KR20140071512A

KR20140071512A - 시험관 내 조건에서 희돌기아교-계통 세포로 분화하는 경향이 있는 포유류의 신경줄기세포 및／또는 신경선조세포의 순수 또는 농축 세포군을 수득하고 유지하는 세포배양방법

Info

Publication number: KR20140071512A
Application number: KR1020137018381A
Authority: KR
Inventors: 츠네오 키도
Original assignee: 츠네오 키도
Priority date: 2011-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2014-06-11
Also published as: CN103687941A; NZ712598A; US8993320B2; WO2012095730A1; IL227361B; JP5649745B2; AR084835A1; CN109749996A; AU2012206411A1; MX2013008208A; PL2663638T3; JP2014503219A; ES2732938T3; NZ611902A; EP2663638A1; TW201237169A; EA201390801A1; AU2012206411B2; TWI586805B; EP2663638B1

Abstract

선조세포 또는 줄기세포인, 분리된 증식가능한 인간 신경줄기세포 또는 선조세포는 신경세포, 성상교세포, 및 희돌기아교세포로 분화할 수 있는 능력을 유지하고, 이후의 계대를 통해 희돌기아교 계통 세포로 효율적으로 분화할 수 있는 능력을 유지하며, 적어도 세포표면 항원 CD133 및 CD140α를 발현한다. 아울러, 신경세포, 성상교세포, 및 희돌기아교세포로 분화할 수 있는 능력과 희돌기아교 계통 세포로 효율적으로 분화할 수 있는 능력을 유지하는, 증식가능한 신경선조세포 또는 신경줄기세포를 시험관 내 조건에서 배양하는 방법 및 그 배양물 자체가 제공된다. 더 나아가, 증식가능한 신경줄기세포 또는 본 발명의 방법에 의해 배양된 세포를 포함하는 조성물의 형태로 제공되는 수초의 손실 또는 희돌기아교세포의 손실에 의해 야기되는 증상의 치료방법이 제공된다.

Description

시험관 내 조건에서 희돌기아교-계통 세포로 분화하는 경향이 있는 포유류의 신경줄기세포 및／또는 신경선조세포의 순수 또는 농축 세포군을 수득하고 유지하는 세포배양방법{Culture method to obtain and maintain a pure or enriched population of mammalian neural stem cells and/or neural progenitor cells that are prone to differentiate into oligodendrocyte-lineage cells in vitro}

본 발명은 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포의 세포배양방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 시험관 내 조건(in vitro)에서 희돌기아교-계통 세포(oligodendrocyte-lineage cell)로 분화하는 경향이 있는 포유류의 신경줄기세포(neural stem cells) 및/또는 신경선조세포(neural progenitor cells)의 순수 또는 농축 세포군을 수득하고 유지하는 세포배양방법에 관한 것이다.

본 출원은 2011년 1월 12일에 출원된 미국 가출원번호 61/431,944 및 2011년 11월 11일에 출원된 미국 가출원번호 61/558,527과 관련된 출원이다.

중추신경계의 발달 과정 중에, 원시적인, 다분화능 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)가 증식하여, 성체 뇌를 구성하는 다양한 세포 형태로 분화하는 전구세포로 일시적으로 나뉘게 된다. 성체 중추신경계는 주로 신경세포(neuron), 성상교세포(astrocyte) 및 희돌기아교세포(oligodendrocyte)를 포함하는 교세포(glial cell)로 이루어진다. 신경세포, 성상교세포 및 희돌기아교세포에 대한 선조세포(progenitor cells)는 발달중인 뇌의 신경줄기세포로부터 순차적으로 유래한다(도 1). 신경선조세포들이 최초로 형성되고 여러 형태의 신경세포로 분화한다. 성상교세포는 두 번째로 발달되고 신경세포의 생존을 지원하는 기능을 한다. 마지막으로 희돌기아교 선조세포(oligodendrocyte progenitor cell)가 나타나기 시작하여 중추신경계 전반에 걸쳐 이동한다. 상기 희돌기아교 선조세포는 이어 성숙한 희돌기아교세포로 분화하고, 적절한 신경세포의 기능을 위해 필수적인 수초(myelin)을 생산한다.

희돌기아교세포는 중추신경계를 지원하는데 중요한 역할을 하기 때문에, 희돌기아교세포 또는 이의 선조세포(즉, 희돌기아교 전-선조세포 및/또는 희돌기아교 선조세포)의 순수 또는 농축 세포집단(population)은 선천적인 탈수초성 질환(예를 들어, 크라베병(Krabbe disease)과 메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher disease)), 척수손상 및 신경세포를 절연하는 수초의 결함으로 인해 야기되는 다른 증상을 포함하는 신경질환의 치료에 사용되는 세포치료제 및 재생의약에 유용할 수 있다. 이들 세포는 또한 다발성경화증과 정신분열증과 같은 많은 신경질환의 연구 및 이들 질환의 치료를 위한 새로운 약물의 탐색을 위해 사용될 수 있다.

성숙한 희돌기아교세포는 배양시 증식하지 않고 잘 생존하지 않으며, 연구 또는 인간의 치료에 사용하기에 충분한 양의 희돌기아교세포를 조직 시료로부터 직접 수득하는 것은 극히 어렵다. 결과적으로, 이러한 목적을 위해 희돌기아교세포를 사용하는 데에는 이들 세포의 가용성 부족이 걸림돌로 작용한다.

이 문제를 해결하는 한 가지 방법은, 조직으로부터 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포를 수득하여, 향후 희돌기아교세포로 분화할 수 있는 충분히 많은 양의 세포를 수득하기 위해 이들 세포를 배양하여 증식시키는 것과 관련되어 있다. 분화는 이식의 경우와 같이 시험관 내 또는 생체 내 조건에서 모두 일어날 수 있다. 이를 통해 연구 및 인간의 치료에 사용하기 위해 희돌기아교세포, 또는 이의 선조세포 또는 전-선조세포의 대량의 집단을 형성할 수 있다.

그러나 과학자들은 - 특히 인간 또는 비인간 영장류로부터 - 희돌기아교 선조세포 및/또는 희돌기아교 전-선조세포의 대량 증식과 장기적인 배양을 가능케 하는 배양조건을 확인하기 위해 노력해 왔는데, 이러한 증식된 세포집단은 기본적으로 희돌기아교세포로 분화할 수 있는 능력을 유지하는 세포들로 구성되어 있다.

몇몇 과학자들은 랫트로부터 희돌기아교 선조세포를 수득하는 것이 가능하다고 보고해왔다(Raff et al., J. Neurosci., 3:1289, 1983; Raff et al., Nature., 303:390, 1983; Espinosa de los Monteros et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 90:50, 1993). 이들 증식성 희돌기아교 선조세포는 시험관 내 조건(in vitro)에서 희돌기아교세포나 또는 제2형 성상교세포(type 2 astrocytes)로 분화하는 능력 때문에 O-2A 전구세포로 알려졌다. 다른 과학자들은 초도배양(primary culture)에서 랫트 또는 마우스 희돌기아교 전-선조세포를 확인하였다(Gallo, Armstrong RC, J. Neurosci., 5:394, 1995; Grinspan, Franceschini B, J. Neurosci. Res., 41 :540, 1995; Decker et al., Mol. Cell. Neurosci., 16:422, 2000). 이들 세포는 희돌기아교 선조세포의 전구체로서 사료되며, 희돌기아교 선조세포에 비하여 그들의 우수한 이동 능력(migration capacity) 때문에 세포치료에 더 유용할 것으로 기대된다. 그러나 불행하게도, 과학자들은 시험관 내 조건에서 장기적으로 이들 세포를 효과적으로 증식하는데 실패해왔다. 반면, 과학자들은 B104 조건 배지(conditioned medium)나 (i) 염기성 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor, bFGF) 및 뉴로트로핀-3(neurotrophin-3, NT-3)를 수반한 혈소판 유래 성장인자-AA(platelet derived growth factor-AA, PDGF-AA), 또는 (ii) 섬모상 향신경성 인자(ciliary neurotrophic factor, CNTF) 및 NT-3를 수반한 PDGF-AA와 같은 성장인자(growth factor)의 조합을 이용하여 랫트 시신경(optic nerve) 또는 척수 유래의 O2A 전구세포의 배양방법을 보고한 바 있다. 그러나 어느 누구도 이들 성장인자를 사용하여 영장류 조직으로부터 이들 유형의 세포들은 대량 증식하는데 성공한 바 없다.

그러므로 랫트나 마우스 이상의 다른 포유류로부터 희돌기아교세포 및/또는 희돌기아교세포 선조세포의 순수 또는 농축 집단을 수득하고 증식하는 것은 매우 어려운 일로 남아있다. 인간 및 비인간 영장류로부터 이들 세포를 수득하고 증식하는 것은 특히 더욱 어렵다. 그러므로 시험관 내 조건에서 희돌기아교-계통 세포로 분화할 수 있는 포유류 신경줄기세포 또는 신경선조세포의 순수 또는 농축 집단을 형성하는 방법에 대한 큰 필요성이 존재한다.

본 발명은 신경세포, 성상교세포, 및 희돌기아교세포로 분화되는 능력을 유지하고, 이후의 계대배양을 통해 희돌기아교-계통 세포로 분화하는 능력을 유지하며, 적어도 세포표면항원 CD133 및 CD140α를 발현하는, 분리된 증식 가능한 인간 신경선조세포 또는 신경줄기세포에 관련된 것이다.

본 발명은 또한 시험관 내 조건에서 증식 가능한 포유류 중추신경계로부터 분리된 신경선조세포와 신경줄기세포에 대한 세포배양 방법으로서, 상기 세포는 신경세포, 성상교세포 및 희돌기아교세포로 분화하는 능력과 효과적으로 희돌기아교-계통 세포로 분화하는 능력을 유지하며, 인간 배아 신경조직으로부터 적어도 하나의 세포를 분리 및 해리하는 단계; 상기 세포를 적어도 5 ng/ml PDGF-AA, 0.5 ng/ml bFGF, 10 μM 1-티오글리세롤(1-thioglycerol)을 포함하는 화학적으로 정의된(chemically defined) 무혈청 배양배지에서 1~20% O₂, 5% CO₂ 분위기에서 37℃ 온도로 배양하는 단계; 및 상기 증식가능한 인간 신경세포를 수득하기 위해 상기 세포를 계대배양하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 신경세포, 성상교세포, 및 희돌기아교세포로 분화되는 능력을 유지할 수 있고, 이후의 계대배양을 통해 희돌기아교-계통 세포로 분화하는 능력을 유지하는, 적어도 세포표면항원 CD133 및 CD140α를 발현하는, 분리된 증식가능한 인간 신경선조세포 또는 신경줄기세포를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 수초의 손실 또는 희돌기아교세포의 손실에 의해 유발되는 증상의 치료방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 포유류의 중추신경계로부터 수득된 분리된, 적어도 5 ng/ml PDGF-AA, 5 ng/ml bFGF 및 10 μM 1-티오글리세롤을 포함하는 화학적으로 정의된 무혈청 배지에 잠겨있는 적어도 하나 이상의 신경세포를 포함하는 시험관 내 조건의 배양물에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 분리된 증식가능한 인간 신경세포를 포함하는 약제학적 신경 줄기세포 조성물에 관한 것이다.

덧붙여, 본 발명은 증상을 치료하기 위한 의약에 있어서 약제학적 신경줄기세포 조성물의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 시험관 내 조건에서 포유류의 중추신경계로부터 분리된 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포의 시험관 내 조건의 배양 및 증식방법에 관한 것으로서, 상기 배양되고 증식된 세포는 희돌기아교-계통 세포로 분화할 수 있는 능력을 유지한다. 본 발명에서 세포배양은 부착배양이다.

본 발명은 시험관 내 조건에서 희돌기아교-계통 세포(즉, 도 7 및 도 15에서 나타난 바와 같이 거미줄 형태를 가진 O4-양성 세포)로 분화하는 경향이 있는 증식된 포유동물 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포의 분리된 순수 또는 농축된 세포집단에 관한 것이다.

본 발명은 더 나아가 포유동물 중추신경계로부터 분리된 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포로부터 시험관 내 조건의 증식 및 분화를 통해 형성된 포유류 희돌기아교-계통 세포에 관한 것이다.

도 1은 신경줄기세포 및 신경선조세포의 뇌-신경세포, 성상교세포 및 희돌기아교세포의 세 가지 주요 유형의 세포로의 발생을 나타낸다.
도 2는 다양한 CNS 세포의 표지자 발현의 비교를 나타낸다.
도 3은 슬라이드 A-F에서 인간 배아줄기세포(HFSC, 클론 #2b)의 위상차현미경 이미지를 나타낸다.
도 4는 각기 다른 조합의 성장인자 존재 하에서의 HFSC 세포(클론 #2b)의 증식 속도를 나타낸다.
도 5는 HFSC 세포(클론 #2b)의 증식에 대한 고농도의 PDGF-AA(100 ng/ml) 및 1-티오글리세롤의 효과를 나타낸다.
도 6은 HFSC 세포(클론 #2b)의 성장곡선을 나타낸다.
도 7은 슬라이드 A-F에서 무혈청 배지에서의 HFSC 세포의 자발적 분화를 나타낸다.
도 8은 다양한 계대에서 HFSC 세포(클론 #3)의 형태를 보여주는 도립현미경으로 촬영한 위상차현미경 이미지이다.
도 9는 HFSC 세포(클론 #3)의 성장 곡선을 나타낸다.
도 10은 슬라이드 A-F에서 다양한 계대에서 HFSC 세포(클론 #4A 및 #4B)의 형태를 보여주는 도립현미경으로 촬영한 위상차현미경 이미지이다.
도 11은 HFSC 세포(클론 #4A 및 #4B)의 성장 곡선을 나타낸다.
도 12는 A-S 슬라이드에서의 미분화 HFSC 세포의 면역-표현형을 나타낸다.
도 13은 A-H 슬라이드에서의, 미분화 HFSC 세포(클론 #2b, 계대 13)의 비율을 나타내는 유세포분석 데이터를 나타낸다.
도 14는 분화된 HFSC 세포(클론 #3, 계대 15)의 면역-표현형을 나타낸다.
도 15는 슬라이드 A-E에서 HFSC 세포(클론 #2b, 계대 15)의 분화 잠재력을 나타낸다.

도면에 대한 자세한 설명

도 1은 신경줄기세포 및 신경선조세포의 뇌-신경세포, 성상교세포 및 희돌기아교세포라는 세 가지 주요 세포 유형으로의 발생을 보여준다. 실선 화살표는 한 가지 유형의 세포의 다른 유형의 세포로의 진행을 나타낸다. HFSC로부터의 신경세포-제한 전구체(neuronal-restricted precursors, NRP)로의 점선은 상기 HFSC 세포가 신경세포로의 전환에 대한 낮은 경향을 가짐을 나타낸다. HFSC 세포로부터 O2A 세포로의 굵은 실선은 상기 HFSC 세포가 희돌기아교-계통 세포를 생산하는 큰 경향성을 가짐을 나타낸다. HFSC 세포의 신경세포, 성상교세포, 및 희돌기아교세포로의 다분화능은 실시예 7에서 나타냈다(도 14 참조). 희돌기아교-계통 세포로 분화되는 HFSC 세포의 경향성은 실시예 2(도 7 참조) 및 실시예 8(도 15 참조)에서 나타냈다.

도 2는 다양한 CNS 세포의 표지자 발현의 비교를 보여준다. 본 발명은 실시예 7(도 12 및 도 13 참조)에서 HFSC 세포의 표현형을 개시하고, 상기 도면에서 동일한 내용을 요약하고 있다. 후술하겠지만, HFSC 세포는 다른 세포 유형과 동일하지 않고 신경줄기세포 및 희돌기아교세포 제2형 성상교 선조체(oligodendrocyte Type-2 astrocyte progenitor, 02A) 모두의 특징을 가지고 있다.

도 3은 슬라이드 A-F에서 인간 배아줄기세포(클론 #2b)의 위상차현미경 이미지(phase contrast image)를 나타낸다. 도 3의 슬라이드 A는 20 ng/ml PDGF-AA와 10 ng/ml bFGF를 처리하고, 글루타민과 HEPES를 포함하고 B27 보충물(Invtrogen^TM), 비필수 아미노산(NEAA, Invtrogen^TM), 1.5 mM 피루브산(Invtrogen^TM), 55 μM β-머캅토에탄올(Invtrogen^TM), 및 1 mM N-아세틸-L-시스테인(Sigma)이 보충된 DMEM/F12 배지(이하, "HFSCM1 배지" 약칭함)에서 37℃의 온도조건, 5% O₂, 및 5% CO₂의 분위기의 배양기에서 배양된 HFSC 세포(클론 #2b)를 보여주는 도립현미경(inverted microscopy)으로 촬영된 위상차현미경 이미지이다. 이들 보여진 세포들은 계대 0의 7일째의 세포들이다. 상기 세포들은 구체를 형성하였고 이들 구체는 계대 1에서 폴리-오르니틴이 코팅된 배양 접시에 구체를 해체하지 않고 직접 분주하였다.

도 3의 슬라이드 B 및 슬라이드 C는 상기 도 3의 슬라이드 A에 대하여 설명한 바와 같이 배양된 HFSC 세포(클론 #2b)를 보여주는 도립현미경으로 촬영된 위상차 현미경 이미지이다. 이들 세포들은 각각 계대 1의 1일째 및 계대 2의 14일째의 세포들이다. 이들 세포들은 폴리-오르니틴이 코팅된 배양 접시에 직접 부착하였고 구체로부터 뻗어나갔다(도 3의 슬라이드 B). 상기 계대된 세포들은 이후 계대배양시 이와 같은 배양 조건에서는 성공적으로 증식할 수 없었다(도 3의 슬라이드 C).

도 3의 슬라이드 D-F는 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤을 처리한 HFSCM1 배지에서 37℃의 온도조건, 5% O₂, 및 5% CO₂의 분위기의 배양기에서 여러번 계대되고 배양된 후의 HFSC 세포(클론 #2b)를 보여주는 도립현미경으로 촬영된 위상차현미경 이미지이다. 대부분의 HFSC 세포들은 둘러싸고 있는 세포들과 함께 클러스터를 형성하고 있는 암영상의 세포들(phase dark cells)이었다. 상기 클러스터로부터 분리된 산개세포들(scattered cells)은 전-희돌기아교아세포(pro-oligodendroblast) 또는 미성숙 희돌기아교세포의 전형적인 특징인 프로세스-지향 다중극 세포들(process-bearing mulipolar cells, 이른바, "거미줄-유사" 형태로 불리움)로 자발적으로 분화하는 경향을 보였으나, 이러한 외형을 같는 세포들의 빈도는 1% 미만에 불과했다. 도 3의 슬라이드 D, E, 및 F에서 보이는 세포들은 각각 계대 8의 8일째, 계대 11의 11일째, 및 계대 19의 11일째의 세포들이다.

도 4는 하기와 같은 성장인자의 다른 조합의 존재 하에서의 HFSC 세포들(클론 #2b)의 증식속도를 나타낸다: (1): 20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF; (2): 20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 5 ng/ml NT-3; (3): 20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1; (4): 20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 5 ng/ml NT-3 + 10 ng/ml IGF-1. 상기 세포들은 계대 3의 11일째(P3D11)에 수확되어 각각의 조건에서의 생존 세포를 계수하였다. 그런 다음, 이들을 계대 3에서 사용된 것과 동일한 조건으로 동일 세포 밀도로 계대하였다. 이들 세포들은 계대 4의 8일째(P4D8)에 수확한 후 각 조건에서의 생존 세포를 계수하였다(이들 세포들은 구체를 형성하기 시작하였기 때문에 부포화(sub-confluent) 상태 전에 수확되었다). 조건 (4)가 계대 3에서는 가장 효과적이었으나 계대 4에서는 그렇지 않았고, 조건 (3)은 양 계대 모두에서 효과적이었다.

도 5는 하기 조합의 성장인자의 존재 하에서 HFSCM1 배지에서 배양된 HFSC 세포(클론 #2b)의 증식에 있어서의 고농도의 PDGF-AA(100 ng/ml)와 1-티오글리세롤의 영향을 나타낸다): (1): 20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1; (2): 20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1 + 50 μM 1-티오글리세롤; (3): 100 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1; (4): 100 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1 + 50 μM 1-티오글리세롤; (5): 100 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 50 μM 1-티오글리세롤. 상기 세포들은 계대 5의 7일째에 수확되었고(이들 세포들은 계대 4에서 그랬던 것처럼 구체를 형성하기 시작했기 때문에 부-포화 상태 전에 수확되었다). 각 조건에 따라 생존세포를 계수하였다. 20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF의 조합 역시 조사하였으나, 평가하기에는 너무 적은 수의 세포가 회수되었고(측정 가능 범위에서 1 x 10⁴ 세포 미만) 이에 상기 도면에서 데이터는 제거되었다. 조건 (1)은 계대 3에서 세포를 증식시킬 수 있었으나 계대 5에서는 세포를 증식시킬 수 없었다. 50 μM 1-티오글리세롤의 첨가시[조건 (2)] 또는 100 ng/ml까지의 PDGF-AA 농도의 증가시[조건 (3)] 증식속도 상에서 아주 약한 정도의 양성의 효과가 나타났다. 50 μM 1-티오글리세롤의 첨가 및 PDGF-AA 농도의 100 ng/ml까지의 상승을 조합한 경우[조건 (4)], 상기 세포 증식속도는 극적으로 향상되었고 상기 세포들은 성공적으로 증식할 수 있었다. 이러한 조건에서 IGF-1을 제거할 경우[조건 (5)], 상기 증식속도는 1 미만으로 감소하여, IGF-1이 HFSC 세포의 증식 및/또는 생존을 촉진함을 나타냈다.

도 6 은 인간 HFSC 세포(클론 #2b, 흑색선으로 연결된 개방원)의 생장곡선을 나타낸다. HFSC 세포(클론 #2b)는 초기에 10 ng/ml PDGF-AA 및 10 ng/ml bFGF의 존재하에 배양되었다. 10 ng/ml IGF-1가 계대 3부터 첨가되었다. PDGF-AA의 농도는 계대 6부터 20 ng/ml에서 100 ng/ml로 증가되었다. 그러나, 이들 세포의 증식속도에 대하여 아주 미미한 영향을 주거나 거의 영향을 미치지 못하였다. 계대 7부터 50 μM 1-티오글리세롤이 첨가되었다. HFSC 세포(클론 #2b)는 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤의 존재 하에서 급속히 성장하기 시작하였다. 계대 17에서 10 ng/ml NT-3가 첨가되었다. NT-3는 상기 세포의 성장을 약간 향상시켰으나 이러한 효과는 계대 후에 사라졌다. 본 도판(pannel)은 또한 계대 10의 6일째(P11D6: 쇄선으로 연결된 개방원) 및 계대 11의 11일째(P11D11; 점선으로 연결된 개방원)째에 냉동시킨 인간 HFSC 세포의 성장곡선을 포함한다. 상기 냉동된 세포들은 녹인 후 유사한 속도로 증식할 수 있었다.

도 7은 슬라이드 A-F에서 무혈청 배지에서의 HFSC 세포의 자발적 분화를 나타낸다. 슬라이드 A 및 B는 20 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤(도 7의 슬라이드 A)이 보충된 HFSCM1 배지 또는 상기 배지에서 1-티오글리세롤이 제거된 배지(도 7의 슬라이드 B)로 배양된 이후 계대 12의 9일째(도 7의 슬라이드 A 및 B)의 HFSC 세포의 형태적 변화를 나타내는 도립현미경으로 촬영한 위상차현미경 이미지이다. HFSC 세포는 배지교환 사이에 bFGF의 보충 없이도 자발적으로 분화하였다. 심지어 동일 조건에서 매일 bFGF가 보충되면 HFSC 세포는 분화하지 않았고, 서서히 성장하는 것으로 보였다. 덧붙여, HFSC 세포는 40 ng/ml 또는 더 높은 농도의 PDGF-AA가 사용될 경우 분화가 차단되었고 클러스터를 형성하였다. PDGF-AA 농도를 100 ng/ml로부터 20 ng/ml로 감소시키고 bFGF를 보충하지 않을 경우, 세포는 거미줄-유사 형태를 가진 프로세스-지향 다중극 세포로 자발적으로 분화하였고, 이들 세포는 O4 항원(도 7의 슬라이드 C 및 D) 및 GalC 항원(도 7의 슬라이드 E 및 F)을 발현하였으며, 이는 희돌기아교-계통 세포[예를 들어, 전-희돌기아교아세포(pro-oligodendroblast, O4-양성 및 GalC-음성), 미성숙 희돌기아교세포(immature oligodendrocyte, O4-양성 및 GalC-양성)]의 특징을 규정짓는 것이다.

도 8은 다양한 계대에서의 HFSC 세포(클론 #3)의 형태를 나타내는 도립현미경으로 촬영한 위상차현미경 이미지이다. 통상적인 신경줄기세포는 15일 동안 bFGF 및 EGF의 존재 하에 초기 증식한다(계대 0의 15일째의 도 8의 슬라이드 A 참조). 그 이후, 상기 세포는 20 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF을 처리한 HFSCM1 배지에서 37℃의 온도조건, 5% O₂, 및 5% CO₂의 분위기의 배양기에서 배양되었다. PDGF-AA의 농도를 100 ng/ml로 증가시켰고, 10 ng/ml의 IGF-1을 계대 8부터 첨가하였으며(도 9 참조), 50 μM 1-티오글리세롤을 계대 8부터 첨가하였다(도 9 참조). 이들의 형태는 수 계대 후에 클론 #2b와 거의 동일하게 되었다.

도 9는 인간 HFSC 세포(클론 #3, 흑색선으로 연결된 개방원)의 성장곡선을 타나낸다. HFSC 세포(클론 #3)는 초기에는 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml bFGF의 존재하에 배양되었고 통상적인 신경줄기세포로 증식되었다. 그런 다음, 상기 성장인자 조합은 계대 1부터 20 ng/ml PDGF-AA 및 10 ng/ml bFGF, 계대 2부터 10 ng/ml IGF-1 및 10 ng/ml NT-3로 변화시켰다. 도 4에 나타난 데이터를 기반으로, NT-3를 이들 배양에서 제거하였고 PDGF-AA의 농도를 계대 4부터 20 ng/ml에서 100 ng/ml로 증가시켰다. 그러나, 클론 #2b에서 나타난 바와 같이 세포 증식속도 상에 아주 미미한 영향을 미치거나 거의 영향을 미치지 않았다. 계대 5부터 50 μM 1-티오글리세롤을 첨가하였고 HFSC 세포(클론 #3)은 HFSC 세포(클론 #2b)가 그랬던 것처럼 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤의 존재하에 급격히 성장하기 시작하였다. 본 도판은 또한 계대 7의 7일째(P10D7: 쇄선으로 여결된 개방원)에 동결시킨 인간 HFSC 세포(클론 #3)의 성장곡선을 포함한다. 상기 동결 세포는 해동 이후에 유사한 속도로 증식할 수 있었다.

도 10은 슬라이드 A-F에서 다양한 계대에서의 HFSC 세포(클론 4A 및 4B)의 형태를 나타내는 도립현미경으로 촬영한 위상차현미경 이미지이다. 이들 세포들은 20 ng/ml PDGF-AA, 20 ng/ml bFGF 및 20 ng/ml of IGF-1(클론 #4A) 또는 100 ng/ml PDGF-AA, 20 ng/ml bFGF 및 20 ng/ml IGF-1(클론 #4B)와 함께 50 μM 1-티오글리세롤이 첨가된 HFSCM1 배지에서 37°C의 온도조건, 5% O₂ 및 5% CO₂의 분위기의 배양기에서 배양되었다. 클론 #4A는 초기에는 클론 #4B보다 더 느리게 성장하였으나 계대 2부터는 클론 #4B와 같은 속도로 성장하기 시작하였다. 이들은 거의 균일화되었고 이들의 형태는 계대 3 이후에는 클론 #2b 및 클론 #3과 거의 동일하게 됐다.

도 11은 인간 HFSC 세포(클론 #4A: 쇄선으로 연결한 개방원 및 클론 #4B 흑색실선으로 연결한 개방원)의 성장곡선을 나타낸다. HFSC 세포(클론 #4A)는 20 ng/ml PDGF-AA, 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤의 존재하에 배양되었다. HFSC 세포(클론 #4B)는 100 ng/ml of PDGF-AA, 20 ng/ml bFGF and 20 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤의 존재 하에서 배양되었다. 양 클론의 세포수는 처음에는 급격하게 감소하였고 이러한 감소는 클론 #4A에서 보다 두드러졌다. 이러한 세포수의 초기 감소 이후에, 이들 세포들은 급격하게 증식하기 시작했다. 본 도판은 또한 계대 5의 6일째(P5D6: 쇄선으로 연결된 개방원)에 동결된 인간 HFSC 세포의 성장곡선을 포함한다.

도 12는 슬라이드 A-S에서 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1, 및 50 μM 1-티오글리세롤의 존재하에서 배양되고, CD133, Sox2, 네스틴(nestin), Olig2, PDGF-Rα, NG2, A2B5, PSA-NCAM, GFAP 또는 비멘틴(vimentin) 중 어느 하나에 대하여 양성으로 염색되는 미분화 HFSC 세포(클론 #2b, 계대 12-16)의 면역-표현형을 나타낸다. DAPI가 핵의 대비염색(counterstaining)을 위해 사용되었다. 이들 그림들은 적어도 90% 이상의 세포들이 CD133, Sox2, 네스틴, Olig2, PDGF-Rα, NG2, A2B5 및 비멘틴에 대하여 양성이고 GFAP-양성 세포는 없음을 나타낸다. PSA-NCAM의 염색은 다소 약하였으나 90% 이상의 세포들은 여전히 PSA-NCAM에 대하여 양성으로 보였다.

도 13은, 슬라이드 A-H에서, 미분화 HFSC 세포(클론 #2b)의 비율을 나타내는 유세포분석(flow cytometry) 데이터를 보여준다. 흑색선 히스토그램은 동형 대조군을 나타내고, 회색으로 칠해진 히스토그램은 각 조사된 항원을 나타낸다. 이들 데이터는 대부분의 HFSC 세포가 CD133-양성(도 13의 슬라이드 A), CD9-양성(도 13의 슬라이드 B), CD140α-양성(도 13의 슬라이드 C), NG2-양성(도 13의 슬라이드 D), A2B5-양성(도 13의 슬라이드 E), O4-양성(도 13의 슬라이드 F), PSA-NCAM-양성(도 13의 슬라이드 G)임을 나타냈다. 면역세포화학분석에 의해 조사된 바와 같이(데이터는 제시되지 않음), CD44는 음성이었다(도 13의 슬라이드 H).

도 14는 31일간 혈청-포함 배지에서 배양되고 신경세포(βⅢ 튜불린(tubulin), 뉴로필라멘트-L(reurofilament-L), 및 MAP2), 희돌기아교세포(O4, MBP) 및 성상교세포(GFAP)를 인식할 수 있는 항체와 그에 이은 형광 2차 항체로 염색된 미분화 HFSC 세포(클론 #3, 계대 15)의 면역-표현형을 나타낸다. DAPI가 핵을 대비염색하기 위해 사용되었다. HFSC 세포는 각 표지자(marker)에 대하여 양성인 세포로 분화할 수 있었다. 신경 축삭돌기(neuronal axon) 및 수초(myelin)의 공-위치화(co-localization)를 평가하기 위해, 세포를 항-βⅢ 튜불린 항체 및 항-MBP 항체(도 14의 슬라이드 A-C), 항-뉴로필라멘트-L 항체, 및 항-MBP 항체(도 14의 슬라이드 D-F). 및 항-MAP2 항체 및 항-MBP 항체(도 14의 슬라이드 G-I)로 동시 염색하였다. 오직 일부의 신경 축삭돌기와 수초만이 공-위치한 것으로 보였다. O4 항원 및 MBP의 공위치화를 조사하기 위해, 세포를 항-O4 항체와 항-MBP 항체로 동시 염색하였다(도 14의 슬라이드 J-L). 대부분의 MBP의 신호는 O4 항원의 신호와 공위치화하였다. HFSC 세포는 또한 GFAP 항원에 대하여 양성인 성상교세포로 분화할 수 있었다(도 14의 슬라이드 M-O). 덧붙여, 다수의 세포들은 성상교세포 및 중간엽세포(mesenchymal cells)를 포함하는 다수의 상피세포에서 발현되는 비멘틴에 대하여 양성이었다. 더 나아가, 미분화 세포들은 또한 비멘틴에 대하여 양성이었다(데이터는 제시하지 않음).

도 15는 슬라이드 A-E에서 HFSC 세포(클론 #2b, 계대 15)의 분화 잠재력을 나타낸다. 이들 세포들은 10 ng/ml PDGF-AA, 100 ng/ml IGF-1, 10 ng/ml BDNF, 및 100 μM pCPT-cAMP이 처리되고, B27 보충물, N2 보충물 및 50 μM 1-티오글리세롤이 보충된, 글루타민 및 HEPES를 포함하는 DMEM/F12 배지에서 분화하였다. 이들 세포들은 분화 4일 후에 항-GD3 항체 및 항-O4 항체와 뒤따르는 형광 2차 항체로 염색이 되었다. 미분화 세포들은 희돌기아교 선조세포보다 GD3를 더 강하게 발현하였고 O4는 그와 반대였다(도 15의 화살표 머리, 슬라이드 A, B, 및 C는 미분화 세포를 나타냄). 분화 세포의 대부분은 약한 GD3 신호 및 강한 O4 신호를 나타내는 다중극의 형태(multipolar morphology)를 나타냈는데, 이는 이들이 희돌기아교 선조세포 또는 전-희돌기아교아세포(pro-oligodendroblast)였음을 나타낸다. 다른 세포 유형(예를 들어, 성상교세포 및 신경세포)은 GD3-음성 및 O4-양성 세포로 규정되었다. 도 15의 슬라이드 D는 분화된 세포의 10장의 다른 이미지로부터 각 세포집단의 비율을 보여준다. 전체 세포의 70% 이상은 희돌기아교 선조세포로 분화하였다(75 ± 2.09%). 전체 세포의 20% 이상은 여전히 미분화된 세포였다(23.5 ±2.03%). 다른 세포 유형들은 전체 세포의 1% 미만이었다(0.7 ± 0.41%). 분화된 세포들(희돌기아교 선조세포와 다른 세포 유형을 합한)에 대한 희돌기아교 선조세포 및 다른 세포 유형의 비율을 계산하였고 이는 도 15의 슬라이드 E에 나타냈다. 희돌기아교 선조세포는 분화세포의 99.1% ± 0.56%이었던 반면 다른 세포유형은 분화세포 중 0.9 ± 0.56%에 불과했다.

발명의 바람직한 실시 태양의 상세한 설명

본 발명은 시험관 내 조건에서 희돌기아교세포 또는 희돌기아교-계통 세포로 분화되는 능력을 가진 순수 또는 농축 세포집단을 생산하기 위하여 포유류의 중추신경계로부터 분리된 신경줄기세포 또는 신경선조세포의 세포배양 및 증식방법을 제공한다. 신경줄기세포 및 신경선조세포 모두 (신경선조세포나 성숙한 신경세포와 같은) 신경세포, 또는 성상교세포 및 희돌기아교-세포를 포함하는 아교세포(glial cell) 중의 어느 하나인 자손(progeny)를 생성한다. 신경줄기세포는 자가재생가능한(self-renewable) 반면(즉, 무제한 증식이 가능한), 신경선조세포는 자가재생할 수도 있으나, 반드시 필연적인 것은 아니다. 본 발명의 배양방법은 분화된 세포중 적어도 70%, 80%, 90% 또는 95%의 희돌기아교-계통 세포로 분화할 수 있는 증식된 세포집단을 생산할 수 있는데, 상기 희돌기아교-계통 세포는 희돌기아교 선조세포 및 희돌기아교세포이다.

이하 약어 및 정의는 본 출원의 전반에 걸쳐서 사용된다:

용어 "HFSC 세포" 또는 인간 배아 척수-유래 세포(human fetal spinal cord-derived cell)는 본 발명에서 기술된 증식된 포유류 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포의 순수 또는 농축집단을 의미한다.

용어 "HFSCM1 배지"는 글루타민 및 HEPES를 포함하고 B27(Invitrogen^TM), 비필수아미노산(NEAA, Invitrogen^TM), 1.5 mM의 피루브산(Invitrogen^TM), 55 μM β-머캅토에탄올(Invitrogen^TM), 1 mM의 N-아세틸-L-시스테인(Sigma)이 보충된 DMEM/F12 배지를 의미한다.

용어 "아교세포(glial cell)"는 중추신경계의 비신경세포를 의미하며, 성숙한 희돌기아교세포, 성상교세포, 이러한 세포 유형 중 어느 하나 또는 모두로 분화가 예정된 선조세포를 포함한다.

용어 "다분화능 선조세포(multipotent progenitor cells)"는 세포를 다중의 그러나 제한된 수의 계통으로 분화시킬 수 있는 잠재력을 가진 선조세포를 의미한다.

"만능분화능(pluripotency)"은 (라틴어 "plurmus"로부터 유래하거나 "매우 많은(very many)" 및 "잠재력(potentia)" 또는 "능력을 가진(powered)"으로부터 유래하였고) 내배엽(interior stomach lining, 위장관, 폐), 중배엽(근육, 뼈, 혈액, 비뇨 생식기), 또는 외배엽(표피 조직과 신경계)의 세 가지 배엽으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 줄기세포를 의미한다. 신경줄기세포는 다분화능(multipotent)이지만 만능분화능(pluripotent)은 아니며, 배아줄기세포는 만능분화능이지만 다분화능은 아니다.

"예정된 선조세포(committed progenitor cells)"는 특정 유형의 성숙세포가 되도록 예정되거나 운명이 결정된 선조세포이다. 이는 둘 또는 그 이상의 유형의 성숙세포(O-2A 선조세포는 시기 및 환경인자에 의존적으로, 희돌기아교세포 또는 제2형 상상교세포 중 어느 하나가 될 수 있다) 중 어느 하나로 될 수 있는 잠재력을 가진 다분화능 또는 만능분화능 선조세포와 대비된다.

"희돌기아교세포(oligodendrocyte)"는 주기능이 일부 척추동물의 중추 신경계에서 신경 세포의 축삭돌기를 절연하는 것인 교세포의 일종이다.

용어 "희돌기아교-계통 세포(oligodendrocyte-lineage cells)"는 희돌기아교세포(oligodendrocyte), 전-희돌기아교아세포(pro-oligodendroblast) 및 희돌기아교 선조세포(oligodendrocyte progenitors, 예를 들어, O2A 선조체)를 포함하는데, 아교세포-제한 전구체(glial-restricted precursors)나 신경줄기세포는 포함하지 않는다.

용어 "희돌기아교 선조세포(oligodendrocyte progenitor cells)" 및 "희돌기아교세포 선조체"는 본 출원 전반에 걸쳐서 상호 호환되도록 사용되며, 신경세포 또는 비신경조직에 대하여 우선하여 희돌기아교세포인 선조세포 및/또는 자손세포를 형성하도록 예정된 세포를 의미한다. 특별히 명시되지 않는 한, 반드시 필수적이지는 않지만 이들은 (제2형 성상교세포와 같은) 다른 유형의 교세포를 만드는 능력을 가지고 있다.

"희돌기아교 전-선조세포(oligodendrocyte pre-progenitors)"는 희돌기아교 선조세포의 전임 세포(predecessor cells)이다.

"전-희돌기아교아세포(pro-oligodendroblasts)"는 유사분혈-후 희돌기아교세포에 대한 전임세포이다.

배양 중 "증식되는(expanding) 세포"는 세포증식을 촉진하는 보충물을 포함하는 배양 배지에서 세포의 수가 증가하는 것을 의미하다.

세포의 "증식속도(expansion rate)"는 배양시작기의 초기 세포 수로 나뉜 특정 일자의 세포 수를 의미한다.

본 문서에서 사용된 "증식된(expanded)" 신경선조세포 또는 신경줄기세포는 증식된 세포집단을 생산하는 시험관 내 조건에서 증식되는, 분리된 신경선조세포 또는 신경줄기세포로부터 유래한 신경선조세포 또는 신경줄기세포를 의미한다.

세포의 "계대(passaging)"는 "부배양(subculturing)" 또는 세포의 "나눔(splitting)"으로도 불리우는데, 트립신이나 콜라게나제과 같은 효소로 세포를 해리한 후 작은 수의 세포를 새로운 배양용기에 옮김으로써, 연장된 시간동안 실험실 내 배양조건 하에서 세포가 생존하고 성장하도록 하는 기술을 의미한다. 세포들은 규칙적인 간격으로 계대될 경우 장기간의 세포의 고밀도와 연관된 조기 노화를 피하면서 세포를 장기간 배양될 수 있다.

"성장환경(growth environment)"은 시험관 내 조건에서 세포가 증식, 분화, 및/또는 성숙할 수 있는 환경이다. 상기 환경의 특징은 세포가 배양되는 배지, 존재할 수도 있는 성장인자 또는 분화-유도 인자 및 (고체표면 상의 기판과 같은) 지지구조를 포함한다.

일반적 기술

세포생물학, 단백질화학, 및 항체기술의 일반적인 실험방법은 Current Protocols in Protein Science(J.E. Colligan et al., eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology(J.S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) 및 Current Protocols in Immunology(J.E. Colligan et al., eds., Wiley & Sons)에서 찾을 수 있다. 세포배양방법은 The current edition of Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique(R.I. Freshney et al., Wily & Sons) 및 General Techniques of Cell Culture(M.A. Harrison & I.F. Rae, Cambridge Univ. Press)에 설명되어 있다. 조직배양의 보충물과 시약은 Chemicon^®, Millipore^®, R&D Systems^®, Invitrogen^TM, Nalgene-Nunc^TM International, Sigma-Aldrich^TM, 및 ScienCell와 같은 상용 제조자로부터 구매 가능하다.

본 문서와 관련된 전문 참고서적은 하기와 같다: Principle of Neuroscience, 4th edition, Kandel et al. eds., McGraw-Hill 2000; CNS Regeneration: Basic Science and Clinical Advances, M. H. Tuszynski & J.H Kordower, eds., Academic Press, 1999; The Neuron: Cell and Molecular Biology, 3 rd edition, I. B. Levitan and L.K. Kaczmarek, Oxford U. Press, 2001 ; Glial Cells: Their Role in Behavior, P.R. Laming et al. eds., Cambridge U. Press 1998; The Functional Roles of Glial Cells in Health and Disease, Matsas & Tsacopoulos eds., Plenum Pub. Corp, 1999: Glial Cell Development, Jessen & Richardson eds., Oxford U. Press, 2001 ; 및 Man of Steel, Adrian Hill, 1996.

세포 개체발생(cell ontogeny)의 맥락에서, 형용사 "분화된"은 상대적 용어다. 즉, 분화된 세포는 비교대상인 진행 중의 세포에 비해 발생 경로(development pathway)에 따라 더 진행된 세포를 의미한다. 따라서 신경줄기세포는 계통-제한적 선조체(lineage-restricted progenitor)로 분화가 가능하다. 결국 이들은 경로를 따라 어떤 세포로 또는 성숙 신경세포 또는 희돌기아교세포와 같은 최종-단계의 분화된 세포로 분화할 수 있다.

본 발명에서 분화된 세포는 희돌기아교세포의 특징정기인 표현형 표지자를 발현하는지 여부에 따라 특징지을 수 있다.

이들 세포에 대한 전형적인 면역세포화학 표지자(immunocytochemical marker)들은 상기 세포집단의 성숙도에 의존적인데, 하기와 같다:

Sox2: 만능줄기세포와 신경줄기세포에 대한 표지자.

네스틴(Nestin): 신경줄기세포에 대한 표지자.

CD133: 신경줄기세포에 대한 세포표면 표지자.

PDGF-수용체 알파(receptor alpha, PDGF-Rα): 혈소판 유래 성장인자 수용체의 α쇄로서, 희돌기아교세포 및 그의 선조체에 대한 표지자이다.

CD140α: PDGF-Rα와 동일하고, CD140α 항체는 PDGF-Rα의 세포외 도메인을 인식하며, 희돌기아교세포 및 희돌기아교 선조체에 대한 세포표면 표지자이다.

CD9: 인테그린 및 막투과 4 상과 단백질(transmembrane 4 superfamily proteins)과의 복합체로 알려진 세포표면 당단백질로서, 생식줄기세포, 신경줄기세포, 희돌기아교세포 및 중간엽 줄기세포에 대한 세포표면 표지자이다.

PSA-NCAM: 폴리사이알릴-신경세포 부착분자(polysialylated-neural cell adhesion molecules)로서, 신경세포-제한 전구체(neuronal-restricted precursor, NRP), 신경선조세포, 신경아세포(neuroblast), 희돌기아교세포 전-선조체에 대한 세포표면 표지자이다. 상기 표지자는 아교세포-제한 전구체(glial-restricted precursor, GRP)에 대해서는 음성이다.

A2B5: 아교세포-제한 전구체. 아교 선조세포(glial progenitor cells), 희돌기아교 선조세포(oligodentrocyte progenitor cell, OPC), 및 제2형 성상교세포에 대한 세포표면 표지자이다. 상기 세포표면 표지자는 신경세포-제한 전구체(neuronal-restricted precursor, NRP)에 대하여는 음성이다.

NG2: 콘드로이친 황산 프로테오글리칸(chondroitin sulfate proteoglycan)으로서, 대식세포 및 희돌기아교 선조세포에 대한 세포표면 표지자이다.

GD3: 강글리오시드 GD3로서, 희돌기아교 전-선조체 및 희돌기아교 선조체에 대한 표지자이다.

04: 희돌기아교세포 및 희돌기아교 선조체에 대한 표지자이다.

갈락토세레브로시드 C(galactocerebgroside, GalC): 성숙 희돌기아교세포에 대한 표지자.

수초 염기성 단백질(myelin basic protein, MBP): 성숙 희돌기아교세포에 대한 표지자.

CD44: 세포-세포 상호작용, 세포 부착 및 이동과 관련된 세포-표면 당단백질로서, 히알루론산에 대한 수용체이다. 일부 상피세포 및 성상교 계통 세포에 대한 세포표면 표지자이다.

아교세포 섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP): 성상교세포에 대한 표지자.

βⅢ 튜불린(βⅢ tubulin): 신경선조세포와 신경세포의 표지자.

뉴로필라멘트-L(Neurofilament-L): 성숙한 신경세포의 표지자.

미세소관-연관 단백질 2(microtubule-associated protein, MAP2): 성숙한 신경세포에 대한 표지자.

조직-특이적 표지자는 특정 세포 표면 표지자에 대한 유면역세포화학(flow immunocytochemistry) 또는 (예를 들어, 고정된 세포 또는 조직절편를 대상으로 한) 세포내 또는 세포-표면 표지자에 대한 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 적절한 면역학적 기술을 이용하여 검출될 수 있다. 유세포분석에 대한 상세한 방법은 Gallacher et al, Blood., 96:1740, 2000에서 제공되고 있다. 표준 면역세포화학분석 또는 유세포분석에서 선택적으로 세포의 고정 이후에, 또한 선택적으로 표지를 증폭하기 위해 표지된 2차 항체 또는 다른 접합물을 이용함으로써, 상기 항체에 유의하게 검출 가능한 양의 항체가 결합할 경우, 세포-표면 항원의 발현은 양성으로 규정한다. 연구 또는 치료적 이용을 촉진하기 위해, 희돌기아교세포나 희돌기아교 선조세포의 특성을 가진 집단에서 세포의 비율을 극대화하는 것이 매우 유용하다. 그러한 세포에 특징적인 표현형 표지자의 하나 또는 그 이상에 대하여 양성인 것으로 확인되는 적어도 50%, 60%, 70%, 90% 또는 95%의 특정 계통의 세포인 세포집단을 수득하는 것이 가능하다.

신경 기능의 재구축(reconstitution)과 관련된 치료 기술을 위해, 세포집단의 다른 유형, 특히 미분화된 줄기세포 및 비-외배엽 계통의 세포를 형성하는 능력을 최소화하는 것이 종종 요구된다. 치료 목적에 따라서는, 신경세포 계통 및 그의 예정된 선조체 또는 성상교 계통 세포 및 그의 예정된 선조체의 비율을 최소화하는 것이 유리할 수 있다. 본 발명에 따른 세포집단의 오염은 이러한 다른 유형의 세포의 오염비율이 기껏해야 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만이다.

본 발명의 발명은 온전한 인간 개체의 발달을 유발할 수는 없다.

본 발명의 방법은 여러 계대를 통하여 세포의 증식을 허용하는 정의된 배지에서 포유류의 중추신경계에서 분리된 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포의 세포배양과 관련이 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 배양된 세포는 증식을 통해, 희돌기아교-계통 세포로 분화하는 능력을 유지한다. 본 발명의 방법을 사용하여 배양된 세포는 희돌기아교-계통 세포로 분화할 수 있는 능력을 유지하면서도 6회 이상의 계대가 가능하고, 1,000배 이상 증식이 가능하다. 일부 실시예에서, 본 발명의 세포배양방법에 의해 증식된 세포잡단은 무혈청 배양 조건에서 분화된 세포 중 적어도 30%, 50%, 70%, 또는 80%의 희돌기아교-계통 세포를 갖는 분화된 세포를 포함하거나, 그러한 세포집단으로 분화할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 세포배양방법에 따라 증식된 세포집단은 분화된 세포 중 적어도 90% 이상 희돌기아교-계통 세포를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 상기 증식된 세포는 다분화능을 갖는다. 일부 실시예에서, 증식된 세포의 대부분은 감소된 PDGF-AA 배지(즉, 바람직하게는 10 ng/ml bFGF를 수반하거나 10 ng/ml bFGF 및 50 μM 1-티오글리세롤을 수반하거나 선택적으로 적어도 10 ng/ml IGF-1을 수반한 20 ng/ml PDGF-AA)에서 배양할 때, 배지의 교환 사이에 bFGF의 보충 없이도 희돌기아교-계통 세포로 분화할 수 있다. 일부 실시예에서 증식된 세포의 대부분은 글루타민 및 HEPES를 포함하고, B27 보충물, N2 보충물 및 50 μM 1-티오글리세롤이 보충된, 10 ng/ml of PDGF-AA, 100 ng/ml IGF-1, 100 μM pCPT-cAMP 및 10 ng/ml BDNF이 함유된 DMEM/F12 배지에서 배양할 때, 희돌기아교-계통 세포로 분화할 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위해 분리된 포유류의 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포는 포유류, 이에 한정되지는 않지만 바람직하게는 인간과 같은 영장류의 중추신경계로부터 수득될 수 있다.

희돌기아교 선조세포와 희돌기아교 전-선조세포는 중추신경계의 백질에 존재하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 본 발명에 사용하기 위한 세포가 분리되는 적절한 원천은 시신경, 뇌량 및 척수를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 덧붙여, 분리된 줄기세포는 본 기술 분야에 알려진 방법을 이용하여 포유류의 배아, 바람직하게는 이에 한정되지는 않지만 인간의 배아와 같은 영장류의 배아로부터 유래할 수 있다. 일부 실시예에 따르면, 본 발명에 사용되기 위해 분리된 줄기세포는 임신 8-24주령의, 바람직하게는 임신 12-18주령의 인간 배아 척수로부터 수득될 수 있다. 인간 배아 척주는 예를 들어, Advanced Bioscience Resources사(Alameda, CA, USA)와 같은 회사를 통해 그리고 IRB 승인 및 공여자의 동의 하에 수득될 수 있다. 척수 조직은 척수막 및 말초신경을 제거한 채 척주로부터 절개될 수 있다. 그런 다음, 상기 조직은 해체하고, 세척하여, 세포증식을 허용하는 배지가 포함된 배양 용기에 옮겨질 수 있다.

적절한 세포배양 용기는 이에 한정되지는 않으나, 폴리-아미노산[예를 들어 폴리-라이신(poly-lysine) 및/또는 폴리-오르니틴(poly-ornithine)]의 단독 또는 조합을 가진 배양 표면, 조직배양 플라스틱 및 라미닌(laminin), 비트로넥틴(vitronectin) 또는 피브로넥틴(fibronectin)으로 처리된 표면을 갖춘 배양용기일 수 있다. 일반적으로 세포는 10⁴ 내지 10⁵ cells/cm² 밀도로, 바람직하게는 약 3 x 10⁴ 내지 5 x 10⁴ cells/cm²의 밀도로 도말될 수 있다. 폴리-오르니틴 또는 폴리-라이신은 종래에 보고된 바와 같이 배양 용기 코팅을 위해 사용될 수 있다(Raff et al., J. Neurosci., 3:1289, 1983; Raff et al, Nature., 303:390, 1983; Protocols for Neural Cell Culture, 3rd edition, Humana Press, Inc.). 배양용기는 1 내지 40 μg/ml의, 바람직하게는 2 내지 20 μg/ml, 보다 바람직하게는 5 내지 15 μg/ml의 폴리-오르니틴으로 코팅될 수 있다. 세포 부착의 강도(strength)는 배양용기의 제조회사, 표면 수식(surface modification), 형태 및 특정 제조 일련번호(lot number)에 따라 다를 수 있다. 코팅된 물질의 최적 농도는 본 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 각각의 배양 용기의 재료에 따라 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 배양용기, 예를 들어 BD Falcon(Sparks, MD, USA)로부터 구매된 배양용기는 10 μg/ml의 폴리-오르니틴 또는 폴리-라이신을 2시간 동안 처리함으로써 코팅된다. 일부 실시예에서, 예를 들어 Nalgen Nunc International(Rochester, NY, USA)에서 구매된 배양용기는 5 pg/ml의 폴리-오르니틴 또는 폴리-라이신을 30분 동안 처리함으로써 코팅된다.

포유류의 중추신경계로부터 수득되어 분리된 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포는 상기 세포의 분화(예를 들어, 신경세포, 성상교세포 또는 희돌기아교세포로의)를 촉진하지 않고 세포증식을 허용하는 무혈청의 화학적으로 정의된 배지에서 배양된다. 상기 배양배지는 반드시 이에 한정되지는 않으나, DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12, 1:1, Invitrogen^®), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, RPMI-1640 및 Neurobasal과 같은 기본배지를 포함한다. 상기 기본배지는 세포의 건강과 생존을 지지하는 다양한 요소로 보충될 수 있다. 상기 요소들은 반드시 이에 한정되는 것은 아니나, 적어도 0.25% 비-필수 아미노산[NEAA(Invitrogen^®): 100 μM L-알라닌, L-아스파라긴 H20, L-아스파르트산, L-글루타민산, 글리신, L-프롤린, 및 L-세린을 포함하는 1% 용액], 1.0 mM 글루타민, 0.5 mM 피루브산, 1% B27(Invitrogen^®), 0.1 mM N-아세틸-L-시스테인 및/또는 10 μM β-머캅토에탄올을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 기본배지는 B27 대신 NS21을 포함할 수 있다(Y. Chen et al., J. Neurosci. Methods., 171 :239, 2008). B27 보충물은 소혈청 알부민, 트랜스페린(transferrin), 인슐린, 프로게스테론, 코르티코스테론, 트리이오도-L-티로닌(triiodo-L-thyronine), 레티놀 아세테이트, DL-토코페롤, DL-토코페롤 아세테이트, 비오틴, 리놀레산(linoleic acid), 리놀렌산(linolenic acid), 에탄올아민, 아셀렌산나트륨(sodium selenite), L-카르니틴, 환원 글루타티온(reducted glutathione), 카탈라제, 슈퍼옥시드 디스타무타아제(superoxide dismutase), D-갈락토오스 및 퓨트레신(putrescine)을 포함할 수 있다. Invitrogen사는 성분을 공개하였으나 그의 농도는 공개하지 않았다. 그러나 이에 대한 원래의 제형(formulation)인 B18 보충물의 각 성분의 농도는 공개되었다. NS21은 이러한 정보를 바탕으로 개발되었고, 각 성분의 농도는 공개되었다. NS21은 신경세포 배양시 B27 보충물만큼 작동하였다. 덧붙여 NS21은 인간 배아 줄기세포로부터 분화된 신경줄기세포와 희돌기아교 선조세포의 배양에 사용되었다. 따라서 NS21은 B27 보충물을 대체할 수 있는 것으로 사료된다. 바람직한 실시예에서, 세포 배양배지는 1-4 mM, 더 바람직하게는 2.5 mM 글루타민, 10-25 mM, 더 바람직하게는 15 mM HEPES, 0.5-2.0 mM, 더 바람직하게는 1 mM 피루브산, 1-4%, 더 바람직하게는 2% B27 보충물, 0.25-3%, 더 바람직하게는 1% NEAA, 1-200 μM, 더 바람직하게는 50 μM 1-티오글리세롤, 0.1-3 mM N-아세틸-L-시스테인(더 바람직하게는 1 mM) 및/또는 10-100 μM, 더 바람직하게는 55 μM β-머캅토에탄올이 보충된 DMEM/F12 배지를 포함할 수 있다.

더 나아가, 산소는 신경선조세포의 분화를 촉진할 수 있다. 따라서 세포분화를 감소시키기 위해, 세포는 1-20% O₂성장 환경에서 배양하였다. 바람직한 실시예에서, 세포는 37℃ 온도 1-10%, 더 바람직하게는 5% O₂, 5% CO₂ 성장 환경을 제공하는 배양기 내에서 배양 플라스크 내에 배양된다. HFSC 세포 확립 후, 산소 농도의 효과를 평가하였으나 HFSC 세포를 증식하기 위한 세포배양 조건에서 5% O₂ 농도와 비교할 때 20% O₂ 농도 조건에서 분화된 세포의 증가는 없었다. 5% O₂ 조건에서 HFSC 세포 성장은 20% O₂조건의 성장보다 약간 빨랐다. 산소는 산화 스트레스(oxidative stress)를 야기하고 설치류 세포(rodent cell)에서 p53의 돌연변이를 유도한다. 돌연변이 위험을 줄이기 위해 본 발명자들은 HFSC 세포 배양시 5% O₂ 조건을 유지하였다.

신경줄기세포 및/또는 신경선조세포는 세포의 분리를 위해 증식을 자극하는 성장인자를 추가적으로 함유하는 세포배양 배지에서 배양된다. 배양배지는 세포를 분리하기 위해 적어도 5, 10, 20 또는 40 ng/ml PDGF-AA, 적어도 2.5, 5 또는 10 ng/ml bFGF, 및/또는 적어도 10, 25 또는 50 μM 1-티오글리세롤을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 배양배지는 적어도 1, 5 또는 10 ng/ml IGF-1를 추가적으로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, PDGF-AA는 PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, 또는 PDGF-DD로 대체될 수 있다. 일부 실시예에서, bFGF는 다른 섬유아세포 성장인자 구성원(예를 들어, FGF-4 또는 FGF-9)으로 대체될 수 있다. 일부 실시예에서, IGF-1는 IGF-2로 대체될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 세포를 분리하기 위해 세포 배양배지는 40-60 μM 1-티오글리세롤, 40-200 ng/ml PDGF-AA, 5-100 ng/ml bFGF, 및 5-100 ng/ml IGF-1를 포함할 수 있다.

상기 분리된 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포는 세포를 분리한 후 증식을 자극하기 위한 성장인자를 추가적으로 포함하는 세포배지에서 배양된다. 상기 배양배지는세포를 증식하기 위해 1, 2, 또는 5 ng/ml PDGF-AA, 0.5, 1 또는 5 ng/ml bFGF, 및/또는 적어도 10, 25 또는 50 μM 1-티오글리세롤을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 배양배지는 1, 2 또는 5 ng/ml IGF-1를 추가적으로 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 배양배지는 HFSC 세포를 분리한 후 세포를 증식하기 위해, 40-60 μM 1-티오글리세롤, 5-100 ng/ml PDGF-AA, 1-50 ng/ml bFGF, 및 5-100 ng/ml IGF-1를 포함할 수 있다. 본 발명의 세포배양 조건 하에서 성장한 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포는 50-120 시간의 배가시간을 나타낸다. 바람직한 실시예에서, 상기 배가시간은 약 60-100 시간이다. 상기 세포는 8, 11, 14 또는 17회 계대까지 상기 증식속도를 계속 유지할 수 있다. 상기 세포는 한달에 적어도 100, 250, 또는 바람직하게는 적어도 500배로 증식될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 방법을 이용하여 배양된 상기 세포는 18회 계대 이상 동안 >1의 증식속도을 나타냈다.

실시예

실시예 1: HFSC 세포 배양과 증식; 기본배지와 성장인자의 확인

일부 배지와 보충물(supplements)을 Advanced Bioscience Resources사(Alamada, CA, USA)로부터 구매하고 공여자의 동의를 구한 인간 12주령 배아 척수(Human 12-week fetal spinal cord)로부터 유래된 HFSC 세포를 이용한 예비실험에서 조사하였다. 상기 세포는 초기에 2 mM의 글루타민(Invitrogen^TM), 1 mM의 피루브산 (Invitrogen^TM) 및 2% B27 보충물(Invitrogen^TM)이 보충된 DMEM:F-12 (1:1)(DMEM/F12)(Invitrogen^TM, Carlsbad, CA, USA)배지로 배양하였다. 다양한 성장인자가 HFSC 세포의 성장을 자극하는지 조사하였다. 대부분의 효과적인 성장인자는 PDGF-AA 및 bFGF의 조합이었다. PDGF-AA 및 bFGF 존재 하에 세포는 성장할 수 있었으나 액포(vacuoles)가 관찰되었고 건강하지 않아 보였다. 몇몇 보충물들이 조사되었고 2 mM 글루타민, 1 mM 피루브산 및 2% B27 보충물에 더하여 1%의 NEAA를 보충한 DMEM/F12가 액포를 감소시키고 세포수를 약간 증가시킬 수 있었다(데이터는 제시되지 않음). 1 mM N-아세틸-L-시스테인(Sigma-Aldrich^TM, St. Louis, MO, USA) 및 55 μM β-머캅토에탄올(Invitrogen^TM)을 포함하는 다른 보충물들은 세포의 상태를 개선한 것처럼 보였으나 그 개선 정도는 NEAA만큼 현저하지는 않았다. 따라서, 2 mM 글루타민, 1 mM 피루브산, 2% B27 보충물, 1% NEAA, 1 mM N-아세틸-L-시스테인 및 5 μM β-머캅토에탄올을 포함하는 DMEM/F12 배지가 최적의 기본배지(optimal base medium)로 확인되었고, 이후 HFSC 세포를 배양하는데 사용되었다. 인간 15-주령 배아 척수를 척주(spinal column)로부터 절개(dissect)하고, 척수막과 말초신경은 제거하였다. 그런 다음 상기 조직을 아큐타제(Accutase)로 해체하고 세척하여 인간 배아 척수로부터 수득된 세포를 하기의 배지를 담고 있는 세포 배양 용기(vessel)에서 옮겼다: 2.5 mM 글루타민, 15 mM HEPES, 2% B27 보충물(Invitrogen^TM), 1% NEAA, 1.5 mM 피루브산(Invitrogen^TM), 55 μM β-머캅토에탄올(Invitrogen^TM), 1 mM N-아세틸-L-시스테인(Sigma-Aldrich^TM), 20 ng/ml PDGF-AA(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA) 및 10 ng/ml bFGF(R&D Systems)를 포함하는 DMEM/F12 배지. 그런다음 세포를 37℃, 5% 0₂, 및 5% C0₂ 조건의 배양기에 넣고 배양하였다. 매일 세포배지에 bFGF(10 ng/ml)를 첨가하였다. 계대배양하는 동안 2-3일 마다 배지를 교체하였다. 예비실험에 기반하여, PDGF-AA와 bFGF가 존재 하에 성장 중인 세포는 그렇게 많지 않았으며, 상당수 세포들은 증식을 멈추고 수주 안에 사멸하였다. PDGF-Rα를 발현하는 세포가 대개 5% 미만이기 때문에 이러한 결과는 합당한 것으로 보인다. PDGF-AA와 bFGF에 반응하지 않은 세포를 제거하기 위하여, 세포는 극-저 부착 배양 플레이트(ultra-low adhesion culture plate, Corning, Inc., Corning, NY, USA)에서 배양하였다. PDGF-AA와 bFGF에 반응하는 세포의 경우 구체(sphere)를 형성한 반면(도 3, 슬라이드 A) 그에 반응하지 않는 세포는 구체를 형성하지 않았다. 계대배양 및 배지 교체를 위하여, 구체(spheres)를 저속 원심분리하여 수집하였다(구체수집을 위해 300 rpm, 단일세포 수집을 위해 1,000 rpm). 9일 후에 세포를 수확하여, 폴리-오르티닌-코팅된 배양용기에서 배양하였다. 이 기간 경과 후 세포를 매 7-14일 마다 계대하였다. 세포는 초기 단계에서 불균일한 형태(heterogeneous morphology)로 존재하였고(도 3, 슬라이드 B 및 C) 다수의 세포는 한 달 이내에 증식을 멈췄다. 시간이 지날수록 증식속도는 느려졌고, 세포는 결국 증식하지 않았으며, 세포는 건강하지 않게 보이기 시작하였으며, 세포질(cytoplasm) 안에서 액포(vacuoles)가 형성되었다.

실시예 2: HSCF세포 증식에 대한 적절한 성장조건의 정의

실시예 1에서 언급된 바와 같이, 배양배지 내에 PDGF-AA 및 bFGF를 포함시킬 경우 초기에는 HFSC 세포의 적절한 성장을 유지하였으나 2번째 계대 후, 세포의 증식속도가 느려졌다. NT-3(R&D Systems) 및 IGF-1(Sigma-Aldrich^TM)을 이들이 HFSC 세포의 증식을 향상시킬 수 있는 확인하기 위해 조사하였다. 20 ng/ml PDGF-AA 및 10 ng/ml bFGF의 존재는 세포의 증식 속도를 자극하기에 불충분하였다(증식속도 <1)(도 4). 이후 5 ng/ml NT-3 및/또는 10 ng/ml IGF-1의 첨가는 향상된 증식속도의 나타냈다(증식속도 >1 ). NT-3 및 IGF-1의 조합은 계대 3에서 가장 효과적이었다. 각 조건으로부터 수득된 세포는 그의 효과를 확인하기 위해 추가적으로 계대하였다. 상기 세포는 구체를 형성하기 시작하였기 때문에, 더 일찍 수확하였다. 계대 4에서, NT-3 및 IGF-1의 조합에 의한 증식속도의 회복은 감소하였고, IGF-1의 단독 첨가가 계대 4에서는 가장 효과적이었다. NT-3 및 IGF-1의 조합은 세포분화를 야기할 수 있거나 또는 더 많은 구체(sphere)를 형성하고 배지 교환시 손실될 수 있었다. 따라서 IGF-1의 첨가가 가장 효과적인 생존인자로 확인되었고, 이후의 HFSC 세포 배양에 사용되었다. 그러나 HFSC 세포의 증식속도는 계대 4의 말기에 다시 느려지기 시작하였고 세포의 수는 파종된 세포와 비교하였을 때 감소하였다. 따라서 계대 5에서 다른 보충물인 1-티오글리세롤이 HFSC 세포의 증식을 향상시키는지 여부를 조사하였다.

도 5는 HFSC 세포의 증식에 대한 1-티오글리세롤의 효과를 보여준다. 초기 성장인자 조합(20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF)은 세포를 전혀 증식시킬 수 없었다(계수 가능 범위 아래에 있었기 때문에 본 도면에서 데이터는 나타나지 않았다). 계대 3부터 사용된 성장인자 조합(20 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1)은 상기 조합(20 ng/ml PDGF-AA 및 10 ng/ml bFGF)보다 효과적이었으나 계대 4 이후에는 HFSC 세포증식을 잘 자극할 수 없었다(도 4). 많은 조인자(cofactor)는 지방산 및 이와 관련된 긴사슬 탄화수소성 티올(long-chain hydrocarbon feature thiols)의 생합성(biosynthesis) 및 분해(degradation)와 관련이 있다. 1-티오글리세롤은 티올 기반의 항산화물질(antioxidant) 중의 하나이고 일부 세포(즉, 마우스 배아 피질 및 해마 신경세포, 마우스 골수 지방세포 및 인간 B 세포계열)의 증식을 자극하는 것으로 종래에 보고된바 있기 때문에, HFSC 세포에 대하여 이후 조사되었다. 덧붙여, 더 높은 농도의 PDGF-AA(100 ng/ml)가 성장인자의 반응성의 감소를 보완할 수 있는지 여부를 확인하였다.

20 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 및 10 ng/ml IGF-1의 존재 하에, 50 μM 1-티오글리세롤의 첨가는 증식을 다소 자극하였으나 세포의 수는 여전히 감소하였다(증식속도 <1). 이러한 결과는 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1의 존재 하에 PDGF-AA 농도가 100 ng/ml까지 증가하였을 때, 1-티오글리세롤 부재 하에 얻은 결과와 유사한 것이었다. 그러나, 50 μM 1-티오글리세롤 및 증가된 PDGF-AA(100 ng/ml)을 배양배지에 (10 ng/ml bFGF 및 10 ng/ml IFG-1와 함께) 첨가하였을 때, 상기 두 요소는 세포 수를 유의하게 증가시킴으로써(증식속도 >1) 상승작용을 나타냈다. IGF-1를 보충물 칵테일(100 ng/ml PDGF-AA + 10 ng/ml bFGF + 50 μM 1-티오글리세롤)에서 제거하였을 때, 증식 속도는 <1로 감소하였는데, 이는 IGF-1가 HFSC 세포의 증식 및/또는 생존을 촉진하는 것으로 나타났다. 그러나 만약 HFSC 세포를 이러한 조건에서 더 오래 배양하였다면, HFSC 세포는 이러한 조건에서 조차 증식되었을 수도 있다. 이러한 데이터는 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1에 더하여 50 μM 1-티오글리세롤의 첨가와 PDGF-AA 농도의 100 ng/ml까지 증가가 상기 세포의 증식에 중요하였음을 나타낸다. 더 나아가, IGF-1의 첨가는 필수적이지는 않으나 여전히 50 μM 1-티오글리세롤과 100 ng/ml PDGF-AA의 존재 하에 증식속도를 증가시키는데 효과적일 수 있다. 10 ng/ml bFGF + 10 ng/ml IGF-1에 더한 50 μM 1-티오글리세롤 및 100 ng/ml PDGF-AA의 조합이 이후의 HFSC 세포의 배양에 사용되었다. HFSC 세포는 계대 6 이후에 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤 존재 하에 추가적으로 증식되었다. 상기 세포는 계대 이후에 이 조건으로 더욱 빠르게 증식되었고 일주일 내에 3-4배로 증식되었다. 배가시간(doubling time)은 이 조건에서 약 60-100시간이었다. 상기 HFSC 세포는 심지어 계대 8(도 3, 슬라이드 D), 계대 11(도 3, 슬라이드 E) 및 계대 19(도 3, 슬라이드 F) 이후에도 이러한 증식상태를 유지할 수 있었다. 그러므로 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤을 포함하는 정의된성 배지는 신경줄기세포 및/또는 세포전구세포에서 장기간 증식을 위한 적절한 배양 조건으로 확인되었다.

실시예3: HFSC 세포의 자발적인 분화기법

다양한 세포배양 조건을 확인하는 동안, HFSC 세포를 bFGF를 제거한 배지로로 배양할 때, 이들 세포의 상당수가 양극성(bipolar) 또는 희돌기세포의 지표인 다극성(multipolar) 세포로 분화되었고, 곧 사멸하였다. 이러한 세포사멸을 피하기 위하여 자발적인 분화 기법이 개발되었다.

배양배지는 HFSC 증식 동안 통상적으로 매 2일마다 교환하였는데, 이는 HSFC 세포를 증식 상태로 유지하는데 매우 중요한 것으로 사료된다. 세포분화를 향상시키기 위해서는, 본 실험 동안 배지를 매 3 또는 4일마다 교환하였다. bFGF와 고농도의 PDGF-AA는 HFSC 세포의 분화를 차단하는 것으로 보였으나, 이들은 또한 HFSC 세포의 생존에도 중요하였다. 따라서 50μM 1-티오글리세롤이 있거나 또는 1-티오글리세롤이 없는 상태에서, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1의 존재 하에, PDGF-AA 농도를 100 ng/ml에서 20 ng/ml로 감소시켰다. HFSC 세포는 bFGF가 제거되었을 때 잘 생존할 수 없었다. 대개, bFGF는 HFSC 세포를 증식상태로 유지하기 위하여 매일 보충하였다. bFGF의 보충을 중단하였을 때, 클러스터로부터 분리된 다수의 HFSC 세포는 (전-희돌기아교아세포 및/또는 미성숙 희돌기아교세포의 지표인) 복잡한 거미줄-유사 프로세스(web-like process)를 형성하였고, 도 7의 슬라이드 A 및 B에서 나타난 바와 같이 잘 생존하였다.

도 7의 슬라이드 C-F에 나타난 바와 같이, 거미줄-유사 형태(spider's web-like morphology)를 가진 이 프로세스-지향 세포(process-bearing cells)는 04 항원 및/또는 GalC 항원에 대하여 양성을 나타냈으며, 전-희돌기아교아세포(pro-oligodendroblast, O4-양성 및 GalC-음성) 또는 미성숙 희돌기아교세포(O4-양성 및 GalC-양성)로 사료된다. HFSC 세포는 심지어 1-티오글리세롤의 존재 하에도 HFSC 세포는 분화할 수 있었으나, 이 경우 프로세스의 복잡도는 도 7의 슬라이드 A 및 B에 나타난 바와 같이 배양배지 내에 1-티오글리세롤이 존재할 때보다 단순해 보였다. 덧붙여, 성상교세포 및 신경세포와 같은 다른 유형의 세포들이 드물게 관찰되었고, HFSC 세포는 오직 희돌기아교-계통 세포로 분화하는 경향을 나타냈다. 이들 기법은 분화된 희돌기아교-계통 세포를 건강한 상태로 관찰할 수 있게 해준다.

대부분의 미분화 세포들은 희돌기아교세포의 특성을 나타내고 희돌기아교세포 또는 전-희돌기아교세포를 닮고 있기 때문에, 이들 데이터는 더 나아가 본 발명의 배양조건이 희돌기아교세포로 분화하는 경향이 있는 분리된 신경줄기세포 및/또는 신경선조세포의 증식에 특히 유용함을 보여준다.

실시예 4: 통상적인 신경줄기세포로부터 HFSC 세포의 유도

도 1에서 나타난 바와 같이 통상적인 신경줄기세포는 HFSC 세포의 선조로 여겨진다. 이 관계를 확인하기 위해 HFSC 세포가 종래에 보고된 바와 같이 통상적인 신경줄기세포로부터 유도되는지 여부를 조사하였다. 인간 배아 척수(임신 11주령)의 2차 조직으로부터 유래된 세포를 통상적은 신경줄기세포의 증식을 위해, 15일 동안 2.5 mM 글루타민, 15 mM HEPES, 2% B27 보충물, 1% NEAA, 1.5 mM 피루브산, 55 μM β- 머캅토에탄올, 및 1 mM N-아세틸-L-시스테인이 포함된 DMEM/F12에 10 ng/ml EGF 및 10 ng/ml bFGF 존재 하에서 초도 배양하였다. 많은 다른 유형의 세포가 초기에 존재하였으나 일부 증식 가능한 세포집단은 초도배양의 말기에 수득되었다. 이 결과는 계대 0의 15일째를 나타내는 도 8의 슬라이드 A에 도시되어 있다. 상기 세포의 첫 번째 계대 후에 계대 15까지 클론 #2b(0 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1, 100 ng/ml PDGF-AA, 및 50 μM 1-티오글리세롤이 포함된 HFSCM1 배지)과 같은 조건에서 배양되었다.

증식가능한 세포집단으로부터 유래된 세포의 형태는 초도배양의 말기에 수득되었고, 계대 5 부근에서 균일화(homogenous)되었고, 상기 세포는 클론 #2b에서 형성되는 것과 유사하게(도 8, 슬라이드 B-F) 클러스터 및 구체를 형성하는 경향이 있었다. 덧붙여 상기 클론은 희교돌기아교-계통 세포로 자발적으로 분화하였고(데이터 미제시), 클론 #2B와 같은 면역-표현형(immune-phenotype)을 나타냈고(데이터 미제시), 실시예 7에서 서술된 바와 같이, 유세포분석에 의해 동일한 세포 표지자 표현형 양상을 나타냈다. 이 클론에서 유래한 세포를 이후의 분석(예를 들어 도 12)을 위해 동결시켰다. 이러한 결과는 HFSC 세포가 통상적인 신경줄기세포로부터 유도되고, 통상적인 신경줄기세포가 HFSC 세포의 선조일 것이라는 점을 시사한다.

PDGF-AA는 PDGF-Rα를 통하여 작동하는 것으로 생각된다. 상기 수용체는 모든 PDGF 계열의 구성원(PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC 및 PDGF-DD)에 의해 자극되는 것으로 알려져 있다. PDGF_BB는 HFSC 세포 클론 #2b 및 클론 #3을 사용하여 PDGF-AA를 대체할 수 있는지 여부를 조사하였다. PDGF-BB는 PDGF-AA 대신에 동일한 조건에서 두 클론을 증식시킬 수 있었고, 이로써 PDGF-AA가 성공적으로 다른 PDGF 계열의 구성원으로 대체될 수 있음이 입증되었다.

실시예 5: 세포배양 요소의 확인

본 발명자들이 HFSC 세포(클론 #2b)가 확립된 후, 다양한 배양조건을 조사하는 동안, 본 발명자들은 각 성장인자에 대한 투여량 반응이 변화함을 확인하였다. HFSC 세포(클론 #2b)를 분리하기 위해, 더 높은 농도의 PDGF-AA(100 ng/ml)는 50 μM 1-티오글리세롤의 첨가와 더불어 필수적이었다. 상기 클론이 지속적으로 증식하게 된 이후, 더 높은 농도의 PDGF-AA(100 ng/ml)는 더 이상 상기 클론의 증식을 위해 필요하지 않았다. 증식속도는 10-20 ng/ml PDGG-AA에서 포화가 되었고, 더 높은 농도의 PDGF-AA(100 ng/ml)는 이들의 성장에 추가적인 효과가 없었다. 이는 장기간 배양 또는 지속적인 1?티오글리세롤의 사용이 원인일 수도 있다. HFSC 세포의 클론 #2b 및 클론 #3를 확립하기 위해 수 계대 후에도 1-티오글리세롤이 사용되었다. 더 높은 농도의 PDGF-AA의 효과를 조사하기 위하여, 초도배양으로부터 새로운 클론을 1-티오글리세롤 존재 하에 확립시켰다. 덧붙여 bFGF와 IGF-1의 반응은 20 ng/ml 및 40 ng/ml에서 각각 포화가 되는 것처럼 보였다. 더 높은 농도의 IGF-1(50-500 ng/ml)를 사용하였을 때 더 많은 분화된 세포가 관찰되었다(대략 1 % 내외로 보였다). 따라서 20 ng/ml IGF-1는 HFSC 세포의 증식을 위해 바람직한 것으로 여겨졌다. 20 ng/ml bFGF와 20 ng/ml IGF-1의 사용은 10 ng/ml bFGF 및 10 ng/ml IGF-1의 사용과 비교하였을 때보다 증식속도를 5-10% 향상시켰다. 그러므로 본 실험에서 20 ng/ml bFGF와 20 ng/ml IGF-1를 사용하였다.

더 높은 농도의 PDGF-AA가 상기 정의된 최적 배양배지의 요소에 필요한지 여부와 이들이 다른 배치(batch)의 세포에서 유사한 성장특성을 제공하는지 여부를 확인하기 위해 세 번째 시료(임신 12주령)으로부터 얻은 HFSC 세포를 배양하였다. 상기 세포는 20 ng/ml bFGF 및 20 ng/ml IGF-1의 첨가에 더하여 클론 #2b 및 #3와 동일한 배양배지(즉, 20 ng/ml bFGF 및 20 ng/ml IGF-1에 더하여 20 ng/ml(클론 #4A) 또는 100 ng/ml(클론 #4B)을 첨가한 HFSCM1 배지 및 50 μM 1-티오글리세롤)에서 배양되었다. 첫 번째 계대 말기에 클론 #4A의 세포수는 클론 #4B의 수의 1/3 미만이었다(도 11, 슬라이드 A 및 B). 그러나, 클론 #4A는 첫 번째 계대 이후에, 심지어 클론 #4B보다 낮은 PDGF-AA 농도에서 조차 클론 #4B와 동일한 속도로 증식되기 시작하였다. 상기 세포의 형태(morphology)는 세 번째 계대에서 균일화(homogenous)되었고, 상기 세포는 클론 #2b 또는 #3에서 나타난 것과 같이 클러스터와 구체를 형성하는 경향을 가졌다(도 10, 슬라이드 C-F). 덧붙여 이들 세포는 클론 #2b 또는 #3이 그랬던 것처럼 희돌기아교-계통 세포로 자발적으로 분화할 수 있었다. 이러한 결과는 더 높은 농도의 PDGF-AA가 필수적이지는 않으나 HFSC 세포의 분리하는데 선호되며 더 높은 농도의 PDFG-AA는 일단 HFSC 세포가 확립된 이상 필수적이지 않음을 시사한다. 더 나아가, 상기 세포배양 방법은 세포의 다른 배치에서 비슷한 성장특성을 제공할 수 있고 이 과정이 재현가능할 수 있음이 확인되었다. 이 클론으로부터 유래한 상기 세포는 다음 실험에 사용하기 위하여 동결되었다.

실시예 6: 동결-해동 주기 이후의 HFSC 세포의 회복 및 성장

클론 #2b의 세포는 계대 10, 11 및 12에서 8% DMSO 존재 하에 동결보존되었다. 계대 11대에서 동결시킨 HFSC 세포(클론 #2b)는 ATCC(수탁번호 PTA-12291)에 기탁되었다. 또한 클론 #3의 세포는 계대 9 및 10에서 8% DMSO 존재 하에 동결보존되었다. 클론 #4A 및 #4B의 세포는 클론 #2b 또는 #3보다 더 빨리 성장하였고, 그러므로 그들은 계대 4 및 5(클론 #4A) 또는 계대 3, 4 및 5(클론 #4B)에서 같은 조건으로 8% DMSO의 존재 하에 동결보존되었다. HFSC 세포의 배양에 사용된 것과 동일한 배지(HFSCM1 배지 및 50 μM 1-티오글리세롤)를 HFSC 세포의 동결에 사용하였다. 세포는 후에 해동시키고, 상술한 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1, 100 ng/ml PDGF-AA 또는 20 ng/ml bFGF, 20 ng/ml IGF-1, 및 20 ng/ml PDGF-AA을 수반한 무혈청 HFSCM1 배지 및 50 μM 1-티오글리세롤에서 배양하였다. 이들 세포는 동결 전과 유사한 속도로 증식하는 것으로 관찰되었다(도 6, 도 9 및 도 11). 상기 동결된 세포는 도 12-15에서 나타난 이후 실험에 사용되었다.

실시예 7: 증식되고 미분화된 HFSC 세포의 특징

실시예 2의 HFSC 세포는 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤 존재 하에 배양하였을 때, 도 3, 슬라이드 D-F에 보여지는 바와 같이 클러스터 및/또는 구체로 성장하였다. 클러스터로부터 분리되는 산개 세포(scattered cells)는 도 3의 슬라이드 D 및 E에서 나타난 바와 같이 희돌기아교세포로 분화되는 경향을 보였다. 심지어 상기 세포가 단세포기로 계대될 경우에 조차도, 이들은 결국 응집하기 시작하여 다시 클러스터를 형성하였다. 증식기에서 그들의 형태는 희돌기아교 전-선조세포(Ben-Hur et al., J. Neurosci., 18:5777, 1998; Gago et al., Mol. Cell. Neurosci., 22:162, 2003)와 유사하였으나, 어떠한 클러스터 형성 없이 양극성 형태로 성장하는 O-2A 선조체와는 달랐다. 랫트 희돌기아교 전-선조세포는 오래 전에 보고되었지만, 인간 대응물(counterpart)는 아직 보고되지 않았다. 그러나 희돌기아교 선조세포는 하기에 나타난 바와 같이 어찌 됐든 간에 희돌기아교세포로 분화하는 능력을 유지하기 때문에, 증식중인 세포배양물에서 희돌기아교 선조세포의 정밀한 시기를 확인하는 것은 필수적이지 않다.

분화되지 않은 HFSC 세포의 면역-표현형을 확인하기 위하여 11-15 계대에서 상기 세포를 아큐타제(Innovative Cell Technologies, 미국)로 단일 세포 상태로 분리시켰고, 폴리-오르티닌이 코팅된 24-웰 배양 플레이트에서 분주하여, 100 ng/ml PDGF-AA, 10 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF-1 및 50 μM 1-티오글리세롤 존재 하에 3-7일 동안 배양하였다. 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하였고, PBS로 세척하였다. CD133, PDGF-Rα, NG2, A2B5, 04, 01, GalC 및 PSA-NCAM의 표면항원을 염색하기 위하여, 세포를 3% 정상 염소 혈청(normal goat serum, NGS)이 포함된 PBS를 사용하여 차단(bloking)하였고, 항체로 염색하였다. Sox2, 네스틴, Olig2, 수초 염기성 단백질(myelin basic protein, MBP), 비멘틴(vimentin), GFAP, βⅢ 튜불린(tubulin), 뉴로필라멘트-L(neurofilament-L) 및 MAP2와 같은 세포내(intracellular) 항원을 염색하기 위하여, 세포는 차단(blocking)하기 전에 10분 동안 0.1% Triton X-100이 들어 있는 빙냉(ice-cold) PBS을 사용하여 투과화(permeabilized)시켰다. CD133/1 마우스 IgG1 단클론 항체(클론 AC133, Miltenyi Biotec), 항-PDGF-Rα 토끼 다클론 항체(Upstate), 항-NG2 토끼 다클론 항체(Millipore), 항-PSA-NCAM 마우스 IgM 단클론 항체(Millipore), A2B5 마우스 IgM 단클론 항체(Millipore), O4 마우스 IgM 단클론 항체(R&D Systems), O1 마우스 IgM 단클론 항체(Millipore), 항-Sox2 토끼 다클론 항체(Millipore), 항-네스틴 마우스 IgG1 단클론 항체(Millipore), 항-Olig2 마우스 단클론 IgG2ase 단클론 IgG2a 항체, 항-GalC 단클론 IgG3 항체(Millipore), 항-MBP 랫트 단클론 IgG2a 항체(Millipore), 항-비멘틴 마우스 IgG1 단클론 항체(Santa Cruz), 항-GFAP 토끼 다클론 항체(Millipore), 항-βⅢ 튜불린 단클론 마우스 IgG1 항체(Millipore), 항-뉴로필라멘트-L 마우스 단클론 IgG1 항체(Cell Signaling), 항-MAP2 토끼 다클론 항체(Millipore) 및 항-MAP2 마우스 IgG1 단클론 항체(Millipore)은 3% NGS가 포함된 PBS에 1:300(CD133/1), 1:300(PDGF-Rα), 1:600(NG2), 1:1000(PSA-NCAM), 1:1000(A2B5), 1:1000(O4), 1:1000(O1), 1:1000(Sox2), 1:200(네스틴), 1:200(Olig2), 1:100(GalC), 1:50(MBP), 1:500(비멘틴), 1:1000(GFAP), 1:100(βⅢ Tublin), 1:200(뉴로필라멘트-L), 1:1000(MAP2, 다클론) 또는 1:200(MAP2, 단클론)으로 희석하여 사용하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 3% NGS가 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 일부 경우에는, 일부 세포 표면항원을(NG2, A2B5, O4, O1 및 GD3)을 위한 생존세포 염색(live cell staining)을 비특이적 신호를 감소시키기 위해 사용하였다. 이러한 경우 세포를 차단 없이 고정 전에 각 1차 항체로 염색하였다. 항-NG2 토끼 다클론 항체, A2B5 마우스 IgM 단클론 항체, 04 마우스 IgM 단클론 항체, 01 마우스 IgM 단클론 항체, 및 항-Disialoganglioside GD3 마우스 단클론 IgG3 항체(Millipore)는 0.5% BSA를 포함하는 PBS에서 1:150(NG2), 1:100(A2B5), 1:200(O4), 1:100(O1) 및 1:200(GD3)로 희석하여 사용하였다. 상온에서 30분 동안 정치시킨 후, 각 웰은 0.5%가 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 이차 항체인 DyLight 488-conjugated AffiniPure 염소 항-토끼 IgG(Fcγ 단편 특이적), DyLight 488-conjugated AffiniPure 염소 항-마우스 IgG(Fcγ 단편 특이적), DyLight 488-conjugated AffiniPure 염소 항-토끼 IgG(H+L), DyLight 488-conjugated AffiniPure 염소 항-랫트 IgG(H+L), DyLight 594-conjugated AffiniPure 염소 항-마우스 IgG(H+L), 및/또는 DyLight 594-conjugated AffiniPure 염소 항-마우스 IgM(μ 쇄 특이적)는 모두 잭슨면역연구소로부터 구매하였고, 상온에서 1시간 동안 1:500으로 희석하여 사용하였다. 상기 세포는 PBS로 2회 세척한 후, DAPI를 사용하여 세포핵을 대비염색하였다. 상기 세포는 반사형광(epifluorescence) 기능을 장착한 Olympus 1X81을 사용하여 관찰하였다.

대부분 HFSC 세포는 신경줄기세포의 지표인 CD133-양성(도 12, 슬라이드 A 및 B), Sox2-양성(도 12, 슬라이드 C 및 D) 및 네스틴-양성(도 12, 슬라이드 E 및 F)이었다. 대부분 HFSC 세포는 Olig2-양성(종종 운동신경세포 및 희돌기아교세포에 대한 선조세포에 대한 지표인)(도 12 슬라이드 G 및 H), PDGF-Rα-양성(종종 희돌기아교-계통 세포에 대한 지표인)(도 12 슬라이드 I 및 J), A2B5-양성(A2B5는 통상적으로 신경줄기세포에는 나타나지 않고 아교세포 선조세포(glial progenitor cells), 희돌기아교 선조세포 및 제2형 성상교세포에서 발견된다)(도 12, 슬라이드 M 및 N)이었다. 대부분의 HFSC 세포는 PSA-NCAM-양성(도 12, 슬라이드 O 및 P)이었으나, 그 발현 수준은 다양하였다(PSA-NCAM는 통상적으로 신경줄기세포에는 나타나지 않고, 신경선조세포 및 희돌기아교 전-선조세포에서 발견된다). 대부분의 HFSC 세포는 비멘틴-양성(도 12, 슬라이드 Q-S)인 반면, GFAP-양성 세포는 관찰되지 않았다. 최소한 90%의 HSFC 세포는 GFAP를 제외한 상기 표지자에 대해 양성으로 보였으나, HFSC 세포가 클러스터를 형성하고 고정 및 염색 과정에서 쉽게 세포 배양용기로부터 분리되는 경향을 가지고 있기 때문에 정확한 계수는(counting) 매우 어려웠다. 상기 세포들의 순도를 정량화하기 위해, 유세포분석을 수행하였으며, 해당 결과는 도 13에 나타냈다.

덧붙여 미분화 HFSC 세포는 면역세포화학염색법(immunocytochemistry)에 의해 전-희돌기아교아세포(O4-양성, GalC-음성) 및 미성숙 희돌기아교세포(O4-양성, GalC-양성)에 대한 표지자인 04 항체로 약하게 염색되었으나, 약한 염색과 비특이적 염색을 구분하는 것은 매우 어려웠다. 다중극 형태와 함께 강한 04-양성을 나타내는 일분 전-희돌기아교아세포가 상기 배양에서 관찰되었으나 이들의 출현빈도는 전체 세포 중 1% 미만이었다.

덧붙여, 미분화 HFSC 세포는 항-MAP2 항체에 의해 약하게 염색되었으나 그 형태는 신경세포와 같지 않았다. 상기 항체를 혈청의 존재 하에 분화된 세포와 함께 사용했을 때, 신경세포가 강한 신호와 신경세포 형태와 함께 확인되었다(도 14, 슬라이드 H). 신경세포 형태와 함께 MAP-2의 그러한 강한 신호는 미분화 HFSC 세포에서는 확인되지 않았다. 이러한 약한 신호는 상기 세포가 분화되면 사라졌는데, 이로써 상기 염색이 특이적이고 미분화 HFSC 세포는 비특이적으로 염색되지 않을 수 있다.

결론적으로, HFSC 세포는 신경줄기세포에 특이적인 표지자(CD133, Sox2, 및 네스틴)와 희돌기아교-계통 세포에 특이적인 표지자(Olig2, NG2, A2B5, 및 O4)를 발현하였다. 이들 결과는 HFSC 세포는 신경줄기 세포와 희돌기아교 선조세포 사이에 중간체(intermediate)임을 시사하였다. 더 나아가 HFSC 세포는 PSA-NCAM을 발현하였는데, 이는 상기 세포가 랫트 희돌기아교 전-선조세포의 인간 대응물(counterpart)임을 나타내는 것이다.

PSA-NCAM의 폴리시알산(Polysialic acid, PSA)는 세포 사이의 거리를 조절하는 역할을 하는 매우 큰 수화 부피(enourmous hydrated volume)를 가진 긴, 음전하를 띤 세포표면 글리칸이다. PAS는 성체 CNS에서 다수의 가소성-관련 반응(plasticity-related responses)에 관련되어 있는데, 이러한 반응은 생체주기(circadian) 및 호르몬 양상(hormonal pattern)의 변화, 통증 및 스트레스에 대한 적응, 및 기억과 학습의 양상(aspect of learning and memory)을 포함한다(Rutishauser, Nat. Rev. Neurosci., 9:26, 2008). 신생아의 신경계(neonatal nervous system)에서의 PSA의 역할 중에 하나는 희돌기아교 선조체의 이동(migration)에 있다. PSA가 이동중인 O2A 전구체로부터 제거되었을 때 상처 모델에서 O2A 선조체의 이동이 억제되었다(Barral-Moran et al., J. Neurosci. Res., 72:679, 2003). 다른 역할은 세포의 분화시기를 조절하는 것이다. PSA는 발생중인 축삭돌기(axon)와 희돌기아교세포 전구체(oligodendrocyte precursors)에서 발현되었고, 상기 세포들에서 이의 하향조절은 수초화의 개시와 관련되어 있다. PSA는 또한 성체 CNS의 가소성-관련 반응과 관련되어 있다. PSA의 발생 및 성체의 가소성을 조절하는 능력을 고려해 볼 때, PSA-발현 세포가 조직이 상처(injury)나 질병에 의해 손상된 상황에서 치료적 가치를 가질 수 있다. PSA-발현 영역 (상처에서의 PSA의 재조합 발현 또는 이식된 슈반세포)에서의 축삭돌기 재생(axonal regrowth)이 외상 모델(trauma model)에서의 상처를 통해 관찰되었다. HFSC 세포는 내생적(endogenous) PSA-발현 세포이고 뇌손상이나 척추손상과 같은 외상(trauma)을 치료하는데 있어 동일한 효과가 있을 것이다.

HFSC 세포(클론 #2b)의 특징을 추가적으로 규명하기 위해, 계대 11에서 동결된 세포를 해동시킨 후, 상술한 배양조건에서 배양하였고 매 7-9일마다 계대하였다. 계대 13에서 9일간 배양된 상기 세포를 대상으로 하기 항체들을 이용하여 유세포분석을 수행하였다: PE-접합 항-CD133/1 마우스 IgG1 단클론 항체 (클론 AC133, Miltenyi Biotec); PE-접합 CD140α 마우스 IgG2a 단클론 항체(클론 αR1, BD Pharmingen); PE-접합 CD9 마우스 IgG1 단클론 항체(클론 M-L13, BD Pharmingen); PE-접합 CD44 마우스 IgG2b 단클론 항체(클론 G44-26, BD Pharmingen); PE-접합 항-PSA-NCAM 마우스 IgM 단클론 항체(2-2B, Miltenyi Biotec); PE-접합 A2B5 마우스 IgM 단클론 항체(클론 105HB29, Miltenyi Biotec); PE-접합 O4 마우스 IgM 단클론 항체(클론 O4, Miltenyi Biotec); 및 PE-접합 항-NG2 마우스 IgG1 단클론 항체(R&D Systems). 간략히, 아큐타제로 해체시킨 후에, 상기 세포를 세척하고 2 mM EDTA 및 0.5% BSA가 함유된 빙냉(ice-cold) PBS에서 재부유하고, 얼음 상에 정치하였다. 세포를 계수한 후 2 mM EDTA 및 0.5% BSA를 함유한 빙냉 PBS를 사용하여 세포농도를 1 x 10⁷cells/ml으로 조정하였다. 세포 현탁액 25 μl(250,000 cells)을 1.5 ml 튜브로 옮겨 담았다. 그후 제조사에 지시에 따라 각 튜브에 1차 항체를 첨가하였다. 각 항체에 대한 PE-접합 동형 대조군(isotype controls)을 적절한 관문(appropriate gate)을 설정하기 위해 사용하였다. 얼음 위에서 20분 동안 고정한 후, 세포를 2 mM EDTA 및 0.5% BSA가 함유된 빙냉 PBS에서 세척하고 고정 완충액(BD Bioscience)으로 재부유하였다. 얼음 위에서 20분간 고정한 후 세포를 세척하고 2 mM EDTA 및 0.5% BSA가 함유된 빙냉 PBS로 재부유하였다. FACS Canto II(BD Bioscience)를 사용하여 세포의 형광을 측정하였고 각 데이터는 Gatelogic software(Inivai Technologies Pty Ltd.)를 사용하여 분석하였다.

도 13에서 나타난 바와 같이, 전부 또는 대부분의 HFSC 세포(클론 #2b)는 CD133-양성(세포 중 100%), CD9-양성(세포 중 100%), CD140α-양성(세포 중 98.8%), NG2-양성(세포 중 89.8%), A2B5-양성(세포 중 99.9%), 04-양성(세포 중 94.6%), PSA-NCAM-양성(세포 중 68.9%), 및 CD44-음성(세포 중 0.4%가 양성이었음)이다. 세포면역화학염색법(immunocytochemistry)에 의해 04 신호는 비-특이적 염색(non-specific staining)과 구별하기 어려웠고, 전-희돌기아교아세포(pro-oligodendroblast)나 희돌기아교세포의 O4 신호보다 매우 약했다. 유세포분석(flow cytometry)의 결과로부터 HFSC 세포(클론 #2b)의 O4 신호는 동형 대조군 및 04 항원에 대해 약하게 양성하게 나타나는 HFSC 세포(클론 #2b)로부터 구분될 수 있었다. HFSC 세포(클론 #3)은 유세포분석에 의해 거의 동일한 표현형을 나타냈다. 이들은 CD133-양성(세포 중 98.4%), CD9-양성(세포 중 99.4%), CD140α-양성(세포 중 91.5%), NG2-양성(세포 중 63.4%), A2B5-양성(세포 중 99.8%), 04-양성(세포 중 71.6%), PSA-NCAM-양성(세포 중 74.7%), 및 CD44-음성 (세포 중 0.3%가 양성이었음)이었다.

실시예 8: 혈청 함유 배지에서 증식 HFSC 세포의 분화 가능성

증식된 세포의 분화 잠재력을 확인하기 위해, HFSC 세포(클론 #3)를 분리/ 단일 세포 단계로 계대하였고, 분화를 자극하기 위해 혈청이 함유된 배지[희돌기아교 선조세포 분화 배지(OPCDM, ScienCell 연구소)]에서 배양하였다. 그 후 세포를 신경세포(항-βⅢ 튜불린 항체, 항-뉴로필라멘트-L 항체 및 항-MAP2 항체), 희돌기아교 선조세포 및 희돌기아교세포[04 항체, 01 항체, 항-GalC 항체 및 항-수초 염기성 단백질 항체)), 및 성상교세포(항-GFAP 항체)를 인식하는 항체에 이은 형광염료-접합 이차항체(fluorescent dye-conjugated secondary antibody, DyLight 488 또는 DyLight 594, 잭슨면역연구소)로 염색하였다. DAPI는 세포핵에 대한 대비염색(counterstain)에 이용되었다.

모든 세 가지 주요 중추 신경계(CNS) 표현형이 HFSC 세포(클론 #3)의 분화를 자극하기 위한 처리 이후에 관찰되었다. HFSC 세포를 혈청이 함유된 배지에서 배양할 때, 신경세포의 지표인 βⅢ 튜불린-양성 세포, 뉴로필라멘트-L-양성 세포, 및 MAP-2-양성 세포가 관찰되었다. 다수의 βⅢ 튜불린-양성 세포가 존재한 반면(도 14, 슬라이드 B), 뉴로필라멘트-L(도 14, 슬라이드 E) 또는 MAP2(도 14, 슬라이드 H)에 대하여 양성인 세포는 소수 존재하였다. 이러한 데이터는 이들 중 다수가 미성숙 신경세포임을 나타냈다. HFSC 세포는 MBP-양성 세포로 분화할 수 있었다. MBP는 수초의 주요 구성 요소이며 오직 성숙 희돌기아교세포에서만 발현된다. 이런 결과는 HFSC 세포가 성숙 희돌기아교세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있음을 나타낸다. MBP의 공-위치화는(co-localization) 및 상기 신경 표지자를 평가하였으나 소수의 공-위치화만 관찰되었다(도 14, 슬라이드 C, F, I). 수초는 미성숙 신경세포를 둘러싸지 않을 것이기 때문에, 이는 아마도 신경세포의 미성숙에 기인하는 것일 수 있다. MBP 및 O4 항원의 공-위치화 역시 평가하였다(도 14, 슬라이드 J-L). 대부분의 MBP의 신호는 O4 항원의 신호와 공-위치화였으나, O4 항원의 신호의 절반만이 MBP의 신호와 공-위치화하였다. O4 항원이 희돌기아교 선조세포, 미성숙 희돌기아교세포 및 성숙 희돌기아교세포에서 발현되는 반면, MBP는 오직 성숙 희돌기아교세포에서만 발현되기 때문에, 이러한 결과는 합당하다. 이들 세포는 또한 미성숙 희돌기아교세포에 대한 표지자인 GalC 항원에 대하여 양성이었다(데이터는 제시되지 않음). GFAP-양성 세포(성상교세포)와 비멘틴-양성 세포 역시 도 14, 슬라이드 M-0에서 나타난 바와 같이 확인되었다. 이들 결과는 증식된 HFSC 세포가 환경에 의존적으로 상기 세 가지 주요 중추신경계 세포 표현형을 생성할 수 있기 때문에, 상기 증식된 HFSC 세포는 다분화능(multipotent)이고, 그러므로 신경줄기세포(neural stem cells)와 유사함을 나타낸다. HFSC 세포(클론 #2b) 역시 동일한 조건에서 검사되었고, HFSC 세포(클론 #3)과 같이 동일한 다분화능을 나타냈다.

실시예 9: 혈청이 없는 배지에서 증식 HFSC 세포의 분화 가능성

도 5에서 나타낸 바와 같이, HFSC 세포는 bFGF의 보충 없이 PDGF-AA 농도를 줄임으로써 희돌기아교세포로의 좋은 분화 잠재력을 보여주었다. 그러나 분화된 세포는 전체 세포의 절반 미만이었다. HFSC 세포를 bFGF 없이 10 ng/ml의 PDGF-AA 및 100 ng/ml의 IGF-1와 함께 매우 낮은 밀도(< 0.5 x 10⁴ cells/cm²)로 파종 할 경우, 대부분의 세포는 분화하는 듯 보였으나 하루 내에서 소실되었다. 희돌기아교세포로 분화하는 잠재력을 추가적으로 확인하기 위해서는, 분화의 유도 및 장기간의 세포 생존이 매우 중요하다고 판단되었다. 고리형 AMP (cAMP)는 여러 유형의 세포의 분화를 유도하는 것으로 알려져 있다. cAMP의 세포 투과성 아날로그인 pCPT-cAMP가 HFSC 세포의 분화를 유도 할 수 있는지 여부를 확인하였다. 100 μM pCPT-cAMP는 고밀도(3 x 10⁴ cells/cm²)에서 HFSC 세포의 분화를 유도 할 수 있었으나, 세포는 100 ng/ml IGF-1 존재 하에 조차도 생존할 수 없었다. BDNF는 희돌기아교 선조세포의 분화를 향상시키고 분화된 세포의 생존을 지지함이 종래에 보고되었다. HFSC 세포를 B27, N2 보충물 그리고 50 μM 1-티오글리세롤이 보충되고, 글루타민 및 HEPES가 포함된 DMEM/F12 배지에서 10 ng/ml PDGF-AA, 100 ng/ml IGF-1, 100 μM pCPT-cAMP, 및 10 ng/ml BDNF이 존재 하에 분화시켰을 때, HFSC 세포의 적어도 절반 이상은 프로세스-지향 세포(process-bearing cells)로 분화하였다.

HFSC 세포는 04 또는 NG2와 같은 몇몇 희돌기아교세포 표지자를 발현하기 때문에, HFSC 세포와 희돌기아교-계통 세포와 구별하는 새로운 방법이 요구되었다. 몇 가지 시도에 기초하여, 본 발명자는 미분화 세포가 희돌기아교 선조세포보다 더 강한 GD3를 발현하고, O4의 경우는 그 반대임을 확인하였다(도 11, 슬라이드 A, B, 및 C의 화살표 머리). 상기 세포를 GD3 및 O4로 염색하였을 때, 희돌기아교세포는 염색 양상과 형태를 이용하여 구별할 수 있었다. 덧붙여 신경세포나 성상교세포와 같은 다른 유형의 세포는 GD3과 04를 발현하지 않기 때문에 이들 세포 역시 확인할 수 있었다 도 15, 슬라이드 D는 각 세포 유형의 비율을 보여 준다. 미분화 세포는 전체 세포의 23.5% ± 2.0%이었다. 희돌기아교 선조세포는 전체 세포의 75.8% ± 2.1를 차지하였다. 다른 유형의 세포는 단지 0.9% ± 0.6%을 차지하였다. 상기에서 언급한 바와 같이 분화된 세포(희돌기아교 선조세포 및 다른 세포형태)에 대한 희돌기아교 선조세포의 비율은 분화된 세포의 99.1% ± 0.56%이었던 반면, 다른 유형의 세포는 분화된 세포의 0.9% ± 0.56%이었다. 이러한 결과는 HFSC 세포가 희돌기아교-계통 세포로의 분화에 대한 높은 잠재력을 가지고 있음을 나타낸다.

실시예 10: 형광 활성화 세포정렬(FACS) 방법 및 자성 정렬(magnetic sorting) 방법에 의한 HFSC 세포의 농축 또는 선택

본 발명은 HFSC 세포의 표현형이 CD133-양성, CD140α-양성, CD9-양성, CD44-음성, PSA-NCAM-양성, A2B5-양성, O4-양성, 및 NG2-양성임을 개시하였다. 이러한 정보는 배양 없이 HFSC 세포를 선택하거나 농축하는 것을 가능케 한다. CD133은 신경줄기세포의 표지자이고, 선조체 또는 선조세포에서는 발현되지 않는다. CD9 또한 신경줄기세포 표지자이나, 일부 희돌기아교세포는 CD9를 발현한다고 알려졌다. PSA-NCAM 및 A2B5는 신경세포-제한 전구체(neuronal-restricted precursor) 아교세포-제한 전구체(glial-restricted precursor) 검출을 위해 사용하였다. 대부분 신경전구체나 선조체(progenitors)은 PSA-NCAM 및 A2B5 또는 PSA-NCAM 또는 A2B5 중 어느 어느 하나를 발현된다고 여겨지기 때문에, 이들의 사용으로는 HFSC 세포, 특히 임신 초기와 중기의 HFSC 세포를 잘 농축시킬 수 없다. CD140α, NG2, A2B5 및 O4는 희돌기아교 전구세포, 전-희돌기교세포(pro-oligodendroglia) 또는 희돌기아교세포에 대한 표지자로 사용된다. CD140α 및 NG2의 발현 수준은 희돌기아교 전구세포, 전-희돌기교세포 및 희돌기아교세포보다 HFSC세포에서 높게 나타난 반면, A2B5 및 O4 발현 수준은 HFSC세포에서 희돌기아교 전구세포, 전-회돌기교세포 및 희돌기아교세포보다 낮았다. CD140α 및 NG2의 사용은 HFSC 세포를 농축하는데 보다 적절할 것으로 여겨진다. 상기 정보 및 본 발명에 기재된 상기 결과에 기초하여, HSCF 세포를 농축하기 위한 각 표지자의 효과는 CD140α > NG2 > CD9 > CD133 > A2B5 > 04, PSA-NCAM 순서이나 상기 순서는 임신 주령에 따라 달라질 수 있다.

그러나, 단일 표지자는 HFSC 세포를 선택(select)하기에는 충분하지 않을 수 있으며, 두 가지 표지자의 조합이 보다 특이적으로 HFSC 세포를 선택할 수 있다. 신경줄기세포 표지자(CD133 또는 CD9) 중에 하나와 희돌기아교-계통 세포 표지자(CD140α, NG2) 중에 하나의 조합이 HFSC 세포를 선택하기에 매우 효과적일 수 있다. 상기 지식에 기초하여, HFSC 세포를 선택하는 가장 효과적인 표지자의 조합은 상기 조합 중에 CD133 및 CD140α일 수 있으나, 다른 조합 역시 단일 표지자를 이용한 선택보다 효과적일 수 있다.

CD133 또는 CD140α의 출현빈도는 일반적으로 낮고(5% 미만), CD140α의 출현은 CD133의 출현보다 더 나중이다(임신 8주령에서 시작하여 최대 18주령까지 발현). 그러므로 임신 주령에 따라 CD133과 CD140α를 모두 발현하는 세포는 매우 적다(전체 세포의 1% 미만). 만약 세포가 임신 15주령 또는 그 이전의 인간 배아조직으로부터 유래한 것이라면, 대부분의 CD133-양성 세포는 CD140α을 발현하지 않을 것이다. CD133-양성 및 CD140α-음성 세포는 나중에 CD140α을 발현할 것이기 때문에, 상기 HFSC 세포는 CD133-양성 세포의 초기 농축 이후, 상기 세포를 동일 조건에서 배양함으로써 수득할 수 있다.

American Type Culture Collection

ATCCPTA-12291

20111130

Claims

신경세포(neuron), 성상교세포(astrocyte), 및 희돌기아교세포(oligodendrocyte)로 분화되는 능력을 유지하고,
이후의 계대를 통해 효과적으로 희돌기아교-계통 세포(oligodendrocyte-lineage cell)로 분화할 수 있는 능력을 유지하며,
적어도 세포표면항원 CD133, CD140α, A2B5, 및 PSA-NCAM을 발현하는 선조세포 또는 줄기세포인, 분리된 증식가능한 인간 신경세포에 있어서,
상기 세포는 유효량의 성장 보충물을 포함하는 배양배지를 포함하는, 상기 증식가능한 신경세포의 농축에 유효한 조건 하에서 배양되고,
HFSC 세포를 분리하기 위한 상기 배양배지 내의 성장 보충물의 유효량은 적어도 10 μM의 1-티오글리세롤인, 분리된 증식가능한 인간 신경세포.
제1항에 있어서,
상기 세포는 ATCC 수탁번호 PTA-12291로 기탁된 신경세포인, 분리된 증식가능한 인간 신경세포.
제1항에 있어서,
상기 세포는 척수, 대뇌피질, 해마(hippocampus), 선조체(striatum), 전뇌기저부(basal forebrain), 복측중뇌(ventral mesencephalon), 청반(locus ceruleus), 시상하부(hypothalamus), 소뇌(cerebellum), 뇌량(corpus callosum), 및 시신경(optic nerve)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 배아 신경조직에서 유래된 세포인, 증식가능한 인간 신경세포.
제3항에 있어서,
상기 신경조직은 임신 8~24주령의 인간의 척수에서 분리된, 증식가능한 인간 신경세포.
제1항에 있어서,
상기 조건은 유효량의 성장 보충물, 두 가지 성장인자, 및 하나의 생존인자를 추가적으로 포함하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 두 가지 성장인자는 혈소판 유래 성장인자(PDGF) 및 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF)이고 HFSC 세포의 분리를 위해, 적어도 5 ng/ml의 PDGF 및 적어도 2.5 ng/ml의 bFGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 두 가지 성장인자는 PDGF 및 bFGF이고 HFSC 세포의 분리를 위해 약 40 ng/ml 내지 약 200 ng/ml의 PDGF 및 약 5 ng/ml 내지 약 40 ng/ml의 bFGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 두 가지 성장인자는 PDGF 및 bFGF이고 HFSC 세포의 분리를 위해 약 100 ng/ml의 PDGF 및 약 20 ng/ml의 bFGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 두 가지 성장인자는 PDGF 및 bFGF이고 세포주 확립 후 HFSC 세포의 증식과 유지를 위해, 적어도 1 ng/ml의 PDGF 및 0.5 ng/ml의 bFGF 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 두 가지 성장인자는 PDGF 및 bFGF이고 세포주 확립 후 HFSC 세포의 증식을 위해 약 100 ng/ml의 PDGF 및 약 1 ng/ml 내지 50 ng/ml의 bFGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 두 가지 성장인자는 PDGF 및 bFGF이고 세포주 확립 후 HFSC 세포의 증식을 위해 약 20 ng/ml의 PDGF 및 약 20 ng/ml의 bFGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 하나의 생존인자는 인슐린-유사 성장인자(IGF)이고 적어도 1 ng/ml의 IGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 하나의 생존인자는 IGF이고 약 5 ng/ml 내지 100 ng/ml의 IGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제5항에 있어서,
상기 하나의 생존인자는 IGF이고 약 20 ng/ml의 IGF의 농도로 존재하는, 증식가능한 인간 신경세포.
제1항에 있어서,
상기 세포는 이후의 계대를 통해 신경세포, 성상교세포, 및 희돌기아교세포로 분화되는 능력 및 CD133, CD140α, A2B5 및 PSA-NCAM와 같은 세포표면 항원을 발현하는 능력을 잃지 않은채, 동결 및 해동이 가능한, 증식가능한 인간 신경세포.
a) 인간 배아 신경조직으로부터 적어도 하나의 세포를 분리하고 해리하는 단계;
b) 상기 세포를 37℃의 온도로, 1-20% O₂ 및 5% CO₂를 포함하는 분위기에서
적어도 5 ng/ml의 PDGF-AA,
적어도 0.5 ng/ml bFGF, 및
적어도 10 μM 1-티오글리세롤
을 포함하는 화학적으로 정의된 무혈청 배양배지에서 배양하는 단계; 및
c) 증식가능한 인간 신경세포를 수득하기 위해 상기 b)로부터 세포를 계대하는 단계를 포함하는,
포유동물 중추신경계로부터 분리된 선조세포 또는 줄기세포로서, 신경세포, 성상교세포, 및 희돌기아교세포로 분화할 수 있는 능력을 유지하며, 희돌기아교-계통 세포로 분화할 수 있는 능력을 가진, 증식가능한 신경세포를 시험관 내 조건에서 배양하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 배양배지는 적어도 1.0 ng/ml IGF-1을 추가적으로 포함하는, 방법.
제16항에 있어서,
상기 신경조직은 척수, 대뇌피질, 해마, 선조체(striatum), 전뇌기저부(basal forebrain), 복측중뇌(ventral mesencephalon), 청반(locus ceruleus), 시상하부, 소뇌, 뇌량(corpus callosum), 및 시신경으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제16항에 있어서,
a) 단계에서 상기 신경조직은 임산 8~24주령의 인간 배아 척수로부터 유래한 것인, 방법.
제16항에 있어서,
a) 단계에서 상기 분리는 FACS(fluorescence activated cell sorting) 또는 면역선별(immunopanning) 중 적어도 하나를 사용하는 분리 방법에 의해 수행되는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 배양배지는
40 내지 200 ng/ml PDGF-AA,
5 내지 100 ng/ml bFGF,
10 내지 100 μΜ 1 티오글리세롤, 및
5 내지 100 ng/ml IGF-1
를 포함하는 방법.
제17항에 있어서,
상기 배양배지는
약 100 ng/ml PDGF-AA,
약 20 ng/ml bFGF,
약 50 μΜ 1-티오글리세롤, 및
약 20 ng/ml IGF-1
를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 배양배지는
5 ng/ml 내지 100 ng/ml PDGF-AA,
1 ng/ml 내지 50 ng/ml bFGF,
5 μΜ 내지 100 μΜ 1-티오글리세롤, 및
5 ng/ml 내지 100 ng/mlIGF-1
를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 배양배지는
약 20 ng/ml PDGF-AA,
약 20 ng/ml bFGF,
약 50 μΜ 1-티오글리세롤, 및
약 20 ng/ml IGF-1
를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 배양 단계는 폴리-오르니틴 또는 폴리-라이신으로 코팅된 배양용기 내에서 수행되는, 방법.
제17항에 있어서,
상기 화학적으로 정의된 무혈청 배지는 비필수 아미노산, 글루타민, 피루브산, B27 보충물, N-아세틸-L-시스테인 및 β-머캅토에탄올로 보충된 DMEM/F12 배지를 포함하는, 방법.
적어도 5 ng/ml PDGF-AA,
적어도 5 ng/ml bFGF, 및
적어도 10 μM 1-티오글리세롤
을 포함하는 화학적으로 정의된 무혈청 배지에 잠긴, 포유류 중추신경계로부터 수득된 적어도 하나 이상의 분리된 신경세포를 포함하는 시험관 내 조건의 배양물.
제27항에 있어서,
적어도 1.0 ng/ml의 IGF-1을 추가적으로 포함하는, 시험관 내 조건의 배양물.
제28항에 있어서,
상기 세포는 인간 배아 척수로부터 수득된, 시험관 내 조건의 배양물.
제29항에 있어서,
상기 시험관 내 조건의 배양물은 폴리-오르니틴 또는 폴리-라이신으로 코팅된 배양용기 내에 존재하는, 시험관 내 조건의 배양물.
제29항에 있어서,
상기 화학적으로 정의된 무혈청 배지는 비필수 아미노산, 글루타민, 피루브산, B27 보충물, N-아세틸-시스테인 및 β-머캅토에탄올로 보충된 DMEM/F12 배지를 추가적으로 포함하는, 시험관 내 조건의 배양물.
제29항에 있어서,
상기 신경세포는 CD133-양성, CD140α-양성, A2B5-양성 및 PSA-NCAM-양성인, 시험관 내 조건의 배양물.
제1항의 분리된 증식가능한 인간 신경세포를 포함하는 치료적으로 유효한 양의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 수초의 손실 또는 희돌기아교세포의 손실에 의해 야기되는 증상의 치료방법.
제33항에 있어서,
상기 증상은 탈수초성 질환(demyelinating disease) 또는 퇴행성 신경질환인, 치료방법.
제34항에 있어서,
상기 탈수초성 질환은 척수 손상(spinal cord injury, SCI), 다발성경화증(mutiple scleorosis, MS), 유전적 백질이영양증(hereditary leukodystrophy), 횡단성 척수증/척수염, 진행성 다소성 백질뇌염(progressive multiple focal leukoencephalopathy) 및 다른 선천성 탈수초성질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 치료방법.
제34항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머, 알츠하이머형 노인성치매(senile dementia Alzheimer type), 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성축색경화증(amyothrophic lateral sclerosis), 허혈, 실명, 및 유수 신경(myelinated neurons) 손상에 의해 야기된 퇴행성 신경질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 치료방법.
제34항에 있어서,
상기 투여하는 단계는 탈수초성 질환과 퇴행성 신경질환에 걸린 신경조직이나 측뇌실(lateral ventricles) 내에 증식가능한 인간 신경세포를 주입하는 단계를 포함하는, 치료방법.
제37항에 있어서,
상기 신경조직은 척수, 뇌실하영역(subventricular zone), 뇌량, 소뇌, 기저핵, 전뇌 기저핵(nucleus basalis), 흑질(substantial nigra)로 구성되는 군으로부터 선택되는, 치료방법.
제34항에 있어서,
상기 투여하는 단계는 자궁경유 배아 뇌실내 주입(transuterine fetal intraventricular injection), 뇌실내 주입, 실질내 주입(intraparenchymal injection), 유리체강내 주사(intravitreal injection) 및 혈관내 투여로 구성되는 방법에 의해 상기 개체 내로 상기 증식가능한 인간 신경세포를 주입하는 단계를 포함하는, 치료방법
제34항에 있어서,
상기 투여하는 단계에 앞서 상기 증식가능한 인간 신경세포를 분화시키는 단계를 추가적으로 포함하는, 치료방법.
제1항의 분리된 증식가능한 인간 신경세포를 포함하는 약학적 신경줄기세포 조성물.
제16항의 방법에 의해 시험관 내 조건에서 배양된 증식가능한 신경세포를 포함하는 약학적 신경줄기세포 조성물.
수초의 손실 또는 희돌기아교세포의 손실에 의해 유발되는 증상의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 제41항 또는 제42항의 약학적 조성물의 용도.