KR101323650B1 - 미분화 전능성 줄기세포의 제거방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미분화 전능성 줄기세포의 제거방법 및 미분화 전능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 (a) 미분화 전능성 줄기세포 및 분화 세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비(preparation)하는 단계; (b) 상기 세포 시료에 SSEA-3(stage-specific embryonic antigen-3) 항체 및 TRA(tumor rejection antigen)-1-60 항체를 상기 세포 시료에 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 SSEA-3 항체 및 상기 TRA-1-60 항체 모두가 결합된 세포를 분리하는 단계를 포함하는 미분화 전능성 줄기세포의 제거방법 및 미분화 전능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 비교적 간단하면서도 매우 효율적으로 미분화 전능성 줄기세포를 제거할 수 있다. 본 발명에 따른 SSEA-3 항체와 TRA-1-60 항체를 이용한 미분화 세포의 분리는 0.01% 이하의 매우 낮은 미분화 세포 오염률을 보여준다.

Description

미분화 전능성 줄기세포의 제거방법{Methods for Depleting Undifferentiated Pluripotent Stem Cells}

본 발명은 미분화 전능성 줄기세포의 제거방법 및 미분화 전능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물에 관한 것이다.

배아줄기세포(ESCs)는 자기재생능(self-renewal)을 갖고 있으며 거의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있다.¹ 이러한 특징은 재생의학분야에서 배아줄기세포의 의약으로서의 사용가능성을 크게 높인다. 조직치료나 세포치료에 있어, 배아줄기세포의 임상적 사용은 특정 병원체-프리 GMP-등급의 세포뿐만 아니라 무종양 말단 분화세포 또는 전구세포를 요구한다. 배아줄기세포가 특정계통으로 효율적으로 분화하는 것을 조절하는 특이적인 과정에도 불구하고 세포 중에는 분화된 세포와 미분화세포가 혼재할 가능성이 있다. 인간의 배아줄기세포와 유도전능줄기세포의 전분화능을 증명하는데 테라토마 형성 실험법이 널리 이용된다(예, 체내에서 3배엽으로 발생).² ESCs로부터 유래된 분화세포가 종양을 형성하는지는 알려져 있지 않지만, 세포치료제의 성분내에 포함된 미분화 세포에 의한 오염이 이소성 이식에서 인 비보 테라토마를 야기할 수 있다는 큰 우려가 있가 있으며, 실험적으로 이 우려가 마우스 배아줄기세포에서는 증명된 바 있다._3,4 미미하지만, 테라토마나 다른 비정상적인 세포 성장(종양)의 형태는 상당한 건강상의 위험성을 갖고 있으며, 이는 이식한 세포나 조직의 기능의 손실을 야기할 수 있다. 실제로, 최근 보고에서 SCID 마우스에 이식한 인간 태아 조직내에 주입된 인간배아줄기세포(hESCs)가 악성종양으로 발전된 결과가 있다.₅ 이러한 종양 형성 가능성 때문에, 재생의학의 세포치료에 미분화 ESCs를 임상적으로 적용하는 것을 어렵게 한다.

설치류 ESCs(mESCs) 및 mESCs-유래 분화 세포(인슐린생성세포, 심장세포, 신경세포)가 면역력이 손상된 마우스에 주입되었을 때 테라토마를 생성하지만, 인간 ESC(hESC)-유래 분화 세포에 의한 면역손상 마우스에서의 테라토마 형성의 빈도는, 설치류 세포의 그것과 비교하여 상대적으로 낮다.^4,5 Lee et al.는 심근세포 및 골격세포에서 테라토마가 형성되는데 최소한 1 x 10⁴-1 x 10⁵의 세포가 요구된다는 것으로 이식된 hESCs 수가 테라토마의 형성에 중요한 요소임을 보여주었다.⁶ 그러나 van der Bogt et al.는 약 100개의 hESCs의 피하주입은 테라토마를 야기할 수 있으며 이는 hESC-유래 치료제 세포가 미분화세포에 의해 오염되는 것이 종양 형성을 야기할 수 있음을 보여주었다.⁷ 이러한 테라토마의 형성에 있어서 mESCs 및 hESCs의 차이는 종간-장벽(species-barrier)(마우스 조직에 이식된 인간세포에 대한 미세환경 차이) 또는 테라토마 형성에 있어 두 ESCs의 de novo 능력의 차이로 여겨진다. 주입경로(피하주입, 고환내주입, 근육내주입 및 신장 캡슐 내 주입), 주입된 세포의 구성(단일세포 현탁액, 응집체 및/또는 마트리겔과의 공동주입) 및 시간을 포함하는 다른 변수들이 주입된 세포의 종양생성에 영향을 주는 것으로 보고 있다.^6,8 또한 면역력이 손상된 마우스에서 hESCs나 유도전능줄기세포(iPSC)로부터 분화된 세포에서 테라토마가 없는 것은 면역 거부반응이기 때문에, 이러한 실험적 모델은 인간에게 적용하는 ESCs를 이용하는 것에 대한 안전성을 보장할 수 없다.

이러한 변수들 및 불확실성 때문에, hESCs-유래 분화세포의 임상적 적용은, 이 세포가 종양형성의 위험성으로부터 자유롭다는 것에 대한 확실한 보장을 요구한다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 다양한 접근방식들이 제안되었다.⁹ 첫째로, 유전적으로 조작된 ESCs는 세포로부터 미분화 ESCs의 제거를 할 수 있도록 한다. 스템니스 유전자의 프로모터의 조절하에 자살유전자 둔 유전자 조작된 ESCs는 미분화세포를 간사이클로비르(gancyclovir)에 민감하게 만든다.¹⁰ hTERT 프로모터의 조절 하에서 α1,3-갈락토실트랜스퍼라아제(α1,3-galactosyltransferase)에 의한 hESCs의 유전적 변형은 미분화세포를 정상 인간혈청에 대하여 아폽토시스가 매우 잘 발생되도록 한다. 배아줄기세포로의 이종유전자의 도입에 의한 미분화세포의 제거는 어느 정도 기대되지만, 이는 또 다른 규제 문제를 야기하는 유전적 조작으로 임상적 적용에 제한적이다.

둘째, 세포 혼합물에서 미분화세포의 선별적 아폽토시스 유도가 제안되었다.^12,13 이 접근 방법은 매력적인 측면이 있지만, 상기 선별을 위한 분자들이 다른 종류의 세포의 필수과정에 참여할 수 있기 때문에, 상기 방법은 분화세포에 대한 활성 결여를 추가적으로 확인할 것이 요구된다. 또한, 중간단계(전구세포) 치료 세포들이 화학물질의 영향을 받을 수 있다. 셋째, hESCs로 부터 완벽하게 치료용 분화세포를 시험관에서 유도하는 것으로, 그 결과인 분화세포들은 in vivo 에서 테라토마 형성능을 상실하고 극히 제한적인 분화능을 갖는 것이 이상적이다. Brederlau et al.은 체외에서 hESCs로 부터 분화세포로 배양하는 기간이 길수록 래트에 이식하면 테라토마 발생율이 반비례하여 주는 것으로 보고하였으며¹⁴, 이것은 체외에서의 분화 기간이 길수록 분화세포 중의 미분화세포의 함량이 줄어 든다는 것을 의미한다. 그러나 현재의 분화방법은 미분화 hESCs의 오염 없이 분화세포를 만들 수 없다. 분화세포 중 잔류 미분화세포의 일부가 임상적 세팅에서 테라토마를 형성 할 수 있으므로, 고효율의 더 나은 ESCs 분화방법에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 넷째, 비균질한 세포혼합물에서 항체를 이용한 미분화세포의 양성 선별(인리치먼트)이나 음성 선별(제거)을 할 수 있다. 항체를 이용한 특성 세포의 분리는 면역학 및 혈액학 분야에서 개발되고, 발전되고 개량되었고, 이는 효율적인 분화 방법을 포함한 상기 전략들을 보완할 수 있다.¹⁵ 현재, 세포 분리를 위해 단일클론항체를 이용한 3가지 주요 방법을 이용할 수 있다. (1) 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters, FACS), (2) 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter, MACS) 및 (3) 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis). 이중 MACS는 용이하고 신속하게 원치 않는 세포를 효율적으로 분리해 준다. 특히 하나의 항체를 이용한 방법은 효율이 낮은 경우, 두 종류 이상의 항체를 조합하여 더 나은 결과를 얻을 수 있다. 이 후보들 중에서 grobo-계열 당지질(SSEA-3, SSEA-4)의 항원과 케라틴 설페이트 관련 항원(TRA-1-60 및 TRA-1-81)은 hESCs에 많이 발현되고 분화 시에는 감소하는 것으로 알려져 있다.¹⁶ 미분화 SSEA-4-양성 ESCs의 제거는 동종이계 세팅에서 ESCs-유래 조혈모성 전구세포에서 테라토마의 형성을 억제한다.¹⁷ 최근, Choo et al.는 PODXL의 특정 항원결정기에 대한 한 종류의 단일클론항체는 미분화 hESCs의 선별적인 아폽토시스을 유도한다고 보고했다.¹⁸ 여전히 이러한 접근에 대한 문제점은 신경전구세포에서 SSEA-4의 경우와 같이 특정 계통으로 분화된 세포에서 발현되는 확실한 마커에 그 적용이 제한적이라는 것이다.¹⁹

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 비균질 세포 파퓰레이션에서 전능성 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 두 개의 표면 마커 즉 SSEA-3(stage-specific embryonic antigen-3) 및 TRA(tumor rejection antigen)-1-60에 대하여 각각 특이성을 갖는 두 종의 항체를 이용하여 세포를 제거하는 경우에는 비균질 세포 파퓰레이션에서 전능성 줄기세포를 매우 효과적으로 제거할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 미분화 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells)의 제거방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 미분화 전능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 미분화 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells)의 제거방법을 제공한다:

(a) 미분화 전능성 줄기세포 및 분화 세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비(preparation)하는 단계;

(b) 상기 세포 시료에 SSEA-3(stage-specific embryonic antigen-3) 항체 및 TRA(tumor rejection antigen)-1-60 항체를 상기 세포 시료에 접촉시키는 단계; 및

(c) 상기 SSEA-3 항체 및 상기 TRA-1-60 항체 모두가 결합된 세포를 분리하는 단계.

본 발명자들은 비균질 세포 파퓰레이션에서 전능성 줄기세포를 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 두 개의 표면 마커 즉 SSEA-3(stage-specific embryonic antigen-3) 및 TRA(tumor rejection antigen)-1-60에 대하여 각각 특이성을 갖는 두 종의 항체를 이용하여 세포를 제거하는 경우에는 비균질 세포 파퓰레이션에서 전능성 줄기세포를 매우 효과적으로 제거할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 미분화 전능성 줄기세포의 제거방법을 각각의 단계로 나누어 상세하게 설명하면 다음과 같다:

단계 (a): 미분화 전능성 줄기세포 및 분화 세포(differentiated cells)를 포함하 는 세포 시료의 준비(preparation)

본 발명에 따르면, 미분화 전능성 줄기세포 및 분화 세포(differentiated cells)를 포함하는 세포 시료를 준비(preparation)한다.

상기 세포 시료는 다양하게 준비될 수 있다. 예를 들어, 미분화 전능성 줄기세포(예컨대, 배아줄기세포)를 분화시킨(예컨대, 신경 세포로 분화) 결과물이 상기 세포 시료이다. 미분화 전능성 줄기세포를 분화시킨 결과물에는 일반적으로 모든 세포들이 분화세포를 포함하지 않으며, 미분화 전능성 줄기세포가 소량 잔존 해 있다. 따라서, 분화시킨 결과물을 세포 치료제로 이용하기 위해서는 미분화 전능성 줄기세포의 완전한 제거가 필요하다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 미분화 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 유도전능줄기세포(induced pluripotent stem cells: iPSCs)이다.

용어 ‘유도전능줄기세포’는 비-전분화능 세포(예를 들면, 체세포)로부터 특정 유전자를 삽입하거나 이 특정 유전자에 상응하는 단백질을 도입하여 인위적으로 유래된 전분화능 줄기세포이다. 유도전능줄기세포는 줄기세포 유전자 및 단백질 발현, 염색체 메틸화, 배가시간(doubling time), 배아체 형성, 테라토마 형성, 생존성 키메라 형성, 교잡성 및 분화성을 가지는 면에서 전분화능 줄기세포(예를 들면, 배아줄기세포)와 동일하다고 여겨진다.

바람직하게는, 미분화 전능성 줄기세포는 배아줄기세포이다.

보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 미분화 전능성 줄기세포는 인간, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트 또는 조류로부터 유래된 것이고, 가장 바람직하게는 인간 전능성 줄기세포이다.

보다 더 바람직하게는, 상기 세포 시료는 미분화 전능성 줄기세포를 신경 세포(neural cells)로 분화시킨 세포 시료이며 상기 세포 시료는 미분화 전능성 줄기세포 및 분화세포로서의 신경 세포(neural cells)를 포함한다.

본 명세서의 용어 ‘분화 세포’는 줄기세포가 특정 분화 자극에 의해 특정 세포로 분화가 진행된 세포이다.

단계 (b): SSEA ( stage - specific embryonic antigen )-3 항체 및 TRA ( tumor rejection antigen )-1-60 항체를 세포 시료에 접촉

이어, 세포 시료에 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 접촉시킨다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

SSEA-3 및 TRA-1-60에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 SSEA-3 또는 TRA-1-60 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 명세서에서, SSEA-3 또는 TRA-1-60을 언급하면서 사용되는 용어 “항체”는 SSEA-3 또는 TRA-1-60에 대한 특이 항체로서, SSEA-3 또는 TRA-1-60 표면 단백질에 대해 특이적으로 결합하며, 완전한 항체 형태뿐만 아니라 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함한다.

완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다 (Cellular and Molecular Immunology, Wonsiewicz, M. J., Ed., Chapter 45, pp. 41-50, W. B. Saunders Co. Philadelphia, PA(1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunology, 2nd Ed., Chapter 4,pp. 45-65, sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984)).

항체 분자의 항원 결합 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085, WO 88/07086 및 WO 88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂ 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 세포 시료에 접촉시킨다.

단계 (b)는 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 세포 시료에 각각 따로 처리하거나 동시에 처리하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 세포 시료에 동시에 처리한다.

SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체는 세포 시료 내 미분화 전능성 줄기세포의 표면에 결합한다.

단계 (c): SSEA -3 항체 및 상기 TRA -1-60 항체 모두가 결합된 세포를 분리

이어, SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체 모두가 결합된 세포를 분리한다.

SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체 두 가지 항체 모두는 미분화 전능성 줄기세포에 결합할 가능성이 매우 높다. 그러나 모든 미분화 전능성 줄기세포가 SSEA-3 및 TRA-1-60 모두를 발현하지 않을 수도 있다. 바람직하게는, 상기 단계의 세포 시료로부터 미분화 전능성 세포의 분리는 상기 SSEA-3 항체와 상기 TRA-1-60 항체 모두가 결합된 세포 이외에 상기 SSEA-3 항체 또는 상기 TRA-1-60 항체가 결합된 세포도 분리한다.

보다 바람직하게는, 항체를 이용한 상기 세포 분리를 위해 형광-활성세포분류기(fluorescence-activating cell sorters: FACS), 자성활성세포분류기(magnetic activated cell sorter: MACS) 및 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis) 방법을 이용한다.

만일, 본 발명을 MACS를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 다음과 같이 실시할 수 있다:

본 발명에서 MACS는 직접적 표지방법 및 간접적 표지방법으로 실시할 수 있다.

예를 들어, 직접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 자성입자에 결합된 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다.

예를 들어, 간접적 표지방법에 따라 MACS를 실시하는 경우, 적합한 중개물질이 결합된 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 예컨대, 형광물질이 결합된 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨다. 형광물질 이외에도, 중개물질은 스트렙타비딘, SSEA-3 항체 또는 TRA-1-60 항체의 Fc 부위에 특이성을 갖는 항체 및 아비딘을 포함한다. 중개물질이 결합된 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시킨 다음, 자성입자에 결합되어 있고 상기 중개물질에 특이성을 갖는 항체를 처리한다. 그런 다음, 자성을 갖는 분리기(separator)에 적용하여 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체가 결합된 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다.

MACS는 기본적으로 면역자기 분리 과정에 따른 것으로서, 상기 과정의 일반적인 내용은 미합중국 특허 제 5,385,707 호, 제 5,541,072 호, 제 5,646,001 호, 제 6,008,002 호 및 제 6,153,411 호에 개시되어 있으며, 이용되는 자성 입자 또는 마이크로비드 및 분리기는 Miltenyi Biotech(독일연방국)에서 용이하게 구입할 수 있다.

본 발명은 FACS를 이용하여 실시할 수 있다. FACS는 Flow Cytometry First Principles by Alice Longobardi Givan. ISBN 0471382248 및 Practical Flow Cytometry by Howard M. Shapiro. ISBN 0471411256에 개시된 방법에 따라 실시할 수 있다.

보다 더 바람직하게는 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 MACS에 의해 실시한다. 보다 더욱 더 바람직하게는, 미분화 전능성 줄기세포의 분리는 간접적 표지를 이용하는 MACS에 의해 실시한다.

예를 들어, 형광물질로 표지된 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체를 미분화 전능성 줄기세포에 결합시키고 이어 상기 형광물질에 특이적인 항체가 결합된 자성입자(또는 자성 마이크로비드)를 결합시키고, 그런 다음 분리기를 이용하여 미분화 전능성 줄기세포를 분리한다. 이 경우, 상기 SSEA-3 항체 및 TRA-1-60 항체에 결합된 형광물질은 각각 다른 물질 또는 동일한 물질일 수 있다.

이용 가능한 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), PE(phycoerythrin), 에오신, 카르복시플루오르세인, 플루오르세인 아마이다이트, 로즈 벤갈, 다이라이트 플루오르, 메틸린 블루, 쿠마린 및 로다민을 포함하지만 이에 한정된 것은 아니다.

MACS에 의해 단계 (c)를 실시하는 경우, 바람직하게는 MACS는 2회 이상 실시한다.

예를 들어, 컬럼으로 제작된 MACS 분리기에 상기 항체가 처리된 세포 시료를 2회 이상 통과시켜 실시할 수 있다.

본 발명의 방법에 따르면, SSEA-3 항체와 TRA-1-60 항체를 이용한 비균질 세포 파퓰레이션에서 적합한 분리방식(예컨대, MACS)에 따라 미분화 전능성 줄기세포(예컨대, hESCs)를 효과적으로 제거하는 방법을 제시한다. 따라서, 본 발명에서 제시하는 전략은 임상 적용하기에 알맞은 고순도 미분화 전능성 줄기세포-결여, 생존 세포준비를 할 수 있다. 본 발명의 방법은 높은 특이성과 결합 활성을 갖는 두 종류 이상의 마커에 대한 항체를 이용하여 종양형성 가능성이 없는 세포 치료제에 대한 보다 나은 해결을 제공하였다.

본 발명의 미분화 전능성 줄기세포의 제거방법은 비균질 세포 파퓰레이션으로부터 효과적으로 미분화 전능성 줄기세포를 제거한다. 본 명세서에서 미분화 전능성 줄기세포를 언급하면서 사용되는 용어 “제거(depletion or removal)”는 세포 시료 즉 비균질 세포 파퓰레이션으로부터 미분화 전능성 줄기세포를 실질적으로 제거되어 테라토마를 형성하지 않는 세포 조성물을 의미한다. 예를 들어, 용어 제거는 본 발명의 방법이 적용된 세포 시료에서 미분화 전능성 줄기세포의 양이 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만, 보다 바람직하게는 0.1% 미만이 되도록 하는 것을 의미한다. 상기 용어 “%”는 세포개수(cell count)를 기준으로 한 백분율이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 제조방법에 의해 미분화 전능성 줄기세포가 제거된 세포 조성물을 제공한다.

본 발명의 세포 조성물은 미분화 전능성 줄기세포가 제거된 조성물이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포 조성물은 동물에 이식 시 테라토마(teratoma)를 형성하지 않는 안전한 조성물이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 비균질 세포파퓰레이션에서 미분화 전능성 줄기세포를 제거하는 방법을 제공한다.

(b) 본 발명에 따르면, 비교적 간단하면서도 매우 효율적으로 미분화 전능성 줄기세포를 제거할 수 있다.

(c) 본 발명에 따른 SSEA-3 항체와 TRA-1-60 항체를 이용한 미분화 세포의 분리는 0.01% 이하의 매우 낮은 미분화 세포 오염률을 보여준다.

(d) 본 발명에 따른 세포 조성물은 동물에 이식 시 테라토마(teratoma)를 형성하지 않는다.

도 1는 미분화 hESCs의 제거를 위한 순차적 MACS의 도식도를 보여준다. 두 종류의 항체로 특이 표면 마커를 염색한 후, 이중연속 MACS 컬럼(LS 컬럼)으로 세포를 분류하여 비균질한 세포 혼합물로부터 원치않는(항체-결합) 세포를 제거하였다.
도 2는 hESCs, EBs 및 신경전구세포의 유동세포 분석 결과를 보여준다. 배아줄기세포주(SNU-hES3)의 대표적 히스토그램인 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81이 신경 전구세포에 상당히 발현되었다. 오픈 히스토그램은 아이소타입 컨트롤을 나타낸다.
도 3는 hESCs와 정상 인간 PBMCs의 혼합물로부터 hESC의 면역자성 분리를 보여준다. 분리 이전에, hESCs와 정상 인간 PBMCs는 의도적으로 1:4-1:5의 비율로 혼합한다. SSEA-3, TRA-1-60 또는 TRA-1-81 에 대한 형광-결합 항체로 염색하고 마이크로비즈-결합 항-PE- 또는 항 -FITC 항체와 염색한 후, MACS로 세포를 분리한 결과이다. 용출(flow-through) 분획에서 마커 발현 세포의 제거했으나 여전히 미분화 마커-양성 세포를 상당량 포함하고 있다.
도 4a-도 4c는 두 종류의 hESC 표면 마커를 이용한 연속 MACS에 의한 hESCs의 완전 제거를 보여준다. 도 4a는 hESCs 및 PBMCs의 비분리 혼합 파퓰레이션에서 SSEA-3 및 TRA-1-60 발현의 유세포분석기 데이터로서, 컬럼에 남아 있는 세포(양성분획) 및 용출 분획에 있는 세포를 보여준다. 값은 SSEA-3 또는 TRA-1-60에 대한 단일 양성이나 이중 양성 세포의 비율이다. 도 4b는 양성분획 및 비분리 세포에서 높은 빈도의 형광세포가 관찰되는 것과 대조적으로 “용출" 분획에서는 SSEA-3₊가 확인되지 않음을 보여준다. SSEA-3-염색 세포(초록)의 면역 형광은 DAPI-염색 세포핵(청색)와 같이 나타난다. 도 4c는 Oct-4의 qRT-PCR 결과로서, "용출액"에 hESCs의 부재를 보여준다.
도 5는 고환내 이식 시 고환 조직의 조직학적 분석으로 테라토마가 형성되지 않음을 보여준다. 도 5a는 2× 10₅ hESC-제거(음성분획) 또는 hESC-풍부화(양성분획)을 숙주 마우스의 고환캡슐에 이식 한 후 12주 경과된 NOD/SCID 마우스 고환 조직의 현미경사진이다. 헤마토자일인 & 에오신 염색법을 통한 조직학적 평가에서 이식된 고환에서 종양이나 테라토마 형성이 보이지 않았다. 도 5b는 MACS 분리의 SSEA-3⁺ TRA-1-60⁺분획으로부터 응집체 형성을 나타낸다. MACS 컬럼의 양성분획세포는 in vitro 조작 동안 생존력을 갖고 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

재료 및 방법

인간배아줄기세포와 세포배양

인간 ESCs 연구는 KFDA(Korean Food and Drug Administration) 및 연세대학교 의과대학 내부 리뷰 보드의 승인을 받았다. 인간 배아줄기세포주 SNU-hES3 (P30-36) 및 CHA-hEA-hES3(P88-93)을 각각 서울대학병원(서울, 대한민국) 및 차병원(서울, 대한민국)으로부터 제공받았다. 이 세포는 20%(v/v) KSR(Knockout Serum Replacement; Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국), 100 IU/㎖ 페니실린 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국) 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국), 0.1 mM 비필수 아미노산(Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 미국), 및 4 ng/㎖ bFGF (basic fibroblast growth factor; Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)을 포함하는 DMEM/F12 배지에서 배양하였다.²⁰ SNU-hES3 및 CHA-hES3 세포주를 각각 유사분열적으로 정지된 STO(ATCC, Manassas, 미국) 피더세포 및 마우스 배아섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts: MEFs) 층에서 배양하였다. 5-7일 동안 매일 배지를 교환하였으며, 공지된 계대배양 방법에 따라 hESC 콜로니들을 신선한 피더 층에 옮겼다.²⁰

hESCs의 신경세포로의 분화

2 ㎎/㎖ IV형 콜라게나아제(Invitrogen, 미국)를 30분 동안 처리한 후 피더 세포층으로부터 hESC 콜로니를 분리시켜 배아체(embryoid bodies: EB) 형성을 하도록 하였으며, bFGF가 없는 정상 hESC 배양 배지가 포함된 페트리 디쉬로 이동시켰다. 자발적 분화를 위하여, 상기 EBs를 7일 동안 2일에 한번 배지를 교환하여 배양하였다. 신경전구세포와 구형 신경매스(spherical neural mass: SNM)를 공지된 방법에 따라 준비하였다.²¹ 간단하게, EBs 형성 7일 후에, EBs를 신경전구세포(Neural Precursor cell: NPC) 선별 배지에서 5일 동안 배양한 후, 형성된 NPC를 0.5% N2(Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)가 첨가된 무혈청의 변형 EB 배지에서 4일 동안 증식하였다. SNM 형성을 위하여, 신경 증식 배양 동안 관찰된 신경 로제트 및 신경 튜브-유사 구조를 기계적으로 분리시키고 이를 NP 증식 배지를 포함하는 배양 디쉬에서 배양하였다. SNMs를 4-6 피스로 기계적으로 단편화 하고 7-10일 동안 계대배양 하였다.

분류를 위한 단일 세포 부유물의 준비와 유세포분석기(flow cytometry)

hESCs의 단일 세포 부유물을 공지된 계대배양 방법을 수정하여 준비하였다.²² 피더층에서 hESCs를 분리하기위해, 10 μM ROCK 억제제(Sigma, Y-27632) 또는 0.5 μM 티아조비빈(Stemgent, San Diego, CA, 미국)을 효소 처리 이전에 첨가하였다.^23,24 1.5 ㎎/㎖ 콜라게나아제 타입 Ⅳ (Warthington, NJ, 미국)을 처리하여 hESCs의 클럼프를 수득하고 TryPLE Express(Invitrogen, Carlsbad, CA, 미국)로 추가적으로 처리하였다. 세포 분리는 MACS(Miltenyi Biotech, Auburn, CA, 미국)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행하였다. 간단하게, 분리한 세포를 70 ㎛ 세포 스트레이너(BD-Pharmingen, San Diego, CA, 미국)에 통과시키고, PE-결합 항-SSEA-3(BD-Pharmingen, San Diego, CA, 미국), FITC-결합 항-SSEA-4(BD-Pharmingen, San Diego, CA, 미국) 및 FITC-결합 항-TRA-1-60(BD-Pharmingen, San Diego, CA, 미국) 또는 PE-결합 항-SSEA-3(BD-Pharmingen, San Diego, CA, 미국)와 FITC-결합 항-TRA-1-60(BD-Pharmingen, San Diego, CA, 미국)의 조합을 이용하여 100 units/㎖ DNase Ⅰ(Sigma, 미국)를 첨가한 PBS/EDTA/0.1% BSA에서 4℃, 15분간 염색하였다. 5 mM EDTA가 첨가된 PBS로 세척하고 5 mM EDTA와 BSA가 첨가된 PBS로 부유시킨 후에 항-PE-, 항-FITC-마이크로비즈 또는 둘의 조합을 이용하여 4℃, 15분간 염색하였다. 세척 후에, 염색된 hESCs를 2 연속 MACS 컬럼(LS 컬럼)으로 분류하였다(도 1). 양성 및 음성분획의 순도를 평가하기 위해 염색된 세포를 수집하여 형광색소 결합 항체를 염색하고 유세포분석기, 실시간-PCR 또는 면역형광현미경으로 분석하였다.

세포 표면 항원을 플루오레세인 결합 일차항체로 4℃, 15분간 빛을 차단하여 반응시켜 표지하였다. 염색된 세포를 Cytomics^TM Flow Cytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA, 미국)로 분석하였다. 세포잔해와 응집체를 피하기 위해 적절한 스캐터 게이트를 이용하여 시료 당 2만 개의 세포 분석을 수행하였다. 데이터는 WinMDI 2.8 소프트웨어 (http://facs.scripps.edu/help/html/read1ptl.htm)로 처리하였다. hESC 제거의 효율성은 다음의 식으로 계산하였다: 효율성(%)=1-(용출 분획에서의 % hESC/초기 파퓰레이션의 % hESC)

SCID 마우스에서의 종양형성과 조직학적 분석

모든 동물 실험은 연세의과대학의 Health Sciences Animal Policy and Welfare Committee의 가이드라인에 따라 승인되었다. hESC-제거(SSEA-3 및 TRA-1-60 MACS 분류의 음성분획) 또는 hESC-풍부화 분획의 단일세포 현탁액을 PBS 1회 세척한 후, PBS에 2× 10⁶ cells/㎖ 로 부유하였다. 분주액 100 ㎕를 8주령 웅성 NOD/SCID 마우스(오리엔트 바이오, 서울, 한국)의 고환 캡슐 밑에 이식하였다. 테라토마의 성장은 팔페이션(palpation)으로 매주 결정하였으며, 마우스는 이식 후 12주에 경추탈골 하였다. 조직을 고정하고 섹션한 후 헤마토자일인 & 에오신으로 염색하였다. 포르말린-고정/파라핀-임베딩된 조직에 대하여 면역조직화학법을 실시하였다. 섹션을 자일렌에서 탈파라핀화 하고 연속적인 에탄올 등급으로 수화하였다. 시트레이트-EDTA 완충액(10 mM 시트르산, 2 mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 6.2) 또는 Tris-EDTA(10 mM Trizma base, 1 mM EDTA, 0.05% Tween-20, pH 9) 내의 섹션을 가열하여 항원 회수를 실시하였다. 섹션을 5% 혈청에서 30분 동안 블록킹 하였다. HRP-결합 2차항체를 사용하여 인간 핵 항원(HuNu, Chemicon, Temecula, CA, 미국) 염색을 수행하고 이어 다이아미노벤지딘(diaminobenzidine) 용액과 반응시켰다.

정량적 역전사 - 중합효소연쇄반응 ( qRT - PCR ) 분석

Easy-Spin^TM 총 RNA 추출키트(인트론 바이오테크놀로지, 서울, 한국)를 이용하여 제조자의 지시대로 총 RNAs를 추출하고, 총 RNAs 1 ㎍을 Power cDNA 합성키트(인트론 바이오테크놀로지, 서울, 한국)을 이용해 역전사 하였다. qRT-PCR은 SYBR Premix Ex Taq^TM(다가라바이오, Shiga, 일본)을 사용하여 수행하였으며, My-iQ 또는 CFX96 실시간 시스템(Bio-Rad, Hercules, 미국)을 이용하여 다음의 조건으로 반응을 수행하였다: (1단계) 95℃ 1분; (2단계) (95℃ 20초, 63℃ 20초, 72℃ 20초)를 40회; (3단계) 72℃ 1분 최종 연장. 특정 마커 유전자의 발현값(Ct 값)은 β-액틴의 발현값으로 정규화 하였으며, 마커의 정규화된 발현정도는 △△Ct 방법에 따라 MACS-sorted 세포 사이에 비교하였다.²⁵ 모든 데이터를 3번 이상의 독립 실험으로 확인하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다. Oct4-F 5'-tgg gct cga gaa gga tgt g-3'; Oct4-R 5'-gca tag tcg ctg ctt gat cg-3'; β-actin-F 5'-gct ctt ttc cag cct tcc tt-3'; β-actin-R 5'-ctt ctg cat cct gtc agc aa-3.'

실험 결과

In vitro hESC 의 신경 분화동안 마커의 변화

미분화 hESCs에서 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, Oct4 및 Nanog의 전분화능 줄기세포마커의 양성 염색은 전형적인 특징이다. 본 발명자들은 신경계 세포로의 hESCs 분화동안 표면 마커의 발현 프로필을 조사하였다. 신경전구세포에서 SSEA-3 및 TRA-1-60의 표면 발현은 급감하였으며, TRA-1-81는 상당량 발현되었다(도 2).

SSEA-4(Stage specific embryonic antigen 4)는 적은 정도이긴 하지만, 신경 로제트와 SNMs에서 계속해서 발현되었다. 이 결과는 (1) ESC-유래 신경선조세포와 전구세포가 자연의 인간 배아 뇌-유래 신경선조세포와 유사하다는 것(자연의 인간 배아 뇌-유래 신경선조세포는 SSEA-4를 발현함), 그리고 (2) SSEA-4는 신경계열 세포에서 미분화 ESC 감소에 대한 적합한 마커가 아니라는 것을 보여준다.¹⁹ 따라서, 본 데이터는 SNM의 세포는 정상 인간 뇌의 전형적인 신경선조세포와 매우 관련 있음을 보여준다.

단일 마커에 의한 미분화 hESC 의 제거

중요 줄기 세포 마커의 유세포분석기의 결과는 이러한 마커가 분화세포의 비균질 파퓰레이션으로부터 hESC 제거를 확인할 수 있음을 보여준다. 본 발명자들은 각 마커가 분화세포 중의 hESCs의 중요한 포션이 제거할 수 있는지를 MACS로 확인하였다. 준비 및 이후의 이식을 위해 발명자들은 1:4-1:5 비율로 hESCs와 정상 인간 PBMCs(Peripheral Blood mononuclear cells, 말초혈단핵세포) 혼합물을 고의적으로 만들었다. 그리하여, 초기 세포 파퓰레이션은 20-25% hESC-마커 양성세포를 포함하였다(도 3). PBMCs는 이 hESC 마커에 적은 양성을 나타내었다. hESCs에서 유래한 분화세포에서 SSEA-4는 계속 발현하지만, SSEA-4에 대한 추가적인 분석을 수행하지 않았다. 단일클론항체를 단일 마커로서 활용할 때, 용출(음성) 분획 중의 hESCs의 제거는 불완전하다. 통상적으로, 음성분획은 3-5% 마커-양성 세포(hESCs)를 구성하고 있다. MACS 컬럼에서 마커-양성 세포의 정체는 60-80% 이다. 이는 이전의 결과와 같은 의미로서, 단일항체는 음성분획에서 4-7%의 hESCs 오염을 나타내었다.²⁶

이중마커에 의한 미분화 hESCs 의 제거

모든 hESCs를 완전히 공유하는 전분화능 마커는 없기 때문에, 하나의 항체만을 발현하는 hESCs도 완전히 제거하기 위해 두 종류의 단일클론항체를 활용하여 시도하였다. 또한, 두 MACS 컬럼을 탑 다운 방식으로 조립하여 첫 번째 컬럼의 용출 분획으로부터 항체-염색 세포를 제거하고자 하였다(도 1). MACS 컬럼을 회수할 때, 용출액의 순도는 거의 100% hESC-결여 세포 파퓰레이션에 도달하였다(도 4a). SSEA-3 및 TRA-1-60 항체의 조합은 0.1% hESCs 이하 이었다. 두 연속 MACS 정제는 용출세포의 수를 50%까지 상당히 감소시켰다. 이러한 세포 수의 감소는 양성분획에서 나타나는 컬럼 안의 높은 정체 때문이다.

면역형광 현미경 관찰을 통하여 음성분획 내에 오염 형광세포(SSEA-3 및 TRA-1-60)의 부재를 확인하였고, 이는 양성분획 내의 높은 빈도의 형광 세포와 다른 결과이고, 이러한 결과는 이중 마커-MACS의 효율성을 보여준다(도 4b). 또한, qRT-PCR은 음성분획에 Oct-4+ 세포가 없음을 추가적으로 확인하였다(도 4c).

테라토마 형성

용출(음성) 분획은 최소 12주 동안 NOD/SCID 마우스에서 테라토마를 형성하지 않았다. 양성 및 음성 두 분획의 생존도는 통상적으로 80% 이상 이었다. 이 데이터는 정제물(단일세포 부유물)이 매우 취약하거나 살아남기 위해 숙주 조직의 혈관망(vascular network)에 접근할 수 없음을 보여준다. 1× 10⁵ 세포에 상응하는 응집체로서의 미분화 hESCs는 NOD/SCID 마우스에서 테라토마를 형성하였으며, hESCs의 단일 세포 부유물로 구성된 양성분획은 12주 동안 면역 손상 마우스에서 테라토마를 생성하지 못했다(도 5a). 본 발명자들은 이식된 hESCs가 12주 동안 남아있는 것을 항-인간 핵 학원의 면역조직화학 염색법으로 추가 확인하였다. 정상 마우스 고환 조직 섹션은 내부 음성 대조군으로 쓰였다. 이중 MACS 컬럼 분리시 hESCs의 생존력을 측정하기 위해, 양성분획의 세포로부터 EB의 형성을 유도하였다. 도 5b에서 보듯이, 전형적인 EB 응집체 형성은 MACS 분리한 세포가 in vitro 조작(예를 들어, 세포 배양, 워싱, 염색, MACS 분리 및 컬럼으로부터의 융출) 동안 생존력이 갖고 있음을 보여준다.

토의 사항

현재, hESCs로부터 순수한 치료 세포의 생성은 도전으로 남아있으며, 그러므로, 잔류 미분화세포가 갖고 있는 테라토마 발생 가능성을 없애기 위한 전략적 발전이 필수적이다. 여기, 본 발명자들은 두 종류 단일클론항체의 조합과 함께 2 연속 MACS 컬럼 분리로 이 목표를 이룰 수 있음을 보여준다. MACS에 의한 hESC 제거의 효율성을 종래의 hESC 마커(SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81)로 측정하였다. 수십 년 동안 MACS는 양성 선별과 음성 제거를 위한 가장 특이적인 접근을 제공하였으며, 특정 세포의 정제, 제거를 위한 기초 및 임상 연구에 성공적으로 적용되어왔다. MACS 분리에 대한 한계 사항은 (1)선택 마커 및 (2) 마커에 높은 친화성을 갖는 항체이다. 유세포분석기 데이터에 기초하여, 본 발명자들은 SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81를 MACS 선별의 우수한 후보로 판단하였으며, 본 발명의 전략에 이를 적용하였다.

본 발명자들은 ESC 마커의 조합이 미분화세포를 완전하게 제거할 수 있다는 증거를 제시하였지만, 어떤 ESC 마커는 세포 계통에 의존적인 미분화 세포의 제거에 적합하지 않을 것으로 판단된다. 예를 들어, Shibata et al.는 동종이계 이식에서 cynomolgus ESC-유래 혈구전구세포 중 SSEA-4-양성 세포를 제거함으로써 테라토마의 생성을 억제한다고 보여주었다.¹⁷ 그러나, 이 마커는 신경 세포 계통에서는 사용될 수 없는데, 그 이유는 본 발명자들이 ESC 보다는 낮은 레벨이지만 ESC-유래 신경 전구세포가 공통적으로 상기 마커를 발현한다는 것을 발견하였기 때문이다. 이러한 실험 결과는, 인간 뇌 신경 선조세포가 SSEA-4를 발현한다는 보고와 일치하는 것이다.¹⁹

2-연속 MACS 전략은, 분화세포(PBMC)와 20-25% hESC의 혼합물로부터 용출 분획의 SSEA-3⁺ 및/또는 TRA-1-60⁺ 세포가 0.1% 세포 미만을 포함하는 것을 제공하였다. 유세포분석기 피노타이핑의 해상도가 통상적으로 0.01% 레벨을 초과하기 때문에, 본 발명자들은 면역형광현미경을 사용하여 음성분획 중의 hESCs의 양을 추가적으로 측정하였다. 측정된 10,000 개 이상의 세포 중에서, 형광세포(항체-염색 세포)는 발견되지 않았으며, 이는 오염이 총 세포의 0.01%를 초과하지 않음을 보여주는 것이다. 또한 음성분획의 RT-PCR 결과에서 신호가 발견되지 않은 것으로 이 접근법이 음성 선별된 세포 중의 미분화 hESCs를 거의 완전하게 제거할 수 있음을 보여준다. 또한, 본 발명자들은 최소 12주 동안에 hESC-양성분획뿐 아니라, hESC-제거(음성) 분획에서 어떠한 테라토마 형성을 관찰 할 수 없었다. hESC 응집체(10⁶ hESCs)를 연구한 다른 보고와 달리 2× 10⁵(MACS 분류의 양성분획 안의 5× 10⁴ 이하 hESCs)수의 단일세포 부유물을 고환에 주입하여 (양성분획에 의한) 테라토마가 형성되지 않음을 관찰하였다.^8,27 전형적으로 1× 10⁶의 미분화세포를 고환에 주입하였을 때, 테라토마 형성률은 94%이다.²⁸ 이러한 이유는 (1) 적은 수의 hESCs는 종양을 형성할 수 없고, (2) hESCs의 차선의 수 또는 (3) 정상적으로 응집체를 형성하는 것과 비교하여 MACS 후 단일세포 부유물의 낮은 생존력 때문일 것이다. 임상의 경우, 테라토마의 형성이 억제되어야하므로, 이러한 hESCs를 포함하는 단일 세포 부유물의 결과는 세포치료에 있어 기대되는 전략을 제공한다.

mESC 모델을 이용한 Schriebl et al.의 최근 논문은 MACS 기술이 이론적으로 ESCs로부터 유래한 미분화 세포가-없는 세포 치료제의 정제하는데 불충분하다고 말한다.²⁹ 그들의 수학적 추산을 보면, 반복적인 MACS 분리의 30단계 이상이, 치료를 위한 10⁹ 세포 중 10^-1 이하의 세포를 얻은 데 요구된다. 그러나, 이 모델은 오염세포를 전체의 0.0000001%로 제한함으로써 매우 엄격하게 안전성의 이슈를 반영하였다. 설치류와 인간 hESCs 사이의 테라토마 형성 효율의 차이로부터, 테라토마 형성을 위한 hESC의 최소 요구 수가 완전히 밝혀져 있지 않으며, 최소 100-10,000배 정도 더 클 것으로 판단된다. 또한, 단일세포 부유물 상태 hESCs의 체내 생존력, 생존, 면역학적 인지 및 국부 미세환경을 고려하면, 테라토마 형성을 위한 hESC의 최소 요구 수는 2-3배 더 증가할 것이다. 이러한 파라미터를 고려하면, 10⁹세포 중 10⁴~10⁵ 세포(즉, 0.001-0.01%)는 임상 적용을 위한 안전성 마진으로 역할을 할 것이다. 같은 맥락으로, Shibata et al.는 동종이계 원숭이 모델로 이식 시, 사이노몰그 ESC-유래 혈구 선조세포에서 SSEA-4-양성세포를 제거하면 테라토마의 형성이 억제된다고 보고했다.¹⁷ hESCs의 유세포분석기 제거는 오염세포가 거의 없는 보다 순수한 파퓰레이션을 제공하지만, 상기 기술을 이용하여 단지 몇 번의 연구만 성공적으로 이루어졌으며 이는 소팅된 세포의 생존도에 영향을 주는 저속 소팅 속도 때문이다.^17,30,31 다시 말해, MACS 분리에 있어 높은 결합 활성을 갖는 항체와 프로토콜의 추가적인 개선은 높은 생존률과 신속하고 효율적인 제거/정제를 제공할 것이다.

결과적으로, 본 발명자들의 결과는 이중컬럼 MACS 분리가 비균질 세포 파퓰레이션에서 hESCs의 완전한 제거에 효과적이라고 설명한다. 염색과 분리의 전반적인 과정이 1시간을 넘지 않으며, 트리판 블루 및 EB 형성 분석으로 보아, 음성 및 양성의 생존력은 용인될 수 있었다. 따라서, MACS 전략은 임상 적용하기에 알맞은 고순도 미분화 hESC-결여, 생존 세포준비를 할 수 있다. 다단계 MACS는 높은 특이성과 결합 활성을 갖는 두 종류 이상의 마커에 대한 항체를 이용하여 종양형성 가능성이 없는 세포 치료제에 대한 보다나은 해결을 제공하였다. 선별적인 제거를 위한 다른 전략 및/또는 화합물 또는 세포독성 항체로 인한 아폽토시스의 활용은 특정 세포의 분리 및/또는 제거의 효율성을 증가시킬 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (11)

1. 다음 단계를 포함하는 미분화 전능성 줄기세포(pluripotent stem cells) 및 분화된 신경 세포(differentiated neural cells)를 포함하는 세포 시료에서의 미분화 전능성 줄기세포의 제거방법:
   (a) 미분화 전능성 줄기세포를 신경 세포(neural cells)로 분화시킴으로써 미분화 전능성 줄기세포 및 분화된 신경 세포(differentiated neural cells)를 포함하는 세포 시료를 준비(preparation)하는 단계;
   (b) 상기 세포 시료에 SSEA-3(stage-specific embryonic antigen-3) 항체 및 TRA(tumor rejection antigen)-1-60 항체를 접촉시키는 단계; 및
   (c) 상기 SSEA-3 항체가 결합된 세포, 상기 TRA-1-60 항체가 결합된 세포 및 상기 SSEA-3 항체 및 상기 TRA-1-60 항체 모두가 결합된 세포를 분리하는 단계.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 미분화 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells), 배아생식세포(embryonic germ cells), 배아종양세포(embryonic carcinoma cells) 또는 iPSCs(induced pluripotent stem cells)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 미분화 전능성 줄기세포는 배아줄기세포(embryonic stem cells)인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 자기활성세포분리(magnetic activated cell sorting: MACS), 형광활성세포분리(fluorescent-activated cell sorting: FACS), 및 보체 매개성 용해(complement-mediated lysis)에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제 7 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 MACS에 의해 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
9. 제 8 항에 있어서, 상기 MACS에 의한 분리는 최소 2회 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
10. 삭제
11. 삭제

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