KR20120136638A - 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법 및 방법에 의해 분리된 신경전구세포에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 얻는 단계; (b) 상기 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 PSA-NCAM 항체 결합된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법 및 방법에 의해 분리된 신경전구세포에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 기존의 방법과 비교하여 분화과정을 단축하여 분화 과정 중에 생길 수 있는 변수에 의한 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점을 극복할 수 있다. 또한 세포의 계대가 진행되어도 신경전구세포의 특성이 유지되며 본 발명의 분리방법에 의한 신경전구세포는 종양 형성능이 낮고 분화능 및 분열능이 우수한 신경전구세포로 기대된다.

Description

전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법{Methods for Separating and Culturing of Neural Precursor Cell derived Pluripotent Stem Cells}

본 발명은 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법 및 방법에 의해 분리된 신경전구세포에 관한 것이다.

인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포를 유도하는 기술은 꾸준히 연구되고 있다[1-2]. 분화 유도된 신경전구세포는 특정 신경세포로 분화되거나, 신경전구세포 혹은 더 분화된 신경세포 단계에서 뇌신경계 질환 동물 모델에 이식되어 그 임상적 적용 가능성을 확인하는데 이용되고 있다[3-4]. 하지만 기존의 방법은 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터 특정 신경세포로의 분화 과정까지 여러 단계의 분화 과정을 거쳐 오랜 시간이 소요되어(예컨대, 1달 이상), 분화 과정 중에 생길 수 있는 여러 변수들(실험자의 숙련도, 분화에 사용되는 시약 및 오염)에 의해 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점이 존재하였다. 이런 문제점들을 해결하기 위해 분화 중간 단계인 신경전구세포 단계에서 그 고유의 특성, 즉 1) 신경계를 구성하는 모든 종류의 신경세포 혹은 교세포로의 분화능력, 2) 더 나아가 신호전달기전의 조절을 통해 특정 신경세포 혹은 교세포로 분화될 수 있는 능력, 3) 줄기세포의 기본특성인 자가 증식능(self-newal)을 유지하면서 증식시키는 기술을 개발하는 연구가 진행되고 있다. 일례로, 태아에서 분리한 신경줄기세포의 증식법을 응용한 구형의 신경전구체 덩어리 형태로 부유배양을 시키면서 기계적인 분쇄법을 통한 유지 배양 및 증폭 기술이 최근 개발되었다[5]. 하지만 이 방법은 순수한 신경전구세포를 유지 및 증식시키기에 실험자의 숙련도에 의해 크게 차이가 나고, 매우 많은 시간과 노력이 소모되는 방법이라는 단점이 있다. 이 문제점을 해결하기 위해 신경전구세포의 단일층 부착배양(monolayer-attachment culture) 기술이 최근 개발되고 있는 추세이다[6-7]. 이 방법은 간단히 말해 신경전구세포를 기존의 동물세포의 배양같이 배양기 바닥에 한 층의 세포로 부착시켜 트립신(trypsin)같은 효소를 이용해 계대배양을 하는 것을 말한다. 2005년 영국의 Austin Smith 박사 연구진에 의해 가장 먼저 개발된 단일층 부착배양을 통한 신경전구세포의 분리배양법을 살펴보면 인간 배아줄기세포 배양 중에 자발적으로 분화 발생한 신경상피세포(neuroepithelial cells)의 특성을 갖는 꽃모양 신경전구체(neural rosette) 덩어리를 현미경 하에서 육안으로 기계적으로 분리 및 효소 처리하여 단일 세포 현탁액으로 만든 다음 배양기 바닥에 부착시켜 특정 신경세포 분화배지에서 배양하는 방법을 이용하고 있다. 이 방법은 여러 계대(passage)를 걸쳐 유지 및 증식 배양이 되고 신경세포 혹은 교세포로의 분화 할 수 있는 능력이 있는 것으로 알려져 있다. 하지만 이러한 방식으로 배양되는 신경전구세포는 특정 신경세포 혹은 교세포로의 분화능이 현저히 떨어지는 것으로 알려져 특정 뇌신경계 질환 치료를 위한 신경세포 분화(예컨대, 파킨슨 병 치료를 위한 도파민 신경세포의 분화)에 적합하지 않는 단점이 있다[8]. 최근에 독일의 Oliver Br박사 연구진에 의해 개발된 다른 방법은 인간 배아줄기세포로부터 분화 유도된 신경 로제트를 육안 분리하여 짧게 3차원 부유배양 후 효소처리를 통해 배양기의 바닥에 재부착 시킨 상태에서 반복적인 계대 배양하는 방법이다. 이 방법을 통해서 유지 배양되는 신경전구세포는 초기단계의 신경전구세포(primitive neural precursor)의 특성을 유지하므로 세포 신호전달기전의 조절을 통해 특정 신경세포로의 분화도 가능한 것으로 알려져 있다. 하지만 이들 기존 방법들은 초기 신경전구세포를 분리할 때 실험자의 경험에 의존하는 육안 분리법을 이용하므로 매번 그 순도를 담보하지 못하거나 일부 신경전구세포가 아닌 세포가 섞여 있을 단점이 있을 수 있다. 특히 최근 인간 배아줄기세포주간의 분화특성 때문에 특정 계열(lineage)의 세포로 분화에 차이가 있다고 알려져 있다[9]. 또한 최근 개발된 체세포 리프로그래밍 기술을 이용해 수립된 인간 역분화줄기세포의 경우 인간 배아줄기세포에 비해 신경세포로의 분화능이 떨어진다는 보고가 있는 바, 다양한 배아 및 역분화 줄기세포로부터 비슷한 수율로 순수한 신경전구세포를 분리하기에 큰 어려움이 있을 것이라는 것은 충분히 예상 가능하다[10]. 따라서 어떤 종류의 전분화능 줄기세포에서도 효율적이고 고순도의 신경전구세포를 분리하여 그 성질을 유지하면서 증식배양을 하는 기술 개발이 절실하다. 따라서 본 기술은 기존에 본 연구진에 의해 개발된 모든 전분화능 줄기세포에 적용 가능한 고효율 신경분화법에 이어 개발된 기술로, 신경전구세포 단계에서 특이하게 발현되는 표면항원인 PSA-NCAM을 발현하는 세포를 MACS법을 통해 선택적으로 분리하여 고순도의 신경전구세포 만을 유지 배양 및 냉동하여 신경세포 및 교세포로 분화시키는 방법을 기술하고 있다[11]. 현재까지 특정 표면 항원을 이용한 세포 분리법을 통해 신경전구세포를 분리한 다음 그 특성을 유지하면서 장기간 유지 배양하는 기술은 알려진 바 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 뇌신경계 질환 치료를 위한 세포 대체 치료제를 개발하기 위해 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 순수분리 및 유지배양 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 신경 마커인 PSA-NCAM 단백질의 항체를 이용하여 분리하는 경우에는 비균질 세포 파퓰레이션에서 신경전구세포를 매우 효과적으로 분리할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 분리 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법에 의해 분리된 신경전구세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 뉴우런(neuron)을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte)를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 성상세포(astrocyte)을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells)로부터 신경전구세포(neural precursor cells)의 분리 방법을 제공한다:

(a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 얻는 단계;

(b) 상기 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 PSA-NCAM 항체 결합된 세포를 분리하는 단계.

본 발명자들은 뇌신경계 질환의 치료를 위한 세포 대체 치료제를 개발하기 위하여 전능성 줄기세포를 효과적으로 분리할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 항-PSA-NCAM 항체를 이용하여 세포를 분리하는 경우에 고순도의 세포전구세포를 분리할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 전능성 줄기세포로부터 신경전구세포의 분리 방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션의 준비

본 발명에 따르면, 전능성 줄기세포를 신경 로제트로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 준비한다.

상기 세포 파퓰레이션은 다양하게 준비될 수 있다. 예를 들어, 전능성 줄기세포(예컨대, 배아줄기세포 및 유도 전능줄기세포)를 신경 로제트로 분화시킨 세포 파퓰레이션이다. 전능성 줄기세포를 분화시킨 결과물에는 일반적으로 모든 세포들이 분화세포를 포함하지 않으며, 비균질 파퓰레이션을 이룬다. 따라서, 신경 로제트를 세포 치료제로 이용하기 위해서는 신경전구세포를 순수하게 분리해야 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도전능줄기세포(induced pluripotent stem cells: iPSCs)이다.

바람직하게는 전능성 줄기세포는 배아줄기세포이다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 전능성 줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 인간 전능성 줄기세포이다.

보다 더 바람직하게는, 상기 세포 파퓰레이션은 전능성 줄기세포는 신경전구세포로 분화시킨 세포 파퓰레이션이며, 상기 세포 파퓰레이션은 비균질 신경전구세포를 포함한다.

본 명세서의 용어 ‘신경 로제트’는 인간 배아줄기세포의 신경분화 과정의 초기단계의 신경줄기세포를 말하며, 신경 로제트(neural rosette)는 원주형의 방사상 형태를 갖는다. 상기 신경 로제트는 Pax6 및 Sox1 같은 초기 신경외배엽(neuroectodermal)마커를 발현하는 세포로 구성되며, 다양한 뉴우론 세포 및 신경교세포로 분화할 수 있다.

상기 ‘신경줄기세포’는 자기재생능 및 다분화능 세포로 신경계의 주된 세포를 생산한다.

본 명세서의 용어 ‘세포 파퓰레이션’은 줄기세포가 신경 분화 자극에 의해 신경전구세포로 분화가 진행된 세포이다.

상기 ‘신경 분화 자극’은 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 무혈청 배지(Tropepe V et al., Direct neural fate specification from embryonic stem cells: A primitive mammalian neural stem cell stage acquired through a default mechanism. Neuron. 30:6578(2001)), FGFs(fibroblast growth factors), Wnt 및 RA(retinoic acid)와 같은 모르포겐(morphogens)의 처리(Ying QL et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21:183186(2003))에 의해 분화 할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

바람직한 구현예에 따르면, 상기 비균질 신경전구세포는 CNS(central nervous system)-타입 신경전구세포 및 PNS(peripheral nervous system)-타입 신경전구세포를 포함한다.

본 명세서에 있어, 용어 ‘CNS-타입 신경전구세포’는 뉴우론(neuron), 올리고덴드로사이트(oligodendrocytes) 또는 성상세포(astrocytes)로 분화할 수 있다.

본 명세서에 있어, 용어 ‘PNS-타입 신경전구세포’는 말초신경계를 이루는 세포들로 분화되는 신경능(neural crest)-타입 전구체이다. 신경능-타입 전구체는 주로 말초신경계를 이루는 신경세포를 만드는 전구세포이기는 하지만 중배엽성 세포들(예컨대, 지방세포 및 근육세포)들의 원시세포로 알려져 있어 PNS-타입 신경전구세포의 세포를 분리해 내는 과정이 요구된다.

단계　(b)： 세포 파퓰레이션에 PSA - NCAM 　항체를 접촉

이어, 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM 항체를 접촉시킨다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

PSA-NCAM에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 PSA-NCAM 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, PSA-NCAM을 언급하면서 사용되는 용어 “항체”는 PSA-NCAM에 대한 특이 항체로서, PSA-NCAM 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

단계(b)는 PSA-NCAM 항체를 세포 파퓰레이션에 처리하는 단계로, PSA-NCAM 항체는 CNS-타입 신경전구세포에 특이적으로 결합한다.

단계 (c): PSA - NCAM 항체 결합된 세포의 분리

이어, PSA-NCAM 항체가 결합된 세포를 분리한다. PSA-NCAM 항체가 결합된 세포는 CNS-타입 신경전구세포이다.

바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 분리된 CNS-타입 신경전구세포는 로제트 타입 신경줄기세포(neural stem cell: NSC) 및 NSC^{FGF / EGF} 특성을 모두 갖는다.

상기 로제트 NSCs는 NSC^{FGF / EGF}에 비해 훨씬 초기상태(primitive)의 신경전구세포로 모든 중추 및 말초신경계를 구성하는 세포들로 모두 분화할 수 있다. 세포신호 전달기전의 조절에 의해 특정 신경세포, 교세포로 분화할 수 있는 능력이 있으며 강한 세포분열능을 가지고 있어 동물모델에 이식하였을 경우 과증식에 의한 종양 형성이 관찰된다. 또한 PLZF 또는 DACH1같은 특정 단백질들이 발현되어 마커로 사용될 수 있다.

반면에 NSC^{FGF / EGF}는 분화능이 로제트 NSC에 비해 떨어져 일부 중추신경계를 구성하는 세포들로만 분화하며 특정 신경세포 및 교세포로의 분화유도가 힘든 경향이 있다. 또한 이식 시 종양 형성의 가능성이 매우 희박하다.

바람직하게는, 항체를 이용한 상기 세포 분리를 위해 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters: FACS), 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter: MACS) 및 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis) 방법을 이용하며, 보다 바람직하게는 MACS를 이용하여 실시한다.

만일, 본 발명을 MACS를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 다음과 같이 실시할 수 있다:

본 발명에서 MACS는 직접적 표지방법 및 간접적 표지방법으로 실시할 수 있다.

예를 들어, 직접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 자성입자에 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 PSA-NCAM 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다.

예를 들어, 간접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 적합한 중개물질이 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 예컨대, 형광물질이 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 형광물질 이외에도, 중개물질은 스트렙타비딘, PSA-NCAM 항체의 Fc 부위에 특이성을 갖는 항체 및 아비딘을 포함한다. 중개물질이 결합된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨 다음, 자성입자에 결합되어 있고 상기 중개물질에 특이성을 갖는 항체를 처리한다. 그런 다음, 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 PSA-NCAM 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다.

MACS는 기본적으로 면역자기 분리 과정에 따른 것으로서, 상기 과정의 일반적인 내용은 미합중국 특허 제 5,385,707 호, 제 5,541,072 호, 제 5,646,001 호, 제 6,008,002 호 및 제 6,153,411 호에 개시되어 있으며, 이용되는 자성 입자 또는 마이크로비드 및 분리기는 Miltenyi Biotech(독일연방국)에서 용이하게 구입할 수 있다.

본 발명은 FACS를 이용하여 실시할 수 있다. FACS는 Flow Cytometry First Principles by Alice Longobardi Givan. ISBN 0471382248 및 Practical Flow Cytometry by Howard M. Shapiro. ISBN 0471411256에 개시된 방법에 따라 실시할 수 있다.

보다 더 바람직하게는 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 MACS에 의해 실시한다. 보다 더욱 더 바람직하게는, 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 간접적 표지를 이용하는 MACS에 의해 실시한다.

예를 들어, 형광물질로 표지된 PSA-NCAM 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 상기 형광물질에 특이적인 항체가 결합된 자성입자(또는 자성 마이크로비드)를 결합시키고, 그런 다음 분리기를 이용하여 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다. 이 경우, 상기 PSA-NCAM 항체에 결합된 형광물질은 각각 다른 물질 또는 동일한 물질일 수 있다.

이용 가능한 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), 에오신, 카르복시플루오르세인, 플루오르세인 아마이다이트, 로즈 벤갈, 다이라이트 플루오르, 메틸린 블루, 쿠마린 및 로다민을 포함하지만 이에 한정된 것은 아니다.

본 발명에 따르면 상기 방법은 99% 이상의 신경전구세포 순수도(purity)를 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 분리방법에 의해 신경전구세포를 제공한다.

보다 바람직하게는, 상기 신경전구세포는 CNS-타입 신경전구세포이다.

보다 더 바람직하게는, 상기 CNS-타입 신경전구세포는 로제트 타입 신경전구세포 및 NSC^{FGF / EGF} 특성을 모두 갖는다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 뉴우런을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 올리고덴드로사이트를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 성상세포를 제공한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 분화 과정 중에 생길 수 있는 변수에 의한 분화 수율이 일정하게 유지되지 못하는 단점을 극복할 수 있다.

(b) 세포의 계대가 진행되어도 신경전구세포의 특성이 유지될 수 있다.

(c) 기존의 방법과 비교하여 분화과정을 단축할 수 있으며 보다 순순한 분리방법을 제공한다.

(d) 본 발명의 분리방법에 의한 신경전구세포는 종양 형성능이 낮고 분화능 및 분열능이 우수한 신경전구세포로 기대된다.

도 1은 인간 전분화능 줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화 유도를 보여준다. (a)는 인간 배아줄기세포로부터 신경전구세포로의 분화를 유도하기 위하여 dorsomorphin과 SB431542를 동시에 처리한 배아체(Embryoid bodies: EBs)의 모습을 보여준다. (b)는 배아체를 매트리겔 코팅된 배양기 바닥에 붙인 후 N2 배지에서 5-6일 동안 배양 중인 콜로니의 모습이다. 가운데 부분에 여러 개의 꽃모양을 나타내는 신경 로제트(neural rosette) 구조들이 관찰된다. (c)는 (b)사진의 박스부분을 확대한 사진으로, 개개의 신경 로제트 구조들이 붉은색 점선의 원으로 표시되어 있다. (d)는 신경전구세포의 전형적인 마커인 Sox1 및 Pax6로 염색한 후에 신경 로제트 구조부분을 확대하여 관찰한 사진으로 Sox1 및 Pax6는 전사인자로서 핵에 특이하게 위치하여 염색되어 핵에서 강하게 염색되어 겹쳐진 것을 볼 수 있다. (e)는 신경 로제트 구조의 가운데 루멘(lumen)부분에서 특징적으로 발현되는 Zo-1(초록색)이 확인됨을 보여준다. (f)는 신경전구세포의 또 다른 마커인 PSA-NCAM도 발현을 나타낸다.
도 2는 인간 전분화능 줄기세포로부터 분화유도 된 신경전구세포에서 관찰되는 PSA-NCAM 양성 및 음성세포를 보여준다. (a)는 분화 유도된 신경 로제트를 분리하여 N2B27 배지에서 배양 중인 세포에서 PSA-NCAM 항체로 면역염색을 해 보면 PSA-NCAM이 강하게 발현되는 신경 로제트 중심부세포와는 달리, 밖으로 이동해 나온 세포는 PSA-NCAM에 의해 염색되지 않는 것을 확인할 수 있었다. (b) 및 (c)는 MACS에 의해 분리된 PSA-NCAM 양성 및 음성세포들의 모습을 보여준다.
도 3은 MACS 후 분리된 PSA-NCAM 음성세포의 특성분석을 보여준다. (a)는 MACS 후 pass-through로 나온 PSA-NCAM 음성세포가 신경능 전구세포의 모습과 유사한 것을 보여주며, (b) 및 (c)는 신경능 전구세포의 특이적 마커인 AP2와 HNK-1 를 발현하는 것을 확인한 결과이다. (d)는 신경능 전구세포의 분화과정에 관련되어 있는 여러 전사인자들의 발현이 PSA-NCAM 양성세포에 비해 높은 것을 확인한 RT-PCR 결과를 보여준다.
도 4는 MACS 후 분리된 PSA-NCAM 양성세포의 특성분석을 분석한 결과이다. (a-b)는 MACS에 의해 분리된 후 PSA-NCAM 항체로 형광면역분석(FACS)을 한 결과 -85% 정도가 PSA-NCAM 양성으로 확인되었고, 이후 유지 배양하면서 그 비율은 -95% 로 높아진 결과이다. (c)는 Nestin과 Sox1으로 형광염색을 한 후 직접 카운팅을 한 결과 형광면역분석과 유사한 결과를 보여준다. (d-e)는 유지 배양중인 신경전구세포는 세포 모양의 큰 변화 없이 각종 신경전구세포 마커(Sox1/2, Nestin 및 Musashi1)들을 비슷한 수준으로 유지하고 있음을 확인한 면역형광염색법 결과이다. (f)는 신경전구세포 마커(Sox1 및 Pax6)의 발현을 RT-PCR을 통해서도 확인한 결과이다. 인간 텔로머레이즈 역전사효소(human Telomerase Reverse Transcriptase: hTERT)의 발현이 유지되었으며, 소 뇌(Fetal brain)의 cDNA는 대조군으로 사용하였다.
도 5는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포의 자가재생산(self-renewal) 특성 및 정상 핵형의 유지를 확인한 결과이다. (a)는 분열되는 세포의 마커인 Ki67을 통한 면역염색 결과, 배양되는 신경전구세포는 계대가 진행되어도 그 분열능을 잃어버리지 않고 자가재생산 하는 것을 확인한 결과이며, (b)는 오랜 계대 배양 후에도 정상핵형을 유지하는 것을 확인한 결과이다.
도 6는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포에서 SSEA4+ 세포의 존재 가능성 확인한 실험이다. MACS 후 초기에 유지 배양되는 신경전구세포에서 SSEA4로 표지되는 세포의 비율이 -7% 정도였으나 계대가 진행되면서 그 비율이 음성대조군의 비율(0.5% 수준)과 거의 유사한 0.7%로 확인되었다. 하지만 초기에 검출되는 약 7%도 미분화 세포라기보다는 초기 신경외배엽에서 확인되는 SSEA4+ 인 것으로 예측된다.
도 7는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포 중 로제트 type NSC의 특성을 분석한 결과이다. (a)는 유지 배양되는 신경전구세포가 계대가 지속되어도 형태학적으로 로제트 구조를 유지하고 있으며, (b)는 로제트 type NSC 특이적 마커 (PLZF, DACH1, PLAGL1 및 NR2F)의 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다. (c)는 특히 PLZF의 경우 계대가 지속될 때 그 발현을 면역형광염색법을 통해서 확인한 결과이다.
도 8는 MACS 후 유지 배양되는 신경전구세포 중 NSC^{FGF / EGF} 의 특성을 분석한 결과이다. (a)는 유지 배양되는 신경전구세포는 NSC^{FGF / EGF} 의 전형적인 마커들 중에 일부(PMP2 및 HOP)는 발현이 RT-PCR을 통해 검출되지 않으나, 일부 마커의 경우 (AQP4 및 S100b)는 발현이 확인되었다. 특히 S100b의 경우는 면역염색으로도 확인되는 바 (b)에서 볼 수 있듯이, NSC^{FGF / EGF} 의 특성도 일부 보이는 것을 확인한 결과이다. 소 뇌의 cDNA를 양성대조군으로 사용하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

인간 줄기세포(hESC) 배양

인간 줄기 세포주 H9(Human Embryonic Stem Cell: hESC, P31-45, WiCell Inc, Madison, Wisconsin, 미국)를 20% KSR(Knockout Serum Replacement, Invitrogen, Carlsbad, 미국), 1×비필수 아미노산(Invitrogen, 미국), 0.1 mM β-머캅토에탄올(Sigma, St. Louis, MO, 미국) 및 4 ng/㎖ bFGF(basic fibroblast growth factor, Invitrogen, 미국)가 첨가된 DMEM-F12 배지에서 배양하였다. hESC 세포들을 유사분열적으로 정지된 STO(ATCC) 피더 세포층에서 성장시켰다. 5-7일 동안 매일 공지된 계대배양 방법[19]에 의하여 hESC 콜로니들은 신선한 피더 층에 옮겼다.

인간 전분화능 줄기세포의 신경전구세포 분화 유도

30분 동안 IV형 콜라게나아제(Invitrogen, 미국)를 2 ㎎/㎖로 처리한 후 피더 세포층으로부터 hESC 콜로니를 분리시켜 배아체(embryoid bodies: EB) 형성을 하도록 하였으며, bFGF가 없는 ESC 배양 배지가 포함된 페트리 디쉬로 이동시켰다. EB를 형성시키는 동안, 5 의 DM(dorsomorphin, Sigma, 미국) 및 5-10 의 SB431542(Calbiochem, San Diego, CA, 미국)를 배지에 첨가하였으며, 약 4일 동안 매일 한번 배지를 교환하였다. 그 다음 EB를 20 ng/㎖ bFGF가 보충된 무혈청 신경분화배지(N2 배지 DMEM/F12 plus 1×N2 첨가제, Invitrogen, 미국)가 들어 있는 매트리겔(Matrigel, BD bioscience, Maryland, 미국)이 코팅된 35 ㎜ 배양 디쉬에 부착시켜 5-6일간 추가적으로 배양하였다. EB가 부착되어 형성된 콜로니의 중심부에는 뚜렷한 신경 로제트(neural rosette) 구조가 형성되는 것을 확인할 수 있는데 이를 해부현미경 상에서 가늘게 뽑은 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용해 물리적으로 분리해 낸 후, 200 p 피펫을 이용해 작은 덩어리들로 분쇄하여 다시 매트리겔이 코팅된 60 ㎜ 디쉬에 부착시켜 N2B27 배지에 (DMEM/F12에 1×N2 및 1×B27 첨가제 및 20 ng/㎖의 bFGF가 첨가된 배지)로 일주일간 추가 배양하였다.

자성면역분리법 (MACS)에 의한 PSA-NCAM 양성세포의 분리

N2B27 배지에서 일주일 간 추가 배양된 세포에 10 μM의 Y27632 (Calbiochem, 미국)을 1시간가량 처리한 다음 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후, Accutase(Milipore, Messachusetts, 미국)를 약 15분간 처리하여 완전히 단일세포로 분리된 세포 현탁액을 만들었다. 그 후 MACS 세포 분리 키트(Milteny, Bergisch Gladbach, 독일)로 제조사의 매뉴얼에 따라 항-PSA-NCAM-마이트로비드(Milteny, Cat#130-092-966)를 이용해 PSA-NCAM 양성세포를 분리하였다. 분리된 PSA-NCAM 양성세포 7-8×10⁶ 개를 매트리겔이 코팅된 60 mm 디쉬에 접종한 후 N2B27 배지로 배양하였다.

신경전구세포의 유지 배양 및 분화

세포가 배양 디쉬 바닥의 약 95%이상을 차지하게 되면 계대 배양을 실시하였다. 1 ㎖ Accutase를 3분간 처리한 다음 피펫을 이용해 2-3회 가볍게 피펫팅 해 준 다음 2 ㎖ PBS로 희석하였다. 1,500 rpm으로 2분간 원심 분리하여 상등액은 버리고 펠렛을 2 ㎖의 배지에 부유하여 같은 크기의 매트리겔이 코팅된 두 개의 배양 디쉬로 분주하였다. 배지는 매일 교환해 주었으며, 위와 같이 1 : 2의 비율로 약 2-3일에 한번씩 계대 배양하였다. 사용한 배지는 일반적으로 N2B27 배지를 사용하였다. 하지만 B27 첨가제가 생산 배치(Batch)에 따라 차이가 있어서 세포의 상태가 일정하게 유지가 되지 않는 경우가 종종 발생하는데 이때는 뉴로플렉스(Neuroplex) N2 및 G21 첨가제(Gemini, California, 미국)를 각각 N2 및 B27 첨가제 대신에 사용된 N2G21 배지를 N2B27 배지를 1:1로 섞은 배지(이하, NBG 배지)를 사용하여 해결하였다. 신경전구세포를 신경세포 혹은 교세포로 분화시키기 위해서는 유지 배양하던 신경전구세포를 매트리겔 젤이 코팅된 디쉬 혹은 커버슬립(coverslip) 위에 0.5-1×10⁵ cells/cm²로 부착시킨 다음 0.1% FBS(Fetal bovine serum)와 200 의 아스코르브산(ascorbic acid)를 첨가하고 다음 bFGF가 포함되지 않은 NBG 배지에서 약 2-3주간 더 배양하였다. 세포를 냉동보관 하기 위해서는 배양 중인 신경전구세포를 Accutase 처리 한 후 신경전구세포 냉동배지(N2B27 배지:DMSO(Demethyl sulfoxide):KSR=4:1:5)로 2×10⁶ cells 농도의 세포현탁액을 만들어 CryoFeezing 용기(Nalgene, Roschester, NY, 미국)에 담은 후 초저온냉동고(deep freezer)에 24시간 보관 후 액체질소 통에 보관하였다. 해동은 일반적인 N2B27 배지를 이용해 동물세포 해동법을 따랐다.

면역형광분석 (Fluorescence-activated cell sorting: FACS)

배양하던 세포를 Accutase로 단일세포로 완전히 분리한 다음 PBS로 1회 세척 후 2% BSA(bovine serum albumin)이 포함된 PBS로 4℃에서 5분간 블로킹하였다. 그 후 항-PSA-NCAM 항체(Milipore, 1:400) 및 항-SSEA4 항체(Santa Cruz, CA, 미국, 1:500)로 4℃에서 15분간 반응한 후 3회 PBS로 세척한 다음 2% BSA-PBS에 Alexa 2차 항체(Molecular Probe, Eugene, OR, 미국)로 10분간 4℃에서 반응하였다. 동일한 방법으로 3회 세척 한 다음 PBS 500 ㎕로 세포 현탁액을 만들어 FACS Caliber(BD bioscience)와 그 분석 프로그램으로 분석하였다.

면역염색 및 정량 분석

30분간 4% 파라-포름알데히드-PBS를 이용하여 세포들을 고정시켰다. 1구획 당 0.01% 트리톤(Triton)×100/PBS(세포내 마커)으로 처리하고, 실온에서 1시간 동안 5% 당나귀 혈청(Calbiochem, CA, 미국) 혹은 2% BSA으로 블로킹 한 후 4℃에서 일차 항체로 12시간 반응하였다. 본 연구에서 이용한 세포내 마커인 일차항체는 다음과 같다:

Oct4(1:100, Santa Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, 미국); SSEA4 (Stage Specific Embryonic Antigen 4, 500, Santa Cruz Biotechnology); Sox1(1:200, Millipore, Billerica, MA, 미국); Pax6(1:200, DSHB, Iowa, IA, 미국), Nestin(1:1000, Millipore); α-페토프로틴(α-fetoprotein: AFP, :100, Santa Cruz Biotechnology); Tuj1(1:1000, Covance, Berkeley, CA, 미국); GFAP(Glial fibrillary acidic protein, 1:300, Millipore), O4(1:200, R&D systems), Musashi-1(1:200, R&D systems), Ki67(1:100, Novus Biologicals, Littleton, CO, 미국)

일차 항체 반응 후, 결합시킨 일차 항체를 검출하기 위하여 형광(Alexa-Fluor 또는 594)-결합 2차 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, 미국)를 이용하였다. 핵을 검출하기 위하여 DAPI (4-6-diamidino-2-phenylindole, Vector, Burlingame, CA, 미국)가 포함된 마운팅 용액을 이용하였다. 올림푸스 IX71 현미경과 DP71 디지털 카메라로 세포를 관찰하였으며, 이미지-프로 플러스 ver 5.1(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, 미국)로 분석하였다. 독립적인 3번의 실험을 통해 얻어진 면역표지된 세포에 대해 7-8개의 임의표본 촬영을 통해 육안 혹은 MetaMorph (v.7.17, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 미국) 프로그램을 통해 카운팅 하여 정량적 평가를 실시하였다. 평균±표준오차로 값을 표현하였다. 통계적 유의성은 스튜던트 t-테스트 또는 SPSS 소프트웨어 버젼 12.0을 이용하는 One-Way ANOVA 테스트를 이용하였다.

RT - PCR 및 데이터 분석

제조사의 프로토콜에 따라 Easy-Spin total RNA 정제 키트(iNtRON Biotechnology, Seoul, 대한민국)을 이용하여 세포 내 존재하는 총 RNAs를 추출한 후, iScript cDNA 합성 키트(BioRad, Hercules, CA, 미국))를 이용하여 1 ㎍ RNAs를 역전사하였다. EmeraldAmp GT PCR 마스터 믹스(Takara Bio Inc, Shiga, 일본)를 이용하여 2700 Master Cycler(Applied Biosystems, 미국)에서 PCR 반응을 수행하였다. PCR의 조건은 다음과 같다:

95℃ 3분(1 단계), 95℃ 60초, 55-58℃ 60초 및 72℃ 60초를 1사이클로 하여 총 30-38 사이클(cycles)(2단계), 72℃ 5분 최종 익스텐션(3단계).

반응이 끝난 샘플은 1% 아가로즈 젤(Agarose gel)에서 전기영동을 통해 분석하였고 이티디움 브로마이드(Ethidium Bromide)염색을 통해 젤 닥(Gel Doc) 시스템(Bio Rad, 미국)에서 증폭된 DNA 절편을 분석하였다. 적어도 3회 이상의 독립적인 실험을 통해 모든 데이터를 최종 확인하였으며, 사용된 프라이머의 서열은 표 1에 나타내었다.

타깃유전자	염기서열		참고문헌
Actin	정방향	gctcttttccagccttcctt	20
	역방향	cttctgcatcctgtcagcaa
GAPDH	정방향	accacagtccatgccatcac	21
	역방향	tccaccaccctgttgctgta
dHand	정방향	agaagaccgacgtgaaagaggaga	22
	역방향	acacgggagtgtcctcttcgtatt
Snail	정방향	ctcctctacttcagcctctt	22
	역방향	cttcatcaaagtcctgtggg
Foxd3	정방향	caagcccaagaacagcctagtgaa	22
	역방향	tgacgaagcagtcgttgagtgaga
Sox1	정방향	caatgcggggaggagaagtc	21
	역방향	ctctggaccaaactgtggcg
Pax6	정방향	ggcaacctacgcaagatggc	21
	역방향	tgagggctgtgtctgttcgg
hTERT	정방향	tgtgcaccaacatctacaag	23
	역방향	gcgttcttggctttcaggat
PLZF	정방향	ctatgggcgagaggagagtg	24
	역방향	tcaatacagcgtcagccttg
DACH1	정방향	gtggaaaacacccctcagaa	24
	역방향	cttgttccacattgcacacc
PLAGL1	정방향	gcctcagtcacctcaaaagc	24
	역방향	cttaacctgtggggcaaaga
NR2F	정방향	acaggaactgtcccatcgac	24
	역방향	gatgtagccggacaggtagc
PMP2	정방향	caagctaggccaggaatttg	24
	역방향	ccacgcccttcattttacat
HOP	정방향	gcattgacagcttcactcca	23
	역방향	ggaaatgctagccacaccat
AQP4	정방향	ggaatttctggccatgctta	24
	역방향	agacttggcgatgctgatct
S100b	정방향	aaagagcaggaggttgtgga	24
	역방향	aggaaaggtttggctgcttt

실험 결과

인간 배아줄기세포로부터 효율적인 신경전구세포의 유도

인간 배아줄기세포의 분화 과정에서 BMP 신호와 Activin/Nodal 신호를 각각 Dorsomorphin(5 ㎍/㎖)과 SB431542(5-10 ㎍/㎖)의 처리에 의해 억제를 하게 되면 신경 전구세포로의 분화 유도가 더욱 촉진이 된다[11]. 따라서 인간 배아줄기세포(H9)에서부터 배아체(Embryoid body; EB, 도 1a)를 만들고 dorsomorphin과 SB431542를 3-4일간 처리 한 후 매트리겔이 코팅된 배양 디쉬에 부착하였다. 배아줄기세포주 혹은 역분화 줄기세포주의 고유 분화 특성에 따라 분화가 더디게 진행되는 경우가 있는데 이런 경우 dorsormorphin과 SB431542를 처리하는 기간을 6-8 일 정도로 연장하면 해결이 가능하였다. 다음 5-6일간 bFGF(basic-fibroblast growth factor)와 인슐린이 추가로 첨가된 무혈청 신경분화배지(이후 N2 배지, 조성은 실시예의 ‘신경전구세포의 유지 배양 및 분화’에서 설명되어 있음)에서 배양을 하면 콜로니의 가운데 부분에 신경 로제트(neural rosette) 모양의 구조가 생긴다(도 1b-1c). 이 구조는 신경전구세포 특이적인 마커인 Pax6와 Sox1가 강하게 발현하며(도 1d), 꽃 모양 구조의 중심부인 루멘(lumen)에는 Zo-1이라고 하는 갭 결합(gap junction) 단백질이 강하게 발현되는 것이 면역염색을 통해 확인되므로 초기 신경전구세포 구조인 신경 로제트임을 확인할 수 있었다(도 1e). 신경 로제트 덩어리들을 해부 현미경 하에서 조심스럽게 분리하여 가벼운 피펫팅으로 작은 조각들로 부순 다음 다시 매트리겔이 코팅된 배양기에 재부착하여, bFGF와 EGF(epidermal growth factor)가 첨가된 N2B27 배지에서 일주일간 더 배양을 하면 로제트 구조를 유지하면서 신경전구세포가 활발히 증식한다. 이 상태의 신경전구세포 역시 Pax6와 Sox1이 강하게 발현이 되고 있으며, 다른 신경전구세포 마커인 PSA-NCAM에 대해 면역염색을 해 보아도 로제트 구조를 중심으로 PSA-NCAM이 강하게 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 1f).

MACS 법을 이용해 고수율로 PSA - NCAM 양성의 신경전구세포의 분리

이전의 연구결과들에서 로제트 구조를 이루는 세포들은 주로 중추신경계 (central nervous system: CNS)를 이루는 세포들로 분화되는 신경전구세포의 성질을 갖는다고 한다. 하지만 로제트의 가장자리 부분은 로제트 내부의 세포와는 달리 말초신경계(peripheral nervous system: PNS)를 이루는 세포들로 분화되는 신경능(neural crest) 타입의 전구체에서 확인되는 마커인 p75, HNK1 등이 발현된다고 한다[12]. 즉 로제트 구조를 아무리 육안으로 정교하게 분리하였다하더라도 세포 구성이 비균질 할 수 있다는 간접적 근거를 제시하고 있다. 본 실험에서도 분리된 신경 로제트 세포를 증식하는 과정에서 로제트 구조에서부터 이탈해 나온 일부 세포에서는 PSA-NCAM 항체에 의해 염색되지 않는 세포들이 일부 존재함을 확인할 수 있다(도 2a). 이러한 결과는 로제트 구조 밖으로 이탈해 나온 세포가 신경능 타입의 세포일 가능성이 있다는 점을 시사한다. 신경능 타입의 세포는 주로 말초신경계를 이루는 신경세포를 만드는 전구세포이기는 하지만 중배엽성 세포들(예컨대, 지방세포 및 근육세포)들의 원시세포라고도 알려져 있어, 향후 분화과정에서 이러한 세포들로 분화할 가능성 있으므로 이들을 분리해 내는 과정이 요구된다[12]. 따라서 본 실험에서는 신경 로제트의 내부구조를 이루는 세포들만을 선택적으로 분리하기 위하여 자성 비드가 결합된 PSA-NCAM 항체를 이용하여 MACS법을 통해 PSA-NCAM 양성 세포만을 선택적으로 분리하였다. MACS법은 일반적으로 형광면역분리법(Fluorescence-activated cell sorting; FACS)과 비교하여 세포 분리 과정 중 훨씬 세포에 손상을 덜 주며, 월등히 저렴한 비용으로 FACS법과 비슷한 효율로 원하는 혹은 원하지 않는 세포를 분리해 낼 수 있는 장점이 있다[13]. 간단히 그 과정을 설명하면 N2B27 배지에서 일주일간 증폭된 신경전구세포를 Accutase를 처리하여 단일세포 현탁액으로 만들고 자성 비드가 결합된 PSA-NCAM 특이적 항체와 반응시킨 후 자성에 의해 걸러진 세포만을 추출해 내는 방법이다. MACS 후 추출된 PSA-NCAM 양성세포를 매트리겔이 코팅된 배양기 바닥에 부착시키고 N2B27 배지에서 배양하면 신경전구세포의 전형적인 모양을 보이고 인접한 세포끼리 서로 모여서 다시 로제트와 유사한 구조를 형성하게 된다(도 2b). 반면에 PSA-NCAM 음성세포의 경우 신경능 전구세포의 전형적인 모습을 보이고 로제트와 같은 특별한 구조를 형성하지 않고 단일세포로 흩어져 자라고 있음을 확인하였다(도 2c). 또한 PSA-NCAM 음성세포는 신경능 전구세포의 마커인 AP2, HNK-1 및 p75 등이 강하게 염색되었고, Snail, dHand 및 FoxD3와 같은 신경능 전구세포의 분화과정에 관련된 유전자들이 PSA-NCAM 양성세포에 비해 더 많이 발현됨을 역전사-중합효소 연쇄반응 (reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 분석에 의해서 확인하였다(도 3a-3d). 결과적으로 인간 배아줄기세포로부터 BMP 및 Activin/Nodal 신호전달 기전의 억제를 통해 분화 유도된 신경전구세포들에서 MACS법을 통해 PSA-NCAM 양성세포들만을 선택적으로 분리하면 신경능 전구세포를 제외한 순수한 신경전구세포들이 분리될 수 있음을 확인하였다.

분리된 신경전구세포의 증식 및 유지배양

MACS법에 의해 분리된 신경전구세포를 FACS법을 통해 그 수율을 확인해 보면 약 85%가 PSA-NCAM 양성 세포임을 확인할 수 있었다(도 4a). 또한 이 세포를 아래에 기술하는 방법에 의해 증식 배양하면 그 비율은 >94%로 증가하였다(도 4b). 세포 분리 후 매트리겔이 코팅된 배양 디쉬에 부착시킨 후 다른 신경 마커인 Nestin과 Sox1에 특이적인 항체를 이용해 면역 염색하여 관찰하니 육안으로도 전체 세포 중의 85% 이상임을 확인할 수 있다(도 4c).

MACS법에 의해 분리된 신경전구세포는 60 mm 배양디쉬에 약 7-8×10⁶의 고밀도로 세포를 부착시켜 주어야 신경전구세포의 전형적인 모양을 잘 유지하면서 비교적 균일한 세포들로 유지할 수 있었다. 저밀도 (6×10⁶ cells/60mm 디쉬 미만)으로 접종을 해주면 2-3일 후 배양되는 세포들에게서 신경능 전구세포의 모양(납작하고 세포체의 크기가 큰)을 보이는 세포들이 많이 관찰되었다. 고밀도로 부착시킨 후 다음날 혹은 그 다음날에 세포들이 자라 배양 디쉬 바닥을 95% 이상을 차지하게 되면 Accutase 처리하여 단일 세포로 떨어뜨린 다음 1:2의 비율로 계대를 하였다. 같은 방법으로 5-6 계대가 지나면 균일한 세포 모양을 보이는 세포들이 비교적 안정된 세포 성장 속도로 유지할 수 있게 된다. 이 상태의 세포는 일반적인 세포 냉동 기법을 이용하여 액체질소에 보관하였다가 해동하여도 같은 상태를 유지할 수 있게 됨을 확인하였다.

반복적인 계대가 진행되어도 세포의 상태가 초기의 신경전구세포의 모양을 유지하는지 확인하기 위하여 약 10 계대 간격으로 신경전구세포 특이적인 마커 (Sox1, Sox2, Nestin 및 Musashi1)의 발현을 면역염색 후 정성, 정량분석을 통해 확인하였다. 그 결과 약 20 계대가 반복되어도 세포의 모양에는 큰 변화가 없었으며(도 4d) 각각의 마커 발현양에도 유의한 변화가 없음을 확인하였다(도 4e). RNA 전사체의 양을 RT-PCR을 통해 확인해 보았을 때에도 신경전구세포의 마커인 Sox1 및 Pax6의 발현양이 꾸준히 유지됨을 확인하였다(도 4f). 배양되는 신경전구세포가 활발히 세포분열을 통해 자기증식능을 유지하는지 확인해 보기 위하여 세포분열 여부를 확인할 수 있는 마커(Ki67)를 면역염색 후 정량적으로 확인해 본 결과 20 계대가 되어도 초기 계대(2-3계대)의 발현양에 비해 유의한 차이를 보이지 않았다(도 5a). 더구나 지속적인 세포분열능의 척도가 되는 텔로머레이즈 역전사효소(human Telomerase Reverse Transcriptase; hTERT)의 발현도 계대가 반복이 되어도 여전히 유지가 됨을 확인할 수 있었다(도 4e). 줄기세포는 시험관 내에서 지속적인 계대배양을 통해 염색체 이상을 나타낼 수 있다고 알려져 있다[14]. 유지 배양되고 있는 본 신경전구세포에서 염색체 이상이 나타나는지 여부를 확인하기 위해 염색체 핵형검사(karyotyping)를 실시해 본 결과 20 계대가 지난 세포에서도 정상적인 핵형을 유지하는 것을 확인하였다(도 5b). 이러한 실험적 근거들을 보아 본 방법에 의해 분리되어 계대 증식되는 신경전구세포는 고유의 마커 발현을 유지하면서 지속적으로 분열할 수 있으며 정상적인 핵형을 유지할 수 있는 세포임을 알 수 있다. 마지막으로 배양중인 세포에 신경전구세포 이외의 다른 세포가 섞여 있을 가능성을 확인해 보았다. 미분화 마커인 Oct4, 중배엽성 세포의 마커인 Brachyury 및 내배엽성 마커인 AFP의 발현 여부를 RT-PCR 및 면역염색을 통해 확인해 보았을 때 유지배양 중인 신경전구세포에서 검출이 되지 않았다. 하지만 혹시 모를 미분화 세포의 존재 가능성을 미분화세포를 확인하는 마커로 사용하는 SSEA4를 표식자로 FACS 분석을 해본 결과 MACS 분리 후 초기 계대의 세포에서 약 7% 정도의 세포가 양성으로 검출이 되나 약 10 계대 이후의 세포에서는 음성대조군과 견줄 만한 약 0.7%의 세포만이 양성으로 검출되었다(도 6). 이를 보아 초기 계대에서 검출되는 SSEA4 양성세포는 미분화 세포일 가능성 보다는 초기 신경전구세포의 표면에서 소량 검출되는 SSEA 항원 때문인 것으로 생각된다[15]. 또한 MACS법에 의해 분리 배양되는 PSA-NCAM 양성 신경전구세포에서는 신경능 분화에 관련된 마커들의 발현이 거의 검출이 되지 않는 것으로 처음 의도한 순수한 신경전구세포의 상태로 유지 배양되고 있음을 확인하였다(도 3d).

신경전구세포의 특성분석

기존의 연구 결과에 따르면 인간 배아줄기세포로부터 분화한 신경전구세포는 크게 두 종류로 구분이 된다[8]. 그 중 하나는 로제트 타입의 신경줄기세포(rosette neural stem cells; rosette NSCs)이며 다른 하나는 bFGF와 EGF가 첨가된 신경분화배지에서 배양되고 있는 NSC, 즉 NSC^{FGF / EGF}로 나뉜다. 두 세포 타입은 각기 독특한 분자 세포생리학적 특성을 지니는데 예를 들면 로제트 NSCs의 경우 NSC^{FGF / EGF}에 비해 훨씬 초기상태(primitive)의 신경전구세포로 모든 중추 및 말초신경계를 구성하는 세포들로 모두 분화할 수 있다. 세포신호 전달기전의 조절에 의해 특정 신경세포, 교세포로 분화할 수 있는 능력이 있으며 강한 세포분열능을 가지고 있어 동물모델에 이식하였을 경우 과증식에 의한 종양 형성이 관찰된다. 또한 PLZF 또는 DACH1같은 특정 단백질들이 발현되어 마커로 사용될 수 있다. 반면에 NSC^{FGF / EGF}는 분화능이 로제트 NSC에 비해 떨어져 일부 중추신경계를 구성하는 세포들로만 분화하며 특정 신경세포 및 교세포로의 분화유도가 힘든 경향이 있다. 또한 이식 시 종양 형성의 가능성이 매우 희박하며 S100b, AQP4 또는 PMP2 등의 단백질을 특이적으로 발현한다[8].

본 기술에 의해 분리, 유지 배양되고 있는 신경전구세포의 특성을 확인하기 위하여 위에서 기술한 두 가지 종류의 NSC를 구분할 수 있는 마커들의 발현을 면역염색과 RT-PCR을 통해 확인해 보았다. 우선 로제트 타입 NSC의 특성 중의 하나인 로제트 구조가 계대가 지속되어도 반복적으로 관찰하였다(도 7a). 특히 로제트 구조의 특징적인 세포들의 배치와 아울러 Zo-1의 특징적인 발현을 확인한바 구조적인 로제트 형성이 확인하였다(도 7a). 더욱이 로제트 NSC에 특징적으로 발현이 된다고 알려져 있는 PLZF, DACH1, NR2F 및 PLAGL1 등이 계대 진행여부에 관계없이 강하게 발현됨을 RT-PCR 분석을 통해 확인하였고, 특히 PLZF의 경우는 분석된 모든 계대의 세포에서 모두 잘 발현이 되는 것이 확인하였다(도 7b-7c). 따라서 본 기술에 의해 분리, 유지 배양되는 신경전구세포는 로제트 NSC의 특성을 가진 세포임을 알 수 있었다. 또한 NSC^{FGF / EGF}의 특성을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위하여 NSC^{FGF / EGF} 특이적 마커인 PMP2, HOP, AQP4 및 S100b 등의 발현을 RT-PCR 분석을 통해 확인해 보았다. 그 결과 PMP2 및 HOP은 확인되지 않았으나 AQP4의 경우 아주 미량이, S100b의 경우는 상당한 양의 발현이 확인되었다(도 8a). 더욱이 S100b은 면역염색으로도 확인되었다(도 8b). 여기서 관찰된 놀라운 사실은 본 기술에 의해 분리, 유지배양 되고 있는 신경전구세포는 로제트 NSC의 특성 뿐 아니라 NSC^{FGF / EGF}의 특성도 일부 보인다는 점이다. 이는 아마도 로제트 NSC와 NSC^FGF/EGF의 중간 정도 단계의 세포일 가능성을 보여주고 있다. 그렇다면 본 기술에 의해 분리 및 배양되는 신경전구세포는 아마도 두 세포의 장점(높은 분화능과 낮은 종양 형성능)을 모두 가진 세포라고 예측해 볼 수 있겠다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

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2. Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, et al., Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 2009 Mar;27(3):275-80.

3. Perrier AL, Tabar V, Barberi T, et al.,Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Aug 24;101(34):12543-8.

4. Cho MS, Lee YE, Kim JY, et al., Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Mar 4;105(9):3392-7.

5. Cho MS, Hwang DY, Kim DW. Efficient derivation of functional dopaminergic neurons from human embryonic stem cells on a large scale. Nat Protoc. 2008;3(12):1888-94.

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7. Koch P, Opitz T, Steinbeck JA, et al., A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Mar 3;106(9):3225-30.

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9. Osafune K, Caron L, Borowiak M, et al., Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines. Nat Biotechnol. 2008 Mar;26(3):313-5.

10. Hu BY, Weick JP, Yu J, et al., Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Mar 2;107(9):4335-40.

11. Kim DS, Lee JS, Leem JW, et al., Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 2010 Jun;6(2):270-81.

12. Lee G, Kim H, Elkabetz Y, et al., Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 2007 Dec;25(12):1468-75.

13. http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_21_MACS_Cell_Separation.aspx

14. Pera MF. Unnatural selection of cultured human ES cells? Nat Biotechnol. 2004 Jan;22(1):42-3.

15. Barraud P, Stott S, MøllgK, et al.,In vitro characterization of a human neural progenitor cell coexpressing SSEA4 and CD133. J Neurosci Res. 2007 Feb 1;85(2):250-9.

16. Perrier A L, Tabar V. Barberi T, Rubio M E, Bruses J, Topf N, Harrison N L, Studer L, 2004, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 101, 12543-12548.

17. Li X J, Du Z W, Zamowska E D, Pankratz M, Hansen L O, Pearce R A, Zhang S C, 2005, Nat.Biotechnol., 23, 215-221.

18. Zhang S C, Wernig M, Duncan I D, Brustle O, Thomson J A, 2001, Nat.Biotechnol., 19, 1129-1133.

19. Methods for expansion of human embryonic stem cells. Oh SK, Kim HS, Park YB, et al., Stem Cells. 2005 May;23(5):605-9

20. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Kim DS, Lee JS, Leem JW, et al., Stem Cell Rev . 2010 Jun;6(2):270-81.

21. Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells. Cho MS, Lee YE, Kim JY, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Mar 4;105(9):3392-7.

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23. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.

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Claims (16)

1. 다음 단계를 포함하는 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells)로부터 신경전구세포(neural precursor cells)의 분리 방법:
   (a) 전능성 줄기세포를 신경 로제트(neural rosette)로 분화시켜 신경전구세포를 포함하는 세포 파퓰레이션을 얻는 단계;
   (b) 상기 세포 파퓰레이션에 PSA-NCAM(poly-sialated neural cell adhesion molecule) 항체를 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 PSA-NCAM 항체 결합된 세포를 분리하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 iPSCs(induced pluripotent stem cells)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 전능성 줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포 파퓰레이션은 비균질 신경전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제 5 항에 있어서 상기 비균질 신경전구세포는 CNS(central nervous system)-타입 신경전구세포 및 PNS(peripheral nervous system)-타입 신경전구세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제 6 항에 있어서, 상기 PSA-NCAM 항체는 CNS-타입 신경전구세포에 특이적으로 결합하며 상기 단계 (c)에서 분리되는 세포는 CNS-타입 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 분리된 CNS-타입 신경전구세포는 로제트 타입 신경줄기세포(neural stem cell: NSC) 및 NSC^{FGF / EGF} 특성을 모두 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b) 및 (c)는 MACS(magnetic activated cell sorter)에 따라 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 99% 이상의 신경전구세포 순수도(purity)를 나타내는 것을 특징으로 하는 방법.
    
11. 상기 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분리된 신경전구세포.
    
12. 제 11 항에 있어서, 상기 신경전구세포는 CNS-타입 신경전구세포인 것을 특징으로 하는 신경전구세포.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 CNS-타입 신경전구세포는 로제트 타입 신경줄기세포(neural stem cell: NSC) 및 NSC^{FGF / EGF} 특성을 모두 가지는 것을 특징으로 하는 신경전구세포.
    
14. 상기 제 11 항의 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 뉴우런(neuron).
    
15. 상기 제 11 항의 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte).
    
16. 상기 제 11 항의 방법에 의해 분리된 신경전구세포로부터 분화된 성상세포(astrocyte).
    

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