CN1810960A

CN1810960A - 诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法

Info

Publication number: CN1810960A
Application number: CNA2006100330083A
Authority: CN
Inventors: 胡祥; 杨波
Original assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2006-01-13
Publication date: 2006-08-02

Abstract

本发明为一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，本发明的方法是取人羊膜间充质干细胞在含全反式维甲酸、碱性成纤维生长因子、胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。经本发明方法的诱导，人羊膜间充质干细胞在体外可分化为神经元细胞。经本发明方法产生的神经细胞及含有该神经细胞的组合物，可广泛用于治疗神经疾病。

Description

诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及诱导间充质干细胞向神经细胞分化的方法，具体涉及的是一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，以及通过本发明方法所得神经细胞及含有所述神经细胞作为有效成分的组合物。

背景技术

近几年来，干细胞的研究取得了重大突破.1999和2000年，世界最权威的美国《Science》杂志连续2年将干细胞和人类基因组计划列为当年的10大科学突破，尤其是在1999年甚至将干细胞研究列为第一位。干细胞很可能在医学领域引发革命性进步，因而具有不可估量的医学价值而引起全世界的广泛关注和研究，美国《时代》周刊认为干细胞和人类基因组计划将同时成为新世纪最具有发展和应用前景的领域。

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，简称MSCs)是来源于成熟组织中的多能干细胞，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，是细胞移植和组织工程的新型种子细胞，具有广阔的应用前景。其中，研究最为广泛的MSCs是来源于骨髓的间充质干细胞，尽管其伦理问题与胚胎干细胞相比大为减少，但骨髓细胞必须通过侵入的途径获得，及其随着年龄的增长，干细胞数量显著减少。许多研究机构已经在其它组织中寻找到多能干细胞，包括动员的外周血、脐血、乳牙、脐带间充质细胞，然而，从这些组织中得到的细胞数量十分有限。羊膜是胎儿出生以后的废弃物，从羊膜分离、培养干细胞，因其来源广泛，不受伦理限制等优越性而具有广阔的应用前景。目前，国内外还没有从羊膜分离、培养间充质干细胞或将其诱导分化为神经细胞的报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于针对目前还没有将羊膜间充质干细胞诱导分化为神经细胞的方法的现状，提供一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法。

本发明的第二个目的在于提供本发明方法所得的神经细胞及含有所得神经细胞的组合物。

本发明的第一个目的是这样实现的：取人羊膜间充质干细胞在含全反式维甲酸、碱性成纤维生长因子、胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。

作为本发明方法的较佳方案，DMEM/F12培养基含20μmol-30μmol/L全反式维甲酸、10-20μg/L碱性成纤维生长因子、10％-20％体积百分含量的胎牛血清较佳。

作为本发明方法的较佳方案，人羊膜间充质干细胞在所述培养基中培养4-7天。在此期间，大部分人羊膜间充质干细胞分化为神经元。

作为本发明方法的较佳方案，人羊膜间充质干细胞选传至第3-5代的人羊膜间充质干细胞。传至第3-5代的人羊膜间充质干细胞不仅已经纯化，而且保持着增生和分化能力。

本发明中的人羊膜间充质干细胞可由如下方法制得：

(1)取人羊膜先用胰蛋白酶消化，然后用胶原酶、脱氧核糖核酸酶消化，得到细胞悬液；

(2)将上一步所得的细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；

(3)将第(2)步所得细胞接种于培养基中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中进行培养，并通过换液和传代，使人羊膜间充质干细胞逐渐得到扩增和纯化，所述培养基采用V_DMEM∶V_F12＝1∶1的DMEM/F12培养基，其中含有体积百分含量为10％-20％的胎牛血清和终浓度为10-20μg/L的碱性成纤维生长因子。

在上述人羊膜间充质干细胞的分离培养方法的第(1)步中，优选采用重量百分含量为0.125-0.25％的胰蛋白酶，室温消化30-60分钟，共2-4次，然后用含体积百分含量为10％-20％胎牛血清的DMEM/F12培养液中止胰蛋白酶，采用含0.5-2.0g/L胶原酶和0.05-0.20g/L脱氧核糖核酸酶的V_DMEM∶V_F12＝1∶1的DMEM/F12培养液，37℃消化1-2小时。

将细胞扩增和纯化的过程优选如下：在上述人羊膜间充质干细胞的分离培养方法的第(3)步开始，培养48～72小时，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3～4天全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2或1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程。

本发明还包括通过本发明方法所得的神经细胞及含有所述神经细胞的组合物，可用于治疗神经疾病，如脑损伤、帕金森综合症、脑卒中、脊髓损伤及外周神经损伤等。

本发明的技术效果在于：本发明提供了一种诱导人羊膜间充质干细胞(Human Amniotic-derived mesenchymal stem cells，简称HADMSCs)向神经细胞分化的方法，经本发明方法的诱导，人羊膜间充质干细胞在体外可分化为神经元细胞。经本发明方法产生的神经细胞及含有该神经细胞的组合物，可广泛用于治疗神经疾病。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1是实施例一中培养不同时间的HADMSCs的放大100倍的显微照片。

图2是实施例一中流式细胞分析结果图。

图3是实施例一中HADMSCs经诱导向神经细胞分化的细胞照片，其中A为诱导4天的放大100倍的照片；B为诱导7天的照片；C为诱导前细胞表达nestin的照片，放大200倍；D为诱导7天细胞表达NSE的照片，放大200倍。

图4是实施例二中移植后神经细胞表达特异性标志物的照片，其中A、B、C、D为HADMSCs移植组，放大400倍，A、B为移植后2周、4周移植细胞表达GFAP的照片，C、D为移植后2周、4周移植细胞表达NSE的照片；E、F、G、H为纤维蛋白胶和HADMSCs混合移植组，放大400倍，E、F为移植后2周、4周移植细胞表达GFAP的照片，G、H为移植后2周、4周移植细胞表达NSE的照片。

具体实施方式

实施例一：

一、人羊膜间充质干细胞的分离、培养、扩增及纯化

1、人羊膜间充质细胞的分离：

在无菌条件下取正常足月剖腹产胎儿的人胎盘，钝性分离胎盘脐带面的羊膜，用磷酸缓冲液(PBS)充分冲洗，将羊膜剪成1.0cm×1.0cm大小的片状，按每克组织加入重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶2ml，室温消化30分钟，共3次，然后用含体积百分含量为10％胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培养液中止胰蛋白酶，以尽可能除去上皮细胞。然后将羊膜尽可能剪碎，以每克组织加入含1.0g/L胶原酶和0.10g/L脱氧核糖核酸酶的V_DMEM∶V_F12＝1∶1的DMEM/F12培养液2ml，37℃消化60分钟后得细胞悬液。然后用不锈钢网过滤将消化下来的细胞制成单细胞悬液，1000r/m离心10分钟，用PBS洗2次，用台盘兰染色，计数活细胞，以2×10⁵个/ml的密度将所得细胞接种于75ml培养瓶内。本发明在接种时的细胞密度可采用1×10⁵-1×10⁶/ml。

2、人羊膜间充质干细胞的培养、纯化及扩增：

培养基采用V_DMEM∶V_F12＝1∶1的DMEM/F12培养基，其中加了体积百分含量为10％的胎牛血清(FBS)和终浓度为20ng/ml的碱性成纤维生长因子(bFGF)，将上一过程所得的人羊膜间充质细胞分装于75ml培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、体积分数为5％的CO₂培养箱中培养48-72小时后，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3-4天全量换液一次。待细胞达到80％-90％融合时，用重量百分含量为0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2的比例进行传代接种培养，并记为P1代。传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，再重复上述操作进行传代，此传代培养记为P2代，然后继续上述传代培养过程。细胞于24小时内开始贴壁，72小时观察，见细胞呈圆形、梭形、星形、多角形等多种形态，通过全量换液逐渐去除未贴壁细胞，此时贴壁细胞呈单个分散或几个细胞的克隆，10天以后细胞形态逐渐均匀，呈长梭形，有伪足，14天左右可见两种细胞克隆：上皮样细胞克隆和成纤维样细胞克隆，前者是杂细胞，后者是人羊膜间充质干细胞，每个克隆约含200～300个细胞，培养至14～18天细胞达80％～90％融合，见成纤维样细胞呈放射状或漩涡状分布，上皮样细胞呈铺路石样排列。传代后细胞24小时内完全贴壁，7～10天达到完全融合，传至3代，细胞形态很均匀，上皮样细胞克隆消失。随着传代的进行，HADMSCs的胞体逐渐增大，出现部分宽大扁平的细胞，失去增殖和分化能力，而大部分细胞仍然维持细长的梭形，保持增生和分化能力。体外培养10代以后，细胞的增殖速度明显减慢，细胞出现老化现象。

在上述培养传代过程中的细胞形态可参见图1：A是培养8天的图，细胞混杂，见圆形、星形、多角形、梭形等多种形态；B、C是培养13天的图，其中B是成纤维细胞样克隆，C是上皮细胞样克隆；D是第1代3天的图，E是第3代3天的图，F是第3代6天的图，G是第6代3天的图，H是第8代10天的图。

3、流式细胞检测：

培养4-6代的人羊膜间质干细胞用重量百分含量0.25％的胰蛋白酶消化后，用含体积百分含量为1％小牛血清白蛋白的PBS调整细胞至5×10⁵/50ul。然后分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-ABC、HLA-DR，置4℃孵育30分钟，用PBS洗1次，直标单抗可直接上流式细胞仪检测，而间标单抗再加兔抗鼠FITC二抗，置4℃孵育30分钟，用PBS洗涤2次后，进行流式细胞仪分析。分析结果如图所示，显示CD29、CD44、HLA-ABC阳性，CD34、CD45、HLA-DR阴性。上述鼠抗人单克隆抗体CD29-PE、CD34-FITC、CD45-FITC、CD44-FITC、HLA-ABC、HLA-DR购自Santa Cruz Biontechnology Ins.公司。

在上述第1步的分离步骤中，胰蛋白酶的重量百分含量可为0.125-0.25％，消化时间可为30-60分钟，次数为2-4次；中止胰蛋白酶的DMEM/F12培养液中胎牛血清的体积百分含量可为10％-20％；胶原酶、脱氧核糖核酸酶消化时，V_DMEM∶V_F12＝1∶1的DMEM/F12培养液中胶原酶的浓度可采用0.5-2.0g/L，脱氧核糖核酸酶可为0.05-0.20g/L，消化时间可为1-2小时。

二、体外定向诱导HADMSCs向神经元样细胞分化

1、定向诱导：取上述传至第3代的HADMSCs按4×10⁵/L密度接种于事先放置有消毒盖玻片的六孔板内制备细胞爬片，待细胞达80％融合时，以含30μmol/L全反式维甲酸(Retinic acid，购自sigma公司)、20ng/mlbFGF、10％FBS的DMEM/F12培养基诱导7天，对照组不加任何诱导剂。结果：培养的人羊膜间充质干细胞表达神经干细胞的标志物人神经巢蛋白(nestin)，经诱导后的细胞表达nestin和神经元的标志物人神经元特异性烯醇化酶(NSE)，不表达神经胶质细胞的标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。

本发明在上述诱导培养基中全反式维甲酸的浓度可采用20-30μmol/L，碱性成纤维生长因子10-20μg/L、胎牛血清的体积百分含量为10％-20％。

2、倒置显微镜下观察：HADMSCs向神经细胞的诱导分化，在加入诱导液后2天，即有部分细胞发生形态变化，胞体回缩，凸起变细变长，逐渐呈现神经元样细胞形态，可观察到部分细胞脱壁死亡；诱导4天后，大部分细胞发生形态改变，较多的神经元样细胞聚集在一起，相邻的细胞间轴突联结成网状，诱导的神经元样细胞形态不一，有简单的双极细胞，也有复杂的多极细胞，少部分细胞始终未发生形态改变，仍保持宽大扁平状；7天后，大部分细胞呈神经元样形态。HADMSCs在上述诱导分化过程中的细胞形态参见图3。

3、免疫细胞化学检测：取生长有细胞的盖玻片，采用SP免疫组化方法进行免疫细胞化学染色，细胞盖玻片用80％的丙酮固定10

分钟，3％H₂O₂封闭10分钟，山羊血清封闭15分钟，去除血清后分别加入兔抗人神经巢蛋白、小鼠抗人神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白单抗工作液，并设阴性对照，以PBS代替一抗，置于湿盒中4℃下过夜，PBS洗涤3遍，分别滴加羊抗兔及羊抗鼠的二抗工作液，室温30分钟，再加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，室温孵育30分钟，显色剂DAB显色，中性树胶封片。镜下随机取10个非重叠视野(放大100倍)，计算nestin和NSE和GFAP阳性细胞占总细胞的比例。结果显示，诱导分化前HADMSCs的nestin表达率为82.0±3.3；诱导4天NSE表达率为40.4±2.0，诱导7天后NSE表达率为78.1±3.4，诱导4天和7天相比NSE表达在统计学上有差异，t＝-30.52，P＜0.05，表达上调；不表达GFAP。

实施例二：含有HADMSCs的组合物在治疗神经系统疾病中的应用

HADMSCs能够分化为神经细胞，为神经移植开辟了新的细胞来源。本发明建立了动物模型，对上述结果进行进一步证实。

1、动物分组及模型制作：

Wistar大鼠80只，雌雄不限，随机分为4组：A组为损伤组(Sham)，20只，只开颅钻孔不打击脑组织不移植细胞，作为阴性对照组。B组为假移植组(TBI+NS)，20只，开颅钻孔打击脑组织1天后注射生理盐水10μl，作为干预对照。C组为移植组(TBI+HADMSCs)，20只，开颅钻孔打击脑组织1天后注射含HADMSCs的生理盐水10μl，作为HADMSCs移植组。D组为纤维蛋白胶移植组(TBI+FG+HADMSCs)，20只，开颅钻孔打击脑组织1天后将HADMSCs以1×10⁶/ml密度与纤维蛋白胶的组分主体胶和催化剂混合，于损伤区用纤维蛋白胶专用注射器单点注射混合液100μl，作为纤维蛋白胶细胞移植组。纤维蛋白胶由广州倍秀生物技术有限公司生产。

B、C、D组三组采用自由落体硬膜外撞击法制作大鼠脑创伤模型，损伤装置有底板，固定支架，垂直导杆，20g砝码，聚乙烯撞击圆锥组成。撞击圆锥头端直径4mm，高2.5mm。10％水合氯醛腹腔内注射麻醉大鼠，注射量为3ml/kg体重，将大鼠头部固定于手术台上，减去顶部皮毛，消毒，沿中线切开皮肤及骨膜，左侧前卤后3mm，左旁开2mm，钻一直径为5mm的圆形窗，将撞击圆锥头端放入骨窗中，砝码自30cm高处垂直落下，撞击置于硬膜上的圆锥，致中度脑损伤，缝合骨膜及皮肤，放回复苏。

2、免疫组化：

创伤后2周、4周用10％水合氯醛腹腔内过量注射麻醉处死大鼠，每组各5只，立即开胸经心脏主动脉插管，1分钟内用1％肝素生理盐水100ml快速灌注，然后用4％多聚甲醛溶液滴灌2小时，灌注后取出脑组织，放入4℃、4％多聚甲醛溶液中固定过夜。梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡并制成蜡块，以损伤区为中心切片10张，将切片贴附于多聚赖氨酸处理的玻片上以备免疫组化染色。

免疫组化SP法：将石蜡切片脱蜡和水化；用PH7.4的PBS冲洗，冲洗3次，每次5分钟，3％H₂O₂室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗3次，每次5分钟；加热抗原修复：将切片放入抗原修复液中，电炉加热至96～100℃，持续20分钟；室温冷却后用PBS冲洗5分钟×3次；10％正常山羊血清封闭，室温孵育20分钟，倾去血清，勿洗；滴加鼠抗人GFAP工作液，鼠抗人NSE工作液，4℃湿盒过夜；PBS冲洗3分钟×3次；滴加二抗即生物素标记山羊抗鼠IgG工作液，室温下孵育30分钟；PBS冲洗3分钟×3次；滴加三抗即辣根酶标记链霉卵白素-过氧化物酶溶液，37℃孵育30分钟；PBS冲洗3分钟×3次；加新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5～10分钟；自来水充分冲洗；苏木素复染；酸酒精分化；梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果显示：动物脑内移植2周、4周均表达NSE和GFAP，参见图4。表明HADMSCs在体内分化为神经元和神经胶质细胞，HADMSCs能够在纤维蛋白胶内存活和分化。

从以上实施例可见：人羊膜间充质干细胞表达神经干细胞的标志物nestin，经体外诱导该细胞可分化为神经元，在损伤脑区可分化为神经元和神经胶质细胞。因此，可通过局部应用或、腰椎穿刺及静脉输注等途径将HADMSCs移植人体来治疗脑损伤、帕金森综合症、脑卒中、脊髓损伤及外周神经损伤等神经系统疾病。

实施例三：纤维蛋白胶作为HADMSCs的支架材料在组织工程中的应用

纤维蛋白胶是从血液中提取相关成分如纤维蛋白原、XIII因子、凝血酶等制成的医用生物材料，可作为粘合剂粘合修复组织损伤，其组织相容性和生物降解性良好，可被组织完全吸收。我们将纤维蛋白胶和HADMSCs混合，并移植于大鼠的损伤脑组织内，2周和4周均发现其分化为神经元和神经胶质细胞，表明移植的HADMSCs在纤维蛋白胶内能够很好的生存，且在局部微环境的影响下，能够分化为神经细胞。移植区未见炎细胞浸润，表明其和脑组织的良好相容性。2周的组织HE切片中未发现纤维蛋白胶团块，说明纤维蛋白胶已经完全溶解，其降解性能良好。且用纤维蛋白胶作为细胞移植的支架，不仅能够起到局部止血的作用，还能防止细胞的流动，使局部保持更大的细胞浓度，更有利于损伤的修复。同时，纤维蛋白胶作为HADMSCs的支架材料，还可用于骨组织工程等其它组织工程。

Claims

1.一种诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于：取人羊膜间充质干细胞在含全反式维甲酸、碱性成纤维生长因子、胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。

2.根据权利要求1所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于：所述DMEM/F12培养基含20μmol-30μmol/L全反式维甲酸、10-20μg/L碱性成纤维生长因子、10％-20％体积百分含量的胎牛血清。

3.根据权利要求1或2所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于：所述人羊膜间充质干细胞在所述培养基中培养4-7天。

4.根据权利要求1或2所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于：所述人羊膜间充质干细胞选传至第3-5代的人羊膜间充质干细胞。

5.根据权利要求1或2所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于所述人羊膜间充质干细胞由如下方法制得：

(2)将上一步所得的细胞悬液过滤，制成单细胞悬液；

6.根据权利要求5所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于：在所述第(1)步中，采用重量百分含量为0.125-0.25％的胰蛋白酶，室温消化30-60分钟，共2-4次，然后用含体积百分含量为10％-20％胎牛血清的DMEM/F12培养液中止胰蛋白酶，采用含0.5-2.0g/L胶原酶和0.05-0.20g/L脱氧核糖核酸酶的V_DMEM∶V_F12＝1∶1的DMEM/F12培养液，37℃消化1-2小时。

7.根据权利要求5所述的诱导人羊膜间充质干细胞向神经细胞分化的方法，其特征在于：在第(3)步开始细胞培养后，培养48～72小时，更换培养液，弃去未贴壁的细胞，根据细胞生长情况，每3～4天全量换液一次，待细胞达到80％～90％融合时，用0.25％的胰蛋白酶消化，然后按1∶2或1∶3的比例进行传代接种培养，并记为P1代，传代培养过程中每3天全量换液，直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底，重复上述操作进行传代培养，并记为P2代，继续上述传代培养过程。

8.通过权利要求1或2所述的方法得到的神经细胞。

9.一种用于治疗神经疾病的组合物，包括权利要求8所述的神经细胞。