CN102796696A - 一种从人皮肤细胞直接诱导的神经元细胞及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，涉及一种从人皮肤细胞直接诱导的神经元细胞及其制备方法；本发明方法通过将包含重编程转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l的cDNA导入离体成人皮肤细胞后，筛选表达人神经元细胞标记物的细胞克隆，直接制得能稳定传代的诱导型人神经元细胞。所述的神经元细胞具有以下特征：（1）在体外表达人神经元细胞特异性标志蛋白；（2）在体内可存活并发挥功能。本发明获得具有功能的人神经元细胞不需经过多能干细胞的过程，技术更简单有效；无异源饲养层参与，临床应用前景更好；采用的转录因子未见有致瘤相关报道，生物安全性更高。

Description

一种从人皮肤细胞直接诱导的神经元细胞及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及神经元细胞诱导的方法，具体涉及一种从人皮肤细胞直接诱导神经元细胞的方法。

背景技术

神经系统疾病如脑损伤、脊髓损伤、中风、帕金森病、神经元性肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默病等社会危害大、治疗难度高，长期以来是医学领域的难题。已有研究表明，利用人神经元细胞研究神经损伤的机理，筛选干预神经功能的新药，并用于移植修复受损神经功能是有效且具应用前景的方法；但功能神经细胞的来源途径有限，以往常用胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES细胞）分化获得人神经细胞（Wichterle H, Lieberam I, Porter JA, et al. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 2002; 110(3): 385-397），而ES细胞的使用又一直受到伦理学的争议，因此，获得大量可用于基础研究及临床应用的功能性神经元细胞具有重要的科学和社会意义。

2006年，Yamanaka等通过四种转录因子（Oct-3/4，Sox2，c-Myc，KLF4）介导，将小鼠成纤维细胞转变为在形态、增殖和畸胎瘤形成能力等方面与ES细胞相似的“诱导型多能干细胞”（induced pluripotent stem cell，iPS 细胞）（Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126(4): 663-676）；所述的iPS细胞不涉及伦理争议，可分化为神经细胞（Dimos JT, Rodolfa KT, Eggan K, et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 2008; 321(5893): 1218-1221），其开创的外源转录因子诱导细胞重编程的方式成为近年来干细胞研究的重大突破。但是，制备所述iPS细胞引入了c-Myc 和KLF4两个致癌因子，其分化潜能又决定了有产生畸胎瘤的危险，这些缺陷严重影响了iPS细胞的推广和应用；因此，利用外源转录因子诱导的方法，从皮肤细胞获得安全、具功能的神经细胞，是一种较为理想的策略。

2008年，哈佛大学Douglas Melton教授领导的研究团队使用一套以三个转录因子为主的诱导体系将胰岛外分泌细胞直接转化为胰岛内分泌β细胞（Zhou Q, Brown J, Kanarek A, et al. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to β-cells.Nature, 2008, 455: 627-632）。2010年1月，美国斯坦福大学医学院的Marius Wernig等在《Nature》杂志上报道，诱导细胞重编程可绕过iPS这一步骤，直接在体外将小鼠的胚胎和成体皮肤细胞转变为诱导型神经元细胞（Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 2010; 463(7284):1035-41）。2010年8月，美国和日本的研究人员在《Cell》杂志网络版上报道，他们通过在小鼠成纤维原细胞中植入特定基因，成功培育出可自发收缩的心肌细胞（Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P, et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell.142:375-386）。2011年3月，美国的科研人员报道，使用制备iPS细胞的4个转录因子也可直接将小鼠皮肤细胞转变成心脏细胞（Efe JA, Hilcove S, Kim JH, et al. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a direct reprogramming strategy. Nature Cell Biology. 2011; 13(3):215-223）。上述的动物研究成果表明，利用外源转录因子诱导的方法，有望不需经过多能干细胞（iPS细胞）这一步骤，直接从皮肤细胞获得诱导型人神经元细胞，且此种细胞类型转换方法不使用肿瘤相关因子，所获细胞不会在体内形成畸胎瘤，具有很好的安全性。

但是，上述的技术方法尚存以下缺陷：1）到目前为止，使用诱导小鼠的转录因子组合来诱导人的皮肤细胞，不能得到人的诱导型神经元细胞；2）在动物实验中，可通过转基因技术，将标识细胞类型转变的报告基因整合到小鼠基因组中，制成转基因小鼠，当皮肤细胞转变成为神经细胞后，就可通过荧光或抗生素抗性筛选将需要的神经细胞挑选出来，但因转基因技术不能直接应用于人，故此种细胞筛选方法不能应用于诱导型人神经元细胞的制备；3）普遍认为，要全面评价一类新型细胞的特征和功能，须提供完整的体外和体内实验数据，但前述研究在评估小鼠诱导型神经元细胞时只开展了体外实验，未将获得的功能细胞移植到体内进行分析鉴定，从而缺乏对这一类新细胞特征的完整认识。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种从人皮肤细胞直接诱导获得神经元细胞的方法；进一步提供一种从人皮肤细胞直接诱导得到的神经元细胞。

本发明方法通过将包含重编程转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l 的cDNA导入离体成人皮肤细胞后，筛选表达人神经元细胞标记物的细胞克隆，直接制得能稳定传代的诱导型人神经元细胞。

上述制备方法中，所述的cDNA通过病毒载体导入所述的人皮肤细胞；

所述的人皮肤细胞来源于离体的成人头皮组织；

所述的病毒载体为慢病毒载体（基础载体购自美国Addgene公司）；

所述的慢病毒载体以组合形式携带的转录因子包括Sox2、Ascl1和Myt1l。

上述制备方法中，筛选过程是采用流式细胞术分选多唾液酸-神经细胞黏附分子（PSA-NCAM）标记呈阳性的细胞克隆。

具体而言，本发明从人皮肤细胞直接诱导获得神经元细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）人皮肤细胞的收集和培养：

无菌收集离体成人头皮组织，按常规方法经酶消化、接种和传代等步骤培养出成人皮肤细胞；

（2）筛选可促成人皮肤细胞转变为神经元细胞的关键诱导因子：

从与人神经发育密切相关或在重编程过程中具重要作用的转录因子中筛选出备选因子，如：Ascl1、Brn2、Lhx2、Myt1l、Pax6、Sox2等，经过不同组合的多次测试，找到可促使人皮肤细胞向神经元细胞转变的关键因子组合——Sox2、Ascl1和Myt1l；

在人皮肤细胞向神经元细胞转变的过程中，所述的Sox2可首先结合到涉及此类细胞类型转变的染色体上，打开染色体本身的致密结构，以利于其他诱导性转录因子的结合；所述的Ascl1在神经元细胞的产生、类型决定和分化中起重要作用，且是小鼠皮肤细胞向神经元细胞的转变最为关键的因子；所述的Myt1l通常以转录激活因子的角色参与神经系统和垂体内多个调控基因的表达；上述的三个因子协同作用，开启细胞类型变换的级联反应，实现人皮肤细胞向神经元细胞的直接转变；

（3）构建携带转录因子的慢病毒载体：

分别将Sox2、Ascl1和Myt1l等3个转录因子的cDNA连接到慢病毒（Lentivirus）穿梭质粒表达载体上（载体主要包含5’端的巨细胞病毒立即早期启动子（MIEP），目的基因，多克隆位点以及3’端的SV40 PolyA位点等元件）；使用293T细胞进行病毒包装和生产；利用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因；

（4）病毒感染离体成人皮肤细胞：

采用步骤（3）所获得的病毒液，感染步骤（1）获得的成人皮肤细胞，培养1天后将细胞转置于不含病毒液的神经元细胞培养液（DMEM/F12基础培养液中添加有B27、N2、bFGF 、EGF 等生长因子）中；

（5）筛选表达人神经细胞标志蛋白的细胞克隆：

挑选具有典型神经元形态的细胞，用流式细胞分选术筛选出表达人神经细胞标志蛋白PSA-NCAM（神经元细胞早期标志）的阳性细胞克隆；

（6）诱导型人神经元细胞的长期培养：

将筛选得来的诱导型人神经元细胞在体外继续传代培养，得到稳定表达各种人神经元标志性特征的诱导型人神经元细胞系。

本发明提供了一种从人皮肤细胞直接诱导得到的神经元细胞。

本发明中，将所述的诱导型人神经元细胞移植于闭合性脑外伤模型（免疫缺陷小鼠脑内），结果证实，该神经元细胞是诱导型人神经元细胞，其具有下述完全的功能性神经元细胞体外体内特征：（1）在体外表达人神经元细胞特异性标志蛋白；（2）在体内可存活并表现出一定的功能特征。具体为：

本发明所述的神经元细胞中，所述的标志蛋白包括神经元核（NeuN）蛋白和突触素（Synapsin）蛋白。

本发明所述的神经元细胞在体内的功能特征包括：

（1）移植后的诱导型人神经元细胞可在体内存活；

（2）移植后的诱导型人神经元细胞在体内表达神经元细胞亚类特异性标志蛋白；

（3）移植后的诱导型人神经元细胞在体内参与移植受体神经电信号的传导；

（4）移植后的诱导型人神经元细胞在体内有助于脑损伤小鼠运动功能的改善；

其中，

所述的特征（1）中检测诱导型人神经元细胞存活的指标包括倒置荧光显微镜下观察到小鼠脑内存在形态完整、带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的外源移植诱导型人神经元细胞；

所述的特征（2）中的标志蛋白包括乙酰胆碱转移酶（ChAT）蛋白和Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体（VGLUT1）等。

所述的特征（3）中，检测神经电生理的指标包括：在细胞贴附模式（cell-attached mode）下记录到所移植诱导型人神经元细胞的动作电流信号；在全细胞模式（whole-cell mode）下记录到所移植诱导型人神经元细胞的自发性动作电位信号；在电流钳模式（current clamp）下记录到的注入不同大小去极化电流后，所移植诱导型人神经元细胞产生快速变化的诱发性动作电位信号；

所述的特征（4）中检测移植后的诱导型人神经元细胞在体内影响脑损伤小鼠运动能力改善的指标包括：依据改良的BBB运动能力评分标准，观察到移植后的诱导型人神经元细胞在体内有助于脑损伤小鼠运动功能的改善。

本发明对从人皮肤细胞直接诱导得到的神经元细胞（诱导型人神经元细胞）进行体外体内特征鉴定，鉴定步骤为：

（1）诱导型人神经元细胞的体外特征鉴定：

在体外对诱导型人神经元细胞进行细胞免疫荧光染色等指标检测，鉴定人皮肤细胞起源的诱导型神经元细胞的体外特征；

（2）诱导型人神经元细胞的体内特征鉴定：

首先，制作闭合性脑外伤免疫缺陷小鼠模型；然后将带有GFP标记的诱导型人神经元细胞移植于小鼠脑内；具体步骤为：

1)      荧光显微镜下观察所移植诱导型人神经元细胞在体内的存活和分布情况；

2)      组织免疫化学等方法检测所移植诱导型人神经元细胞在体内的分化情况；

3)      在诱导型人神经元细胞移植于小鼠脑内6~8周后检测是否有肿瘤产生，确证诱导型人神经元细胞的安全性；

4)      利用脑片膜片钳技术分析所移植诱导型人神经元细胞在受体动物体内的电生理特征；

5)      依据改良的BBB运动能力评分标准，评价所移植诱导型人神经元细胞对脑损伤小鼠运动能力改善的影响。

   本发明对从人皮肤细胞直接诱导得到的神经元细胞（诱导型人神经元细胞）进行体外体内特征鉴定，包括鉴定结果为：

（1）诱导型人神经元细胞在体外：

表达人神经元细胞特异性标志蛋白，包括：神经元核（NeuN）蛋白和突触素（Synapsin）蛋白；

（2）移植于小鼠脑内的诱导型人神经元细胞在受体体内：

1）  可存活且未见有致瘤性；

2） 移植后的诱导型人神经元细胞在体内表达神经元细胞亚类特异性标志蛋白，包括乙酰胆碱转移酶（ChAT）蛋白和Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体（VGLUT1）；

3） 移植后的诱导型人神经元细胞在体内参与移植受体神经电信号的传导，可发放动作电流、自发或诱发性动作电位等电生理信号；

4）依据改良的BBB运动能力评分标准，诱导型人神经元细胞移植组小鼠的运动能力恢复情况明显优于其他细胞移植组和对照组，说明移植后的诱导型人神经元细胞在体内有助于脑损伤小鼠运动功能的改善。

本发明从人皮肤细胞直接诱导获得神经元细胞的方法具有如下优点，

有助于获取到大量可用于基础研究及临床应用的人功能性神经元细胞。在本发明中，诱导和培养所述的诱导型神经元细胞均在无异源饲养层细胞的条件下进行，且所用重编程诱导因子不包括肿瘤相关因子，使所获细胞具备更好的生物安全性。

与已有的各类直接诱导型功能细胞相比，本发明的从人皮肤细胞直接诱导得到的诱导型人神经元细胞，在体外表达人神经元细胞特异性标志蛋白；被移植于闭合性脑外伤模型免疫缺陷小鼠脑内后，可在体内存活，表达神经元细胞亚类特异性标志蛋白，参与移植受体神经电信号的传导，并有助于脑损伤小鼠运动功能的改善，从而具备了较完整、充分的新型细胞体内外特征评价数据。

本发明还提供了一种适用于人神经元细胞体外筛选的方法，本发明所用流式细胞术分选诱导型人神经元细胞，安全有效地实现了对特定类型人类细胞的筛选和富集。

本发明全面地检测了人诱导型神经元细胞的生物学特征和功能，为所述诱导型人神经元细胞的研究和应用提供了可靠的数据，也为其他新型细胞的评估提供了一套可供参考的方法体系；采用本发明获得具有功能的人神经元细胞不需经过多能干细胞的过程，技术更简单有效；无异源饲养层参与，临床应用前景更好；采用的转录因子未见有致瘤相关报道，生物安全性更高。

附图说明

图1显示了人诱导型神经元细胞在倒置显微镜下的检测结果，其中，由人皮肤细胞诱导而来的神经元细胞胞体呈圆形或多角形，有突起伸出，且与邻近细胞交织成网状。

图2显示了经流式细胞术分选PSA-NCAM标记呈阳性的人诱导型神经元细胞克隆。红色方框表示的是筛选阳性细胞的范围。

图3显示了人诱导型神经元细胞在体外的免疫荧光染色结果，其中，a是神经元核（NeuN）蛋白染色（红色），NeuN是现今识别神经元的标准免疫细胞化学标志物；b是突触素（Synapsin）蛋白染色（红色点状），Synapsin是神经元轴突终末特异性标志物；细胞核均使用DAPI染色（蓝色）。

图4显示了人诱导型神经元细胞移植于小鼠脑内后在倒置荧光显微镜下观察脑切片的结果，其中，通过绿色荧光蛋白标记的人诱导型神经元细胞（绿色）在小鼠脑内保持形态完整，具有神经细胞样形态和突起。

图5显示了人诱导型神经元细胞移植于小鼠脑内后的免疫荧光染色结果，其中，a是乙酰胆碱转移酶（ChAT）蛋白染色（红色点状），ChAT是胆碱能神经元的标志酶，而乙酰胆碱作为神经递质在神经冲动传递中起重要作用；b是Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体（VGLUT1）蛋白染色（红色），VGLUT1标记谷氨酸能神经元，而谷氨酸是中枢神经系统主要的兴奋性神经递质，研究发现其在癫痫的发病中发挥重要作用；细胞核均使用DAPI染色。

图6显示了利用脑片膜片钳技术记录人诱导型神经元细胞在被移植于小鼠脑内后的神经电生理信号，其中，a是在细胞贴附模式（cell-attached mode）下记录到的动作电流信号；b是在全细胞模式（whole-cell mode）下记录到的自发性动作电位信号；c是在电流钳模式（current clamp）下记录到的注入不同大小去极化电流后，细胞产生快速变化的诱发性动作电位信号。

图7显示了人诱导型神经元细胞在被移植于小鼠脑内后，响应外源添加神经递质抑制剂γ-氨基丁酸（GABA）对神经电活动的影响情况，其中，a是在未有外源GABA影响下记录到的自发性电信号；b是在外源施加了10 μM GABA于细胞表面的情况下记录到的自发性电信号；c是在停止外源施加GABA，并用常规人工脑脊液冲洗细胞一段时间后记录到的自发性电信号。

图8显示了人诱导型神经元细胞被移植于闭合性脑外伤模型免疫缺陷小鼠脑内后，受体运动能力的变化情况，其中，a是细胞移植前，随机分成的3组脑损伤模型小鼠（n=10）运动能力的评分情况，数据显示，各组之间没有显著性差异（p>0.05）；b是进行细胞移植后，分别对对照组、人成纤维细胞移植组和人诱导型神经元细胞移植组小鼠运动能力进行评分的情况，数据显示，人诱导型神经元细胞移植组与另外两组间均有显著性差异（p≤0.05）。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中，未具体注明实施条件和方法处，均为按照常规实验方案，如《分子克隆实验指南（第三版）》（[美]J.萨姆布鲁克，D.W 拉塞尔著，2003）中所述方法或试剂生产商建议方案来开展。

实施例1：成人皮肤细胞的分离和培养

从接受神经外科手术的病人脱落头皮中获取头皮组织并分离成人皮肤细胞。具体分离培养方法如下：将术中清除的头皮组织立即置于冰预冷的PBS中，反复用PBS冲洗去除血块；胶原酶+胰酶两步消化法获得单细胞悬液，置于含2 mmol/L谷氨酰胺、10 % FBS、50 U/ml青霉素/50 U /ml链霉素的DMEM细胞培养液中（均购自GIBCO公司）；调整细胞密度至1×l0⁵/m1，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱进行培养，24h后更换新培养液；将原代培养5d后的细胞离心，用0.25％的胰蛋白酶消化，用所述DMEM细胞培养液终止消化反应，将细胞悬液按5×l0⁵/m1密度传代接种于培养瓶中，在37℃、5%CO₂条件下静置培养，每3天换液1次，每6天按1:2或1:3传代。

将所获原代细胞在培养液中培养3~5代后，根据形态学等特点，剔除杂细胞，纯化所得细胞类型。

实施例2：病毒载体构建及包装

以人总cDNA为模板，扩增Sox2、Ascl1和Myt1l等3个基因；按常规分子克隆方法将基因整合进慢病毒基础表达载体（Addgene公司）；使用293T细胞（Invitrogen公司）包装并大量扩增已携带有转录因子的重构病毒载体。所有基因克隆产物均经PCR和基因测序检测验证。

实施例3：病毒载体感染人皮肤细胞

在转染前一天，将皮肤细胞以8×10⁵/m1 的密度接种；将含有Sox2、Ascl1和Myt1l等3个基因的病毒表达载体等量混合，加入到培养皿中，培养过夜；转染24小时后，用新鲜的神经细胞培养液替换掉含病毒的培养液；培养72小时后检测外源基因的表达情况。每天观察转染细胞的形态学变化，收集转变为具有神经元样形态特征的细胞。

神经细胞培养液的主要成分是DMEM/F12基础培养液（GIBCO公司），并添加有1×GlutaMax（Invitrogen公司）、2% B27无血清培养基添加因子（Invitrogen公司）、1% N2神经细胞生长添加剂（Invitrogen公司）、100 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF，Sigma公司）、100 ng/ml表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF，Sigma公司）、0.16% D-葡萄糖（Sigma公司）和0.2 mM抗坏血酸（Sigma公司）。

实施例4：流式细胞术筛选人诱导型神经元细胞克隆

收集前期挑选的具有典型神经元形态特征的细胞，常规酶消化，PBS洗涤，制成单细胞悬液，细胞密度为1×10⁶/ml。取300 μl细胞，加入1 μl抗人的PSA-NCAM抗体（Millipore公司），4℃避光孵育30 min，2000 r/min离心5 min，弃上清，Buffer洗涤，吹打混匀。BD FACS Aria流式细胞分选仪上机检测，筛选PSA-NCAM阳性细胞克隆。

实施例5：免疫细胞化学反应鉴定人诱导型神经元细胞

细胞用4%多聚甲醛室温固定10 min，PBS冲洗，用含5%正常山羊血清或驴血清（Millipore公司）、1%BSA、0.1% Triton X-100的PBS处理45 min。一抗包括NeuN，Synapsin；一抗使用浓度按试剂盒提供的使用浓度；二抗使用Cy3 标记的驴抗兔IgM（1:200，Invitrogen），Alexa Fluor 555标记驴抗小鼠IgG（1:200，Invitrogen）。细胞核染色采用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，Sigma公司）。

实施例6：制作闭合性脑外伤小鼠模型

参照文献（Nawashiro H, Messing A, Azzam N, et al. Mice lacking GFAP are hypersensitive to traumatic cerebrospinal injury. Neuroreport 1998;9:1691-1696及Okuyama S, Imagawa Y, Ogawa S, et al. The effect of VA-045 on disturbance in consciousness in experimental animal models. Res Commun Chem Pathol Pharmacol. 1993;82(1):91-100）的方法制作闭合性脑外伤小鼠模型。具体为：将麻醉好的小鼠固定在泡沫平台上， 用直径约为5 mm的钢珠以800~200 g-cm的力量， 通过撞击矢中线一侧顶骨造成闭合性脑外伤模型。

实施例7：人诱导型神经元细胞移植及体内鉴定

通过立体定向，将带有GFP标记的人诱导型神经元细胞移植于闭合性脑外伤模型免疫缺陷小鼠脑内，移植方向为沿受损一侧皮层的前后轴，共设置5个移植位点，每个位点约注入1 ×10⁵个细胞。

移植6~8周后通过观察脑部形态，并对脑组织切片行HE染色，检查是否有肿瘤产生。制作小鼠脑冰冻切片的基本步骤为：小鼠经左心室先后灌注0.9%生理盐水20ml，4%多聚甲醛20ml；固定完成后断头取脑置于4%多聚甲醛中固定4~6h，分别经15%、30%蔗糖梯度脱水后行冰冻切片，切片厚度约为10-30μm。

利用组织免疫化学法，检测所移植人诱导型神经元细胞在受体脑内的存活、分布和分化情况，基本操作参照前述脑冰冻切片制作方法和上述实施例5进行。

利用脑片膜片钳技术分析人诱导型神经元细胞在所移植小鼠脑内的电生理特征。离体脑片制备的基本步骤为：小鼠行腹腔注射麻醉，快速断头取脑，浸入预先冰冷且持续通混合气体（95% O₂+5% CO₂）的人工脑脊液中，其配方为（单位mM）：254 sucrose，10 D-glucose，25 NaHCO₃，2 CaCl₂，3 KCl，2 MgSO₄ 和1.25 NaH₂PO₄ （pH 7.4）；将脑组织固定于振动切片机（Leica公司）上，冠状切片，厚度约为300μm，28~32℃条件下预孵育1 h，以利于脑片活性的恢复。

微电极用两步法拉成，充灌电极液后的电阻在2～3MΩ之间。将微电极连于膜片钳仪（Axopatch 700B，Axon USA）的探头上，将单细胞置于浴槽中，人工脑脊液以3ml/min恒速灌流冲洗细胞表面，灌流用人工脑脊液成分包括（单位mM）：125 NaCl，2.5 KCl，1.25 NaH₂PO₄，25 NaHCO₃，10 D-glucose，2 MgSO₄ 和1 CaCl₂。形成高阻封接（>10GΩ）后，用脉冲式抽吸打破细胞膜，形成全细胞构型，用电压钳和电流钳模式进行刺激和记录。实验过程由pCLAMP 9.0（Axon Instrument）控制，数-模转换器完成刺激信号的产生、反馈信号的采集及数据分析，信号输入经过1KHz的滤波。实验在室温（19～22℃）下进行，检测单个人诱导型神经元细胞的电信号。检测指标包括：在细胞贴附模式（cell-attached mode）下记录动作电流信号；在全细胞模式（whole-cell mode）下记录自发性动作电位信号；在电流钳模式（current clamp）下记录注入不同大小去极化电流后，细胞产生快速变化的诱发性动作电位信号等。

实施例8：评价人诱导型神经元细胞对脑损伤小鼠运动能力改善的影响

从移植术后第1天起，对小鼠进行开放场式（open filed）试验。在恢复阶段早期，可观察到后肢运动受限，小鼠无力支撑体重以至于拖着躯干、后腿和臀部；在恢复阶段中期，小鼠逐渐可以走路并支撑自己的体重，前后肢的协调运动开始恢复；在恢复阶段后期，一些精细运动如持续协调步态等逐步恢复。依据改良的BBB运动能力评分标准对以上几个阶段按周评分，持续12周，对所获数据进行统计分析处理，评价人诱导型神经元细胞对脑损伤小鼠运动能力改善的影响。

Claims (13)

1.一种从人皮肤细胞直接诱导神经元细胞的方法，其特征在于，将包含重编程转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l 的cDNA导入成人皮肤细胞后，筛选表达人神经元细胞标记物的细胞克隆，直接制得能稳定传代的诱导型人神经元细胞；包括步骤：

（1）收集和培养人皮肤细胞，所述的人皮肤细胞来源于离体的成人头皮组织：

（2）筛选可促成人皮肤细胞转变为神经元细胞的关键诱导因子：

从备选因子中：Ascl1、Brn2、Lhx2、Myt1l、Pax6、Sox2，经过不同组合的测试，找到关键因子组合：Sox2、Ascl1和Myt1l；

（3）构建携带转录因子的慢病毒载体：

分别将转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l的cDNA连接到慢病毒穿梭质粒表达载体上；用293T细胞进行病毒包装和生产；用绿色荧光蛋白作为报告基因；

（4）病毒感染离体成人皮肤细胞：

采用步骤（3）所获得的病毒液，感染步骤（1）获得的成人皮肤细胞，培养1天后将细胞转置于不含病毒液的神经元细胞培养液中；

（5）筛选表达人神经细胞标志蛋白的细胞克隆：

挑选具有典型神经元形态的细胞，筛选出表达人神经细胞标志蛋白PSA-NCAM的阳性细胞克隆。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）的cDNA通过慢病毒载体导入所述的人皮肤细胞。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）的慢病毒载体以组合形式携带转录因子Sox2、Ascl1和Myt1l。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）的慢病毒载体主要包含5’端的巨细胞病毒立即早期启动子MIEP，目的基因，多克隆位点以及3’端的SV40 PolyA位点。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（5）筛选过程中，采用流式细胞术分选多唾液酸-神经细胞黏附分子标记呈阳性的细胞克隆。

6.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）的神经元细胞培养液为DMEM/F12基础培养液，其中添加有B27、N2、bFGF 和EGF生长因子。

7.一种从人皮肤细胞直接诱导的神经元细胞，其特征在于，所述的神经元细胞通过权利要求1所述的方法制得，具有特征：

（1）在体外表达人神经元细胞特异性标志蛋白；

（2）在体内可存活并发挥功能。

8.按权利要求7所述的神经元细胞，其特征在于，所述的标志蛋白包括神经元核蛋白和突触素蛋白。

9.按权利要求7所述的神经元细胞，其特征在于，将所述的神经元细胞移植后具有以下特征：

（1）移植后的神经元细胞可在体内存活；

（2）移植后的神经元细胞在体内表达神经元细胞亚类特异性标志蛋白；

（3）移植后的神经元细胞在体内参与移植受体神经电信号的传导；

（4）移植后的神经元细胞在体内改善脑损伤的运动功能。

10.按权利要求9所述的神经元细胞，其特征在于，所述的特征（1）中，通过下述指标检测诱导型人神经元细胞存活状态：倒置荧光显微镜下观察到小鼠脑内存在形态完整、带有绿色荧光蛋白标记的外源移植诱导型人神经元细胞。

11.按权利要求9所述的神经元细胞，其特征在于，所述的特征（2）)中的标志蛋白包括乙酰胆碱转移酶蛋白和Ⅰ型囊泡膜谷氨酸转运体。

12.按权利要求9所述的神经元细胞，其特征在于，所述的特征（3）中，检测神经电生理的指标包括：在细胞贴附模式下记录到所移植神经元细胞的动作电流信号；在全细胞模式下记录到所移植神经元细胞的自发性动作电位信号；在电流钳模式下记录到的注入不同大小去极化电流后，所移植神经元细胞产生快速变化的诱发性动作电位信号。

13.按权利要求9所述的神经元细胞，其特征在于，所述的特征（4）中，检测移植后的神经元细胞在体内影响脑损伤后运动能力改善的指标包括：依据改良的BBB运动能力评分标准，观察到移植后的诱导型人神经元细胞在体内有助于脑损伤后运动功能的改善。

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