JP6615616B2

JP6615616B2 - アダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法

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Publication number: JP6615616B2
Application number: JP2015559084A
Authority: JP
Inventors: 誠末松; 康人徳元; 親平玉置
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Filing date: 2015-01-21
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Description

本発明は、器官形成期や出生後間もない時期にみられる活発に細胞分裂を繰り返すオリゴデンドロサイト前駆細胞（以下、「増殖型ＯＰＣ」ということがある）から、成体においてみられる分化能を保持したまま休眠状態にあるオリゴデンドロサイト前駆細胞（以下、「アダルト型ＯＰＣ」ということがある）を製造する方法に関する。

オリゴデンドロサイトは、オリゴデンドロサイト前駆細胞（oligodendrocyte-type-2 astrocyte (Ｏ-２Ａ) progenitor cells;本願ではＯＰＣと記載する）が成熟してなる中枢神経系内のグリア細胞の一つであり、主にミエリン鞘（髄鞘）形成を担っている。ＯＰＣは、神経幹細胞から分化したグリア前駆細胞がさらに分化したものである。器官形成期のＯＰＣは活発に細胞分裂を繰り返しているが、出生後間もない時期からその一部が成熟してオリゴデンドロサイトに分化しはじめ、成体では一部（アダルト型ＯＰＣ）を除いてオリゴデンドロサイトに分化している。成体に見られるアダルト型ＯＰＣは、器官形成期や出生後間もない時期にみられる増殖型ＯＰＣとは異なり、ほとんど増殖していない休眠状態にある。しかしながらアダルト型ＯＰＣは、分化能を保持しており、適当な刺激によりオリゴデンドロサイトへ分化する。つまり、アダルト型ＯＰＣは、体性幹細胞の一種である。

出生後間もないラットの視神経から採取された増殖型ＯＰＣは、酸素濃度２０体積％環境下（大気様環境下）では、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）含有無血清培地で培養してもオリゴデンドロサイトに分化せず、ＰＤＧＦと甲状腺ホルモンを共に含む無血清培地で培養するとオリゴデンドロサイトに分化すること、また、増殖型ＯＰＣをＰＤＧＦ含有無血清培地で増殖期型ＯＰＣの性質を保ったまま複製老化させる事無く１年以上もの長期間にわたり継代培養出来ることが報告されている（例えば、非特許文献２参照）。また、レチノイン酸も甲状腺ホルモンと同様にＯＰＣからオリゴデンドロサイトへの分化を誘導する因子であること、両者は同じｐ５３依存性細胞内情報伝達経路を介して機能しているであろうことも報告されている（例えば、非特許文献３参照）。

Wolswijk，et al.，Development，1990，vol.109，p.691〜698. Tang，et al.，The Journal of Cell Biology，2000，vol.148(5)，p.971〜984. Tokumoto，et al.，The EMBO Journal，2001，vol.20(18)，p.5261〜5268.

一方、アダルト型ＯＰＣは増殖型ＯＰＣが誘導分化されたものであるが（例えば、非特許文献１参照）、その誘導分化の作用機序は未だ明らかになってはいない。アダルト型ＯＰＣの生理的な機能についての研究のためには、ある程度まとまった量のアダルト型ＯＰＣが必要である。また、アダルト型ＯＰＣは適切な刺激によりオリゴデンドロサイトに分化し、ミエリン鞘の形成に寄与する。つまり、ミエリン鞘の損傷部位や脱髄部位にアダルト型ＯＰＣを移植することによりミエリン鞘を治療し得る可能性があるが、細胞治療薬として使用するためにも、ある程度まとまった量のアダルト型ＯＰＣが必要である。しかしながら、アダルト型ＯＰＣは、成体の中枢神経内に微量しか存在していない上にほとんど増殖しないため、充分量のアダルト型ＯＰＣを調製することは非常に困難であった。

本発明は、入手が比較的容易な増殖型ＯＰＣから、これまで多量の取得が困難であったアダルト型ＯＰＣを製造するための方法、及び当該方法により製造されたアダルト型ＯＰＣを有効成分とする医薬用組成物等を提供することを主たる目的とする。

本発明者らは、鋭意研究した結果、低酸素環境下で、甲状腺ホルモン受容体又はレチノイン酸受容体のリガンドで刺激することにより、増殖型オリゴデンドロサイト前駆細胞が、分化能を保持したままほとんど増殖しないアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞に誘導分化されることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明に係るアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法、アダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞、及び医薬用組成物は、下記［１］〜［８］の構成を有する。
［１］増殖型オリゴデンドロサイト前駆細胞を、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下、甲状腺ホルモン受容体又はレチノイン酸受容体のリガンドであって、Ｔ４、Ｔ３、これらと類似の構造を有するテトラゾール化合物のうち甲状腺ホルモン受容体と結合可能な物質、レチノイン酸、及びビタミンＡから選択されるものの存在下、無血清培地中で培養しアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞に誘導分化する工程を有する、アダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
［２］前記工程の前に、前記増殖型オリゴデンドロサイト前駆細胞を、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下、Ｔ４、Ｔ３、これらと類似の構造を有するテトラゾール化合物のうち甲状腺ホルモン受容体と結合可能な物質、レチノイン酸、及びビタミンＡを含んでいない無血清培地中で増殖させる増殖工程を有する、
前記［１］のアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
［３］前記低酸素環境の酸素濃度が０．５〜１．０体積％である、前記［１］又は［２］に記載のアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
［４］前記増殖型オリゴデンドロサイト前駆細胞が、生体から採取されたオリゴデンドロサイト前駆細胞を初代培養又は継代培養して得られた細胞である、前記［１］〜［３］のいずれかのアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
［５］前記［１］〜［４］のいずれかのアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法により製造され、分化能を保持したまま休眠状態にあるアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞と、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下にある無血清培地と、を含む組成物。
［６］Ｔ４、Ｔ３、これらと類似の構造を有するテトラゾール化合物のうち甲状腺ホルモン受容体と結合可能な物質、レチノイン酸、及びビタミンＡからなる群より選択される１種以上を含有し、分化能を保持したまま休眠状態にあるアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞と、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下にある無血清培地と、を含む組成物。
［７］前記［５］又は［６］の組成物を有効成分とする、医薬用組成物。
［８］ミエリン鞘形成不全、脱髄、又はミエリン鞘の損傷の治療用である、前記［７］の医薬用組成物。

本発明により、単に培養条件を調節するだけで、活発に細胞分裂を繰り返す増殖型ＯＰＣから、分化能を保持したまま休眠状態にあるアダルト型ＯＰＣを効率よく製造することができる。特に、予め充分量になるまで増殖させた増殖型ＯＰＣに対して本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法を適用することにより、比較的均質なアダルト型ＯＰＣを充分量得ることができる。また、得られたアダルト型ＯＰＣは、学術研究用のみならず、細胞医薬としても有効である。

実施例１において、増殖型ＯＰＣをＴＨ（甲状腺ホルモン）含有培地で培養した場合とＴＨ不含培地で培養した場合における細胞増殖率（倍）を算出した結果を示した図である。実施例２において、ＴＨ含有培地で、酸素濃度２０体積％の環境下で培養した細胞の染色像（上段）と、酸素濃度１．５体積％の環境下で培養した細胞の染色像（下段）である。実施例２において、ディッシュ中の全細胞に対する抗ガングリオシドＧＴ３抗体（Ａ２Ｂ５抗体）で染色された細胞の割合と抗ＧＣ抗体で染色された細胞の割合を算出した結果を示した図である。実施例３において、増殖型ＯＰＣを酸素濃度１．５体積％の環境下で、ＴＨ含有培地又はＲＡ含有培地で培養した場合の、全コロニーに対する、それぞれの細胞分裂回数であったコロニーの占める割合（％）を計測した結果を示した図である。実施例３において、酸素濃度１．５体積％の環境下で、ＴＨ含有培地で培養した細胞の位相差顕微鏡画像（「＋ＴＨ」）と、ＲＡ含有培地で培養した細胞の位相差顕微鏡画像（「＋ＲＡ」）である。実施例４において、ＰＤＧＦ不含ＴＨ含有培地で培養したディッシュに存在していたＭＢＰ陽性細胞とＣＮＰａｓｅ陽性細胞の染色像と、ＦＢＳ含有培地で培養したディッシュに存在していたＧＦＡＰ陽性細胞の染色像である。実施例５において、アダルト型ＯＰＣを酸素濃度２０体積％の環境下、各培地中で培養した場合の、全コロニーに対する、それぞれの細胞分裂回数であったコロニーの占める割合（％）を計測した結果を示した図である。実施例５において、図７に示す結果に基づき、アダルト型ＯＰＣを酸素濃度２０体積％の環境下で、各培地で培養した場合のコロニーの平均細胞分裂回数を算出した結果を示した図である。実施例６において、各酸素濃度の環境下で、ＴＨ含有培地で培養した場合の生細胞数を計数した結果を示した図である。実施例７において、マウス由来の増殖型ＯＰＣを酸素濃度１．０又は３．０体積％の環境下で、ＴＨ含有培地で培養した場合の、全クローンに対する、それぞれの細胞分裂回数であったクローンの占める割合（％）を計測した結果を示した図である。

本発明に係るアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法（以下、「本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法」ということがある。）は、増殖型ＯＰＣを、低酸素環境下、甲状腺ホルモン受容体又はレチノイン酸受容体のリガンドの存在下で培養し、アダルト型ＯＰＣに誘導分化する工程を有することを特徴とする。非特許文献２や非特許文献３において開示されているように、甲状腺ホルモンやレチノイン酸は、酸素濃度２０体積％環境下ではＯＰＣからオリゴデンドロサイトへの分化誘導因子として知られている。これらの因子が、低酸素環境下では分化誘導因子としては機能せず、休眠状態のアダルト型ＯＰＣへの誘導分化因子として機能すること、すなわち、低酸素刺激と共に甲状腺ホルモン受容体又はレチノイン酸受容体を刺激することにより増殖型ＯＰＣがアダルト型ＯＰＣへと誘導分化されることは、本発明者らにより初めて見出された知見である。

本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法において用いられる増殖型ＯＰＣは、器官形成期や出生後間もない時期にみられる活発に細胞分裂を繰り返すＯＰＣであり、細胞周期が５０時間以下の細胞をいう。本発明において用いられる増殖型ＯＰＣとしては、器官形成期や出生後間もない時期にある生物から採取された増殖型ＯＰＣそのものであってもよく、生体から採取された増殖型ＯＰＣを初代培養又は継代培養して増殖させた細胞であってもよい。また、ＥＳ（胚性幹）細胞やｉＰＳ（人工多能性幹）細胞から分化させた増殖型ＯＰＣも、本発明において用いることができる。

生体からの増殖型ＯＰＣの採取、及びその後の培養は、常法により行うことができる。増殖型ＯＰＣは、特に、視神経から多く採取できる。例えば、出生後間もない時期のラット（生後１〜１０日）の視神経を切除して細断したものから単細胞懸濁液を調製し、当該単細胞懸濁液から、Ａ２Ｂ５抗体等の増殖型ＯＰＣの細胞表面に特異的に発現している分子を認識する抗体を利用した免疫的手法により増殖型ＯＰＣを精製することができる。精製された増殖型ＯＰＣを培養する培地としては、分化誘導することなく増殖型ＯＰＣを培養可能な培地であれば特に限定されるものではない。例えば、増殖型ＯＰＣは、無血清改変Ｂ−Ｓ培地や無血清ＤＭＥＭ培地等で培養することができる。この際、培地には、インシュリン、フォルスコリン、ＰＤＧＦ−ＡＡ、及びＮＴ−３（ニューロトロフィン−３）等が添加されていることが好ましい。特にＰＤＧＦ−ＡＡで刺激することにより、増殖型ＯＰＣが効率よく増殖する。この際の培養は、標準的な酸素濃度（約２０体積％）で行ってもよく、生体内における酸素濃度（組織にもよるが、脳内では約０．５〜８体積％濃度相当）で行ってもよく、低酸素濃度（１．５体積％以下）で行ってもよい。

本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法において、増殖型ＯＰＣをアダルト型ＯＰＣへ誘導分化するための培養時における気体の酸素濃度は、増殖型ＯＰＣに対して低酸素刺激可能な程度の低濃度である。低酸素刺激となり得る酸素濃度の上限値は、当該細胞の由来する組織や生物種によって多少の違いがある。用いる増殖型ＯＰＣに対して低酸素刺激となる酸素濃度の上限値は、例えば後記実施例６に示すように実験的に求めることができる。本発明において、増殖型ＯＰＣをアダルト型ＯＰＣへ誘導分化するための培養時には、酸素濃度が１．５体積％以下の環境下が好ましく、０．５〜１．５体積％の環境下がより好ましく、０．５〜１．２体積％の環境下がさらに好ましく、０．５〜１．０体積％の環境下がよりさらに好ましい。Kitamotoらの報告（Kitamoto，et al.，Oncogene，2013，vol.32，p.4614〜4621.）、Sekiguchiらの報告（Sekiguchi，et al.，Journal of Cellular and Molecular Medicine，2012，vol.16(8)，p.1934〜1945.）、及びAllenらの報告（Allen，et al.，TISSUE ENGINEERING，2006，vol.12(11)，p.3135〜3147.）にあるように、酸素濃度を１体積％以下に調整することにより、ヒト、ラット、マウスをはじめとする各種生物由来の細胞に対して低酸素刺激を行うことができる。

本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法において、増殖型ＯＰＣをアダルト型ＯＰＣへ誘導分化するための培養時における気体の酸素濃度以外のガス組成は特に限定されるものではないが、酸素以外に窒素を主たる成分とすることが好ましく、二酸化炭素を含有していてもよい。二酸化炭素を含有する場合には、二酸化炭素濃度は３〜１０体積％程度であることが好ましい。

本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法は、具体的には、低酸素濃度の気体内で、甲状腺ホルモン受容体又はレチノイン酸受容体のリガンドを添加した培地中で増殖型ＯＰＣを培養する。当該培地としては、無血清改変Ｂ−Ｓ培地や無血清ＤＭＥＭ培地等の増殖型ＯＰＣが分化誘導されずに増殖可能な培地に、甲状腺ホルモン受容体又はレチノイン酸受容体のリガンドを添加した培地が挙げられる。

本発明において用いられる甲状腺ホルモン受容体のリガンドとしては、Ｔ４（３，５，３’，５’−テトラヨード−Ｌ−チロニン。チロキシンともいう。）及びＴ３（３，５，３’−トリヨード−Ｌ−チロニン）が挙げられる。その他、Ｔ３又はＴ４と類似の構造を有するテトラゾール化合物のうち、甲状腺ホルモン受容体と結合可能な物質であってもよい。本発明において用いられるレチノイン酸受容体のリガンドとしては、レチノイン酸、ビタミンＡ等が挙げられる。本発明において用いられるリガンドとしては、Ｔ４、Ｔ３、又はオールトランスレチノイン酸が好ましい。

増殖型ＯＰＣ細胞は、１種類のリガンドのみを含有する培地中で培養してもよく、２種類以上のリガンドを含有する培地中で培養してもよい。また、甲状腺ホルモン受容体のリガンドとレチノイン酸受容体のリガンドの両方を含有する培地であってもよい。具体的には、例えば、Ｔ３とＴ４のいずれか一方のみを含有する培地であってもよく、Ｔ３とＴ４を両方含有する培地であってもよく、Ｔ３とＴ４の少なくともいずれか一方とレチノイン酸を含有する培地であってもよい。

本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法により得られたアダルト型ＯＰＣは、増殖が停止しており休眠状態にあるが、多分化能と再増殖能を有する。このため、得られたアダルト型ＯＰＣは、生体内に存在するアダルト型ＯＰＣと同様に適切な刺激により再分裂及び分化が誘導される。例えば、当該アダルト型ＯＰＣをＰＤＧＦとニューレグリン（ＮＲＧ）とフォスフォジエステラーゼ１阻害剤であるＩＢＭＸ（１−メチル−３−（２−メチルプロピル）キサンチン）で刺激することによって、再分裂が起こる。一方で、当該アダルト型ＯＰＣを酸素濃度２０％環境下でＰＤＧＦとＴＨで刺激することにより、オリゴデンドロサイトに分化する。

本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法により、比較的均質なアダルト型ＯＰＣを従来よりも多量にかつ安定して供給することが可能になる。このため、得られたアダルト型ＯＰＣをモデル細胞等として用いることにより、アダルト型ＯＰＣの機能研究が飛躍的に加速することが期待できる。

アダルト型ＯＰＣをミエリン鞘の損傷部位や、脱鞘部位、ミエリン鞘形成不全部位に移植することにより、ミエリン鞘が回復することが期待できる。また、アダルト型ＯＰＣは、増殖型ＯＰＣとは異なり、分化能を有するものの休眠状態にあるため、癌化するリスクが低いという利点もある。

このため、本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法により得られたアダルト型ＯＰＣは、医薬用組成物の有効成分として用いることもできる。当該医薬用組成物は、ミエリン鞘形成不全、脱髄、又はミエリン鞘の損傷の治療に用いられるものであることが好ましい。具体的には、例えば、外傷、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、多発性硬化症（ＭＳ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、脳脊髄炎（ＥＰＬ）、橋中心髄鞘崩壊症（ＣＰＭ）、ウォラー変性、副腎白質ジストロフィー、アレキサンダー病、ペリツェウス・メルツバッヘル病（ＰＭＺ）、黄斑円孔等の治療や予防に用いられる医薬用組成物の有効成分としてアダルト型ＯＰＣは有用なことが期待できる。

本発明に係るアダルト型ＯＰＣ製造方法により得られたアダルト型ＯＰＣは、その他にも、アダルト型ＯＰＣに対する増殖誘導能又は分化誘導能を有する物質のスクリーニングにも用いることができる。例えば、アダルト型ＯＰＣを、増殖誘導能又は分化誘導能についての候補物質を含有する培地中で培養し、当該アダルト型ＯＰＣが再分裂するかどうか、即ち培地中のアダルト型ＯＰＣの数が培養によって増加したか否かを計測するか、又はアダルト型ＯＰＣがオリゴデンドロサイトへ分化するか、即ち培地中の細胞に、分化細胞特異的な抗原が発現しているか否かを検出する検出工程を行い、前記検出工程において、前記アダルト型ＯＰＣが有意に増殖した場合又は前記アダルト型ＯＰＣから分化誘導された細胞が検出された場合に、前記候補物質がアダルト型ＯＰＣに対する増殖誘導能又は分化誘導能を有するとそれぞれ評価することで、当該候補物質のスクリーニングを行うことができる。増殖誘導能の確認手段としては、ＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）の取り込みの差を確認したり、増殖マーカーのＫｉ-６７タンパク質の発現を確認することによっても行うことができます。当該アダルト型ＯＰＣが再分裂し、培地中のアダルト型ＯＰＣの数が有意に増加した場合（２倍以上、好ましくは１０倍以上）には、培地に添加した候補物質はアダルト型ＯＰＣに対する増殖誘導能を有すると評価することができる。また、当該アダルト型ＯＰＣがオリゴデンドロサイトへ分化し、培地中の細胞に分化細胞特異的な抗原を検出できた場合には、培地に添加した候補物質はアダルト型ＯＰＣに対する分化誘導能を有すると評価することができる。分化細胞特異的な抗原としては、オリゴデンドロサイトに特異的に発現しているＧＣ（ガラクトセレブシド）、ＰＬＰ（プロテオリピッドプロテイン）、ＣＮＰａｓｅ（2',3'サイクリックフォスフォジエステレース）、ＭＢＰ（ミエリンベーシックプロテイン）等を挙げることができる。

次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。また、以下の全ての動物実験のプロトコールは、慶応義塾大学の倫理委員会により承認された。

また、特に記載のない限り、以降の実施例において用いた増殖型ＯＰＣは、生後７日齢（Ｐ７）のラットの視神経から、Barresらのimmunopanning法（Barres et al.，Cell，1992，vol.70，p.31〜46）に則って精製したものであって、純度（全細胞に対する増殖型ＯＰＣの占める割合）が９９．９％以上のものである。

［実施例１］
増殖型ＯＰＣを、酸素濃度が１．５体積％の環境下で、甲状腺ホルモンを添加した培地又は甲状腺ホルモン無添加の培地中で培養し、増殖型ＯＰＣの増殖能に対する甲状腺ホルモンの影響を調べた。

ポリ−Ｄ−リジン（ＰＤＬ）をコートしたＴ２５培養フラスコに、１フラスコ当たり１０００個の増殖型ＯＰＣを播き、甲状腺ホルモン混合物（Ｔ３とＴ４の等量混合物（４０ｎｇ／ｍＬ）。以下、「ＴＨ」と略記することがある。）を添加したＴＨ含有培地と添加していないＴＨ不含培地中で、酸素濃度１．５体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中、３７℃でそれぞれ１５日間培養した。ＴＨ不含培地としては、ＰＤＧＦ−ＡＡ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＮＴ−３（５ｎｇ／ｍＬ）、インシュリン（５μｇ／ｍＬ）、及びフォルスコリン（５μＭ）を添加した無血清改変Ｂ−Ｓ培地を用い、ＴＨ含有培地としては、ＴＨ不含培地にＴＨ（Ｔ３とＴ４が各４０ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地を用いた。

各フラスコ内の細胞数を計数した結果を表１に、細胞増殖率（倍）を算出した結果を図１に示す。ＴＨ不含培地では、１５日目には当初の細胞数の６０倍以上となった（表１中、「甲状腺ホルモン無し」、図１中、「ｗ／ｏＴＨ」）。一方、ＴＨ含有培地では、培養４日目まではＴＨ不含培地と同様に増殖が見られたが、以降は細胞数はほぼ一定であり、増殖が停止していた（表１中、「甲状腺ホルモン有り」、図１中、「ｗｉｔｈＴＨ」）。当該結果から、低酸素環境下でＴＨ刺激することにより、細胞を一定時期まで増殖させ、その後増殖を停止できることが確認された。

［実施例２］
増殖型ＯＰＣを、酸素濃度が１．５体積％又は２０体積％の環境下で、甲状腺ホルモンを添加した培地中で培養し、増殖型ＯＰＣの分化能に対する甲状腺ホルモンの影響を調べた。
ＰＤＬをコートした直径１２ｍｍのガラスボトムディッシュに、ディッシュ当たり３００個の増殖型ＯＰＣを播いたものを６枚用意し、実施例１で用いたＴＨ含有培地中で３７℃、１２日間培養した。６枚のディッシュのうち、３枚は酸素濃度１．５体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で培養し、残る３枚は酸素濃度２０体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で培養した。
培養終了後、各ディッシュの細胞を、２．０％ホルムアルデヒド溶液で室温、５分間処理することによって固定した。固定された細胞に対して、マウス抗ＧＣ（ガラクトセレブトシド）抗体（Martin C. Raff氏より供与）及びマウスＡ２Ｂ５抗体（Martin C. Raff氏より供与）を用いて一次免疫染色した後、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体及びＡｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ５６８標識抗マウスＩｇＭ抗体（いずれも、インビトロジェン社製）を用いて二次染色し、さらにＤＡＰＩ染色（同仁化学研究所製）を行った。Ａ２Ｂ５抗体はＯＰＣ特異抗体であり、ＧＣはオリゴデンドロサイトマーカーである。

図２に、酸素濃度２０体積％の環境下で培養した細胞の染色像（上段）と、酸素濃度１．５体積％の環境下で培養した細胞の染色像（下段）を示す。また、図３に、各ディッシュ中の細胞のうち、Ａ２Ｂ５抗体で染色された細胞（Ａ２Ｂ５陽性細胞）の割合（図中、「Ａ２Ｂ５＋」）と抗ＧＣ抗体で染色された細胞（ＧＣ陽性細胞）の割合（図中、「ＧＣ＋」）を算出した結果を示す。図３中、左カラム（「２０％Ｏ_２」）が酸素濃度２０体積％の環境下で培養した結果であり、右カラム（「１．５％Ｏ_２」）が酸素濃度１．５体積％の環境下で培養した結果である。この結果、酸素濃度２０体積％の環境下で培養した細胞は、約６５％がＧＣ陽性細胞であり、オリゴデンドロサイトに分化していた。これに対して、酸素濃度１．５体積％の環境下で培養した細胞では、ＧＣ陽性細胞は約１０％しかなく、約４５％はＡ２Ｂ５陽性細胞であり、ＯＰＣであった。
以上より、実施例１の結果とあわせると、増殖型ＯＰＣを低酸素濃度環境下で甲状腺ホルモン含有培地で培養した場合、一定時期までは増殖を示すが、その後増殖を停止し、オリゴデンドロサイトへの分化が抑えられたアダルト型ＯＰＣとなることが確認できた。

［実施例３］
増殖型ＯＰＣを、酸素濃度が１．５体積％の環境下で、甲状腺ホルモンを添加した培地又はレチノイン酸を添加した培地中で培養し、増殖型ＯＰＣに対するレチノイン酸（ＲＡ）の影響を調べた。
ＰＤＬをコートした直径１２ｍｍのガラスボトムディッシュに、ディッシュ当たり３００個の増殖型ＯＰＣを播いたものを６枚用意し、酸素濃度１．５体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で３７℃、１２日間培養した。６枚のディッシュのうち、３枚は実施例１で用いたＴＨ含有培地中で培養し、残る３枚はＲＡ含有培地（実施例１で用いたＴＨ不含培地にオールトランスレチノイン酸（シグマ社製）（１ｎｇ／ｍＬ）を添加した培地）中で培養した。

培養終了後、各コロニーを形成する細胞数を計数し、コロニーごとの細胞分裂回数を求めた。図４に、全コロニーに対する、それぞれの細胞分裂回数であったコロニーの占める割合（％）を計測した結果を示す。この結果、ＴＨ含有培地で培養した場合（図中、「＋ＴＨ」）とＲＡ含有培地で培養した場合（図中、「＋ＲＡ」）は、細胞分裂回数が５〜６回のコロニーの占める割合が最も多く、細胞分裂回数が１０回を超えるコロニーはなかった。
また、図５に、ＴＨ含有培地で培養した細胞の位相差顕微鏡画像（「＋ＴＨ」）と、ＲＡ含有培地で培養した細胞の位相差顕微鏡画像（「＋ＲＡ」）を示す。増殖型ＯＰＣを１２日間ＴＨ含有培地で培養した後の細胞とＲＡ含有培地で培養した後の細胞は、いずれも同様の形態であった。これらの結果から、甲状腺ホルモンと同様にレチノイン酸も、低酸素環境下で増殖型ＯＰＣの増殖を停止させアダルト型ＯＰＣへ分化誘導し得ることが明らかになった。

［実施例４］
増殖型ＯＰＣを低酸素刺激及びＴＨ刺激して得られたアダルト型ＯＰＣが、分化能を備えているかどうかを調べた。
ＰＤＬをコートした直径１２ｍｍのガラスボトムディッシュに、ディッシュ当たり３００個の増殖型ＯＰＣを播いたものを６枚用意し、酸素濃度１．５体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で３７℃、１５日間、実施例１で用いたＴＨ含有培地中で培養した。次いで、６枚のディッシュのうち３枚について、培地をＰＤＧＦ不含ＴＨ含有培地（実施例１で用いたＴＨ含有培地からＰＤＧＦを除いた培地）に交換し、酸素濃度１．５体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で３７℃、５日間培養した。残る３枚については、培地をＦＢＳ含有培地（ＦＢＳ（１０％）を添加した無血清改変Ｂ−Ｓ培地）に交換し、酸素濃度１．５体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で３７℃、５日間培養した。

培養終了後、各ディッシュの細胞を、２．０％ホルムアルデヒド溶液で室温、５分間処理することによって固定した後、細胞膜透過処理を行った。細胞膜透過処理後の細胞のうち、ＰＤＧＦ不含ＴＨ含有培地で培養した３枚のうちの１枚と、ＦＢＳ含有培地で培養した３枚のうちの１枚に対して、ラット抗ＭＢＰ抗体（ＭＡＢ３８６、ミリポア社製）を用いて一次免疫染色した後、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗ラットＩｇＧ抗体を用いて二次染色した。同様に、ＰＤＧＦ不含ＴＨ含有培地で培養した３枚のうちの１枚と、ＦＢＳ含有培地で培養した３枚のうちの１枚に対して、マウス抗ＣＮＰａｓｅ抗体（Ｃ５９２２、シグマ社製）を用いて一次免疫染色した後、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて二次染色した。ＰＤＧＦ不含ＴＨ含有培地で培養した３枚のうちの１枚と、ＦＢＳ含有培地で培養した３枚のうちの１枚に対して、ウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（Ｇ４５４６、シグマ社製）を用いて一次免疫染色した後、Ａｌｅｘａ（登録商標）Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体を用いて二次染色した。ＣＮＰａｓｅ（２’，３’−サイクリックヌクレオチドフォスフォジエステラーゼ）及びＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）は、オリゴデンドロサイトのマーカーであり、ＧＦＡＰ（グリア細胞線維性酸性タンパク質）は、アストロサイトのマーカーである。

図６に、各細胞の染色像を示す。ＰＤＧＦ不含ＴＨ含有培地で培養したディッシュには、ＭＢＰ陽性細胞とＣＮＰａｓｅ陽性細胞が存在していた（図中、「ＭＢＰ陽性」と「ＣＮＰａｓｅ陽性」）。これに対して、ＦＢＳ含有培地で培養したディッシュには、ＧＦＡＰ陽性細胞が存在していた（図中、「ＧＦＡＰ陽性」）。これらの結果から、増殖型ＯＰＣを低酸素刺激及びＴＨ刺激して得られたアダルト型ＯＰＣは、適当な刺激により、オリゴデンドロサイト及びアストロサイトに分化し得ること、すなわち、当該アダルト型ＯＰＣは、増殖期型ＯＰＣと同じく多分化能を保持していることが確認された。

［実施例５］
増殖型ＯＰＣを低酸素刺激及びＴＨ刺激して得られたアダルト型ＯＰＣの再増殖能と分化能について調べた。
ＰＤＬをコートしたＴ２５培養フラスコに、１フラスコ当たり１０００個の増殖型ＯＰＣを播き、酸素濃度１．５体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で３７℃、１５日間、実施例１で用いたＴＨ含有培地中で培養した。次いで、当該フラスコから細胞を回収し、新たなＰＤＬをコートしたＴ２５培養フラスコに、１フラスコ当たり１０００個の増殖型ＯＰＣを播いたものを３枚用意し、酸素濃度２０体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で３７℃、７日間培養した。３枚のフラスコのうちの１枚は、実施例１で用いたＴＨ不含培地で培養し、１枚は実施例１で用いたＴＨ含有培地で培養し、残る１枚はＩＮ含有培地（実施例１で用いたＴＨ不含培地に、ＮＲＧ１（５０ｎｇ／ｍＬ）とＩＢＭＸ（０．１ｍＭ）を添加した培地）で培養した。

培養終了後、各コロニーを形成する細胞数を計数し、コロニーごとの細胞分裂回数を求めた。図７に、全コロニーに対する、それぞれの細胞分裂回数であったコロニーの占める割合（％）を計測した結果を示す。また、図８に、図７に示す結果に基づき、各培地で培養した場合のコロニーの平均細胞分裂回数を算出した結果を示す。この結果、ＴＨ不含培地又はＩＮ含有培地で培養した場合には、７割近くのコロニーが少なくとも１回は細胞分裂を行っており、６回も分裂したコロニーもあったが、オリゴデンドロサイトに分化した細胞は観察されなかった（図７及び８中、「Ｐ」及び「Ｐ＋Ｉ＋Ｎ」）。これに対して、ＴＨ含有培地で培養した場合には、平均細胞分裂回数は０．５未満であり、オリゴデンドロサイトに分化した細胞が観察された（図７及び８中、「Ｐ＋ＴＨ」）。これらの結果から、増殖型ＯＰＣを低酸素刺激及びＴＨ刺激して得られたアダルト型ＯＰＣは、適当な刺激により再増殖可能であり、さらに適当な刺激により分化も可能であることが確認された。

［実施例６］
増殖型ＯＰＣを、酸素濃度が１．０、１．５、２．０、２．５、又は３．０体積％の環境下で、甲状腺ホルモンを添加した培地中で培養し、増殖型ＯＰＣに対する酸素濃度の影響を調べた。
ＰＤＬをコートしたＴ２５培養フラスコに、１フラスコ当たり１０００個の増殖型ＯＰＣを播いたものを５枚用意し、酸素濃度１．０〜３．０体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で、実施例１で用いたＴＨ含有培地中、３７℃、１０日間培養した。
培養終了後、各ディッシュの生細胞数を計数した。図９に、計測した結果を示す。この結果、酸素濃度が２．０、２．５、又は３．０体積％の環境下で培養した場合には、生細胞数４００００個以上にまで増殖していた。これに対して、酸素濃度が１．０体積％又は１．５体積％の環境下で培養した場合には、細胞数はほとんど増えておらず、増殖が停止していることがわかった。つまり、ラットの増殖型ＯＰＣ細胞においては、酸素濃度１．５体積％と２．０体積％の間に、低酸素刺激可能な酸素濃度の上限（閾値）があることがわかった。

［実施例７］
生後７日齢のＣ５７ＢＬ/６マウスの視神経から、Barresらのimmunopanning法（Barres et al.，Cell，1992，vol.70，p.31〜46）に則って精製したものであって、純度（全細胞に対する増殖型ＯＰＣの占める割合）が９９．９％以上の増殖型ＯＰＣを用い、酸素濃度が１．０又は３．０体積％の環境下で、甲状腺ホルモンを添加した培地中で培養し、増殖能を調べた。
ＰＤＬをコートした直径１２ｍｍのガラスボトムディッシュに、ディッシュ当たり３００個のマウス増殖型ＯＰＣを播いたものを６枚用意し、３枚は酸素濃度１．０体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で、残る３枚は酸素濃度３．０体積％、二酸化炭素濃度５体積％の気体中で、それぞれ３７℃、１２日間、実施例１で用いたＴＨ含有培地中で培養した。

培養終了後、各クローンの細胞数を計数し、それぞれの細胞分裂回数を推定した。具体的には、例えば、細胞数が５〜８個の場合には分裂回数は３回、９〜１６個の場合には分裂回数は４回とした。図１０に、全クローンに対する、それぞれの細胞分裂回数であったクローンの占める割合（％）を計測した結果を示す。この結果、酸素濃度が３．０体積％環境下で培養した細胞では、分裂回数が３回以上のクローンが全体の５０％以上であり、１２回分裂した細胞もあった。これに対して、酸素濃度が１．０体積％環境下で培養した細胞では、全体の７０％近くにおいて分裂回数が２回以下であり、一度も分裂しなかったクローンが２７％程度もあり、細胞数はほとんど増えておらず、増殖が停止していることがわかった。これらの結果から、酸素濃度が１．０体積％環境下でＴＨ刺激することにより、マウス由来の増殖型ＯＰＣにおいても、その増殖を停止させアダルト型ＯＰＣへ分化誘導し得ることが明らかになった。

Claims

増殖型オリゴデンドロサイト前駆細胞を、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下、甲状腺ホルモン受容体又はレチノイン酸受容体のリガンドであって、Ｔ４、Ｔ３、これらと類似の構造を有するテトラゾール化合物のうち甲状腺ホルモン受容体と結合可能な物質、レチノイン酸、及びビタミンＡから選択されるものの存在下、無血清培地中で培養しアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞に誘導分化する工程を有する、アダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
前記工程の前に、前記増殖型オリゴデンドロサイト前駆細胞を、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下、Ｔ４、Ｔ３、これらと類似の構造を有するテトラゾール化合物のうち甲状腺ホルモン受容体と結合可能な物質、レチノイン酸、及びビタミンＡを含んでいない無血清培地中で増殖させる増殖工程を有する、
請求項１に記載のアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
前記低酸素環境の酸素濃度が０．５〜１．０体積％である、請求項１又は２に記載のアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
前記増殖型オリゴデンドロサイト前駆細胞が、生体から採取されたオリゴデンドロサイト前駆細胞を初代培養又は継代培養して得られた細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法。
請求項１〜４のいずれか一項に記載のアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞の製造方法により製造され、分化能を保持したまま休眠状態にあるアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞と、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下にある無血清培地と、を含む組成物。
Ｔ４、Ｔ３、これらと類似の構造を有するテトラゾール化合物のうち甲状腺ホルモン受容体と結合可能な物質、レチノイン酸、及びビタミンＡからなる群より選択される１種以上を含有し、分化能を保持したまま休眠状態にあるアダルト型オリゴデンドロサイト前駆細胞と、０．５〜１．５体積％である低酸素環境下にある無血清培地と、を含む組成物。
請求項５又は６に記載の組成物を有効成分として含む、医薬用組成物。
ミエリン鞘形成不全、脱髄、又はミエリン鞘の損傷の治療用である、請求項７に記載の医薬用組成物。