JP2018518503A - 神経前駆細胞の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、抗炎症、新生血管再生、内在性幹細胞の可動及び増殖などの役割であって、虚血性損傷部位を減少させるだけではなく、神経機能を回復させるので、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患との治療剤として用いられうる。特に、本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、多回投与する場合、行動改善効果が非常に優れる。【選択図】図1
Description
本発明は、神経前駆細胞(Neural precursor cell;NPC)の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物に関する。
幹細胞は、その多分化能によって、多様な疾患の有望な治療候補物質として見なされる。例えば、間葉幹細胞(mesenchymal stem cells;MSCs)は、容易に収得及び分離が可能であり、血管新生を促進し、炎症を抑制する多くの栄養因子を分泌する(非特許文献1)。MSCのこのような特性は、ヒト疾病の治療に適用するための研究から考慮された。最近の研究によれば、MSCは、多くの動物モデル及びヒト臨床治療(非特許文献2、非特許文献3)で組織回復に寄与すると明かになった。いくつかの報告が、インビトロでMSCがニューロン(非特許文献4)及び星状細胞(astrocyte)(非特許文献3)を含む神経系列への分化能を言及しているが、これら分化された細胞が、インビボで如何なる機能を行うか否かの明確な証拠はない。MSCの有益な効果は、細胞代替よりは傍分泌(paracrine)機作によって誘導されると見られ、これにより、MSCの移植(transplantation)は、長期間持続する改善ではない、一時的であり、限定された効果を有すると見られる(非特許文献5)。
一方、胚芽幹細胞(embryonic stem cells;ESCs)は、3個の胚芽生殖葉(embryonic germ layer)から由来するあらゆる特定細胞の形態で分化し、強力な自己再生能力を有すると知られた。注目すべきことは、ESCから由来する神経前駆細胞(Neural precursor cells;NPCs)は、優先的にニューロン、星状細胞及び希少突起グリア細胞(oligodendrocyte)を含む神経系の特定形態の細胞に分化するために、脳組織の回復のための細胞源(cell source)と見なされるということである。これら細胞は、また内生神経前駆細胞の生存及び増殖を促進するいくつかの因子を分泌する(非特許文献6)。しかし、ESCから分化された神経前駆細胞(NPC)または神経前駆細胞の培養液が、如何に疾患モデルで移植後、機能の改善に寄与するかは依然として知られていない。
逆分化幹細胞とは、全分化能(pluripotency)を保有しない体細胞に遺伝子導入/転写因子導入、化合物(chemical)処理、成長因子処理などの多様な方式を通じて人為的な逆分化過程を通じて全分化能を有するように誘導された細胞を称する言葉であって、誘導万能幹細胞(iPSC;induced pluripotent stem cells)とも称する(非特許文献7)。これら細胞は、胚芽幹細胞と比べる時、細胞の形態、培養方式、増殖速度、遺伝子発現と染色体変異態様、全分化能、免疫欠乏マウスでのテラトーマ形成能などで非常に高い類似性を示している。この誘導万能幹細胞の分化能は、胚芽幹細胞と類似しているが、これらから分化されたNPCあるいはNPCの培養液が、如何に疾患モデルで移植後、機能の改善に寄与するかはよく知られていない。
本明細書の全般に亘って多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照して挿入されて、本発明が属する技術分野のレベル及び本発明の内容がより明確に説明される。
Caplan,A.I.,& Dennis,J.E.(2006).Mesenchymal stem cells as trophic mediators.Journal of Cellular Biochemistry,98,1076−1084。
Chen,J.,Li,Y.,Katakowski,M.,et al.(2003).Intravenous bone marrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat.Journal of Neuroscience Research,73,778−786。
Kopen,G.C.,Prockop,D.J.,& Phinney,D.G.(1999).Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum,and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains.Proceedings of the National Academy of Sciences,96,10711−10716。
Bae,K.S.,Park,J.B.,Kim,H.S.,Kim,D.S.,Park,D.,J.,& Kang,S.J.(2011).Neuron−like differentiation of bone marrowderived mesenchymal stem cells.Yonsei Medical Journal,52,401−412。
Cho,S.R.,Kim,Y.R.,Kang,H.S.,et al.(2009).Functional recovery after the transplantation of neurally differentiated mesenchymal stem cells derived from bone barrow in a rat model Functional recovery after the transplantation of spinal cord injury.Cell Transplantion,18,1359−1368。
Capone,C.,Frigerio,S.,Fumagalli,S.,et al.(2007).Neurosphere−derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment.PLoSOne,7,e373。
Takahashi,K.,Tanabe,K.,Ohnuki,M.,Narita,M.,Ichisaka,T.,Tomoda,K.,and Yamanaka,S.(2007).Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.Cell 131:861−872。
本発明者らは、虚血性疾患と神経炎症疾患との根本的な治療方法を開発するために研究努力してきた。その結果、幹細胞移植とは異なる接近方式として、神経前駆細胞(NPC)分泌タンパク質(secretome)の病変部位への投与を通じて虚血性損傷部位を減少させ、神経機能を回復させることによって、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患及び退行性神経系疾患とを効果的に治療することができるということを確認することによって、本発明を完成した。
したがって、本発明の目的は、虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、虚血性疾患または神経炎症疾患の予防または治療方法を提供することである。
本発明の他の目的及び利点は、下記の発明の詳細な説明、特許請求の範囲及び図面によってより明確になる。
本発明の一態様によれば、本発明は、神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。
本発明者らは、虚血性疾患と神経炎症疾患との根本的な治療方法を開発するために研究努力してきた。その結果、幹細胞移植とは異なる接近方式として、神経前駆細胞分泌タンパク質の病変部位への投与を通じて虚血性損傷部位を減少させ、神経機能を回復させることによって、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患とを効果的に治療することができるということを確認した。
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである:
(i)本発明は、神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。
(ii)本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、抗炎症、新生血管再生、内在性幹細胞の可動及び増殖などの役割であって、虚血性損傷部位を減少させるだけではなく、神経機能を回復させるので、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患との治療剤として用いられうる。
(iii)また、本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、多回投与する場合、一回性投与よりも行動改善効果が非常に優れる。
(i)本発明は、神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物を提供する。
(ii)本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、抗炎症、新生血管再生、内在性幹細胞の可動及び増殖などの役割であって、虚血性損傷部位を減少させるだけではなく、神経機能を回復させるので、虚血性疾患と炎症による神経損傷疾患のような退行性神経系疾患との治療剤として用いられうる。
(iii)また、本発明の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、多回投与する場合、一回性投与よりも行動改善効果が非常に優れる。
本明細書で使われた用語、“神経前駆細胞の分泌タンパク質”は、神経前駆細胞の培養時に、神経前駆細胞から外部(培養培地)に分泌されたタンパク質の集合体を意味する。
本発明の一具現例によれば、本発明の分泌タンパク質の製造に用いられる神経前駆細胞は、全分化能(万能)幹細胞から分化されたものである。
本明細書で使われた用語、“幹細胞”は、組織を構成する各細胞に分化(differentiation)される前段階の未分化細胞を総称し、特定の分化刺激(環境)によって特定細胞に分化することができる能力を有している。幹細胞は、細胞分裂が止められた分化された細胞とは異なって、細胞分裂によって自身と同一の細胞を生産(self−renewal)し、分化刺激が加えられれば、特定細胞に分化され、このような分化は、他の環境または他の分化刺激によって多様な細胞にも分化されうる分化の柔軟性(plasticity)を有していることが特徴である。
本発明で用いられる幹細胞は、インビトロで無限定増殖され、3種のあらゆる胚芽層(外胚葉、中胚葉と内胚葉)から由来の多様な細胞に分化されうる全分化能(万能)幹細胞(pluripotent stem cell)である。より具体的に、前記全分化能(万能)幹細胞は、胚芽幹細胞(ESCs)、誘導万能幹細胞(iPSC)、胚芽生殖細胞(embryonic germ cells)、または胚芽腫瘍細胞(embryonic carcinoma cells)である。
胚芽幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊(ICM)から由来され、胚芽生殖細胞は、5〜10週齢の生殖隆起(gonadal ridge)の原始生殖細胞から由来される。
誘導万能幹細胞(iPSCs)は、非全分化能細胞(例えば、体細胞)から全能性を付与する特定の遺伝子を挿入して人工的に由来の全分化能幹細胞の1つである。誘導万能幹細胞は、幹細胞遺伝子及びタンパク質発現、染色体メチル化、倍加時間(doubling time)、胚芽体形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性及び分化性を有するという面で全分化能幹細胞(例えば、胚芽幹細胞)と同一であると見なされる。
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞(NPC)は、全分化能(万能)幹細胞(例えば、胚芽幹細胞または誘導万能幹細胞)を神経系列細胞に分化誘導して形成された神経ロゼット(neural rosette)段階前後の神経前駆細胞である。
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、PSA−NCAM(poly−sialylated neural cell adhesion molecule)−陽性神経前駆細胞(NPC)である。
本発明の他の一具現例によれば、前記神経前駆細胞は、PSA−NCAM−陰性神経前駆細胞(NPC)である。
前記PSA−NCAM−陽性あるいは陰性神経前駆細胞(NPC)は、全分化能幹細胞から神経分化刺激を通じて分化された神経ロゼットで抗PSA−NCAM抗体を用いて分離される。前記用語、“神経ロゼット”は、ヒト胚芽幹細胞の神経分化過程の初期段階の神経幹細胞を言い、神経ロゼットは、円柱型の放射状の形態を有する。前記神経ロゼットは、Pax6及びSox1のような初期神経外胚葉(neuroectodermal)マーカーを発現する細胞で構成され、多様なニューロン細胞及び神経膠細胞に分化することができる。
前記神経分化刺激は、当業者に通常実施される方法、例えば、無血清培地(Tropepe V et al.,Direct neural fate specification from embryonic stem cells:A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism.Neuron.30:6578(2001))、FGFs(fibroblast growth factors)、Wnt、及びRA(retinoic acid)のようなモルフォゲン(morphogens)の処理(Ying QL et al.Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.Nat Biotechnol.21:183186(2003))によって分化することができるが、これらに限定されるものではない。
前記抗体としては、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用することができる。PSA−NCAMに対する抗体は、当業者に通常実施される方法、例えば、融合方法(Kohler and Milstein,European Journal of Immunology,6:511−519(1976))、組換えDNA方法(米国特許第4,816,56号)またはファージ抗体ライブラリー方法(Clackson et al,Nature,352:624−628(1991)、及びMarks et al,J.Mol.Biol.,222:58,1−597(1991))によって製造可能である。抗体製造に対する一般的な過程は、Harlow,E.and Lane,D.,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,New York,1999;Zola,H.,Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Florida,1984;及びColigan,CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY,Wiley/Greene,NY,1991に詳細に記載されており、前記文献は、本明細書に参考として組み込まれる。例えば、単一クローン抗体を生産するハイブリードマ細胞の製造は、不死滅化細胞株を抗体生産リンパ球と融合させてなされ、この過程に必要な技術は、当業者によく知られており、容易に実施することができる。ポリクローナル抗体は、PSA−NCAM抗原を適した動物に注射し、この動物から抗血清を収集した後、公知の親和性(affinity)技術を用いて抗血清から抗体を分離して得られる。
本明細書において、PSA−NCAMを言及しながら使われる用語“抗体”は、PSA−NCAMに対する特異抗体であって、PSA−NCAMタンパク質に対して特異的に結合し、完全な抗体の形態だけではなく、抗体分子の抗原結合断片を含む。完全な抗体は、2本の全長の軽鎖及び2本の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されており、抗体分子の抗原結合断片とは、抗原結合機能を保有している断片であって、Fab、F(ab’)、F(ab’)2、及びFvを含む。
抗体を用いたPSA−NCAM−陽性神経前駆細胞(NPC)の分離のために、蛍光−活性細胞分類機(fluorescence−activating cell sorters;FACS)、磁性活性細胞分類機(magnetic activated cell sorter;MACS)、及び補体媒介性溶解(complement−mediated lysis)方法を利用できる。
本発明の一具現例によれば、前記分泌タンパク質は、神経前駆細胞を動物細胞培養培地で培養して得た細胞培養液に含有された形態である。すなわち、本発明の組成物には、神経前駆細胞の分泌タンパク質が含有されている神経前駆細胞の培養液が含まれうるものである。
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞(NPC)の細胞培養液は、神経前駆細胞をITS(インスリン/トランスフェリン/セレン)及びbFGF(basic fibroblast growth factor)が含有された無血清動物細胞培養培地で培養した後、細胞を除去して収得することができる。前記培養には、継代培養した神経前駆細胞、例えば、N2、B−27及び/またはGem21が添加されたbFGF−含有細胞培養培地で4継代以上繰り返し培養して得た神経前駆細胞が用いられうる。
前記培養培地での細胞の除去は、遠心分離、濾過のような通常の細胞分離方法を使用して実施することができる。
前記細胞培養培地としては、神経前駆細胞の培養時に用いられる通常の培地を制限なしに使用し、例えば、DMEM/F12を使用することができる。
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞(NPC)は、ヒト誘導万能幹細胞(iPSC)から分化されたものであり、この神経前駆細胞の分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含む:
アグリン(Agrin)、アネキシンA5(Annexin A5)、BSG(Basigin)、ピグリカン(Biglycan)、カルポニン−3(Calponin−3)、コアクトシン−類似タンパク質(Coactosin−like protein)、コフィリン−1(Cofilin−1)、コラーゲンα−2、クリン−3(Cullin−3)、デストリン(Destrin)、ジストログリカン(Dystroglycan)、エフリン−B2(Ephrin−B2)、エクスポーチン−2(Exportin−2)、エズリン(Ezrin)、フィブロネクチン、ファイブリン−1(Fibulin−1)、Frizzled−relatedタンパク質、ガレクチン−3結合タンパク質(Galectin−3 binding protein)、グラニュリン(Granulins)、成長/分化因子11(Growh/differentiation factor 11)、ハプトグロビン(Haptoglobin)、ヘモペキシン(Hemopexin)、High mobility group protein B2、ホルネリン(Hornerin)、インポーチン−9(Importin−9)、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2(Insulin−like grwoth factor−binding protein 2)、ループスLaタンパク質(Lupus La protein)、大食細胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor)、ミッドカイン(Midkine)、モエシン(Moesin)、ニューロピリン2(Neuropilin 2)、プレイオトロフィン(Pleiotrophin)、プロフィリン−1(Profilin−1)、タンパク質DJ−1(Protein DJ−1)、ラジキシン(Radixin)、Secreted frizzled−related protein−2、セプチン−11(Septin−11)、タリン−1(Talin−1)、テスチカン(Testican)、チモポイエチン(Thymopoietin)、トランスゲリン−3(Transgelin−3)、及びビメンチン(Vimentin)。
アグリン(Agrin)、アネキシンA5(Annexin A5)、BSG(Basigin)、ピグリカン(Biglycan)、カルポニン−3(Calponin−3)、コアクトシン−類似タンパク質(Coactosin−like protein)、コフィリン−1(Cofilin−1)、コラーゲンα−2、クリン−3(Cullin−3)、デストリン(Destrin)、ジストログリカン(Dystroglycan)、エフリン−B2(Ephrin−B2)、エクスポーチン−2(Exportin−2)、エズリン(Ezrin)、フィブロネクチン、ファイブリン−1(Fibulin−1)、Frizzled−relatedタンパク質、ガレクチン−3結合タンパク質(Galectin−3 binding protein)、グラニュリン(Granulins)、成長/分化因子11(Growh/differentiation factor 11)、ハプトグロビン(Haptoglobin)、ヘモペキシン(Hemopexin)、High mobility group protein B2、ホルネリン(Hornerin)、インポーチン−9(Importin−9)、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2(Insulin−like grwoth factor−binding protein 2)、ループスLaタンパク質(Lupus La protein)、大食細胞移動抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor)、ミッドカイン(Midkine)、モエシン(Moesin)、ニューロピリン2(Neuropilin 2)、プレイオトロフィン(Pleiotrophin)、プロフィリン−1(Profilin−1)、タンパク質DJ−1(Protein DJ−1)、ラジキシン(Radixin)、Secreted frizzled−related protein−2、セプチン−11(Septin−11)、タリン−1(Talin−1)、テスチカン(Testican)、チモポイエチン(Thymopoietin)、トランスゲリン−3(Transgelin−3)、及びビメンチン(Vimentin)。
本発明の一具現例によれば、前記神経前駆細胞(NPC)は、ヒト胚芽幹細胞(ESC)から分化されたものであり、この神経前駆細胞の分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含む:
アグリン、アネキシンA2(Annexin A2)、アトラクチン(Attractin)、ピグリカン、セルロプラスミン(Ceruloplasmin)、コフィリン−1、コラーゲンα−1、コロニン−1X(Coronin−1X)、ダームシジン(Dermicidin)、DERP12、エフリン−B3、エクソストシン−2(Exostosin−2)、エズリン、ガレクチン−3結合タンパク質、グラニュリン、成長/分化因子11、ハプトグロビン、ヘモペキシン、High mobility group protein B2、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2、ループスLaタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質8(Multiple epidermal growth factor−like domains protein 8)、ニドゲン−1(Nidogen−1)、パラチモシン(Parathymosin)、プロフィリン−2(Profilin−2)、タンパク質DJ−1、Secreted frizzled−related protein−2、セクレトグラニン(Secretogranin)、タリン−1、チモシンβ4(Thymosin beta−4)、TGFBI(Transforming grwowth factor−beta−induced protein ig−h3)、トランスゲリン(Transgelin)、及びビメンチン。
アグリン、アネキシンA2(Annexin A2)、アトラクチン(Attractin)、ピグリカン、セルロプラスミン(Ceruloplasmin)、コフィリン−1、コラーゲンα−1、コロニン−1X(Coronin−1X)、ダームシジン(Dermicidin)、DERP12、エフリン−B3、エクソストシン−2(Exostosin−2)、エズリン、ガレクチン−3結合タンパク質、グラニュリン、成長/分化因子11、ハプトグロビン、ヘモペキシン、High mobility group protein B2、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2、ループスLaタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質8(Multiple epidermal growth factor−like domains protein 8)、ニドゲン−1(Nidogen−1)、パラチモシン(Parathymosin)、プロフィリン−2(Profilin−2)、タンパク質DJ−1、Secreted frizzled−related protein−2、セクレトグラニン(Secretogranin)、タリン−1、チモシンβ4(Thymosin beta−4)、TGFBI(Transforming grwowth factor−beta−induced protein ig−h3)、トランスゲリン(Transgelin)、及びビメンチン。
本明細書で使われた用語、“治療”は、(a)疾患、疾病または症状の発展の抑制;(b)疾患、疾病または症状の軽減;または(c)疾患、疾病または症状を除去することを意味する。本発明の組成物は、虚血性疾患または神経炎症疾患の症状の発展を抑制するか、それを除去または軽減させる役割を果たす。したがって、本発明の組成物は、それ自体で虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物にもなり、あるいは他の抗虚血/抗炎症組成物と共に投与されて、これら疾患に対する治療補助剤として適用されることもある。これにより、本明細書において、用語“治療”または“治療剤”は、“治療補助”または“治療補助剤”の意味を含む。
本明細書で使われた用語、“虚血性疾患”は、血管損傷による血液漏水(blood leakage)、塞栓(embolism)または梗塞(infarction)などによって血流量が減少して、血液供給が遮断された組織が壊死に至る疾患を言う。
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物として治療可能な虚血性疾患は、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、狭心症、下肢動脈虚血性疾患、四肢末端部虚血性疾患、及び虚血性脳血管疾患で構成された群から選択される。
本明細書で使われた用語、“虚血性心臓疾患”は、心臓に血液を供給する冠状動脈が損傷されるか、狭小または閉塞されて、心臓筋肉への血流が減少して招かれる疾患を意味する。より具体的には、本発明の組成物として治療可能な虚血性心臓疾患は、狭心症、心筋梗塞症及び心不全症で構成された群から選択される。
本明細書で使われた用語、“虚血性脳血管疾患”は、脳血管が損傷されるか、狭小または閉塞されて、これにより血流を供給されていない脳組織が損傷される疾患を意味する。より具体的には、前記虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中であり、前記虚血性脳卒中は、脳出血及び脳梗塞を含む。
本明細書で使われた用語、“神経炎症疾患”は、炎症反応による神経組織の損傷で招かれる疾患を意味し、より具体的には、炎症反応による神経損傷疾患及び退行性神経系疾患を意味する。
本発明の一具現例によれば、本発明の組成物として治療可能な神経炎症疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、白質脳炎、側頭葉てんかん、及び脊髄損傷で構成された群から選択される。本発明において、脊髄損傷は、炎症性脊髄損傷及び外傷性脊髄損傷をいずれも含む意味として使われる。
本発明の一例によれば、ヒトESC−由来及びiPSC−由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を脳卒中実験モデル(pMCAoモデル)に投与した場合、単回及び多回投与時に、PBS群と比較して、いずれも有意にED−1陽性細胞及びGFAP陽性細胞の減少を誘発した(図8aないし図8b及び図9aないし図9b参照)。すなわち、分泌タンパク質は、炎症反応を減少させ、微小グリア細胞(microglial cell)を不活性化(減少)させ(図8aないし図8b)、星状膠細胞(astrocyte)を不活性化(減少)させた(図9aないし図9b)。
また、本発明の分泌タンパク質は、DCX遺伝子によって発現されるダブルコルチン(doublecortin)の発現を増加させ、陽性神経前駆細胞を増加させる(図10参照)。ダブルコルチンは、ニューロン移動タンパク質(Neuronal migration protein)である。このような結果は、分泌タンパク質の投与によって脳組織で内在性神経幹細胞(endogenous neural stem cell)が可動されたということを示す。
本発明の分泌タンパク質は、α−SMA陽性血管の頻度を増加させるが、これは、新生血管が増加したということを意味する(図11参照)。
このような抗炎症、内在性幹細胞の可動及び新生血管の増加効果は、本発明の神経前駆細胞(NPC)由来分泌タンパク質が神経保護作用(neuroprotective effect)機能があるということを示唆する。すなわち、本発明の神経前駆細胞由来分泌タンパク質は、前記のような効果を示すことによって、神経炎症疾患に対する治療を可能にする。
一方、本発明の全分化能幹細胞由来神経前駆細胞の分泌タンパク質は、脊髄損傷に対する治療効果を有する。本発明の一実施例によれば、脊髄損傷モデルを用いたBBB testでは、全分化能幹細胞(ESC)由来神経前駆細胞の分泌タンパク質注入群(injection)で優れた行動回復が表われた(図12参照)。誘導万能幹細胞(iPSC)は、幹細胞遺伝子及びタンパク質発現、染色体メチル化、倍加時間、胚芽体形成、テラトーマ形成、生存性キメラ形成、交雑性及び分化性を有するという面で全分化能幹細胞(例えば、胚芽幹細胞)と同一であると見なされるので、やはり前記のような脊髄損傷に対する治療効果を有する。
本明細書で使われた用語、“投与”または“投与する”は、本発明の組成物の治療的有効量を対象体に直接に投与することによって、対象体の体内で同量を形成させることを言う。したがって、用語“投与する”は、本発明の有効成分である神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質)を病変部位に注入することを含むので、用語“投与する”は、“注入する”のような意味として使われる。
組成物の“治療的有効量”は、組成物を投与しようとする対象体に治療的または予防的の効果を提供するのに十分な含量を意味し、これにより、“予防的有効量”を含む意味である。本明細書で使われた用語、“対象体”は、制限なしにヒト、マウス、ラット、ギニーピッグ、犬、猫、馬、牛、豚、猿、チンパンジー、ヒヒまたは赤毛猿を含む。具体的には、本発明の対象体は、ヒトである。
本発明の組成物が、薬剤学的組成物として製造される場合、本発明の薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容される担体を含む。本発明の薬剤学的組成物に含まれる薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通用されるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微小結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、食塩水、PBS(phosphate buffered saline)、または培地などを含むが、これらに限定されるものではない。
本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含みうる。適した薬剤学的に許容される担体及び製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)に詳しく記載されている。
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与し、具体的には、非経口投与、より具体的には、筋肉内(intramuscular)投与、脳室内(intracerebroventricular)投与、傷(損傷)部位投与、脊髄あるいは髄腔内(Intrathecal)投与または血管内(intravascular)投与である。血管内投与である場合、動脈または静脈内に投与することができる。
本発明の薬剤学的組成物の適した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって多様に処方されうる。
本発明の薬剤学的組成物は、1回または多回として投与される。例えば、ヒトまたは他の動物に1回または分割された容量で多回投与される。単一投与組成物は、一定範囲の量またはその一部に該当する含量を含有して1日容量を満たすことができる。すなわち、本発明による治療組成物は、治療を必要とする患者に毎日単一または複数回投与する方式で投与されるか、一定時間(hours、day、weekなど)の間隔を置いて単一または複数回投与する方式で投与される。
本明細書で使われた用語、“1回投与用”は、1回投与容量の分泌タンパク質を含む組成物または1回投与の形態で投与される組成物の用途を意味し、“多回投与用”は、多回投与容量の分泌タンパク質を含む組成物または多回投与の形態で投与される組成物の用途を意味する。
本発明の一例によれば、本発明の神経前駆細胞(NPC)由来分泌タンパク質を脳卒中動物モデルに1回投与する場合、虚血病変部位が減少し、行動改善効果を示した(図1ないし図4参照)。
一方、本発明の神経前駆細胞(NPC)由来分泌タンパク質を脳卒中動物モデルに多回投与する場合にも、やはり虚血病変部位が減少し、行動改善効果を示した(図6aないし図6i及び図7参照)。特に、単回投与群に比べて、多回投与群が行動改善により高い治療効果を発揮し(図6aないし図6i)、抗炎症効果もさらに高く表われ(図8aないし図8b及び図9aないし図9b参照)、分泌タンパク質の繰り返し投与が内在性神経幹細胞及び新生血管の数も有意に増加させるということを確認した。
本発明の薬剤学的組成物は、当業者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び/または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位用量の形態で製造されるか、または多用量容器内に内入させて製造可能である。この際、剤形は、オイルまたは水性媒質中の溶液、懸濁液、シロップ剤、または乳液の形態であるか、エクストラクト剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤をさらに含みうる。
本発明の他の態様によれば、本発明は、(a)神経前駆細胞(NPC)由来分泌タンパク質の治療学的有効量;及び(b)薬剤学的に許容される担体(carrier)を含む組成物;を対象(subject)に投与する段階を含む虚血性疾患または神経炎症疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明の方法は、前述した本発明の組成物を利用するために、両者間の共通内容は、本明細書の過度な複雑性を回避するために、その記載を省略する。
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。これら実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって、本発明の範囲が、これら実施例によって制限されないということは、当業者にとって自明である。
実験材料及び実験方法
ヒトESC−由来またはヒトiPSC−由来NPC及びPSA−NCAM−陽性NPC細胞の収得
ヒト細胞の使用は、医学研究倫理審議委員会(Institutional Review Board、IRB No.4−2008−0643)の承認を受けた。神経誘導のために、bFGFがないhESC培地(Invitrogen)上でhESCとiPSCとから由来の各胚芽体(embryoid bodies、EBs)を5μM DM(dorsomorphin)(Sigma,St.Louis,MO)及び5〜10μM SB431542(Calbiochem,San Diego,CA)を含む懸濁液で4日間培養し、以後、20ng/ml bFGFが補充された1xN2(Invitrogen)培地でマトリゲルコーティングされたディッシュ(BD Biosciences,Bedford,MA)に5日間吸着させた(Kim,D.S.,Lee,D.R.,Kim,H.S.,et al.(2012).Highly pure and expandable PSA−NCAM−positive neural precursors from human ESC and iPSC−derived neural rosettes.PLoSOne,7,e39715)。吸着されたEBコロニーの中心に表われた神経ロゼットをガラスピペットを用いて周辺の平らな細胞から気をつけて分離した。小さなロゼット塊をマトリゲルコーティングされたディッシュにシーディングし、1xN2、1xB27(Invitrogen)が補充されたDMEM/F12で培養した(Kim,D.S.,Lee,J.S.,Leem,J.W.,et al.(2010).Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.Stem Cell Reviews and Reports,6,270−281)。
ヒトESC−由来またはヒトiPSC−由来NPC及びPSA−NCAM−陽性NPC細胞の収得
ヒト細胞の使用は、医学研究倫理審議委員会(Institutional Review Board、IRB No.4−2008−0643)の承認を受けた。神経誘導のために、bFGFがないhESC培地(Invitrogen)上でhESCとiPSCとから由来の各胚芽体(embryoid bodies、EBs)を5μM DM(dorsomorphin)(Sigma,St.Louis,MO)及び5〜10μM SB431542(Calbiochem,San Diego,CA)を含む懸濁液で4日間培養し、以後、20ng/ml bFGFが補充された1xN2(Invitrogen)培地でマトリゲルコーティングされたディッシュ(BD Biosciences,Bedford,MA)に5日間吸着させた(Kim,D.S.,Lee,D.R.,Kim,H.S.,et al.(2012).Highly pure and expandable PSA−NCAM−positive neural precursors from human ESC and iPSC−derived neural rosettes.PLoSOne,7,e39715)。吸着されたEBコロニーの中心に表われた神経ロゼットをガラスピペットを用いて周辺の平らな細胞から気をつけて分離した。小さなロゼット塊をマトリゲルコーティングされたディッシュにシーディングし、1xN2、1xB27(Invitrogen)が補充されたDMEM/F12で培養した(Kim,D.S.,Lee,J.S.,Leem,J.W.,et al.(2010).Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity.Stem Cell Reviews and Reports,6,270−281)。
80〜90%のコンフルエンシの拡張された神経ロゼットからなる神経前駆細胞(NPC)を得た後、10μM Y27632(Sigma)に1時間露出させて、MACS段階に入る前の細胞死が起こることを防止した。Accutase(Invitrogen)を用いて分離した後に、細胞(〜1x108細胞)を1% BSAが含まれたPBSでブロッキングし、マイクロビーズ(Miltenyi Biotec)が接合された抗PSA−NCAM抗体と共に4℃で15分間培養した。集中的に洗浄した後、細胞懸濁液をMASC(magnetic activated cell sorting)に入れ、カラムに残っている陽性−標識された細胞をチューブに溶離させた。分離されたPSA−NCAM−陽性神経前駆細胞(NPC)をN2B27培地または20ng/ml bFGFが追加されたNBG培地(1xN2、0.5xB27及び0.5xG21補充)(GeminiBio−Products,WestSacramento,CA)に4−5x105細胞/cm2濃度で再びプレーティングした。培養培地は、毎日取り替え、細胞は、2〜3日ごとに継代培養した。
ヒト全分化能胚芽幹細胞(ESC)由来−神経前駆細胞(NPCs)で分泌タンパク質の分離
前記で収得したヒト全分化能胚芽幹細胞(ESC)由来神経前駆細胞(PSA−NCAM−陽性神経前駆細胞)を基本培養液(DMEM/F−12)にN2(100X−最終濃度1X)、B−27(50X−最終濃度0.5X)及びGem21(50X−最終濃度0.5X)の血清除去補充剤を入れ、bFGF(20ng/ml)を添加して、マトリゲル(Matrigel)コーティングされた60mmディッシュに4継代以上繰り返し培養して増幅した後、8〜10個のディッシュに約90%まで細胞が満ちるように培養した。培養液を除去した後、リン酸緩衝溶液で3回洗浄し、無血清基本培養液(DMEM/F12)にITS(100X−最終濃度1X)とbFGF(20ng/ml)のみを添加して24時間培養した。対照群は、細胞がないディッシュに同量の同じ組成の培養液(基本培養液にITSとbFGFとを同量で添加)を入れ、培養器で24時間培養した後、回収したものを対照群として使用した。培養液をいずれも集めて遠心分離して(800gで30分)、細胞の破片などを除去した後、−70℃の冷凍庫に直ちに氷らせた後、必要時に解凍して使用した。
前記で収得したヒト全分化能胚芽幹細胞(ESC)由来神経前駆細胞(PSA−NCAM−陽性神経前駆細胞)を基本培養液(DMEM/F−12)にN2(100X−最終濃度1X)、B−27(50X−最終濃度0.5X)及びGem21(50X−最終濃度0.5X)の血清除去補充剤を入れ、bFGF(20ng/ml)を添加して、マトリゲル(Matrigel)コーティングされた60mmディッシュに4継代以上繰り返し培養して増幅した後、8〜10個のディッシュに約90%まで細胞が満ちるように培養した。培養液を除去した後、リン酸緩衝溶液で3回洗浄し、無血清基本培養液(DMEM/F12)にITS(100X−最終濃度1X)とbFGF(20ng/ml)のみを添加して24時間培養した。対照群は、細胞がないディッシュに同量の同じ組成の培養液(基本培養液にITSとbFGFとを同量で添加)を入れ、培養器で24時間培養した後、回収したものを対照群として使用した。培養液をいずれも集めて遠心分離して(800gで30分)、細胞の破片などを除去した後、−70℃の冷凍庫に直ちに氷らせた後、必要時に解凍して使用した。
ヒト全分化能誘導万能幹細胞(iPSC)−由来神経前駆細胞(NPCs)で分泌タンパク質の分離
P0のヒト全分化能誘導万能幹細胞(iPSC)由来神経前駆細胞(NPC)をDMEM/F−12の基本培養液にN2、B−27、Gem21の血清除去補充剤を入れ、bFGFを添加して、マトリゲルコーティングされた100mmディッシュにP4まで継代してディッシュに約90%以上細胞が満ちるように培養した。以後、培養液を除去し、リン酸緩衝溶液で1回洗浄して、アキュターゼ酵素で細胞をディッシュから分離してPBSで2〜3回洗浄した。そして、フェノールレッドが入っていないDMEM基本培養液にITSのみを添加して、浮遊状態で24時間培養した。培養液の対照群として、同量の基本培養液にITSを同量で添加して、培養器に24時間培養したものを使用した。細胞が浮遊されている培養液をいずれも集めて遠心分離して(1000gで20分)、細胞の破片などを除去した後、−70℃の冷凍庫に直ちに氷らせた後、必要時に解凍して使用した。
P0のヒト全分化能誘導万能幹細胞(iPSC)由来神経前駆細胞(NPC)をDMEM/F−12の基本培養液にN2、B−27、Gem21の血清除去補充剤を入れ、bFGFを添加して、マトリゲルコーティングされた100mmディッシュにP4まで継代してディッシュに約90%以上細胞が満ちるように培養した。以後、培養液を除去し、リン酸緩衝溶液で1回洗浄して、アキュターゼ酵素で細胞をディッシュから分離してPBSで2〜3回洗浄した。そして、フェノールレッドが入っていないDMEM基本培養液にITSのみを添加して、浮遊状態で24時間培養した。培養液の対照群として、同量の基本培養液にITSを同量で添加して、培養器に24時間培養したものを使用した。細胞が浮遊されている培養液をいずれも集めて遠心分離して(1000gで20分)、細胞の破片などを除去した後、−70℃の冷凍庫に直ちに氷らせた後、必要時に解凍して使用した。
細胞の培養条件は、次の通りである:
(1)細胞の基本培養条件−DMEM/F−12、bFGF 20ng/ml、N2 100X−最終濃度1X、B−27 50X−最終濃度0.5X、Gem21 50X−最終濃度0.5X。
(2)分泌タンパク質獲得用培養条件−DMEM/phenol red free、ITS 100X−最終濃度1X。
(1)細胞の基本培養条件−DMEM/F−12、bFGF 20ng/ml、N2 100X−最終濃度1X、B−27 50X−最終濃度0.5X、Gem21 50X−最終濃度0.5X。
(2)分泌タンパク質獲得用培養条件−DMEM/phenol red free、ITS 100X−最終濃度1X。
脳卒中モデルの製作
局所脳虚血による神経細胞損傷に対して神経細胞保護効果を測定するために、応用された血管内縫合糸挿入法(intraluminal suture method)を使用した。Zia Longa(Zea Longa,et al,Stroke.,1989,20,84−91)が開発した方法である局所脳虚血モデルであって、他のモデルとは異なって、臨床的に類似しているという長所がある。このような理由で虚血再灌流(ischemia−reperfusion)に対する機転研究やさまざまな薬物の効果をスクリーニングするのに適したモデルである。局所脳虚血モデルは、前述した長所の以外にも、プローブを用いて中大脳動脈(middle cerebral artery)を一時的に閉鎖して再灌流される損傷と、永久的に閉鎖して持続的な細胞損傷をいずれも観察することができるという長所も有している。脳血流量によって虚血性中心部(ischemic core)と虚血性反陰影部位(ischemic penumbra)との差が決定されるが、前者は、15%未満であり、後者は、40%未満である。10〜20分間閉鎖すれば、中心部で神経細胞が散発的に死んで、1時間程度誘発すれば、中心部位(core)が生じながら脳組織損傷が大きくなり、2〜3時間誘発すれば、永久的に閉鎖されたものと類似した損傷を受ける。
局所脳虚血による神経細胞損傷に対して神経細胞保護効果を測定するために、応用された血管内縫合糸挿入法(intraluminal suture method)を使用した。Zia Longa(Zea Longa,et al,Stroke.,1989,20,84−91)が開発した方法である局所脳虚血モデルであって、他のモデルとは異なって、臨床的に類似しているという長所がある。このような理由で虚血再灌流(ischemia−reperfusion)に対する機転研究やさまざまな薬物の効果をスクリーニングするのに適したモデルである。局所脳虚血モデルは、前述した長所の以外にも、プローブを用いて中大脳動脈(middle cerebral artery)を一時的に閉鎖して再灌流される損傷と、永久的に閉鎖して持続的な細胞損傷をいずれも観察することができるという長所も有している。脳血流量によって虚血性中心部(ischemic core)と虚血性反陰影部位(ischemic penumbra)との差が決定されるが、前者は、15%未満であり、後者は、40%未満である。10〜20分間閉鎖すれば、中心部で神経細胞が散発的に死んで、1時間程度誘発すれば、中心部位(core)が生じながら脳組織損傷が大きくなり、2〜3時間誘発すれば、永久的に閉鎖されたものと類似した損傷を受ける。
一週間の順化後、呼吸麻酔器を使用して実験動物(雄Sprague−Dawley rat、体重250〜300g)を麻酔させ、麻酔剤としてイソフルラン(isoflurane)を使用した。まず、白ラットを80% N2Oと20% O2とが混ぜられた混合ガスに5%のイソフルランで全身麻酔を誘導した後、2〜2.5%で麻酔を保持した。脳卒中モデルの製作のために、白ラットの左側首の皮膚を切開した後、内側に総頚動脈(common carotid artery)、外頚動脈(external carotid artery)及び内頚動脈(internal carotid artery)を剥離して導出した後、それぞれの血管をブラックシルク糸で少し縛って血流を遮断した。総頚動脈を半分程度切断し、切断面を通じてナイロン縫合糸の端部を焼灼してラウンディングして、0.40mmになるように製作した25mmの4−0ナイロンプローブ(probe)を挿入した。外頚動脈を通じて挿入したナイロンプローブを内頚動脈を経て中大脳動脈部位に入れて固定して、総頚動脈盆地で約18〜20mm程度挿入した後、中大脳動脈の起始部を塞いだ後、糸で固定して中大脳動脈を永久に閉鎖した後、皮膚切開部位再び縫合した後、麻酔から自然回復させた。
脳卒中モデルに脳動脈を通じる分泌タンパク質の注入及び行動実験:
a.ヒトESC−由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質の注入
脳卒中誘発一日後に、行動実験に対する基準点(baseline)を確立した後、脳卒中モデルの製作と同じ方式で右側外頚動脈を通じて内頚動脈部位にインスリン注射器針を挿入した後、それを通じて分泌タンパク質を0.2mg/kg(体積50μ)ほど動脈注射し、対照群には同じ体積の培養液あるいはリン酸緩衝溶液(PBS)を投与した。分泌タンパク質液を注入した後、14日間動物の状態を観察し、注入前1回、注入後4回にわたって体重を測定し、行動分析を実施した。
a.ヒトESC−由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質の注入
脳卒中誘発一日後に、行動実験に対する基準点(baseline)を確立した後、脳卒中モデルの製作と同じ方式で右側外頚動脈を通じて内頚動脈部位にインスリン注射器針を挿入した後、それを通じて分泌タンパク質を0.2mg/kg(体積50μ)ほど動脈注射し、対照群には同じ体積の培養液あるいはリン酸緩衝溶液(PBS)を投与した。分泌タンパク質液を注入した後、14日間動物の状態を観察し、注入前1回、注入後4回にわたって体重を測定し、行動分析を実施した。
b.ヒトiPSC−由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質の注入−多回投与
脳卒中誘発一日後に、行動実験に対する基準点を確立した後、脳卒中モデルの製作と同じ方式で右側外頚動脈を通じて内頚動脈部位にインスリン注射器針を挿入した後、それを通じて分泌タンパク質を回当たり0.7mg/Kg(300gラットの場合、200μg)、注射量は、体積200μlほど静脈注射した(penile vein投与)。対照群には、同じ体積の培養液を投与した。タンパク質分離でのように、分泌タンパク質の対照群に同量の基本培養液にITSを同量で添加して、培養器に24時間培養した後、対照群として使用した。分泌タンパク質液を注入した後、14日間動物の状態を観察し、注入前1回(0日)、注入後4回(3日、7日、10日及び14日)にわたって体重を測定し、行動分析を実施した。
脳卒中誘発一日後に、行動実験に対する基準点を確立した後、脳卒中モデルの製作と同じ方式で右側外頚動脈を通じて内頚動脈部位にインスリン注射器針を挿入した後、それを通じて分泌タンパク質を回当たり0.7mg/Kg(300gラットの場合、200μg)、注射量は、体積200μlほど静脈注射した(penile vein投与)。対照群には、同じ体積の培養液を投与した。タンパク質分離でのように、分泌タンパク質の対照群に同量の基本培養液にITSを同量で添加して、培養器に24時間培養した後、対照群として使用した。分泌タンパク質液を注入した後、14日間動物の状態を観察し、注入前1回(0日)、注入後4回(3日、7日、10日及び14日)にわたって体重を測定し、行動分析を実施した。
c.行動実験
<1> 上体姿勢検査:実験動物の大脳皮質と線条体感覚と見なされる上体姿勢を試験するために、非対称運動行動を測定した。
<2> ビーム均衡検査:実験動物が狭いビーム上で安定して均衡を取ることを通じて総前庭運動機能(gross vestibulomotor function)を評価した。
<3> フットフォールト検査:運動において、運動動き(motor movement)の調整(協同)と統合(総合)とを検査する時に使用する実験方法であって、フットフォールト(Foot−fault)は、動物が前足や後足を元の場所に置かないか(misplace)、足が格子板バー(grid bar)の間に落ちる場合と定義し、フットフォールトは、正常な動物においては、特に対称的である。
<4> 捕捉可能牽引検査:検査のうち、捕捉可能如何は、実験動物が前足で水平方向のロープにぶら下げることができる能力を通じて測定した。捕捉可能牽引検査は、実験動物の筋肉強度を評価するために行われた。この検査は、従来に報告された方法で実施した。鉄棒(直径2cm、長さ100cm)を水平にスポンジゴムパッド(厚さ7.5cm)の70cm上に位置させた。実験動物の前足を鉄棒に位置させた後、放した。実験動物を5秒間鉄棒にぶら下げられるようにした。落ちるのにかかる時間と後足を鉄棒上に乗せるか否かを通じて、次のように点数を計算した:0点−実験動物が5秒間ぶら下げられ、後足を乗せる、1点−実験動物が5秒間ぶら下げられ、後足を乗せることができない、2点−実験動物が3〜4秒間ぶら下げられる、3点−実験動物が0〜2秒間ぶら下げられる。
<5> オープンフィールド検査(open−field test):一般的な歩行活動レベルを調べるのに使われる検査であって、動物の行動態様と特性とを直接観察して動物の活動性、情緒性及び行動パターンなどを測定した。
<6> mNSS:前記の多様な検査を通じて得られた運動、感覚、均衡、反応及び情緒の検査値の総合成績で、点数を下記の基準によって計算した(一個体当たり点数を合算してmNSSを測定)。
−オープンフィールド検査(動物の情緒性、活動性、行動パターンなどを測定)
動きない:3
1〜20回:2
21〜30回:1
30回以上:0
−捕捉可能牽引検査(筋力測定)
0〜5秒:3
6〜10秒:2
11〜20秒:1
21秒以上:0
−ビーム均衡検査(均衡感覚測定)
0点:1=安定的姿勢
2=ビームの側面を握って多少搖れる程度
1点:3=1本以上の足がビームから脱落する場合
4=均衡を取ろうと努力するが、落ちる場合
2点:5=均衡を取ることができず、ビームに逆にぶら下げられてから落ちる場合
6=ビーム上で全く均衡を取ることができず、落ちる場合
−フットフォールト検査(運動協応能力)
0〜5回:0
6〜10秒:1
11〜20秒:2
21秒以上:3
−上体姿勢検査(非対称運動行動)
0回:2
1〜4回:1
5回以上:0
<1> 上体姿勢検査:実験動物の大脳皮質と線条体感覚と見なされる上体姿勢を試験するために、非対称運動行動を測定した。
<2> ビーム均衡検査:実験動物が狭いビーム上で安定して均衡を取ることを通じて総前庭運動機能(gross vestibulomotor function)を評価した。
<3> フットフォールト検査:運動において、運動動き(motor movement)の調整(協同)と統合(総合)とを検査する時に使用する実験方法であって、フットフォールト(Foot−fault)は、動物が前足や後足を元の場所に置かないか(misplace)、足が格子板バー(grid bar)の間に落ちる場合と定義し、フットフォールトは、正常な動物においては、特に対称的である。
<4> 捕捉可能牽引検査:検査のうち、捕捉可能如何は、実験動物が前足で水平方向のロープにぶら下げることができる能力を通じて測定した。捕捉可能牽引検査は、実験動物の筋肉強度を評価するために行われた。この検査は、従来に報告された方法で実施した。鉄棒(直径2cm、長さ100cm)を水平にスポンジゴムパッド(厚さ7.5cm)の70cm上に位置させた。実験動物の前足を鉄棒に位置させた後、放した。実験動物を5秒間鉄棒にぶら下げられるようにした。落ちるのにかかる時間と後足を鉄棒上に乗せるか否かを通じて、次のように点数を計算した:0点−実験動物が5秒間ぶら下げられ、後足を乗せる、1点−実験動物が5秒間ぶら下げられ、後足を乗せることができない、2点−実験動物が3〜4秒間ぶら下げられる、3点−実験動物が0〜2秒間ぶら下げられる。
<5> オープンフィールド検査(open−field test):一般的な歩行活動レベルを調べるのに使われる検査であって、動物の行動態様と特性とを直接観察して動物の活動性、情緒性及び行動パターンなどを測定した。
<6> mNSS:前記の多様な検査を通じて得られた運動、感覚、均衡、反応及び情緒の検査値の総合成績で、点数を下記の基準によって計算した(一個体当たり点数を合算してmNSSを測定)。
−オープンフィールド検査(動物の情緒性、活動性、行動パターンなどを測定)
動きない:3
1〜20回:2
21〜30回:1
30回以上:0
−捕捉可能牽引検査(筋力測定)
0〜5秒:3
6〜10秒:2
11〜20秒:1
21秒以上:0
−ビーム均衡検査(均衡感覚測定)
0点:1=安定的姿勢
2=ビームの側面を握って多少搖れる程度
1点:3=1本以上の足がビームから脱落する場合
4=均衡を取ろうと努力するが、落ちる場合
2点:5=均衡を取ることができず、ビームに逆にぶら下げられてから落ちる場合
6=ビーム上で全く均衡を取ることができず、落ちる場合
−フットフォールト検査(運動協応能力)
0〜5回:0
6〜10秒:1
11〜20秒:2
21秒以上:3
−上体姿勢検査(非対称運動行動)
0回:2
1〜4回:1
5回以上:0
脳虚血誘発14日後に、白ラットをゾレチルで麻酔した後、開胸した後、右心耳を切開して針を左心室に注入した後、ポンプを用いてリン酸緩衝溶液を心臓に灌流させて血液を除去した後、脳組織を摘出した。標本製作のための組織切片をブレグマ(bregma)を基準にパラフィンに包埋し、損傷された脳組織を確認するために、脳組織切片をヘマトキシリンに染色し、脱水し、固定し、スライドをデジタルカメラで撮影した後、コンピュータに移した。イメージ分析プログラム(image J)を使用して脳梗塞の比率(%)を下記の数式1で計算した。
(数式1)
脳梗塞の比率(%)=(正常左半球の面積−脳梗塞部位の正常組織の面積)/正常左半球の面積×100
(数式1)
脳梗塞の比率(%)=(正常左半球の面積−脳梗塞部位の正常組織の面積)/正常左半球の面積×100
免疫組織化学的分析及び定量化
脳組織を24時間4% ホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した。パラフィン断面の製作のために、累進エタノールで組織を脱水させ、パラフィンに包埋させた。パラフィン包埋された脳をミクロトーム上で5mmの厚さ層に切断し、キシレンで10分間脱パラピン化した後、累進アルコールで再水和した。切片に10mM クエン酸を1時間処理した後、PBS及び0.5% トリトンX−100を含有する5% BSA溶液を添加した。以後、脳切片をED−1(Abcam)(1:100)、ダブルコルチン(DCX;Abcam、1:100)、神経膠線維硝酸性タンパク質(GFAP;Millipore、1:100)及びα−平滑筋アクチン(aSMA;Abcam、1:100)に対する1次抗体と共に15〜17時間4℃で培養した。切片を1次抗体と共に一晩中培養した後に、PBSで洗浄し、切片を蛍光標識された2次抗体(Alexa−Fluor(登録商標)488または594,1500,Molecular Probes,Eugene,OR,USA)と1時間培養した。蛍光顕微鏡(Olympus IX71)を用いて切片の蛍光イメージを得た。
脳組織を24時間4% ホルムアルデヒドで固定し、PBSで洗浄した。パラフィン断面の製作のために、累進エタノールで組織を脱水させ、パラフィンに包埋させた。パラフィン包埋された脳をミクロトーム上で5mmの厚さ層に切断し、キシレンで10分間脱パラピン化した後、累進アルコールで再水和した。切片に10mM クエン酸を1時間処理した後、PBS及び0.5% トリトンX−100を含有する5% BSA溶液を添加した。以後、脳切片をED−1(Abcam)(1:100)、ダブルコルチン(DCX;Abcam、1:100)、神経膠線維硝酸性タンパク質(GFAP;Millipore、1:100)及びα−平滑筋アクチン(aSMA;Abcam、1:100)に対する1次抗体と共に15〜17時間4℃で培養した。切片を1次抗体と共に一晩中培養した後に、PBSで洗浄し、切片を蛍光標識された2次抗体(Alexa−Fluor(登録商標)488または594,1500,Molecular Probes,Eugene,OR,USA)と1時間培養した。蛍光顕微鏡(Olympus IX71)を用いて切片の蛍光イメージを得た。
分泌タンパク質の分析(Secretomics)
hESC由来の神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質とヒトiPSC由来の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、それぞれ4〜12%の勾配ノベックスビス−トリスゲル(Invitrogen)でSDS−PAGEして分離した後、ゲルコードブルー染色試薬(Pierce)でタンパク質バンドが見えるようにゲルを染色した。該染色されたゲルは、同じサイズの10バンドで切って、リン−ゲルトリプシン分解を公知の方法で行った。
hESC由来の神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質とヒトiPSC由来の神経前駆細胞の分泌タンパク質は、それぞれ4〜12%の勾配ノベックスビス−トリスゲル(Invitrogen)でSDS−PAGEして分離した後、ゲルコードブルー染色試薬(Pierce)でタンパク質バンドが見えるようにゲルを染色した。該染色されたゲルは、同じサイズの10バンドで切って、リン−ゲルトリプシン分解を公知の方法で行った。
リン−ゲル分解によって製造されたペプチドをNano Ultra Performance液体クロマトグラフィー(Eksigent Technologies)と結合したLinearTrap Quadrupole(LTQ)質量分光計(Thermo Finnigan)とを使用して分析した。具体的に、トリプシン処理したペプチドをC18レギュラー5マイクロンサイズレジンがパッキングされた分析カラム(75μmx11cm)に適用した。97% 溶液A(蒸留水に0.1% ギ酸)から60% 溶液B(アセトニトリルに0.1% ギ酸)に流速0.3μl/時間の条件で分線型45分勾配を実施した。分離されたペプチドイオンをナノElectrospray Ionization(ESI)ソースで電気噴霧した。MS/MSスペクトルは、全体MSスキャンを断片で選別して最も多い5種のスペクトルを結果−依存スキャンで求めた。動的排除に対する繰り返し係数を1に、繰り返し期間を30秒に、動的排除期間を180秒に、排除質量幅を1.5Daに、動作排除リストを50に設定した。
ペプチド及びタンパク質の確認は、ipi.HUMAN v3.76データベース(89 378エントリー)でターボ−SEQUESTアルゴリズム(Thermo Finnigan)を使用して検索した。データベース検索後、スカーフフォルド2(Proteome Software)を用いて確認されたペプチド及びタンパク質を確認した。SEQUEST検索で得たペプチドのうち、0.95以上のペプチドプロフェット(PeptideProphet)蓋然性を有する1セットのペプチドを選別した。また、0.99以上のプロテインプロフェット(ProteinProphet)蓋然性及び2本以上の固有ペプチドを有するタンパク質リストを求めた。
脊髄損傷(Spinal cord injury:SCI)モデル製作、分泌体注入及び行動回復検査(BBB score test)
実験動物(雄Sprague−Dawley rat、体重250〜300g)を麻酔した後、脊椎骨の除去を実施した(laminectomy)。NYU Impactorを用いて10gのrodを用いて露出された脊髄上に落として脊髄損傷を誘発した(SCIモデル製作)。以後、傷をよく消毒した後、皮膚を縫合した。脊髄損傷を受けた後、その傷部分に、本発明の全分化能幹細胞(ESC)由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を注入(injection)した。次いで、約3日間隔で2回さらに静脈に投与した。分泌タンパク質を注入した後、BBB testを1週間ごとに施行した。BBB testを8週以上実施して、対照群と比較した。
実験動物(雄Sprague−Dawley rat、体重250〜300g)を麻酔した後、脊椎骨の除去を実施した(laminectomy)。NYU Impactorを用いて10gのrodを用いて露出された脊髄上に落として脊髄損傷を誘発した(SCIモデル製作)。以後、傷をよく消毒した後、皮膚を縫合した。脊髄損傷を受けた後、その傷部分に、本発明の全分化能幹細胞(ESC)由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を注入(injection)した。次いで、約3日間隔で2回さらに静脈に投与した。分泌タンパク質を注入した後、BBB testを1週間ごとに施行した。BBB testを8週以上実施して、対照群と比較した。
統計分析
グループ間の統計学的有意度は、Tukey’s correctionが適用されたone−wat analysis of variance(ANOVA)を用いて求め、p value<0.05を統計学的に有意なものと判定した。
グループ間の統計学的有意度は、Tukey’s correctionが適用されたone−wat analysis of variance(ANOVA)を用いて求め、p value<0.05を統計学的に有意なものと判定した。
実験結果1:ヒト胚芽幹細胞(ESC)−由来神経前駆細胞の分泌タンパク質
脳卒中モデルでヒトESC−由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質による疾患の改善を見るために、次の3個の群で2週間実験を行った。脳卒中誘発24時間後、行動実験で疾患の誘導が確認された白ラットを3個群に任意に割り当てた後、右側外頚動脈に分泌タンパク質(0.2mg/kg、体積50μl)、培地またはPBSを同量(50μl)で注射した。各物質を注入した後、3、7、10及び14日に動物の状態と体重とを確認し、行動分析を実施した。
脳卒中モデルでヒトESC−由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質による疾患の改善を見るために、次の3個の群で2週間実験を行った。脳卒中誘発24時間後、行動実験で疾患の誘導が確認された白ラットを3個群に任意に割り当てた後、右側外頚動脈に分泌タンパク質(0.2mg/kg、体積50μl)、培地またはPBSを同量(50μl)で注射した。各物質を注入した後、3、7、10及び14日に動物の状態と体重とを確認し、行動分析を実施した。
虚血病変部位の分析結果
白ラットで永久MCAOを通じる脳卒中の誘導は、幅広い脳病変の損傷を誘導した。脳卒中誘発14日経過後、脳を摘出した後、TTC(2,3,5−triphenyltetrazolium chloride)染色で脳の損傷有無と損傷部位とを確認した。TTC染色は、細胞内の正常ミトコンドリア酸化酵素システム(mitochondrial oxidative enzyme system)と反応して染色されるが、脳虚血損傷を受けてミトコンドリアが損傷されれば、酸化システムが撹乱されて染色にならず、白色を表わすので、脳の損傷部位を区別することができる。
白ラットで永久MCAOを通じる脳卒中の誘導は、幅広い脳病変の損傷を誘導した。脳卒中誘発14日経過後、脳を摘出した後、TTC(2,3,5−triphenyltetrazolium chloride)染色で脳の損傷有無と損傷部位とを確認した。TTC染色は、細胞内の正常ミトコンドリア酸化酵素システム(mitochondrial oxidative enzyme system)と反応して染色されるが、脳虚血損傷を受けてミトコンドリアが損傷されれば、酸化システムが撹乱されて染色にならず、白色を表わすので、脳の損傷部位を区別することができる。
図1に示されたように、中脳動脈結紮によって誘発された損傷は、主に右側脳の皮質部位と線条体部位とに発生した(図1)。また、神経前駆細胞の分泌タンパク質の注入が虚血性病変部位(infarct size)を減少させた。PBS対照群は、右脳の60%近く損傷され、培地対照群は、46%程度が損傷されたが、分泌タンパク質処理群は、損傷部位が29%程度で対照群に比べて損傷部位が著しく減少した。
体重分析の結果
脳卒中誘発が白ラットの運動能力を減少させて、直ちに体重の減少が7日まで進行し、多様な治療剤は、運動能力の回復を通じて体重の増加を誘導する。分泌タンパク質の注入も、細胞移植と類似に体重増加を誘導した(図2)。神経損傷の回復で最も目立つ現象は、体重の回復である。分泌タンパク質処理群は、PBS対照群に比べて有意な改善を示した。
脳卒中誘発が白ラットの運動能力を減少させて、直ちに体重の減少が7日まで進行し、多様な治療剤は、運動能力の回復を通じて体重の増加を誘導する。分泌タンパク質の注入も、細胞移植と類似に体重増加を誘導した(図2)。神経損傷の回復で最も目立つ現象は、体重の回復である。分泌タンパク質処理群は、PBS対照群に比べて有意な改善を示した。
行動分析の結果
分泌タンパク質処理群は、ビーム均衡検査で2つの対照群に比べて、統計的に有意な行動改善効果を示し、この効果は、治療3日目から表われるなど即刻な効果が表われた(図3a)。
分泌タンパク質処理群は、ビーム均衡検査で2つの対照群に比べて、統計的に有意な行動改善効果を示し、この効果は、治療3日目から表われるなど即刻な効果が表われた(図3a)。
また、捕捉可能牽引検査(prehensile traction)でも、治療(注入)7日目に2つの対照群に比べて、統計的に有意な効果を示した(図3b)。
さらに、分泌タンパク質の注入は、網での失足(foot fault)頻度を減少させる効果を示した(図3c)。単位時間当たり行動の活発さを測定するラインクロスも、改善される趨勢を示した(図3d)。
総合的な行動神経改善効果(mNSS)の分析結果
mNSS(Modified Neurological Severity Score test)は、神経学的機能を測定するための構成表である。運動(筋肉状態)とmensory(時刻、触覚及び自己収容(proprioceptive))の項目で評価した。正常は、0点であり、点数が高いほど機能異常の程度が激しいと判断する。図4に示されたように、mNSSの分析で分泌タンパク質処理群は、治療序盤からPBS対照群と培地対照群よりも遥かに高い治療効果(行動改善)を示した(図4)。
mNSS(Modified Neurological Severity Score test)は、神経学的機能を測定するための構成表である。運動(筋肉状態)とmensory(時刻、触覚及び自己収容(proprioceptive))の項目で評価した。正常は、0点であり、点数が高いほど機能異常の程度が激しいと判断する。図4に示されたように、mNSSの分析で分泌タンパク質処理群は、治療序盤からPBS対照群と培地対照群よりも遥かに高い治療効果(行動改善)を示した(図4)。
mNSS検査でPBS対照群は、脳虚血を誘発させた1日後、平均5.4点で、14日後、平均5.5点で、脳卒中による神経行動学的障害が保持されることが見られた。培地対照群の場合には、一時的な行動改善効果が治療3日に見えたが、追加的な改善効果は発揮することができなかった。一方、分泌タンパク質処理群の場合には、治療3日(mNSS 4.5点)から10日(mNSS 3点)まで持続的な行動改善効果を示した。
分泌タンパク質の分析結果
iPSCs由来の神経前駆細胞(NPC)から得た分泌タンパク質は、次のタンパク質を含んでいた:アグリン、アネキシンA5、BSG、ビグリカン、カルポニン−3、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−1、コラーゲンα−2、クリン−3、デストリン、ジストログリカン、エフリン−B2、エクスポーチン−2、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−1、Frizzled−relatedタンパク質、ガレクチン−3結合タンパク質、グラニュリン、成長/分化因子11、ハプトグロビン、ヘモペキシン、High mobility group protein B2、ホルネリン、インポーチン−9、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2、ループスLaタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン2、プレイオトロフィン、プロフィリン−1、タンパク質DJ−1、ラジキシン、Secreted frizzled−related protein−2、セプチン−11、タリン−1、テスチカン、チモポイエチン、トランスゲリン−3、ビメンチン。
iPSCs由来の神経前駆細胞(NPC)から得た分泌タンパク質は、次のタンパク質を含んでいた:アグリン、アネキシンA5、BSG、ビグリカン、カルポニン−3、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−1、コラーゲンα−2、クリン−3、デストリン、ジストログリカン、エフリン−B2、エクスポーチン−2、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−1、Frizzled−relatedタンパク質、ガレクチン−3結合タンパク質、グラニュリン、成長/分化因子11、ハプトグロビン、ヘモペキシン、High mobility group protein B2、ホルネリン、インポーチン−9、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2、ループスLaタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン2、プレイオトロフィン、プロフィリン−1、タンパク質DJ−1、ラジキシン、Secreted frizzled−related protein−2、セプチン−11、タリン−1、テスチカン、チモポイエチン、トランスゲリン−3、ビメンチン。
ヒト胚芽幹細胞の神経前駆細胞(NPC)から得た分泌タンパク質は、次のタンパク質を含んでいた:アグリン、アネキシンA2、アトラクチン、ビグリカン、セルロプラスミン、コフィリン−1、コラーゲンα−1、コロニン−1X、ダームシジン、DERP12、エフリン−B3、エクソストシン−2、エズリン、ガレクチン−3結合タンパク質、グラニュリン、成長/分化因子11、ハプトグロビン、ヘモペキシン、High mobility group protein B2、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2、ループスLaタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質8、ニドゲン−1、パラチモシン、プロフィリン−2、タンパク質DJ−1、Secreted frizzled−related protein−2、セクレトグラニン、タリン−1、チモシンβ4、TGFBI、トランスゲリン、ビメンチン。
脊髄損傷の治療効果
脊髄損傷(SCI)モデルを作り、その損傷部分に直接全分化能幹細胞(ESC)由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質約30μlを5箇所分けて注入した。次いで、約3日間隔で2回さらに静脈に分泌タンパク質を約200μg(200μl)ずつ注入した。毎週行動回復に対して脊髄損傷行動回復テスト方法(BBB test)によって評価した。BBB試験法は、脊髄損傷研究者に通常よく知られた試験法である。BBB testを8週以上実施して、無処理対照群(コントロール)と比較した時、分泌タンパク質注入群で優れた行動回復結果を示した(図12)。
脊髄損傷(SCI)モデルを作り、その損傷部分に直接全分化能幹細胞(ESC)由来神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質約30μlを5箇所分けて注入した。次いで、約3日間隔で2回さらに静脈に分泌タンパク質を約200μg(200μl)ずつ注入した。毎週行動回復に対して脊髄損傷行動回復テスト方法(BBB test)によって評価した。BBB試験法は、脊髄損傷研究者に通常よく知られた試験法である。BBB testを8週以上実施して、無処理対照群(コントロール)と比較した時、分泌タンパク質注入群で優れた行動回復結果を示した(図12)。
実験結果2:ヒト誘導万能幹細胞(iPSC)−由来神経前駆細胞の分泌タンパク質+多回投与
脳卒中モデルで神経前駆細胞(NPC)分泌タンパク質の単回及び多回投与による疾患の改善を見るために、次の4個の群で2週間実験を行った。実験スケジュールは、図5のようである。
脳卒中モデルで神経前駆細胞(NPC)分泌タンパク質の単回及び多回投与による疾患の改善を見るために、次の4個の群で2週間実験を行った。実験スケジュールは、図5のようである。
図6aないし図6iは、全分化能誘導万能幹細胞由来−神経前駆細胞分泌タンパク質の単回投与vs.4回投与の実験結果を示す。ほとんどの条件で分泌タンパク質(セクレトーム−M)4回処理群が、他の群に比べて、格段の行動改善効果を発揮することが分かる。すなわち、単回投与群に比べて、多回投与群が行動改善に非常に有意な治療効果を発揮するということを確認した。
体重分析の結果
分泌タンパク質単回及び多回処理群は、PBS対照群に比べて、治療3日目に有意な改善を示した(図6i)。しかし、経時的に、群間の体重差は、統計的有意性を喪失した。
分泌タンパク質単回及び多回処理群は、PBS対照群に比べて、治療3日目に有意な改善を示した(図6i)。しかし、経時的に、群間の体重差は、統計的有意性を喪失した。
行動分析の結果
上体姿勢検査で分泌タンパク質多回処理群は、他の群に比べて、統計的に有意な脳損傷部位側である左側上体非対称運動の改善効果を誘導した(図6b)。一方、非損傷側である右側上体非対称運動は、群間の統計的有意性が分泌タンパク質多回投与群の10日を除いては観察されていない(図6c)。
上体姿勢検査で分泌タンパク質多回処理群は、他の群に比べて、統計的に有意な脳損傷部位側である左側上体非対称運動の改善効果を誘導した(図6b)。一方、非損傷側である右側上体非対称運動は、群間の統計的有意性が分泌タンパク質多回投与群の10日を除いては観察されていない(図6c)。
分泌タンパク質の繰り返し投与は、網での失足頻度を減少させる傾向性を示したが、14日を除いては対照群と統計的有意性が見られなかった(図6d)。単位時間当たり行動の活発さを測定するラインクロスも、分泌タンパク質の単回及び多回投与で改善される趨勢を示した(図6e)。
Rearingスコアも、分泌タンパク質の単回及び繰り返し投与が、他の実験群に比べて、改善を誘導する傾向性を確認し(図6f)、ビーム均衡検査で2つの対照群に比べて、分泌タンパク質の多回投与が、統計的に有意な行動改善効果を示し、この効果は、治療3日目から表われるなど即時的な効果が表われた(図6g)。また、捕捉可能牽引検査でも、治療(注入)7日目に2つの対照群に比べて、統計的に有意な効果を示した(図6h)。
総合的な行動神経改善効果(mNSS)の分析結果
図6aに示されたように、mNSSの分析で分泌タンパク質多回処理群は、治療序盤からPBS対照群と培地対照群よりも遥かに高い治療効果(行動改善)を示した。分泌タンパク質単回処理群も、対照群に比べて、実験期間の間に有意な治療効果を発揮し、培地対照群に比べて、優越した行動改善効果を示した。
図6aに示されたように、mNSSの分析で分泌タンパク質多回処理群は、治療序盤からPBS対照群と培地対照群よりも遥かに高い治療効果(行動改善)を示した。分泌タンパク質単回処理群も、対照群に比べて、実験期間の間に有意な治療効果を発揮し、培地対照群に比べて、優越した行動改善効果を示した。
虚血病変部位の分析結果
図7は、ラットpMCAoモデルで神経前駆細胞(NPC)由来分泌タンパク質の投与14日経過時に、梗塞サイズに及ぼす効果を示す。PBS(コントロール)、培地対照群(ブランク)、NPC−由来分泌タンパク質単回(セクレトーム−S)またはNPC−由来分泌タンパク質の繰り返し投与(セクレトーム−M)したラットで治療14日経過後の代表的イメージを示す。ラットpMCAoモデルで神経前駆細胞由来分泌タンパク質の投与14日経過時に、脳梗塞サイズに及ぼす効果を示す。単回及び多回投与時に、PBS群と比較していずれも*P<0.01である。特に、分泌タンパク質の多回投与時に、培地対照群(ブランク)に比べて、P<0.05の有意な改善効果を確認した。
図7は、ラットpMCAoモデルで神経前駆細胞(NPC)由来分泌タンパク質の投与14日経過時に、梗塞サイズに及ぼす効果を示す。PBS(コントロール)、培地対照群(ブランク)、NPC−由来分泌タンパク質単回(セクレトーム−S)またはNPC−由来分泌タンパク質の繰り返し投与(セクレトーム−M)したラットで治療14日経過後の代表的イメージを示す。ラットpMCAoモデルで神経前駆細胞由来分泌タンパク質の投与14日経過時に、脳梗塞サイズに及ぼす効果を示す。単回及び多回投与時に、PBS群と比較していずれも*P<0.01である。特に、分泌タンパク質の多回投与時に、培地対照群(ブランク)に比べて、P<0.05の有意な改善効果を確認した。
抗炎症効果−ED−1陽性細胞の減少
図8aないし図8bは、NPC−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のED−1陽性細胞の頻度が減少し、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意にED−1陽性細胞の減少を誘発するということを示す。スケールバー:200μm。ED−1陽性細胞の数を少なくとも5個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。コントロールと分泌タンパク質−繰り返し投与グループ間の比較時に、*P<0.001である。
図8aないし図8bは、NPC−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のED−1陽性細胞の頻度が減少し、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意にED−1陽性細胞の減少を誘発するということを示す。スケールバー:200μm。ED−1陽性細胞の数を少なくとも5個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。コントロールと分泌タンパク質−繰り返し投与グループ間の比較時に、*P<0.001である。
抗炎症効果−GFAP陽性細胞の減少
図9aないし図9bは、NPC−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のGFAP陽性細胞の頻度を減少させ、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意にGFAP陽性細胞の減少を誘発するということを示す。特に、GFAPの発現は、培地対照群(ブランク)に比べて、分泌タンパク質繰り返し治療群でも有意な減少を誘導した。スケールバー:200μm。GFAP陽性細胞の数を少なくとも5個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。各グループ間の多重比較時に、*P<0.05及び***P<0.001である。
図9aないし図9bは、NPC−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のGFAP陽性細胞の頻度を減少させ、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意にGFAP陽性細胞の減少を誘発するということを示す。特に、GFAPの発現は、培地対照群(ブランク)に比べて、分泌タンパク質繰り返し治療群でも有意な減少を誘導した。スケールバー:200μm。GFAP陽性細胞の数を少なくとも5個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。各グループ間の多重比較時に、*P<0.05及び***P<0.001である。
内在性幹細胞の可動効果
図10は、分泌タンパク質の投与によるラット脳組織での内在性神経幹細胞の可動を示す。分泌タンパク質投与14日経過後、試験した。DCX(赤色)陽性細胞がラット虚血脳で観察された。スケールバー:500μm。
図10は、分泌タンパク質の投与によるラット脳組織での内在性神経幹細胞の可動を示す。分泌タンパク質投与14日経過後、試験した。DCX(赤色)陽性細胞がラット虚血脳で観察された。スケールバー:500μm。
新生血管の増加効果
図11は、NPC−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のα−SMA陽性血管の頻度が増加し、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意に血管の数を増加させるということを示す。α−SMA陽性血管の数を少なくとも5個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。コントロールと分泌タンパク質−繰り返し投与(セクレトーム−M)グループ間の比較時に、*P<0.005である。
図11は、NPC−由来分泌タンパク質の治療で同側線条体のα−SMA陽性血管の頻度が増加し、分泌タンパク質の繰り返し投与が有意に血管の数を増加させるということを示す。α−SMA陽性血管の数を少なくとも5個の別個の顕微鏡領域で測定した。測定値は、±標準誤差で表示した。コントロールと分泌タンパク質−繰り返し投与(セクレトーム−M)グループ間の比較時に、*P<0.005である。
以上、本発明の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい具現例であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物とによって定義される。
Claims (16)
- 神経前駆細胞(NPC)の分泌タンパク質を有効成分として含む虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物。
- 前記神経前駆細胞は、全分化能(万能)幹細胞から分化されたことを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記神経前駆細胞は、全分化能(万能)幹細胞から分化された神経ロゼット段階前後の神経前駆細胞であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記全分化能(万能)幹細胞は、胚芽幹細胞、iPSCs(induced pluripotent stem cells)、胚芽生殖細胞、または胚芽腫瘍細胞であることを特徴とする請求項2または3に記載の組成物。
- 前記神経前駆細胞は、PSA−NCAM−陽性神経前駆細胞であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記神経前駆細胞は、PSA−NCAM−陰性神経前駆細胞であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記分泌タンパク質は、神経前駆細胞を細胞培養培地で培養して得た細胞培養液に含有された形態であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記細胞培養液は、神経前駆細胞をITS(インスリン/トランスフェリン/セレン)とbFGFとが含有された無血清細胞培養培地で培養した後、細胞を除去して収得したことを特徴とする請求項7に記載の組成物。
- 前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物:
アグリン、アネキシンA5、BSG、ピグリカン、カルポニン−3、コアクトシン−類似タンパク質、コフィリン−1、コラーゲンα−2、クリン−3、デストリン、ジストログリカン、エフリン−B2、エクスポーチン−2、エズリン、フィブロネクチン、ファイブリン−1、Frizzled−relatedタンパク質、ガレクチン−3結合タンパク質、グラニュリン、成長/分化因子11、ハプトグロビン、ヘモペキシン、High mobility group protein B2、ホルネリン、インポーチン−9、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2、ループスLaタンパク質、大食細胞移動抑制因子、ミッドカイン、モエシン、ニューロピリン2、プレイオトロフィン、プロフィリン−1、タンパク質DJ−1、ラジキシン、Secreted frizzled−related protein−2、セプチン−11、タリン−1、テスチカン、チモポイエチン、トランスゲリン−3、及びビメンチン。 - 前記分泌タンパク質は、下記のタンパク質を含むことを特徴とする請求項1に記載の組成物:
アグリン、アネキシンA2、アトラクチン、ピグリカン、セルロプラスミン、コフィリン−1、コラーゲンα−1、コロニン−1X、ダームシジン、DERP12、エフリン−B3、エクソストシン−2、エズリン、ガレクチン−3結合タンパク質、グラニュリン、成長/分化因子11、ハプトグロビン、ヘモペキシン、High mobility group protein B2、ホルネリン、インスリン−類似成長因子結合タンパク質2、ループスLaタンパク質、ミッドカイン、モエシン、マルチプル上皮成長因子−類似ドメインタンパク質8、ニドゲン−1、パラチモシン、プロフィリン−2、タンパク質DJ−1、Secreted frizzled−related protein−2、セクレトグラニン、タリン−1、チモシンβ4、TGFBI、トランスゲリン、及びビメンチン。 - 前記虚血性疾患は、虚血性脳血管疾患、虚血性心臓疾患、心筋梗塞、狭心症、下肢動脈虚血性疾患、及び四肢末端部虚血性疾患で構成された群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記虚血性脳血管疾患は、虚血性脳卒中であることを特徴とする請求項11に記載の組成物。
- 前記神経炎症疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ルーゲーリック病、クロイツフェルトヤコブ病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、びまん性レビー小体病、白質脳炎、側頭葉てんかん、及び脊髄損傷で構成された群から選択されることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物は、1回投与用であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- 前記虚血性疾患または神経炎症疾患の治療用組成物は、多回投与用であることを特徴とする請求項1に記載の組成物。
- (a)神経前駆細胞(NPC)由来分泌タンパク質の治療学的有効量;及び(b)薬剤学的に許容される担体を含む組成物;を対象に投与する段階を含む虚血性疾患または神経炎症疾患の予防または治療方法。
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