CN101889079B - 适于临床应用的人胎盘间质细胞库的建立方法 - Google Patents
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Abstract
一种处理人胎盘细胞样本的方法及由该方法获得到人胎盘细胞样本，一种人胎盘细胞库建立方法以及由该方法获得到人胎盘细胞库，获得的这些胎盘细胞样本和胎盘细胞库在用于治疗由于细胞损伤或细胞功能失常而导致的人功能障碍和疾病的用途，以及治疗由于细胞损伤或细胞功能失常而导致的人功能障碍和疾病的方法。还提供了一种在该人胎盘细胞库中检索人胎盘细胞样本的方法以及一种制备人脐带血血清的方法。
Description
技术领域
本发明属于医学技术领域。具体地，本发明涉及一种适于临床应用的人胎盘间质细胞的培育和由所述细胞组成的细胞库的建立和管理的综合方法，包括适于临床应用标准的胎盘样本的保护方法，胎盘间质细胞的培养方法和为实施这些方法需要的人自体脐带血血清的制备方法，以及这一细胞库的数字化注册管理与检索的方法。
背景技术
人类胎盘羊膜和绒毛膜间质细胞包含未分化的干细胞，这些干细胞在体外通过细胞增殖可以产生更多的相同的干细胞，或者在体外通过细胞分化可以生成多种不同细胞谱系的功能细胞。对于细胞移植治疗来说，胎盘干细胞的这两种性质具有重要意义，因为该种治疗需要既大数量的又定向分化的功能细胞。此外，胎盘间质细胞取自分娩期产后与母体和婴儿脱离的胎盘，样本易于收取且不对母体或婴儿造成任何伤害，并且不造成复杂的伦理问题。此外，在母体内，胎盘细胞在保护胎儿免受来自母体的异体免疫影响的机制中具有重要的免疫调节功能，这一功能使得胎盘细胞成为异体细胞移植的理想材料。总之，以上这些特性证明胎盘细胞具有应用于基于细胞治疗的再生医学临床的巨大潜力。对于人胎盘细胞的一般性讨论，它们临床应用的潜力，以及对于处理胎盘细胞的实验室方法，可参见，例如，Parolini O等人，“Concise Review：Isolation andcharacterization of cells from human term placenta：Outcome of the FirstInternational Workshop on Placenta Derived Stem Cells”，STEM CELLS 26，第300-311页，2008；Ilancheran S等人，“Stem cells derived from human fetalmembranes display multi-lineage differentiation potential.Biol Reprod 77，第577-588页，2007；Portmann-Lanz CB等人，“Placental mesenchymal stemcells as potential autologous graft for pre-and perinatal neuroregeneration”，Am J Obstet Gynecol 194，第664-673页，2006；Yen B等人，“Isolation ofmultipotent cells from human term placenta”，Stem Cells 23，第3-9页，2005。
由于包括人胎盘干细胞在内的人体干细胞具有对于临床应用的巨大潜力，建立私人和公众干细胞库已受到人们日亦增加的关注。因此，在许多国家已经建立了家庭或公众的脐带血库和脐带血干细胞库。然而，到目前为止，人胎盘羊膜间质细胞和人胎盘绒毛膜间质细胞还主要为研究目的而保存，并且这样的细胞的处理工艺还没有达到临床应用的标准。
一方面，目前最常用的人胎盘羊膜和绒毛膜间质细胞的培养方法是用以胎牛血清为主要成份的培养液。使用胎牛血清培育细胞具有以下两方面的潜在风险：1)向培育的细胞引入动物来源的病毒，和2)培育的细胞受到动物蛋白抗原的激化。对于这一方面的一般性讨论，可参见，例如，Mannello F.和Tonti G.“Concise Review：No Breakthroughs forHuman Mesenchymal and Embryonic Stem Cell Culture”，Stem Cells 25，1603-1609，2007.
另一方面，一些以前的研究尝试了利用人脐带血血清代替动物血清来生长人骨髓细胞和脐带血干细胞(美国专利7,060,494；美国专利申请20050059152)，但到目前为止还没有利用人脐带血血清培养人胎盘间质细胞的报道。同时，这一方法仍然存在向培育的细胞引入不同人体间病原体交叉感染的潜在风险，因为来自给定血液供体的血清用于不同人的细胞的培养，一些由这样的人体血清携带的病原体可能超过目前病原体检测的范围或者低于目前检测技术的敏感度。随着新的临床标准和病原体检测技术的发展，该风险可能变得至关重要。这一风险在细胞库建立中必须考虑，因为细胞库保存的细胞多为几年后乃至几十年后使用。
中国专利申请公开说明书CN1407088A(申请号：01131190.8)中，公开了一种从胎盘组织提取造血干细胞和用该造血干细胞建立造血干细胞库的方法。该方法包括了从胎盘组织分离包括胎盘间质细胞在内的混合细胞群，然后将整个细胞群冻存。该方法有两点不足，一是由该方法得到的细胞群体是所有单核细胞，含有包括淋巴细胞，巨嗜细胞和脂肪细胞在内的多种细胞，这样的群体不适于临床应用。二是由该方法得到的细胞不经体外培养直接用于冻存，其细胞存活效率还有待证明。
因此，开发一种适用于临床应用的人胎盘间质细胞库的建立方法已成为现实需要。本发明的目标是为满足这种需要提供实施方法。
发明内容
为有助于理解本发明，下面定义了一些术语。本文定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。
除非另外说明，本文所用的术语“分娩期胎盘”是指来自顺产或者剖腹产的临床正常怀孕的产后胎盘。
除非另外说明，本文所用的术语“胎盘羊膜间质细胞”(placentalmniotic mesenchymal stromal cells)_是指来自胎盘羊膜的具有间质细胞形貌的细胞，该细胞通过利用胶原酶或任何其它具有相似功能的酶或酶的组合来消化使其从胎盘羊膜上分离。
除非另外说明，本文所用的术语“胎盘绒毛膜间质细胞”(placentalchorionic mesenchymal stromal cells)_是指来自绒毛膜的具有间质细胞形貌的细胞，该细胞通过用胶原酶或任何其它具有相似功能的酶或酶的组合来消化使其从胎盘绒毛膜上分离。
除非另外说明，本文所用的术语“人脐带血血清”是指由来自不同脐带血供体的人脐带血的混合物制备的血清。
除非另外说明，本文所用的术语“自体脐带血血清”是指从给定胎盘细胞提供者的脐带血中获得的血清，在本文中该血清与用该血清培养的胎盘细胞来自同一捐献者。
除非另外说明，本文所用的术语“DMEM培养液(Dulbecco’s modifiedEagle’s medium)”是所属技术领域内公知的基础培养液，其成份包含各种氨基酸和葡萄糖；一般分为高糖型(不高于4500g/L)和低糖型(不高于1000g/L)两种。一个典型的DMEM细胞培养液配方的例子如下：
DMEM细胞培养液
| 成分(mg/L) | MD200 | MD201 | MD202 | MD203 | MD204 |
| 氯化钙 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 九水硝酸铁 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
| 氯化钾 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
| 无水硫酸镁 | 97.67 | 97.67 | 97.67 | 97.67 | 97.67 |
| 氯化钠 | 6400 | 6400 | 6400 | 6400 | 4400 |
| 无水磷酸二氢钠 | 108.7 | 108.7 | 108.7 | 108.7 | 108.7 |
| L-精氨酸盐酸盐 | 84 | 84 | 84 | 84 | 84 |
| L-胱氨酸盐酸盐 | 63 | 63 | 63 | 63 | 63 |
| L-谷氨酰胺 | 584 | 584 | 584 | 584 | 584 |
| 甘氨酸 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| L-组氨酸盐酸盐 | 42 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| L-异亮氨酸 | 105 | 105 | 105 | 105 | 105 |
| L-亮氨酸 | 105 | 105 | 105 | 105 | 105 |
| L-赖氨酸盐酸盐 | 146 | 146 | 146 | 146 | 146 |
| L-蛋氨酸 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| L-苯丙氨酸 | 66 | 66 | 66 | 66 | 66 |
| L-丝氨酸 | 42 | 42 | 42 | 42 | 42 |
| L-苏氨酸 | 95 | 95 | 95 | 95 | 95 |
| L-色氨酸 | 16 | 16 | 16 | 16 | 16 |
| L-酪氨酸 | 72 | 72 | 72 | 72 | 72 |
| L-缬氨酸 | 94 | 94 | 94 | 94 | 94 |
| D-葡萄糖 | 1000 | 4500 | 4500 | 4500 | 4500 |
| 酚红 | 15 | 15 | 15 | - | 15 |
| 丙酮酸钠 | 110 | - | 110 | - | - |
| HEPES | - | - | - | - | 5958 |
| D-泛酸钙 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 氯化胆碱 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 叶酸 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| i-肌醇 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 | 7.2 |
| 烟酰胺 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 盐酸吡哆醛 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| 核黄素 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| 盐酸硫胺 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 |
| pH(无碳酸氢钠) | 6.3±0.3 | 6.3±0.3 | 6.3±0.3 | 6.3±0.3 | 5.7±0.3 |
除非另外说明，本文所用的术语“HLA测定”是指可以用于测定人体细胞主要组织相容性的HLA类型的任何方法。
除非另外说明，本文所用的术语“细胞库”是指活细胞的一种储藏装置，其中所述各种细胞被长期且安全的保存，并且其中每一株细胞及其信息可以独立地注册管理和识别。
除非另外说明，本文所用的术语“cGMP”是指国际通行的GMP(即Current Good Manufacture Practice简称CGMP)，也叫动态药品生产管理规范，为国际公开性质的行业标准，美国、欧洲和日本等国家均在执行。
本发明的一个目的在于，提供一种适合临床应用的分离和培养人胎盘间质细胞从而建立可用于临床的人胎盘间质细胞库的方法。本发明的另一个目的在于，提供一种利用人脐带血血清培养人胎盘间质细胞的方法。本发明的另一个目的在于，提供一种利用自体脐带血血清培养人胎盘间质细胞的方法。本发明的还一个目的在于，提供一种制备自体脐带血血清的方法，这一方法可使自体血清制备与胎盘间质细胞分离同步化，从而保证自体脐带血血清可用于自体胎盘间质细胞的培养。本发明的另一个目的在于，提供一种在本发明所述的人胎盘细胞库中注册和检索人胎盘细胞样本的方法。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供一种处理人胎盘细胞样本的方法，所述方法包括以下步骤：
a.收集人分娩期胎盘组织，并且在含有0.5％-5％，优选为1％的人体脐带血血清的DMEM培养液中保护该组织；
b.从步骤a中得到的胎盘组织中分离人胎盘间质细胞；
c.在无任何动物成分的培养液中培养来自步骤b的胎盘间质细胞，优选地，所述培养液以DMEM为基础，还包含1)、5％-30％、优选为10％-20％的人脐带血血清；和2)、1％的青霉素/链霉素混合液；
d.检测各个细胞供体的胎盘细胞的主要组织相容性(MHC)的抗原类型(HLA测定)；
e.对经过步骤d.测定的各种HLA类型的细胞进行条形码标识并且将测得的HLA类型信息集合为各个细胞供体注册信息数据；
f.在冷藏保护溶液中保护所述的胎盘间质细胞，并且在液氮中长期保存该细胞，所述的冷藏溶液优选为由50％的人脐带血血清或自体脐带血血清、40％的DMEM和10％的二甲基亚砜(DMSO)组成；
优选地，所述方法中所使用的人体脐带血血清为自体脐带血血清，所述自体脐带血血清的供体与胎盘组织的供体为同一捐献者。
优选地，在本发明所述的处理人胎盘间质细胞样本的方法中：
步骤d中所述的检测抗原类型是利用检测试剂盒来进行的，所述检测试剂盒优选但不限于基于PCR的试剂盒；
步骤e中所述的对于各种HLA类型细胞生成条形码的操作是利用自动数字条形码生成系统进行的，数字条形码系统优选为但不限于Brady的生成条形码系统TSL2200(Brady，美国)。
另一方面，本发明提供一种人胎盘间质细胞库，其中所述人胎盘间质细胞库中的每一株细胞均是根据前述处理人胎盘细胞样本的方法得到的。
又一方面，本发明提供一种建立人胎盘间质细胞库的方法，其中所述方法包括：
1)根据前述处理人胎盘间质细胞样本的方法处理各个人胎盘间质细胞样本；
2)建立可供检索的细胞信息档案，所述细胞信息档案是在基于计算机程序中管理条形码信息和储藏细胞的注册信息的程序，所述的程序要求通过供体的身份识别(ID)和HLA类型来搜索储藏内容。其中所述的可供检索的细胞信息档案包括：
a.搜索条目：(1)供体身份识别(ID)，(2)HLA类型；
b.供体信息：(1)供体姓名、地址、供体父母的电话号码，(2)供体的出生日期和性别，(3)出生医院；和
c.储藏信息：(1)确认储藏细胞的人的姓名，(2)各个储藏小瓶中细胞的数量，储藏的小瓶的数量，以及各个小瓶储藏的位置，包括建筑物名称、房间号、液氮罐号、机架号、冷藏盒号，以及该瓶细胞在盒中的位置。
另一方面，本发明提供一种在本发明所述的人胎盘间质细胞库中检索人胎盘间质细胞样本的方法，所述方法包括：
1).设置针对每一样本的的注册信息档案，其内容包括：
a.搜索条目：(1)供体身份识别(ID)，(2)HLA类型；
b.供体信息：(1)供体姓名、地址、供体父母的电话号码，(2)供体的出生日期和性别，(3)出生医院；和
c.储藏信息：(1)确认储藏细胞的人的姓名，(2)各个储藏小瓶中细胞的数量，储藏的小瓶的数量，以及各个小瓶储藏的位置，包括建筑物名称、房间号、液氮罐号、机架号、冷藏盒号，以及该瓶细胞在盒子中的位置；
2).根据供体父母的要求，确定是否将搜索信息设置为公众可得；和
3).使用能够分别根据各个和/或所有搜索条目来搜索库内容的搜索引擎，所述的搜索引擎优选为但不限于Tiger商业管理软件(HD Tiger，中国)。
再一方面，本发明提供一种制备自体脐带血血清的方法，所述自体脐带血血清优选用作胎盘间质细胞培养基成份，其中所述方法包括以下步骤：
a.在母体分娩后，将临床使用的注射器的针头插入脐带静脉血管，并将脐带血从血管里抽入到注射器中；
b.将血液转移到一个或多个50ml的无抗凝剂的离心管中；
c.使血液在37℃下凝结30-60分钟；
d.在0到5℃间将凝结的血液冷却15-45分钟；
e.以1000g的离心力将所述血液离心10分钟；和
f.将血清转移到收集管中并在50-56℃培育该血清30分钟。
优选地，所述的方法将血清制备的时间与胎盘间质细胞分离的时间同步，使得血清可以用于同一供体的胎盘细胞的培养。
又一方面，本发明开发一种储藏细胞的方法，其中管理储藏细胞的信息，包括所述细胞的HLA类型，使得利用生成条形码和基于计算机数据的管理程序就可以搜索到来自于各个和全部细胞供体的细胞。
又一方面，本发明提供根据前述处理人胎盘细胞样本的方法得到的人胎盘细胞或根据前述建立人胎盘细胞库的方法所建立的人胎盘细胞库用于治疗由于细胞损伤或细胞功能失常导致的人体功能障碍和疾病的用途，优选地，所述由于细胞损伤或细胞功能失常导致的人体功能障碍和疾病选自：I型糖尿病、神经损伤、心肌损伤、老年痴呆症和帕金森氏病。
又一方面，本发明提供治疗由于细胞损伤或细胞功能失常导致的人体功能障碍和疾病的方法，所述方法包括：使用根据前述处理人胎盘细胞样本的方法得到的人胎盘细胞或根据前述建立人胎盘细胞库的方法所建立的人胎盘细胞库，优选地，所述由于细胞损伤或细胞功能失常导致的人体功能障碍和疾病选自：I型糖尿病、神经损伤、心肌损伤、老年痴呆症和帕金森氏病。
根据本发明一个优选的实施方式，本发明提供一种临床适用的储藏人体胎盘细胞的方法，所述的方法在现行药品生产管理规范(cGMP)的条件下实行，且包括以下步骤：
a.在无菌条件下，在分娩后收集人体分娩期胎盘组织，并且在添加了0.5％-5％，优选为1％的人脐带血血清的DMEM培养基中保护该组织；
b.利用当前可利用且被广泛使用的并被本领域技术人员熟悉的方法，优选为胶原酶和分散酶消化法，从步骤a中得到的胎盘组织里分离胎盘间质细胞；
c.在临床适用的细胞培养系统中培养所述的胎盘间质细胞，该培养系统不含任何动物成分；
d.检测各个细胞供体的胎盘细胞的主要组织相容性(MHC)的抗原类型(HLA测定)；
e.为经过HLA测定的细胞生成条形码并且集合测定HLA类型的信息为各个细胞供体注册数据；
f.在冷藏保护溶液中保藏所述的胎盘细胞，并且在液氮中长期保存该细胞；
g.在基于计算机的程序中输入并存储条形码信息和储藏细胞的注册信息，所述的程序可以通过供体的身份识别(ID)和HLA类型来检索储藏内容。
根据如前所述的方法，其中，所述的临床适用的细胞培养系统包括DMEM培养液，5％-30％，优选为10％-20％的人体脐带血血清以及1％的青霉素/链霉素混合溶液。
根据如前所述的方法，其中，所述的胎盘细胞在临床适用的细胞培养系统中培养，所述的体外系统包括DMEM，5％-30％，优选为10％-20％的自体脐带血血清以及1％的青霉素/链霉素混合溶液，所述血清得自于该细胞供体的脐带血，因此所述血清与所述胎盘细胞来自同一捐献者。
根据如前所述的方法，其中，利用检验试剂盒得到所述的胎盘细胞的HLA类型，该试剂盒为商业上可得到的并且为本领域技术人员所熟知的，优选但不限于基于PCR的试剂盒。
根据如前所述的方法，其中，对于各个细胞供体，利用自动数字条形码系统为HLA类型的细胞生成条形码，优选但不限于Brady的生成条形码系统TSL2200(Brady，美国)。
根据本发明一个优选的实施方式，本发明提供一种应用于本发明所述方法的储藏注册程序，其中，所述的储藏注册包括：
a.搜索条目：(1)供体ID，(2)HLA类型；
b.供体信息：(1)供体姓名、地址、供体父母的电话号码，(2)供体的出生日期和性别，(3)出生医院；
c.储藏信息：(1)确认储藏细胞的人的姓名，(2)各个储藏小瓶中细胞的数量，储藏的小瓶的数量，以及各个小瓶储藏的位置，包括建筑物名称、房间号、液氮罐号、机架号、冷藏盒号，及该瓶细胞在盒中的位置；
d.供体父母的知情同意书，由之确定该储藏搜索信息是否设为为公众可得；
e.能够利用各个和所有搜索条目来搜索库内容的搜索引擎，所述的搜索引擎优选但不限于Tiger商业管理软件(HD Tiger，中国)。
根据如前所述的方法，其中所述的冷藏溶液由50％的人脐带血血清或者自体脐带血血清、40％的DMEM、以及10％的二甲基亚砜(DMSO)构成。
根据本发明又一个优选的实施方式，本发明提供由以下步骤制备的自体脐带血血清：
a.将临床使用的注射器的针头插入脐带静脉血管，并将脐带血从血管里抽入到注射器中；
b.将血液转移到50ml的无抗凝剂的离心管中；
c.在cGMP的环境下，使血液在37℃下凝结30-60分钟；
d.在0到5℃间将凝结的血液冷却15-45分钟；
e.以1000g离心力将所述血液离心10分钟；
f.将血清转移到收集管中并在50-56℃培育该血清30分钟。
根据本发明一个优选的实施方式，本发明提供一种建立和维持人胎盘间质细胞库的方法。在该方法中，利用人脐带血血清或者自体脐带血血清来培育人胎盘间质细胞，并在临床适用的条件下处理和储藏所述的细胞，以及在可搜索的数据库中管理被储藏细胞的信息，该数据库中各个和全部细胞供体的临床相关信息可否被搜索到依细胞提者的意愿而定。
如本文所述，在一个实施方案中，本发明提供了一种储藏人胎盘间质细胞的方式。该方式包含如下：第一，该方式提供了从产房中收集人体胎盘组织的方法，在无菌的条件下收集所述的胎盘组织并在含有1％的人脐带血血清的溶液中保护该组织；第二，该方式提供了胎盘间质细胞体外分离培养的步骤，在这样的步骤中，胎盘间质在细胞在由人脐带血血清构成的培养液中培养，所述的培养液无任何动物成分；第三，该方式提供了测定要储藏的细胞的HLA类型的方法，该方法利用基于DNA的HLA测定且独立于蛋白抗原的表达；第四，该方式提供了一种生成条形码标识和储藏细胞的方法，该生成条形码的生成和计算机输入由自动条码系统操作，并与计算机的数据管理以及搜索匹配；第五，该方式还提供了细胞库的数据条目、管理和搜索的格式，该格式包括细胞、细胞供体以及细胞处理方法的信息。
在一个实施方案中，本发明提供了利用自体脐带血血清生长胎盘间质细胞的方法。在该方法中，在体外培养过程期间，所述的胎盘间质细胞生长于与它们在胎盘内所接触的生物因子相同的环境，因此消除了来自带有生物病原体的细胞培养成分的污染的可能性。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种制备用于生长胎盘细胞的自体脐带血血清的方法。该方法将自体血清制备的时间与胎盘细胞分离的时间同步化，从而使得当来自相同胎盘的细胞开始培养时，其自体血清的制备也已经完成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种测定胎盘细胞的HLA类型的方法。在该方法中，测定待保存细胞的HLA类型，优选但不限于，利用基于DNA的HLA测定方法。基于DNA的HLA测定提供一个优点，即HLA测定不受细胞分化时期的影响，因此适用于各种胎盘细胞HLA的测定。
在一个特定的方面，本发明提供了一种生成条形码标识储藏细胞的方法。在该方法中，优选但不限于，通过Brady生成条形码为来自各个细胞供体的细胞生成独特的条形码，并集合在计算机的数据库中。
在另一个方面，本发明还提供了一种集合条形码、HLA类型、供体信息、细胞特性的格式，以及是否进入公共检索的数据库的区分，从而使得细胞库同时容纳分别为家庭和公众利用的不同保存方式。
以下根据本发明的一个具体实例，详细描述本发明方法的一般操作步骤和顺序：
1.胎盘羊膜和绒毛膜间质细胞的分离
在分娩后，在无菌的条件下从分娩期的胎盘上分割一部分胎盘组织，且将被分割的组织保存在离心管中，该离心管装有添加了1％的抗生素和1％的人脐带血血清的DMEM培养基。将该胎盘组织在30分钟内转移到处理实验室中，用含有1％青霉素/链霉素混合溶液的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗三遍。
将绒膜盘从胎盘组织中分割出来，在如上所述PBS溶液中清洗三遍，并进行30分钟至2个小时的分散酶和胶原酶的组合消化来分离胎盘羊膜间质细胞和胎盘绒膜间质细胞。分散酶的用量可以是每毫升2-4个单位，而胶原酶的用量可以是每毫升200-400个单位。消化温度为37摄氏度。在消化之后，让消化容量中的组织残渣沉淀30-60秒，并且将在悬浮液中的细胞通过离心收集起来用于体外培养。
2.胎盘间质细胞的体外培养
将从胎盘组织中分离的人胎盘间质细胞，包括胎盘羊膜间质细胞和胎盘绒膜间质细胞，在添加了抗生素和血清的磷酸盐缓冲液(PBS)中清洗，且放置在装有DMEM培养液的细胞培养瓶中，该DMEM培养基中含有10％-20％的人脐带血血清或10％-20％的自体脐带血血清，以及1％的抗生素(完整培养液)。将细胞在37℃含5％的CO2的空气中培养。一周后，去掉培养瓶中的培养液并加入新的完整培养液，培养再持续一周。细胞在第二周周末传代培养且在之后的每3-4天传代一次。
3.自体脐带血血清的制备
将不同胎盘细胞供体的脐带血分别收集和处理。在分娩后，利用50ml的临床使用的带针头注射器将脐带血收集起来。将针头插入到胎盘的脐带静脉血管中并将脐带血从脐带血管中抽入到注射器中。然后将血液转移到50ml的不含抗凝剂的离心管中。随后在cGMP的环境下使血液在37℃凝结30-60分钟。凝结后，将凝结的血液在0-5℃冷却15-45分钟，然后以1000g离心力离心10分钟。将血清转移到收集管中在50-56℃下灭活30分钟。
4.测定胎盘细胞的HLA类型
利用DNA分离试剂盒来制备取自各个不同细胞供体的胎盘细胞的DNA样品，所述试剂盒为商业上可得到的且为本领域技术人员所熟悉的。使用可商购获得的且为本领域技术人员所熟悉的HLA测定PCR试剂盒，将每一个细胞供体的DNA样品用于基于PCR的HLA测定。
5.数字条形码标识与细胞库注册
将在体外培养的胎盘间质细胞以每小瓶1.2×106个细胞的数量在液氮中低温保藏。利用自动条形码生成器对每一个细胞株作条形码标识并通过注册程序将该条形码标识连同该细胞株及其捐献者的信息输入计算机管理系统。所述的注册程序包括：
a.搜索条目：(1)供体ID，(2)HLA类型；
b.供体信息：(1)姓名、地址、以及供体父母的电话号码，(2)供体的出生日期和性别，(3)生产医院；
c.储藏信息：(1)确认储藏细胞的人的姓名，(2)各个储藏小瓶中细胞的数量，储藏的小瓶的数量，以及各个小瓶储藏的位置，包括建立姓名、房间号、液氮罐号、机架号、盒子号，还有盒子中的位置；
d.供体父母的要求用于确定是否使得搜索信息为公众可得；
e.可以利用各个和所有搜索条目来搜索库内容的搜索引擎。
相对于本发明之前的已有技术，本发明的独创性主要体现在以下几个方面：
第一，本发明给出了用人脐带血血清培养人胎盘间质细胞的方法。胎盘间质细胞直接来自早期胚胎的内胚层细胞，未经过向任何细胞谱系的定向分化，其发育过程和细胞特性均不同于任何类型的成体细胞，包括以前研究涉及的成体骨髓干细胞和脐血干细胞。在人体内，胎盘间质细胞直接从脐带血获得营养，因此，我们假设在体外脐带血清可以模拟体内胎盘干细胞保持不分化状态的营养环境，因此，利用脐带血清培养胎盘间质细胞不但能维持细胞生长，而且能保持干细胞的原有特性。该假设已经被本发明的研究证实。在以前已有的用脐带血清培养人骨髓细胞和脐带血干细胞的尝试中，不论涉及的细胞种类或是培养机制都不同于本发明的内容。
第二，本发明给出了用自体脐带血清培养人胎盘间质细胞的方法，并给出了与胎盘间质细胞分离同步化的自体脐带血清制备方法。这两个方法的结合利用可使由此法培养的细胞安全用于临床而不带任何病理学风险。在此前尚未见有用自体血清培养人胎盘间质细胞的报道。
第三，本发明给出了一种适用于临床应用的人胎盘间质细胞库的建立方法。这一方法的一部分包括了在无动物成分的系统中分离和培养胎盘细胞从而得到可用于临床的人胎盘间质细胞。在中国专利申请公开说明书CN1407088A(申请号：01131190.8)中，公开了一种从胎盘组织提取造血干细胞和用该造血干细胞建立造血干细胞库的方法。如前所述，该方法包括了从胎盘组织分离包括胎盘间质细胞在内的混合细胞群，然后将整个细胞群冻存。该方法的技术要点是：1、将洗净的胎盘组织(不是单细胞)在脐带血血浆(不是血清)与DMEM混合液中保护并在4摄氏度存放不超24小时；2、从用血浆和DMEM保护的胎盘组织中分离全部单核细胞并将此单核细胞直接冷冻保存(详见该申请原文“具体实施方式”第8页和第9页，“实例1和实例2”第11页和第12页)。该方法中凡涉及到细胞培养的部分，均是作细胞取样鉴定，并且培养方法未涉及血清或血浆，培养的细胞也只作鉴定而不是冻存。该方法中有两点不足，其一是由该方法得到的细胞群体是所有单核细胞，含有包括淋巴细胞，巨嗜细胞和脂肪细胞在内的多种细胞，这样的群体不适于临床应用；其二是由该方法得到的细胞不经体外培养直接用于冻存，其细胞存活效率还有待证明。不同于该申请中记载的方法，本发明中给出的细胞库来自于在冻存前进行了体外培养的胎盘间质细胞，给出了胎盘细胞冻存前用人脐带血血清体外培养的方法，由此可提供更纯的、冻存后存活率更高的，从而更加适合于临床应用的胎盘间质细胞。因此，本发明的方法在操作上完全不同于该在先申请文件中公开的方法，并且在技术效果上明显优于以前的有关方法。
本发明的其他方面已在上面的发明内容里详述，并将在下面实例中说明。鉴于对于本发明的技术方案的以上描述，本领域技术人员很容易理解，在不偏离本发明的原理和技术范围内对本发明内容作出的任何等效修改，均应属于本发明的保护范围。
附图的简要说明
以下，结合附图来进一步说明本发明的特定方面。本发明可以通过参考这些附图结合本文显示的详细说明来更好地理解。其中：
图1：该图为在含10％的胎牛血清的DMEM中生长的人胎盘间质细胞。
图2：该图为在含10％的非自体人脐带血血清的DMEM中生长的人胎盘间质细胞。
图3：该图为在含10％的自体脐带血血清的DMEM中生长的人胎盘间质基质细胞。
实施发明的最佳方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1：分离人体胎盘羊膜间质细胞和人体胎盘绒膜间质细胞
在无菌的条件下，将分大约20g的新鲜的人胎盘组织从分娩后的胎盘上分割下来。将该组织保存在50ml的离心管中，该离心管装有20ml含有1％的人脐带血血清和1％的青霉素/链霉素溶液(Invitrogen，产品号15140122)的DMEM(Invitrogen，产品号11885084)培养液。将在以上保护液中的胎盘组织在30分钟之内转移到cGMP实验室中。在处理之前，将该组织在含有1％的青霉素/链霉素的PBS(Invitrogen，产品号14040133)溶液中清洗三次。
利用无菌手术剪刀从胎盘组织上分割绒膜盘，并将绒膜盘在PBS中洗三次，并切成大约1mm3大小的碎块，然后在37℃下利用每毫升270个单位的胶原酶IV(Invitrogen，17104019)和每毫升2.4个单位的分散酶II(Dispase II)(Roche，产品型04942078001)的组合来消化1小时，从而分离出胎盘羊膜间质细胞和胎盘绒毛膜间质细胞。在消化后，使消化容量中的组织残渣静置沉淀30秒钟，然后收集细胞悬浮液中的中间层。将收集的细胞悬浮液用等量的PBS稀释并在700g离心力下离心10分钟，倒掉上清液后，将沉淀的细胞在含有1％人脐带血血清的PBS中洗两遍，再在含有1％人脐带血血清的DMEM培养基中洗一遍。
根据本实施例记载的方法，从每100克新鲜胎盘组织中可得到50万到100万个胎盘间质细胞。
实施例2：制备用于胎盘细胞生长的自体脐带血血清和人脐带血血清
通过以下方式分别地收集和处理各个胎盘细胞供体的脐带血。在分娩时后利用50ml带有16G针头的注射器收集所述的脐带血。将针头插入胎盘的脐带静脉血管中并从脐带血管中将脐带血抽入注射器中。然后将血液转移到50ml的不含抗凝剂的离心管中。每个管中收集30-40毫升的脐带血。在30分钟之内将所收集的血液转移到cGMP实验室中。
2.1自体脐带血血清的制备
将采集在不含抗凝剂的离心管中的脐带血按不同捐献者分别在37℃下将血液凝结45分钟，并在冰水里冷却30分钟，然后将其在室温下以1000g离心力离心10分钟。将管容量上层的血清转移到新的离心管中，在相同的条件下再次离心，转移上清的血清到新的试管中，然后在56℃下培育30分钟。此血清可在4度保存一周或在零下20度保存6个月。
由该方法从每100毫升脐带血中可得到30到40毫升的自体脐带血血清。
2.2非自体人脐带血血清(本文也称为人脐带血血清)的制备
将采集在不含抗凝剂的离心管中的不同捐献者的脐带血混合后分装在50ml的不含抗凝剂的离心管中并使脐带血在室温下凝血16小时，之后将凝血后的血液在4度冷却2小时，然后将其在室温下以1000g离心力离心10分钟。将管容量上层的血清转移到新的离心管中，在相同的条件下再次离心，转移上清的血清到新的试管中，然后在56℃下培育30分钟。此血清可在4度保存一周或在零下20度保存6个月。
由该方法从每100毫升脐带血中可得到30到40毫升人脐带血血清。
实施例3：利用人脐带血血清在体外培养人胎盘间质细胞
将根据实施例1方法所分离得到的人胎盘羊膜和胎盘绒毛膜间质细胞，以每毫升培养液1×106(一百万)个细胞的密度分散在DMEM完整培养液中并将此细胞以每瓶7.5毫升的容量转入25cm2的组织培养瓶里。在所述的DMEM完整培养液成份为：89％DMEM，10％人脐带血血清，1％青霉素/链霉素溶液。将装有此细胞的培养瓶在37℃下含有5％CO2的空气中培养。一周后，将培养液用新鲜配制的DMEM完整培养液所替代，且再持续培养一周。细胞在第二周周末传代培养且在之后的每3-4天传代一次，每次传代均使用新鲜配制的DMEM完整培养基。每次传代的方法是：在超净工作台上，用无菌吸管吸去培养瓶中的培养液，然后将长在瓶底表面的细胞层用磷酸盐缓冲液(PBS)洗一遍，之后移去PBS，加入1毫升1％胰蛋白酶溶液(Invitrogen，产品号25300)并使溶液复盖全部细胞层，将细胞在胰蛋白酶溶液中在37度下培养1分钟后，加入5毫升DMEM完整培养液。将细胞在此培养液中混合成均匀单细胞悬浮液后，等量分到三个新的25cm2的组织培养瓶里，并在每个瓶里添加DMEM完整培养液到7.5毫升，混匀后放回37℃含5％CO2的空气中培养箱中培养。由此方法培养的人胎盘细胞，在一周后胎盘羊膜和胎盘绒毛膜间质细胞及部分羊膜上皮细胞分可完成体外的第一次分裂周期，数量加倍，并且其它种类的细胞，包括淋巴细胞，巨嗜细胞和脂肪细胞等会被自然清除，从而得到较纯的细胞群。从第二周开始，细胞进入正常细胞生长周期，从此时起每3-4天对细胞作显微镜下的形态学观察和通过细胞计数作生长活性分析。本实施例细胞形态学和生长活性分析结果见附图2和后附的表1。
实施例4：利用自体脐带血血清在体外培养人胎盘间质细胞
将从实施例1方法所分离得到的人胎盘羊膜间质细胞和胎盘绒毛膜间质细胞在体外培养。本实施例的操作方法，使用试剂及细胞生长分析方法与实施例3所描述的相同，除了用自体脐带血血清替代人脐带血血清。细胞形态学和生长活性分析结果实例见附图3和后附的表1。
实施例5：利用胎牛血清在体外培养人胎盘间质细胞
本实例是作为实例3和4的对照实验所设。将从实施例1方法所分离得到的人胎盘羊膜间质细胞和胎盘绒毛膜间质细胞在体外培养。本实施例的操作方法，使用试剂及细胞生长分析方法与实施例3所描述的相同，除了用胎牛血清(Invitrogen，产品号10099141)替代人脐带血血清。细胞形态学和生长活性分析结果实例见附图1案和后附的表1。
表1：人胎盘间质细胞在不同血清中细胞生长活性的比较
| 使用血清 | 细胞培养期间 | 细胞分裂周期 |
| 胎牛血清 | 第2-6代 | 24-30小时 |
| 自体人脐带血血清 | 第2-6代 | 24-30小时 |
| 非自体人脐带血血清 | 第2-4代 | 24-36小时 |
由附图1至3和上面的表1表明，与之前所属技术领域中通常采用的使用胎牛血清的培养方法相比，使用人脐带血血清和自体脐带血血清培养的人胎盘间质细胞，不论是在细胞形态学上还是生长活性上都能够达到甚至超过使用胎牛血清培养的结果，说明本发明给出的人胎盘间质细胞的培养方法可以代替以前的方法从满足临床应用的要求。
Claims (10)
1.一种处理人胎盘细胞样本的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a.收集人分娩期胎盘组织，并且在含有0.5％-5％的人脐带血血清的DMEM培养基中保护该组织；
b.从步骤a中得到的胎盘组织中分离人胎盘羊膜间质细胞和人体胎盘绒毛膜间质细胞；
c.在无任何动物成分的细胞培养体系中将所述人胎盘细胞体外培养，所述培养体系为以DMEM为基础的培养液，此培养液中还包含：
1).5％-30％的人脐带血血清；和
2).1％的青霉素/链霉素溶液；
d.检测各个细胞供体的胎盘细胞的主要组织相容性MHC的抗原类型即HLA测定；
e.为经过步骤d.测定的各种HLA类型的细胞生成条形码并且将测得的HLA类型信息集合为各个细胞供体注册信息数据；
f.在冷藏保护溶液中保藏所述的胎盘间质细胞，并且在液氮中保存该细胞，所述的冷藏保护溶液由50％的人脐带血血清、40％的DMEM和10％的二甲基亚砜DMSO组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤a中，收集人分娩期胎盘组织，并且在含有1％的人脐带血血清的DMEM培养基中保护该组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c中，所述的人脐带血血清为10％-20％的人脐带血血清。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在f步骤中，所使用的人脐带血血清为自体脐带血血清。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述自体脐带血血清得自于给定胎盘间质细胞供体自身的脐带血，因而所述的自体脐带血血清与用该血清培养的胎盘间质细胞来自同一捐献者。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述自体脐带血血清通过以下方法制得：
a.在母体分娩时，将临床使用的注射器的针头插入脐带静脉血管，并将脐带血从血管里抽入到注射器中；
b.将血液转移到50ml的无抗凝剂的离心管中；
c.使血液在37℃下凝结30-60分钟；
d.在0到5℃间将凝结的血液冷却15-45分钟；
e.以1000g离心力将所述血液离心10分钟；和
f.将血清转移到收集管中并在50-56℃培育该血清30分钟。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤d中的检测抗原类型操作是利用检测试剂盒来进行的；和/或
所述步骤e中的对于各种HLA类型细胞生成条形码的操作是利用自动数字条形码系统进行的，数字条形码系统为Brady的生成条形码系统TSL2200。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述检测试剂盒基于PCR的试剂盒。
9.一种建立人胎盘间质细胞库的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)根据权利要求1-8中任一项的方法处理各个人胎盘间质细胞样本；
2)建立可供检索的细胞信息档案，所述细胞信息档案是在基于计算机程序中注册和管理条形码信息和储藏的细胞信息的程序，所述的程序可以通过供体的身份识别ID和HLA类型来搜索储藏内容。
10.根据权利要求9所述的建立人胎盘细胞库的方法，其特征在于，所述的可供检索的细胞信息档案包括：
a.搜索条目：(1)供体身份识别ID和(2)HLA类型；
b.供体信息：(1)供体姓名、地址、供体父母的电话号码，(2)供体的出生日期和性别，(3)出生医院；以及
c.储藏信息：(1)确认储藏细胞的人的姓名，(2)各个储藏小瓶中细胞的数量，储藏的小瓶的数量，以及各个小瓶储藏的位置，包括建筑物名称、房间号、液氮罐号、机架号、冷藏盒号，以及该瓶在盒子中的位置。
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