KR20170001943A

KR20170001943A - 신경전구세포의 분비단백체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20170001943A
Application number: KR1020160080310A
Authority: KR
Inventors: 김동욱; 김한수
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2016-06-27
Publication date: 2017-01-05
Also published as: WO2016209057A2; EP3315133A2; AU2016283612A1; US20180228845A1; WO2016209057A3; CA2990807C; CN107921068A; KR101830945B1; EP3315133B1; CA2990807A1; ES2815537T3; JP2018518503A; US10688135B2; AU2016283612B2; EP3315133A4

Abstract

본 발명은 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 신경전구세포의 분비단백체는 항염증, 신생혈관재생, 내재적줄기세포 가동 및 증식 등 역할로, 허혈성 손상 부위를 감소시킬 뿐만 아니라, 신경기능을 회복시키는바 허혈성 질환과 염증으로 인한 신경 손상 질환과 같은 퇴행성 신경계 질환의 치료제로서 이용될 수 있다. 특히 본 발명의 신경전구세포의 분비단백체는 다회 투여하는 경우 행동개선 효과가 매우 뛰어나다.

Description

신경전구세포의 분비단백체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물{A Composition for Treating Ischemic Diseases or Neuroinflammatory Diseases Comprising Secretome of Neural Precursor Cells as Active Ingredient}

본 발명은 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포는 그 다분화능으로 인하여, 다양한 질환의 유망한 치료 후보물질로 여겨진다. 예를 들어, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs)는 쉽게 수득 및 분리가 가능하며 혈관신생을 촉진하고 염증을 억제하는 많은 영양인자를 분비한다(비특허문헌 1). MSC의 이러한 특성은 인간 질병의 치료에 적용하기 위한 연구에서 고려되어 왔다. 최근의 연구에 의하면 MSC는 많은 동물모델 및 인간 임상치료(비특허문헌 2, 3)에서 조직 회복에 기여하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 보고들이 인 비트로에서 MSC가 뉴런(비특허문헌 4) 및 성상세포(astrocyte)(비특허문헌 3)를 포함하는 신경계열로의 분화능력을 언급하고 있으나, 이들 분화된 세포들이 인 비보에서 어떠한 기능을 하는지에 대한 명확한 증거는 없다. MSC의 유익한 효과는 세포 대체 보다는 측분비(paracrine) 기작에 의해 유도되는 것으로 보이며, 이에 MSC의 이식(transplantation)은 장기간 지속되는 개선이 아닌, 일시적이고 한정된 효과를 가질 것으로 보인다(비특허문헌 5).

이에 반하여, 배아줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)는 3개의 배아 생식엽(embryonic germ layer)에서 유래하는 모든 특정 세포 형태로 분화할 수 있고, 강력한 자가재생 능력을 가지는 것으로 알려졌다. 주목할 만한 것은, ESC에서 유래한 신경전구세포(neural precursor cells, NPCs)는 우선적으로 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 포함하는 신경계열의 특정 형태의 세포로 분화하기 때문에 뇌조직 회복을 위한 세포원(cell source)으로 여겨진다는 것이다. 이들 세포는 또한 내생 신경전구세포의 생존 및 증식을 촉진하는 몇몇 인자를 분비한다(비특허문헌 6). 그러나, ESC에서 분화된 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 또는 신경전구세포의 배양액이 어떻게 질환모델에서 이식 후 기능의 개선에 기여하는지는 여전히 알려져 있지 않다.

역분화줄기세포란 전분화능 (pluripotency)을 보유하지 않는 체세포들에게 유전자 도입/전사인자 도입, 화합물 (chemical) 처리, 성장인자 처리 등의 디양한 방식을 통해 인위적인 역분화 과정을 통해 전분화능을 가지도록 유도된 세포들을 일컫는 말로서 유도만능줄기세포 (iPSC: induced Pluripotent Stem Cell) 라고도 한다 (비특허문헌 7). 이들 세포들은 배아줄기세포와 비교해 볼 때, 세포의 형태, 배양 방식, 증식속도, 유전자 발현과 염색체 변이 양상, 전분화능, 면역결핍마우스에서의 테라토마 형성 능력 등에서 매우 높은 유사성을 보이고 있다. 이 유도만능줄기세포의 분화능력은 배아줄기세포와 유사한데 이들에게서 분화된 NPC 혹은 NPC의 배양액이 어떻게 질환 모델에서 이식후 기능의 개선에 기여하는지 잘 알려져 있지 않다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

1. Caplan, A. I., & Dennis, J. E. (2006). Mesenchymal stem cells as trophic mediators. Journal of Cellular Biochemistry, 98, 1076-1084. 2. Chen, J., Li, Y., Katakowski, M., et al. (2003). Intravenous bone marrow stromal cell therapy reduces apoptosis and promotes endogenous cell proliferation after stroke in female rat. Journal of Neuroscience Research, 73, 778-786. 3. Kopen, G. C., Prockop, D. J., & Phinney, D. G. (1999). Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proceedings of the National Academy of Sciences, 96, 10711-10716. 4. Bae, K. S., Park, J. B., Kim, H. S., Kim, D. S., Park, D. J., & Kang, S. J. (2011). Neuron-like differentiation of bone marrowderived mesenchymal stem cells. Yonsei Medical Journal,52,401-412. 5. Cho, S. R., Kim, Y. R., Kang, H. S., et al. (2009). Functional recovery after the transplantation of neurally differentiated mesenchymal stem cells derived from bone barrow in a rat model Functional recovery after the transplantation of spinal cord injury. Cell Transplantion, 18, 1359-1368. 6. Capone, C., Frigerio, S., Fumagalli, S., et al. (2007). Neurosphere- derived cells exert a neuroprotective action by changing the ischemic microenvironment. PLoSOne, 7, e373. 7. Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-872.

본 발명자들은 허혈성 질환과 신경염증 질환의 근본적인 치료방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포 이식과는 다른 접근방식으로서, 신경전구세포(neural precursor cell; NPC) 분비단백체(secretome)의 병변 부위로의 투여를 통하여 허혈성 손상부위를 감소시키고, 신경기능을 회복시킴으로써 허혈성 질환과 염증으로 인한 신경 손상 질환 및 퇴행성 신경계 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 신경전구세포(neural precursor cell; NPC)의 분비단백체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 허혈성 질환과 신경염증 질환의 근본적인 치료방법을 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 줄기세포 이식과는 다른 접근방식으로서, 신경전구세포 분비단백체의 병변 부위로의 투여를 통하여 허혈성 손상부위를 감소시키고, 신경기능을 회복시킴으로써 허혈성 질환과 염증으로 인한 신경 손상 질환과 같은 퇴행성 신경계 질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, “신경전구세포의 분비단백체(secretome)”는 신경전구세포의 배양 시 신경전구세포로부터 외부(배양배지)로 분비된 단백질들의 집합체를 의미한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 분비단백체의 제조에 이용되는 신경전구세포는 전분화능 (만능)줄기세포로부터 분화된 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어, “줄기세포”는 조직을 구성하는 각 세포로 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭하며, 특정 분화 자극(환경)에 의해 특정 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다. 줄기세포는 세포분열이 정지된 분화된 세포와는 달리 세포분열에 의해 자신과 동일한 세포를 생산(self-renewal)할 수 있고, 분화 자극이 가해지면 특정 세포로 분화되고 이러한 분화는 다른 환경 또는 다른 분화 자극에 의해 다양한 세포로도 분화될 수 있는, 분화의 유연성(plasticity)을 가지고 있는 것이 특징이다.

본 발명에서 이용되는 줄기세포는 인 비트로에서 무한정 증식되며, 3종류의 모든 배아층(외배엽, 중배엽과 내배엽)으로부터 유래되는 다양한 세포로 분화될 수 있는 전분화능 (만능)줄기세포(pluripotent stem cell)이다. 보다 구체적으로, 상기 전분화능 (만능)줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cell; ESCs), 유도만능줄기세포 (iPSC; induced pluripotent stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cell) 또는 배아종양세포(embryonic carcinoma cell)이다.

배아줄기세포는 배반포의 내부세포괴(ICM)로부터 유래되고, 배아생식세포는 5-10 주령의 생식융기(gonadal ridge)의 원시생식세포로부터 유래된다.

유도만능줄기세포(iPSC)는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)로부터 전능성을 부여하는 특정 유전자를 삽입하여 인공적으로 유래된 전분화능 줄기세포의 하나이다. 유도만능줄기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일하다고 여겨진다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 신경전구세포(neural precursor cell; NPC)는 전분화능 (만능)줄기세포(예컨대, 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포)를 신경계열 세포로 분화 유도하여 형성된 신경로제트(neural rosette) 단계 전후의 신경전구세포이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 신경전구세포는 PSA-NCAM(poly-sialylated neural cell adhesion molecule)-양성 신경전구세포신경전구세포 (Neural precursor cell; NPC)이다.

본 발명의 다른 일구현예에 따르면, 상기 신경전구세포는 PSA-NCAM(poly-sialylated neural cell adhesion molecule)-음성 신경전구세포신경전구세포 (Neural precursor cell; NPC)이다.

상기 PSA-NCAM-양성 혹은 음성 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)는 전분화능 줄기세포로부터 신경분화 자극을 통해 분화된 신경 로제트에서 항-PSA-NCAM-항체를 이용하여 분리될 수 있다. 상기 용어, “신경 로제트(neural rosette)”는 인간 배아줄기세포의 신경분화 과정의 초기단계의 신경줄기세포를 말하며, 신경 로제트는 원주형의 방사상 형태를 갖는다. 상기 신경 로제트는 Pax6 및 Sox1 같은 초기 신경외배엽(neuroectodermal) 마커를 발현하는 세포로 구성되며, 다양한 뉴런 세포 및 신경교세포로 분화할 수 있다.

상기 신경분화 자극은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 무혈청 배지(Tropepe V et al., Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron. 30:6578(2001)), FGFs(fibroblast growth factors), Wnt 및 RA(retinoic acid)와 같은 모르포겐(morphogens)의 처리(Ying QL et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21:183186(2003))에 의해 분화할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 항체로는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용할 수 있다. PSA-NCAM에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 PSA-NCAM 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, PSA-NCAM을 언급하면서 사용되는 용어 “항체”는 PSA-NCAM에 대한 특이 항체로서, PSA-NCAM 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다. 완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있으며, 항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편으로서 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv을 포함한다.

항체를 이용한 PSA-NCAM-양성 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 분리를 위하여, 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters: FACS), 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter: MACS) 및 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis) 방법을 이용할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 분비단백체는 신경전구세포를 동물세포 배양배지에서 배양하여 얻은 세포배양액에 함유된 형태이다. 즉, 본 발명의 조성물에는 신경전구세포의 분비단백체가 함유되어 있는 신경전구세포의 배양액이 포함될 수 있는 것이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 신경전구세포(neural precursor cell, NPC)의 세포배양액은 신경전구세포를 ITS(인슐린/트랜스페린/셀레늄) 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)가 함유된 무혈청 동물세포 배양배지에서 배양한 후 세포를 제거하여 수득할 수 있다. 상기 배양에는, 계대 배양한 신경전구세포, 예를 들어, N2, B-27 및/또는 Gem21이 첨가된 bFGF-함유 세포 배양배지에서 4계대 이상 반복 배양하여 얻은 신경전구세포가 이용될 수 있다.

상기 배양배지에서의 세포의 제거는 원심분리, 여과와 같은 통상의 세포 분리방법을 사용하여 실시할 수 있다.

상기 세포 배양배지로는 신경전구세포의 배양 시 이용되는 통상의 배지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 DMEM/F12를 사용할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)는 인간 유도만능줄기세포 (iPSC) 로부터 분화된 것이며, 이 신경전구세포의 분비단백체는 하기의 단백질들을 포함한다:

아그린(Agrin), 아넥신 A5(Annexin A5), BSG(Basigin), 비글리칸(Biglycan), 칼포닌-3(Calponin-3), 콕토신-유사 단백질(Coactosin-like protein), 코피린-1(Cofilin-1), 콜라겐 알파-2, 쿨린-3(Cullin-3), 데스트린(Destrin), 디스트로글리칸(Dystroglycan), 에프린-B2(Ephrin-B2), 엑스포틴-2(Exportin-2), 에즈린(Ezrin), 피브로넥틴, 피블린-1(Fibulin-1), Frizzled-related 단백질, 젤라틴-3 결합 단백질(Galectin-3 binding protein), 그래뉼린(Granulins), 성장/분화 인자 11(Growh/differentiation factor 11), 합토글로빈(Haptoglobin), 헤포펙신(Hemopexin), High mobility group protein B2, 호네린(Hornerin), 임포틴-9(Importin-9), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2), 루프스 La 단백질(Lupus La protein), 대식세포 이동 억제 인자(Macrophage migration inhibitory factor), 미드킨(Midkine), 모에신(Moesin), 뉴로필린 2(Neuropilin 2), 플레이오트로핀(Pleiotrophin), 프로필린-1(Profilin-1), 단백질 DJ-1(Protein DJ-1), 라딕신(Radixin), Secreted frizzled-related protein-2, 셉틴-11(Septin-11), 탈린-1(Talin-1), 테스티칸(Testican), 티모포이에틴(Thymopoietin), 트랜스젤린-3(Transgelin-3) 및 비멘틴(Vimentin).

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)는 인간 배아줄기세포(ESC)로부터 분화된 것이며, 이 신경전구세포의 분비단백체는 하기의 단백질들을 포함한다:

아그린(Agrin), 아넥신 A2(Annexin A2), 아트락틴(Attractin), 비글리칸(Biglycan), 세룰로플라스민(Ceruloplasmin), 코피린-1(Cofilin-1), 콜라겐 알파-1, 코로닌-1X(Coronin-1X), 더미시딘(Dermicidin), DERP12, 에프린-B3, 엑소토신-2(Exostosin-2), 에즈린(Ezrin), 젤라킨-3 결합 단백질, 그래뉼린(Granulins), 성장/분화 인자 11(Growh/differentiation factor 11), 합토글로빈(Haptoglobin), 헤모펙신(Hemopexin), High mobility group protein B2, 호네린(Hornerin), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2), 루프수 La 단백질, 미드킨(Midkine), 모에신(Moesin), 멀티플 상피 성장 인자-유사 도메인 단백질 8(Multiple epidermal growth factor-like domains protein 8), 니도겐-1(Nidogen-1), 파라티모신(Parathymosin), 프로필린-2(Profilin-2), 단백질 DJ-1(Protein DJ-1), Secreted frizzled-related protein-2, 시크리토그래닌(Secretogranin), 탈린-1(Talin-1), 티모신 베타-4(Thymosin beta-4), TGFBI(Transforming grwowth factor-beta-induced protein ig-h3), 트랜스젤린(Transgelin) 및 비멘틴(Vimentin).

본 명세서에서 사용된 용어, “치료”는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물은 허혈성 질환 또는 신경염증 질환의 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 허혈성 질환 또는 신경염증 질환의 치료용 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 항-허혈/항-염증 조성물과 함께 투여되어 이들 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어“치료”또는“치료제”는“치료 보조”또는“치료 보조제”의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “허혈성 질환”은 혈관 손상에 따른 혈액 누수(blood leakage), 색전(embolism) 또는 경색(infarction) 등에 의해 혈류량이 감소하여 혈액공급이 차단된 조직이 괴사에 이르는 질환을 말한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료 가능한 허혈성 질환은 허혈성 심장질환, 심근경색, 협심증, 하지동맥 허혈성 질환, 사지말단부 허혈성 질환 및 허혈성 뇌혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용된 용어, “허혈성 심장질환”은 심장에 혈액을 공급하는 관상동맥이 손상되거나, 협소 또는 폐색되어 심장근육으로의 혈류가 감소하여 초래되는 질환을 의미한다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 조성물로 치료 가능한 허혈성 심장질환은 협심증, 심근경색증 및 심부전증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 사용된 용어, “허혈성 뇌혈관 질환”은 뇌혈관이 손상되거나, 협소 또는 폐색되어 이로 인해 혈류를 공급받지 못한 뇌조직이 손상되는 질환을 의미한다. 보다 구체적으로는, 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌졸중이며, 상기 허혈성 뇌졸중은 뇌출혈 및 뇌경색을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어, “신경염증 질환”은 염증 반응에 의한 신경 조직의 손상으로 초래되는 질환을 의미하며, 보다 구체적으로는 염증 반응에 의한 신경 손상 질환 및 퇴행성 신경계 질환을 의미한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물로 치료 가능한 신경염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 미만성 루이소체병, 백색질뇌염, 측두엽간질 및 척수손상으로 구성된 군으로부터 선택된다. 본 발명에서 척수손상은 염증성 척수손상 및 외상성 척수손상을 모두 포함하는 의미로 사용된다.

본 발명의 일 예에 따르면, 인간 ESC-유래 및 iPSC-유래 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체를 뇌졸중 실험모델 (pMCAo 모델)에 투여한 경우, 단회 및 다회 투여 시 PBS 군과 비교해서 모두 유의하게 ED-1 양성세포 및 GFAP 양성세포의 감소를 유발하였다(도 8a-8b 및 도 9a-9b 참조). 즉, 분비단백체는 염증반응을 감소시키고 미세아교세포(microglial cell)를 불활성화(감소)시키며(도 8a-8b), 별아교세포(astrocyte)를 불활성화(감소)시켰다(도 9a-9b).

또한, 본 발명의 분비단백체는 DCX 유전자에 의해 발현되는 더블코르틴(doublecortin)의 발현을 증가시키고, 양성 신경전구세포를 증가시킨다(도 10 참조). 더블코르틴은 뉴런 이동 단백질(Neuronal migration protein)이다. 이러한 결과는 분비단백체의 투여로 인해 뇌조직에서 내재성 신경줄기세포(endogenous neural stem cell)가 가동되었음을 보여준다.

본 발명의 분비단백체는 α-SMA 양성 혈관의 빈도를 증가시키는데, 이는 신생혈관이 증가되었음을 의미한다(도 11 참조).

이와 같은 항염증, 내재적 줄기세포의 가동 및 신생혈관증가 효과는 본 발명의 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 유래 분비단백체가 신경보호작용(neuroprotective effect) 기능이 있음을 시사한다. 즉, 본 발명의 신경전구세포 유래 분비단백체는 위와 같은 효과를 나타냄으로써 신경염증 질환에 대한 치료를 가능하게 한다.

한편, 본 발명의 전분화능 줄기세포 유래 신경전구세포의 분비단백체는 척수손상에 대한 치료효과를 가진다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 척수손상 모델을 이용한 BBB test에서는 전분화능 줄기세포(ESC) 유래 신경전구세포의 분비단백체 주입군(injection)에서 우수한 행동 회복이 나타났다(도 12 참조). 유도만능줄기세포(iPSC)는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예컨대, 배아줄기세포)와 동일하다고 여겨지므로 역시 위와 같은 척수손상에 대한 치료효과를 가진다.

본 명세서에서 사용된 용어, “투여”또는“투여하다”는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다. 따라서, 용어“투여하다”는 본 발명의 유효성분인 신경전구세포(neural precursor cell, NPC)의 분비단백체를 병변 부위에 주입하는 것을 포함하므로, 용어“투여하다”는“주입하다”와 같은 의미로 사용된다.

조성물의“치료적 유효량”은 조성물을 투여하고자 하는 대상체에게 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 추출물의 함량을 의미하며, 이에 “예방적 유효량”을 포함하는 의미이다. 본 명세서에서 사용된 용어, “대상체”는 제한 없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일, 식염수, PBS(phosphate buffered saline) 또는 배지 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 구체적으로는 비경구 투여, 보다 구체적으로는 근육 내(intramuscular) 투여, 뇌실(intracerebroventricular) 투여, 상처(손상)부위 투여, 척수 혹은 척수강(Intrathecal) 투여 또는 혈관 내(intravascular) 투여이다. 혈관 내 투여인 경우 동맥 또는 정맥 내에 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 일회 또는 다회로서 투여될 수 있다. 예컨대, 인간 또는 다른 동물에게 1회 또는 분할된 용량으로 다회투여될 수 있다. 단일 투여 조성물은 일정 범위의 양 또는 그 일부에 해당하는 함량을 함유하여 1일 용량을 채울 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 치료 조성물은, 치료를 필요로 하는 환자에게 매일 단일 또는 복수회 투여하는 방식으로 투여되거나, 일정 시간(hours, day, week 등)의 간격을 두고 단일 또는 복수회 투여하는 방식으로 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “일회투여용”은 일회투여 용량의 분비단백체를 포함하는 조성물 또는 일회투여 형태로 투여되는 조성물의 용도를 의미하며, “다회투여용”은 다회투여 용량의 분비단백체를 포함하는 조성물 또는 다회투여 형태로 투여되는 조성물의 용도를 의미한다.

본 발명의 일 예에 따르면, 본 발명의 신경전구세포(neural precursor cell, NPC) 유래 분비단백체를 뇌졸중 동물모델에 일회 투여하는 경우 허혈 병변 부위가 감소하고, 행동 개선효과를 나타내었다(도 1 내지 도 4 참조).

한편, 본 발명의 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 유래 분비단백체를 뇌졸중 동물모델에 다회 투여하는 경우에도 역시 허혈 병변 부위가 감소하고, 행동 개선효과를 나타내었다(도 6a 내지 6i 및 도 7 참조). 특히 단회 투여군에 비해 다회 투여군이 행동개선에 보다 높은 치료효과를 발휘하였고(도 6a 내지 6i), 항염증 효과도 더 높게 나타났으며(도 8a-8b 및 도 9a-9b 참조), 분비단백체의 반복 투여가 내재성 신경줄기세포 및 신생혈관의 수도 유의하게 증가시킴을 확인하였다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 신경전구세포의 분비단백체는 항염증, 신생혈관재생, 내재적줄기세포 가동 및 증식 등 역할로, 허혈성 손상 부위를 감소시킬 뿐만 아니라, 신경기능을 회복시키는바 허혈성 질환과 염증으로 인한 신경 손상 질환과 같은 퇴행성 신경계 질환의 치료제로서 이용될 수 있다.

(ⅲ) 또한 본 발명의 신경전구세포의 분비단백체는 다회 투여하는 경우 일회성 투여보다 행동개선 효과가 매우 뛰어나다.

도 1은 PBS 대조군, 배지 대조군 및 인간배아줄기세포 (ESC) 유래 신경전구세포(neural precursor cell; NPC;)의 분비단백체 처리군의 허혈성 병변 부위의 크기를 보여준다.
도 2는 PBS 대조군, 배지 대조군 및 분비단백체 처리군의 체중 변화를 보여준다.
도 3은 PBS 대조군, 배지 대조군 및 분비단백체 처리군의 행동 분석 결과를 보여준다. 도 3a는 빔 균형 검사 결과이고, 도 3b는 포착가능 견인 검사 결과이며, 도 3c는 풋 폴트 검사 결과이고, 도 3d는 단위시간 당 행동의 활발함을 보여주는 라인 크로스(line cross) 결과를 보여준다.
도 4는 PBS 대조군, 배지 대조군 및 분비단백체 처리군의 종합적인 행동신경 개선 효과(mNSS) 분석 결과를 보여준다.
도 1 내지 4에서 *P value < 0.05, **P value < 0.01.
도 5는 인간 유도만능줄기세포(iPSC) 유래-신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 유래 분비단백체의 다회투여 효과를 확인하기 위한 실험 스케쥴을 나타낸다. BrdU 는 신경전구세포 유래 분비단백체에 의한 뇌조직에 존재하는 내재성 신경줄기세포(enogenous neurla stem cell)의 가동 (mobilization)을 확인하기 위해 주입하였다.
도 6a 내지 6i는 전분화능 만능줄기세포 유래-신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 유래 분비단백체의 단회 투여 vs. 4회 투여의 실험결과를 나타낸다. 6a, mNSS (modified Neural Sibiarity Score); 6b, 상체 자세(torso twisting) 검사(왼쪽); 6c, 상체 자세(torso twisting) 검사(오른쪽); 6d, 풋 폴트 검사(foot-fault test); ; 6e, 라인 크로스(line cross) 검사; 6f, Rearing 검사; 6g, 빔 균형(beam balance) 검사; 6h, 포착가능 견인 검사(Prehensile Traction test); 6i, 대조군 및 분비단백체 처리군의 체중 변화를 보여준다. Rearing이란 실험동물이 뒷발로 서서 앞발을 들고 있는 자세를 말하는 것으로 정상적인 동물에서 호기심을 탐색할 때의 일반적인 행동이며, 단위시간당 횟수로 표시된다.
도 6a 내지 6i에서 흰색: 대조군, 검은색: 배지대조군, 황색: 분비단백체 1회 처리군(secretome-S), 적색: 분비단백체 4회 처리군(secretome-M), *P value < 0.05, **P value < 0.01, ***P<0.001.
도 7은 PBS 대조군, 배지 대조군, 분비단백체 단회처리군(Secretome-S) 및 분비단백체 다회처리군(Secretome-M)의 허혈성 병변 부위의 크기를 보여준다.
도 8a-8b는 신경전구세포(neural precursor cell; NPC)-유래 분비단백체의 반복 투여(Secretome-M)가 유의하게 ED-1 양성세포의 감소를 유발함을 보여준다. 스케일 바: 200 μm, *P<0.001.
도 9a-9b는 신경전구세포(neural precursor cell; NPC)-유래 분비단백체의 반복 투여(Secretome-M)가 유의하게 GFAP 양성세포의 감소를 유발함을 보여준다. 스케일 바: 200 μm, *P<0.05 및 ***P<0.001.
도 10은 신경전구세포(neural precursor cell; NPC)-유래 분비단백체의 반복 투여(Secretome-M)로 인한 랫트 뇌조직에서의 내재성 신경줄기세포 (endogenous neural stem cell)의 가동을 보여준다. 스케일바: 500 μm.
도 11은 신경전구세포(neural precursor cell; NPC)-유래 분비단백체의 반복 투여가 유의하게 α-SMA 양성 혈관의 수를 증가시킴을 보여준다. *P<0.005.
도 12는 척수손상 모델에서 BBB test를 8주 이상 실시하여 무처리 대조군과 비교하였을 때 분비단백체 주입군(injection)에서 우수한 행동 회복이 나타남을 보여준다(P<0.05).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

인간 ESC -유래 또는 인간 iPSC -유래 NPC 및 PSA- NCAM -양성 NPC 세포의 수득

인간 세포의 사용은 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board, IRB No. 4-2008-0643)의 승인을 받았다. 신경 유도를 위하여, bFGF가 없는 hESC 배지(Invitrogen) 상에서 hESC와 iPSC에서 유래된 각 배아체(embryoid bodies, EBs)를 5 μM DM(dorsomorphin)(Sigma, St. Louis, MO) 및 5-10 μM SB431542(Calbiochem, San Diego, CA)를 포함하는 현탄액에서 4일간 배양하고, 이후 20 ng/㎖ bFGF가 보충된 1X N2(Invitrogen)배지에서 마트리젤-코팅된 디쉬(BD Biosciences, Bedford, MA)에 5일간 흡착시켰다(Kim, D. S., Lee, D. R., Kim, H. S., et al. (2012). Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoSOne, 7, e39715). 흡착된 EB 콜로니의 중심에 나타난 신경 로제트를 글래스 파이펫을 이용하여 주변의 평평한 세포로부터 조심스럽게 분리하였다. 작은 로제트 덩어리를 마트리젤 코팅된 디쉬에 씨딩하고, 1X N2, 1X B27(Invitrogen)이 보충된 DMEM/F12에서 배양하였다(Kim, D. S., Lee, J. S., Leem, J. W., et al. (2010). Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews and Reports, 6, 270-281).

80-90% 컨플루언시의 확장된 신경 로제트로 된 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)를 얻은 후 10 μM Y27632(Sigma)에 1시간 동안 노출시켜 MACS 단계에 들어가긴 전 세포사가 일어나는 것을 방지하였다. Accutase(Invitrogen)를 이용하여 분리한 뒤에, 세포들(~1 X 10⁸ 세포)을 1% BSA가 포함된 PBS에서 블로킹하고, 마이크로비드(Miltenyi Biotec)가 접합된 항-PSA-NCAM 항체와 함께 4℃에서 15분간 배양하였다. 집중적으로 세척한 뒤, 세포 현탁액을 MASC(magnetic activated cell sorting)에 넣고 컬럼에 남아있는 양성-표지된 세포를 튜브로 용리시켰다. 분리된 PSA-NCAM-양성 신경전구세포 (Neural precursor cell; NPC)를 N2B27 배지 또는 20 ng/㎖ bFGF가 추가된 NBG 배지(1XN2, 0.5XB27 및 0.5XG21 보충)(GeminiBio-Products, WestSacramento, CA)에 4-5 X 10⁵ 세포/cm² 농도로 다시 플레이팅하였다. 배양 배지는 매일 교체하였으며, 세포는 2-3일마다 계대배양하였다.

인간 전분화능 배아줄기세포( ESC ) 유래- 신경전구세포(NPCs)에서 분비단백체 ( secretome )의 분리

상기에서 수득한 인간 전분화능 배아줄기세포(ESC) 유래 신경전구세포(PSA-NCAM-양성 신경전구세포)를 기본 배양액(DMEM/F-12)에 N2(100X-최종농도 1X), B-27(50X- 최종농도 0.5X) 및 Gem21(50X-최종농도 0.5X)의 혈청 제거 보충제를 넣고, bFGF(20 ng/㎖)를 첨가하여 마트리겔(Matrigel) 코팅된 60 mm 디쉬에 4계대 이상 반복 배양하여 증폭한 다음, 8-10개의 디쉬에 약 90%까지 세포가 차게 배양하였다. 배양액을 제거한 후 인산완충용액으로 3번 세척하고, 무혈청 기본 배양액(DMEM/F12)에 ITS(100X-최종농도 1X)와 bFGF(20 ng/㎖)만을 첨가하여 24시간 배양하였다. 대조군은, 세포가 없는 디쉬에 같은 양의 동일한 조성의 배양액(기본 배양액에 ITS와 bFGF를 같은 양으로 첨가)을 넣고, 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 회수한 것을 대조군으로 사용하였다. 배양액을 모두 모아 원심 분리하여(800 g에서 30분) 세포의 파편 등을 제거한 뒤 -70℃의 냉동고에 바로 얼린 후 필요 시 해동하여 사용하였다.

인간 전분화능 유도만능줄기세포 ( iPSC )-유래 신경전구세포(NPCs)에서 분비단백체 ( secretome )의 분리

P₀의 인간 전분화능 유도만능줄기세포(iPSC) 유래 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)를 DMEM/F-12의 기본 배양액에 N2, B-27, Gem21의 혈청제거 보충제를 넣고 bFGF 를 첨가하여, 마트리젤-코팅된 100 mm 디쉬에 P₄까지 계대하여 디쉬에 약 90% 이상 세포가 차게 배양하였다. 이후, 배양액을 제거하고 인산완충용액으로 1번 세척하여 아큐테이즈 효소로 세포를 디쉬에서 분리하여 PBS로 2-3번 세척하였다. 그리고 페놀레드가 들어있지 않은 DMEM 기본 배양액에 ITS 만을 첨가하여 부유상태로 24시간 배양하였다. 배양액의 대조군으로서, 같은 양의 기본 배양액에 ITS를 같은 양으로 첨가하여 배양기에 24시간 배양한 것을 사용하였다. 세포가 부유되어 있는 배양액을 모두 모아 원심 분리하여 (1000 g에서 20분) 세포의 파편 등을 제거한 뒤, -70℃의 냉동고에 바로 얼린 후 필요 시 해동하여 사용하였다.

세포의 배양조건은 다음과 같다:

(1) 세포의 기본 배양조건 - DMEM/F-12, bFGF 20 ng/ml , N2 100X-최종농도 1X, B-27 50X- 최종농도 0.5X, Gem21 50X-최종농도 0.5X

(2) 분비단백체(secretome) 획득용 배양 조건 - DMEM/phenol red free, ITS 100X-최종농도 1X

뇌졸중 모델의 제작

국소 뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대하여 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 응용된 혈관 내 봉합사 삽입법(intraluminal suture method)을 사용하였다. Zia Longa(Zea Longa, et al, Stroke., 1989, 20, 84-91)가 개발한 방법인 국소 뇌허혈 모델로서 다른 모델과는 달리 임상적으로 유사하다는 장점이 있다. 이런 이유로 허혈-재관류(ischemia-reperfusion)에 대한 기전 연구나 여러 가지 약물의 효과를 스크리닝하는 데 적합한 모델이다. 국소 뇌허혈 모델은 상술한 장점 이외에도 프로브를 이용하여 중대뇌동맥(middle cerebral artery)을 일시적으로 폐쇄하여 재관류되는 손상과, 영구적으로 폐쇄하여 지속적인 세포손상을 모두 관찰할 수 있다는 장점도 가지고 있다. 뇌혈류량에 따라 허혈성 중심부(ischemic core) 와 허혈성 반음영 부위(ischemic penumbra)의 차이가 결정되는데 전자는 15% 미만이고 후자는 40% 미만이다. 10-20분간 폐쇄하면 중심부에서 신경세포들이 산발적으로 죽고 1시간 정도 유발하면 중심부위(core)가 생기면서 뇌조직 손상이 커지게 되며, 2-3시간 유발하면 영구적으로 폐쇄된 것과 유사한 손상을 입게 된다.

일주일간의 순화 후, 호흡 마취기를 사용하여 실험동물(수컷 Sprague-Dawley rat, 체중 250-300 g)을 마취시켰으며, 마취제로 이소플루란(isoflurane)을 사용하였다. 먼저 흰쥐를 80% N₂O와 20% O₂가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루란으로 전신마취를 유도한 후 2-2.5%로 마취를 유지하였다. 뇌졸중 모델 제작을 위하여, 흰쥐의 왼쪽 목 피부를 절개한 후 안쪽으로 총경동맥(common carotid artery), 외경동맥(external carotid artery) 및 내경동맥(internal carotid artery)을 박리하여 도출한 뒤 각각의 혈관을 블랙 실크실로 살짝 묶어 혈류를 차단하였다. 총경동맥을 절반 정도 절단하고, 절단면을 통하여 나일론 봉합사의 끝 부분을 소작하여 라운딩해서 0.40 ㎜가 되게 제작한 25 ㎜의 4-0 나일론 프로브(probe)를 삽입하였다. 외경동맥을 통해 삽입한 나일론 프로브를 내경동맥을 거쳐 중대뇌동맥 부위로 넣어 고정하여 총경동맥분지에서 약 18-20 ㎜ 정도 삽입한 후 중대뇌동맥의 기시부를 막은 뒤 실로 고정하여 중대뇌동맥을 영구히 폐쇄한 다음 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연회복 시켰다.

뇌졸중 모델에 뇌동맥을 통한 분비단백체 주입 및 행동실험:

a. 인간 ESC-유래 신경전구세포(NPC)의 분비단백체 주입

뇌졸중 유발 하루 뒤에 행동실험에 대한 기준점(baseline)을 확립한 후, 뇌졸중 모델 제작과 같은 방식으로 오른쪽 외경동맥을 통해 내경동맥 부위로 인슐린 주사기 바늘을 삽입한 후, 이를 통하여 분비단백체를 0.2 mg/kg(부피 50 μ)만큼 동맥 주사하고, 대조군에는 같은 부피의 배양액 혹은 인산완충용액(PBS)을 투여하였다. 분비단백체 액을 주입한 후 14일 동안 동물의 상태를 관찰하였으며, 주입 전 1회, 주입 후 4회에 걸쳐 몸무게를 측정하고 행동 분석을 실시하였다.

b. 인간 iPSC -유래 신경전구세포(NPC)의 분비단백체 주입 - 다회투여

뇌졸중 유발 하루 뒤에 행동실험에 대한 기준점(baseline)을 확립한 후, 뇌졸중 모델 제작과 같은 방식으로 오른쪽 외경동맥을 통해 내경동맥 부위로 인슐린 주사기 바늘을 삽입한 후, 이를 통하여 분비단백체를 회당 0.7 mg/Kg (300 g 랫드의 경우 200 μg, 주사량은 부피 200 μ만큼 정맥 주사하였다(penile vein 투여). 대조군에는 같은 부피의 배양액을 투여하였다. 단백체 분리에서와 같이 분비단백체의 대조군으로 같은 양의 기본 배양액에 ITS를 같은 양으로 첨가하여 배양기에 24시간 배양한 후 대조군으로 사용하였다. 분비단백체 액을 주입한 후 14일 동안 동물의 상태를 관찰하였으며, 주입 전 1회(0일), 주입 후 4회(3일, 7일, 10일 및 14일)에 걸쳐 몸무게를 측정하고 행동 분석을 실시하였다.

c. 행동실험

① 상체 자세(torso twisting) 검사: 실험동물의 대뇌피질과 선조체 감각으로 간주되는 상체 자세를 시험하기 위하여, 비대칭 운동 행동을 측정하였다.

② 빔 균형(beam balance) 검사: 실험동물이 좁은 빔 위에서 안정적으로 균형을 잡는 것을 통해 총 전정 운동 기능(gross vestibulomotor function)을 평가하였다.

③ 풋 폴트 검사(foot-fault test): 운동에 있어서 운동 움직임(motor movement)의 조정(협동)과 통합(종합)을 검사할 때 사용하는 실험방법으로, 풋 폴트(Foot-fault)는 동물이 앞발이나 뒷발을 제자리에 두지 않거나(misplace), 발이 격자판 바(grid bar)사이로 떨어지는 경우로 정의하고, 풋 폴트는 정상적인 동물에 있어서는 특이하게 대칭적이다.

④ 포착가능 견인 검사(Prehensile Traction test): 검사 중 포착가능 여부는 실험동물이 앞발로 수평방향의 로프에 매달릴 수 있는 능력을 통해 측정하였다. 포착가능 견인 검사는 실험동물의 근육 강도를 평가하기 위하여 행해졌다. 이 검사는 종래에 보고된 방법으로 실시하였다. 철막대(직경 2 cm, 길이 100 cm)를 수평으로 스펀지 고무패드(두께 7.5 cm)의 70 cm 위에 위치시켰다. 실험동물의 앞발을 철막대에 위치시킨 뒤 풀어주었다. 실험동물을 5초간 철막대에 매달리도록 하였다. 떨어지는데 걸리는 시간과 뒷다리를 철막대 위에 올려놓는지 여부를 통해 다음과 같이 점수를 계산하였다: 0점 - 실험동물이 5초 동안 매달리고 뒷다리를 올려놓음, 1점 - 실험동물이 5초 동안 매달리고 뒷다리를 올려놓지 못함, 2점 - 실험동물이 3-4초 간 매달림, 3점 - 실험동물이 0-2초 동안 매달림.

⑤ 오픈 필드 검사(open-field test): 일반적인 보행활동 수준을 알아보는 데 사용되는 검사로, 동물의 행동양상과 특성을 직접 관찰하여 동물의 활동성, 정서성 및 행동패턴 등을 측정하였다.

⑥ mNSS(modified Neural Sibiarity Score): 위의 다양한 검사를 통해 얻어진 운동, 감각, 균형, 반응 및 정서 검사 값의 종합 성적으로, 점수를 하기의 기준에 따라 계산하였다(한 개체 당 점수를 합산하여 mNSS를 측정).

- 오픈 필드 검사(동물의 정서성, 활동성, 행동패턴 등을 측정)

움직임 없음: 3

1-20회: 2

21-30회: 1

30회 이상: 0

- 포착가능 견인 검사(근력측정)

0-5초: 3

6-10초: 2

11-20초: 1

21초 이상: 0

- 빔 균형 검사(균형감각 측정)

0점: 1 = 안정적 자세

2 = 빔의 측면을 잡고 약간 흔들리는 정도

1점: 3 = 1개 이상의 다리가 빔에서 탈락하는 경우

4 = 균형 잡으려고 노력하지만 떨어지는 경우

2점: 5 = 균형을 잡지 못하고, 빔에 거꾸로 매달리다가 떨어지는 경우

6 = 빔 위에서 전혀 균형을 잡지 못하고 떨어지는 경우

- 풋 폴트 검사(운동협응 능력)

0-5번: 0

6-10초: 1

11-20초: 2

21초 이상: 3

- 상체 자세 검사(비대칭 운동 행동)

0번: 2

1-4번: 1

5번 이상: 0

뇌허혈 유발 14일 후에 흰쥐를 졸레틸로 마취한 후 개흉한 다음, 우심이를 절개하여 바늘을 좌심실에 주입한 후 펌프를 이용하여 인산완충용액을 심장에 관류시켜 혈액을 제거한 뒤 뇌조직을 적출하였다. 표본제작을 위한 조직절편을 브레그마(bregma)를 기준으로 파라핀에 포매하고, 손상된 뇌조직을 확인하기 위해 뇌조직 절편을 헤마톡실린에 염색하고 탈수한 뒤 고정한 다음 슬라이드를 디지털 카메라로 촬영한 후 컴퓨터로 옮겼다. 이미지 분석프로그램(image J)을 사용하여 뇌경색 비율(%)을 하기 수학식 1로 계산하였다.

수학식 1

뇌경색 비율(%) = (정상 좌반구의 면적-뇌경색 부위의 정상조직의 면적)/정상 좌반구의 면적 X 100

면역조직화학적 분석 및 정량화

뇌 조직을 24시간 동안 4% 포름알데히드로 고정하고 PBS로 세척하였다. 파라핀 단면 제작을 위해, 누진 에탄올에서 조직을 탈수시키고 파라핀에 포매시켰다. 파라핀-포매된 뇌를 마이크로톰 상에서 4 mm 두께 층으로 절단하고, 자일렌에서 10분 간 탈파라핀화한 뒤 누진 알콜에서 재수화하였다. 절편에 10 mM 시트르산을 1시간 동안 처리한 뒤 PBS 및 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 5% BSA 용액을 첨가하였다. 이후, 뇌 절편을 ED-1(Abcam)(1:100), 더블코르틴 (DCX; Abcam, 1:100), 신경교섬유질산성단백질 (GFAP; Millipore, 1:100) 및 α-평활근액틴 (aSMA; Abcam, 1:100)에 대한 1차 항체와 함께 15-17시간 동안 4℃에서 배양하였다. 절편들을 1차 항체와 함께 하룻밤동안 배양한 뒤에, PBS로 세척하고 절편들을 형광 표지된 2차 항체(Alexa-Fluor®488 또는 594, 1500, Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 1시간 동안 배양하였다. 형광 현미경(Olympus IX71)를 이용하여 절편의 형광 이미지를 얻었다.

분비단백체 분석(Secretomics)

hESC 유래 신경전구세포 (Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체와 인간 iPSC 유래 신경전구세포의 분비단백체는, 각각 4-12% 구배 노벡스 비스-트리스젤(Invitrogen)로 SDS-PAGE하여 분리한 다음 젤코드 블루 염색시약(Pierce)으로 단백질 밴드가 보이도록 젤을 염색하였다. 염색된 젤은 종일한 크기의 10밴드로 잘라인-젤 트립신 분해를 공지된 방법으로 수행하였다.

인-젤 분해에 의해 제조된 펩타이드를 Nano Ultra Performance 액체크로마토그래피(Eksigent Technologies)와 결합한 LinearTrap Quadrupole (LTQ) 질량분광계(Thermo Finnigan)를 사용하여 분석하였다. 구체적으로, 트립신 처리한 펩타이드를 C18레귤러 5 마이크론 사이즈 레진이 패킹된 분석 컬럼(75 마이크로미터 X 11 cm)에 적용하였다. 97% 용액 A(증류수에 0.1% 포름산)에서 60% 용액 B(아세토니트릴에 0.1% 포름산)로 유속 0.3 마이크로리터/시간의 조건에서 분선형 45분 구배를 실시하였다. 분리된 펩타이드 이온을 나노 Electrospray Ionization (ESI) 소스로 전기분무 하였다. MS/MS 스펙트럼은 전체 MS 스캔을 단편으로 선별하여 가장 많은 5가지 스펙트럼을 결과-의존 스캔으로 구하였다. 동적 배제에 대한 반복계수를 1로, 반복 기간을 30초로, 동적배제 기간을 180초로, 배제 질량 너비를 1.5 Da으로, 동작 배제리스트를 50으로 설정하였다.

펩타이드 및 단백질 확인은 ipi.HUMAN v3.76 데이터베이스(89 378 엔트리)에서 터보-SEQUEST 알고리즘(Thermo Finnigan)을 사용하여 검색하였다. 데이터베이스 검색 후 스카프폴드 2(Proteome Software)를 이용하여 확인된 펩타이드 및 단백질을 확인하였다. SEQUEST 검색으로 얻은 펩타이드 중 0.95 이상의 펩타이드프로펫(PeptideProphet) 개연성을 갖는 한 세트의 펩타이드를 선별하였다. 또한, 0.99 이상의 프로테인프로펫(ProteinProphet) 개연성 및 2개 이상의 고유 펩타이드를 갖는 단백질 리스트를 구하였다.

척수 손상 (Spinal cord injury: SCI) 모델 제작, 분비체 주입 및 행동 회복 검사 (BBB score test)

실험동물(수컷 Sprague-Dawley rat, 체중 250-300 g)을 마취한 후 척추 뼈 제거를 실시하였다(laminectomy). NYU Impactor를 이용하여 10 g 짜리 rod를 이용하여 노출된 척수 위로 떨어뜨려서 척수 손상을 유발하였다(SCI 모델 제작). 이후 상처를 잘 소독한 후 피부를 봉합해주었다. 척수손상을 받은 후 그 상처 부분에 본 발명의 전분화능 줄기세포(ESC) 유래 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체(secretome)를 주입 (injection)하였다. 그 후 약 3일 간격으로 두 번 더 정맥으로 투여하였다. 분비단백체(secretome)를 주입한 후 BBB test를 1주일 마다 시행하였다. BBB test를 8주 이상 실시하여 대조군과 비교하였다.

통계 분석

그룹간의 통계학적 유의도는 Tukey's correction이 적용된 one-wat analysis of variance (ANOVA)를 이용하여 구하였으며, p value < 0.05를 통계학적으로 유의한 것으로 판정하였다.

실험결과 1: 인간 배아줄기세포( ESC )-유래 신경전구세포의 분비단백체

뇌졸중 모델에서 인간 ESC-유래 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체에 의한 질환의 개선을 보기 위해 다음의 3개의 군으로 2주간 실험을 수행하였다. 뇌졸중 유발 24시간 후, 행동실험으로 질환의 유도가 확인된 흰쥐를 3개 군으로 임의로 할당한 다음, 오른쪽 외경동맥으로 분비단백체(0.2 mg/kg, 부피 50 ㎕), 배지 또는 PBS를 동량(50 ㎕) 주사하였다. 각 물질을 주입한 후 3, 7, 10 및 14일에 동물의 상태와 체중을 확인하고, 행동 분석을 실시하였다.

그룹	설명
PBS 대조군	뇌졸중 유발 후 PBS 처리군
배지 대조군	뇌졸중 유발 후 신경전구세포 배양에 활용한 배지 처리군
분비단백체 처리군	뇌졸중 유발 후 신경전구세포 배양액 처리군

허혈 병변 부위 분석 결과

흰쥐에서 영구 MCAO를 통한 뇌졸중의 유도는 광범위한 뇌병변의 손상을 유도하였다. 뇌졸중 유발 14일 경과 후 뇌를 적출한 다음, TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 염색으로 뇌의 손상 여부와 손상 부위를 확인하였다. TTC 염색은 세포 내의 정상 미토콘드리아 산화 효소 시스템(mitochondrial oxidative enzyme system)과 반응하여 염색되는데, 뇌허혈 손상을 받아 미토콘드리아가 손상되면 산화 시스템이 교란되어 염색이 되지 않아 흰색을 나타내므로 뇌의 손상부위를 구별할 수 있다.

도 1에 나타난 바와 같이, 중뇌 동맥결찰에 의해 유발된 손상은 주로 오른쪽 뇌의 피질 부위와 선조체 부위에 발생하였다(도 1). 또한, 신경전구세포의 분비단백체 주입이 허혈성 병변 부위(infarct size)를 감소시켰다. PBS 대조군은 우뇌의 60% 가까이 손상되었고, 배지 대조군은 46% 정도가 손상되었으나, 분비단백체 처리군은 손상 부위가 29% 정도로 대조군에 비하여 손상 부위가 현저히 감소하였다.

체중 분석 결과

뇌졸중 유발이 흰쥐의 운동능력을 감소시켜 즉각적으로 체중의 감소가 7일까지 진행되며, 다양한 치료제는 운동능력의 회복을 통해 체중의 증가를 유도한다. 분비단백체의 주입도 세포 이식과 유사하게 체중 증가를 유도하였다(도 2). 신경손상의 회복에서 가장 눈에 띄는 현상은 체중의 회복이다. 분비단백체 처리군은 PBS 대조군에 비해 유의한 개선을 보였다.

행동 분석 결과

분비단백체 처리군은 빔 균형 검사에서 두 대조군들에 비해 통계적으로 유의한 행동 개선효과를 보였으며, 이 효과는 치료 3일째부터 나타나는 등 즉시적인 효과가 나타났다(도 3a).

또한, 포착가능 견인 검사(prehensile traction)에서도 치료(주입) 7일째에 두 대조군 대비 통계적으로 유의한 효과를 보였다(도 3b).

나아가, 분비단백체 주입은 그물망에서의 실족(foot fault) 빈도를 감소시키는 효과를 보여주었다(도 3c). 단위시간 당 행동의 활발함을 측정하는 라인 크로스(line cross)도 개선되는 추세를 보여주었다(도 3d).

종합적인 행동신경 개선 효과(mNSS) 분석 결과

mNSS(Modified Neurological Severity Score test)는 신경학적 기능을 측정하기 위한 구성표이다. 운동(근육 상태)과 mensory(시각, 촉각 및 자기 수용(proprioceptive)) 항목으로 평가하였다. 정상은 0점이며, 점수가 높을수록 기능이상의 정도가 심한 것으로 판단한다. 도 4에 나타난 바와 같이, mNSS의 분석에서 분비단백체 처리군은 치료 초반부터 PBS 대조군과 배지 대조군 보다 훨씬 높은 치료 효과(행동 개선)를 보여주었다(도 4).

mNSS 검사에서 PBS 대조군은 뇌허혈을 유발시킨 1일 후 평균 5.4점에서 14일 후 평균 5.5점으로, 뇌졸중에 의한 신경행동학적 장애가 유지됨을 볼 수 있었다. 배지 대조군의 경우에는 일시적인 행동 개선 효과가 치료 3일에 보였으나, 추가적인 개선 효과는 발휘하지 못하였다. 반면, 분비단백체 처리군의 경우에는 치료 3일(mNSS 4.5점)부터 10일(mNSS 3점)까지 지속적인 행동 개선 효과를 나타내었다.

분비단백체 분석 결과

iPSCs 유래의 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)로부터 얻은 분비단백체는 다음의 단백질들을 포함하고 있었다: 아그린(Agrin), 아넥신 A5(Annexin A5), BSG(Basigin), 비글리칸(Biglycan), 칼포닌-3(Calponin-3), 콕토신-유사 단백질(Coactosin-like protein), 코피린-1(Cofilin-1), 콜라겐 알파-2, 쿨린-3(Cullin-3), 데스트린(Destrin), 디스트로글리칸(Dystroglycan), 에프린-B2(Ephrin-B2), 엑스포틴-2(Exportin-2), 에즈린(Ezrin), 피브로넥틴, 피블린-1(Fibulin-1), Frizzled-related 단백질, 젤라틴-3 결합 단백질(Galectin-3 binding protein), 그래뉼린(Granulins), 성장/분화 인자 11(Growh/differentiation factor 11), 합토글로빈(Haptoglobin), 헤포펙신(Hemopexin), High mobility group protein B2, 호네린(Hornerin), 임포틴-9(Importin-9), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2), 루프스 La 단백질(Lupus La protein), 대식세포 이동 억제 인자(Macrophage migration inhibitory factor), 미드킨(Midkine), 모에신(Moesin), 뉴로필린 2(Neuropilin 2), 플레이오트로핀(Pleiotrophin), 프로필린-1(Profilin-1), 단백질 DJ-1(Protein DJ-1), 라딕신(Radixin), Secreted frizzled-related protein-2, 셉틴-11(Septin-11), 탈린-1(Talin-1), 테스티칸(Testican), 티모포이에틴(Thymopoietin), 트랜스젤린-3(Transgelin-3), 비멘틴(Vimentin).

인간 배아줄기세포의 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)로부터 얻은 분비단백체는 다음의 단백질들을 포함하고 있었다: 아그린(Agrin), 아넥신 A2(Annexin A2), 아트락틴(Attractin), 비글리칸(Biglycan), 세룰로플라스민(Ceruloplasmin), 코피린-1(Cofilin-1), 콜라겐 알파-1, 코로닌-1X(Coronin-1X), 더미시딘(Dermicidin), DERP12, 에프린-B3, 엑소토신-2(Exostosin-2), 에즈린(Ezrin), 젤라킨-3 결합 단백질, 그래뉼린(Granulins), 성장/분화 인자 11(Growh/differentiation factor 11), 합토글로빈(Haptoglobin), 헤모펙신(Hemopexin), High mobility group protein B2, 호네린(Hornerin), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2), 루프수 La 단백질, 미드킨(Midkine), 모에신(Moesin), 멀티플 상피 성장 인자-유사 도메인 단백질 8(Multiple epidermal growth factor-like domains protein 8), 니도겐-1(Nidogen-1), 파라티모신(Parathymosin), 프로필린-2(Profilin-2), 단백질 DJ-1(Protein DJ-1), Secreted frizzled-related protein-2, 시크리토그래닌(Secretogranin), 탈린-1(Talin-1), 티모신 베타-4(Thymosin beta-4), TGFBI(Transforming grwowth factor-beta-induced protein ig-h3), 트랜스젤린(Transgelin), 비멘틴(Vimentin).

척수손상 치료 효과

척수 손상 (Spinal cord injury: SCI) 모델을 만들고 그 손상 부분에 직접 전분화능 줄기세포(ESC) 유래 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC)의 분비단백체 (secretome) 약 30 μl를 5군데 나누어 주입(injection) 하였다. 그 후 약 3일 간격으로 두 번 더 정맥으로 분비단백체를 약 200 μg (200 μl)씩 주입하였다. 매주 행동 회복에 대하여 척수 손상 행동 회복 테스트 방법( BBB test)에 따라 평가하였다. BBB 시험법은 척수 손상 연구자에게 통상적으로 잘 알려진 시험법이다. BBB test를 8주 이상 실시하여 무처리 대조군(control)과 비교하였을 때 분비단백체 주입군(injection)에서 우수한 행동 회복 결과를 보여주었다(도 12).

실험결과 2: 인간 유도만능줄기세포 ( iPSC )-유래 신경전구세포의 분비단백체 + 다회투여

뇌졸중 모델에서 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 분비단백체의 단회 및 다회투여에 의한 질환의 개선을 보기 위해 다음의 4개의 군으로 2주간 실험을 수행하였다. 실험스케쥴은 도 5와 같다.

그룹	설명
대조군	뇌졸중 유발 후 무처리군
배지 대조군	뇌졸중 유발 후 신경전구세포 배양에 활용한 배지 처리군
분비단백체 1회 처리군	뇌졸중 유발 후 신경전구세포 배양액 1회 처리군
분비단백체 4회 처리군	뇌졸중 유발 후 신경전구세포 배양액 4회 처리군

도 6a 내지 6i는 전분화능 유도 만능줄기세포 유래-신경전구세포 분비단백체의 단회 투여 vs. 4회 투여의 실험결과를 나타낸다. 거의 모든 조건에서 분비단백체(secretome-M) 4회 처리군이 다른 군들에 비해 월등한 행동개선 효과를 발휘하는 것을 알 수 있다. 즉, 단회 투여군에 비해 다회 투여군이 행동개선에 매우 유의한 치료효과를 발휘함을 확인하였다.

체중 분석 결과

분비단백체 단회 및 다회 처리군은 PBS 대조군에 비해 치료 3일차에 유의한 개선을 보였다 (도 6i). 그러나 시일이 경과함에 따라 군간의 체중차이는 통계적 유의성을 상실하였다.

행동 분석 결과

상체 자세(torso twisting) 검사에서 분비단백체 다회 처리군은 다른 군에 비해 통계적으로 유의한 뇌손상 부위쪽인 왼쪽 상체 비대칭 운동의 개선효과를 유도하였다 (도 6b). 반면 비손상 쪽인 오른쪽 상체 비대칭 운동은 군간의 통계적 유의성이 분비단백체 다회 투여군의 10일을 제외하고는 관찰되지 않았다 (도 6c).

분비단백체 반복투여는 그물망에서의 실족(foot fault) 빈도를 감소시키는 경향성을 보여주었으나, 14일을 제외하고는 대조군과 통계적 유의성이 보이지 않았다 (도 6d). 단위시간 당 행동의 활발함을 측정하는 라인 크로스(line cross)도 분비단백체의 단회 및 다회 투여로 개선되는 추세를 보여주었다(도 6e).

Rearing 스코어 역시 분비단백체의 단회 및 반복 투여가 다른 실험군에 비해 개선을 유도하는 경향성을 확인하였으며 (도 6f), 빔 균형 검사에서 두 대조군들에 비해 분비단백체의 다회 투여가 통계적으로 유의한 행동 개선효과를 보였으며, 이 효과는 치료 3일째부터 나타나는 등 즉시적인 효과가 나타났다(도 6g). 또한, 포착가능 견인 검사(prehensile traction)에서도 치료(주입) 7일째에 두 대조군 대비 통계적으로 유의한 효과를 보였다(도 6h).

종합적인 행동신경 개선 효과(mNSS) 분석 결과

도 6a에 나타난 바와 같이, mNSS의 분석에서 분비단백체 다회 처리군은 치료 초반부터 PBS 대조군과 배지 대조군 보다 훨씬 높은 치료 효과(행동 개선)를 보여주었다. 분비단백체 단회 처리군도 대조군에 비해서 실험기간 동안 유의한 치료효과를 발휘하였고, 배지 대조군에 비해 우월한 행동개선 효과를 보였다.

허혈 병변 부위 분석 결과

도 7은 랫트 pMCAo 모델에서 신경전구세포(Neural precursor cell; NPC) 유래 분비단백체의 투여 14일 경과 시 경색 크기에 미치는 효과를 보여준다. PBS (control), 배지대조군 (blank), NPC-유래 분비단백체 단회 (Secretome-S) 또는 NPC-유래 분비단백체 반복 투여 (Secretome-M)한 랫트에서 치료 14일 경과 후의 대표적 이미지를 보여준다. 랫트 pMCAo 모델에서 신경전구세포 유래 분비단백체의 투여 14일 경과 시 뇌경색 크기에 미치는 효과를 보여준다. 단회 및 다회 투여 시 PBS 군과 비교해서 모두 *P<0.01 이다. 특히 분비단백체의 다회 투여시 배지 대조군 (blank)에 비해 P<0.05의 유의한 개선 효과를 확인하였다.

항염증 효과 - ED-1 양성세포 감소

도 8a-8b는 NPC-유래 분비단백체의 치료로 동측 선조체의 ED-1 양성세포의 빈도가 감소하고, 분비단백체의 반복 투여가 유의하게 ED-1 양성세포의 감소를 유발함을 보여준다. 스케일 바: 200 μm. ED-1 양성 세포의 수를 최소 5 개의 별개의 현미경 영역에서 측정하였다. 측정값은 ±표준오차로 표시하였다. Control과 분비단백체-반복투여 그룹간의 비교시 *P<0.001 이다.

항염증 효과 - GFAP 양성세포 감소

도 9a-9b는 NPC-유래 분비단백체의 치료로 동측 선조체의 GFAP 양성세포의 빈도를 감소시키며, 분비단백체의 반복 투여가 유의하게 GFAP 양성세포의 감소를 유발함을 보여준다. 특히 GFAP 의 발현은 배지대조군 (Blank)에 비해 분비단백체 반복치료 군에서도 유의한 감소를 유도하였다. 스케일 바: 200μm. GFAP 양성 세포의 수를 최소 5 개별개의 현미경 영역에서 측정하였다. 측정값은 ± 표준오차로 표시하였다. 각 그룹 간의 다중 비교시 *P<0.05 및 ***P<0.001 이다

내재적 줄기세포의 가동효과

도 10은 분비단백체의 투여로 인한 랫트 뇌조직에서의 내재성 신경줄기세포 (endogenous neural stem cell)의 가동을 보여준다. 분비단백체 투여 14일 경과 후 시험하였다. DCX(붉은색) 양성세포가 랫트 허혈 뇌에서 관찰되었다. 스케일바: 500 μm.

신생혈관 증가 효과

도 11은 NPC-유래 분비단백체의 치료로 동측 선조체의 α-SMA 양성 혈관의 빈도가 증가하고, 분비단백체의 반복 투여가 유의하게 혈관의 수를 증가시킴을 보여준다. α-SMA 양성 혈관의 수를 최소 5 개의 별개의 현미경 영역에서 측정하였다. 측정값은 ± 표준오차로 표시하였다. Control과 분비단백체-반복투여 (Secretome-M)그룹간의 비교시 *P<0.005 이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

신경전구세포(neural precursor cell; NPC)의 분비단백체(secretome)를 유효성분으로 포함하는 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경전구세포는 전분화능 만능줄기세포로부터 분화된 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경전구세포는 전분화능 만능줄기세포로부터 분화된 신경 로제트 단계 전후의 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 전분화능 만능줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), iPSCs(induced pluripotent stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells) 또는 배아종양세포(embryonic carcinoma cells)인 것을 특징으로 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경전구세포는 PSA-NCAM(poly-sialylated neural cell adhesion molecule)-양성 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경전구세포는 PSA-NCAM(poly-sialylated neural cell adhesion molecule)-음성 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 분비단백체는 신경전구세포를 세포 배양배지에서 배양하여 얻은 세포배양액에 함유된 형태인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 세포배양액은 신경전구세포를 ITS(인슐린/트랜스페린/셀레늄)와 bFGF(basic fibroblast growth factor)가 함유된 무혈청 세포 배양배지에서 배양한 후 세포를 제거하여 수득한 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 분비단백체는 하기의 단백질들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
아그린(Agrin), 아넥신 A5(Annexin A5), BSG(Basigin), 비글리칸(Biglycan), 칼포닌-3(Calponin-3), 콕토신-유사 단백질(Coactosin-like protein), 코피린-1(Cofilin-1), 콜라겐 알파-2, 쿨린-3(Cullin-3), 데스트린(Destrin), 디스트로글리칸(Dystroglycan), 에프린-B2(Ephrin-B2), 엑스포틴-2(Exportin-2), 에즈린(Ezrin), 피브로넥틴, 피블린-1(Fibulin-1), Frizzled-related 단백질, 젤라틴-3 결합 단백질(Galectin-3 binding protein), 그래뉼린(Granulins), 성장/분화 인자 11(Growh/differentiation factor 11), 합토글로빈(Haptoglobin), 헤포펙신(Hemopexin), High mobility group protein B2, 호네린(Hornerin), 임포틴-9(Importin-9), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2), 루프스 La 단백질(Lupus La protein), 대식세포 이동 억제 인자(Macrophage migration inhibitory factor), 미드킨(Midkine), 모에신(Moesin), 뉴로필린 2(Neuropilin 2), 플레이오트로핀(Pleiotrophin), 프로필린-1(Profilin-1), 단백질 DJ-1(Protein DJ-1), 라딕신(Radixin), Secreted frizzled-related protein-2, 셉틴-11(Septin-11), 탈린-1(Talin-1), 테스티칸(Testican), 티모포이에틴(Thymopoietin), 트랜스젤린-3(Transgelin-3) 및 비멘틴(Vimentin).
제 1 항에 있어서, 상기 분비단백체는 하기의 단백질들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
아그린(Agrin), 아넥신 A2(Annexin A2), 아트락틴(Attractin), 비글리칸(Biglycan), 세룰로플라스민(Ceruloplasmin), 코피린-1(Cofilin-1), 콜라겐 알파-1, 코로닌-1X(Coronin-1X), 더미시딘(Dermicidin), DERP12, 에프린-B3, 엑소토신-2(Exostosin-2), 에즈린(Ezrin), 젤라킨-3 결합 단백질, 그래뉼린(Granulins), 성장/분화 인자 11(Growh/differentiation factor 11), 합토글로빈(Haptoglobin), 헤모펙신(Hemopexin), High mobility group protein B2, 호네린(Hornerin), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 2(Insulin-like grwoth factor-binding protein 2), 루프수 La 단백질, 미드킨(Midkine), 모에신(Moesin), 멀티플 상피 성장 인자-유사 도메인 단백질 8(Multiple epidermal growth factor-like domains protein 8), 니도겐-1(Nidogen-1), 파라티모신(Parathymosin), 프로필린-2(Profilin-2), 단백질 DJ-1(Protein DJ-1), Secreted frizzled-related protein-2, 시크리토그래닌(Secretogranin), 탈린-1(Talin-1), 티모신 베타-4(Thymosin beta-4), TGFBI(Transforming grwowth factor-beta-induced protein ig-h3), 트랜스젤린(Transgelin) 및 비멘틴(Vimentin).
제 1 항에 있어서, 상기 허혈성 질환은 허혈성 뇌혈관 질환, 허혈성 심장질환, 심근경색, 협심증, 하지동맥 허혈성 질환 및 사지말단부 허혈성 질환으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 11 항에 있어서, 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌졸중인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 신경염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 미만성 루이소체병, 백색질뇌염, 측두엽간질 및 척수손상으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물은 일회투여용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 허혈성 질환 또는 신경염증 질환 치료용 조성물은 다회투여용인 것을 특징으로 하는 조성물.