MX2013008208A - Metodo de cultivo para obtener y mantener una poblacion pura o enriquecida de celulas no diferenciadas neurales y/o celulas progenitoras neurales de mamifero que con propensas a diferenciarse en celulas del linaje oligodendrocitico in vitro. - Google Patents

Metodo de cultivo para obtener y mantener una poblacion pura o enriquecida de celulas no diferenciadas neurales y/o celulas progenitoras neurales de mamifero que con propensas a diferenciarse en celulas del linaje oligodendrocitico in vitro.

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Abstract

Una célula no diferenciada o progenitora neural humana expandible, aislada, donde la célula es una célula progenitora o célula no diferenciada, mantiene su capacidad de diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos, mantiene su capacidad para diferenciarse de células de linaje oligodendrocítico eficientemente a través de pasos subsecuentes, y la célula expresa al menos los antígenos de la superficie celular CD133 y CD140a. También se proporciona un método de cultivo in vitro de una célula progenitora o no diferenciada neural de mamífero aislada de un sistema nervioso central de mamífero, y el cultivo en sí, donde la célula conserva su capacidad para diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos y su capacidad para diferenciarse en células de linaje oligodendrocítico eficientemente. Además, se proporciona un método para tratar una condición causada por una pérdida de mielina o pérdida de oligodendrocitos como lo es una composición que comprende una célula no diferenciada neural expandible aislada o cultivada por los métodos de la invención.

Description

MÉTODO DE CULTIVO PARA OBTENER Y MANTENER UNA POBLACIÓN PURA O ENRIQUECIDA DE CÉLULAS NO DIFERENCIADAS NEURALES Y/O CÉLULAS PROGENITORAS NEURALES DE MAMÍFERO QUE SON PROPENSAS A DIFERENCIARSE EN CÉLULAS DEL LINAJE OLIGODENDROCITICO IN VITRO CAMPO TÉCNICO Esta invención se relaciona de manera general con el campo de la biología celular de las células no diferenciadas neurales y células progenitoras neurales. De manera más específica, esta invención proporciona una población pura o enriquecida de células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales de mamífero que son propensas a diferenciarse en células del linaje oligodendrocítico in vitro, adecuadas para usarse en investigación biológica, selección de fármacos y terapia en humanos .
Durante el desarrollo del sistema nervioso central, primitivo, las células no diferenciadas neurales multipotentes (NSC) proliferan, dando lugar a células progenitoras que se dividen de manera transitoria que eventualmente se diferencian en los diferentes tipos de células que componen el cerebro adulto. El sistema nervioso central adulto principalmente consiste de neuronas y células gliales, las cuales incluyen astrocitos y oligodendrocitos . Las células progenitoras para. las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos se originan secuencialmente de células no diferenciadas neurales en el cerebro en desarrollo (véase la Figura 1) . Las células progenitores neuronales forman primero y se diferencian en muchos tipos de neuronas. Los astrocitos se desarrollan en segundo lugar y funcionan para soportar la sobrevivencia neuronal. Finalmente, las células progenitoras de los oligodendrocitos comienzan a aparecer y migran a través del sistema nervioso central. Ellas se diferencian entonces en oligodendrocitos maduros, los cuales producen la mielina necesaria para la función neuronal apropiada.
Puesto que los oligodendrocitos juegan un papel importante en el soporte del sistema nervioso central, üna población pura o enriquecida de oligodendrocitos o sus células predecesoras (es decir, células preprogenitoras de los oligodendrocitos y/o las células progenitoras de los oligodendrocitos) seria útil para terapias celulares: y medicina regenerativa como en el tratamiento de trastornos neurológicos incluyendo enfermedades desmielinizantes congénitas (por ejemplo, enfermedad de Krabbe o enfermedad de Pelizaeus-Merzbacher ) , daño de la médula espinal y otras condiciones que resulten de defectos en el revestimiento ;de mielina que aisla las células nerviosas. Esas células también pueden ser usadas para investigar y para identificar nuevos fármacos para el tratamiento de muchos trastornos neurológicos como la esclerosis múltiple y la esquizofrenia .
Los oligodendrocitos maduros no proliferan y no sobreviven bien en cultivo, y la capacidad para obtener oligodendrocitos directamente de muestras de tejido en cantidades suficientes para usarse en investigación o terapia en humanos es extremadamente difícil. Como resultado, el uso de oligodendrocitos para esos propósitos es impedido por la falta de disponibilidad de esas células.
Una solución a este problema implica obtener células no diferenciadas neurales y/o células progenitores neurales de tejido, expandir las células en cultivo para obtener una cantidad suficientemente grande de células que puedan posteriormente diferenciarse en oligodendrocitos. La diferenciación puede tomar lugar ya sea in vitro o in vivo, como en el caso de un trasplante. Esto daría como resultado una población grande de oligodendrocitos o sus progenitores o preprogenitores para usarse en investigación y terapia en humanos .
Sin embargo, los científicos han luchado por identificar las condiciones de cultivo que permitan el cultivo a largo plazo y expansión masiva de los progenitores y/o preprogenitores de los oligodendrocitos -particularmente de humanos o primates no humanos - donde la población celular expandida resultante está comprendida principalmente de células que retienen la capacidad para diferenciarse en oligodendrocitos .
Varios científicos han reportado la obtención de células progenitoras de oligodendrocitos de ratas ( (Raff et al, J. Neurosci., 3:1289, 1983; Raff et al, Nature., 303:390, 1983; Espinosa de los Monteros et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A., 90:50, 1993). Esos progenitores de oligodendrocitos proliferativos son conocidos como progenitores 0-2A debido a su capacidad para diferenciarse in vitro en oligodendrocitos o astrocitos del tipo 2. Otros científicos han identificado preprogenitores de oligodendrocitos de rata o ratón en cultivo primario ((Gallo, Armstrong RC, J. Neurosci., 15:394, 1995; Grinspan, Franceschini B, J. Neurosci. Res., 41:540, 1995; Decker et al, Mol. Cell. Neurosci., 16:422, 2000). Se piensa que esas células son precursoras de progenitores oligodendrocíticos y se espera que sean más benéficas en terapia celular debido a su capacidad de migración superior en comparación con los progenitores oligodendrocíticos. Desafortunadamente, los científicos han sido incapaces de expandir efectivamente esas células durante periodos prolongados de tiempo in vitro. En contraste, los científicos han reportado el cultivo de progenitores de 02A de nervio óptico o médula espinal de rata usando medio acondicionado B104 o combinaciones del factor del crecimiento como (i) factor del crecimiento-AA derivado de las plaquetas (PDGF-AA) con factor del crecimiento de los fibroblastos básico (bFGF o FGF básico) y neurotrofina-3 (NT-3), o (ii) PDGF-AA con factor neurotrófico ciliar (CNTF) y NT-3. Sin embargo, no se ha tenido éxito en la expansión masiva de esos tipos de células de tejido de primate usando esos factores del crecimiento.
De este modo, sigue siendo muy difícil obtener y expandir una población pura o enriquecida de oligodendrocitos y/o sus células predecesoras de mamíferos diferentes a las ratas o ratones. Es particularmente difícil obtener y expandir esas células de humanos y primates no humanos. Por lo tanto, existe una gran necesidad de métodos para generar poblaciones puras o enriquecidas de células de mamífero no diferenciadas neurales o células progenitores que sean propensas a diferenciarse en células del linaje oligodendrocítico in vitro.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una célula neural humana expandible aislada donde una célula es una célula progenitora o célula no diferenciada, caracterizada porque una célula conserva su capacidad para diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos, caracterizada porque una célula conserva su capacidad para diferenciarse en células del linaje oligodendrocitico eficientemente a través de pasos subsecuentes, y donde una célula expresa al menos los antigenos de la superficie celular CD133 y CDl40a.
La presente invención también se relaciona con un método de cultivo in vitro de una célula neural expandible donde una célula es una célula progenitora o célula no diferenciada aislada de un sistema nervioso central de mamífero donde una célula conserva su capacidad para diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos y su capacidad para diferenciarse en células del linaje oligodendrocitico eficientemente, caracterizada porque el método comprende aislar y disociar al menos una célula de un tejido neural fetal humano; cultivar una célula a una temperatura de 37 °C, en una atmósfera que comprende 1-20% de 02, y 5% de C02, y en un medio de cultivo sin 1 s.uéro definido químicamente, caracterizada porque el medio comprende al menos 5 ng/ml de PDGF-AA, al menos 0.5 ng/ml de bFGF, y al menos 10 µ? de 1-tioglicerol; y pasar una célula para obtener una célula neural humana expandible.
La presente invención se relaciona además con un método para tratar una condición causada por una pérdida de mielina o una pérdida de oligodendrocitos que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende una célula neural humana expandióle aislada la cual es capaz de conservar su capacidad para diferenciarse en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos, caracterizada porque una célula conserva su capacidad para diferenciarse en células del linaje oligodendrocitico eficientemente a través de pases subsecuentes, y donde una célula expresa al menos los antigenos de la superficie celular CD133 y CD140a.
La presente invención también se relaciona con un cultivo in vitro que comprende al menos una célula neural aislada obtenida de un sistema nervioso central de mamífero, caracterizada porque una célula es sumergida en medio de cultivo sin suero definido químicamente el cual tiene al menos 5 ng/ml de PDGF-AA, - al menos 5 ng/ml ' de bFGF, y al menos 10 µ? de 1-tioglicerol .
La presente invención se relaciona además con una composición farmacéutica de célula neural no diferenciada que comprende una célula neural humana expandible aislada.
La presente invención se relaciona adicionalmente con el uso de una composición farmacéutica de célula neural no diferenciada en un medicamento para tratar una condición .
La presente invención también se relaciona con un método para cultivar y expandir in vitro células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales aisladas de un sistema nervioso central de mamífero donde las células cultivadas y expandidas conservan su capacidad para diferenciarse en células del linaje oligodendrocitico. El cultivo de células en la presente invención es un cultivo de adhesión.
La presente invención se relaciona además con una población pura o enriquecida aislada de células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales de mamífero expandidas que son propensas a diferenciarse en células del linaje oligodendrocitico (es decir células 04 positivas con morfología de telaraña como se muestra en la Figura 7 y la Figura 15) in vitro.
La presente invención se relaciona además con células de mamífero del linaje oligodendrocitico vía 1 la expansión y diferenciación in vitro de células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales aislada de sistema nervioso central de mamífero.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 describe el desarrollo de las células no diferenciadas neurales y células progenitoras neurales en tres tipos de células principales en el cerebro-neuronas, astrocitos y oligodendrocitos; La Figura 2 muestra la comparación de : la expresión de un marcador de varias células del SNC; La Figura 3 describe imágenes de contraste de Células No Diferenciadas Fetales Humanas (clona #2b) en las diapositivas A-F; La Figura 4 ilustra la tasa de expansión de las células HFSC (clona #2b) en presencia de diferentes combinaciones de factores del crecimiento; La Figura 5 ilustra los efectos de altas dosis de PDGF-AA (100 ng/ml) y 1-tioglicerol sobre la proliferación de las células HFSC (clona #2b) ; La Figura 6 ilustra una curva de crecimiento de las células HFSC (clona #2b) ; La Figura 7 describe la diferenciación espontánea de las células HFSC en medio sin suero en las diapositivas A-F; La Figura 8 muestra imágenes de contraste de fase tomadas con un microscopio invertido que muestran la morfología de las células HFSC (clona #3) a varios pases; La Figura 9 ilustra una curva de crecimiento de las células HFSC (clona #3) ; La Figura 10 muestra imágenes de contraste de fase tomadas con un microscopio invertido que muestran la morfología de las células HFSC (clona 4A y 4B) á varios pases en las diapositivas A-F; La Figura 11 ilustra una curva de crecimiento de las células HFSC (clona #4A y #4B) ; La Figura 12 ilustra el inmunofenotipo de las células HFSC no diferenciadas en las diapositivas A-S; La Figura 13, en las diapositivas A-H, muestra datos de citometria de flujo que ilustran la proporción de las células HFSC no diferenciadas (clona #2b, pase 13) ; La Figura 14 ilustra el inmunofenotipo de células HFSC diferenciadas (clona #3, pase 15) ; y La Figura 15 ilustra el potencial de diferenciación de las células HFSC (clona #2b, pase 15) en las diapositivas A-E.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS La Figura 1 describe el desarrollo de las células no diferenciadas neurales y células progenitoras neurales en tres tipos de células principales en el cerebro-neuronas, astrocitos y oligodendrocitos . Las flechas de lineas sólidas indican el progreso de un tipo de célula a otro. La linea discontinua de una célula HFSC a los precursores restringidos neuronales (PRN) indica que Las células HFSC tienen una menor tendencia a alcanzar el destino neuronal. La linea negra gruesa de una célula HFSC a las células 02A indica que una célula HFSC tiene :una mayor tendencia a producir células del linaje oligodendrocitico . La multipotencialidad de una célula HFSC a diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos fue mostrada en el Ejemplo 7 (véase la Figura 14 > ¿ La tendencia de una célula HFSC para diferenciarse en células del linaje oligodendrocitico fue mostrada en el Ejemplo 2 (véase la Figura 7) y el Ejemplo 8 (véase la Figura 15).
La Figura 2 muestra una comparación de la expresión de un marcador de varias células del SNC. Esta invención describe el fenotipo de una célula HFSC en el Ejemplo 7 (véase la Figura 12 y la Figura 13) y resume el mismo en esta figura. Como se discute más adelante, una célula HFSC no es la misma que cualquier otro tipo de célula y tiene ambas características de una célula neural no diferenciada y el progenitor de los Astrocitos del Tipo 2 de los oligodendrocitos (02A) .
La Figura 3 describe imágenes de contraste de Células No Diferenciadas Fetales Humanas (clona #2b) en las diapositivas A-F. La Figura 3, la diapositiva A es una imagen de contraste de fase tomada con un microscopio invertido que muestra las células HFSC (clona #2b) cultivadas en DMEM/F12 que contiene glutamina y HEPES y suplementado con suplemento B27 ( InvitrogenMR) , aminoácidos no esenciales (NEAA) ( InvitrogenMR) , 1.5 mM de piruvato (InvitrogenMR) , 55 µ? de ß-mercaptoetanol ( Invitrogé.nMR)' ,' y 1 mM de N-acetil-L-cisteína (Sigma) , (en combinación referidos como "medio HFSCMI" aquí posteriormente) con 20 ng/ml de PDGF-AA y 10 ng/ml de bFGF en una incubadora mantenido a 37°C, 5% de 02, y 5% de C02. Las células mostradas son de la fase 0, día 7. Las células formaron esferas y esas esferas fueron cultivadas sobre una placa de cultivo recubierta con poliornitina directamente sin disociar las esferas en el pase 1.
La Figura 3, la diapositiva B y la diapositiva C, son imágenes de contraste de fase tomadas con un microscopio invertido que muestra las células HFSC (clona #2b) cultivadas como se describe en la descripción de la Figura 3, diapositiva A aquí anteriormente. Las células mostradas son del pase 1, día 1 y pase 2, día 14, respectivamente. Las células cultivadas directamente sobre una placa de cultivo recubierta con poliornitina adheridas y propagadas de esferas (Figura 3, diapositiva B) . Las células pasadas pudieron expandirse exitosamente en estas condiciones de cultivo en el pase subsecuente (Figura 3, diapositiva C) .
La Figura 3, las diapositivas D-F son imágenes de contraste de fase tomadas con un microscopio invertido que muestra las células HFSC (clona #2b) después de pases múltiples y cultivadas en medio HFSCM1 con 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de 1-tioglicerol en una incubadora mantenido a 37 °C, 5% de 02/ y 5% de CO2. La mayoría de las células HFSC fueron células de la fase oscura agrupadas con las células circundantes. Las células dispersas que se separaron de los grupos tendieron a diferenciarse espontáneamente en células multipolares que resisten el proceso (la llamada morfología "similar a telaraña") que es característica de los prooligodendroblastos u oligodendrocitos inmaduros (indicados por cabezas de flecha blancas en la Figura 3, diapositivas D y E) pero su frecuencia de aparición fue usualmente menor de 1%. Las células mostradas en la Figura 3, diapositivas D, E, y F son del pase 8, día 8, pase 11, día 11 y pase 19, día 11, respectivamente.
La Figura 4 ilustra la tasa de expansión de las células HFSC (clona #2b) en presencia de diferentes combinaciones de factores del crecimiento: (1): 20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF; (2): 20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 5 ng/ml de NT-3; (3): 20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1 ; (4): 20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 5 ng/ml de NT-3 + 10 ng/ml. de IGF-1. Las células fueron cosechadas el día 11 del pase 3 (P3D11) y el número de células vivas en cada condición fue contado. Entonces, fueron pasadas en la misma condición que fue usada en el pase 3 a la misma densidad celular. Las células fueron cosechadas el día 8 del pase 4 (P4D8) y el número de células vivas en cada condición fue contado (esas células fueron cosechadas antes de volverse subconfluentes debido a que comenzaron a formar esferas) . La condición (4) fue más efectiva en el pase 3 pero no en el pasé . : La condición (3) fue efectiva en ambos pases.
La Figura 5 ilustra los efectos de altas dosis de PDGF-AA (100 ng/ml) y 1-tioglicerol sobre la proliferación de las células HFSC (clona #2b) ; cultivadas en medio HFSCM1 en presencia de las siguientes combinaciones de factores del crecimiento: (1) : 20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + .10 ng/ml de IGF-1; (2): 20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1 + 50 µ de 1-tioglicerol; (3): 100 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1 ; (4): 100 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1 + 50 µ? de 1-tioglicerol; (5) : 100 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 50 µ? de 1-tioglicerol. Las células fueron cosechadas el día 7 del pase 5 (esas células fueron cosechadas antes de volverse subconfluentes debido a que comenzaron a formar esferas como lo hicieron en el pase 4) y el número de células vivas en cada condición fue contado. También fue probada la combinación de 20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF, pero el número de células recuperadas fue demasiado bajo para la evaluación (menos :de 1 x 104 células lo cual estuvo por debajo de intervalo contable) y sus datos fueron eliminados de esta figura. La condición (1) pudo expandir las células en el pase 3 pero no pudo expandir las células en el pase 5. La adición de 50 µ? de 1-tioglicerol [condición (2)] o el incremento de la concentración de PDGF-AA a 100 ng/ml [condición (3) ] tuvo un efecto muy poco positivo sobre la tasa de expansión. Cuando la adición de 50 µ? de l-tioglicerol y el incremento de la concentración de PDGF-AA a 100 ng/ml fueron combinadas [condición (4)], la tasa de expansión celular mejoró dramáticamente y las células pudieron expandirse exitosamente. Cuando el IGF-1 fue eliminado de esta condición [condición (5)], la tasa de expansión disminuyó a <1, indicando que el IGF-1 también promovió la proliferación y/o sobrevivencia de una célula HFSC.
La Figura 6 muestra una curva de crecimiento para las células HFSC humanas (Clona #2b) (círculo abierto con línea negra) . Las células HFSC (Clona #2b) fueron cultivadas inicialmente en presencia de 10 ng/ml de PDGF-AA y 10 ng/ml de bFGF. Se agregaron 10 ng/ml de IGF-1 del pase 3. La concentración de PDGF-AA se incrementó de 20 ng/ml a 100 ng/ml del pase 6. Sin embargo, tuvieron muy poco o ningún efecto sobre la tasa de expansión de las células. Se agregaron 50 µ? de l-tioglicerol del pasq 7. Las células HFSC (Clona #2b) comenzaron a crecer rápidamente en presencia de 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ de l-tioglicerol. Se agregaron 10 ng/ml de NT-3 en el pase 17. El NT-3 mejoró el crecimiento celular un poco pero sus efectos desaparecieron después de un pase. Este panel también incluye curvas de crecimiento para las células HFSC humanas (Clona #2b) congeladas el día 6 del pase 10 (PIO Día 6: círculo abierto con línea discontinua) y día 11 del pase 11 (Pll Día 11: círculo abierto con línea punteada) . Las células congeladas pudieron expandirse a una velocidad similar después de ser descongeladas.
La Figura 7 describe la diferenciación espontánea de las células HFSC en medio sin suero en las diapositivas A-F. Las diapositivas A y B son imágenes de contraste de fase tomadas con un microscopio invertido que muestra el cambio morfológico de las células HFSC (clona #2b) en el pase 12, día 9 (Figura 7, diapositivas A y B) después de ser cultivadas en medio HFSCM1 suplementado con 20 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de 1-tioglicerol (Figura 7, diapositiva A) o sin 1-tioglicerol (Figura 7, diapositiva B) . Las células HFSC se diferenciaron espontáneamente sin reabastecimiento de bFGF entre el cambio de medio. Aún en la misma condición, las células HFSC no se diferenciaron si el bFGF fue reabastecido diariamente y parecieron crecer lentamente. Además, las células HFSC fueron bloqueadas para diferenciarse y formaron grupos cuando se usaron 40 ng/ml de o más de PDGF-AA. Haciendo disminuir la concentración de PDGF-AA de 100 ng/ml a 20 ng/ml y sin reabastecimiento de bFGF, las células podrían diferenciarse espontáneamente en células multipolares que resistan el proceso con morfología similar a telaraña, las cuales expresaron al antigeno 04 (Figura 7, diapositivas C Y D) y/o antigeno GalC (Figura 7, diapositivas E y F) , una característica que define a las células del linaje oligodendrocítico [es decir, prooligodendroblastos (04-positivos y GalC-negativos ) , oligodendrocitos inmaduros (04-positivos y GalC-positivos) ] .
La Figura 8 muestra imágenes de contraste de fase tomadas con un microscopio invertido que muestran la morfología de las células HFSC (clona #3) a varios pases. Las células no diferenciadas neurales convencionales fueron inicialmente expandidas en presencia de bFGF y EGF durante 15 días (véase la Figura 8, diapositiva A al Día 15 de Pase 0) . Después de eso, las células fueron cultivadas en el medio HFSCMl con 20 ng/ml de PDGF-AA y 10 ng/ml de bFGF en una incubadora mantenido a 37°C, 5% de 02, y 5% de ' CO¿'. La concentración PDGF-AA se incrementó a 100 ng/ml y fueron agregados 10 ng/ml de IGF-1 del pase 4 (véase la Figura *9) . Se agregaron 50 µ? de 1-tioglicerol del pase 8 (véase la Figura 9) . Su morfología se volvió casi idéntica a la dé la clona #2b después de varios pases.
La Figura 9 muestra una curva de crecimiento para las células HFSC humanas (Clona #3) (círculo abierto con línea negra) . Las células HFSC (Clona #3) fueron cultivadas inicialmente en presencia de 10 ng/ml de EGF y 10 ng/ml de bFGF para expandir las células no diferenciadas neurales convencionales. Entonces, la combinación de factor del crecimiento fue cambiada a 20 ng/ml de PDGF-AA y 10 ng/ml de bFGF del pase 1. Se agregaron 10 ng/ml de IGF-1 y 10 ng/ml de NT-3 del pase 2. Sobre la base de los datos mostrados en la Figura 4, se removió el NT-3 de este cultivo y la concentración de PDGF-AA se incrementó de 20 ng/ml de a 100 ng/ml del pase 4. Sin embargo, tuvieron muy poco o ningún efecto sobre la tasa de expansión de las células como se muestra en la clona #2b. Se agregaron 50 µ? de 1-tioglicerol del pase 5, y entonces las células HFSC (Clona #3) comenzaron a crecer rápidamente en presencia de 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de 1-tioglicerol como las células HFSC (Clona #2b) . Este panel también incluye curvas de crecimiento para las células HFSC humanas (Clona #3) congeladas el día 7 'del pase 10 (PIO Día 7: circulo abierto con linea discontinua). Las células congeladas pudieron expandirse a una velocidad similar después de ser descongeladas.
La Figura 10 muestra imágenes de contraste de fase tomadas con un microscopio invertido que muestran la morfología de las células HFSC (clonas 4A y 4B) a varios pases en las diapositivas A-F. Las células fueron cultivadas en el medio HFSCMl y 50 µ? de 1-tioglicerol con 20 ng/ml de PDGF-AA, 20 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de IGF-1 (clona #4A) o 100 ng/ml de PDGF-AA, 20 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de IGF-1 (clona #4B) en una incubadora mantenido a 37°C, 5% de 02, y 5% de C02. La Clona #4A creció más lentamente que la clona #4B inicialmente pero comenzó a crecer aproximadamente a la misma velocidad que la clona #4B del pase 2. Ellas se volvieron casi homogéneas y su morfología se volvió casi idéntica a la de la clona #2b o #3 después de 3 pases.
La Figura 11 muestra una curva de crecimiento para las células HFSC humanas (Clona #4A: cuadro abierto con línea discontinua y #4B: círculo abierto con línea negra) . Las células HFSC (Clona #4A) fueron cultivadas en presencia de 20 ng/ml de PDGF-AA, 20 ng/ml de bFGF, ¦ 20 ng/ml, IGF-1 y 50 µ? de 1-tioglicerol . Las células HFSC (Clona #4B) fueron cultivadas en presencia de 100 ng/ml de PDGF-AA, 20 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de; 1-tioglicerol. El número de células de ambas clonas disminuyó dramáticamente al inicio y esta declinación fue más prominente en la clona #4A. Después de esta declinación inicial en el número de células, comenzaron a expandirse rápidamente. Este panel también incluye una curva de crecimiento para las células HFSC humanas (Clona #4B) congeladas el día 6 del pase 5 (P5 Día 6: círculo abierto con línea discontinua) .
La Figura 12 ilustra el inmunofenotipo de las células HFSC no diferenciadas en las diapositivas A-S; (clona #2b, pase 12-16) cultivadas en presencia de 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1, y 50 µ? de 1-tioglicerol, y tinción positiva para CD133, Sox2, Nestina, 01ig2, PDGF-Ra, NG2 , A2B5, PSA-NCAM, GFAP o Vimentina. Se usó DAPI para contrateñir los núcleos celulares. Esas figuras mostraron que al menos 90% de las células fueron positivas para CD133, Sox2, Nestina, 01ig2, PDGF-Ra, NG2, A2B5 y vimentina pero no existieron células positivas a GFAP. La tinción de PSA-NCAM fue un poco débil pero aún mayor del 90% de las células que parecieron positivas a PSA-NCAM.
La Figura 13, en las diapositivas A-H, muestra datos de citometria de flujo que ilustran la proporción de células HFSC no diferenciadas (clona #2b, pase 13). Los histogramas en lineas negras representan el control de isotipo y los histogramas llenos de gris representan cada antigeno probado. Estos datos mostraron que la mayoría de las células HFSC fueron CD133-positivas (Figura 13, diapositiva A), CD9-positivas (Figura 13 diapositivá B) , CD140a-positivas (Figura 13, diapositiva C) , NG2-positivas (Figura 13, diapositiva D) , positivas a A2B5 (Figura 13, diapositiva E) , 04-positivas (Figura 13, diapositiva F) , y PSA-NCAM-positivas (Figura 13, diapositiva G) . De acuerdo a lo probado por inmunocitoquímica (datos no mostrados), fueron negativas a CD44 (Figura 13, diapositiva H) .
La Figura 14 ilustra el inmunofenotipo de células HFSC diferenciadas (clona #3, pase 15) cultivadas en medio gue contiene suero para 31 días y teñidas con anticuerpos que reconocen neuronas (Tublina ß???, Neurofilamento L, y MAP2), oligodendrocitos (04, BP) y astrocitos (GFAP) seguido por un anticuerpo secundario fluorescente. Se usó DAPI para contrateñir los núcleos celulares. Una célula HFSC podría diferenciarse en células positivas para cada marcador. Para evaluar la colocalización del axón neuronal y mielina, las células fueron coteñidas con anticuerpo anti-Tublina ß??? y anticuerpo anti- BP (Figura 14, diapositivas A-C) , anticuerpo anti-Neurofilamento L y anticuerpo anti-MBP (Figura 14, diapositivas D-F) , anticuerpo anti-MAP2 y anticuerpo anti-MBP (Figura 14, diapositivas G-l) . Unicamente unos cuantos ' ¦'· axones neuronales y mielina parecen estar colocalizados. Para evaluar la colocalización del antígeno 04 y MBP, las células fueron coteñidas con anticuerpo para 04 y anticuerpo anti-MBP (Figura 14, diapositivas J-L) . 'La mayoría de las señales para MBP fueron colocalizadas con la señal para el antígeno 04. Las células HFSC podrían también diferenciarse en astrocitos que fueron positivos para el antígeno GFAP (Figura 14, diapositivas M-0) . Además, muchas células fueron positivas para vimentina la cual fue expresada en muchas células epiteliales incluyendo astrocitos y células mesenquimales . Además, las células no diferenciadas fueron también positivas para vimentina (datos no mostrados) .
La Figura 15 ilustra el potencial de diferenciación de las células HFSC (clona #2b, pase 15) en las diapositivas A-E. Las células se diferenciaron en DMEM/F12 que contiene glutamina y HEPES y suplementado con suplemento B27, suplemento N2 y 50 µ? de 1-tioglicerol con 10 ng/ml de PDGF-AA, 100 ng/ml de IGF-1, 10 ng/ml de BDNF, y 100 µ de pCPT-cAMP. Las células fueron teñidas con anticuerpo anti-GD3 y anticuerpo para 04 siguiendo el anticuerpo secundario fluorescente después de una diferenciación de 4 días. Las células no diferenciadas expresaron GD3 más fuerte que las células progenitoras de los oligodendrocitos y 04 viceversa (la cabeza de flecha: de la Figura 15, las diapositivas A, B y C muestran las células no diferenciadas) . La mayoría de las células diferenciadas mostraron una morfología multipolar con una señal de GD3 débil y una señal de 04 fuerte, indicando que ellas fueron las células progenitoras de los oligodendrocitos o prooligodendroblastos . Otros tipos ,de células (por ej . astrocitos y neuronas) fueron definidas como una población de células GD3-negativas y 04-negativas . La Figura 15, diapositiva D muestra la relación de cada población celular de 10 imágenes diferentes de células diferenciadas. Más del 70% del total de las células se diferenciaron en células progenitoras de oligodendrocitos (75.8% ± 2.09%). Más del 20% del total de las células fueron aún células no diferenciadas (23.5% ± 2.03%). Los otros tipos de células fueron menos del 1% del total de las células (0.7% ± 0.41 %) . La relación de células progenitoras de oligodendrocitos y otros tipos de células a células diferenciadas (las células progenitoras de oligodendrocitos más otros tipos de células) fue calculada y se muestra en la Figura 15, diapositiva E. La célula progenitora de oligodendrocitos fue 99.1% + 0.56% de células diferenciadas mientras que otros tipos de células fueron 0.9% ± 0.56% de células diferenciadas.
DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCION La presente invención proporciona un método para cultivar y expandir células no diferenciadas neurales o células progenitoras neurales aisladas de un sistema nervioso central de mamífero para producir una población pura o enriquecida de células no diferenciadas neurales o células progenitoras neurales que tienen la capacidad para diferenciarse en oligodendrocitos o células del linaje oligodendrocítico in vitro. Las células progenitoras neurales y las células no diferenciadas neurales generan ambas progenies que son células neuronales (como progenitoras neuronales o neuronas maduras) o células gliales incluyendo astrocitos y oligodendrocitos . Mientras que las células no diferenciadas neurales son autorrenovables (es decir, capaces de proliferar indefinidamente), las células progenitoras neurales pueden ser, pero no necesariamente, capaces de autorrenovarse . Los métodos de cultivo de la presente invención pueden producir una población celular expandida que puede diferenciarse en al menos 70%, 80%, 90% o 95% de células del linaje oligodendrocítico, las cuales son las células progenitoras de los oligodendrocitos y oligodendrocitos, de células diferenciadas .
Las siguientes abreviaturas y definiciones son usadas a través de esta solicitud: ¦ ¦ : ¡ El término "célula HFSC" o célula derivada , de médula espinal fetal, se refiere a la población ,pura: o enriquecida de células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales de mamífero expandidas que son descritas en esta invención.
El término "medio HFSCM1" se refiere a DMEM/F12 que contiene glutamina y HEPES y suplementado con suplemento B27 ( InvitrogenMR) , aminoácidos no esenciales (NEAA) ( InvitrogenMR) , 1.5 mM de piruvato ( Invitrogen™) , 55 µ? de ß-mercaptoetanol ( Invitrogen ) , y 1 mM de N-acetil-L-cisteína (Sigma) en combinación.
El término "células gliales" se refiere a células no neuronales del sistema nervioso central y abarca oligodendrocitos maduros, astrocitos y células progenitoras comprometidas para ambos de esos tipos de células.
El término "células progenitoras multipotentes" se refiere a células progenitoras neurales que tienen el potencial para dar lugar a células de linajes múltiples, pero en un número limitado.
"Pluripotencia" (derivado del Latín "plurimus" o "muchos" y "potencia" o "poder") se refiere a una célula no diferenciada que tiene el potencial para diferenciarse¦ en cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, los pulmones), mesodermo (músculo, hueso, sangre, urogenital), o ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso) . Las células neurales no diferenciadas son multipotentes y no pluripotentes . Las células embrionarias no diferenciadas son pluripotentes y no multipotentes.
Una "célula progenitora comprometida" es una célula progenitora que está comprometida, o destinada, a convertirse en un tipo específico de célula madura. Esto contrasta con una célula progenitora multipotente o pluripotente, la cual tiene el potencial de convertirse en uno de dos o más tipos de células maduras (como células progenitoras 0-2A las cuales pueden convertirse en oligodendrocitos o astrocitos del tipo 2, dependiendo de la sincronización y factores ambientales) .
Un "oligodendrocito" es un tipo de célula glial cuya función principal es aislar los axones de las células nerviosas en el sistema nervioso central de algunos vertebrados .
El término "células del linaje oligodendrocitico" se refiere a oligodendrocitos, prooligodendroblastos y los progenitores oligodendrociticos (por ej . progenitores de 02A) . Este término no incluye precursores gliales restringidos o células no diferenciadas neurales.
Los términos "células progenitoras de los oligodendrocitos" y " progenitores oligodendrociticos" son usados de manera intercambiable a través de esta solicitud y se refieren a células que están comprometidas para formar más células progenitoras y/o progenie que son oligodendrocitos de preferencia a neuronas o tejido no neurológico. A menos que se especifique otra cosa, pueden, pero no necesariamente, tener la capacidad de producir otros tipos de células gliales (como astrocitos del tipo 2) . Este término como se usa aquí no abarca preprogenitores de oligodendrocitos o precursores gliales restringidos (véase la Figura 1) .
Los "preprogenitores de oligodendrocito" son células predecesoras de los progenitores oligodendrociticos .
Los "prooligodendroblastos" son células predecesoras para los oligodendrocitos postmitoticos.
"Expandir" células en medios de cultivo para incrementar el número de células en presencia de medio de cultivo que contiene suplementos los cuales estimulan la proliferación celular.
La "tasa de expansión" celular se refiere al número de células en una fecha particular dividido por el número de células inicial al inicio del cultivo.
Células progenitoras neurales o células no diferenciadas neurales "expandidas" como se usa aquí se refiere a células progenitoras neurales o células, no diferenciadas neurales que son derivadas de células progenitoras neurales o células no diferenciadas neurales aisladas que han proliferado in vitro, produciendo la población celular expandida.
"Pasar" células (también conocido como "subcultivar" o "dividir" las células) se refiere a una técnica que permite que las células sigan vivas y creciendo bajo las condiciones de cultivo de laboratorio durante periodos prolongados de tiempo disociando las células entre sí (con enzimas como la tripsina o colagenasa y transfiriendo entonces un pequeño número de células a un nuevo recipiente de cultivo. Las células pueden ser cultivadas durante un tiempo prolongado si son pasadas a intervalos regulares, puesto que esto evita la senectud prematura asociada con una densidad celular alta prolongada.
Un "ambiente de crecimiento" es un ambiente en el cual las células de interés proliferarán, se diferenciarán y/o madurarán in vitro. Las características del ambiente incluyen el medio en el cual las células son cultivadas, cualquier factor del crecimiento o factor que induzca diferenciación que pueda está presente, y una estructura de soporte (como un sustrato sobre una superficie sólida) si está presente.
Técnicas Generales Los métodos generales en biología celular, química de las proteínas, y técnicas de anticuerpos pueden ser encontrados en Current Protocols in Protein Science (J.E. Colligan et al., eds., iley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J.S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) y Current Protocols in Immunology (J.E. Colligan et al. eds., Wiley y Sons). Los métodos de cultivo celular son descritos de manera general en la edición actual de Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (R.I. Freshney etl, ily & Sons); General Techniques of Cell Culture (M.A. Harrison & I.F. Rae, Cambridge Univ. Press). Los suministros de reactivos de cultivo celular están disponibles de vendedores comerciales como Chemicon®, Millipore®, R&D Systems®, InvitrogenMR, Nalgene-NuncMR International, Sigma-AldrichMR, y ScienCell.
Los libros de referencia especializados relevantes para esta descripción incluyen Principies of Neuroscience, 4a edición, Kandel et al. eds., McGraw-Hill 2000; CNS Regeneration : Basic Science y Clinical Advances, .H. Tuszynski & J.H Kordower, eds., Academic Press, 1999; The Neuron: Cell y Molecular Biology, 3ra edición, I.B. Levitan y L.K. Kaczmarek, Oxford U. Press, 2001; Glial Cells: Their Role in Behavior, P.R. Laming et al. eds., Cambridge U. Press 1998; The Functional Roles of Glial Cells in Health y Disease, Matsas y Tsacopoulos eds., Plenum Pub. Corp, 1999: Glial Cell Development, Jessen y Richardson eds., Oxford U. Press, 2001; y Man of Steel, Adrián Hill, 1996.
En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciada" es un término relativo. Una célula diferenciada es una célula que ha progresado más a lo largo del camino del desarrollo que las células con las cuales está siendo comparada. De este modo, las células no diferenciadas neurales pueden diferenciarse pro;gén_¿¾óras restringidos por el linaje. Esas, a su vez, pueden diferenciarse en células adicionales a lo largo del camino o a células diferenciadas de la etapa final, como neuronas maduras u oligodendrocitos .
Las células diferenciadas de esta invención pueden ser caracterizadas de acuerdo a si expresan marcadores fenotipicos característicos de los oligodendrocitos. Los marcadores inmunocitoquímicos clásicos para esas células que pueden estar presentes, dependiendo de la madurez de la población celular son los siguientes: Sox2: un marcador para células pluripotentes no diferenciadas y células no diferenciadas neurales.
Nestina: un marcador para células no diferenciadas neurales.
CD133: un marcador de la superficie celular para células no diferenciadas neurales.
Receptor alfa de PDGF (PDGF-Ra) : la cadena a del receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas. Un marcador para oligodendrocitos y sus progenitores.
CD140a: el mismo que PDGF-Ra. El anticuerpo para CD140a reconoce un dominio extracelular de PDGF-Ra. Un marcador de la superficie celular para oligodendrocitos y sus progenitores.
CD9: una glicoproteína de la superficie celular que se sabe se compleja con integrinas y otras proteínas de la superfamilia transmembranal 4. Un marcador de la superficie celular para la célula no diferenciada de la línea germinal, célula no diferenciada neural, oligodendrocito y célula no diferenciada mesenquimal.
PSA-NCAM: moléculas de adhesión de las células neurales polisialiladas . Un marcador de la superficie celular para precursores neurales restringidos (NRP) , progenitores neuronales, neuroblastos y preprogenitores oligodendrocíticos . Este marcador es negativo en el precursor glial restringido (GRP) .
A2B5: un marcador de la superficie celular para el precursor glial restringido (GRP) , células progenitoras gliales y células progenitoras oligodendrocíticas (OPC)' y astrocitos del tipo 2. Este marcador de la superficie celular es negativo en el precursor neuronal restringido (NRP)..., NG2 : un proteoglicano de sulfato de condroitina. Marcador de la superficie celular para macrofagos y células progenitoras olegodendrocíticas .
GD3 : Gangliósido GD3. Un marcador para preprogenitores oligodendrocíticos y progenitores oligodendrocíticos. 04 : un marcador para oligodendrocitos y sus progenitores.
Galactocerebrósido C (GalC) : un marcador para oligodendrocitos inmaduros.
Proteina básica de mielina (MBP) : un marcador para oligodendrocitos maduros.
CD44: una glicoproteina de la superficie celular implicada en interacciones célula-célula, adhesión y migración celular y un receptor para ácido hialurónico. Marcador de la superficie celular para algunas células epiteliales y células del linaje astrocitico.
Proteina ácida fibrilar glial (GFAP) : un marcador para astrocitos.
Tublina ß???: un marcador para progenitores neuronales y neuronas.
Neurofilamento-L : un marcador para neuronas maduras.
Proteina 2 asociada con el microtúbulo (MAP2): un marcador para neuronas maduras.
Los marcadores específicos del tejido pueden ser detectados usando cualquier técnica inmunológica adecuada, como la inmunocitoquímica de flujo para marcadores de; la superficie celular, o inmunohistoquímica (por ejemplo,: de células fijas o secciones de tejido) para marcadores intracelulares o de la superficie celular. Un : método detallado para el análisis por citometría de flujo ¡ es proporcionado en Gallacher et al, Blood. , 96: 1740, 2000.: La expresión de un antígeno de la superficie celular : es definida como positiva si una cantidad significativamente detectable de anticuerpos se une al antigeno en una inmunocitoquimica estándar o ensayo de citometria de flujo, opcionalmente después de la fijación de las células, y usando opcionalmente un anticuerpo secundario marcado u otro conjugado para amplificar la marcación. Para facilitar el uso en la investigación o terapia, con frecuencia es benéfico maximizar la proporción de células en la población que tienen las características de los oligodendrocitos o sus progenitores. Es posible obtener poblaciones de células que sean al menos 50%, 60%, 70%, 90% o 95% células de linaje específico, identificadas como positivas para uno o más de los marcadores fenotípicos característicos de esas células .
Para aplicaciones terapéuticas relacionadas con la reconstitución de la función neural, con frecuencia, es deseable minimizar la capacidad de la población celular para formar otros tipos de células, particularmente células no diferenciadas sin diferenciar, y células de linaje no ectodérmico. Dependiendo de la aplicación, también puede ser ventajoso minimizar la proporción de células del linaje neuronal y sus progenitores comprometidos o células ; de linaje astrocítico y sus progenitores comprometidos. ; La contaminación de las poblaciones de acuerdo con esta invención es de menos de 30%, 20%, 10% o 5% de contaminación con esos otros tipos de células.
Los métodos de la presente invención no pueden dar como resultado el desarrollo de un organismo humano completo.
El método de la presente invención implica cultivar células no diferenciadas neurales aisladas y/o células progenitoras neurales de un sistema nervioso central de mamífero en un medio definido que permita la expansión de las células a través de pases múltiples. Las células cultivadas usando el método de la presente invención retienen su capacidad, a través de la expansión, para diferenciarse en células de linaje ologodendrocítico . Las células cultivadas usando el método de la presente invención pueden ser pasadas más de 6 veces y expandirse más de 1,000 veces reteniendo a la vez su capacidad para diferenciarse posteriormente en células de linaje oligodendrocítico . En algunas modalidades, la población celular expandida resultante del método de cultivo de la presente invención comprende o puede diferenciarse en una población de células que tengan al menos 30%, 50%, 70% u 80% de células de linaje oligodendrocítico de células diferenciadas en condiciones de cultivo sin suero. En una modalidad preferida, la población resultante del cultivo celular expandido del método de cultivo de la presente invención comprende al menos 90% de células del linaje oligodendrocítico de las células diferenciadas. En una modalidad preferida, las células expandidas son multipotentes . En algunas modalidades la mayoría de las células expandidas son capaces de diferenciarse en células de linaje oligodendrocítico después del cultivo en medio pobre en PDGF-AA (es decir, 20 ng/ml de PDGF-AA, preferiblemente con 10 ng/ml de bFGF con o sin 50 µ? de 1-tioglicerol y opcionalmente con al menos 10 ng/ml de IGF-1) sin reabastecimiento de bFGF entre el medio cambiante. En algunas modalidades la mayoría de las células expandidas son capaces de diferenciarse en células de linaje oligodendrocítico tras el cultivo en 10 ng/ml de PDGF-AA, 100 ng/ml de IGF-1, 100 µ? de pCPT-cASMP y 10 ng/ml de BD F en D EM/F12 que contiene glutamina y HEPES y suplementado con suplemento B27, suplemento N2 y 50 µ? de 1-tioglicerol.
Las células no diferenciades neurales y/o células progenitoras neurales de mamífero aisladas para usarse en la presente invención pueden ser obtenidas del sistema nervioso central de un mamífero, preferiblemente un primate como, pero sin limitarse a, un humano. Se sabe que, los progenitores y preprogenitores oligodendrocíticos existen en la materia blanca del sistema nervioso central. Por¦ lo tanto, las fuentes adecuadas de las cuales se aislan células para usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, el nervio óptico, cuerpo calloso y médula espinal. Además, las células no diferenciadas aisladas pueden ser derivadas de un feto de mamífero, preferiblemente un feto de primate, como, pero sin limitarse a un feto humano, usando métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, las células no diferenciadas aisladas son preparadas a partir de tejido de médula espinal fetal humana obtenido de una médula espinal fetal humana. En una modalidad preferida, las células aisladas para usarse en la presente invención son obtenidas de médula espinal fetal humana de 8-24 semanas de gestación, preferiblemente 12-18 semanas de gestación. Las médulas espinales fetales humanas pueden ser obtenidas, por ejemplo, comercialmente a través de compañías como Advanced Bioscience Resources, Inc. (Alameda, CA, EUA) con el permiso IRB y un consentimiento informado de un donador. El tejido de médula espinal puede ser disectado de. médula espinal, con meninges y nervios periféricos removidos. El tejido puede ser disociado, lavado y colocado en : un recipiente de cultivo que contenga un medio de crecimiento que permita la proliferación celular.
Los recipientes de cultivo adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, recipientes de cultivo' con una superficie de cultivo que tiene uno o una combinación de poliaminoácidos (por ejemplo, polilisina y/o poliornitina ) , plástico de cultivo celular y superficies tratadas con laminina, vitronectina o fibronectina . Las células generalmente pueden ser cultivadas a una densidad que va de 104 a 105 células/cm2, preferiblemente a una densidad de aproximadamente 3xl04 o 5xl04 células/cm2. La poliornitina o polilisina pueden ser usadas para recubrir los recipientes de cultivo como se reportó anteriormente (Raff et al, J. Neurosci., 3:1289, 1983; Raff et al, Nature., 303:390, 1983; Protocols for Neural Cell Culture, 3rd edition, Humana Press, Inc.). Los recipientes de cultivo pueden ser recubiertos con 1 o 40 g/ml de poliornitina, preferiblemente de 2 a 20 g/ml, de manera más preferible de 5 a 15 pg/ml. La fuerza de la unión celular puede variar dependiendo del vendedor, modificación de la superficie, formato y lote específico de los recipientes de cultivo. La concentración óptima de los materiales de recubrimiento puede ser determinada por cada fuente del recipiente. ; de cultivo usando métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades es efectuada una incubación de dos horas con' 10 µg/ml de poliornitina o polilisina para recubrir los recipientes, por ejemplo, de BD Falcon (Sparks, MD, EUA) . En algunas modalidades puede ser efectuada una incubación de 30 minutos con 5 yg/ml de poliornitina o polilisina para recubrir los recipientes, por ejemplo, Nalgen Nunc International (Rochester, NY, EUA) .
Las células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales aisladas obtenidas de un sistema nervioso central de un mamífero son cultivadas en un medio de cultivo definido químicamente sin suero que permite la expansión celular sin promover la diferenciación de las células (por ejemplo, en neuronas, astrocitos u oligodendrocitos) . El medio de cultivo comprende un medio base como, pero sin limitarse a, Medio de Eagle Modificado de Dulbecco: Mezcla Nutriente F-12, 1:1 (DMEM/F12) (Invitrogen®) (por ejemplo, Medio de Dulbecco Modificado de Iscove, RPMI-1640 y Neurobasal). El medio base puede ser suplementado con varios componentes para soportar la salud y sobrevivencia celular. Esos componentes pueden incluir, pero no se limitan a, al menos 0.25% de aminoácidos no esenciales [NEAA (Invitrogen®)- una solución al 1% que contiene 100 µ? de L-Alanina, L-Asparagina . H20, Acido L-Aspártico, Acido L-Glutámico, Glicina, L-Prolina,: y; L-Serina] , al menos 1.0 nM de glutamina, al menos 0.5 mM de piruvato, y al menos 1% de suplemento B27 ((Invitrogen®), al menos 0.1 mN de N-acetil-cisteína y/o al menos 10 µ? de ß-mercaptoetanol . En algunas modalidades el medio base puede comprender NS21 (como se describe en Y. Chen et al., J Neurosci . Methods., 171:239, 2008) en lugar de suplemento B27. El suplemento B27 contiene albúmina de suero bovino, transíerrina, insulina, progesterona, corticosterona, triyodo-l-tironina, acetato de retinol, DL tocoferol, DL acetato de tocoferol, Biotina, Acido Linoleico, Acido Linolénico, etanolamina, Selenito de Na, L-carnitina, glutation reducido, catalasa, superóxido dismutasa, D-galactosa y putrescina. Invitrogen ha revelado sus ingredientes pero no ha revelado su concentración. Sin embargo, la concentración de cada uno de los ingredientes de su fórmula original, suplemento B18, fue revelada. El NS21 fue desarrollado en base a esta información y la concentración de cada ingrediente fue revelada. Este funcionó en cultivo neuronal también como el suplemento B27. Además el NS21 pudo ser usado para cultivar células no diferenciadas neurales y progenitores oligodendrociticos derivados de células no diferenciadas embriónicas humanas. Por lo tanto, se piensa que este suplemento es un buen candidato para reemplazar al suplemento B27. En una modalidad preferida, el medio de cultivo comprende DMEM/F12 suplementado con 1-4 mM, de manera más preferible 2.5 mM de glutamina; 10-25 mM, de manera más preferible 15 mM de HEPES; 0.5-2.0 mM, de manera más preferible 1 mM de piruvato; 1 a 4%, de manera más preferible 2% de suplemento B27; 0.25-3%, de manera más preferible 1% de NEAÁ; :1 200 µ?, de manera más preferible 50 µ? 1-tioglicerol ; 0.1-3 mM, de manera más preferible 1 mM de N-acetil-cisteina; y/o 10-100 µ?, de manera más preferible 55 µ? de ß-mercaptdetan'ol .
Además, el oxigeno puede facilitar la diferenciación de las células progenitoras neurales. Por lo tanto, para reducir la diferenciación celular, las células pueden ser cultivadas en un ambiente de crecimiento con 1-20% de 02. En una modalidad preferida, las células son cultivadas en un matraz de cultivo en un incubador que proporcione un ambiente de crecimiento de 37°C, 1-10%, de manera más preferible 5% de 02, 5% de C02- Después de establecer las células HFSC, fue evaluado el efecto de la concentración de oxigeno pero no hubo un incremento en las células diferenciadas en condiciones con 20% de 02 en comparación con condiciones con 5% de 02 en las condiciones de cultivo para expandir las células HFSC. El crecimiento de las células HFSC en condiciones con 5% de 02 fue un poco más rápido que en condiciones con 20% de 02. El oxigeno es una causa de tensión oxidativa y se sabe que induce la mutación de p53 en células de roedor. Para reducir un riesgo de mutación, mantuvimos el cultivo de las células HFSC en condiciones con 5% de 02.
Las células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales son cultivadas en medio de cultivo que comprende además factores del crecimiento para estimular la proliferación para aislar las células.' El medio de cultivo puede contener al menos 5, 10, 20 o 40 ng/ml del factor del crecimiento derivado de las plaquetas AA (PDGF-AA), al menos 2.5, 5 o 10 ng/ml de FGF básico (bFGF) , y/o al menos 10, 25 o 50 µ? de 1-tioglicerol para aislar las células. En algunas modalidades, el medio de cultivo comprende además al menos 1, 5 o 10 ng/ml del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) . En algunas modalidades el PDGF-AA puede ser reemplazado con PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC, o PDGF-DD. En algunas modalidades el bFGF puede ser reemplazado con otro miembro de factores del crecimiento de fibroblastos (por ejemplo FGF-4 o FGF-9) . En algunas modalidades el IGF-1 puede ser reemplazado con IGF-2. En una modalidad preferida, el medio de cultivo comprende 40-60 µ de 1-tioglicerol, 40-200 ng/ml de PDGF-AA, 5-100. ng/ml de bFGF, y 5-100 ng/ml de IGF-1 para aislar las células.
Las células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales aisladas son cultivadas en medio de cultivo que comprende además factores del crecimiento para estimular la proliferación después de aislar las células. El medio de cultivo puede contener al menos 1, 2, o 5 ng/ml del factor del crecimiento derivado de las plaquetas AA (PDGF-AA), al menos 0.5, 1 o 5 ng/ml de FGF básico (bFGF), y/o al menos 10, 25 o 50 µ? 1-tioglicerol para expandir las células. En algunas modalidades el medio de cultivo comprende además 1, 2 o 5 ng/ml de factor del crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) . En una modalidad preferida, el medio de cultivo comprende 40-60 µ? de 1-tioglicerol, 5-100 ng/ml de PDGF-AA, 1-50 ng/ml de bFGF, y 5-100 ng/ml de IGF-1 para expandir las células después del aislamiento de las células HFSC.
Las células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales aisladas que crecieron bajo condiciones de cultivo de la presente invención exhiben el tiempo de duplicación de 50-120 horas. En modalidades preferidas, el tiempo de duplicación es de aproximadamente 60 a 100 horas. Las células pueden continuar con esta velocidad de proliferación a través de al menos 8, 11, 14 o 17 pases. Las células pueden expandirse al menos 100, 250, o preferiblemente al menos 500 veces por mes. En modalidades preferidas, las células cultivadas usando el método de la presente invención exhiben una tasa de expansión de >1 durante más de 18 pases.
E emplos Ejemplo 1 - Cultivo y Expansión de células HFSC; Identificación del medio base y los factores del crecimiento Fueron probados varios medios y suplementos en un experimento preliminar usando células HFSC derivadas de médula espinal fetal humana de 12 semanas, la cual fue obtenida de Advanced Bioscience Resources, Inc. (Alamada, CA, EUA) con un consentimiento informado de. un donador, las células fueron cultivadas en DMEM: F-12 (1:1) (DMEM/F12) (InvitrogenMR, Carlsbad, CA, EUA) suplementado con 2 mM de glutamina ( InvitrogenM ) , 1 mM piruvato ( InvitrogenMR) y 2% de suplemento B27 ( InvitrogenMR) inicialmente . Fueron examinados varios factores del crecimiento que estimulan el crecimiento de células de HFSC. Los factores del crecimiento más efectivos fueron la combinación de PDGF-AA y bFGF. Las células si pudieron crecer en presencia de PDGF-AA y bFGF pero mostraron vacuolas y no parecían sanas. Fueron probados algunos suplementos y se observó que el DMEM/F12 suplementado con 1% de NEAA además de 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato y 2% de Suplemento B27 pueden incrementar ligeramente el número de células (datos no mostrados) . Otros suplementos incluyendo 1 mM de N-acetil-cisteína ( Sigma-AldrichMR, St. Louis, MO, EUA) y 55 µ? de ß-mercaptoetanol ( InvitrogenMR) parecieron mejorar el estado de las células, pero las mejoras no fueron tan prominentes como con NEAA (datos no mostrados) . De este modo, el DMEM/F12 es suplementado con 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato, 2% de Suplemento B27, 1% de NEAA, lmM , de N-acetil-cisteína y 55 µ? de ß-mercaptoetanol fue identificado como el medio base óptimo y fue usado" por : lo tanto para cultivar células HFSC.
La médula espinal fetal humana de 15 semanas fue disectada de la columna vertebral, con las meninges y los nervios periféricos removidos. El tejido fue entonces disociado con Acutasa y lavado y las células obtenidas de la médula espinal fetal humana son colocadas en un recipiente de cultivo que contenia el siguiente medio de crecimiento: DMEM/F12 que contenia 2.5 mM de glutamina y 15 mM de HEPES, 2% de Suplemento B27 ( InvitrogenMR) , 1% de NEAA, 1.5 mM de piruvato (InvitrogenMR) , 55µ? de ß-mercaptoetanol ( InvitrogenMR) , 1 mM de N-acetil-L-cisteina (Sigma-AldrichMR) , 20 ng/ml de PDGF-AA (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, EUA) y 10 ng/ml de bFGF (R&D Systems) . Las células fueron entonces colocadas en una incubadora y mantenidas a 37 °C, 5% de 02, y 5% C02. Se agregó diariamente bFGF (10 ng/ml) al medio de cultivo. El medio fue cambiado cada 2-3 días durante el paso. Sobre la base de los experimentos preliminares, las células del crecimiento no fueron tantas en presencia de PDGF-AA y bFGF muchas-células dejaron de proliferar y murieron dentro de unas cuantas semanas. Este resultado pareció ser razonable debido a :que las células que expresan PDGF-Ra usualmente son menos del 5% de las células. Para remover las células que no responden al PDGF-AA y bFGF, las células fueron cultivadas en una placa de cultivo de adhesión ultrabaja (Corning Inc., Corning, NY, EUA). Las células que responden a PDGF-AA y bFGF produjeron esferas (véase la Figura 3, diapositiva A) mientras que las células que no responden a ellos no forman esferas. Las esferas fueron recolectadas a una velocidad de centrifugación más baja (300 rpm para recolectar esferas contra 1,000 rpm para recolectar células individuales) para el cambio de medio y pase. Después de 9 días, las células fueron cosechadas y pasadas sobre recipientes de cultivo recubiertos con poliornitina . Después de este periodo, las células fueron pasadas cada 7-14 días. Las células exhibieron morfología heterogénea en esas etapas primarias (véase la Figura 3, diapositivas B y C) y muchas de esas células dejaron de proliferar dentro de un mes. La tasa de proliferación se volvió más lenta con' el tiempo y las células eventualmente no se expandieron. Además, las células comenzaron a parecer insanas, formando vacuolas en su citoplasma.
Ejemplo 2 - Identificación de las condiciones de crecimiento óptimas para la expansión de células HSCF Como se mencionó en el Ejemplo 1, la inclusión! de PDGF-AA y bFGF en el medio de cultivo soportó : el crecimiento adecuado de las células HFSC inicialmente, pero la tasa o velocidad de proliferación disminuyó después dé 2 pases. El NT-3 (R&D Systems) y IGF-1 ( Sigma-AÍdrichMR) fueron probados para determinar si podría mejorar... : la proliferación de las células HFSC. La presencia de 2.0 ng/ml de PDGF-AA con 10 ng/ml de bFGF fue insuficiente para estimular la tasa o velocidad de proliferación de las células (la tasa de expansión fue <1) (véase la Figura 4). La adición posterior de 5 ng/ml de NT-3 y/o 10 ng/ml de IGF-1 dio como resultado una mejor tasa de proliferación (la tasa de expansión se convirtió en >1) . La combinación de NT-3 e IGF-1 fue más efectiva en el paso 3. Las células obtenidas de cada condición fueron pasadas adicionalrnente para confirmar sus efectos. Las células fueron cosechadas antes debido a que las células comenzaron a formar esferas. En el pase 4, la recuperación de la tasa de proliferación mediante la combinación de NT-3 e IGF-1 disminuyó la simple adición de IGF-1 se volvió más efectiva en el paso 4. La combinación de NT-3 e IGF-1 pudo causar diferenciación^ de las células o formar esferas y se perdió mientras se cambiaba el medio. De este modo, la adición de IGF-1 fue identificada como el factor de sobrevivencia más efectivo y se usó por lo tanto para cultivar células HFSC. Sin embargo, la tasa de proliferación de las células HFSC comenzó a disminuir nuevamente al final del pase 4 y el número de células disminuyó en comparación con el número1 de células sembradas. Por lo tanto, se examinó si otro suplemento 1-tioglicerol, podría mejorar la proliferación de las células HFSC en el pase 5.
La Figura 5 muestra el efecto del l-tioglic¾rol sobre la proliferación de células HFSC. La combinación de factor del crecimiento inicial (20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF) no pudo expandir las células del todo (datos no mostrados en esta figura debido a que estuvo bajo el intervalo contable) . La combinación de factor de crecimiento usada del pase 3 (20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1) fue más efectiva que esta combinación (20 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF) pero incapaz de estimular la proliferación de las células HFSC bien después del pase 4 (Figura 4). Muchos cofactores relacionados con la biosintesis y degradación de ácidos grasos e hidrocarburos de cadena larga presentan tioles. A continuación fue probado el 1-tioglicerol sobre las células HFSC debido a que es uno de los antioxidantes basados en tiol y se ha reportado que estimula la proliferación de algunas células (por ejemplo neuronas corticales e hipocámpicas embriónicas de ratón, mastocitos de : médula ósea de ratón, y lineas celulares B humanas) en cultivo. Además, también fueron probadas dosis mayores de 'PDGF-AA (100 ng/ml) para ver si podrían complementar la disminución de reactividad a factores del crecimiento.
La adición de 50 µ? de 1-tioglicerol en presencia de 20 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF y 10 ng/ml ' de IGF-1 estimuló la proliferación ligeramente pero el número de células aún disminuyó (tasa de expansión <1) . Este resultado fue similar al que se obtuvo en ausencia: de 1-tioglicerol cuando se incrementó la concentración de PDGF-AA a 100 ng/ml en presencia de 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1. Sin embargo, cuando ambos de 50 µ? de 1-tioglicerol y PDGF-AA incrementado (100 ng/ml) fueron incluidos en el medio de cultivo (junto con 10 ng/ml de bFGF y 10 ng/ml de IGF-1), los dos componentes parecieron trabajar de manera sinérgica, incrementado significativamente el número de células (tasa de expansión >1) . Cuando el IGF-1 fue eliminado de este cóctel de suplemento (es decir que la suplementacion total fue de 100 ng/ml de PDGF-AA + 10 ng/ml de bFGF + 50 µ? de 1-tioglicerol) , la tasa de expansión disminuyó a <1, indicando que el IGF-1 también promovió la proliferación y sobrevivencia de las células HFSC. Sin embargo, si las células HFSC fueron cultivadas en esta condición, las células HFSC pueden expandirse aún en estas condiciones. Estos datos indicaron que la adición de 50 µ? de 1-tioglicerol y el incremento de la concentración de PDGF-AA a 100 ng/ml además de 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1 fue importante para expandir las células. Además, la adición de IGF-1 puede no ser obligatoria pero fue aún efectiva aún en presencia de 50 µ? de 1-tioglicerol y 100 ng/ml de PDGF-AA para incrementar la tasa de expansión. La combinación de 50 µ? de 1-tioglicerol y 100 ng/ml de PDGF-AA además de 10 ng/ml de bFGF + 10 ng/ml de IGF-1 fue usada posteriormente para cultivar células HFSC.
Las células HFSC se expandieron adicionalmente en presencia de 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de 1-tioglicerol después del pase 6. Las células comenzaron a proliferar más rápidamente bajo esas condiciones después del pase y se expandieron 3-4 veces dentro de una semana. El tiempo de duplicación fue de aproximadamente 60-100 horas en estas condiciones. Las células HFSC fueron capaces de mantener este estado proliferativo aún después del pase 8 (véase la Figura 3, diapositiva D) , pase 11 (véase la Figura 3, diapositiva E) y pase 19 (véase la Figura 3, diapositiva F) . De este modo, el medio definido que comprende 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de 1-tioglicerol fue identificado como la condición de cultivo óptima para la expansión a largo plazo de células no diferenciadas neurales y/o células progenitoras neurales.
Ejemplo 3 - Técnica de diferenciación espontánea de células HSCP Aunque se probaron varias condiciones de cultivo, se observó que cuando las células HFSC fueron cultivadas con la remoción de bFGF del medio, muchas de las células parecieron diferenciarse en células bipolares. o multipolares (indicativo de oligodendrocitos ) y murieron pronto. Para evitar esta muerte celular, se desarrolló una técnica de diferenciación espontánea.
El medio de cultivo fue usualmente cambiado cada 2 días para expandir las células HFSC y se pensó que era muy importante mantener las células HFSC en un estado proliferativo . Para mejorar la diferenciación celular, el medio fue cambiado cada 3 o 4 días para este experimento. Se pensó que el FGF básico y la alta concentración de PDGF-AA bloquearon la diferenciación de las células HFSC pero también eran importantes para que las células HFSC sobrevivieran. Por lo tanto, la concentración de PDGF-AA se disminuyó de 100 a 20 ng/ml en presencia de 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 con 50µ? de 1-tioglicerol o sin 1-tioglicerol. Las células HFSC no pudieron sobrevivir bien si el bFGF era removido. Usualmente, el bFGF fue reabastecido para remover las células HFSC en estado proliferativo . Cuando se detuvo el reabastecimiento de bFGF, muchas de las células HFSC se separaron de su grupo y formaron procesos similares a redes complejas (indicativo de prooligodendroblastos y/u oligodendrocitos inmaduros:) y sobrevivieron bien como se muestra en la Figura 7, diapositivas A y B.
Esas células que soportan el proceso con morfología similar a telaraña fueron positivas para el antígeno 04 y/o antígeno GalC como se muestra en la Figura 7, dispositivas C-F, por lo tanto, se pensó que eran prooligodendroblastos (04-positivas y GalC-negativas) u oligodendrocitos inmaduros (04-positivas y GalC-positivas) . Aún en presencia de 1-tioglicerol, las células HFSC pudieron diferenciarse pero la complejidad del proceso pareció ser más simple cuando el 1-tioglicerol estuvo presente en el medio de cultivo como se muestra en la Figura 7, diapositivas A y B. Además, fueron observados raramente otros tipos de células (por ejemplo, astrocitos y neuronas) y se pensó que las células HFSC eran propensas a diferenciarse únicamente en células de linaje oligodendrocitico . Esta técnica permitió observar células de linaje oligodendrocitico diferenciadas en un estado sano.
Esos datos indican además que las condiciones de cultivo de la presente invención son particularmente útiles para expandir células no diferenciadas neurales y/o .células progenitoras neurales aisladas que son propensas a diferenciarse en oligodendrocitos, puesto que la mayoría; de las células diferenciadas exhibieron características oligodendrocíticas y se asemejaron a oligodendrocitos o prooligodendrocitos .
Ejemplo 4 - Inducción de células HFSC a partir de células no diferenciadas neurales convencionales Como se muestra en la Figura 1, se piensa que las células no diferenciadas neurales convencionales son predecesoras de las células HFSC. Confirmar esta relación, se examinó si las células HFSC podrían ser inducidas de células no diferenciadas neurales convencionales que fueron reportadas previamente. Las células de una segunda muestra de tejido de medula espinal fetal humana (11 semanas de gestación) fueron cultivadas inicialmente en presencia de 10 ng/ml de EGF y 10 ng/ml de bFGF en D EM/F12 que contenía 2.5 mM de glutamina, 15 mM de HEPES, 2% de suplemento B27, 1% de NEAA, 1.5 mM piruvato, 55 µ? de ß-mercaptoetanol , y 1 mM de N-acetil-L-cisteína durante 15 días pata expandir las células no diferenciadas neurales convencionales. Muchos tipos de células diferentes estuvieron presentes inicialmente, pero algunas poblaciones de células expandibles fueron obtenidas al final del cultivo primario. Esos resultados son ilustrados en la Figura 8, diapositiva A al día 15 del Pase 0. Después de este pase las células fueron cultivadas en las mismas condiciones que la clona #2b (es decir medio HFSCM1 con 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1, 100 ng/ml de PDGF-AA y 50 µ? de 1-tioglicerol ) a través de 15 pases.
La morfología de las células de la población de células expandibles obtenida al final del cultivo primario se volvió homogénea alrededor del pase 5 y las células tendieron a formar grupos y esferas, de manera similar a aquéllas que se formaron con la clona #2b (véase la Figura 8, diapositivas B-F) . Además, esta clona puede diferenciarse en células de linaje oligodendrociticos espontáneamente (datos no mostrados) , mostrando el mismo fenotipo inmune que la clona #2b (datos no mostrados) y el mismo patrón de expresión de marcador por citometria de flujo como se describe en el Ejemplo 7. Las células de esta clona fueron congeladas para pruebas adicionales (por ejemplo Figura 12) . Los datos sugieren que las células HFSC pudieran ser inducidas de células no diferenciadas neurales convencionales y se piensa que las células no diferenciadas neurales convencionales son predecesoras de las células HFSC.
Se piensa que el PDGF-AA funciona a través del receptor a de PDGF. Se sabe que este receptor es estimulado por todos los miembros de la familia del PDGF (PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB, PDGF-CC y PDGF-DD) . Se USÓ PDGF-BB para examinar si el PDGF-BB podría reemplazar al PDGF-AA usando la clona #2b y clona #3 de las células HFSC. .El PDGF-BB pudo expandir ambas clonas en las mismas condiciones excepto por el PDGF-AA y probó que el PDGF-AA podría ser reemplazado exitosamente con otros miembros de la familia del PDGF.
Ejemplo 5 - Confirmación de los componentes de cultivo celular óptimo Aunque el inventor probó varias condiciones de cultivo después de que las células HFSC (clona #2b) se estableció, el inventor notó que la respuesta a la dosis para cada factor del crecimiento había cambiado. Para aislar las células HFSC (clona #2b) , fueron necesarios concentraciones mayores de PDGF-AA (100 ng/ml) además de 50 µ? de 1-tioglicerol . Después de que esta clona comenzó a proliferar constantemente, no se requirieron concentraciones mayores de PDGF-AA (100 ng/ml) para expandir esta clona. La tasa de expansión se saturó a aproximadamente 10-20 ng/ml de PDGF-AA y la concentración mayor de PDGF-AA (100 ng/ml) no tuvo efectos adicionales sobre su crecimiento. Esto puede deberse a un cultivo a largo plazo o un uso continuo de 1-tioglicerol. Para establecer la clona #2b y la clona #3 de las Células HFSC, se usó 1-tioglicerol después de varios pases. Para examinar el efecto de la concentración mayor de PDGF-AA, fueron establecidas nuevas clonas en presencia de 1-tioglicerol de un cultivo inicial. Además, la respuesta del bFGF e IGF-1 pareció ser saturada a 20 ng/ml y 40 · ng/ml, respectivamente. Cuando se usó una concentración mayor ' de IGF-1 (50-500 ng/ml), pudieron ser observadas más células diferenciadas (pareció ser de alrededor del 1%). Por lo tanto, 20 ng/ml de IGF-1 fueron considerados preferibles para expandir las células HFSC. El uso de 20 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de IGF-1 mejoró la tasa de expansión 5-10% en comparación con el uso de 10 ng/ml de bFGF y 10 ng/ml de IGF-1. Por lo tanto, se usaron 20 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de IGF-1 para este experimento.
Las células HFSC de una tercera muestra (12 semanas de gestación) fueron cultivadas para ver si requería una mayor concentración de PDGF-AA en los componentes del medio de cultivo óptimo identificados y si podrían mejorar las características de crecimiento similares en otros lotes de células. Las células fueron cultivadas en el mismo medio de cultivo que las clonas #2b y #3 (es decir medio HFSCM1 y 50 µ de 1-tioglicerol) con 20 ng/ml (clona #4A) o 100 ng/ml (clona #4B) PDGF-AA además de 20 ng/ml de bFGF y 20 ng/ml de IGF-1. Al final del primer pase, el número de células de la clona #4A fue menor que un tercio de la clona #4B (véase la Figura 11, diapositiva A y diapositiva B) . Sin embargo, la clona: #4A comenzó a proliferar a una velocidad similar a la de la clona #4B después del pase 1 aún con una concentración ¦ ¦ - , menor de PDGF-AA de la clona #4B. La morfología de las células se volvió homogénea en el paso 3 y las ,cél,ulas tendieron a formar grupos y esferas, de manera similar, a aquéllos que se formaron con las clonas #2b o #3 (yéase, ;la Figura 10, diapositivas C-F) . Además, esas células pudieron diferenciarse en células de linaje oligodendrocitico espontáneamente como lo hicieron las clonas #2b y #3. Este resultado sugirió que una concentración mayor de PDGF-AA no era obligatoria pero preferible para aislar las células HFSC y que una concentración mayor de PDGF-AA no era necesaria una vez establecidas las células HFSC. Además, este método de cultivo pudo proporcionar características de crecimiento similares en otros lotes de células y se confirmó que este proceso podría ser repetible. Las células de esta clona fueron congeladas para pruebas futuras.
Ejemplo 6- Capacidad de las células HFSC expandidas para ser recuperadas y crecer después del sitio de congelación - descongelación Las células de la clona #2b fueron criopreservadas en presencia de 8% de DMSO en los pases.10, 11 y 12. Las células HFSC (clona #2b) congeladas en el pase 11 habían sido depositadas en la ATCC (número de acceso PTA-12291) . Las células de la clona #3 también fueron criopreservadas en presencia de 8% de DMSO en los pases 9 y 10. Las células de la clona #4A y #4B crecieron más rápido que la clona #2b o #3, por lo tanto fueron criopreservadas en presencia de 8% de DMSO en los pases 4 y 5 (clona #4A) o los pases 3, 4 y 5 (clona #4B) en las mismas condiciones. Se usó el mismo medio para cultivar las células HFSC (medio HFSCMl y 50 µ? de 1-tioglicerol ) para congelar las células HFSC. Las células fueron descongeladas posteriormente y cultivadas en el medio HFSCMl sin suero descrito anteriormente y 50 uM de l-tioglicerol con 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1, 100 ng/ml de PDGF-AA o 20 ng/ml de bFGF, 20 ng/ml de IGF-1, 20 ng/ml de PDGF-AA. Se observó que esas células proliferaron a una tasa similar antes del congelamiento (véase la Figura 6, Figura 9 y Figura 11). Las células congeladas se usaron para experimentos mostrados en las Figuras 12-15.
Ejemplo 7 - Caracterización de las células HFSC expandidas y no diferenciadas Cuando las células HFSC del Ejemplo 2 fueron cultivadas en presencia de 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de l-tioglicerol, crecieron en grupos y/o esferas como se muestra en la Figura 3, diapositivas D-F. Las células dispersas : que se separaron en los grupos tendieron a diferenciarse en oligodendrocitos como se muestra en la Figura 3, diapositivas D y E. Aún cuando las células fueron pasadas en un solo estado celular, eventualmente comenzaron' a unirse y formar grupos nuevamente. Su forma en este estado proliferativo se asemejó al de las células preprogenito;ras oligodendrociticas (véase Ben-Hur et al, J. Néurosci., 18:5777, 1998; Gago et al, Mol. Cell. Neurosci., 22:162, 2003) , pero no a las progenitores de 0-2A crecieron en una morfología bipolar sin formación de ningún grupo. Aunque fueron reportadas hace mucho tiempo células preprogenitoras de oligodendrocitos en ratas, la contraparte humana no había sido reportada. Sin embargo, no fue necesario identificar la etapa precisa de las células predecesoras oligodendrocíticas en el cultivo celular expandido puesto que retuvieron su capacidad para diferenciarse en oligodendrocitos (como se muestra más adelante) no obstante) .
Para caracterizar el inmunofenotipo de las células HFSC no diferenciadas, las células en los pases 11-15 fueron disociadas con un estado celular individual con Accutasa (Innovative Cell Technologies, San Diego, CA, EUA) y crecieron en placas de cultivo de 24 pozos recubiertas con poliornitina y cultivadas durante 3-7 días en presencia de 100 ng/ml de PDGF-AA, 10 ng/ml de bFGF, 10 ng/ml de IGF-1 y 50 µ? de 1-tioglicerol . Las células fueron entonces fijadas con paraformaldehído al 4% y entonces lavadas con PBS. Para teñir antígeno de superficie como CD133, PDGF-Ra, NG2, A2B5, 04, OI, GalC y PSA-NCAM, las células fueron bloqueadas con PBS que contenía 3% de suero de cabra normal (NGS) y teñidas con anticuerpos. Para teñir antígenos intracelulares como Sox2, nestina, 01ig2, proteína básica de mielina (MBP) , Vimentina, GFAP, Tublina ß???, Neurofilamento L y MAP2, las células fueron permeabilizadas con 0.1% de Tritón X-100 en PBS enfriado con hielo durante 10 min antes del bloqueo. El anticuerpo monoclonal IgGl de ratón CD133/1 (Clona AC133, Miltenyi Biotec) , y el anticuerpo policlonal de conejo anti-PDGF-Ra (Upstate) , anticuerpo policlonal de conejo anti-NG2 (Millipore), anticuerpo monoclonal IgM de ratón anti PSA-NCAM (Millipore) , anticuerpo monoclonal IgM de ratón A2B5 (Millipore) , anticuerpo monoclonal IgM de ratón 04 (R&D Systems) , anticuerpo monoclonal IgM de ratón 01 (Millipore), anticuerpo policlonal de conejo anti-Sox2 (Millipore) , anticuerpo monoclonal IgGl de ratón anti-Nestina (Millipore) , anticuerpo IgG2a monoclonal de ratón anti-01ig2, anticuerpo IgG3 monoclonal anti-GalC de ratón (Millipore) , anticuerpo IgG2a monoclonal de rata anti-MBP (Millipore) , anticuerpo monoclonal IgGl de ratón anti-Vimentina (Santa Cruz), anticuerpo policlonal de conejo anti-GFAP (Millipore), anticuerpo IgGl de ratón monoclonal Tublina Bill (Millipore) , anticuerpo IgGl monoclonal de ratón anti-Neurofilamento L (Cell Signaling) , anticuerpo policlonal de conejo anti-MAP2 (Millipore) y anticuerpo monoclonal IgGl de ratón anti-MAP2 (Millipore) fueron usados a 1:300 (CD133/1) , 1:300 (PDGF-Ra) , 1:600 (NG2), 1:1000 (PSA-NCAM), 1:1000 (A2B5) , 1:1000 (04), 1:1000 (01), 1:1000 (Sox2) , 1:200 (Nestina) , 1:200 (01ig2), 1:100 (GalC), 1:50 (MBP) , 1:500 (Vimentina) , 1:1000 (GFAP) , 1:100 (Tublina ß???) , 1:200 (Neurofilamento L) , 1:1000 (MAP2, policlonal) o 1:200 (MAP2, monoclonal) en PBS que contenia 3% de NGS. Después de la incubación durante la noche a 4°C, los pozos fueron lavados con tres cambios de PBS que contenia 3% de NGS. En algún caso, se usó la tinción de células vivas para algunos antigenos de la superficie celular (NG2, A2B5, 04, 01 y GD3) para reducir las señales no especificas. En algunos casos, las células fueron teñidas con cada anticuerpo primario antes de la fijación sin bloqueo. El anticuerpo policlonal de conejo anti-NG2, anticuerpo monoclonal IgM de ratón A2B5, anticuerpo monoclonal IgM de ratón 04, anticuerpo monoclonal IgM , de ratón OI, y anticuerpo IgG3 monoclonal de ratón anti-Disialogangliósido GD3 (Millipore) fueron usados a 1:150 (NG2), 1:100 (A2B5) , 1:200 (04), 1:100 (01) and 1:20.0 (GD3) en PBS que contenia 0.5% BSA. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente, los pozos fueron lavados con tres cambios de PBS que contenia 0.5% BSA. Los anticuerpos secundarios, IgG anticonejo de cabra AffiniPure conjugado con DyLight 488 (Especifico del Fragmento Fcy) , IgG anti-ratón de Cabra AffiniPure conjugado con DyLight 488 (Especifico del Fragmento Fcy) , IgG anticonejo de Cabra AffiniPure conjugado con DyLight 488 (H+L), IgG anti-rata de Cabra AffiniPure conjugado con DyLight 488 (H+L) , ;IgG anti-ratón de Cabra AffiniPure conjugado con DyLight 594 (H+L) , IgM anti-ratón de Cabra AffiniPure conjugado con DyLight 594 (especifico de la cadena µ) (todos los anticuerpos secundarios fueron comprados de Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) fueron usados a una dilución de 1:500 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron entonces lavadas con 2 cambios de PBS. Se usó DAPI para contrateñir los núcleos celulares. Las células fueron entonces conservadas usando un Olympus 1X81 equipado para epifluorescencia .
La mayoría de las células HFSC fueron CD133-positivas (véase la Figura 12, diapositivas A y B) , Sox2-positivas (véase la Figura 12, diapositivas C y D)¦ y nestina positivas (véase la Figura 12, diapositivas E y F) , indicativo de células no diferenciadas neurales. La mayoría de las células HFSC fueron Olig2-positivas (con frecuencia indicativo de células progenitoras de neuronas motoras1 y oligodendrocitas) (véase la Figura 12, diapositivas G y H) , PDGF-Ra-positivas (con frecuencia indicativo de células !de linaje oligodendrocítico) (véase la Figura 12, diapositivas I y J) , A2B5-positivos (el A2B5 usualmente está ausente de células no diferenciadas neurales y se encuentran sobre células progenitoras gliales, células progenitoras oligodendrocíticas y astrocitos del tipo 2) (véase la Figura 12, diapositivas M y N) , indicativo de células progenitoras de oligodendrocitos . La mayoría de las células HFSC fueron PSA-NCAM-positivas (véase la Figura 12, diapositivas 0 y P) pero hubo una variedad en sus niveles de expresión (PSA-NCAM usualmente está ausente de las células no diferenciadas neurales y se encuentra sobre células progenitoras neuronales y sobre células preprogenitoras oligodendrocíticas) . No pudieron ser observadas células GFAP positivas aunque la mayoría de ellas fueron vimentina-positivas (véase la Figura 12, diapositiva Q-S) . Al menos 90% de las células HFSC parecieron ser positivas para los marcadores anteriores excepto por el GFAP pero el conteo preciso fue muy difícil debido a que las células HFSC tendieron a producir grupos y a desprenderse de los recipientes de cultivo muy fácilmente durante la fijación y tinción. Para cuantificar su pureza, se efectuó un análisis de citometría de flujo y se muestra en la Figura 13.
Además, las células HFSC no diferenciadas' fueron teñidas débilmente con anticuerpo 04 que es un marcador para prooligodendroblastos (04-positivas, GalC-negativas ) y oligodendrocitos inmaduros (04-positivas, GalC-positivas) por inmunocitoquímica pero fue difícil de distinguir con tinción débil y tinción no específica. Algunos prooligodendroblastos mostraron células fuertemente 04-positivas con morfología multipolar pudieron ser observadas en este cultivo pero su frecuencia de aparición fue menor de 1% de las células totales.
Además las células HFSC no diferenciadas fueron teñidas débilmente con anticuerpo anti-MAP2 pero su morfología no fue similar a la de las neuronas. Cuando el anticuerpo fue usado con las células diferenciadas en presencia de suero, la neurona fue identificada con señales fuertes y morfología neuronal (véase la figura 14, diapositiva H) . Esa señal fuerte de MAP2 con morfología neuronal no fue identificada en células HFSC no diferenciadas. Esta señal débil desapareció cuando las células se diferenciaron, de modo que esta tinción parece ser específica y las células HFSC no diferenciadas podrían no ser teñidas específicamente.
En total, las células HFSC expresaron marcadores específicos para células no diferenciadas neurales ; (CD133, Sox2, y Nestina) y marcadores específicos para células del linaje oligodendrocítico (01ig2, NG2, A2B5, y 04) . Esos datos sugirieron que las células HFSC podrían ser una célula intermedia entre las células no diferenciadas neurales y las células progenitoras de oligodendrocitos . Además^ las células HFSC expresaron PSA-NCAM además de los antígenos anteriores, indicativo de que son la contraparte humana de las células · preprogenitoras oligodendrocíticas de rata.
El ácido polisiálico (PSA) del PSA-NCAM es un glicano de la superficie celular, cargado negativamente, largo, con un volumen hidratado enorme que sirve para modular la distancia entre las células. El PSA está implicado en un número de respuestas relacionadas con. la plasticidad en el SNC adulto, incluyendo cambios en los patrones circadianos y hormonales, adaptaciones al dolor y tensión, y aspectos de aprendizaje y memoria (Rutishauser Nat. Rev. Neurosci. 9:26, 2008). Una de las rutas del PSA en el sistema nervioso neonatal es en la migración " de progenitores de oligodendrocitos . Cuando el PSA es removido de progenitores 02A migrantes, la migración del progenitor de 02A fue inhibida en un modelo de herida (Barral-Moran et al, J. Neurosci. Res., 72:679, 2003). Otro papel es el control de la sincronización de diferenciación de las células. El PSA es expresado en axones en desarrollo y precursores oligodendrociticos, y su desrregulación en esas células se correlaciona con la aparición de mielinización. El PSA también está relacionado con respuestas asociadas con la plasticidad del SNC adulto. Dada la capacidad del PSA para regular el desarrollo y plasticidad adulta, se sigue las células que expresan PSA podrían tener valor terapéutico en una situación en la cual los tejidos hayan sido dañados por lesiones o enfermedad. Se observó regeneración axonal en la región que expresa PSA (expresión de PSA modificada en la cicatriz o células de · Schwann injertadas) a través de la cicatriz en un modelo de trauma. La célula HFSC es una célula que expresa PSA endógeno y tendré el mismo efecto sobre el tratamiento de traumas como lesiones cerebrales o lesiones de la médula espinal.
Para caracterizar mejor las células HFSC (clona #2b) , las células que fueron congeladas en el pase 11 fueron descongeladas, cultivadas en las condiciones de crecimiento descritas anteriormente y pasadas cada 7-9 días. Las células cultivadas durante 9 días en el pase 13 fueron entonces sometidas a citometria de flujo usando los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal IgGl de ratón anti-CD133/l conjugado con PE (clona AC133, Miltenyi Biotec) , anticuerpo monoclonal IgG2a de ratón CD140a conjugado con PE (clona aRl, BD Pharmigen) ; anticuerpo monoclonal IgGl de ratón CD9 conjugado con PE (clona M-L13, BD Pharmigen) ; anticuerpo monoclonal IgG2b de ratón CD44 conjugado con PE (clona G44-26, BD Pharmigen) ; anticuerpo monoclonal IgM de ratón anti-PSA-NCAM conjugado con PE (2-2B, Miltenyi Biotec) ; anticuerpo monoclonal IgM de ratón A2B5 conjugado con PE (clona 105HB29, Miltenyi Biotec); anticuerpo monoclonal IgM de ratón 04 conjugado con PE (clona 04, Miltenyi Biotec) y anticuerpo monoclonal IgGl de ratón anti-NG2 conjugado con PE (R&D Systems) . De manera breve, después de la disociación con Accutasa, las células fueron lavadas y resuspendidas en PBS enfriado con hielo con 2m de EDTA y 0.5% de BSA y mantenidas sobre hielo. Después de que fue contado el número de células y el número de células fue ajustado a 1 x 107 células/ml usando PBS enfriado con hielo con 2mM de EDTA y 0.5% de BSA, fueron transferidos 25 µ? de suspensión celular (250,000 células) en cada tubo de 1.5-ml. Entonces fueron agregados los anticuerpos primarios a cada tubo siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los controles isotipicos conjugados con PE para cada anticuerpo fueron usados para ajustar las compuertas apropiadas. Después de 20 minutos de incubación sobre hielo, las células fueron lavadas con PBS enfriado con hielo con 2 m de EDTA y 0.5% de BSA y resuspendidas en amortiguador de fijación (BD Bioscience) . Después de 20 minutos de fijación sobre hielo, las células fueron lavadas y resuspendidas en PBS enfriado con hielo con 2 mM de EDTA y 0.5% de BSA. La fluorescencia :de las células fue medida usando FACS Canto II (BD Bioscience) y cada uno de los datos fue analizado usando el software Gatelogic (Inivai Technologies Pty Ltd.).
Como se muestra en la Figura 13, todas . , la mayoría de las células HFSC (clona#2b) fueron CD133-positivas (100% de las células), CD9-positivas (100% de las células), CD140a-positivas (98.8% de las células), NG2-positivas (89.8% de las células), A2B5-positivas (99.9%: de las células), 04-positivas (94.6% de las células, PSA-NCAM-positivas (68.9% de las células) y CD44-negativas (0.4% de las células fueron positivas) . Por inmunocitoquimica, la señal de 04 pudo ser distinguida fuertemente de la tinción no especifica y fue mucho más débil que la señal de 04 de los prooligodendroblastos u oligodendrocitos . De los resultados de la citometria de flujo, la señal de 04 de las células HFSC (clona#2b) pudo ser separada del control isotipico y las células HFSC (clona#2b) parecieron débilmente positivas para el antigeno 04. Las células HFSC ( (clona#3) mostraron casi el mismo genotipo por citometria de flujo. Ellas fueron CD133-positivas (98.4% de las células), CD9-positivas (99.4% de las células), CD140a-positivas (91.5% de las células), NG2-positivas (63.4% de las células), A2B5-positivas (99.8% de las células), 04-positivas (71.6% de las células), PSA-NCAM-positivas (74.7% de las células) y CD44-negativas (0.3% de las células fueron positivas) .
Ejemplo 8. Potencial de diferenciación de las células HFSC expandidas en medio que contiene suero Para probar el potencial de diferenciación de ,las células expandidas, las células HFSC (clona#3) fueron pasadas a etapa de célula separada/individual y cultivadas en medio que contenia suero [Diferenciación de Células Precursoras de Oligodendrocitos (OPCD ] (ScienCell® Research Laboratories) para estimular la diferenciación.
Las células fueron entonces teñidas con anticuerpos que reconocen neuronas (anticuerpo anti-Tublina ß???, anticuerpo anti-Neurofilamento-L y anticuerpo anti-MAP2) células progenitoras de oligodendrocitos y oligodendrocitos [anticuerpo 04, anticuerpo 01, anticuerpo anti-GalC y anticuerpo anti-proteina básica de mielina (MBP) ] , y astrocitos (anticuerpo anti-GFAP) seguido por un anticuerpo secundario conjugado con tinte fluorescente (DyLight 488 o DyLight 594, Jackson ImmunoResearch) . Se usó DAPI para contrateñir los núcleos celulares.
Los tres fenotipos principales del sistema nervioso central (SNC) fueron observados después de los tratamientos para estimular la diferenciación de las células HFSC. Cuando las células HFSC fueron cultivadas en medio que contiene suero, las células positivas a Tublina ß???, células positivas a Neurofilamento-L, y las células positivas a MAP-2 fueron detectadas (indicativas de neuronas) . Tres fueron principalmente células positivas a Tublina ß??? (Figura 14, diapositiva B) mientras que un número pequeño de células fue positivo para Neurofilamento-L (Figura 14, diapositiva E) o MAP2 (figura 14, diapositiva H) . Este resultado indicó que muchas de ellas son neuronas inmaduras. Las células HFSC también pudieron diferenciarse en células MBP-positivas . MBP es un componente principal de la mielina y expresa únicamente en oligodendrocitos maduros. Estos datos indican que las células HFSC tienen la capacidad para diferenciarse en oligodendrocitos maduros. La colocalización de MBP y los marcadores neuronales anteriores fue evaluada pero únicamente pudo observarse poca colocalización (Figura 14, diapositivas C, F, I). Esto pudo deberse a la inmadurez de las neuronas debido a que la mielina no se había enrollado sobre el axón de la neurona inmadura. También fue evaluada la colocalización de MBP y antígeno 04 (figura 14, diapositivas J-L) . La mayoría de la señal de MBP se colocalizó con la señal del antígeno 04 pero sólo la mitad de la señal del antígeno 04 se colocalizó con la señal de MBP. Este resultado fue razonable debido a que el antíigeno 04 se ha expresado en progenitores de oligodendrocitos, oligodendrocitos inmaduros y oligodendrocitos maduros mientras que el MBP es expresado únicamente en oligodendrocitos maduros. Esas células también fueron positivas para el antígeno GalC, que es un marcador para oligodendrocitos inmaduros (datos no mostrados) . Las células positivas GFAP (astrocitos) y células positivas-vimentina también fueron detectadas como se muestra en la Figura 14, diapositivas M-0) . Esos datos indican que las células HFSC expandidas son multipotentes y que, por lo tanto, son probablemente células no diferenciadas neurales, puesto que son capaces de dar lugar a los tres genotipos principales de células del sistema nervioso central dependiendo del ambiente. Las célula HFSC (clona#2b) también fue probada en las mismas condiciones y mostró la misma multipotencia que la célula HFSC (clona#3) .
Ejemplo 9-Potencial de diferenciación de las células HFSC expandidas en medios sin suero Las células HFSC mostraron buena potencia de diferenciación en oligodendrocitos reduciendo , la concentración de PDGF-AA sin reabastecimiento de bFGF como se muestra en la figura 5. Sin embargo, las células diferenciadas fueron menos de la mitad de las células totales. Si las células HFSC fueron sembradas a una densidad muy baja (<0.5 x 104 células/cm2) sin bFGF con 10 ng/ml de PDGF-AA y 100 ng/ml de IGF-1, la mayoría de las células parecieron diferenciarse pero se perdieron dentro de un día. Para examinar su potencia para diferenciarse en oligodendrocitos adicionalmente, se pensó que una inducción de la diferenciación y sobrevivencia de la célula a largo plazo es muy importante. Se sabe que el AMP Cíclico (cAMP) induce diferenciación de muchos tipos de células. El pCPT-cAMP el cual es un análogo permeable celular del cAMP fue probado para ver si podría inducir diferenciación en las células HFSC. 100 µ? de pCPT-cAMP pudieron inducir diferenciación en las células HFSC a una alta densidad (3 x 104 células/cm2) pero las células no pudieron sobrevivir bien aún en presencia de 100 ng/ml de IGF-1. Se reportó que el BDNF mejora la diferenciación de los progenitores de los oligodendrocitos y soporta la sobrevivencia celular . de células diferenciadas. Cuando las células HFSC fueron diferenciadas en presencia de 10 ng/ml de PDGF-AA, 100 ng/ml de IGF-1, 100 µ? de pCPT-cAMP y 10 ng/ml de BDNF en DMEM/F12 que contiene glutamina y HEPES y suplementado con suplemento B27, suplemento N2 y 50 µ? de 1-tioglicerol , al menos más de la mitad de las células HFSC se diferenciaron en células que soportan el proceso. Debido a que las células HFSC expresan varios marcadores oligodendrociticos como 04 o NG2, fue requerido un nuevo método para distinguir las células HFSC y las células de linaje oligodendrocitico . Sobre la base de varios ensayos, el inventor notó que las células no diferenciadas expresan GD3 más fuerte que las células progenitoras de oligodendrocitos y viceversa 04 (cabeza de flecha de la Figura 11, diapositiva A, diapositiva B y diapositiva C) . Cuando las células fueron teñidas con GD3 y 04, los oligodendrocitos pudieron ser distinguidos usando su patrón de tensión y su morfología. Además, otros tipos de células como neuronas y astrocitos pudieron ser identificados debido a que no expresan GSD3 o antígeno 04. La Figura 15, diapositiva D muestra la relación de cada tipo de célula. Las células' no diferenciadas fueron el 23.5% ± 2.0% de las células totales. Las células progenitoras de oligodendrocitos fueron el 75.8% ± 2.1% de las células totales. Los otros tipos de células fueron únicamente el 0.9% ± 0.6%. Como se mencionó anteriormente, la relación de células progenitoras de oligodendrocitos a células diferenciadas (células progenitoras de oligodendrocitos más otros tipos de células) fueron el 99.1% ± 0.56% de las células diferenciadas, mientras que los otros tipos de células fueron únicamente 0.9% ± 0.56% de las células diferenciadas. Estos datos indican que las células HFSC tienen un alto potencial para diferenciarse en células de linaje oligodendrocitico .
Ejemplo 10 Células HFSC enriquecidas o seleccionadas por un método de clasificación celular activado por fluorescencia (FACS) o un método de clasificación magnética La presente invención describió el fenotipo de la célula HFSC que es CD133-positiva, CD140a-positiva, CD9-positiva, CD44-negativa, PSA-NCAM-positiva, A2B5-positiva, 04-positiva y NG2-negativa . Esta información permitió seleccionar o enriquecer células HFSC sin cultivo. El CD133 es un marcador para la célula no diferenciada neural y no es expresado en células progenitoras o precursoras. El CD9 es usado también como un marcador para la célula no diferenciada neural pero se conocen algunos oligodendrocitos que expresan CD9. El PSA-NCAM y A2B5 son usados para detectar precursores neuronales restringidos o precursores gliales restringidos. Se piensa que la mayoría de los precursores y progenitores neurales expresan PSA-NCAM y A2B5 o cualquiera de PSA-NCAM o A2B5, su uso no puede enriquecer células HFSC tampoco, especialmente en el primer y segundo trimestres. El CD140a, NG2, A2B5 y 04 son usados como marcadores para la célula precursora oligodendrocitica, prooligodendroglia y oligodendrocitos. Los niveles de expresión de CD140a y NG2 fueron mayores en la célula HFSC que en la célula precursora de oligodendrocitos, prooligodendroglia u oligodendrocito, mientras que los niveles de expresión de A2B5 y 04 fueron menores en la célula HFSC que en la célula precursora de oligodendrocitos, prooligodendroglia u oligodendrocitos. Se piensa que el uso de CD140a y NG2 es más apropiado para enriquecer células HFSC. Sobre la base de la información y los datos descritos en esta invención, la efectividad ; de cada marcador para enriquecer células HFSC será CD140á > NG2 > CD9 > CD133 > A2B5 > 04. PSA-NCAM pero este orden variará dependiendo de su semana de gestación.
Sin embargo, un solo marcador no será suficiente para seleccionar células HFSC y la combinación de dos marcadores puede seleccionar células HFSC de manera más específica. La combinación de uno de los marcadores de células no diferenciadas neurales (CD133 o CD9) y uno de los marcadores de linaje oligodendrocítico (CD140a, NG2) será muy efectivo para seleccionar células HFSC. Sobre la base del conocimiento anterior, las combinaciones más eficientes de marcadores para seleccionar células HFSC serán CD133 y CD140a entre esas combinaciones, pero otras combinaciones también serán más efectivas que la selección con un solo marcador.
La frecuencia de aparición de CD133 o CD140a es usualmente baja (menor de 5%) y la aparición de CD140a es tardía (la expresión comienza alrededor de la semana 8 y alcanza un máximo alrededor de la semana 18 de gestación) con relación al CD133. Por lo tanto, cada célula que expresa ambos de CD133 y CD140a serán mucho menos (menos de 1% de las células totales) dependiendo de su semana..,;de gestación. La mayoría de las células positivas CD133 pueden no expresarse de CD140a si las células son derivadas de tejido fetal humano en la semana de gestación 15 o antes. Debido a que las células positivas a CD133 y negativas a CD140a expresarán CD140a posteriormente, las células HFSC pueden ser obtenidas cuando las células sean cultivadas en las mismas condiciones que las células HFSC después del enriquecimiento inicial de las células positivas a CD133.

Claims (21)

REIVINDICACIONES
1. Un método para cultivar in vitro una célula neural expandible, donde la célula es una célula progenitora o célula no diferenciada aislada de un sistema nervioso central de mamífero, donde la célula conserva su capacidad para diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y su capacidad para diferenciarse en células de linaje oligodendrocíticos eficientes, el método se caracteriza porque comprende: a) seleccionar y disociar al menos una célula de un tejido neural fetal humano; b) cultivar la célula a una temperatura de 37°C, en una atmósfera que comprende 1-20% de 02, y 5% de C02, y en un medio de cultivo sin suero definido químicamente, donde el medio comprende - al menos 5 ng/ml de PDGF-AA, - al menos 0.5 ng/ml de bFGF, y - al menos 10 µ de 1 -tioglicerol , c) pasar la célula del b) para obtener la célula neural humana expandible.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo comprende además al menos 1.0 ng/ml de IGF-1.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la célula neural es de un tejiclo neural seleccionado del grupo que consiste de médula espinal, corteza cerebral, hipocampo, estrato, mesencéfalo basal, mesencéfalo ventral, locus cerúleo, hipotálamo, cerebelo, cuerpo calloso y nervio óptico.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en el paso a) el tejido neural es de médula espinal fetal humana de 8-24 semanas de gestación .
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque en el paso a) , la selección es efectuada por un método el cual usa al menos uno de la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o tamiz inmunológico .
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo comprende: - por lo menos 1.0 ng/ml de PDGF-AA, - por lo menos 0.5 ng/ml de bFGF, - por lo menos 10.0 µ? de 1-tioglicerol , y - por lo menos 1.0 ng/ml de IGF-1.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo comprende: - aproximadamente 100 ng/ml de PDGF-AA, - aproximadamente 20 ng/ml de bFGF, - aproximadamente 50 µ? de 1-tioglicerol , y - aproximadamente 20 ng/ml de IGF-1.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo comprende: - aproximadamente 20 ng/ml de PDGF-AA, - aproximadamente 20 ng/ml de bFGF, - aproximadamente 50 µ? de 1-tioglicerol , y - aproximadamente 20 ng/ml de IGF-1.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el paso de cultivo toma lugar en un recipiente de cultivo recubierto con poliornitina o polilisina.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de cultivo sin suero definido químicamente comprende DMEM/F12 suplementado con aminoácidos no esenciales, glutamina, piruvato, B27, N-acetil-cisteína y ß-mercaptoetanol .
11. El método de cultivo in vitro de una célula neural expandible, caracterizado porque comprende: cultivar la célula neural expandible en un medio de cultivo sin suero definido químicamente comprende D EM/F12 suplementado con aminoácidos no esenciales, glutamina, piruvato y B27.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el paso de cultivo toma lugar en un recipiente de cultivo recubierto con poliornitina o polilisina.
13. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque comprende: - por lo menos 1.0 ng/ml de factor neurotrófico derivado (BNDF) , - por lo menos 1.0 ng/ml de pCPT-cAMP.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el cultivo mejora la diferenciación en células de linaje oligodendrocitico .
15. El uso de una célula neural expandible de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14, por la preparación de un medicamento para el tratamiento de una condición causada por una pérdida de mielina o una pérdida de oligodendrocitos .
16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, donde la condición es una enfermedad desmielinizante o una enfermedad neurodegenerativa.
17. El uso de conformidad con la reivindicación 16, donde la enfermedad desmielinizante es seleccionada del grupo que consiste de esclerosis múltiple (MS) , leuco distrofia hereditaria, mielopatia/mielitis transversal, leucoencefalopatía focal multiprogresiva y otras enfermedades desmielinizantes congénitas.
18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, donde la enfermedad neurodegenerativa es seleccionada del grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer, demencia senil del tipo Alzheimer (SDAT) , enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , isquemia, ceguera y enfermedad neurodegenerativa causada por daño a las neuronas mielinizadas .
19. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el cultivo genera por lo menos una célula progenitora de oligodendrocitos u oligodendrocitos .
20. El uso de una célula neural expandible de conformidad con las reivindicaciones 1 a 14 , por estar en una preparación de un medicamento para el tratamiento de una condición causada por una pérdida de mielina o una pérdida de oligodendrocitos.
21. El uso de conformidad con la reivindicación 20, donde el trauma es por lo menos en lesión de la médula espinal (SCI) o lesión cerebral.
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