胞へ分化することができることを明らかにしている。AMDACの神経分化は、正常ヒト神経前駆細胞(Lonza社)、皮膚線維芽細胞、新生児正常(ドナー3)、骨髄MSC(ドナー5及び6)と比べた。
第一の短期神経分化手順において、AMDAC及び他の細胞を解凍し、約5000個/cm2で播種した後、コンフルエントを下回るようになるまで、それらの各成長培地において拡大した。細胞をトリプシン処理し、組織培養液でコーティングされたプレート中に、1ウェルにつき6000個細胞で播種した。全ての細胞を最初に4日間、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)20ng/ml、上皮細胞増殖因子(EGF)20ng/ml(Peprotech社)及びペニシリン/ストレプトマイシン(PenStrep、Invitrogen社)と共に、15％v/vFBS(Hyclone社)を含有するDMEM/F12培地(Invitrogen社)において拡大した。4日後、これらの細胞をPBS(Invitrogen社)においてすすいだ。その後細胞を、20％v/vFBS、PenStrepを含むDMEM/F12中で約24時間培養した。24時間後、細胞をPBS(Invitrogen社)ですすぎ、200mMブチル化ヒドロキシアニソール、10nM塩化カリウム、5mg/mLインスリン、10nMフォルスコリン、4nMバルプロ酸、及び2nMヒドロコルチゾン(Sigma社)を含有する、DMEM/F12、無血清からなる誘導培地において培養した。引き続き細胞を、100％メタノールにより、-20℃で固定した。その後固定した試料を、核のDAPIによる対比染色を行い、抗-ネスチン抗体(Alexa-Fluor 594(Red)複合体)を使用し、ヒトネスチンの発現に関して免疫組織化学(IHC)により評価した。
第二の短期神経分化プロトコールにおいて、全ての細胞を、塩基性FGFの20ng/ml、EGFの20ng/ml及びPenStrep(Invitrogen社)と共に、15％FBS(Hyclone社)を含有するDMEM/F12培地(Invitrogen社)において、最初に4日間拡大した。4日後、これらの細胞をPBS(Invitrogen社)においてすすぎ、20％v/vFBS、PenStrepを含むDMEM/F12中で培養した。24時間後、細胞をPBSですすいだ。その後培地を、神経前駆細胞拡大培地(NPE)に交換し、これはB27(Gibco社)、4mM L-グルタミン、1μMレチノイン酸(Sigma社)、及びPenStrepと共に、NEUROBASAL(商標)-A基本培地(Gibco社)で構成された。4日後、各ウェルから培地を取り除き、細胞を、氷冷した4％w/vパラホルムアルデヒドにより10分間、室温で固定した。その後固定した試料を、星状膠細胞表現型に関してGFAP(グリア線維性酸性タンパク質)の発現についてIHCにより、及びニューロン表現型に関してTuJ1(ニューロン-特異性クラスIIIチューブリン)により、各々、評価した。
第一の分化プロトコールにおいて、全ての細胞型は、双曲細胞の形態(bipolar morphology)を伴う細胞型に形質転換され、且つネスチンにより陽性に染まった。神経前駆細胞は構成的に、予想されたようにネスチンを発現した。第二の分化プロトコールにおいて、ニューロン-関連(Tuj1)マーカー及び星状膠細胞-関連(GFAP)マーカーの発現を評価した。誘導時に、AMDAC、及びBM-MSCは、Tuj1を低レベルで発現した。線維芽細胞上の発現は、バックグラウンドのために、ぎりぎり陽性であることがわかった。AMDAC、及び1つのBM-MSC細胞株は、GFAPの低レベル発現を示した。陽性対照細胞株(神経前駆細胞)は、予想されたようにTuj1及びGFAPの両方を構成的に発現した。
従って、AMDACは、神経誘導条件下で、神経分化と一致する形態学的及び生化学的変化を示すことができる。
(6.4 実施例4：羊膜由来血管新生細胞を使用する免疫調節)
本実施例は、AMDACは、ビーズ-刺激したT細胞を利用するアッセイにおいて、インビトロにおいて免疫抑制機能を示すことを明らかにしている。
(6.4.1 T細胞増殖のAMDAC-媒介性抑制)
AMDACは、前記実施例1に説明したように入手した。CD4+及びCD8+ T細胞は、ヒト末梢血から入手した。
T細胞を、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)により標識し、且つ抗-CD3抗-CD28-コートされたDynabeadsと混合し、引き続きAMDACの非存在下で培養するか、或いはBead T-リンパ球反応(BTR)としても公知の、細胞と細胞が接触することができるようにAMDACと共培養した。AMDACとの共培養は、96-ウェルプレートのウェル内で、20,000個のAMDACの存在又は非存在下で、100,000個のT-リンパ球を、抗-CD3及び抗-CD28コートされたDynaBeads(Invitrogen社)と、ビーズ：T-リンパ球の比1:3で混合することにより、実行した。混合した(共培養)及び混合していない細胞培養物を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、5日間インキュベートした。正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)は、実質的にT細胞阻害活性を有さないが、これを陰性対照として使用し、AMDACと同じ条件に供した。
5日後、CD4+及びCD8+ T細胞上のCFSE蛍光を、フローサイトメトリーを用いて検出し、T細胞増殖の抑制率を、AMDAC又はNHDFと共培養しなかったCFSE-標識したT細胞の培養物と比較した、増殖していない(CFSE高)T細胞の増加した画分を基に計算した。図4に明らかにしたように、AMDACは、インビトロでのCD4+及びCD8+ T細胞の増殖を阻害し、これはAMDACは免疫調節性であることを示している。
(6.4.2 T細胞によるTNF-α分泌を阻害するAMDACにより馴化された培地)
AMDACは、前記実施例1に説明したように入手した。T細胞は、ヒト末梢血から入手した。
AMDACを、組織培養プレート上に播種し、一晩インキュベーションし、接着単層を形成した。翌日、AMDAC培養物を、AMDAC由来抗炎症因子の強力なインデューサーであることが先に示されているIL-1βにより刺激した。IL-1β刺激の16時間後、AMDACにより馴化された培地を回収し、抗-CD3 抗-CD28-コートされたDynabeadsによりコートされたヒト末梢血T細胞と、容積比9：1で混合した。抗-CD3 抗-CD28-コートされたDynabeadsによりコートされたヒト末梢血T細胞の別の集団を、対照として維持した。T細胞を、AMDAC-馴化培地と混合し、且つT細胞の混合していない集団を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、72時間インキュベーションした。正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)により馴化された培地は、実質的にTNF-α阻害活性を有さないが、これを陰性対照として使用し、AMDACと同じ条件に供した。
72時間培養後、T-細胞由来のTNF-αの濃度を、サイトメトリックビーズ-ベースのELISA法を用い、T細胞培養上清において測定した。TNF-α分泌の抑制率を、AMDAC-馴化培地と混合しなかった対照T細胞培地と比較した、AMDAC-馴化培地の存在下でのTNF-α濃度の減少を基に計算した。図5に明らかにしたように、AMDAC-馴化培地の存在下でのT細胞の培養は、T細胞由来のTNF-αの生成の抑制を誘導した。
(6.5 実施例5：T細胞コンパートメントを改変するAMDAC)
本実施例は、前記実施例1に説明したように入手した羊膜由来接着細胞(AMDAC)は、Th1、Th17及びFoxP3 Tregサブセットをスキューするよう影響を及ぼすことができることを明らかにしている。
(6.5.1 方法)
(Tリンパ球増殖アッセイ)
混合したリンパ球反応(MLR)を、先に実施例1に説明したように単離した20,000個のAMDAC細胞の存在又は非存在下で、FALCON平底96ウェル組織培養プレート(Fisher Scientific社、ピッツバーグ、PA)の各ウェルにおいて、100,000個のHLA-がマッチしないカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)-標識したTリンパ球を、10,000個の成熟樹状細胞(mDC)と混合することにより実行した。混合した細胞培養物を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、6日間培養した。6日目に、全ての細胞を回収し、抗-CD4-PE及び抗-CD8-APC(R&D systems社、ミネアポリス、MN)により染色した。
ビーズTリンパ球反応(BTR)を、96-ウェルプレートのウェル中で、100,000個のTリンパ球を、抗-CD3及び抗-CD28コートされたDynaBeads(Invitrogen社)と、ビーズ：Tリンパ球比1：3で混合することにより実行した。BTR反応は、20,000個のAMDAC細胞の存在又は非存在下で行った。混合した細胞培養物を、37℃、5％CO2、及び相対湿度90％で、6日間培養した。6日目に、全ての細胞を回収し、抗-CD4-PE及び抗-CD8-APC(R&D systems社、ミネアポリス、MN)により染色した。
Tリンパ球増殖は、FACS Canto II機器(BD社、フランクリンレーク、NJ)により、CD4及びCD8の単独の陽性細胞上の、CFSE蛍光強度の分析により測定した。本試験における全てのFACSデータは、flowjo 8.7.1ソフトウェア(Tree Star社、アッシュランド、OR)を用い分析した。
(T細胞スキュー(分極))
Th1スキューを、IL-2(200 IU/ml)、IL-12(2ng/ml)及び抗-IL-4(0.4μg/ml)を含有するサイトカインカクテルをスキューする追加のTh1によるBTR反応を用いて実行した。
Th17スキューに関して、5×105個の総Tリンパ球を、5×105 個選別されたCD14+単球、50ng/mL抗-CD3抗体(BD BioScienences社)及び100ng/mL LPS(Sigma Aldrich社)により、50,000個のAMDACの存在下又は非存在下のいずれかで6日間刺激した。Th17細胞集団は、CD4陽性集団上のIL-17を染色する、細胞内サイトカイン染色(ICCS)により分析した。
(細胞内サイトカイン及びFoxp3染色)
Th1細胞サブセットを、以下に列挙した。BTR反応からのT細胞を、50ng/mL酢酸ミリスチン酸ホルボール(PMA)及び750ng/mLイオノマイシン(PI)(Sigma Aldrich社)により5時間再活性化した。最後の3時間の間に、GOLGISTOP(商標)(Becton Dickinson社；タンパク質輸送阻害剤)を、添加した。次に細胞を、PE標識した抗-CD4抗体により、引き続きCytofix/Cytopermキット(Becton Dickinson社)を製造業者の指示に従い用い、APC複合した抗-IFN-γ抗体により、表面染色した。
Th17細胞サブセットを列挙するために、Th17スキュー活性化反応からのT細胞を、50ng/mL PMA及び750ng/mLイオノマイシン(Sigma Aldrich社)により5時間再活性化し、最後の3時間は、GOLGISTOP(商標)(Becton Dickinson社)が共に存在した。その後細胞を、PE標識した抗-CD4抗体により染色し、引き続きCytofix/Cytopermキット(Becton Dickinson社)を製造業者の指示に従い用い、APC複合した抗-IL-17抗体により染色した。
Treg細胞サブセットを列挙するために、BTR反応からのT細胞を、PE標識した抗-CD4抗体により表面染色し、引き続きFoxp3染色キット(eBioscience社、サンディエゴ、CA)を製造業者の指示に従い用い、APC複合した抗-Foxp3抗体により表面染色した。
(樹状細胞分化及び刺激)
未熟DC(iDC)を、マイトジェン-指向した分化により、磁気選別されたCD14+単球集団から作製した。簡単に述べると、iDCを、GM-CSF(20ng/ml)及びIL-4(40ng/ml)と1×106/mlで4日間培養した単球から得た。その後iDC(1×105個細胞)を、FALCON 24ウェル組織培養プレート(Fisher Scientific社、ピッツバーグ、PA)の各ウェルにおいて、1×105個AMDACの存在下又は非存在下のいずれかで、1μg/ml LPSにより24時間刺激した。培養上清を回収し、サイトカインプロファイルを、サイトメトリックビーズアレイ(CBA)により分析した。
(サイトメトリックビーズアレイ(CBA)分析)
培養上清中のサイトカイン濃度を、複数の可溶性被検体の同時定量的検出のためのサイトメトリックビーズアレイシステム(CBA；Becton Dickinson社)を製造業者の指示に従い用いて測定した。簡単に述べると、活性化されたT細胞により生成された下記サイトカインの特異的検出のために、BTR培養上清中の試料を、捕捉ビーズの混合物とインキュベーションした：IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、TNF、リンホトキシン-α(LT-α)及びIFN-γ。引き続き、ビーズに結合したサイトカインを、蛍光標識した検出試薬と結合させ、且つFACSCanto IIフローサイトメトリーを製造業者のプロトコールに従い用いて検出した。データを獲得し、FACS-DIVA 6.0 ソフトウェア(Becton Dickinson社)を用いて解析し、その後FCAP Array 1.0プログラム(Becton Dickinson社)を用いサイトカイン濃度を計算した。
(IL-21 ELISA)
可溶性IL-21を、eBioscience社からのIL-21 ELSAIキット(88-7216)を製造業者のプロトコールに従い用い、Th17スキュー培養から得られた上清中で測定した。
(NK増殖アッセイ及びNK細胞傷害アッセイ)
ヒトNK細胞を、NK細胞単離キット(Miltenyi Biotech社、オーバーン、CA)を製造業者の指示に従い用い、PBMCから単離した。NK細胞増殖を、35μg/mlトランスフェリン、5μg/mlインスリン、20Mエタノールアミン、1μg/mlオレイン酸、1μg/mlリノール酸、0.2μg/mlパルミチン酸、2.5μg/ml BSA、0.1μg/ml PHA(Sigma-Aldrich社)及び200IU/mlヒトIL-2(R&D社)を補充した10％ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone社)を含有する1ml IMDM中において、2.5×105個NK細胞を、マイトマイシンC処理した(16g/ml)フィーダー細胞(1×106個ヒト同種PBMC又は1×105個K562細胞のいずれか)と一緒に、培養することにより決定した。細胞を、等量のIMDM(10％FBS、2％ヒト血清及び400IU/ml IL-2)を3日毎に添加しながら、37℃、5％CO2でインキュベーションした。NK細胞数を、以下のように7日毎に、FACSにより決定した。簡単に述べると、総NK細胞を、組織培養ウェルから回収した。PBSで洗浄した後、細胞を2uM TO-PRO3で染色した。最後に、10μlカウンティングビーズ(Spherotech社、カタログ番号ACBP-50-10)を各試料に添加し、これは総細胞数の校正のための内部標準として働いた。相対NK数は、回収されたカウンティングビーズ1000個当たりの総生存NK細胞数を基に計算した。
NK細胞傷害アッセイを、NK細胞を、異なるエフェクター／標的(E/T)比で、標的細胞と混合することにより実行した。一晩培養した後、標的細胞数を、上記のカウンティングビーズ法と標的細胞からNK細胞を分化するための細胞表面マーカーを用い、決定した。K562細胞のNK細胞傷害性に関して、K562細胞はHLA-ABC陰性であるので、FITC複合した抗-HLA-ABC抗体を、NK細胞マーカーとして使用した。AMDAC細胞に関して、CD90-PEを、AMDACをNK細胞及びK562細胞から識別するために使用した。細胞傷害率は、下記式のように計算した：（1−試料中の総標的数÷NK細胞を含まない対照中の総標的細胞）×100。
(6.5.2 T細胞コンパートメントのAMDACスキュー)
T細胞コンパートメントにおけるスキューに影響を及ぼすAMDACの能力を、T細胞及びAMDAC共培養を使用するTh1及びTh17スキューアッセイにおいてT細胞を生成するサイトカインを測定することにより試験した。簡単に述べると、Th1スキューアッセイにおいて、AMDACを予めプレーティングした。翌日、1×106個/ml T細胞、Dynabeads 6×105個/ml、IL-2(200IU/ml)、IL-12(2ng/ml)、及び抗-IL-4(0.4μg/ml)を添加し、AMDACと混合した。4日後、Th1細胞の割合を、インターフェロン-ガンマ(IFN-γ)細胞内染色により分析した。図6に示すように、AMDACは、投与量依存的様式で、Th1の割合を大きく低下した。同様に、Th17スキューアッセイにおいて、AMDACを一晩予めプレーティングした。その後T細胞(1×106/ml)、CD14+細胞(1×106/ml)、抗-CD3(50ng/ml)及び細菌リポ多糖体(LPS)(100ng/ml)の混合物をAMDACを含むプレートに添加した。6日間培養した後、Th17の割合を、IL-17細胞内染色により試験した。図7に示すように、AMDACは、投与量依存的様式で、Th17の割合を抑えた。AMDACのFoxP3陽性T細胞集団に対する作用を調べるために、1×106個PBMCを、AMDACと6日間共培養した。FoxP3陽性集団を、FoxP3細胞内染色により分析した。図8に示したように、AMDACは、FoxP3陽性T細胞集団をわずかに増加した。
(6.5.3 DC成熟及び機能のAMDAC媒介性調節)
本実験は、AMDACは、未熟樹状細胞(DC)の成熟及び分化を調節することを明らかにしている。
DCの成熟及び機能のAMDAC-媒介性調節を調べるために、単球由来の未熟DCを、AMDACの存在下又は非存在下で、LPS単独又はLPSとIFN-γの組合せで処理し、DC成熟プロセスを更に駆動した。DC成熟は、DC成熟マーカーCD86及びHLA-DRのFACS染色により分析した。DC機能評価は、IL-12の細胞内染色により、及びCBAによる可溶性サイトカイン生成の測定により、評価した。図9A及び9Bに示すように、DC上のCD86(図9A)、HLA DR(図9B)発現のダウンモジュレーションにより、AMDACは、LPS-誘導した及びLPS＋IFN-γ-誘導したDC成熟を強力に抑制した。更に、図9Cに示したように、AMDACは、LPS＋IFN-γ-刺激したIL-12-生成DC集団の形成を〜70％、有意に抑制した。AMDACは更に、LPS-刺激したDCによるTNF-α及びIL-12の生成を抑制することができることがわかった。図10参照。
(6.5.4 Th17スキュー培養物中のIL-21生成を抑制するAMDAC)
IL-21は、Th17集団の維持に必要な重要なサイトカインである。AMDACは、IL-21生成を調節することができるかどうかを調べるために、「方法」の項に説明したように、AMDACをTh17スキュー培養物に導入した。AMDACは、AMDAC細胞を含まないTh17スキュー培養物と比べ、AMDAC-Th17共培養において、IL-21生成を72.35％抑制した。AMDACはまた、AMDAC非存在培養物と比べ、Th17 T細胞数を72.65％抑制した。
(6.5.5 NK細胞の細胞傷害性及び増殖のAMDAC調節)
NK細胞は、先天性免疫系の主要成分を構成する細胞傷害性リンパ球である。NK細胞は、ウイルス感染された腫瘍及び細胞の拒絶反応に加え、同種細胞及び組織の拒絶反応において大きい役割を果たす。AMDACのNK細胞に対する免疫調節作用を調べるために、NK細胞増殖及び細胞傷害アッセイを確立した。図11に示したように、AMDACは、AMDAC細胞を有さない対照と比べ、ヒトNK細胞増殖を抑制した。
加えて、NK細胞の細胞傷害性に対するAMDACの作用を調べた。このアッセイにおいては、AMDACを、先の「方法」の項に説明したように、NK細胞傷害アッセイへ導入した。簡単に述べると、予め播種したAMDAC(1×105個細胞)の2倍滴定を行いながら、1×106個NK細胞を、1×105個K562細胞(E/T比10：1)と混合した。NK細胞及びK562細胞を一晩共培養し、且つNK細胞の細胞傷害性を、先の「方法」の項に説明したように、プロトコールに従い決定した。図12に示したように、AMDAC細胞は、ヒトNK細胞の細胞傷害性を投与量依存的様式で抑制した。
(6.6 実施例6：ラットSCIモデルにおけるAMDACを使用するSCI治療)
この実施例は、AMDACの、脊髄損傷に対する作用を評価する、特にラットの未損傷脊髄及び損傷脊髄に移植されたAMDACの免疫拒絶、遊走、及び分化を評価する、例証的モデル及び方法を提供する。このモデルは、AMDAC投与の単独での作用、又は第二の治療選択肢との組合せ、例えばメチルプレドニゾロン、リチウム、及び／若しくはシクロスポリンAとの共投与での作用の評価を提供する。歩行回復(BBBスコア)、皮質脊髄路及びセロトニン作動性軸索の再生、並びに脊髄の白質領域を含む機能に対するAMDACの作用を、細胞移植をしない対照ラットと比べ、シクロスポリンを伴う又は伴わずに、損傷後12週で評価する。該細胞は、損傷後直ぐ、2週目、及び6週目に脊髄へ移植し、脊髄損傷の急性相、亜急性相及び慢性相への細胞の移植をシミュレートする。損傷後0、1、2、3、4、及び6週目に、投与したAMDACの生存、遊走、及び分化を評価する。加えて、AMDACの投与後の神経原性増殖因子、例えばニューロトロフィンの発現を、遺伝子チップ、RT-PCR及びELISA法を用いて評価することができる。
(実験デザイン)
(AMDACのインビボ持続性) AMDACを、0、1、2、3、4、及び6週目に、25mm重り落下による脊髄損傷の苦痛を伴う又は伴わないラット脊髄の椎骨分節のT9の上端及びT10の下端で、中心灰白質領域に注射する(n＝4/群)。6週間後、ラットを、ペントバルビタール60mg/kgで麻酔し、ホルムアルデヒドで灌流し、且つ脊髄を水平に切断し、落射蛍光解剖顕微鏡により試験する。注射部位からの様々な距離でのAMDACの分布を蛍光により測定し、且つ切片を、β-3-チューブリン(ニューロン)、GFAP(星状膠細胞)、ネスチン(前駆細胞)マーカーについて免疫組織学的に染色する。
(治療) AMDAC投与したラットを、メチルプレドニゾロン(MP、移植時30mg/kgボーラス)、リチウム(Li、100mg/kg/日で6週間)、及びシクロスポリン(CsA、10mg/kg/日)で治療し、且つ損傷及び移植後6週目の移植したAMDACの数、分布、及び特徴を評価する。AMDAC単独、MP単独、Li単独、CsA単独、又はMP＋Liの作用を評価する。細胞を定量するために、脊髄中のヒトDNA及び緑色蛍光タンパク質(GFP)の量を測定する。AMDAC中の短-中期GFP発現を、構成的GFP発現カセットをコードしているプラスミドベクターのAmaxa-ベースのエレクトロポレーションにより達成する。長期発現は、構成的GFP発現をコードしているレンチウイルスベクターを使用し達成する。
(遺伝子／タンパク質発現) RT/PCR及びELISAを使用し、治療していない動物、又はAMDAC単独、AMDAC＋MP、AMDAC＋MP及びLi、並びにAMDAC＋MP、Li及びCsAで治療した動物において、LIF、BDNF、GDNF、NT3、NGFA、及びGFPのmRNA及びタンパク質のレベルを測定する。
(回復／再生) AMDACは、CsAを伴う又は伴わずに、損傷後2週間及び6週間に移植し、且つ動物は、12週間維持する。移動運動回復(BBB)を評価し、組織学的試験を行う。
(プロトコール)
(麻酔) 77±1日齢のSprague-Dawleyラットに、椎弓切除術を施す。ラットを、腹腔内ペントバルビタール(雌45mg/kg、雄65mg/kg)により麻酔する。5分以内に深麻酔状態とならなかったラットは、本実験から除外する。損傷後1週目及び4週目の脊髄への細胞の遅延移植のために、ラットは、頭部錐体(head-cone)を介したイソフルランでの自発呼吸により麻酔する(5％で5分間誘導し、その後1％で維持)。
(脊髄損傷) ラットを剃毛し、且つ手術部位をベタジン処理した後、背側正中切開を行い、T8-11脊柱を露出し、且つT9-10椎弓切除術を行い、下側にあるT13脊髄を露出する。ラットを、TS及びT11背側突起上に配置したクランプにより懸架する。麻酔導入の1時間後に、10gの棒を、T13脊髄上25mmに落下する。ポリ乳酸及びポリカプリラクトンの薄いシート(100μ)を癒着を防止するために硬膜上に配置し、且つ自家皮下脂肪小片を椎弓切除部位に配置し、瘢痕形成を遅らせる。椎弓切除の上側及び下側で、筋肉を正中線で絹糸により縫合する。皮膚をステンレス製クリップで閉じる。クリップは1週間後に取り外す。
(細胞移植) 硬膜を、26-ゲージツベルクリン注射器で切開し、200,000個細胞の1μL懸濁液を、脊髄へ注射する。遅延移植のためには、椎弓切除部位を、イソフルランによる麻酔後に再度開放し、小さい硬膜切開を行い、衝撃部位に対し吻側及び尾側の脊髄へ、マイクロピペットを用い、細胞200,000個の1μL懸濁液を2回注入する。
(術後ケア) ラットが覚醒するまでは、ラットをヒーティングパッド上に維持する。チアノーゼ(ラットの足の色から)を示すラットには、分泌物を清掃し且つ呼吸を刺激するために、経口気道吸引を施す。呼吸器閉塞の発生が比較的多い場合は、術中の分泌物の増加を低下するために、アトロピン0.04mg/kg IM又はグリコピロレート0.5mg/kg IMを任意に投与する。脱水の徴候(例えば、背中の皮膚をつまんで、数秒以内に戻ることができない)を示すラットは、皮下食塩水注射5〜10ml(雌5ml、雄10ml)を投与する。尿道及び創傷の感染症を減らすために、全てのラットにはセファゾリン50mg/kgを毎日皮下に7日間投与する。
(術後鎮痛) 脊髄損傷したラットは一般に、疼痛の証拠を示さず、その理由はこの損傷は損傷部位で又はその下側で感覚消失(anesthesia)を引き起こすからである。しかしながら、椎弓切除術のみを施された動物、すなわち脊髄損傷を伴わず術後疼痛を示す動物については、局所麻酔薬ブピバカイン(Marcaine)を、手術部位に最大投与量2mg/kg体重で投与する。各動物を、疼痛の証拠についてモニタリングし、且つ必要ならば緩和を施す。
(長期ケア) ラットを、毎日検査し、移動運動スコア(BBB)について毎週評価する。最初に、動物を毎日2回検査し、触診がラットの膀胱内の尿＞1mlを示す場合、手作業で絞り出す(expressed)。開始後7日間に、膀胱感染症の指標である、濁った血尿を伴うラットには、Baytril(フルオロキノロン抗生物質)2.5mg/kg/日を7〜10日間投与する。この投与量で感染症が治らない場合、ラットを安楽死させる。第二に、ラットを無菌白色紙製寝床(Alpha Dry)上に維持し、これはラットを乾燥状態で維持し血尿の存在を示す。血尿を示すラットは取りのけ、感染症の伝播を防ぐために、他のラットから離してケアする。第三に、ラットが疼痛の証拠(発声、接触に対する過敏)又は自咬症(脱毛又は皮膚穿通により明らかになる損傷部位の下側の皮膚分節を噛む)を示す場合、ラットには、経口アセトアミノフェン(64mg/kg/日、「Baby Tylenol」、経口)を、それらの皮膚病巣が完全に治癒するまで毎日投与する。疼痛の治療可能な原因が認められない場合、ラットは安楽死させる。動物は第1週は毎日、それ以後は週1回体重を量る。
(安楽死) 全ての動物は、ペントバルビタール (雌-雄投与量100mg/kg)で深麻酔をかけ、分子試験のために断頭するか、又は固定及び組織試験のために4％パラホルムアルデヒド溶液で灌流する。
(6.7 実施例7：ラットTBIモデルにおけるAMDACを使用するTBIの治療)
この実施例は、AMDACの、外傷性脳損傷に対する作用を評価する、例証的モデル及び方法を提供する。いずれか特定の理論又は作用機構と結びつけることを意図するものではないが、外傷性脳損傷は、循環免疫細胞の増加と相関する、脾臓重量の減少を生じ、これは血液脳関門透過性の増大に繋がると考えられる。従って本方法は、AMDACの、免疫反応を調節する能力；脾細胞と同時局在化し、脾細胞の増殖並びにIL-4及びIL-10などの抗炎症サイトカインの分泌を促進する能力；脾臓重量を保持する能力；並びに、誘導された外傷性脳損傷後の、血液脳関門の完全性を維持する能力を評価することを提供する。
(インビボ方法)
(制御皮質衝撃損傷) 制御皮質衝撃(CCI)装置、例えばeCCIモデル6.3(VCU社、リッチモンド、VA)を使用し、その開示が全体として引用により本明細書中に組み込まれているLighthallJ.の文献(Neurotrauma 5, 1-15 (1988))に説明されたように、片側性の脳損傷を与える。体重225〜250gの雄のラットを、4％イソフルラン及びO2により麻酔をかけ、各ラットの頭部を、定位固定式フレームに載せる。頭を、水平面に維持する。正中線切開を用い露出し、且つ7〜8mmの頭蓋骨切除術を右側頭蓋冠に行う。頭蓋骨切除術の中心が、ブレグマとラムダの間の中央に、正中線から側方に〜3mmに、側頭頭頂皮質に重なるように、配置する。動物には、直径6mmの衝撃装置尖端(impactor tip)を用い、へこみ深さ3.1mmの、衝撃速度5.8m/秒、及び滞留時間150ms(中等度−重度の損傷)を、垂直面からの角度10°で、1回の衝撃を施し、皮質表面に対し直交する衝撃を生じる。この衝撃は、頭頂連合皮質に行う。シャム損傷を、動物に麻酔をかけ、正中線切開を行い、且つ頭蓋から皮膚、結合組織及び腱膜を分離することにより行う。その後切開は閉じる。
(AMDACの調製及び静脈内注射) 注射前に、AMDACを解凍し、リン酸緩衝食塩水(PBS)ビヒクルで洗浄し且つ懸濁し、濃度2×106個細胞/mLとする。トリパンブルー排出により、細胞をカウントし、生存度をチェックする。静脈内注射直前に、AMDACを、穏やかに8〜10回滴定し(titrate)、細胞の均質な混合を確実にする。AMDACを、CCI損傷後2時間及び24時間の両方で、2つの異なる投与量(CCI＋2×106個AMDAC/kg、及びCCI＋10×106個AMDAC/kg)で注射する。従って、各処置動物は、それらに割り当てられたAMDAC濃度の2つの個別の投与量を受け取る。CCI損傷対照動物は、細胞処理動物と同じ指定された時点で、PBSビヒクル注射のみを受け取る。
(ラット脾臓摘出) 脾臓摘出後のラットで行った全ての実験に関して、雄のSprague Dawleyラットを、前述のように麻酔をかけ、背臥位で配置する。腹部四分円の左上部に小さい3cm切開を作製し、その後脾臓を引き出し(retraction)、脾門を結紮する。脾臓摘出後、切開部を連続縫合により閉じる。脾臓摘出術後、動物は回復させ、72時間順応させる。その後全ての実験は、当初の脾臓摘出術後72時間で完了する。
(エバンスブルー血液脳関門(BBB)透過性分析) CCI損傷の72時間後、ラットを、前述のように麻酔をかけ、PBS中の3％エバンスブルー色素1mL(4cm3/kg)を、右側内頸静脈へ直接カニューレを介して注入する。動物を60分間回復させ、色素を灌流させる。この後、動物を右心房穿刺により屠殺し、4％パラホルムアルデヒドを灌流する。次に動物を断頭し、その後脳を摘出する。小脳を、残りの皮質組織から解離する。この脳を、正中線を通って分割し、各半球の塊(損傷と同側及び損傷と対側)を規準化のために測定する。引き続き、各半球を、色素抽出のために、ホルムアミド5mL中50℃で一晩インキュベートする。遠心分離後、各試料からの上清100μLを、96ウェルプレートに移し(3つ組)、吸光度を620nmで測定する。全ての値を、半球重量に対し規準化する。
(皮質免疫組織化学) BBB完全性を、タイトジャンクションタンパク質オクルジン(occluding)についての免疫染色により、及び蛍光顕微鏡による可視化(核についてDAPIブルー、及びオクルジンについてFITCグリーン)により更に試験する。CCI損傷の72時間後、無傷の脾臓を持つラット及び脾臓摘出後のラットの両方の4群(未損傷、CCI損傷のみ、CCI損傷＋2×106個AMDAC/kg、及びCCI損傷＋10×106個AMDAC/kg)を、屠殺し迅速に断頭する。脳を摘出し、両半球(損傷の同側及び対側)を分離する。その後組織試料を、直ちに予め冷却した2-メチルブタン中に配置し、瞬間凍結する。試料を、ドライアイスへ移し、組織を切片化するまで−80℃で貯蔵する。その後組織試料を、最適切断温度（Optimal Cutting Temperature）化合物、例えばSakura Finetek社(トランス、CA)中に配置し、且つ直接損傷領域を貫通する20μmの凍結切片を作製する。血管構造に対する直接損傷は、タイトジャンクションタンパク質オクルジンの抗体(例えば、1：150希釈、Invitrogen社、カールスバッド、CA)及び好適なフルオレセインイソチオシアネート(FITC)複合した二次抗体(例えば、1：200希釈、Invitrogen社、カールスバッド、CA)で染色することにより評価する。全ての抗体染色後、組織切片を、核染色について4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(例えば、Invitrogen社、カールスバッド、CA)により対抗染色し、且つ蛍光顕微鏡により可視化する。
(脾臓の免疫組織化学) インビボにおいてAMDACを追跡するため、例えば投与されたAMDACは肺微小血管を迂回し脾臓に達するかどうかを決定するために、ラットの4群(未損傷、CCI損傷のみ、CCI損傷＋2×106個AMDAC/kg、及びCCI損傷＋10×106個AMDAC/kg)に、シャム損傷又はCCI損傷のいずれかを施す。次に2つの治療群には、量子ドット(例えば、QDOT、Qtracker細胞標識キット525及び800、Invitrogen社、カールスバッド、CA)標識した(製造業者の指示するプロトコールに従い)AMDACの注射を、CCI損傷後2及び24時間で投与する。二回目のQDOT標識したAMDAC注入の6時間後、動物を屠殺し、脾臓を摘出する。その後脾臓を、蛍光スキャナー(例えば、Odyssey Imaging System、Licor社、リンカーン、NE)上に配置し、QDOT標識したAMDACを局在化する。走査が完了した後、組織試料を、直ちに予め冷却した2-メチルブタン中に配置し、瞬間凍結する。試料を、ドライアイスへ移し、使用するまで−80℃で貯蔵する。次に組織試料を、最適切断温度(Optimal Cutting Temperature)化合物(例えばSakura Finetek社、トランス、CA)中に配置し、且つ脾臓を貫通する10μmの凍結切片を作製する。組織切片を、核染色について4'6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Invitrogen社、カールスバッド、CA)により染色し、且つQDOT標識したAMDAC及び脾細胞の両方を、蛍光顕微鏡により可視化する。更に脾臓の構造を評価するために、ヘマトキシリン・エオシン染色を、製造業者の指示するプロトコールに従い行う。
(脾細胞単離／脾臓重量の測定) 損傷の72時間後、動物に脾臓摘出を施し、脾臓重量を測定する。動物をこの時点で安楽死させる。次に脾臓を、レーザーブレードを用い小片とし、基本培地(RPMI中の10％FBS及び1％ペニシリン／ストレプトマイシン)で洗浄し、破砕し、且つ100μmフィルターを通して濾過する。このフィルターから流出した試料を、穏やかに8〜10回滴定し、引き続き40μmフィルターを通して濾過し、あらゆる残存する結合組織を除去する。この試料を、1000gで3分間遠心分離する。次に上清溶液を除去し、且つ試料を赤血球溶解緩衝液(Qiagen Sciences社、バレンシア、CA)3mL中に懸濁し、氷上で5分間インキュベーションする。引き続き試料を、基本培地で2回洗浄し、前述の設定を用いて遠心分離する。トリパンブルー排出により、脾細胞をカウントし、生存度をチェックする。
(インビボ脾細胞増殖アッセイ) 屠殺した時点で活発に増殖している脾細胞(S相)の割合を、例えば、Click-iT(商標)EdUフローサイトメトリーアッセイキット(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を製造業者の指示したプロトコールに従い用いて測定する。簡単に述べると、脾細胞を、72時間の時点で収集し、この細胞に20mMEdUを添加し、2時間インキュベーションする。次に、これらの細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定する。細胞を、Triton-X100を用いて透過性とし、次に該製造業者から提供された抗-EdU抗体「カクテル」を添加する。最後に、これらの細胞を洗浄し、引き続きリボヌクレアーゼ及びCellCycle488-Red染色を添加し、DNA含量を分析する。
(インビボ脾細胞アポトーシスアッセイ) 屠殺時のアポトーシス脾細胞の割合を、例えばアネキシンV染色(BD Biosciences社、サンノゼ、CA)を製造業者の指示したプロトコールに従い用いて測定する。簡単に述べると、単離後、脾細胞を、冷PBSにより2回洗浄する。次に、1×106個細胞を、アネキシンV及び7-アミノ-アクチノマイシン(7-AAD)の5μLと一緒に15分間インキュベーションする。その後フローサイトメトリーを用い、アポトーシス細胞の割合を測定する。定量的PCR RNAを、例えば、RNEasyカラム(Qiagen社、バレンシア、CA)を製造業者の仕様に従い用いて、脾細胞から単離する。ラットの参照RNA(Stratagene社、ラホヤ、CA)を、陽性対照として用いる。cDNAの合成は、M-MLV逆転写酵素及びランダムヘキサマー(Promega社、マジソン、WI)により実行する。対照反応を、ゲノムDNA夾雑を制御するために、逆転写酵素を使わずに実行する。qPCRを、例えば、ABI 7500を9600エミュレーションで用い、行う。
(インビトロ法)
(脾細胞培養) 密度7.5×105個細胞/mLの培養脾細胞を、コンカナバリンA 2μgで刺激した成長培地(RPMI中の10％FBS、1％ビタミンを含むRPMI、1％ピルビン酸ナトリウム、0.09％2-メルカプトエタノール、及び1％ペニシリン／ストレプトマイシン)において72時間拡大する。
(脾細胞特徴づけ) 単離した脾細胞を、単球、好中球、及びT細胞集団を決定するために、フローサイトメトリーにより分析する。単球及び好中球は、各々、CD200及びCD11b/CD18に対する抗体を用いて測定する。脾細胞T細胞集団を、CD3、CD4、及びCD8抗体を用いて標識する。全ての染色は、製造業者の指示したプロトコールに従い完了する。
(インビトロにおける増殖アッセイ) 刺激した成長培地において培養した後の活発に増殖しているCD4+脾細胞(S相)の割合を、例えば、Click-iT(商標)EdUフローサイトメトリーアッセイキット(Invitrogen社、カールスバッド、CA)を製造業者の指示したプロトコールに従い用いて測定する。簡単に述べると、脾細胞を、密度7.5×105個細胞/mLで、前述のように、コンカナバリンA 2μgで刺激した成長培地において、72時間培養する。20mM EdUを添加し、1時間インキュベーションする。次に、これらの細胞を、DMEM中の4％ウシ血清(4％FBS)で洗浄し、且つCD4-PEを添加し、関心対象のT細胞集団をゲート開閉(gate)する。30分間のインキュベーション後、細胞を洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで固定する。細胞を、Triton-X100を用いて透過性とし、次に該製造業者から提供された抗-EdU抗体「カクテル」を添加する。最後に、これらの細胞を洗浄し、引き続きリボヌクレアーゼ及びCellCycle488-Red染色を添加し、DNA含量を分析する。
(インビトロにおける脾細胞サイトカイン産生) 刺激した成長培地での培養後、抗炎症サイトカインIL-4及びIL-10の産生を、例えば、BD Cytometric Bead Array flexセット(BD Biosciences社、サンノゼ、CA)を製造業者の指示したプロトコールに従い用いる、フローサイトメトリーにより定量した。
(6.8 実施例8：組織修復のためのAMDACの使用)
本実施例は、線維形成を調節し、組織を修復するためのAMDACの使用方法を明らかにしている。
ELISAアッセイ及びマルチプレックスアッセイを用い、2つの細胞型の分泌プロファイルを評価するために、AMDAC-馴化培地を、正常ヒト皮膚線維芽細胞(NHDF)の馴化培地と比較した。AMDACはフォリスタチンを、NHDFにより分泌されるフォリスタチン量よりも、多く分泌すると決定した。AMDACはまた肝細胞増殖因子(HGF)を、NHDFにより分泌されるHGF量よりも、多く分泌すると決定した。加えて、AMDACは、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)1、MMP2、MMP7、及びMMP10を分泌すると決定した。
AMDACは、NHDFに比べ、フォリスタチン及びHGFの両方を高レベルで分泌すること、並びにAMDACはMMP1、MMP2、MMP7、及びMMP10も分泌するという決定は、AMDACは、インビボにおいて線維形成を調節することができ、その結果組織修復に関連する方法、例えば本明細書に説明された方法において有用となり得ることを指摘している。
(6.9 実施例9：羊膜由来接着細胞を用いる治療方法)
(6.9.1 AMDACを用いるSCIの治療)
脊髄損傷(SCI)を呈し、且つ感覚機能及び／又は運動機能の喪失を経験している個人。個人に、0.9％ NaCl溶液中2.5×108〜1×1010個のOCT-4-、CD49f+羊膜由来接着細胞(AMDAC)の細胞集団を静脈内投与する。個人を、次の1ヶ月にわたってモニタリングし、1種以上の該症状の軽減を評価する。加えて個人を、続く1年間にわたり経過モニタリングし、例えば症状が戻るか又は重症度が増した場合には、必要に応じ、同投与量のAMDACを投与する。
(6.9.2 AMDACを用いるSCIの治療)
脊髄損傷(SCI)を呈し、且つ感覚機能及び／又は運動機能の喪失を経験している個人。個人に、0.9％ NaCl中1×106〜1×107個のOCT-4-、CD49f+羊膜由来接着細胞(AMDAC)の細胞集団を脊髄損傷部位に投与する。個人を、次の1ヶ月にわたってモニタリングし、1種以上の該症状の軽減を評価する。加えて個人を、続く1年にわたり経過モニタリングし、例えば症状が戻るか又は重症度が増した場合には、必要に応じ、同投与量のAMDACを投与する。
(6.9.3 AMDACを用いるTBIの治療)
外傷性脳損傷(TBI)を呈し、且つ記憶喪失、注意不足／集中力不足、及び／又は眩暈／平衡感覚障害を経験している個人。個人に、0.9％ NaCl溶液中2.5×108〜1×1010個のOCT-4-、CD49f+羊膜由来接着細胞(AMDAC)の細胞集団を静脈内に投与する。個人を、次の1ヶ月にわたってモニタリングし、1種以上の該症状の軽減を評価する。加えて個人を、続く1年にわたり経過モニタリングし、例えば症状が戻るか又は重症度が増した場合には、必要に応じ、同投与量のAMDACを投与する。
(6.9.4 AMDACを用いるTBIの治療)
外傷性脳損傷(TBI)を呈し、且つ記憶喪失、注意不足／集中力不足、及び／又は眩暈／平衡感覚障害を経験している個人。個人に、0.9％ NaCl中1×106〜1×107個のOCT-4-、CD49f+羊膜由来接着細胞(AMDAC)の細胞集団を頭蓋内に投与する。個人を、次の1ヶ月にわたってモニタリングし、1種以上の該症状の軽減を評価する。加えて個人を、続く1年にわたり経過モニタリングし、例えば症状が戻るか又は重症度が増した場合には、必要に応じ、同投与量のAMDACを投与する。
等価物：
本発明は、本明細書に記載の具体的実施態様によって範囲が限定されるべきではない。実際、記載されたものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明及び添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような変更は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
様々な刊行物、特許、及び特許出願が本明細書で引用されており、それらの開示は、その全体が引用により組み込まれている。

Claims (37)

  1. 治療有効量の羊膜由来接着細胞、又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地を個体へ投与することを含む、中枢神経系の疾患、障害又は病態を有するか又はその発症のリスクがある個体を治療する方法であって、ここで該治療有効量が、該疾患、障害又は病態の1以上の症状の検出可能な改善を引き起こすのに十分な量であり、且つここで該AMDACが、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-であり、且つ組織培養プラスチックに接着する、前記方法。
  2. 前記AMDACが、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-であり、且つフローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+、CD105+、及びCD200+である、請求項1記載の方法。
  3. 前記AMDACが、免疫局在化により決定可能なVEGFR1/Flt-1(血管内皮増殖因子受容体1)及びVEGFR2/KDR(血管内皮増殖因子受容体2)について陽性である、請求項1記載の方法。
  4. 前記AMDACが、フローサイトメトリーにより決定可能なCD90+及びCD117-であり、且つRT-PCRにより決定可能なHLA-G-である、請求項1記載の方法。
  5. 前記AMDACが、RT-PCRにより決定可能なOCT-4-及びHLA-G-であり、且つフローサイトメトリーにより決定可能なCD49f+、CD90+、CD105+、及びCD117-である、請求項4記載の方法。
  6. 前記AMDACが加えて、免疫局在化により決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+(アンジオポエチン受容体)、TEM-7+(腫瘍内皮マーカー7)、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、又はCXCR4-(ケモカイン(C-X-Cモチーフ)受容体4)の1以上である、請求項1記載の方法。
  7. 前記AMDACが加えて、免疫局在化により決定可能な、CD9+、CD10+、CD44+、CD54+、CD98+、Tie-2+、TEM-7+、CD31-、CD34-、CD45-、CD133-、CD143-、CD146-、及びCXCR4-である、請求項1記載の方法。
  8. 前記AMDACが、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、CD117-、及びCD200+であり、且つここで該AMDACが：
    (a)免疫局在化により決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、又はVEGFR2/KDR(CD309)の1以上を発現するか；
    (b)免疫局在化により決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、又はVE-カドヘリンの発現を欠くか；
    (c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠くか；
    (d)
    Figure 2014507389
     のmRNAを発現するか；
    (e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、又はミオシン重鎖、非筋A型の1以上を生成するか；
    (f)血管内皮増殖因子(VEGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インターロイキン-8(IL-8)、単球走化性タンパク質-3(MCP-3)、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、又はガレクチン-1を、AMDACが成長している培養培地へ分泌するか；
    (g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、又はmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現するか；
    (h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現するか；
    (i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、又はmiR-16を発現するか；或いは
    (j)21％O2下で培養された場合のCD202b、IL-8又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8又はVEGFを増加したレベルで発現する、請求項1記載の方法。
  9. 前記AMDACが、RT-PCRにより決定可能な、OCT-4-であり、且つ免疫局在化により決定可能な、CD49f+、HLA-G-、CD90+、CD105+、及びCD117-であり、且つここで該AMDACが：
    (a)免疫局在化により決定可能な、CD9、CD10、CD44、CD54、CD98、CD200、Tie-2、TEM-7、VEGFR1/Flt-1、及びVEGFR2/KDR(CD309)を発現するか；
    (b)免疫局在化により決定可能な、CD31、CD34、CD38、CD45、CD133、CD143、CD144、CD146、CD271、CXCR4、HLA-G、及びVE-カドヘリンの発現を欠くか；
    (c)RT-PCRにより決定可能な、SOX2の発現を欠くか；
    (d)RT-PCRにより決定可能な、
    Figure 2014507389
     のmRNAを発現するか；
    (e)タンパク質CD49d、コネキシン-43、HLA-ABC、β2-ミクログロブリン、CD349、CD318、PDL1、CD106、ガレクチン-1、ADAM 17、アンギオテンシノーゲン前駆体、フィラミンA、α-アクチニン1、メガリン、マクロファージアセチル化LDL受容体I及びII、IIB型アクチビン受容体前駆体、Wnt-9タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質、星状膠細胞、ミオシン-結合タンパク質C、及び／又はミオシン重鎖、非筋A型を生成するか；
    (f)VEGF、HGF、IL-8、MCP-3、FGF2、フォリスタチン、G-CSF、EGF、ENA-78、GRO、IL-6、MCP-1、PDGF-BB、TIMP-2、uPAR、及びガレクチン-1を、該細胞が成長している培養培地へ分泌するか；
    (g)マイクロRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、及びmiR-296を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより高いレベルで発現するか；
    (h)マイクロRNA類miR-20a、miR-20b、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を、同等数の骨髄由来間葉系幹細胞よりもより低いレベルで発現するか；
    (i)miRNA類miR-17-3p、miR-18a、miR-18b、miR-19b、miR-92、miR-20a、miR-20b、miR-296、miR-221、miR-222、miR-15b、及びmiR-16を発現するか；或いは
    (j)21％O2下でのCD202b、IL-8及び／又はVEGFの発現と比べ、約5％未満O2で培養された場合にCD202b、IL-8及び／又はVEGFを増加したレベルで発現する、請求項8記載の方法。
  10. 更に、第二の型の幹細胞を該個体へ投与することを含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  11. 前記第二の型の幹細胞が、胚性幹細胞、末梢血から単離された幹細胞、胎盤血から単離された幹細胞、胎盤灌流液から単離された幹細胞、胎盤組織から単離された非-AMDAC幹細胞、臍帯血から単離された幹細胞、臍帯幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、脂肪由来幹細胞、造血幹細胞、又は体性幹細胞である、請求項10記載の方法。
  12. 前記疾患、障害又は病態が、脊髄損傷である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記脊髄損傷が、直接外傷からの破壊により引き起こされる、請求項12記載の方法。
  14. 前記脊髄損傷が、骨片又は椎間板物質による圧迫により引き起こされる、請求項12記載の方法。
  15. 前記疾患、障害又は病態が、脊髄損傷から生じる脊髄ショックである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  16. 前記疾患、障害又は病態が、脊髄損傷から生じる神経原性ショックである、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記疾患、障害又は病態が、脊髄損傷から生じる自律神経反射異常である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記疾患、障害又は病態が、脊髄損傷から生じる浮腫である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記疾患、障害又は病態が、脊髄中心症候群、ブラウン・セカール症候群、脊髄前部症候群、脊髄円錐症候群、及び馬尾症候群からなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記脊髄損傷が、頸椎、胸椎、腰椎、又は仙椎の1以上にある、請求項12記載の方法。
  21. 前記脊髄損傷が、頸髄、胸髄、腰仙椎、円錐(conus)、後頭部の1以上、又は馬尾神経の1以上に対するものである、請求項12記載の方法。
  22. 前記1以上の症状が、脊髄の頸髄分節、胸髄分節、腰髄分節又は仙髄分節の運動機能、感覚機能、又は運動感覚機能の喪失又は障害を含む、請求項12記載の方法。
  23. 前記1以上の症状が、腕、胴体、脚又は骨盤器官の運動機能、感覚機能、又は運動感覚機能の喪失又は障害を含む、請求項12記載の方法。
  24. 前記1以上の症状が、皮膚分節C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10、T11、T12、L1、L2、L3、L4又はL5の1以上の無感覚を含む、請求項12記載の方法。
  25. 前記羊膜由来接着細胞又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量が、脊髄損傷の14日以内に個体に投与される、請求項12記載の方法。
  26. 前記個体へ第二の治療薬を投与することを含む、請求項12記載の方法。
  27. 前記第二の治療薬が、コルチコステロイド、神経保護薬、免疫調節薬若しくは免疫抑制薬、又は抗凝血薬である、請求項26記載の方法。
  28. 前記疾患、障害又は病態が、外傷性脳損傷である、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
  29. 前記外傷性脳損傷が、前頭葉、頭頂葉、後頭葉、側頭葉、脳幹、又は小脳の損傷である、請求項28記載の方法。
  30. 前記外傷性脳損傷が、軽度の外傷性脳損傷である、請求項28記載の方法。
  31. 前記外傷性脳損傷が、中程度から重度の外傷性脳損傷である、請求項28記載の方法。
  32. 前記症状が、頭痛、思考の困難、記憶障害、注意欠陥、気分動揺及び欲求不満、疲労、視力障害、記憶喪失、注意不足／集中力不足、睡眠障害、眩暈／平衡感覚障害、短気、情緒障害、意気消沈、発作、悪心、嗅覚喪失、光及び音への過敏、気分変動、迷い又は混乱、及び思考緩徐の1以上である、請求項28記載の方法。
  33. 前記症状が、注意困難、集中困難、散漫性、記憶困難、処理速度の緩慢化、混乱、固執、衝動、言語処理の困難、発語及び言語の困難、話し言葉の理解不能(受容失語症)、会話及び理解の困難(表現性失語症)、不明瞭言語、非常に速い又は非常に遅い発語、難読症、及び難書症、触覚・温度・運動・四肢の位置・微細な識別の解釈の困難、心理学的に意味のあるデータへの知覚印象の統合又はパターン化の困難、部分的又は完全な視力喪失、眼筋虚弱及び二重視力(複視)、かすみ目、距離判断の問題、眼球固視微動(眼振)、光への不耐(羞明)、聴力低下又は喪失、耳鳴り(耳鳴)、音への敏感さの増大、嗅覚喪失又は減退(嗅覚消失)、味覚喪失又は減退、発作、てんかんに関連した痙攣、身体麻痺／痙直、慢性疼痛、腸及び膀胱の制御喪失、睡眠障害、体力低下、食欲の変化、体温調節不能、月経困難、社会的感情の困難、依存行動、情動能喪失、意欲喪失、短気、攻撃性、抑鬱、脱抑制、及び認識欠如の1以上である、請求項28記載の方法。
  34. 前記個体への第二の治療薬の投与を含む、請求項28記載の方法。
  35. 前記第二の治療薬が、抗痙攣薬、抗欝薬、アマンタジン、メチルフェニデート、ブロモクリプチン、カルバマゼピン又はアミトリプチリンである、請求項34記載の方法。
  36. 前記羊膜由来接着細胞又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量が、静脈内、動脈内、腹腔内、心室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、滑液嚢内、眼球内、硝子体内、大脳内、脳室内、髄腔内、骨内注入、膀胱内、経真皮、槽内、硬膜外、又は皮下投与からなる群から選択される経路により、個体へ投与される、請求項1記載の方法。
  37. 前記羊膜由来接着細胞又は羊膜由来接着細胞により馴化された培養培地の治療有効量が、損傷部位へ直接個体に投与される、請求項1記載の方法。
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